Control de calidad de la exportación selectiva del retículo endoplásmico mediada por lípidos

Facultad de Biología Departamento de Biología Celular CONTROL DE CALIDAD DE LA EXPORTACIÓN SELECTIVA DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO MEDIADA POR LÍPIDOS TESIS DOCTORAL REALIZADA EN EL PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA INTEGRADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTORA POR DÑA. SUSANA SABIDO BOZO SEVILLA, 2022 La doctoranda Susana Sabido Bozo El director y tutor Manuel Muñiz Guinea 2 3 TABLA DE CONTENIDO ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................. 5 ABREVIATURAS ........................................................................................................ 7 RESUMEN ............................................................................................................... 11 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 13 1.1. La ruta secretora ................................................................................................. 15 1.1.1. Formación y ensamblaje de vesículas de transporte COPII ............................................. 16 1.1.2. Formación de los sitios de salida del retículo endoplásmico o ERES ............................... 18 1.2. Sorting de proteínas en la ruta secretora ............................................................. 19 1.2.1. Sorting de proteínas mediado por secuencias señal ........................................................ 20 1.2.2. Sorting de proteínas mediado por la composición lipídica diferencial de la membrana . 21 1.2.2.1. Composición lipídica de las membranas a lo largo de la ruta secretora ...................... 21 1.2.2.2. Segregación lateral de lípidos como mecanismo de sorting ........................................ 23 1.3. Exportación de las proteínas ancladas a GPI del RE .............................................. 27 1.3.1. Requisitos específicos de la maquinaria de cubierta COPII para el transporte de las proteínas ancladas a GPI .................................................................................................................... 30 1.3.1.1. El receptor p24............................................................................................................. 31 1.3.1.2. Remodelación del glicano del GPI ................................................................................ 33 1.3.2. Sorting de las proteínas ancladas a GPI previa exportación del RE.................................. 34 1.3.2.1. Remodelación lipídica del GPI ...................................................................................... 35 1.3.2.2. Síntesis y transporte de ceramida................................................................................ 36 1.3.2.3. Modelo de sorting de las proteínas ancladas a GPI dependiente de ceramida ........... 38 2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ........................................................................... 41 3. RESULTADOS ................................................................................................... 53 3.1. Análisis del papel de la ceramida presente en la estructura del GPI en la segregación y exportación selectiva de las proteínas ancladas a GPI a través de ERES específicos ..................................................................................................................... 55 3.1.1. La ceramida C26 incorporada al GPI por Cwh43 es necesaria para el clustering de Gas1 y su posterior exportación del RE ......................................................................................................... 55 3.1.2. Ted1 monitoriza la incorporación de ceramida C26 en el GPI de Gas1 para garantizar su exportación del RE ............................................................................................................................. 58 3.1.3. La segregación selectiva de Gas1 en ERES específicos depende de la remodelación de ceramida del GPI ................................................................................................................................ 68 3.2. Implicación del receptor p24 en el mecanismo de segregación selectiva de proteínas ancladas a GPI mediado por ceramidas ........................................................... 72 3.2.1. Los clusters de la proteína anclada a GPI Gas1 se localizan en zonas del RE con mayor grosor de membrana ......................................................................................................................... 72 3.2.1. Papel del dominio transmembrana de Emp24 en la formación de clusters de Gas1-GFP dependiente de ceramidas muy largas C26 ....................................................................................... 74 4. DISCUSIÓN ...................................................................................................... 81 4.1. Control de calidad ejercido sobre la segregación selectiva mediada por lípidos de las proteínas ancladas a GPI ........................................................................................... 83 4 4.2. ¿Cuál es el mecanismo responsable de esta segregación selectiva mediada por lípidos? .......................................................................................................................... 88 4.3. Segregación selectiva de proteínas ancladas a GPI en mamíferos ......................... 93 5. CONCLUSIONES ................................................................................................ 95 6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 99 6.1. Organismos y condiciones de cultivo ................................................................. 101 6.1.1. Cultivo de Escherichia coli .............................................................................................. 101 6.1.2. Cultivo de Saccharomyces cerevisiae ............................................................................. 101 6.2. Técnicas genéticas ............................................................................................ 104 6.2.1. Técnicas de manipulación de ADN ................................................................................. 104 6.2.1.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .............................................................. 104 6.2.1.2. Restricción enzimática y ligación de plásmidos o fragmentos de ADN ..................... 104 6.2.1.3. Separación y visualización de los fragmentos de AND en geles de agarosa .............. 