Evolución temporal de la microbiota fúngica de esputo en pacientes con fibrosis quística

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Evolución temporal de la microbiota fúngica de esputo en pacientes con Fibrosis Quística Trabajo que presenta la licenciada Laura Carrasco Hernández para optar al grado de Doctor en Medicina Sevilla, Septiembre de 2017 Dª. Mª. ESTHER QUINTANA GALLEGO, DOCTORA EN MEDICINA Y CIRUGÍA, Y TUTORA CLÍNICA UNIVERSITARIA. D. JOSE LUIS LOPEZ-CAMPOS BODINEAU,PROFESOR ASOCIADO DEL DEPARTAMENTO DE MEDICINA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA. Dª. CARMEN DE LA HORRA PADILLA, DOCTORA EN FARMACIA E INVESTIGADORA EN EL INSTITUTO DE BIOMEDICINA DE SEVILLA. CERTIFICAN: Que Dña. Laura Carrasco Hernández, Licenciada en Medicina, ha realizado bajo nuestra dirección el trabajo titulado “EVOLUCIÓN TEMPORAL DE LA MICROBIOTA FÚNGICA DE ESPUTO EN PACIENTES CON FIBROSIS QUÍSTICA”. Revisado el presente trabajo por creer que reúne las condiciones necesarias, estimamos que puede ser presentado como Tesis Doctoral. Sevilla, Septiembre de 2017 AGRADECIMIENTOS. Tras varios años de constante trabajo yaestá concluida la Tesis Doctoral, de la cual me siento muy orgullosa. Pero este trabajo no hubiera concluido sin la colaboración de muchas personas que me han acompañado en este largo camino y a las cuales me gustaría agradecer con estas palabras. En primer lugar, quería agradecer a mis directores de Tesis,a la Dra. Esther Quintana Gallego y alDr. José Luis López Campos. Durante estos años me han visto crecer profesional y personalmente, y han contribuido a mi desarrollo profesional. Gracias a sus correcciones, sugerencias, su apoyo, sus ideas de las que tanto provecho he sacado, sin que este trabajo no hubiera sido posible y por su incondicional respaldo y amistad. También agradecer al equipo de laboratorio, coordinado por Carmen de la Horra, por su colaboración en el procesamiento de las muestras y su paciencia para enseñarme las técnicas. No puedo olvidar a mi familia a la que tanto tengo que agradecer, a mis abuelos, a mi hermano y en especial a mi padre Melchor y mi madre Emi, pues gracias a ellos y sus sacrificios me he convertido en la persona y el médico que hoy soy. Y por supuesto a Alfredo, mi esposo, por su inmensa paciencia, por su gran apoyo, amor y cariño, por estar ahí cuando más lo necesito. Gracias aquellos que ya no están pero que formaron parte de mi vida. Gracias a todos por todo. Tabla de contenido Introducción. ........................................................................................................ 1 Antecedentes históricos ................................................................................... 2 Epidemiología .................................................................................................. 5 Genética........................................................................................................... 5 Proteína CFTR ................................................................................................. 6 Mutaciones del gen CFTR ................................................................................ 8 Fisiopatología ................................................................................................. 11 Manifestaciones clínicas ................................................................................ 13 Diagnóstico de la FQ ...................................................................................... 15 Definición de microbiota ................................................................................. 16 Microbiología .................................................................................................. 17 Características de las especies fúngicas ........................................................ 19 Género Candida ............................................................................................. 22 Género Aspergillus ......................................................................................... 23 Género Pneumocystis .................................................................................... 23 Género Scedosporium ................................................................................... 24 Técnicas moleculares..................................................................................... 25 Hipótesis y Objetivos. ........................................................................................ 27 Hipótesis ............................................................................................................ 28 Objetivos ........................................................................................................... 28 Método. ............................................................................................................. 30 Diseño y Población en estudio ....................................................................... 31 Criterios de inclusión y exclusión ................................................................... 31 Parámetros evaluados ................................................................................... 32 Variables de estudio ....................................................................................... 34 Aspectos éticos .............................................................................................. 35 Técnica de extracción de esputo .................................................................... 35 Identificación de microorganismos por métodos estandarizados .................... 36 Identificación de microorganismos mediante técnicas moleculares ................ 37 Digestión de las muestras ........................................................................... 37 Extracción del ADN ..................................................................................... 38 Técnicas de amplificación ........................................................................... 39 Técnica de Clonación ................................................................................. 43 Técnica de Secuenciación .......................................................................... 44 Controles de calidad ................................................................................... 45 Método estadístico ......................................................................................... 45 Resultados. ........................................................................................................ 48 Descripción de la muestra .............................................................................. 49 Objetivo 1. Identificar por cultivo convencional y por metagenómica la población fúngica. ...................................................................................... 57 Objetivo 2. Analizar la concordancia entre la identificación convencional y la biología molecular. ............................................................. 66 Objetivo 3. Relacionar la colonización fúngica con otros gérmenes presentes, así como la presencia de coinfecciones. ....................................... 70 Pseudomonas ............................................................................................. 70 Staphylococcus .......................................................................................... 72 Serratia ....................................................................................................... 76 Objetivo 4. Analizar los hallazgos microbiológicos con las mutaciones presentes en CTFR y los parámetros clínicos. .......................... 102 Discusión. ........................................................................................................ 120 Mensaje fundamental de la tesis .................................................................. 121 Fortalezas del estudio .................................................................................. 122 Limitaciones del estudio ............................................................................... 123 Resultados comparados con otros estudios ................................................. 125 Frecuencia de hongos detectados ............................................................... 128 Candida .................................................................................................... 128 Aspergillus ................................................................................................ 130 Pneumocystis ........................................................................................... 132 Scedosporium ........................................................................................... 134 Malassezia ............................................................................................... 136 Cryptococcus ............................................................................................ 136 Hongos ambientales ................................................................................. 137 Función pulmonar y hongos ......................................................................... 137 Tratamiento antifúngico en pacientes con FQ .............................................. 143 Propuestas de futuro .................................................................................... 146 Conclusiones. .................................................................................................. 149 Anexo I. Información al paciente y consentimiento informado. ......................... 152 Anexo II. Cuestionario estandarizado de recogida de datos clínicos. ............... 154 Bibliografía. ...................................................................................................... 158 ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 1. Características fenotípicas de FQ. Modificado de Tratado de FQ (26). 15 Tabla 2. Clasificación taxonómica del reino hongos. Modificada de Boekhout T et al. (41) ............................................................................................................... 21 Tabla 3. Medios de cultivo recomendables, condiciones óptimas de incubación y objetivos de los mismo. Modificada de Oliver A et al (36). ................................. 38 Tabla 4. Programa de la PCR semi-nested para el gen ITS: primera ronda ....... 41 Tabla 5. Programa de la PCR semi-nested para el gen ITS: segunda ronda ..... 41 Tabla 6. Programa para la PCR-TR para mtLSR rRNA. ..................................... 43 Tabla 7. Características de la población. ........................................................... 51 Tabla 8. Pruebas complementarias basales de la población estudiada. ............ 52 Tabla 9. Colonizaciones basales en el año previo de la población estudiada. ... 53 Tabla 10. Tratamientos basales en los 6 meses previos de la población estudiada. .......................................................................................................... 54 Tabla 11. Diferencias en la detección de hongos entre las técnicas convencionales y las moleculares ...................................................................... 57 Tabla 12. Concordancia entre técnicas convencionales y metagenómica en visita 1. ....................................................................................................................... 67 Tabla 13. Perfil diagnóstico del cultivo convencional en la visita 1. .................... 67 Tabla 14. Concordancia entre técnicas convencionales y metagenómica en visita 2. ....................................................................................................................... 68 Tabla 15. Perfil diagnóstico del cultivo convencional en la visita 2. .................... 68 Tabla 16. Concordancia entre técnicas convencionales y metagenómica en visita 3. ....................................................................................................................... 69 Tabla 17. Perfil diagnóstico del cultivo convencional en la visita 3. .................... 69 Tabla 18. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 1. .............................................. 76 Tabla 19. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 1. ....................................................... 77 Tabla 20. Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 1. .............................................. 77 Tabla 21. Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 1. ....................................................... 78 Tabla 22. Relación entre la evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 1 y 2 y la colonización crónica previa por Pseudomonas. ................ 78 Tabla 23. Relación entre la evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 2 y 3 y la colonización crónica previa por Pseudomonas. ................ 79 Tabla 24. Relación entre la evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 1 y 3 y la colonización crónica previa por Pseudomonas. ................ 79 Tabla 25. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 3 ............................................... 80 Tabla 26. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 3........................................................ 80 Tabla 27. Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 3. .............................................. 81 Tabla 28. Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 3. ....................................................... 81 Tabla 29. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamiento de Candida por metagenómica en visita 1. ..................................... 82 Tabla 30. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamiento de Aspergillus por metagenómica en visita 1. ................................. 82 ABREVIATURAS. ABC: ATP-Binding Cassette ADN: ácido desoxiribonucleico ARN: ácido ribonucleico ARNm: ácido ribonucleico mensajero ATP: Adenosín trifosfato BAL: lavado broncoalveolar CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Cl–: cloro CRD: cuaderno de recogida de datos DMRFQ: diabetes mellitusdiabetes relacionada con la FQ DS: desviación estándar EDTA: etildiaminotetraacético FEV1: volumen espirado en el primer segundo FQ: fibrosis quística FVC: capacidad vital forzada HGVS: Human Genome Variation Society H2O: agua IgE: Inmunoglobulina E IMC: Índice de masa corporal ITS: Internal Transcribed Spacers K+: potasio MR: meticilín-resistente. MS: meticilín-sensible MRSA: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Na+:sodio NBD: Nucleotide Binding Domain NTP: nucleótido trifosfato PCR: reacción en cadena de la polimerasa PCR-DGGE: polimerase chain reactionDenaturing Gradient Gel Electrophoresis) PCR-TR: PCR a tiempo real o cuantitativa rRNA: ribosomal ribonucleic acid SDS: dodecilsulfato sódico FINANCIACIÓN DEL PROYECTO. Este proyecto con número de expediente PS09/00957, ha sido financiado desde el 1 de Enero de 2011 hasta el 31 de Diciembre de 2013 por el Instituto de Salud Carlos III. Cuya investigadora principal fue Carmen de la Horra Padilla. Y con una Beca Neumosur Nº12-2009 presentada por Esther Quintana Gallego como investigadora principal. ACTIVIDAD CIENTÍFICA DERIVADA DE ESTA TESIS DOCTORAL. • Valoración metagenómica de la microbiota fúngica de esputo en pacientes con fibrosis quística. L. Carrasco Hernández, M. Abad Arranz, C. De la Horra Padilla, E. Quintana Gallego, V. Friaza Patiño, E-J Calderón Sandubete, J.M Valera Aguilar. Presentado en formato póster en el 39º. Congreso Neumosur. Badajoz 14-17 Marzo 2013 • Valoración metagenómica de la microbiota fúngica de esputo en pacientes con fibrosis quística. L. Carrasco Hernández, M. Abad Arranz, C. De la Horra Padilla, E. Quintana Gallego, V. Friaza Patiño, E-J Calderón Sandubete, J.M Valera Aguilar. Presentado en formato póster en el 46º. Congreso Nacional SEPAR. Barcelona 14 -17Junio 2013. • Fungi communities detected by metagenomic tools in sputum in patients with cystic fibrosis. L. Carrasco Hernández, M. Abad Arranz, C. De la Horra Padilla, E. Quintana Gallego, V. Friaza Patiño, E-J Calderón Sandubete, J.M Valera Aguilar. Presentado en formato póster en el Congreso ERS. Barcelona. 7-11 Septiembre de 2013. • Evolución temporal de la microbiota fúngica en pacientes con fibrosis quística. L. Carrasco Hernández, E. Quintana Gallego, I. Delgado Pecellín, C. Calero Acuña, JL López Campos Bodineau, C. De la Horra Padilla. Presentado en formato póster en el41º Congreso Neumosur. Córdoba. 19-21 Marzo 2015. • Evolución temporal de la microbiota fúngica en pacientes con fibrosis quística. L. Carrasco Hernández, E. Quintana Gallego, I. Delgado Pecellín, C. Calero Acuña, JL López Campos Bodineau, C. De la Horra Padilla. Presentado en formato póster en el48º Congreso Nacional SEPAR. Gran Canaria. 5-8 Junio 2015. • Temporal progression of fungal microbiota in patients with cystic fibrosis. L. Carrasco Hernández, C. López Ramírez, E. Quintana Gallego, I. Delgado Pecellín, C. Calero Acuña, JL López Campos Bodineau, C. De la Horra Padilla. Presentado en formato comunicación oral en el Congreso ERS. Amsterdam. 26-30 Septiembre de 2015. • Estudio prospectivo de la microbiota fúngica de esputo en pacientes con fibrosis quística. L. Carrasco Hernández, E. Quintana Gallego, I. Delgado Pecellín, J.L LópezCampos, C. De la Horra Padilla. Presentado en formato comunicación oral en el 43º Congreso Neumosur. Málaga. 23-26Marzo de 2017. • Microbiota fúngica de esputo en pacientes con fibrosis quística. L. Carrasco Hernández, E. Quintana Gallego, I. Delgado Pecellín, J.L LópezCampos, C. De la Horra Padilla. Presentado en formato póster en el 50º CongresoCongreso Nacional SEPAR. Junio. 2-5 de 2017. • Fungal microbiota in patients with cystic fibrosis. L. Carrasco Hernández, E. Quintana Gallego, I. Delgado Pecellín, M.Domínguez Begines, JL. López-Campos, C. De la Horra Padilla. Presentado en formato póster discusión en el 40º European cystic fibrosis conference. Junio. 7-10 de 2017. – 1 – Introducción. – 2 – La Fibrosis Quística (FQ) es la enfermedad genética más común, de herencia autosómica recesiva que afecta a la raza caucásica. La enfermedad se produce por mutaciones en el gen que codifica la denominada proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR, por sus siglas en inglés: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). La proteína CFTR se encuentra presente en las membranas celulares de células epiteliales del aparato respiratorio, páncreas, vías biliares, glándulas sudoríparas y en el sistema genitourinario, ejerciendo su función como canal de trasporte de cloro, esencial para la regulación de sal y agua a través de las membranas celulares(1). Al encontrarse este canal expresado en varios órganos, va a dar lugar a diferentes manifestaciones clínicas, otorgándole el papel de enfermedad multisistémica. Antecedentes históricos Son muchos los conocimientos sobre FQ, que se han adquirido a lo largo del tiempo, algunos de ellos revolucionarios. Las primeras descripciones de esta patología se encuentran recogidas en el folclore popular del Norte de Europa, en los que se hablaba de unos niños que presentaban un sabor salado al besarlos y que tenían una muerte precoz (2). Las primeras descripciones histopatológicas de la FQ se realizaron en el siglo XVI, por Peter Paaw en Holanda. En los años 30 se observaron anormalidades pancreáticas en las autopsias de algunos bebés que padecían el llamado “Síndrome Celíaco”. Dorothy Andersen (3), patóloga de Nueva York, revisó sus propios casos y los describió como una “Enfermedad fibroquística del páncreas”. Fue en los años 40 cuando, Sidney Farber, reconoció que la FQ era un desorden generalizado, más que un síndrome de malabsorción e introdujo el término de mucoviscidosis (4). Pronto sería descrita el tipo de herencia genética, autosómica recesiva (5), por la que se – 3 – caracteriza dicha enfermedad. El mayor avance, de este periodo fue, el primer uso de la penicilina en 1946 (6) y posteriormente de otros antibióticos. Tras la postración por calor sufrido por algunos lactantes con FQ durante la ola de calor de 1948 en Nueva York, Paul di Sant'Agnese identificó el alto contenido de sal en el sudor, convirtiéndose el test del sudor en la principal prueba diagnóstica(7). Posteriormente, se empezó a utilizar la iontoforesis con pilocarpina para estimular el sudor (8). En 1955 comienzan a crearse las primeras Unidades de Atención Especializada integrando un tratamiento multidisciplinario y desde entonces el pronóstico de la enfermedad ha ido aumentando de forma progresiva. Durante los años sesenta hubo un progreso clínico modesto, pero aún era desconocida la naturaleza del defecto y había pocos científicos que investigaban en el problema. Es a principios de los años setenta, cuando Douglas Crozier, cambia a sus pacientes afectos de FQ a una dieta alta en grasa saturada junto con la toma de enzimas pancreáticas, 60-100 diarias, comprobando una mejora en el estado nutricional, crecimiento y supervivencia (9). Se mostraron estudios donde se comprobó que la infección crónica por Pseudomonas, llevaba a un mal pronóstico y una mejora en la supervivencia con la administración de ciclos de antibióticos (10). La década de los 80, fue una época de progreso científico y clínico. Se demostró una alteración en el potencial de membrana intranasal (11), un defecto en el intercambio del cloro, se encontró un marcador en el cromosoma 7 relacionado con la FQ y en 1989 fue finalmente identificado el gen de la FQ, denominado gen regulador de la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (12). En los años 90, se demostró la mutación genética más – 4 – frecuente, la Phe508del. Otros de los avances importantes de esta época, fue el uso de la prueba tripsina inmunorreactiva para el cribado neonatal, convirtiéndose en la base de la mayoría de los programas de cribado neonatal de FQ (13). Una terapia revolucionaría, para aquellos pacientes que habían llegado a las etapas finales de su enfermedad, era un trasplante de corazón y pulmón. La mejora en la perspectiva que caracterizó los años ochenta continuó a través de los años noventa como resultado de la mejora constante de la atención y la creciente especialización del personal de los Centros de FQ, ahora bien, establecidos en muchos países. El arsenal terapéutico disponible comienza a ampliarse con la DNasa humana recombinante, el primer mucolítico realmente eficaz (14), una nueva preparación de tobramicina para inhalación (15), y de azitromicina también para los pacientes con infección crónica por Pseudomonas. En la actualidad, dos enfoques tienen por objetivo corregir el defecto básico: la terapia genética, dirigida a corregir la alteración genética, y la terapia con moléculas encaminadas a corregir el defecto funcional a nivel de la proteína CFTR. Esta última comienza a dar resultados prometedores con diversas moléculas en desarrollo y una de ellas (ivacaftor) ya comercializadas para la mutación de clase III, denominadas según la nomenclatura clásica como G551D o Gly551Asp según la Human Genome Variation Society (HGVS), con excelentes resultados en niños > de 2 años, adolescentes y adultos. El objetivo final será a través de la terapia correctora y potenciadora poder llegar a dar respuesta a todos los pacientes con FQ cualquiera que sea su mutación. Es probable que, conforme se vayan teniendo resultados de éstas y otras moléculas nuevas, haga falta una mólecula o combinación de estas según la o las mutaciones existentes en cada paciente, pero el futuro es prometedor y se están – 11 – que se produce una cierta función, pero a un nivel disminuido. (2657+5G>A, 3718-2477C>T)(2). • La clase VI está formada por mutaciones que determinan la pérdida del extremo COOHterminal, reduciendo la estabilidad de la molécula y también pueden dañar la regulación de los canales vecinos a la CFTR en la superficie celular. (4279insA). • Finalmente, la clase VII, recientemente incorporadas a la clasificación. (25). Son las llamadas mutaciones incontrolables porque ellas no pueden ser rescatadas mediante el uso de fármacos. Por ejemplo, las grandes delecciones como dele2,3(21kb). En general, las mutaciones de clase I-III impiden la maduración de la proteína y se asocian a un fenotipo de FQ grave en relación a insuficiencia pancreática exocrina, mientras que las mutaciones de clase IV-VI están asociadas a una amplia variabilidad fenotípica. En las mutaciones de las clases III a VI las proteínas llegan a la superficie de la célula, pero no funcionan adecuadamente(1). Fisiopatología La alteración en el transporte del ion cloro, junto con el del transporte del ion sodio (Na+) y el agua (H2O), es la anomalía responsable de la fibrosis quística. Como consecuencia de esta anomalía se producen secreciones espesas a nivel del páncreas, las vías biliares, glándulas sudoríparas, aparato genital (epidídimo y cuello cervical) intestino y aparato respiratorio (tanto en la vía aérea superior como inferior). El moco espeso y viscoso obstruye los conductos del órgano donde se localiza dando lugar a repercusiones multisistémicas que condicionan la variedad de sus manifestaciones clínicas. – 12 – La fisiopatología en las glándulas sudoríparas es diferente al del resto de glándulas. En la glándula sudorípara sana, iones cloruro (Cl–) y Na+ salen a la luz en la parte proximal de las glándulas sudoríparas con el fin de arrastrar agua y excretarla en la superficie de la piel para la termorregulación corporal; para ahorrar iones, la mayor parte de Na+ y Cl– se reabsorbe en la parte distal que es impermeable al agua. En los pacientes con FQ al existir una anomalía en canal CFTR, el ion cloro no puede ser trasportado al interior de la célula, no pudiéndose reabsorber el Na+, por lo que ambos son eliminados. Como consecuencia los pacientes presentan un exceso de cloruro sódico en el sudor, dando lugar a un característico sudor salado (2). En las células epiteliales del aparato respiratorio, el Cl–penetra en las células a través de un co-trasportador que introduce potasio (K+) y expulsa Na+ situado en la membrana basal. El Cl–acumulado en el citosol es expulsado al exterior a través de los canales de Cl–, localizados en la membrana apical. Acompañando al Cl–, se produce la salida de H2O lo que favorece la fluidez de las secreciones (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). En los pacientes con FQ, al encontrarnos con un canal anómalo o ausencia de este, la salida del Cl–queda bloqueada, y por tanto una reducción de la salida de H2O. A nivel de la membrana basal, el Na+ es reabsorbido junto al H2O, dando como resultado unas secreciones deshidratadas y viscosas(26,27). La falta de fluidez de las secreciones y la alteración del movimiento de los cilios por la viscosidad de la mucosidad favorece una limpieza inadecuada, dando como resultado la obstrucción de los bronquios y las infecciones respiratorias. – 13 – Figura 4. Trasporte de electrolitos en el epitelio respiratorio