105 6.2.2. Purificación de ADN desde Escherichia coli .................................................................... 105 6.2.3. Transformación de Escherichia coli ................................................................................ 106 6.2.4. Transformación de Saccharomyces cerevisiae ............................................................... 106 6.2.4.1. Método One Step ....................................................................................................... 106 6.2.4.2. Método Lithium Acetate/Single-Stranded Carrier DNA/Polyethylene Glycol ........... 106 6.2.5. Cruce, esporulación y disección de tétradas .................................................................. 107 6.2.6. Construcción de plásmidos ............................................................................................ 108 6.3. Técnicas bioquímicas ........................................................................................ 109 6.3.1. Extractos celulares de levadura ..................................................................................... 109 6.3.2. Electroforesis en geles de acril-amida ............................................................................ 110 6.3.3. Western blots y anticuerpos .......................................................................................... 110 6.3.4. Stripping ......................................................................................................................... 111 6.3.5. Ensayo de co-inmunoprecipitación ................................................................................ 112 6.3.6. Pulso y caza .................................................................................................................... 113 6.3.7. Análisis de la composición lipídica celular in vivo .......................................................... 113 6.4. Análisis del glicano del GPI por espectrometría de masas ................................... 114 6.5. Microscopía de fluorescencia ............................................................................ 115 6.5.1. Fluorescencia convencional ........................................................................................... 115 6.5.2. Super Resolution Confocal Live Image Microscopy (SCLIM) ........................................... 115 6.6. Análisis estadístico ............................................................................................ 116 7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 117 5 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Transporte intracelular ________________________________________________ 16 Figura 2. Ensamblaje de la cubierta COPII en la membrana del RE ______________________ 17 Figura 3. Los ERES están íntimamente relacionados con el primer compartimento post-RE __ 19 Figura 4. Las membranas de la ruta secretora temprana y tardía tienen una composición lipídica y unas propiedades físicas opuestas _______________________________________ 22 Figura 5. Organización de dominios lipídicos en la membrana _________________________ 25 Figura 6. Balsas lipídicas y proteínas ancladas a GPI _________________________________ 26 Figura 7. Estructura del GPI ____________________________________________________ 27 Figura 8. Biosíntesis del precursor del GPI y su transferencia a la proteína aceptora en la membrana del RE en levaduras _________________________________________________ 28 Figura 9. Las proteínas ancladas a GPI son segregadas del resto de proteínas de superficie durante su transporte a lo largo de la ruta secretora ________________________________ 29 Figura 10. Las proteínas ancladas a GPI son exportadas del RE por una maquinaria COPII especializada _______________________________________________________________ 30 Figura 11. La organización estructural de las proteínas de la familia p24 depende de la oligomerización de sus subunidades _____________________________________________ 32 Figura 12. La remodelación del GPI regula activamente el reclutamiento de una cubierta COPII especializada _______________________________________________________________ 34 Figura 13. Remodelación lipídica de las proteínas ancladas a GPI ______________________ 35 Figura 14. Síntesis de ceramida en levaduras ______________________________________ 36 Figura 15. Transporte de ceramida desde el RE hacia el Golgi en levaduras ______________ 37 Figura 16. Modelo: Las ceramidas de cadena muy larga C26 promoverían la formación de clusters de proteínas ancladas a GPI y su segregación previa exportación del RE __________ 39 Figura 17. La proteína anclada a GPI Gas1-GFP forma clusters y es segregada del resto de proteínas transmembrana en la membrana del RE __________________________________ 44 Figura 18. El clustering y sorting de las proteínas ancladas a GPI depende de la longitud de las ceramidas libres presentes en la membrana del RE _________________________________ 46 Figura 19. El clustering de Gas1-GFP depende de su interacción con el receptor p24 _______ 47 Figura 20. La ceramida se encuentra enriquecida alrededor de la porción citosólica del tallo transmembrana de Emp24_____________________________________________________ 49 Figura 21. Modelo: Clustering y sorting de las proteínas ancladas a GPI dependiente de las ceramidas muy largas C26 _____________________________________________________ 50 6 Figura 22. La deleción de CWH43 causa acumulación de la forma de RE de Gas1 __________ 56 Figura 23. Las cepas mutantes bst1Δ y Cwh43Δ son defectivas en la formación de clusters de Gas1-GFP __________________________________________________________________ 57 Figura 24. Los esfingolípidos complejos son sintetizados de forma normal en el mutante cwh43Δ ____________________________________________________________________ 58 Figura 25. La mutación gpi7Δ suprime el defecto de interacción entre Gas1-GFP y el complejo p24 causado por la deleción de CWH43 __________________________________________ 60 Figura 26. La mutación gpi7Δ suprime la acumulación de la forma de RE de Gas1 causada por cwh43Δ ____________________________________________________________________ 61 Figura 27. La mutación gpi7Δ es incapaz de restaurar el defecto de exportación de Gas1 causado por emp24Δ _________________________________________________________ 62 Figura 28. Análisis estructural del glicano del GPI de Gas1-GFP. ________________________ 64 Figura 29. La tasa de degradación de Gas1 no se vio afectada en el mutante cwh43Δ ______ 65 Figura 30. El mutante gpi7Δ anula la dependencia de ceramida para el transporte de las proteínas ancladas a GPI ______________________________________________________ 67 Figura 31. La proteína anclada a GPI Gas1-GFP que contiene DAG falla en la formación de clusters en el RE _____________________________________________________________ 68 Figura 32. La proteína anclada a GPI Gas1-GFP con DAG entra en los mismos ERES que la proteína transmembrana Mid2-iRFP _____________________________________________ 70 Figura 33. El marcador de mayor longitud mRFP-WALP29 muestra un patrón punteado que colocaliza con los clusters de Gas1-GFP _____________________________________________ 74 Figura 34. Generación de la construcción mutante Emp24-Inv ________________________ 75 Figura 35. Gas1 es retenido en el RE en el mutante emp24Δ Emp24-Inv _________________ 76 Figura 36. Gas1-GFP es incapaz de interaccionar con la versión mutante del receptor Emp24Inv ________________________________________________________________________ 77 Figura 37. El mutante Emp24-Inv afecta a la generación de clusters de Gas1-GFP _________ 78 Figura 38. La ausencia de ceramida mejora el transporte de Cwp2-VENUS en Emp24-Inv ___ 79 Figura 39. Modelo: Control de calidad sobre la segregación selectiva de las proteínas ancladas a GPI mediada por lípidos _____________________________________________________ 87 Figura 40. Modelo: Segregación de proteínas ancladas a GPI dependiente de la longitud del lípido mediado por el receptor p24 ______________________________________________ 89 7 ABREVIATURAS Acyl-PI Acil-fosfatidilinositol COPI Cubiertas COPI (COat Protein Complex I) COPII Cubiertas COPII (COat Protein Complex II) CPY Carboxipeptidasa Y DMSO Dimetil sulfóxido DRM Membranas resistentes a detergentes (Detergent resistant membranes) dNTP Desoxiribonucleótidos trifosfato DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilen-diamino tetraacético (EthyleneDiamine Tetraacetic Acid) ERAD Degradación asociada al RE (ER Associated Degradation) ERES Sitios de salida del RE (ER Exit Sites) ERGIC Compartimento intermedio (ER-to-Golgi intermediate Compartment) EtNP Etanolaminafosfato (Ethanolamine-phosphate) GAP Proteína aceleradora de la actividad GTPasa (GTPase Accelerating Protein) GDP Guanosín difosfato GEF Factor intercambiador de nucleótidos de guanina (Guanine nucleotide Exchange Factor) GFP Proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein) GlcN Glucosamina Golgi Aparato de Golgi GPI Glicosil-fosfaditilinositol (Glycosylphosphatidylinositol) GST Glutatión-S-transferasa GTP Guanosín trifosfato HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)1-piperazina-etanosulfónico IPC Inositol-fosfoceramida (InositolPhospho-Ceramide) LCB Bases de cadena larga (Long Chain Bases) 8 Man Manosa MIPC Manosa-inositolfosfoceramida M(IP)2C Inositolfosfo-manosa-inositolfosfo-ceramida PBS Tampón fosfato salino (Phosphate Buffered Saline) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) PEG Polietilenglicol pG1 Fosfatidilinositol PI Fosfatidilinositol PM Membrana plasmática (Plasma Membrane) PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PhenylMethylSulfonyl Fluoride) RE Retículo endoplásmico SC Medio de cultivo sintético completo para levaduras (Synthetic Complete) SCLIM Super Resolution confocal Live-Imaging Microscopy SDS Dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulfate) SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS PoliAcrilamide Gel Electrophoresis) TGN Red Trans-Golgi (Trans Golgi Network) TMD Dominio transmembrana (Transmembrane Domain) TRIS Tris-(hidroximetil)-aminometano TX-100 Tritón X-100 VLCFA Ácidos grasos de cadena muy larga (Very Long Chain Fatty Acids) WB Western Blot Wt Silvestre (Wild type) YNB Bases nitrogenadas de levaduras (Yeast Nitrogen Base) YPD Medio de cultivo completo para levaduras (Yeast extract Peptone Dextrose) 9 Nota Bene → Debido a la ausencia de términos que abarquen de forma correcta el significado de los siguientes conceptos y la dificultad de adaptar tales expresiones al español, las siguientes palabras serán usadas en inglés de forma recursiva a lo largo del presente texto: - Sorting: exportación y transporte selectivo a lo largo de la ruta secretora de las distintas proteínas o especies lipídicas que repercute de forma directa en el destino funcional. - Clustering: Segregación lateral y agrupación selectiva de determinados componentes de la membrana lipídica que los separa del resto. INTRODUCCIÓN 16 1.1.1. Formación y ensamblaje de vesículas de transporte COPII Una vez las proteínas han completado su síntesis, maduración y plegamiento en el RE, están listas para ser exportadas al Aparato de Golgi en vesículas COPII. Estas vesículas de transporte se forman cuando el complejo proteico citosólico de cubierta COPII deforma la membrana del RE en unos dominios especializados denominados sitios de salida o ERES (ER Exit Sites) (Figura 2). Tras su escisión, estas vesículas COPII se fusionan con la membrana del Golgi, liberando allí su carga y completando el primer paso del transporte anterógrado (Barlowe & Miller, 2013). El ensamblaje comienza con el reclutamiento de la GTPasa monomérica Sar1, la cual es activada gracias a la proteína integral de membrana Sec12, que actúa como GEF (Guanosine Exchange Factor) de Sar1 produciendo el intercambio de GDP por GTP (Barlowe & Schekman, 1993). Una vez activada, Sar1 despliega una α-hélice anfipática que permite su integración en la membrana del RE (Lee et al., 2005). Sar1-GTP recluta a la capa interna de la cubierta, formada por el heterodímero Sec23-Sec24, gracias a su Figura 1. Transporte intracelular El esquema representa los diferentes compartimentos que componen la ruta secretora y endocítica. El flujo de transporte se encuentra indicado por flechas. Los colores representan la localización de las principales cubiertas responsables de la formación de las vesículas. La cubierta COPII (azul) media el transporte desde el RE hacia el aparato de Golgi. La cubierta COPI (rojo) está involucrada en el transporte retrógrado entre las distintas cisternas del Golgi así como el transporte Golgi-RE. Los transportadores de clatrina (naranja) son responsables del transporte post-Golgi. Figura extraída de (Bonifacino & Glick, 2004). INTRODUCCIÓN 17 interacción con la subunidad Sec23. Sec24 es la responsable de interaccionar y capturar selectivamente al cargo, mientras que Sec23 actúa como proteína