de un paciente con CFTR no funcionante. Modificado de Tratado de FQ (26) Manifestaciones clínicas Las manifestaciones clínicas de la FQ son muy variables debido al carácter multisistémico de la enfermedad, afectando aparato digestivo, respiratorio, glándulas sudoríparas, aparato genital… etc. Las denominadas, manifestaciones clásicas de la FQ (Tabla 1), son la tos crónica con expectoración, sinusitis o poliposis nasal, presencia de acropaquias, colonización por gérmenes típicos (Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia), bronquiectasias, síntomas gastrointestinales por la insuficiencia pancreática exocrina, esterilidad por azoospermia obstructiva y un sudor con alta concentración de sal (28). – 14 – No obstante, estas manifestaciones pueden no estar presentes en todos los pacientes con FQ, debido a la variabilidad de la presentación de esta enfermedad. Los síntomas digestivos y la deshidratación suelen ser los primeros en aparecer. Sin embargo, la edad de comienzo de los síntomas respiratorios es muy variable, pudiendo aparecer a diferentes etapas de la vida. La afectación pulmonar está presente de forma casi universal en los adolescentes y los adultos (2) y es la primera causa de morbi-mortalidad. Algunos autores relacionan las distintas mutaciones genéticas con las mutaciones más o menos graves y una presentación más o menos precoz (28,29). El síntoma inicial de la FQ es la tos crónica, seguida de la expectoración que al inicio de la vida es blanquecina, modificando su purulencia con el tiempo. El exceso de secreciones respiratorias espesas y viscosas, conducen a una obstrucción, inflamación e infección de las vías respiratorias inferiores. Sobre esta base patogénica, se presentan las denominadas exacerbaciones agudas que afectan de manera más o menos importante a la función pulmonar debido probablemente a un incremento de la carga bacteriana habitual y a la respuesta del huésped (30). – 15 – Tabla 1. Características fenotípicas de FQ. Modificado de Tratado de FQ (26). Enfermedad sinopulmonar crónica • Colonización/infección persistente con patógenos típicos de FQ: S. aureus, Haemophilus influenzae, P. aeruginosa mucoide y no mucoide y B. cepacia • Tos y expectoración crónica • Alteraciones persistentes en la radiografía del tórax (p. ej.: bronquiectasias, atelectasias, infiltrados, hiperinsuflación) • Obstrucción de las vías aéreas puesta de manifiesto por sibilancias y atrapamiento aéreo • Pólipos nasales; anomalías radiológicas de los senos paranasales • Acropaquias Alteraciones gastrointestinales y nutricionales • Intestinales: íleo meconial, síndrome de obstrucción intestinal distal, prolapso rectal • Pancreáticas: insuficiencia pancreática, pancreatitis recurrente • Hepáticas: enfermedad hepática crónica puesta de manifiesto por evidencia clínica o histológica decirrosis biliar focal o de cirrosis multilobular • Nutricionales: malnutrición proteico-calórica, hipoproteinemia y edema,complicaciones secundarias a deficiencia de vitaminas liposolubles Síndromes de pierde sal • Pérdida aguda de sal • Alcalosis metabólica crónica Alteraciones urogenitales en el varón • Azoospermia obstructiva (ausencia bilateral congénita de conductos deferentes) Diagnóstico de la Fibrosis Quística Para realizar el diagnóstico de la FQ, debemos realizar en primer lugar, el test del sudor, considerado el método Gold estándar para el diagnóstico y posteriormente el estudio de las mutaciones genéticas del CFTR. Recientemente ha sido publicado un consenso sobre el diagnóstico de la FQ (31), que se muestra en la siguiente figura. – 16 – Figura 5. Algoritmo diagnóstico de la Fibrosis Quística (26). Definición de microbiota Antes de comenzar a hablar sobre los microorganismos que son encontrados en las vías respiratorias de los pacientes con FQ, es necesario conocer qué es la microbiota. Se define microbiota, como colección de microorganismos que cohabitan con el huésped y que han desarrollado una relación íntima con éste (32). Está predominantemente compuesta por bacterias, pero también se ha comprobado que forma parte de ella hongos (conocida como microbiota fúngica o micobioma) y virus (viroma)(33). En el hombre adulto se estima que existen del orden de 1014 microorganismos. La microbiota es característica de cada tejido y está presente en zonas del individuo expuestas al exterior (como puede ser la cavidad oral o el tracto respiratorio). – 17 – Existen estudios que explican los cambios dinámicos en la microbiota tanto espacial como temporalmente (32), cambios que van a depender de la interacción entre microorganismos, el estado inmunológico del huésped y los factores medioambientales. Es importante tener conocimiento sobre la microbiota, ya queinteracciones entre microorganismos pueden explicar en parte, las exacerbaciones infecciosas. En los últimos años, la microbiota fúngica o micobioma, ha llamado la atención de los investigadores, obteniéndose la evidencia de que la microbiota fúngica pudiera tener un impacto clínico (actuar como cofactor en la inflamación y en la respuesta inmune del huésped y por lo tanto puede contribuir a la disminución de la función pulmonar y la progresión de la enfermedad) en los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas como es la FQ. Este nuevo conocimiento es debido al desarrollo de las técnicas cultivos independientes, que permiten identificar hongos no cultivables por métodos convencionales (33). Microbiología Los patógenos bacterianos que colonizan la vía aérea en los pacientes con FQ lo hacen frecuentemente siguiendo una secuencia, más o menos establecida, dependiendo de la edad (Figura 6). Los patógenos que con mayor frecuencia son aislados, son P. aeruginosa y S. Aureus(2). En los niños pequeños con FQ, S. aureus es a menudo el primer microorganismo que se aísla, decreciendo éste con la edad.A medida que los pacientes crecen aumenta la colonización por Pseudomonas aeruginosa, de tal forma que enla edad adulta el 70% de los pacientes con FQ están colonizados por P. aeruginosa siendo la responsable en gran parte del deterioro progresivo de la función respiratoria (17). Aunque existe una alta prevalencia en este grupo – 18 – etario, la prevalencia de P. aeruginosacontinúa disminuyendo, debido principalmente a la implementación de una terapia erradicadora cuando se obtiene un primer aislamiento. En cuanto a S. Aureus y MRSA (por sus siglas en Inglés, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) se ha producido un incremento, debidoa la mejora de las técnicas de detección de los microorganismos Gram positivos. Desde 2010 como observamos en la figura 6, la curva de prevalencia se ha mantenido en meseta. Dicha estabilización puede estar relacionada con el incremento de las medidas preventivas usadas para controlar las infecciones. (21,34,35). Figura 6. Distribución de microorganismos encontrados en los pacientes con FQ por edad (21). Figura 7. Prevalencia de los microorganismos en los pacientes con FQ (21). – 19 – Debido a la mayor expectativa de vida de estos pacientes y al hecho de que se utilicen ciclos repetidos de antibióticos para controlar las exacerbaciones, se ha favorecido la colonización por otros patógenos como B. cepacia, S. maltophilia, A. xylosoxidans, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Micobacterias no tuberculosas (M. abscesus, M. avium) así como diferentes tipos de hongos (Aspergillus, Candida) (36). Entre los hongos filamentosos, Aspergillus fumigatus es el más común, pero existen otras especies como Scedosporium apiospermum, Scedosporium prolificans, Aspergillus terreus y Exophiala dermatitidis. No debemos de olvidarnos de Pneumocystis jirovecii que se comporta como colonizador del tracto respiratorio de los pacientes con FQ aunque no se descarta su rol en la respuesta inflamatoria local(37). Características de las especies fúngicas Hoy día, las especies fúngicas están ganando importancia en la producción de enfermedades debido al aumento de población inmunodeprimida (trasplantes de órganos, terapia corticoidea, tratamiento inmusupresores, antibiótico prolongados…) Al menos 50 hongos de las 100.000 especies son conocidos como patógenos primarios en humanos ( ), siendo muchos reconocidos como agentes colonizadores en diferentes muestras y ahora son identificados como causantes de enfermedad en humanos en presencia de factores favorecedores(38). En la fibrosis quística, la colonización infección fúngica de las vías respiratorias es frecuente debido al tratamiento prolongado antimicrobiano, corticoideo y por la existencia de – 20 – bronquiectasias, aunque se desconoce el papel que ejercen en la patogénesis de la enfermedad(39). Los hongos son microorganismos eucariotas, que se clasifican en su propio reino, el reino Hongos. La clasificación morfológica, agrupa a los hongos en levaduras y formas miceliales. Se define a levadura como un microorganismo unicelular que se reproduce mediante gemación o fisión, de modo que la célula progenitora se desprende de una porción propia para producir una descendiente. Esta célula hija se puede alargar y da lugar a lo que se conoce como pseudohifa. Las formas miceliales son microorganismos pluricelulares formados por unas estructuras tubulares conocidas como hifas, cuyos extremos se alargan mediante un proceso denominado extensión apical. La mayoría de las especies fúngicas son aerobias, aunque existen algunas especies anaerobias, y de crecimiento lento. Su forma de reproducirse es mediante la formación de esporas, las cuales pueden ser sexuales, conociéndose al hongo productor de este tipo de esporas como telemorfo; y asexuales, en este caso el hongo productor de estas esporas se denomina anamorfo(40). La clasificación taxonómica del reino de los hongos ha cambiado mucho a lo largo de las últimas décadas, en la actualidad se clasifican en 7 filos, siendo tres filos los que tienen importancia médica (Cigomycotas, Ascomycota y Basidiomicota) y en los que nos vamos a centrar(41). – 27 – Hipótesis y Objetivos. – 28 – Hipótesis El estudio del esputo espontáneo de pacientes adultos y niños con FQ no trasplantados mediante técnicas de metagenómica constituye una técnica eficaz para el estudio de la microbiota fúngica de estos pacientes que se relaciona con parámetros clínicos. Objetivos OBJETIVOS PRINCIPALES 1. Identificar la microbiota fúngica presente en el esputo espontáneo de pacientes con FQ no trasplantados y mayores o igual a 6 años mediante el estudio metagenómico. 2. Estudiar la posible relación entre los resultados obtenidos por las técnicas moleculares y los parámetros clínicos y biológicos de evolución de la enfermedad. OBJETIVOS SECUNDARIOS. 1. Identificar por cultivo convencional y mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa, PCR-DGGE, los hongos presentes en las secreciones respiratorias de pacientes FQ no trasplantados mayores de 6 años. 2. Analizar la concordancia entre la identificación convencional y la biología molecular. – 29 – 3. Relacionar la colonización fúngica con otros microorganismos presentes, así como la presencia de coinfecciones. 4. Analizar la relación de los hongos identificados, con la evolución de los parámetros de la función respiratoria y respuestas alérgicas asociadas, así como con las mutaciones presentes en CTFR. – 30 – Método. – 31 – Diseño y Población en estudio Para cubrir los objetivos planteados se realizó un estudio observacional de cohortes prospectivas. Se incluyeron 68 pacientes diagnosticados de FQ mayores de 6 años, en seguimiento por la Unidad de Fibrosis Quística del Hospital universitario Virgen del Rocío, de Sevilla. Estos pacientes cumplían todos los criterios de inclusión establecidos para el estudio. Criterios de inclusión y exclusión Criterios de inclusión: • Pacientes diagnosticados de FQ, con 2 test del sudor positivos (> 60mmol/l) o un estudio genético confirmando las dos mutaciones del gen de la proteína CFTR. • Posibilidad de obtener una muestra respiratoria (esputo espontáneo) Criterios de exclusión: • Aquellos pacientes que presentaran una exacerbación respiratoria en el momento de reclutamiento o en las 4 semanas previas. Se utilizó para la definición de exacerbación respiratoria los criterios de Fuchs (14). • Pacientes menores de 6 años. • Pacientes en tratamiento con inmunosupresores. • Paciente con trasplante de órgano sólido previo a la inclusión del estudio. • Pacientes con datos analíticos o funcionales incompletos previos. • Posibilidad de pérdida de seguimiento semestral o anual del paciente. – 32 – Parámetros evaluados A todos los pacientes incluidos se les hizo un seguimiento durante un año, con tres visitas. La visita basal que coincidía con la inclusión del paciente en el estudio, la semestral y la anual. Todos los datos recogidos, fueron incluidos a un cuaderno de recogida de datos (CRD), el cual se muestra en el anexo 1. En la visita basal (visita 1), además de la firma del consentimiento informado, fueron recogidos los siguientes datos: • Datos epidemiológicos: sexo, edad y año de nacimiento. • Datos clínicos: índice de masa corporal (IMC Kg/m2), mutación detectada en el gen de la CFTR mediante un test genético, niveles de inmunoglobulina E (IgE), comorbilidades asociadas a la fibrosis quística, tratamiento antibiótico recibido en el año previo a la inclusión del estudio (tanto antibioterapia oral como intravenosa), tratamiento con corticoides orales, intravenosos e inhalados. Se evaluó la colonización crónica e intermitente de la vía aérea por