estimuladora de la actividad GTPásica (GAP: GTPase Accelerating Protein) de Sar1. Una vez formado este complejo cebador o prebudding complex constituido por Sar1-Sec23-Sec24-cargo, el heterotetrámero Sec13-Sec31 es reclutado a través de su interacción con Sec23 para formar la capa externa de la cubierta COPII (Sato & Nakano, 2005). Esta capa externa promueve curvatura y rigidez a la membrana, lo que favorece la formación de las vesículas, cuya escisión final depende de la hidrólisis de GTP por Sar1. Por su parte, se ha propuesto que Sec16 podría actuar como una plataforma para la formación de estas vesículas COPII al unir los distintos componentes de la cubierta, lo que podría contribuir a la organización de los ERES (Kurokawa & Nakano, 2019). Otros estudios sugieren que podría regular la formación de las vesículas COPII controlando la actividad GAP sobre Sar1 junto con Sec12 (Kung et al., 2012; Yorimitsu & Sato, 2012). Figura 2. Ensamblaje de la cubierta COPII en la membrana del RE El ensamblaje de esta maquinaria comienza con el reclutamiento de la GTPasa monomérica Sar1, que es cargada con GTP gracias a la proteína de membrana Sec12. Esto conduce a la inserción de Sar1 en la membrana del RE y el reclutamiento del heterodímero Sec23-Sec24, a través de la interacción con Sec23, dando lugar al complejo de prebudding. Mientras que Sec23 constituye la proteína activadora de la GTPasa, Sec24 es el elemento a través del cual la cubierta une los diferentes cargos. A continuación, se recluta el heterotetrámero Sec13-Sec31 que formará la capa externa de la envoltura y se encargará de dar rigidez y curvatura a la membrana, respectivamente. Cuando la cubierta se encuentra completamente ensamblada se alcanza el máximo de actividad de la GTPasa, dando lugar a la escisión de la vesícula. La proteína Sec16 ayuda a la formación de las vesículas actuando como plataforma para los diferentes componentes de la cubierta COPII. Figura adaptada de (D'Arcangelo et al., 2013). INTRODUCCIÓN 18 1.1.2. Formación de los sitios de salida del retículo endoplásmico o ERES A pesar de que la maquinaria de cubierta COPII ha sido caracterizada al detalle, los mecanismos que rigen la organización estructural y funcional de los ERES son aún desconocidos. El número y la organización espacial de los ERES difiere en distintas especies, pero parecen correlacionar con la organización del Aparato de Golgi (Figura 3). Las células de vertebrados contienen una única estructura compleja que conforma el Golgi, formando una cinta con todas las pilas de cisternas (cis, medial y trans), quedando estrechamente unidas las unas a las otras. Estas células muestran cientos de ERES en la membrana del RE distribuidos por toda la célula, por lo que la mayoría de ellos quedan lejos de las cisternas del Golgi, sin embargo, son capaces de interaccionar funcionalmente con el compartimento intermedio ER-Golgi (ERGIC) (Budnik & Stephens, 2009). Por su parte, en la levadura S. cerevisiae el Golgi no se encuentra organizado en pilas, sino que las cisternas individuales se encuentran distribuidas por todo el citoplasma (Losev et al., 2006) y los ERES tienen una mayor probabilidad de encontrarse cerca de las cisternas cis que de las trans (Okamoto et al., 2012; Shindiapina & Barlowe, 2010). Es decir, esto sugiere que los ERES se encuentran íntimamente ligados al primer compartimento post-ER, lo que podría generar una unidad funcional para transportar el cargo desde el RE hacia el Golgi. Además, en S. cerevisiae los ERES muestran una alta colocalización con Rtn1, proteína que se encuentra en las zonas de alta curvatura en la membrana del RE, lo que sugiere que los ERES se organizan preferencialmente en dominios de alta curvatura (De Craene et al., 2006; Voeltz et al., 2006). Es más, se ha observado que los ERES aparecen concretamente, en zonas del RE que poseen tanto curvatura negativa como positiva, probablemente debido a la presencia de lípidos con diferentes estructuras. Dado que la formación de vesículas requiere no solo curvatura positiva, sino también negativa para constreñir el cuello de la vesícula naciente, estas zonas del RE donde preferentemente se forman los ERES podrían facilitar la formación de vesículas COPII (Okamoto et al., 2012). INTRODUCCIÓN 19 1.2. Sorting de proteínas en la ruta secretora El proceso para dirigir cada proteína individual a su localización funcional específica dentro de la célula se conoce como sorting de proteínas y es esencial para el mantenimiento de la compartimentalización celular y la homeostasis. Para realizar su función correctamente las proteínas deben alcanzar su destino final, de hecho, se sabe que un gran número de enfermedades, desde genéticas hasta neurodegenerativas, están relacionadas directa o indirectamente con fallos en los procesos de sorting. De esta manera, entender los mecanismos que rigen este sorting de proteínas a través de la ruta secretora se ha convertido en un objetivo de gran importancia tanto en la investigación básica como biomédica. Figura 3. Los ERES están íntimamente relacionados con el primer compartimento post-RE El aparato de Golgi en células de vertebrados se representa como una única cinta, compuesta por cisternas cis, medial y trans conectadas estrechamente las unas a las otras. Los ERES se encuentran representados como puntos rojos en la membrana del RE, la mayoría de los cuales parecen distantes de las cisternas del Golgi, pero cerca del ERGIC (puntos verdes). En las células de S. cerevisiae las cisternas del Golgi se encuentran distribuidas por todo el citoplasma, donde las cisternas cis (verde) se encuentran habitualmente cerca de los ERES (puntos rojos), los cuales están localizados en las regiones de alta curvatura del RE. Figura adaptada de (Kurokawa & Nakano, 2019). INTRODUCCIÓN 20 1.2.1. Sorting de proteínas mediado por secuencias señal En la ruta secretora las proteínas son transportadas entre los diferentes orgánulos gracias a transportadores como las vesículas lipídicas. Sin embargo, los mecanismos de sorting por los cuales las diferentes proteínas son incorporadas en las vesículas de transporte de forma selectiva no están completamente establecidos. Se sabe que algunas proteínas de secreción altamente abundantes, como la albúmina, se incorporan en las vesículas de forma pasiva e inespecífica por un proceso denominado Bulk Flow (Thor et al., 2009), no obstante, la mayoría de proteínas dependen de una señal de sorting específica presente en su secuencia de aminoácidos (aa). Esta secuencia señal es reconocida directa o indirectamente por los componentes de la cubierta, lo que permite su incorporación en las vesículas nacientes. En el caso de las vesículas COPII es la subunidad Sec24 la encargada del reclutamiento selectivo del cargo. Sec24 contiene diferentes dominios o bolsillos en su superficie capaces de reconocer distintas secuencias señal (Miller et al., 2003). Además, la existencia de diferentes isoformas (Sec24A-D en mamíferos y Lst1/Sfb3 y Iss1/Sfb2 en levaduras) aumenta aún más el repertorio de cargos distintos que la cubierta es capaz de incorporar en las vesículas. En el caso de las proteínas que no pueden interaccionar directamente con la cubierta, bien porque son completamente luminales o bien porque carecen de las señales adecuadas, existe una gran variedad de receptores de cargo que reconocen a estas proteínas y las conectan con Sec24 (D'Arcangelo et al., 2013; Geva & Schuldiner, 2014). Aun así, esta amplia diversidad por parte de la cubierta a la hora de interaccionar selectivamente con distintos tipos de cargos es insuficiente para explicar el sorting de la inmensa cantidad de proteínas diferentes que son sintetizadas en el RE, lo que sugiere la existencia de mecanismos de sorting adicionales. INTRODUCCIÓN 21 1.2.2. Sorting de proteínas mediado por la composición lipídica diferencial de la membrana La existencia de proteínas de secreción sin señal de sorting conocida indican que debe existir algún mecanismo adicional que contribuya a este fenómeno. En este sentido, se ha propuesto que la interacción de las proteínas con el entorno lipídico de las membranas podría jugar un papel importante. Este proceso dependería de las características físico-químicas de las proteínas de membrana y su interacción con las propiedades heterogéneas de las membranas de los distintos compartimentos. 1.2.2.1. Composición lipídica de las membranas a lo largo de la ruta secretora Los distintos orgánulos a través de la ruta secretora poseen diferencias significativas en su composición lipídica, lo cual contribuye a definir tanto su forma como sus funciones especializadas. Por tanto, la identidad de un compartimento dado dentro de la célula no solo se encuentra definido por la combinación de proteínas que lo forman, ya que las diferentes especies de lípidos pueden afectar a características físicas generales tales como la fluidez, el grosor, el grado de empaquetamiento, la carga superficial o, incluso, la curvatura de las membranas (Harayama & Riezman, 2018; van Meer et al., 2008) . La composición lipídica de los diferentes compartimentos viene dada por la combinación de las tres principales categorías de lípidos de membrana en eucariotas: fosfolípidos, esfingolípidos y esteroles (Holthuis & Menon, 2014). El RE, el primer paso en la ruta secretora, no solo es el principal productor de proteínas de la célula, sino que también se encarga de sintetizar la gran mayoría de los lípidos. En este orgánulo se fabrican una gran cantidad de fosfolípidos y esteroles, así como la ceramida, el precursor de los esfingolípidos. El RE proporciona la mayor parte de los lípidos de membrana tanto al Golgi como a la membrana plasmática, dada su baja capacidad de generar sus propios lípidos. Sin embargo, a pesar de este intercambio de material constante, estos orgánulos presentan claras diferencias en la composición de INTRODUCCIÓN 22 sus membranas. En primer lugar, los esteroles se encuentran en muy baja cantidad en el RE, a pesar de ser su lugar de producción, mientras que son bastante abundantes en el TGN y la membrana plasmática (van Meer et al., 2008). Por su parte, los esfingolípidos son sintetizados en el lumen del TGN gracias a la ceramida proporcionada por el RE y suelen acumularse en la membrana plasmática, al igual que los esteroles, mientras mantienen niveles bajos en el RE (Holthuis et al., 2001). Además, los fosfolípidos de la membrana plasmática contienen acilos más largos y saturados que los presentes en el RE (Figura 4). Figura 4. Las membranas de la ruta secretora temprana y tardía tienen una composición lipídica y unas propiedades físicas opuestas El RE posee membranas delgadas y poco empaquetadas con una carga neutra en la cara citoplásmica, cualidades adaptadas a sus funciones biosintéticas. Por su parte, la membrana plasmática, de manera contraria, es más gruesa, presenta un mayor empaquetamiento lipídico y cargas negativas en la cara citoplásmica, contribuyendo a sus funciones de barrera biológica. Este contraste en sus propiedades físicas se ve reflejado en la longitud (20 aa y 25 aa, respectivamente) y geometría de los dominios transmembranas (TMD) de sus proteínas residentes. Figura adaptada de (Holthuis & Menon, 2014). INTRODUCCIÓN 23 De esta manera, se genera un gradiente de composición lipídica desde una membrana delgada y poco empaquetada como la del RE, hacia membranas más gruesas y con un alto grado de empaquetamiento gracias a la sucesiva acumulación de especies lipídicas saturadas como los esfingolípidos y los esteroles, que contribuyen a proporcionar rigidez a la membrana plasmática favoreciendo sus funciones de barrera biológica. Este cambio en el grosor de las membranas debido al aumento en la concentración de esfingolípidos y esteroles se ve reflejado en la longitud y composición de los dominios transmembrana (TMDs) de las proteínas a lo largo de la ruta secretora. Los TMDs de las proteínas residentes en el RE y Golgi son significativamente más cortos que los de la membrana plasmática (Sharpe et al., 2010). 