microorganismos cultivables. • Datos funcionales: capacidad vital forzada (FVC), volumen espirado en el primer segundo (FEV1) y cociente FEV1/ FVC, medidos por espirometría forzada post-broncodilatación. • Datos analíticos con un margen de +/- 3 meses: Hemoglobina. creatinina sérica, leucocitos, neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, IgETotal, Ig Aspergillus fumigatus, Ig m3Aspergillus fumigates y Aspergillus IFI. • Índice radiológico BHALLA: sistema de clasificación del daño pulmonar en pacientes con FQ, siendo la máxima puntuación de 25, y la mínima de 0, indicando un mayor daño del parénquima pulmonar a menor puntuación obtenida. – 33 – • Muestras microbiológicas: las muestras de esputo son analizadas mediante dos aproximaciones metodológicas, el cultivo de esputo convencional, y las determinaciones moleculares (en este caso con la PCR y posterior secuenciación genómica. A los 6 meses de seguimiento (visita 2) los datos que se recogieron fueron: • Datos clínicos: IMC Kg/m2, nuevas comorbilidades asociadas a la FQ y colonización crónica e intermitente de la vía aérea. • Datos funcionales: FVC, FEV1, cociente FVC/FEV1. • Datos analíticos con un margen de +/- 3 meses: Hemoglobina. creatinina sérica, leucocitos, neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, IgETotal, IgG Aspergillus fumigatus, IgE m3Aspergillus fumigatus y Aspergillus IFI. • Muestra de esputo, analizados con las mismas técnicas que en la visita 1. En la visita anual (vista 3), se recogen de nuevo: • Datos clínicos: IMC Kg/m2, nuevas comorbilidades, números de exacerbaciones, tratamientos antibióticos recibidos y colonización crónica e intermitente de la vía aérea. • Datos funcionales: FVC, FEV1, cociente FVC/FEV1. • Datos analíticos con un margen de +/- 3 meses: Hemoglobina. creatinina sérica, leucocitos, neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, IgETotal, IgG Aspergillus fumigatus, IgE m3Aspergillus fumigatus y Aspergillus IFI. • Muestra de esputo Las comorbilidades recogidas, son las relacionadas con la FQ como: la intolerancia a la glucosa, la diabetes mellitus relacionada con la FQ (DMRFQ), la insuficiencia pancreática exocrina y la hepatopatía secundaria a la FQ. – 34 – La colonización crónica se definió como la presencia de cultivos positivos persistentes, al menos 3 cultivos positivos en 6 meses, con al menos un mes de separación entre sí. Se define colonización intermitente a la presencia de cultivos intermitentemente positivos y negativos en muestras consecutivas en un período de 6 meses a partir de la colonización inicial, al menos 3 cultivos espaciados en un mes entre ambos(55). Las espirometrías realizadas durante el seguimiento de estos pacientes fueron efectuadas con el espirómetro Power Unit JAEGER, Lab Manager V5.3.0 y seguían las recomendaciones internacionales(56). Variables de estudio • Análisis de la microbiota fúngica del esputo espontáneo de pacientes con FQ ≥6 años y no trasplantados, mediante metagenómica. • Cultivo convencional para hongos del esputo espontáneo de los pacientes con FQ. • Identificación de P. jirovecii mediante PCR a tiempo real del gen mt LSU rRNA en esputo espontáneo de pacientes con FQ al inicio del estudio, a los 6 y 12 meses. • Identificación de especies fúngicas mediante PCR tipo Nested y posterior secuenciación en el esputo espontáneo de pacientes con FQ al inicio del estudio, a los 6 y 12 meses. • Características clínicas, funcionales y radiológicas de los pacientes con FQ. – 35 – Aspectos éticos El estudio respetaba los principios éticos recogidos en la última revisión de la declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité e investigación clínica del centro (acta número 06/2009). Previo a la participación, tras ser explicado y entendido el estudio, los pacientes o el tutor legal en caso de menores de edad, firmaron un consentimiento informado aceptando la participación en dicho estudio. El consentimiento informado utilizado se aporta en el anexo 2. La información recogida se anotaba en CRD, que posteriormente era transcrito a una base de datos. La información recogida para la realización de esta tesis cumplía con la legislación de protección de datos (Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de Protección de Datos de Carácter Personal). Tanto en el CRD como la base de datos estaban bajo la custodia de la doctoranda y en ellos no se recogían datos que permitían identificar al paciente. Técnica de extracción de esputo Las muestras se debían recoger en la primera hora de la mañana. Se considerabaque una muestra era adecuada cuando al teñirla con tinción de Gram se observaban > 25 leucocitos y < 10 células epiteliales. Las tres muestras de esputo fueron recogidas en las sucesivas visitas, es decir, basal al inicio del estudio, a los 6 y 12 meses, y fueron numeradas sucesivamente con el orden cronológico de recogida. • Para la recogida del esputo, los pacientes debían de seguir los siguientes pasos: • Enjuagar la boca con agua antes de emitir la muestra. – 36 – • Inspirar dos veces profundamente, conteniendo el aliento durante unos segundos. Inspirar por tercera vez y expulsar el aire vigorosamente. Inspirar una vez más y luego toser. Con estas maniobras se intenta recoger un esputo que provenga de la vía aérea inferior. • Sostener el envase estéril cerca de los labios y depositar la muestra. • Se entregaba la muestra de esputo en la Unidad de Fibrosis Quística. Se conservaba en la nevera, a 4ºC si el procesamiento no es inmediato hasta su recepción en el laboratorio. Las muestras de esputo se recogieron por duplicado en condiciones de asepsia para evitar contaminantes. Se dividieron en alícuotas de 500 μL y se envió una muestra al Servicio de Microbiología del HUVR y la otra muestra se remitió en paralelo al laboratorio de Epidemiología Clínica y Molecular, del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) donde se mantuvo criopreservada a -20ºC hasta su posterior análisis. Identificación de microorganismos por métodos estandarizados El cultivo de las muestras respiratorias fue realizado en el Servicio de Microbiología, del Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla. Previo al cultivo, las muestras respiratorias deben de someterse, debido a su elevada consistencia a un procesamiento, para que el cultivo sea lo más efectivo posible (36). • Homogeneización de la muestra: habitualmente se emplean agentes mucolíticos (N-acetilcisteína) o ditiotreitol. El tiempo de contacto entre estos productos y el esputo previo a la siembra no debe ser prolongado ya que pueden inhibir o retrasar el crecimiento de diferentes patógenos. Para evitar esta acción deletérea también se ha recomendado emplear – 43 – (temperatura de fusión) entre 77 y 81ºC. Descartando la amplificación inespecífica de dímeros de cebador entre 72-75ºC. La identificación molecular de polimorfismos en las posiciones 85 y 248 del gen mt LSU rRNA de P. jirovecii se realizó mediante secuenciación directa precedida de la purificación del fragmento y su precipitación. Para el análisis de las secuencias obtenidas se utilizó el software de Macintosh Sequence Navigator v.1.0.1. de PE-Applied Biosystems. Tabla 6. Programa para la PCR-TR para mtLSR rRNA. Etapa Número de ciclos Temperatura (ºC) Tiempo Activación 1 95 8 minutos Desnaturalización Hibridación Extensión 40 95 5 segundos 55 15 segundos 72 10 segundos Terminación 1 76 1 segundo Técnica de Clonación La clonación se realizó en aquellos fragmentos que no se separaban en el gel de agarosa por poseer un peso molecular parecido. El proceso de clonación se realiza siguiendo los siguientes pasos: • Ligación: El procedimiento de ligación se emplea cuando se quiere introducir un fragmento de ADN de doble cadena deseado, en un vector. Un vector no es más, que una molécula de ADN que actúa como vehículo para transferir material genético a una célula y replicarse en esta. – 44 – • Transfección o transformación: Es la reacción en la que el vector con el gen de interés es introducido a una célula huésped, que le proporcionará la maquinaria enzimática necesaria para la replicación. • Selección: en este proceso se selecciona las colonias de células que han sido exitosamente transfectadas con el vector que contiene el gen deseado. Los vectores actuales incluyen marcadores que solo permite el crecimiento de las células a las que se le ha introducido el vector. Posteriormente las células son cultivadas. Técnica de Secuenciación El fundamento de esta técnica se basa en obtener fragmentos de amplificación cuyo tamaño difiere una sola base, a partir de un molde de ADN. Se consigue esta reacción al incorporar una cadena de ADN, un cebador, una ADN polimerasa y nucleótidos marcados con fluorescencia, que al incorporarse al final de la cadena (extremo 3’) producen la terminación del fragmento. Los nucleótidos terminales empleados llevan cuatro tipos distintos de marcaje, por lo que se puede llevar a cabo en el mismo tubo las cuatro reacciones de terminación específica (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). De esta forma se determina cuál es el nucleótido terminal de los fragmentos de ADN en función de su señal y resolver la secuencia con un solo carril. Posteriormente, se realiza una precipitación para eliminar los reactivos sobrantes de la reacción y otras moléculas que puedan interferir en la lectura del secuenciador. Las secuencias obtenidas, se comparan con secuencias que habían sido incluidas en la base de datos de PubMed, para identificar a que hongo correspondía en cada caso. Para buscar la concordancia entre las secuencias – 45 – que habíamos obtenido de nuestras muestras y las secuencias descritas en la base de datos, se recurrió a la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Se utilizó el programa Nucleotide Blast que nos permitía buscar una base de datos de nucleótidos utilizando nuestra secuencia de nucleótidos como patrón de búsqueda. Tras introducir nuestra secuencia en formato FASTA, filtramos la búsqueda evitando aquellas secuencias que pertenecen a humanos o ratón y seleccionamos la opción búsqueda de Megablast, con la cual conseguíamos rastrear aquellas secuencias que eran altamente similares a la nuestra. Controles de calidad Las muestras se procesaron en el laboratorio a ciegas y bajo código. Para evitar falsos positivos debido a contaminaciones, en todas las etapas se utilizaron puntas de pipeta con filtro. La extracción de ADN, preparación de la mezcla de reacción, amplificación por PCR y detección se efectuaron en distintas áreas. Para detectar la posible contaminación cruzada, todas las reacciones de PCR llevaban como control negativo H2O estéril. En los procesos de digestión de muestras se usó como control negativo de posible contaminación suero fisiológico. Método estadístico Los datos obtenidos se analizaron con el Statistical Package for Social Sciences (SPSS INc. IBM Corporation, Armonk, Nueva York, EE.UU) versión 23. Los resultados se han expresado como medias y desviación estándar (DS) para las variables cuantitativas, y mediante las frecuenciasabsolutas y relativas para las variables cualitativas, expresando las desviaciones estándar o los porcentajes – 46 – entre paréntesis. Las relaciones bivariantes entre variables se realizarán mediante el test de la Chi-cuadrado para variables categóricas y con la t de Student para variables independientes previa realización del test de Levene para evaluar la igualdad de las varianzas. El estudio del grado de concordancia entre ambas técnicas (convencional y metagenómica) para el cultivo de hongos (objetivo 2) se estimará mediante la construcción de tablas de contingencia 2x2 para cada una de las visitas excluyendo los casos sin resultados y el cálculo del coeficiente Kappa de Cohen. El coeficiente kappa es una herramienta estadística frecuentemente utilizada para determinar el grado de concordancia inter-observador. Este coeficiente corresponde proporción de concordancias observadas sobre el total de observaciones, habiendo excluido las concordancias atribuibles al azar. Puede tomar valores entre -1 y +1. Mientras más cercano a +1, mayor es el grado de concordancia inter-observador, por el contrario, mientras más cercano a -1, mayor es el grado de discordancia inter-observador. Un valor de κ = 0 refleja que la concordancia observada es precisamente la que se espera a causa exclusivamente del azar(57). Además, se estudió el perfil diagnóstico de las técnicas convencionales tomando como estándar de referencia a las técnicas metagenómicas. Se estimarán la prevalencia, sensibilidad, especificidad, proporción de falsos positivos, proporción de falsos negativos, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. La relación entre los cambios en los resultados dela metagenómica y las variables clínicas registradas se estudiaron mediante el test de ANOVA, previa realización de la prueba de Levene para evaluar la igualdad de las varianzas, – 47 – aplicándose el test de Welch en su lugar si éstas no eran homogéneas. Además, se aplicó la corrección de Bonferroni para detectar diferencias inter-grupos. La comparación de las variables cuantitativas entre los grupos de evolución temporal de la metagenómica se realizó con el test de al Chi-cuadrado, realizando estudios pareados por categorías para explorar las diferencias intragrupos. – 48 – Resultados. – 49 – Descripción de la muestra La cohorte se compuso de 68 pacientes diagnosticados de FQ. Como se refleja en la Tabla 7. Características de la