1.2.2.2. Segregación lateral de lípidos como mecanismo de sorting Para mantener esta organización diferencial de la composición lipídica a lo largo de la ruta secretora, los lípidos deben ser segregados de forma específica a su lugar de destino, al igual que las proteínas de secreción. El transporte lipídico entre compartimentos puede ocurrir, bien por transporte vesicular, o bien a través de proteínas transportadoras, las cuales suelen operar en los sitios de contacto entre las membranas del orgánulo aceptor y el donador (Holthuis & Menon, 2014). En este sentido, las vesículas pueden actuar como transportadores bidireccionales de una gran cantidad de lípidos, como constituyentes básicos de su propia membrana, lo cual podría contribuir en la segregación lipídica, por ejemplo, mediante la incorporación selectiva de esfingolípidos y esteroles en el transporte anterógrado o la exclusión de estos en el transporte retrógrado (Contreras et al., 2012). De hecho, ha sido demostrado que las vesículas de transporte retrógrado COPI se encuentran depletadas en colesterol y esfingomielina en células de mamífero, promoviendo la acumulación de esteroles y esfingolípidos aguas arriba del TGN (Brügger et al., 2000). Además, análisis lipidómicos revelaron que las vesículas de transporte anterógrado contenían mayores niveles de esteroles y esfingolípidos que su orgánulo donador en células de levadura (Klemm et al., 2009). Esta acumulación selectiva de ciertos lípidos en las vesículas de transporte podría estar mediado por sus propiedades físico-químicas intrínsecas. INTRODUCCIÓN 24 Los lípidos con ácidos grasos largos y saturados hacen a la membrana más gruesa y menos fluida debido al alto empaquetamiento de sus colas hidrofóbicas e interacciones lípido-lípido más fuertes. De manera contraria, los lípidos insaturados previenen este empaquetamiento. En membranas artificiales, los lípidos saturados, los insaturados y el colesterol segregan en diferentes fases generando regiones con un alto empaquetamiento lipídico, conocidas como regiones de lípidos ordenadas (Lo: Liquidordered domains), o regiones más desordenadas y fluidas (liquid-disordered domains) (van Meer et al., 2008)(Figura 5A). Esta separación local en fases constituye la base de la teoría altamente debatida de las balsas lipídicas, la cual defiende que la interacción preferencial entre esfingolípidos y esteroles por puentes de hidrógeno podría favorecer la formación de dominios lipídicos altamente empaquetados que flotarían en un entorno más fluido de fosfolípidos insaturados (Sezgin et al., 2017). Estas balsas lipídicas favorecerían la formación de clusters de determinadas proteínas en estos dominios especializados de lípidos ordenados lo cual contribuiría al sorting de las proteínas de secreción a su localización celular específica (Simons & Sampaio, 2011). Es más, se sabe que la longitud del TMD de las proteínas debe coincidir con el grosor de su membrana de residencia (Bretscher & Munro, 1993). Dado que se piensa que estas balsas lipídicas presentan un mayor grosor que la membrana que los rodea, este desfase hidrofóbico favorecería que proteínas con TMDs largos segregaran junto a estos dominios lipídicos a lo largo de la ruta secretora (Figura 5B). Sin embargo, la existencia de estos dominios aún no ha sido demostrada por observación directa en células vivas (Levental & Veatch, 2016). Estas balsas lipídicas son habitualmente definidas por su resistencia a la extracción con detergentes in vitro, siendo encontradas en las fracciones de membrana resistentes a detergentes (DRM) (Brown & Rose, 1992; Schuck et al., 2003). No obstante, los tratamientos con detergentes pueden alterar su composición o incluso inducir esta separación en fases, por lo que los DRM no deben ser equiparados con las balsas lipídicas. Es más, resultados recientes sugieren que serían las propias proteínas las que reorganizarían los lípidos en torno a su TMD para evitar la exposición de sus residuos hidrofóbicos, actuando por tanto como cebadores en la generación de estos nanodominios, quedando los lípidos encargados de estabilizar y favorecer su expansión (Raghupathy et al., 2015) . INTRODUCCIÓN 25 La hipótesis de las balsas lipídicas fue inicialmente postulada para explicar el sorting de ciertas proteínas desde el TGN hacia la membrana apical, la cual está enriquecida en esfingolípidos y colesterol a diferencia de la membrana basolateral de células epiteliales polarizadas en mamíferos (Simons & Ikonen, 1997). Una de estas proteínas que segrega hacia la membrana apical son las proteínas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI), las cuales son proteínas luminales ancladas a la membrana a través de un glicolípido (Figura 6). Estas proteínas, debido a la presencia de lípidos de cadena saturada en la estructura del GPI, son encontradas en DRM, por lo que suelen ser consideradas como modelos para el estudio de la segregación de proteínas en balsas lipídicas (Pike, 2006). Figura 5. Organización de dominios lipídicos en la membrana (A) Organización de los lípidos de membrana en fases dependiendo de su grado de saturación y longitud. Se generarían dominios ordenados constituidos por lípidos largos y saturados, incluyendo el colesterol, que se encontrarían inmersos en un entorno de lípidos desordenados, cortos e insaturados. (B) Las proteínas transmembrana localizan en aquellos dominios de membrana cuya longitud coincida con la de su dominio transmembrana (TMD). La exposición de residuos hidrofóbicos en las proteínas con TMD largos produciría un desajuste hidrofóbico lo que favorecería su localización en dominios de membrana más largos y ordenados. Figura adaptada de (Sezgin et al., 2017). INTRODUCCIÓN 32 subfamilias de una misma rama en levadura (Marzioch et al., 1999). Sin embargo, en organismos pluricelulares se han descrito patrones de expresión diferencial específicos de tejido, en los que los diferentes miembros de cada subfamilia no son intercambiables entre sí (Carney & Bowen, 2004; Strating & Martens, 2009). Las proteínas p24 son proteínas transmembrana tipo I. Presentan un dominio luminal que contiene motivos de unión a proteínas carga y un tallo citosólico que muestra una gran afinidad para interaccionar con los complejos de cubierta COPII y COPI, estando ambas regiones conectadas por un único dominio transmembrana (TMD). A pesar de que el tallo citosólico representa sólo un pequeño porcentaje de la proteína, de 12 a 20 aminoácidos, es en esta región donde se localizan las señales responsables del movimiento cíclico y de la localización del complejo p24 en la célula. En la fracción luminal se encuentran la secuencia señal necesaria para su translocación al RE, un dominio GOLD (Golgi dynamics) y una región coiled-coil (Figura 11). La región coiled-coil, que precede al TMD es esencial para la formación del complejo: heterotetrámeros (p24α+p24β+p24γ+p24δ) o heterodímeros (p24β+p24δ). Figura 11. La organización estructural de las proteínas de la familia p24 depende de la oligomerización de sus subunidades (A) Estructura de las proteínas p24, destacándose el dominio GOLD, la región coil-coiled (CC), el dominio transmembrana (TM) y el tallo citosólico (CT). (B) Los miembros de las diferentes familias interaccionan a través de sus regiones coil-coiled para formar los complejos, ya sean heterodímeros o heterotetrámeros. Figura extraída de (Pastor-Cantizano et al., 2016). INTRODUCCIÓN 33 La oligomerización del complejo p24 es esencial para la estabilidad de las propias proteínas p24 en la célula, así como para que el complejo pueda ciclar entre RE y Golgi (Füllekrug et al., 1999). En S. cerevisiae el complejo está formado principalmente por las proteínas Emp24, Erv25, Erp1 y Erp2. La eliminación tanto de Emp24 como de Erv25 genera complejos inestables, no funcionales, que terminan siendo degradados. De este modo, la eliminación de una de estas subunidades tiene como consecuencia la disminución de los niveles proteicos del resto de la familia (Marzioch et al., 1999). 1.3.1.2. Remodelación del glicano del GPI El reconocimiento de las proteínas ancladas a GPI por parte del complejo p24 se encuentra regulado por la remodelación de la parte glucídica del GPI. Esta modificación consiste en la eliminación de la EtNP presente en la segunda manosa del glicano por la fosfodiesterasa Ted1 en levaduras y PGAP5 en mamíferos (Figura 12) (Fujita et al., 2009; Manzano-Lopez et al., 2015). De hecho, ha sido demostrado que p24 actúa como una lectina al reconocer de manera específica el glicano remodelado de las proteínas ancladas a GPI. Este reconocimiento por parte del receptor p24 dispara el reclutamiento y la estabilización de Lst1 a los ERES, con la consiguiente formación de vesículas COPII. Es decir, el reclutamiento de la cubierta COPII por parte del complejo p24 no ocurre de forma constitutiva, en su lugar, se encuentra activamente regulada por la unión de un cargo maduro. La existencia de un mecanismo regulatorio de este tipo ayudaría a entender como la producción de vesículas COPII se ajustaría a la cantidad de cargos luminales que se encuentran listos para salir del RE. Además de esta EtNP presente en la segunda manosa, la cual es añadida durante la síntesis del precursor GPI por medio de la enzima Gpi7, el glicano presenta dos EtNP más (Figura 8). Una en la tercera manosa, a través de la cual se ancla la proteína luminal, y otra en la primera manosa, que al igual que ocurre con la EtNP de la segunda manosa, se encuentra ausente en la forma madura de la proteína. Se ha descubierto recientemente, que sería la enzima Cdc1, localizada en el Golgi, la que se encargaría de su eliminación antes de alcanzar su destino final en la membrana plasmática (Vazquez et al., 2014; Yang & Banfield, 2020). INTRODUCCIÓN 34 1.3.2. Sorting de las proteínas ancladas a GPI previa exportación del RE Tradicionalmente se creía que todas las proteínas de secreción viajaban juntas en las mismas vesículas COPII desde el RE hasta el Golgi, donde serían segregadas a su destino final. Sin embargo, hoy día se sabe que las proteínas ancladas a GPI en levadura son segregadas del resto de proteínas de secreción previa exportación del RE, siendo incorporadas en vesículas COPII especializadas (Castillon et al., 2009; Muñiz et al., 2001). El mecanismo que subyace bajo este sorting de las proteínas ancladas a GPI en el RE es aún desconocido, pero se piensa que los lípidos podrían estar involucrados, por lo que la remodelación de la porción lipídica del GPI podría jugar un papel importante en este evento (Muñiz & Riezman, 2016). Figura 12. La remodelación del GPI regula activamente el reclutamiento de una cubierta COPII especializada La eliminación de la EtNP de la segunda manosa del glicano del GPI por parte de Ted1 permite la interacción de las proteínas ancladas a GPI con el receptor p24. Esta unión promueve el reclutamiento selectivo de una cubierta interna COPII específica, formada por Lst1/Sec23, con la consiguiente formación de vesículas COPII. Este mecanismo implica que la formación de estas vesículas COPII especializadas se encuentra regulado por la cantidad de proteínas ancladas a GPI listas para ser exportadas. Figura extraída de (Lopez et al., 2019). INTRODUCCIÓN 35 1.3.2.1. Remodelación lipídica del GPI En levaduras, esta remodelación lipídica del GPI comienza inmediatamente después del anclaje a la proteína (Pittet & Conzelmann, 2007). Esta consiste en la deacilación por parte de Bst1 (Tanaka et al., 2004) seguida de la remodelación de los ácidos grasos, lo cual implica el reemplazamiento de las cadenas cortas e insaturadas del diacilglicerol (C18:1), por unas más largas y saturadas (C26:0) (Bosson et al., 2006). A continuación, este diacilglicerol de C26 es en algunas ocasiones reemplazado por ceramida (C26:0) gracias a la enzima Cwh43 (Figura 13) (Fujita & Kinoshita, 2012; Umemura et al., 2007). De hecho, ha sido propuesto, que las proteínas ancladas a GPI que se dirigen a la membrana plasmática adquieren esta ceramida en su porción lipídica, mientras aquellas que se dirigen a la pared celular mantienen el diacilglicerol C26, como se ha demostrado en el caso de Gas1 y Cwp2, respectivamente. Por tanto, el tipo de lípido presente en el GPI (diacilglicerol o ceramida) podría contribuir a determinar su destino final en levaduras. El mecanismo implicado es aún desconocido, pero se cree que las secuencias diferenciales cercanas al Ω site de la proteína, donde el GPI es anclado, podrían estar relacionadas (Yoko-O et al., 2018). Figura 13. Remodelación lipídica de las proteínas ancladas a GPI 1) La proteína es anclada al GPI en el lumen del RE. 2) El acilo unido al inositol es eliminado por la enzima Bst1. Después, la cadena de ácido graso insaturada en la posición sn2 es eliminada por Per1, y en su lugar una cadena muy larga y saturada (C26:0) es añadida por Gup1. 3) En muchos casos el diacilglicerol el sustituido por ceramida por Cwh43. Acyl-PI: acil-fosfatifilinositol, pG1: fosfatidilinositol, IPC: inositolfosfo-ceramida, GlcN: glucosamida, Man: manosa y EtNP: etanolaminafosfato. INTRODUCCIÓN 36 1.3.2.2. Síntesis y transporte de ceramida La síntesis de ceramida tiene lugar en el RE, después de lo cual es transportada al Golgi para servir como precursor de la síntesis de esfingolípidos (Figura 14). Esta comienza con la síntesis de sus dos componentes, la esfingosina o bases de cadena larga (LCB) y los ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA). Por su parte, la esfingosina es generada por la condensación del aminoácido serina junto con el ácido graso de la Coenzima A, gracias a la serina-palmitoiltransferasa, comprendida por el heterodímero Lcb1/Lcb2 en levaduras. El otro componente es generado por la elongación de ácidos grasos de cadena larga (C12-C16) hasta obtener VLCFA de C18 o más gracias a las elongasas Elo13. La combinación de ambos componentes por las ceramidas sintasas Lag1 y Lac1, da lugar a las ceramidas, siendo las C26 