población. Grupo Característica Valor promedio* Datos clínicos Edad (años) 21,5 (9,7) Sexo (hombres) 30 (44,1) No fumadores 68 (100) No bebedor 68 (100) Índice de masa corporal (kg/m2) 19,2 (3,2) Índice BHALLA 14,7 (5,9) Exacerbaciones año previo 3 (2) Ciclos de antibióticos año previo 3,2 (2,3) Mutaciones Phe508del homocigoto 24 (35,3) Phe508del heterocigoto 28 (41,2) Gly542* homocigoto 0 (0) Gly542* heterocigoto 10 (14,7) Arg334Trp homocigoto 0 (0) Arg334Trp heterocigoto 9 (13,2) Otras 7 (10,3) Comorbilidades Insuficiencia pancreática exocrina 46 (67,6) DMRFQ 10 (14,7) Intolerancia a la glucosa 32 (47,1) Hepatopatía asociada a la FQ 12 (17,6) Aspergilosis broncopulmonar alérgica 3 (4,4) – 50 – Otras comorbilidades 18 (26,5) *Datos expresados en media (desviación estándar) y en frecuencias absolutas (relativas) según la naturaleza de la variable. Tabla 8. Pruebas complementarias basales de la población estudiada. Grupo Característica Valor promedio* Pruebas funcionales FVC (ml) 2623 (1108) FVC (%) 78,6 (22,7) FEV 1 (ml) 1671 (845) FEV 1 (%) 59,6 (24,7) FEV 1 /FVC 62 (11) Pruebas analíticas IgE Total (KU/l) 455 (938) IgE m3Aspergillus fumigatus (KUA/l) 9,6 (22,3) IgGAspergillus fumigatus (mgA/l) 53,7 (38,8) Aspergillus IFI Negativo 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 4 (5,9) 14 (20,6) 16 (23,5) 14 (20,6) 7 (10,3) 5 (7,4) 1 (1,5) Hemoglobina (g/dl) 13,8 (1,2) Leucocitos (x109/l) 8,9 (2,8) Neutrófilos (x109/l) 5,3 (2,4) Eosinófilos (x109/l) 0,3 (0,1) Creatinina (mg/dl) 0,6 (0,2) – 51 – *Datos expresados en media (desviación estándar) y en frecuencias absolutas (relativas) según la naturaleza de la variable. Tabla 9. Colonizaciones basales en el año previo de la población estudiada. Microrganismo Colonización intermitente* Colonización crónica* Bacterias S. aureus MS 18 (26,5) 15 (22,1) S. aureus MR 4 (5,9) 7 (10,3) P. aeruginosa 19 (27,9) 29 (42,6) P. aeruginosa resistente 0 (0) 1 (1,5) Serratia sp. 3 (4,4) 2 (2,9) S. maltophilia 6 (8,8) 0 S. pneumoniae 2 (2,9) 0 H. influenzae 13 (19,1) 0 B. Cepaceae 9 (13,2) 2 (2,9) A. xylosoxidans 6 (8,8) 0 Otras bacterias 17 (25,3) 1 (1,5) Hongos Aspergillus 19 (27,9) 1 (1,5) Candida 23 (33,8) 0 Levaduras 9 (13,2) 1 (1,5) Otros hongos 9 (13,3) 0 *Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). MR: meticilín-resistente. MS: meticilín-sensible. – 52 – Los tratamientos basales en los 6 meses previos de la población estudiada están resumidos en la Tabla 10. Continuando con el tratamiento realizado por los pacientes de la cohorte, los 6 meses previos al ingreso del estudio, observamos que 25 (36,8%) casos tomaban corticoides inhalados (budesonida y fluticasona) unos 173 (±33DS) días, a dosis media de 752 (±545,5DS) µg. Solo 1 (1,5%) caso tomó corticoides orales de forma puntual. Respecto al tratamiento antibiótico oral, fue usado en 58 (85,3%) casos de la población como tratamiento de una exacerbación infecciosa, siendo los antibióticos que con mayor frecuencia se usaron ciprofloxacino (52,9%), cefuroxima axetilo (48,5%), cotrimoxazol (30,9%) y amoxicilina clavulánico (25%) como se muestra en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. La azitromicina por vía oral fue empleada en 29 (42,6%) casos de los pacientes con efecto antiinflamatorio e inmunomodulador, siendo administrada tres veces por semana. El uso de antibioterapia intravenosa fue inferior a la oral, usada en 10 (14,7%) de los pacientes. Los fármacos más empleados fueron tobramicina (13,2%) y ceftazidima (14.7%). Otros tipos de antibióticos por vía intravenosa fueron usados con menor frecuencia como se registra en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. La antibioterapia inhalada fue aplicada en 56 (82,4%) de los casos, siendo la más usada la colistina en 53 (77,9%) casos, frente a tobramicina con 3(4,4%) casos. Tabla 10. Tratamientos basales en los 6 meses previos de la población estudiada. Tratamiento Valor promedio* Corticoides inhalados 25 (36,8) – 59 – . En nuestra muestra 38(55,9%) era sexo femenino, con una edad media de 21,5 años, cuya mutación predominante era la Phe508del, presentada en heterocigosis en 28 (41,2%) casos y en homocigosis en 24 (35,3%) casos. La media en el número de exacerbaciones infecciosas en los pacientes FQ en el año previo del inicio del estudio fue de 3 (±2DS) con necesidad de utilizar3,2 (±2,3DS) ciclos de antibióticos al año.En cuanto a las comorbilidades destacar que 46 (67,6%) casos tenían una alteración de la función pancreática exocrina y un 64,7% del páncreas endocrino, incluyéndose en este último aquellos pacientes que padecen DMRFQ e intolerancia a la glucosa. A diferencia del páncreas el hígado estaba afectado en 12 (17,6%) casos. Otras comorbilidades presentes en 18 (26,5%) de los pacientes fueron alteración de la mineralización ósea, pancreatitis agudas, neumotórax, hemoptisis masiva con necesidad de embolización, poliposis nasosinusal, asma bronquial, epilepsia, enfermedad celiaca, intolerancia a la lactosa y vasculitis leucocitoclástica. Las Pruebas complementarias basales de la población estudiada están resumidas en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. Con respecto a las pruebas funcionales, se obtuvo una media de FEV1 de 59,6% (±24,7DS) y un coeficiente FEV1/FVC de 62% (±11DS). En cuanto a los datos analíticos presentaba una Hemoglobina de 13,8 g/dl (±1,2DS), leucocitos de 8,9 x109/l (±2,8DS), eosinófilos de 0,3 x109/l (±0,1DS) e IgE Total de 455 KU/l (±938 DS). Las colonizaciones basales en el año previo de la población estudiada se encuentran resumidas en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. La colonización bacteriana intermitente más frecuente es por P. aeruginosaque tiene lugar en 19 (27,9%) casos, seguida de S. aureus MSen 18 (26,5%) casos y H. influenzaeen 13 (19,1%). A nivel de hongos la colonización – 60 – intermitente más frecuente es por Candida en 23 (33,8%) casos seguida de Aspergillusen 19 (27,9%). La colonización crónica bacteriana que predomina en nuestra cohorte es por P. aeruginosapresente en 29 (42,6%) de los casos. En cuanto a los hongos solo existe colonización crónica en dos casos, 1(1,5%) caso de Aspergillusy 1(1,5%) caso por Levaduras. Figura 9. Distribución del seguimiento en la población de estudio. – 61 – Tabla 7. Características de la población. Grupo Característica Valor promedio* Datos clínicos Edad (años) 21,5 (9,7) Sexo (hombres) 30 (44,1) No fumadores 68 (100) No bebedor 68 (100) Índice de masa corporal (kg/m2) 19,2 (3,2) Índice BHALLA 14,7 (5,9) Exacerbaciones año previo 3 (2) Ciclos de antibióticos año previo 3,2 (2,3) Mutaciones Phe508del homocigoto 24 (35,3) Phe508del heterocigoto 28 (41,2) Gly542* homocigoto 0 (0) Gly542* heterocigoto 10 (14,7) Arg334Trp homocigoto 0 (0) Arg334Trp heterocigoto 9 (13,2) Otras 7 (10,3) Comorbilidades Insuficiencia pancreática exocrina 46 (67,6) DMRFQ 10 (14,7) Intolerancia a la glucosa 32 (47,1) Hepatopatía asociada a la FQ 12 (17,6) Aspergilosis broncopulmonar alérgica 3 (4,4) Otras comorbilidades 18 (26,5) *Datos expresados en media (desviación estándar) y en frecuencias absolutas (relativas) según la naturaleza de la variable. – 62 – Tabla 8. Pruebas complementarias basales de la población estudiada. Grupo Característica Valor promedio* Pruebas funcionales FVC (ml) 2623 (1108) FVC (%) 78,6 (22,7) FEV 1 (ml) 1671 (845) FEV 1 (%) 59,6 (24,7) FEV 1 /FVC 62 (11) Pruebas analíticas IgE Total (KU/l) 455 (938) IgE m3Aspergillus fumigatus (KUA/l) 9,6 (22,3) IgGAspergillus fumigatus (mgA/l) 53,7 (38,8) Aspergillus IFI Negativo 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 4 (5,9) 14 (20,6) 16 (23,5) 14 (20,6) 7 (10,3) 5 (7,4) 1 (1,5) Hemoglobina (g/dl) 13,8 (1,2) Leucocitos (x109/l) 8,9 (2,8) Neutrófilos (x109/l) 5,3 (2,4) Eosinófilos (x109/l) 0,3 (0,1) Creatinina (mg/dl) 0,6 (0,2) *Datos expresados en media (desviación estándar) y en frecuencias absolutas (relativas) según la naturaleza de la variable. – 63 – Tabla 9. Colonizaciones basales en el año previo de la población estudiada. Microrganismo Colonización intermitente* Colonización crónica* Bacterias S. aureus MS 18 (26,5) 15 (22,1) S. aureus MR 4 (5,9) 7 (10,3) P. aeruginosa 19 (27,9) 29 (42,6) P. aeruginosa resistente 0 (0) 1 (1,5) Serratia sp. 3 (4,4) 2 (2,9) S. maltophilia 6 (8,8) 0 S. pneumoniae 2 (2,9) 0 H. influenzae 13 (19,1) 0 B. Cepaceae 9 (13,2) 2 (2,9) A. xylosoxidans 6 (8,8) 0 Otras bacterias 17 (25,3) 1 (1,5) Hongos Aspergillus 19 (27,9) 1 (1,5) Candida 23 (33,8) 0 Levaduras 9 (13,2) 1 (1,5) Otros hongos 9 (13,3) 0 *Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). MR: meticilín-resistente. MS: meticilín-sensible. Los tratamientos basales en los 6 meses previos de la población estudiada están resumidos en la Tabla 10. Continuando con el tratamiento realizado por los pacientes de la cohorte, los 6 meses previos al ingreso del estudio, observamos que 25 (36,8%) casos tomaban corticoides inhalados (budesonida y fluticasona) unos 173 (±33DS) días, a dosis media de 752 (±545,5DS) µg. Solo 1 (1,5%) – 64 – caso tomó corticoides orales de forma puntual. Respecto al tratamiento antibiótico oral, fue usado en 58 (85,3%) casos de la población como tratamiento de una exacerbación infecciosa, siendo los antibióticos que con mayor frecuencia se usaron ciprofloxacino (52,9%), cefuroxima axetilo (48,5%), cotrimoxazol (30,9%) y amoxicilina clavulánico (25%) como se muestra en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. La azitromicina por vía oral fue empleada en 29 (42,6%) casos de los pacientes con efecto antiinflamatorio e inmunomodulador, siendo administrada tres veces por semana. El uso de antibioterapia intravenosa fue inferior a la oral, usada en 10 (14,7%) de los pacientes. Los fármacos más empleados fueron tobramicina (13,2%) y ceftazidima (14.7%). Otros tipos de antibióticos por vía intravenosa fueron usados con menor frecuencia como se registra en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. La antibioterapia inhalada fue aplicada en 56 (82,4%) de los casos, siendo la más usada la colistina en 53 (77,9%) casos, frente a tobramicina con 3(4,4%) casos. Tabla 10. Tratamientos basales en los 6 meses previos de la población estudiada. Tratamiento Valor promedio* Corticoides inhalados 25 (36,8) Corticoides orales 1 (1,5) Antibiótico oral 58 (85,3) Antibiótico inhalado 56 (82,4) Antibiótico intravenoso 10 (14,7) Azitromicina oral (3 veces por semana) 29 (42,6) *Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). – 65 – Figura 10.Distribución de antibioterapia oral utilizada 6 meses previos del inicio del estudio. *Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Figura 11. Distribución de antibioterapia intravenosa utilizada 6 meses previos del inicio del estudio. *Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). – 66 – – 67 – Objetivo 1. Identificar por cultivo convencional y por metagenómica la población fúngica. Si analizamos la capacidad de identificar las especies fúngicas, del cultivo convencional de esputo y la técnica de metagenómica a lo largo del seguimiento, observamos que la detección de hongos en la muestra de esputo de los pacientes de la cohorte fue mayor con la técnica molecular que con el cultivo, tal como se muestra en la Tabla 11. Tabla 11. Diferencias en la detección de hongos entre las técnicas convencionales y las moleculares Técnicas de detección Basal* 1º Semestre* 2º Semestre* Cultivo de esputo Positivo 15 (22,1) 14 (21,2) 19 (28,8) Negativo 53 (77,9) 52 (78,8) 47 (71,2) No realizado 0 (0) 2 (3) 2 (3) Técnica metagenómica Positivo 46 (67,6) 40 (60,6) 30 (65,2) Negativo 22 (32,4) 26 (39,4) 16 (34,8) No realizado 0 (0) 2 (3) 22 (47,) *Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas) – 68 – Las diferencias de detección de hongos entre ambas técnicas en la visita basal están reflejadas en la Figura 12. Con el cultivo convencional observamos que el género que con mayor frecuencia fue aislado en el primer periodo de tiempo, fue el género Aspergillusen 7 (10,3%) casos, siendo la especie aislada en todos los casos el A. fumigatus. Siguiendo a este encontramos a las Levaduras spp (no identificado el género), presentes en 5(7,4%) de los pacientes. El tercer género encontrado fue Candida con 4 (5,9%)casos, siendo la especie C. albicans la predominante en todos los casos. Otras especies encontradas, aunque en menor proporción fueron Cryptococcus y otros hongos filamentosos.Los hallazgos encontrados en el cultivo convencional difieren de los hallazgos detectados por técnicas moleculares. A diferencia del cultivo convencional, Candida fue el género más frecuente en 26 (38,2%) casos, seguido por Aspergillusen 7 (10,3%) casos, Cladosporium 4 (5,9%) casos y Cryptococcus2 (2,9%) casos. Con respecto a las especies de Candida se identificaron tres especies C. albicans, en mayor proporción en 16 (23,5) casos, C. parapsilosisen 9 (13,2%) casos y C. glabrataen 1 (1,5%) caso. Otras especies encontradas, aunque en menor proporción, fueron Dioscorea yAlternaria, entre otros, aunque en menor proporción. Otro hongo para tener en cuenta fue Pneumocystis hallado en 25(36,8%) de los pacientes. Las diferencias de detección de hongos entre ambas técnicas a los 6 meses están reflejadas en la Figura 13. Al igual que el tiempo basal, el hongo que con mayor frecuencia fueron aislados por cultivo convencional es Aspergillus en 6 (9,1%) y Levaduras sp en 6 (9,1%) casos, en igual número de pacientes. La especie de Aspergillus aislada fue A. fumigatus en sólo 2 (3%) pacientes. Al igual que el tiempo anterior de seguimiento se identificaron otros hongos filamentosos. Y un nuevo género de hongo que previamente no había aparecido el – 75 – Figura 19. Progresión en el tiempo de los cultivos por metagenómica del género Pneumocystis. – 76 – Objetivo 2. Analizar la concordancia entre la identificación convencional y la biología molecular. El grado de concordancia entre ambas técnicas, convencional y metagenómica, en la visita 1 se muestra en la Tabla 12. El índice kappa fue no significativo, indicando una falta del grado de acuerdo. Tomando como estándar de referencia a los resultados de la metagenómica, el perfil diagnóstico de los cultivos convencionales en la visita 1 se muestra en la Tabla 13. En la tabla 13se observa que existe una sensibilidad del 23,91% con IC 95%:13,77-34,05% y una especificidad del 81,82% con IC 95%: 72,65-90,99%. Para una prevalencia del 67,65%, el VPP es 73,33% y el VPN 33,96%. El grado de concordancia entre ambas técnicas, convencional y metagenómica, en la visita 2 se muestra en la Tabla 14. El índice kappa fue no significativo, indicando una falta del grado de acuerdo. Tomando como estándar de referencia a los resultados de la metagenómica, el perfil diagnóstico de los cultivos convencionales en la visita 2 se muestra en la Tabla 15. En dicha tabla se muestra una sensibilidad del 20%con IC 95%:10,35-29,65% y una especificidad del 76,92% con IC 95%: 66,76-87,09%. Para una prevalencia del 60,61%, el VPP es 57,14% y el VPN 38,46%. El grado de concordancia entre ambas técnicas, convencional y metagenómica, en la visita 3 se muestra en la Tabla 16. El índice kappa fue no significativo, indicando una falta del grado de acuerdo. Tomando como estándar de referencia a los resultados de la metagenómica, el perfil diagnóstico de los cultivos convencionales en la visita 3 se muestra en la Tabla 17. En la tabla se puede observar una sensibilidad del 36,67%con IC 95%: 22,74-50,59% y una especificidad del 87,50% con IC 95%:77,94-97,06%. Para una prevalencia del 65,22%, el VPP es 84,62% y el VPN 42,42%. – 77 – Tabla 12. Concordancia entre técnicas convencionales y metagenómica en visita 1. Metagenómica Total Positivo Negativo Convencional Positivo 11 (16,2) 4 (5,9) 15 (22,1) Negativo 35 (51,5) 18 (26,5) 53 (77,9) Total 46 (67,6) 22 (32,4) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Tabla 13. Perfil diagnóstico del cultivo convencional en la visita 1. Valor IC 95% IC 99% Prevalencia 67,65% 56,53% 78,77% 53,01% 82,28% Sensibilidad 23,91% 13,77% 34,05% 10,57% 37,26% Especificidad 81,82% 72,65% 90,99% 69,75% 93,89% Proporción FP 18,18% 9,01% 27,35% 6,11% 30,25% Proporción FN 76,09% 65,95% 86,23% 62,74% 89,43% VPP 73,33% 62,82% 83,84% 59,50% 87,17% VPN 33,96% 22,71% 45,22% 19,15% 48,78% FP: falsos positivos. FN: falsos negativos. VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. IC: intervalo de confianza. – 78 – Tabla 14. Concordancia entre técnicas convencionales y metagenómica en visita 2. Metagenómica Total Positivo Negativo Convencional Positivo 8 (11,8) 6 (8,8) 14 (21,2) Negativo 32 (41,7) 20 (29,4) 52 (78,8) Total 40 (60,6) 26 (39,4) 66 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Tabla 15. Perfil diagnóstico del cultivo convencional en la visita 2. Valor IC 95% IC 99% Prevalencia 60,61% 48,82% 72,39% 45,09% 76,12% Sensibilidad 20,00% 10,35% 29,65% 7,30% 32,70% Especificidad 76,92% 66,76% 87,09% 63,54% 90,30% Proporción FP 23,08% 12,91% 33,24% 9,70% 36,46% Proporción FN 80,00% 70,35% 89,65% 67,30% 92,70% VPP 57,14% 45,20% 69,08% 41,43% 72,86% VPN 38,46% 26,72% 50,20% 23,01% 53,91% FP: falsos positivos. FN: falsos negativos. VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. IC: intervalo de confianza. – 79 – Tabla 16. Concordancia entre técnicas convencionales y metagenómica en visita 3. Metagenómica Total Positivo Negativo Convencional Positivo 11 (23,9) 2 (4,3) 13 (28,3) Negativo 19 (41,3) 14 (30,4) 33 (71,7) Total 30 (65,2) 16 (34,8) 46 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Tabla 17. Perfil diagnóstico del cultivo convencional en la visita 3. Valor IC 95% IC 99% Prevalencia 65,22% 51,45% 78,98% 47,10% 83,34% Sensibilidad 36,67% 22,74% 50,59% 18,34% 55,00% Especificidad 87,50% 77,94% 97,06% 74,92% 100,08% Proporción FP 12,50% 2,94% 22,06% -0,08% 25,08% Proporción FN 63,33% 49,41% 77,26% 45,00% 81,66% VPP 84,62% 74,19% 95,04% 70,89% 98,34% VPN 42,42% 28,14% 56,71% 23,62% 61,22% FP: falsos positivos. FN: falsos negativos. VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. IC: intervalo de confianza. – 80 – Objetivo 3. Relacionar la colonización fúngica con otros microorganismos presentes, así como la presencia de coinfecciones. Para valorar si existe una asociación entre la colonización crónica o intermitente previa sobre los aislamientos de hongos por ambas técnicas, se presentan las siguientes tablas de contingencia evaluando esta relación. Pseudomonas En la . Tabla 18 se muestra la relación entre colonización crónica por Pseudomonasy aislamientos de hongos por cultivo convencional en visita 1 sin que se haya podido confirmar dicha relación, mientras que en la Tabla 19 se muestra la relación entre colonización crónica por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 1, igualmente la asociación no fue estadísticamente significativa. La relación entre colonización intermitente por Pseudomonas y aislamiento de hongos se ha explorado en la Tabla 20 para el cultivo convencional y en la Tabla 21 para las técnicas de metagenómica. En ambos casos, la relación no fue significativa. La asociación entre colonización crónica previa por Pseudomonasy la presencia o ausencia de cambios entre la visita 1 y 2, reflejada en la Tabla 22, entre la visita 2 y 3, en la Tabla 23 y entre las visitas 1 y 3, en la Tabla 24, fue analizada sin encontrar asociaciones significativas entre estas variables. Se analizaron la relación entre colonización crónica por Pseudomonasy aislamientos de hongos por cultivo convencional y metagenómica en la visita 2 así como la relación entre colonización intermitente por Pseudomonasy – 81 – aislamientos de hongos por cultivo convencional y metagenómica en la visita 2 sin encontrar hallazgos significativos. En la visita 3, tampoco se encontraron asociaciones significativas entre la colonización crónica por Pseudomonasy aislamientos de hongos por cultivo convencional, como se muestra en la Tabla 25, o por metagenómica fúngica, como se observa en la Tabla 26. Al igual que no se encontraron asociaciones significativas entre colonización intermitente por Pseudomonasy aislamientos de hongos por cultivo convencional, expresado en la Tabla 27 o mediante técnicas metagenómicas, como se muestra en la Tabla 28. A continuación, se presentan las tablas de contingencias que analizan la influencia de la colonización crónica o intermitente previa por Pseudomonas sobre los aislamientos de hongos más frecuentemente detectados en nuestra cohorte mediante técnicas de metagenómica (Candida, Aspergillus y Pneumocystis). La Tabla 29 muestra la relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos de Candida detectado mediante técnica metagenómica en la visita 1, la Tabla 30 muestra la relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos de Aspergillusdetectado mediante técnica metagenómica en la visita 1 y la Tabla 31 muestra la relación existente con Pneumocystis en la visita 1.En ninguno de los casos se encontraron asociaciones significativas. La relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos de Candida,AspergillusyPneumocystis detectados mediante técnica metagenómica en la visita 1, se analizan en la Tabla 32, Tabla 33 y Tabla 34 – 82 – respectivamente, sin obtener una relación significativa para ninguna de estas variables. La relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos de Candida,Aspergillusy Pneumocystis detectados mediante técnica metagenómica en la visita 2 y la relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos de Candida,AspergillusyPneumocystis detectados mediante técnica metagenómica en la visita 2, no fueron significativas. En la Tabla 35 podemos observar la relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos de Candida detectado mediante técnica metagenómica en la visita 3, la Tabla 36 muestra la relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos de Aspergillusdetectado mediante técnica metagenómica en la visita 3 y la Tabla 37 muestra la relación existente con Pneumocystis en visita 3.En ninguno de los casos se obtuvo una relación significativa. La relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos de Candida,AspergillusyPneumocystis detectados mediante técnica metagenómica en la visita 3, se analizan en la Tabla 38, Tabla 39 y Tabla 40 respectivamente. No se obtuvieron relaciones significativas en ninguna de las variables. – 83 – Staphylococcus La Tabla 25Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 3 Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Cultivo visita 3 Positivo 6 (8,8) 13 (19,1) 19 (27,9) Negativo 22 (28,6) 25 (32,8) 47 (61,1) No realizado 2 (2,9) 0(0) 2 (2,9) Total 30 (44,1) 38 (55,9) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.257 Tabla 26 Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 3 Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Metagenómica visita 3 Positivo 12 (17,6) 18 (26,5) 30 (44,1) Negativo 9 (13,2) 7 (10,3) 16 (23,5) No realizado 9 (13,3) 13 (19,1) 22 (32,4) Total 30 (44,1) 38 (55,9) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.292 – 84 – Tabla 27 Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 3. Colonización intermitente Pseudomonas Total Positivo Negativo Cultivo visita 3 Positivo 7 (10,3) 12 (17,6) 19 (27,9) Negativo 12 (17,6) 35 (515) 47 (69,1) No realizado 0 (0) 2 (2,9) 2 (2,9) Total 19(27,9) 49 (72,1) 68(100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.358 Tabla 28Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 3. Colonización intermitente Pseudomonas Total Positivo Negativo Metagenómica visita 3 Positivo 11 (16,2) 19 (27,9) 30 (44,1) Negativo 3 (4,4) 13 (19,1) 16 (23,5) No realizado 5 (7,4) 17 (25) 22 (32,4) Total 19 (27,9) 49 (72,1) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.20 – 91 – relación significativa (valor p por Chi-cuadrado: 0,016), mientras que la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. muestra la relación entre colonización crónica previa y aislamientos por metagenómica en la visita 1, no obteniéndose una asociación significativa en este caso. La relación entre colonización intermitente por Staphylococcus y aislamiento de hongos se ha analizado en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. para el cultivo convencional y en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. para las técnicas de metagenómica. En ambos casos, la relación no fue significativa. La asociación entre colonización crónica previa por Staphylococcusy la presencia o ausencia de cambios entre la visita 1 y 2, reflejada en la Tabla 45, entre la visita 2 y 3, en la Tabla 46 y entre las visitas 1 y 3, en la Tabla 47, fue analizada sin encontrar asociaciones significativas entre estas variables. – 92 – Al analizar la relación entre colonización crónica por Staphylococcus y aislamientos por cultivo convencional en la visita 2 mostrada en la Tabla 48, observamos que existe una relación significativa (valor p significativo por Chicuadrado: 0.019) que no se reproduce utilizando la técnica metegenómica. La colonización intermitente por Staphylococcusno mostró asociación significativa con los aislamientos por cultivo convencional y metagenómica en la visita 2. En la visita 3, no se encontraron asociaciones significativas entre colonización crónica por Staphylococcusy aislamientos de hongos por cultivo convencional, Tabla 49, ni mediante aislamientos por metagenómica fúngica, tal como se muestra en la Tabla 50. El análisis entre colonización intermitente por Staphylococcus y aislamiento de hongos mostrado en la Tabla 51 para el cultivo convencional y en la Tabla 52 para las técnicas de metagenómica, tampoco encontró asociaciones significativas. En las sucesivas tablas de contingencias se analizan la relación de la colonización crónica o intermitente previa por Staphylococcus sobre los aislamientos de hongosque han sido detectado con mayor frecuencia en la cohorte mediante técnicas metagenómica (Candida, Aspergillus y Pneumocystis). En la visita 1, no se encontraron asociaciones significativas entre la colonización crónica previa por Staphylococcuscon los aislamientos mediante técnica metagenómica de Candida, mostrado en laTabla 53; Aspergillusmostrado en la Tabla 54 yPneumocystis mostrado en la Tabla 55. – 93 – La relación entre colonización intermitente previa por Staphylococcus y aislamientos de Candida,Aspergillus,Pneumocystis detectados mediante técnica metagenómica en la visita 1, se analizan en la Tabla 56, Tabla 57 y Tabla 58 respectivamente, sin encontrar asociaciones significativas. En la Tabla 59, observamos unaasociación significativa entre colonización crónica previa por Staphylococcuscon el aislamiento de Aspergillus por metagenómica en la visita 2, (valor p por Chi-cuadrado:0.025). La relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y el aislamiento de Candida oPneumocystis por metagenómica en la visita 2 no mostraron asociación significativa. En la visita 3, no se encontraron asociaciones significativas entre la colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamientos mediante técnicas metagenómicas de Candidacomo se observa en la Tabla 60, Aspergillus en la Tabla 61 o Pneumocystis en la Tabla 62; ni entre la colonización intermitente por Staphylococcus y el aislamiento de estos hongos por la misma técnica (Tabla 63, 64 y 65 respectivamente). – 94 – Serratia En la Tabla 66 se muestra la relación entre colonización crónica previa por Serratia y el aislamiento de Aspergillus por metagenómica en la visita 2, (valor p significativo por Chi-cuadrado:0.006). Sin embargo, no se reprodujo dicha relación entre colonización crónica previa por Serratia y el aislamiento deCandida oPneumocystispor metagenómica ni entre colonización intermitente previa por Serratia y aislamiento deCandida, Aspergillus oPneumocystispor metagenómica en la visita 2. La relación entre colonización crónica previa por Serratia y aislamiento de Candida por metagenómica en la visita 3, que se ilustra en la Tabla 67fue significativa (valor p por Chi-cuadrado:0.045). No se obtuvieronasociaciones significativas entre la crónica previa por Serratia y el aislamiento de Aspergillus y Pneumocystispor metagenómica en visita 3, ni relación entre la intermitente previa por Serratia y aislamiento de Candia, Aspergillus oPneumocystispor metagenómica en dicha visita. Tabla 18. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 1. Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Cultivo visita 1 Positivo 7 (10,3) 8 (11,8) 15 (22,1) Negativo 23 (33,8) 30 (44,1) 53 (77,9) Total 30 (44,1) 38 (55,9) 68 (100) – 95 – Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.822. Tabla 19. Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 1. Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Metagenómica visita 1 Positivo 22 (32,4) 24 (35,3) 46 (67,6) Negativo 8 (11,8) 14 (20,6) 22 (32,4) Total 30 (44,1) 38 (55,9) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.373. Tabla 20. Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 1. Colonización intermitente Pseudomonas Total Positivo Negativo Cultivo visita 1 Positivo 7 (10,3) 8 (11,8) 15 (22,1) Negativo 12 (17,6) 41 (60,3) 53 (77,9) – 96 – Total 19 (27,9) 49 (72,1) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.067. Tabla 21. Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 1. Colonización intermitente Pseudomonas Total Positivo Negativo Metagenómica visita 1 Positivo 11 (16,2) 35 (51,1) 46 (67,6) Negativo 8 (11,8) 14 (20,6) 22 (32,4) Total 19 (27,9) 49 (72,1) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.284. Tabla 22. Relación entre la evolución de la microbiota fúngicapor metagenómica entre visita 1 y 2 y la colonización crónica previa por Pseudomonas. Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Negativo persistente 3 (10,0) 8 (21,1) 11 (16,2) Adquisición cepa 3 (10,0) 6 (15,8) 9 (13,2) Pérdida cepa 7 (23,3) 8 (21,1) 15 (22,1) – 97 – Positivo persistente 15 (50,0) 16 (42,1) 31 (45,6) No realizado 2 (6,7) 0 (0) 2 (2,9) Total 30 (100) 38 (100) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la columna. Valor p no significativo por Chi-cuadrado:0.593. Tabla 23. Relación entre la evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 2 y 3 y la colonización crónica previa por Pseudomonas. Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Negativo persistente 3 (10,0) 2 (5,3) 5 (7,4) Adquisición cepa 3 (10,0) 8 (21,1) 11 (16,2) Pérdida cepa 6 (20,0) 5 (13,2) 11 (16,2) Positivo persistente 9 (30,0) 10 (26,3) 19 (27,9) No realizado 9 (30,0) 13 (34,2) 22 (32,4) Total 30 (100) 38 (100) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la columna. Valor p no significativo por Chi-cuadrado: 0.515 Tabla 24. Relación entre la evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 1 y 3 y la colonización crónica previa por Pseudomonas. Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Negativo persistente 2 (6,7) 2 (5,3) 4 (5,9) Adquisición cepa 2 (6,7) 4 (10,5) 6 (8,8) – 98 – Pérdida cepa 12 (40,0) 10 (26,3) 22 (32,4) Positivo persistente 10 (33,3) 14 (36,8) 24 (35,3) No realizado 4 (13,3) 8 (21,1) 12 (17,6) Total 30 (100) 38 (100) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la columna. Valor p no significativo por Chi-cuadrado:0.744 Tabla 25Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 3 Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Cultivo visita 3 Positivo 6 (8,8) 13 (19,1) 19 (27,9) Negativo 22 (28,6) 25 (32,8) 47 (61,1) No realizado 2 (2,9) 0(0) 2 (2,9) Total 30 (44,1) 38 (55,9) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.257 Tabla 26 Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 3 Colonización crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Metagenómica visita 3 Positivo 12 (17,6) 18 (26,5) 30 (44,1) Negativo 9 (13,2) 7 (10,3) 16 (23,5) – 99 – No realizado 9 (13,3) 13 (19,1) 22 (32,4) Total 30 (44,1) 38 (55,9) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.292 Tabla 27 Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por cultivo convencional en visita 3. Colonización intermitente Pseudomonas Total Positivo Negativo Cultivo visita 3 Positivo 7 (10,3) 12 (17,6) 19 (27,9) Negativo 12 (17,6) 35 (515) 47 (69,1) No realizado 0 (0) 2 (2,9) 2 (2,9) Total 19(27,9) 49 (72,1) 68(100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.358 Tabla 28Relación entre colonización intermitente previa por Pseudomonas y aislamientos por metagenómica en visita 3. Colonización intermitente Pseudomonas Total Positivo Negativo Metagenómica visita 3 Positivo 11 (16,2) 19 (27,9) 30 (44,1) Negativo 3 (4,4) 13 (19,1) 16 (23,5) No realizado 5 (7,4) 17 (25) 22 (32,4) – 100 – Total 19 (27,9) 49 (72,1) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.20 Tabla 29 Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamiento de Candida por metagenómica en visita 1. Colonización Crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Candida visita 1 Positivo 12 (17,6) 14 (20,6) 26 (38,2) Negativo 18(26,5) 24(35,3) 42 (61,8) Total 30 (44,1) 38(55,9) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chi-cuadrado: 0.790) Tabla 30 Relación entre colonización crónica previa por Pseudomonas y aislamiento de Aspergillus por metagenómica en visita 1. Colonización Crónica Pseudomonas Total Positivo Negativo Aspergillus visita 1 Positivo 4 (5,9) 3 (4,4) 7 (10,3) Negativo 26(38,2) 35(51,5) 61 (89,7) Total 30 (44,1) 38(55,9) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.464 – 107 – Tabla 43 Relación entre colonización intermitente previa por Staphylococcus y aislamiento por cultivo convencional en visita 1. Colonización intermitente Staphylococcus Total Positivo Negativo Cultivo visita 1 Positivo 5 (7,4) 10 (14,7) 15 (22,1) Negativo 17 (25,0) 36 (52,9) 53 (77,9) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado.0.927 Tabla 44 Relación entre colonización intermitente previa por Staphylococcus y aislamiento por metagenómica en visita 1. Colonización intermitente Staphylococcus Total Positivo Negativo Metagenómica visita 1 Positivo 13 (19,1) 33 (48,5) 46 (67,6) Negativo 9 (13,2) 13 (19,1) 22 (32,4) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado.0.297 – 108 – Tabla 45 Relación entre l evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 1 y 2 y la colonización crónica previa por Staphylococcus. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Negativo persistente 3 (13,6) 8 (17,4) 11 (16,2) Adquisición cepa 4 (18,2) 5 (10,9) 9 (13,2) Pérdida cepa 5 (22,7) 10 (21,7) 15 (22,1) Positivo persistente 10 (45,5) 21 (45,5) 31 (45,6) No realizado 0 (0) 2 (4,3) 2 (2,9) Total 22 (100) 46 (100) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la columna. Valor p no significativo por Chi-cuadrado:0.874 Tabla 46 Relación entre la evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 2 y 3 y la colonización crónica previa por Staphylococcus. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Negativo persistente 1 (4,5) 4 (8,7) 5 (7,4) Adquisición cepa 5 (22,7) 6 (13,0) 11 (16,2) Pérdida cepa 4 (18,2) 7 (15,2) 11 (16,2) Positivo persistente 6 (27,3) 13 (28,3) 19 (29,7) No realizado 6 (27,3) 16 (34,8) 22 (32,4) Total 22 (100) 46 (100) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la columna. Valor p no significativo por Chi-cuadrado. 0.769 – 109 – Tabla 47 Relación entre la evolución de la microbiota fúngica por metagenómica entre visita 1 y 3 y la colonización previa por Staphylococcus. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Negativo persistente 2 (9,1) 2 (4,3) 4 (5,9) Adquisición cepa 2 (9,1) 4 (8,7) 6 (8,8) Pérdida cepa 6 (27,3) 16 (34,8) 22 (32,4) Positivo persistente 9 (40,9) 15 (32,6) 24 (35,3) No realizado 3 (13,6) 9 (19,6) 12 (17,6) Total 22 (100) 46 (100) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la columna. Valor p no significativo por Chi-cuadrado: 0.793 Tabla 48 Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento por cultivo convencional en visita 2. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Cultivo visita 2 Positivo 1 (1,5) 31 (45,6) 32 (47,1) Negativo 21 (30,9) 13 (19,1) 34 (50) No realizado 0 (0) 2 (2,9) 2 (2,9) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chi-cuadrado: 0.019 – 110 – Tabla 49 Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento por cultivo convencional en visita 3. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Cultivo visita 3 Positivo 3 (4,4) 16 (23,5) 19 (27,9) Negativo 19 (27,9) 28 (41,2) 47 (69,1) 0 (0) 2 (2,9) 2 (2,9) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.055 Tabla 50 Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamientos por metagenómica en visita 3. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Metagenómica visita 3 Positivo 11 (16,2) 19 (27,9) 30 (44,1) Negativo 5 (7,3) 11 (16,2) 16 (23,5) 6 (8,8) 16 (23,6) 22 (32,4) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68(100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chi-cuadrado: 0.713 – 111 – Tabla 51 Relación entre colonización intermitente previa por Staphylococcus y aislamientos por cultivo en visita 3. Colonización intermitente Staphylococcus Total Positivo Negativo Cultivo visita 3 Positivo 8 (11,7) 11 (16,2) 19 (27,9) Negativo 14 (20,6) 33 (48,5) 47 (69,1) No realizado 0 (0) 2 (2.9) 2 (2.9) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.336 Tabla 52 Relación entre colonización crónica intermitente previa por Staphylococcus y aislamientos por metagenómica en visita 3. Colonización intermitente Staphylococcus Total Positivo Negativo Metagenómica visita 3 Positivo 10 (14,7) 20 (29,4) 30 (44,1) Negativo 3 (4,4) 13 (19,1) 16 (23,5) No realizado 9 (13,3) 13 (19,1) 22 (32,4) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.295 – 112 – Tabla 53 Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento de Candida por metagenómica en visita 1. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Candida visita 1 Positivo 5 (7,4) 21(30,9) 26 (38,2) Negativo 17 (25) 25 (36,8) 42 (61,8) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.069 Tabla 54. Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento de Aspergillus por metagenómica en visita 1. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Aspergillus visita 1 Positivo 3 (4,4) 4 (5,9) 7 (10,3) Negativo 19 (27,9) 42 (61,8) 61 (89,7) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.531 – 113 – Tabla 55. Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento de Pneumocystis por metagenómica en visita 1. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Pneumocystis visita 1 Positivo 7 (10,3) 18 (26,5) 25 (36,8) Negativo 15 (22) 28 (41,2) 43 (63,2) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.559 Tabla 56. Relación entre colonización intermitente previa por Staphylococcus y aislamiento de Candida por metagenómica en visita 1. Colonización intermitente Staphylococcus Total Positivo Negativo Candida visita 1 Positivo 9 (13,2) 17 (25) 42 (61,8) Negativo 13 (19,1) 29 (42,6) 26 (38,2) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.754 – 114 – Tabla 57.Relación entre colonización intermitente previa por Staphylococcus y aislamiento de Aspergillus por metagenómica en visita 1. Colonización intermitente Staphylococcus Total Positivo Negativo Aspergillus visita 1 Positivo 2 (2,9) 5 (7,4) 7 (10,3) Negativo 20 (29,4) 41 (60.3) 61 (89,7) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.821 Tabla 58. Relación entre colonización intermitente previa por Staphylococcus y aislamiento de Pneumocystis por metagenómica en visita 1. Colonización intermitente Staphylococcus Total Positivo Negativo Pneumocystis visita 1 Positivo 10 (14,7) 15 (22,1) 25 (36,8) Negativo 12 (17,6) 31 (45,6) 43 (63,2) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.304 – 115 – Tabla 59. Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento de Aspergillus por metagenómica en visita 2. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Aspergillus visita 2 Positivo 3 (4,4) 0 (0) 3 (4,4) Negativo 19 (27,9) 44 (64,7) 63 (92,6) No realizado 0 (0) 2 (2,9) 2 (2,9) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.025 Tabla 60. Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento de Candida por metagenómica en visita 3. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Candida visita 3 Positivo 5 (7,4) 12 (17,6) 17 (25) Negativo 11 (16,2) 18 (26,4) 29 (42,6) No realizado 6 (8,8) 16 (23,6) 22 (32,4) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.691 – 116 – Tabla 61. Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento de Aspergillus por metagenómica en visita 3. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Aspergillus visita 3 Positivo 1 (1,45) 1 (1,45) 2(2,9) Negativo 15 (22,1) 29 (42,6) 44 (64,7) No realizado 6 (8,8) 16 (25,6) 22 (32,4) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.739 Tabla 62. Relación entre colonización crónica previa por Staphylococcus y aislamiento de Pneumocystis por metagenómica en visita 3. Colonización crónica Staphylococcus Total Positivo Negativo Pneumocystis visita 3 Positivo 4 (5,9) 17 (25) 21 (30,9) Negativo 16 (23,5) 21 (30,9) 37 (54,4) No realizado 2 (2,9) 8 (11,8) 10 (14,7) Total 22 (32,4) 46 (67,6) 68 (100) Datos expresados en frecuencias absolutas (relativas). Porcentajes expresados con respecto a la cohorte completa. Valor p no significativo por Chicuadrado:0.111 – 123 – La relación entre los resultados de la metagenómica para Candida en la visita 3 con respecto a la visita 1 y variables clínicas se presentan en la Tabla 72. La comorbilidad asociada a la FQ, intolerancia a la glucosa, Δ IMC y Δ FEV1/FVC presentaron una relación cercana a la significación estadística. En la Tabla 73, se observa la relación entre los resultados de la metagenómica para Pneumocystis en lavisita 3 con respecto a la visita 1 y variables clínicas.En ella podemos ver que muestran una relación cercana a la significación estadística en FEV1/FVC, Δ FVC en valores absoluto, Hemoglobina y el tratamiento con Azitromicina oral de manera pautada en los 6 meses previos. Figura 20. Evolución funcional de la FVC durante el año de seguimiento. – 124 – Figura 21. Evolución funcional del FEV1 durante el año de seguimiento. – 125 – Tabla 68. Relación entre los resultados de la metagenómica en visita 1 y variables clínicas basales. Característicaclínicas Metagenómica visita 1 Valor p* Positivo Negativo Datos clínicos Edad (años) 20 (9) 23 (11) 0,376 Sexo (hombres) 17 (37,0) 13 (59,1) 0,085 IMC (kg/m2) 19,1 (3,3) 19,4 (2,9) 0,681 Índice BHALLA 14,6 (6,1) 14,9 (5,4) 0,846 Exacerbaciones año previo 3,4 (2,3) 2,7 (2,1) 0,261 Exacerbaciones año siguiente 3,9 (2,6) 3,1 (2,4) 0,200 Mutaciones Phe508del homocigoto 16 (34,8) 8 (36,4) 0,898 Phe508del heterocigoto 19 (41,3) 9 (40,9) 0,975 Gly542* homocigoto 0 (0) 0 (0) NS Gly542* heterocigoto 7 (15,2) 3 (13,6) 0,863 Arg334Trp homocigoto 0 (0) 0 (0) NS Arg334Trp heterocigoto 5 (10,9) 4 (18,2) 0,405 Comorbilidades Insuficiencia pancreática 34 (73,9) 12 (54,5) 0,110 DMRFQ 9 (19,6) 1 (4,5) 0,102 Intolerancia a la glucosa 21 (45,7) 11 (50,0) 0,737 Hepatopatía asociada a la FQ 8 (17,4) 4 (18,2) 0,936 ABPA 2 (4,3) 1 (4,5) 0,970 Espirometría FVC (ml) 2433 (914) 3017 (1371) 0,080 FVC (%) 76,9 (20,2) 82,1 (27,3) 0,383 FEV 1 (ml) 1504 (617) 2020 (1128) 0,055 FEV 1 (%) 57,1 (21,7) 64,8 (29,9) 0,225 FEV 1 /FVC 61,3 (11,1) 63,8 (11,9) 0,405 – 126 – Característicaclínicas Metagenómica visita 1 Valor p* Positivo Negativo Pruebas analíticas IgE Total (KU/l) 362 (827) 636 (1122) 0,318 IgE m3A. fumigatus (KUA/l) 8,8 (22,4) 10,9 (22,5) 0,715 IgGA.fumigatus (mgA/l) 55,3 (40,1) 50,4 (36,6) 0,638 Hemoglobina (g/dl) 13,7 (1,2) 13,9 (1,1) 0,658 Leucocitos (x109/l) 9,1 (3,1) 8,6 (1,9) 0,593 Neutrófilos (x109/l) 5,4 (2,7) 5,1 (1,6) 0,554 Eosinófilos (x109/l) 0,2 (0,1) 0,2 (0,1) 0,235 Creatinina (mg/dl) 0,61 (0,2) 0,66 (0,1) 0,331 Tratamientos previos Corticoides inhalados 21 (45,7) 4 (18,2) 0,028 Corticoides orales 1 (2,2) 0 (0) 0,486 Antibiótico oral 39 (84,8) 19 (86,4) 0,863 Antibiótico inhalado 39 (84,8) 17 (77,3) 0,447 Antibiótico intravenoso 8 (17,4) 2 (9,1) 0,366 Azitromicina oral 23 (50,0) 6 (27,3) 0,076 Datos expresados en media (desviación estándar) o frecuencias absolutas (relativas), según la naturaleza de la variable. Porcentajes referidos por columnas. * Calculado mediante Chi-cuadrado o t de Student para datos independientes según la naturaleza de la variable. Se marcan en gris las relaciones con una p < 0,1. IMC: índice de masa corporal. ABPA: Aspergilosis broncopulmonar alérgica. FVC: Capacidad vital forzada. FEV1: volumen espirado forzado en el primer segundo. – 127 – Tabla 69. Relación entre los resultados de la metagenómica en visita 2 con respecto a visita 1 y las variables clínicas. Característica clínicas Metagenómicaen visita 2 con respecto a la visita 1 Valor p* Negativos (n=11) Adquiere (n=9) Pierde (n=15) Positivos (n=31) Datos clínicos Edad (años) 24,7 (13,0) 20,3 (9,4) 22,2 (8,3) 20,1 (9,4) 0,583 Sexo (hombres) 8 (72,7)† 5 (55,6) 3 (20,0)† 14 (45,2) 0,055 IMC (kg/m2) 19,6 (3,4) 19,6 (2,4) 19,2 (3,2) 19,1 (3,3) 0,969 Índice BHALLA 15,1 (4,2) 16,8 (5,2) 12,7 (6,8) 15,6 (5,6) 0,322 Exacerbaciones año previo 2,2 (1,5) 2,5 (2,4) 3,1 (2,2) 3,5 (2,3) 0,382 Exacerbaciones año siguiente 3,1 (1,8) 2,8 (3,1) 4,0 (2,8) 3,9 (2,5) 0,632 Mutaciones Phe508del homocigoto 3 (27,3) 4 (44,4) 3 (20,0) 13 (41,9) 0,426 Phe508del heterocigoto 5 (45,5) 4 (44,4) 7 (46,7) 12 (38,7) 0,952 Gly542* heterocigoto 1 (9,1) 1 (11,1) 5 (33,3)† 2 (6,5) 0,088 Arg334Trp heterocigoto 2 (18,2) 1 (11,1) 1 (6,7) 4 (12,9) 0,844 Comorbilidades Insuficiencia pancreática 6 (54,5) 5 (55,6) 13 (86,7) 21 (67,7) 0,265 Diabetes mellitus 0 (0) 1 (11,1) 5 (33,3) 4 (12,9) 0,109 Intolerancia a la glucosa 7 (63,6) 2 (22,2) 8 (53,3) 13 (41,9) 0,266 Hepatopatía asociada a la FQ 2 (18,2) 1 (11,1) 3 (20,0) 5 (16,1) 0,951 ABPA 0 (0) 1 (11,1) 0 (0) 2 (6,5) 0,495 Espirometría FVC (ml) 3346 (1012) 3281 (1622) 2477 (924) 2548 (1029) 0,082 FVC (%) 85,2 (17,3) 88,6 (24,1) 73,7 (20,1) 77,7 (23,9) 0,365 FEV 1 (ml) 2229 (878) 2230 (1334) 1582 (687) 1532 (710) 0,039 FEV 1 (%) 66,7 (21,4) 71,5 (25,6) 53,5 (19,4) 56,4 (25,3) 0,213 FEV 1 /FVC 64,9 (10,9) 66,2 (10,1) 60,6 (10,9) 60,3 (13,2) 0,523 – 128 – Característica clínicas Metagenómicaen visita 2 con respecto a la visita 1 Valor p* Negativos (n=11) Adquiere (n=9) Pierde (n=15) Positivos (n=31) Pruebas analíticas IgE Total (KU/l) 429 (531) 371 (658) 82 (79) 312 (228) 0,240 IgE m3A. fumigatus (KUA/l) 9,8 (21,9) 9,3 (17,4) 0,68 (0,63) 7,4 (8,4) 0,684 IgGA.fumigatus (mgA/l) 37,7 (32,7) 42,0 (24,8) 76,7 (69,5) 49,1 (48,9) 0,532 Hemoglobina (g/dl) 14,1 (1,2) 14,3 (2,0) 13,5 (1,0) 13,9 (1,4) 0,733 Leucocitos (x109/l) 8,9 (2,1) 8,6 (1,4) 9,8 (2,0) 8,8 (2,8) 0,698 Neutrófilos (x109/l) 5,1 (1,5) 5,9 (1,4) 6,4 (2,2) 5,3 (2,3) 0,473 Eosinófilos (x109/l) 0,3 (0,1) 0,1 (0,8) 0,2 (0,1) 0,2 (0,1) 0,040 Creatinina (mg/dl) 0,7 (0,1) 0,6 (0,1) 0,6 (0,2) 0,6 (0,1) 0,486 Tratamientos previos Corticoides inhalados 2 (18,2) 2 (22,2) 8 (53,3) 13 (41,9) 0,213 Corticoides orales 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (3,2) 0,766 Antibiótico oral 10 (90,9) 7 (77,8) 13 (86,7) 26 (83,9) 0,867 Antibiótico inhalado 9 (81,8) 6 (66,7) 12 (80,0) 27 (87,1) 0,572 Antibiótico intravenoso 1 (9,1) 0 (0) 2 (13,3) 6 (19,4) 0,480 Azitromicina oral 1 (9,1) † 3 (33,3) 8 (53,3) 15 (48,8) 0,090 Datos expresados en media (desviación estándar) o frecuencias absolutas (relativas), según la naturaleza de la variable. Porcentajes referidos por columnas.* Calculado mediante prueba de ANOVA para datos independientes según la naturaleza de la variable.† p < 0,05 según corrección de Bonferroni o Chi-cuadrado.Se marcan en gris las relaciones con una p < 0,1. IMC: índice de masa corporal. ABPA: Aspergilosis broncopulmonar alérgica. FVC: Capacidad vital forzada. FEV1: volumen espirado forzado en el primer segundo. – 129 – Tabla 70. Relación entre los resultados de la metagenómica en visita 3 con respecto a la visita 2 y variables clínicas. Característica clínicas Metagenómica en visita 3 respecto a la visita 2 Valor p* Negativos (n=5) Adquiere (n=11) Pierde (n=11) Positivos (n=19) Datos clínicos Edad (años) 25,8 (4,4) 20,4 (9,5) 23,0 (9,1) 19,3 (9,3) 0,456 Sexo (hombres) 1 (20,0) 4 (36,4) 6 (54,5) 9 (47,4) 0,570 IMC (kg/m2) 21,5 (2,5) 18,3 (2,9) 20,2 (2,2) 19,3 (3,7) 0,319 Índice BHALLA 13,6 (4,5) 12,4 (6,2) 16,6 (4,4) 16,2 (5,1) 0,209 Exacerbaciones año previo 1,6 (0,8) 4,0 (2,2) 3,1 (1,8) 3,6 (2,8) 0,283 Exacerbaciones año siguiente 2,0 (0) 4,7 (2,8) 2,6 (1,7) 4,5 (2,8) 0,079 Mutaciones Phe508del homocigoto 1 (20,0) 4 (36,4) 4 (36,4) 9 (47,4) 0,710 Phe508del heterocigoto 2 (40,0) 5 (45,5) 2 (18,2) 8 (42,1) 0,542 Gly542* heterocigoto 2 (40,0) 2 (18,2) 2 (18,2) 0 (0) † 0,087 Arg334Trp heterocigoto 0 (0) 1 (9,1) 1 (9,1) 3 (15,8) 0,764 Comorbilidades Insuficiencia pancreática 0 (0) 0 (0) 2 (18,2) 1 (5,3) 0,306 DMRFQ 1 (20,0) 3 (27,3) 2 (18,2) 3 (15,8) 0,896 Intolerancia a la glucosa 3 (60,0) 6 (54,5) 5 (45,5) 6 (31,6) 0,529 Hepatopatía asociada a la FQ 1 (20,0) 3 (27,3) 1 (9,1) 2 (10,5) 0,578 ABPA 4 (80,0) 9 (81,8) 6 (54,5) 13 (68,4) 0,528 Espirometría FVC (ml) 2877 (648) 2276 (569) 3296 (1471) 2576 (931) 0,134 FVC (%) 76,9 (11,8) 72,0 (14,1) 85,2 (25,8) 77,7 (23,2) 0,568 FEV 1 (ml) 1692 (449) 1431 (532) 2098 (1285) 1631 (643) 0,307 FEV 1 (%) 53,6 (16,6) 50,8 (15,5) 64,2 (31,2) 58,5 (22,6) 0,585 FEV 1 /FVC 58,9 (9,8) 60,5 (10,6) 61,4 (13,9) 64,1 (13,3) 0,823 – 130 – Característica clínicas Metagenómica en visita 3 respecto a la visita 2 Valor p* Negativos (n=5) Adquiere (n=11) Pierde (n=11) Positivos (n=19) Pruebas analíticas IgE Total (KU/l) 205 (239) 215 (173) 1066 (1410) 238 (170) 0,685 IgE m3A. fumigatus (KUA/l) 4,1 (4,8) 6,6 (6.0) 15,1 (13,8) 5,1 (6,1) 0,530 IgGA.fumigatus (mgA/l) 71,9 (52,8) 51,1 (33,7) 107 (51,3) 45,4 (30,3) 0,052 Hemoglobina (g/dl) 13,7 (0,5) 14,1 (1,2) 14,0 (1,7) 13,6 (1,9) 0,854 Leucocitos (x109/l) 7,5 (0,1) 8,6 (2,5) 8,7 (2,3) 8,5 (3,9) 0,955 Neutrófilos (x109/l) 4,5 (0,8) 5,0 (1,8) 5,5 (2,3) 5,0 (3,5) 0,955 Eosinófilos (x109/l) 0,5 (0,2) 0,2 (0,1) 0,2 (0,1) 0,4 (0,2) 0,087 Creatinina (mg/dl) 0,7 (0,2) 0,6 (0,1) 0,6 (0,2) 0,6 (0,1) 0,564 Tratamientos previos Corticoides inhalados 3 (75,0) 4 (36,4) 5 (45,5) 8 (44,4) 0,619 Corticoides orales 0 (0) 0 (0) 1 (9,1) 1 (5,6) 0,734 Antibiótico oral 4 (80,0) 11 (100) 8 (72,7) 18 (94,7) 0,142 Antibiótico inhalado 4 (80,0) 10 (90,9) 10 (90,9) 16 (84,2) 0,887 Antibiótico intravenoso 1 (20,0) 1 (9,1) 2 (18,2) 3 (15,8) 0,921 Azitromicina oral 4 (80,0) 8 (72,7) 6 (54,5) 13 (68,4) 0,720 Datos expresados en media (desviación estándar) o frecuencias absolutas (relativas), según la naturaleza de la variable. Porcentajes referidos por columnas.* Calculado mediante prueba de ANOVA para datos independientes según la naturaleza de la variable. † p < 0,05 según corrección de Bonferroni o Chi-cuadrado. Se marcan en gris las relaciones con una p < 0,1.IMC: índice de masa corporal. ABPA: Aspergilosis broncopulmonar alérgica. FVC: Capacidad vital forzada. FEV1: volumen espirado forzado en el primer segundo. – 131 – Tabla 71. Relación entre los resultados de la metagenómica en visita 3 con respecto a la visita 1 y variables clínicas. Característica clínicas Metagenómica en visita 3 respecto a la visita 1 Valor p* Negativos (n=4) Adquiere (n=6) Pierde (n=22) Positivos (n=24) Datos clínicos Edad (años) 19,2 (10,8) 21,3 (8,8) 22,3 (8,4) 19,3 (9,5) 0,714 Sexo (hombres) 3 (75,0) 3 (50,0) 7 (31,8) 10 (41,7) 0,410 Índice BHALLA 18,0 (3,1) 12,8 (5,0) 14,0 (6,4) 15,1 (6,0) 0,555 Exacerbaciones año previo 3,0 (2,9) 2,6 (1,6) 2,6 (1,4) 4,0 (2,7) 0,304 Exacerbaciones año siguiente 1,5 (1,9) 4,3 (2,7) 3,1 (2,1) 4,6 (2,8) 0,076 Mutaciones Phe508del homocigoto 2 (50,0) 2 (33,3) 5 (22,7) 11 (45,8) 0,383 Phe508del heterocigoto 1 (25,0) 4 (66,7) 10 (45,5) 9 (37,5) 0,522 Gly542* heterocigoto 1 (25,0) 0 (0) 5 (22,7) 2 (8,7) 0,341 Arg334Trp heterocigoto 0 (0) 2 (33,3) 3 (13,6) 2 (8,3) 0,339 Comorbilidades Insuficiencia pancreática 3 (75,0) 2 (33,3) † 14 (63,6) 20 (83,3) 0,098 DMRFQ 1 (25,0) 0 (0) 3 (13,6) 6 (25,0) 0,467 Intolerancia a la glucosa 2 (50,0) 2 (33,3) 11 (50,0) 10 (41,7) 0,874 Hepatopatía asociada a la FQ 0 (0) 1 (16,7) 4 (18,2) 4 (16,7) 0,838 ABPA 0 (0) 1 (16,7) 2 (9,1) 0 (0) 0,295 Espirometría IMC (kg/m2) 20,4 (1,7) 19,0 (1,4) 19,8 (2,8) 18,9 (3,8) 0,576 FVC (ml) 3963 (2542) 2575 (540) 2647 (942) 2426 (877) 0,721 FVC (%) 96,2 (32,8) 70,0 (15,6) 76,5 (19,9) 77,0 (21,1) 0,366 FEV 1 (ml) 2676 (2159) 1681 (559) 1539 (745) 1518 (619) 0,797 FEV 1 (%) 77,6 (41,3) 52,4 (12,8) 51,6 (22,4) 56,3 (21,9) 0,314 FEV 1 /FVC 65,3 (17,3) 64,1 (9,4) 56,7 (12,5) 62,3 (13,0) 0,380 – 132 – Característica clínicas Metagenómica en visita 3 respecto a la visita 1 Valor p* Negativos (n=4) Adquiere (n=6) Pierde (n=22) Positivos (n=24) Cambios espirometría Δ IMC (kg/m2) –0,2 (0,8) 0,4 (1,4) 0,8 (1,1) –0,07 (1,7) 0,220 Δ FVC (ml) 20 (105) –123 (439) 57 (358) 137 (371) 0,485 Δ FVC (%) –17,1 (23,0) –2,8 (10,0) 0,2 (10,7) –0,1 (13,2) 0,162 Δ FEV 1 (ml) 36 (172) –73 (352) –8 (329) 73 (334) 0,748 Δ FEV 1 (%) –15,1 (22,8) –1,3 (9,3) –2,9 (10,3) –2,9 (16,9) 0,535 Δ FEV 1 /FVC 1,8 (2,1) 1,9 (4,4) –1,9 (10,7) –0,6 (8,1) 0,766 Pruebas analíticas IgE Total (KU/l) 3463 () 245 (163) 311 (387) 222 (174) 0,000 IgE m3A. fumigatus (KUA/l) 23,8 () 3,5 (2,0) 6,6 (9,7) 6,3 (6,5) 0,196 IgGA.fumigatus (mgA/l) 133 () 46,1 (27,7) 88,4 (51,4) 48,5 (32,9) 0,047 Hemoglobina (g/dl) 14,6 (2,4) 12,9 (1,3) 13,4 (1,3) 14,1 (1,6) 0,346 Leucocitos (x109/l) 10,7 (1,7) 9,6 (3,1) 8,0 (2,0) 8,3 (3,3) 0,369 Neutrófilos (x109/l) 7,4 (2,1) 5,3 (2,3) 4,9 (1,7) 4,9 (3,0) 0,424 Eosinófilos (x109/l) 0,1 (0,2) 0,2 (0,1) 0,3 (0,2) 0,3 ()0,2 0,579 Creatinina (mg/dl) 0,5 (0,1) 0,6 (0,1) 0,6 (0,1) 0,6 (0,1) 0,576 Tratamientos previos Corticoides inhalados 1 (25,0) 3 (50,0) 10 (47,6) 9 (39,1) 0,808 Corticoides orales 0 (0) 1 (16,7) 1 (4,8) 0 (0) 0,269 Antibiótico oral 1 (25,0) † 6 (100) 21 (95,5) 23 (95,8) <0,001 Antibiótico inhalado 3 (75,0) 5 (83,3) 18 (81,8) 21 (87,5) 0,911 Antibiótico intravenoso 0 (0) 1 (16,7) 8 (36,4) 3 (12,5) 0,156 Azitromicina oral 1 (25,0) 5 (83,3) 16 (72,7) 16 (66,7) 0,233