las más abundantes en levadura (Olson et al., 2016). Figura 14. Síntesis de ceramida en levaduras Principales pasos de la síntesis de ceramida. Se nombran las principales enzimas reguladoras. Las estructuras de LCB y VLCFA son representativas, dada la alta variabilidad comprendida por las posibles hidroxilaciones, insaturaciones y variaciones en la longitud de la cadena. Figura extraída de (Olson et al., 2016). INTRODUCCIÓN 37 Una vez sintetizada, la ceramida es transportada al cis-Golgi principalmente mediante vesículas COPII (Funato et al., 2020). Más tarde, en el medial-Golgi es convertida en inositolfosfoceramida (IPC) por la enzima Aur1 y posteriormente manosilada hasta obtener MIPC y M(IP)2C (Figura 15). Una pequeña proporción de ceramida (20-30%) es dirigida directamente al medial-Golgi vía no vesicular por el transportador Nvj2 (Liu et al., 2017). Las ceramidas tienen propiedades biofísicas únicas, ya que son extremadamente hidrofóbicas y son capaces de formar extensas redes de puentes de hidrógeno debido a la presencia en su estructura de grupos donadores y aceptores, es decir, hidrógenos y átomos electronegativos (Alonso & Goñi, 2018; Castro et al., 2014). Estas propiedades confieren a la ceramida la capacidad de segregar en dominios ricos en ceramida, los cuales se encuentran altamente ordenados y empaquetados en la fase fluida de la membrana (Silva et al., 2006; Sot et al., 2006; Veiga et al., 1999). Estudios recientes han demostrado que la longitud de las cadenas de ácidos grasos de la ceramida tiene un impacto directo en las propiedades biofísicas de estos dominios, tales como, su grado Figura 15. Transporte de ceramida desde el RE hacia el Golgi en levaduras La ceramida C26 es sintetizada en el RE y es transportada principalmente mediante vesículas COPII al Aparato de Golgi, donde sirven como precursores para la síntesis de esfingolípidos complejos. Figura adaptada de (Funato et al., 2020). INTRODUCCIÓN 38 de empaquetamiento, forma, tamaño y grosor de la bicapa lipídica (Pinto et al., 2011; Zelnik et al., 2020). Dado que la ceramida se sintetiza en el RE, ha sido propuesto que estos dominios ordenados enriquecidos en ceramida podrían regular ciertas funciones del RE, por ejemplo, afectando al grado de difusión de las proteínas transmembranas, lo que incluso podría tener un impacto en su transporte a lo largo de la ruta secretora (Zelnik et al., 2020). 1.3.2.3. Modelo de sorting de las proteínas ancladas a GPI dependiente de ceramida Estas propiedades biofísicas únicas de las ceramidas de cadena muy larga podrían tener un impacto en la exportación del RE de las proteínas ancladas a GPI que poseen ceramidas C26. De hecho, la remodelación lipídica del GPI es necesaria para su aislamiento en DRMs, lo cual ha sido propuesto como un reflejo de su asociación con estos dominios enriquecidos en ceramida (Castillon et al., 2011; Fujita, Umemura, et al., 2006). Estos resultados demuestran que la remodelación lipídica del GPI cambia las propiedades de las proteínas ancladas a GPI, probablemente afectando a su asociación funcional con la membrana. Es más, la síntesis de ceramida es requerida para la exportación del RE de las proteínas ancladas a GPI basadas en ceramida C26 (Horvath et al., 1994; Sütterlin et al., 1997) y, a su vez, la síntesis de IPC en el Golgi a partir de ceramida depende de la síntesis de GPI (Kajiwara et al., 2008), lo que sugiere que las proteínas ancladas a GPI modificadas con ceramidas C26 y las ceramidas C26 libres se transportan al Golgi de forma interdependiente. Teniendo en cuenta estos datos se ha propuesto un modelo mediante el cual, las proteínas ancladas a GPI con ceramidas C26 coalescerían junto con las ceramidas C26 libres en la membrana del RE, generando dominios ordenados dentro del entorno relativamente desordenado de lípidos de la membrana del RE, la cual está constituida principalmente por lípidos cortos e insaturados (C16:1 y C18:1) (Funato et al., 2020; Melero et al., 2018). La formación de estos dominios provocaría la segregación lateral de las proteínas ancladas a GPI basadas en ceramidas C26 del resto de proteínas transmembrana del RE. Finalmente, estas proteínas ancladas a GPI con ceramidas C26 INTRODUCCIÓN 39 junto con las ceramidas C26 de la membrana serían concentradas en ERES específicos para ser posteriormente incorporadas en vesículas COPII especializadas que las transporten hacia el Golgi (Figura 16) (Muñiz & Riezman, 2016). Figura 16. Modelo: Las ceramidas de cadena muy larga C26 promoverían la formación de clusters de proteínas ancladas a GPI y su segregación previa exportación del RE Modelo de sorting de las proteínas ancladas a GPI por el cual la adquisición de ceramidas C26 tras la remodelación lipídica del GPI generaría un desajuste hidrofóbico en la membrana del RE llevando a la concentración de las proteínas ancladas a GPI en dominios ordenados ricos en ceramidas. Esta concentración dependiente de ceramida C26 conllevaría la segregación de las proteínas ancladas a GPI del resto de proteínas transmembrana, siendo incorporadas en ERES específicos. Figura adaptada de (Muñiz & Zurzolo, 2014). INTRODUCCIÓN 40 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 41 2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 48 sugiriendo que el mecanismo de segregación de las proteínas ancladas a GPI tiene que depender específicamente de las propiedades biofísicas únicas que presentan las ceramidas de cadena muy larga C26. De hecho, estudios previos realizados en sistemas de membrana artificiales mostraron que las ceramidas de cadena muy larga promueven la separación de fases y la curvatura de la membrana (Pinto et al., 2011), y que estos fenómenos biofísicos se deben a la capacidad de las ceramidas muy largas de interdigitar parcialmente entre sí, formando fases en la membrana con un mayor grosor (Ventura et al., 2020). Por tanto, en base a las evidencias disponibles se propuso un modelo para explicar el papel de las ceramidas C26 y el receptor p24 en la segregación y exportación diferencial de proteínas ancladas a GPI con ceramida C26 desde el RE. Según este modelo, el receptor p24 estaría favoreciendo la formación de una fase interdigitada al concentrar ceramida C26 libre en la parte citosólica de la membrana y proteínas ancladas a GPI con ceramida C26 en la parte luminal. Esta interdigitación local induciría el clustering y la curvatura de la membrana del RE, dando lugar a la segregación e incorporación de las proteínas ancladas a GPI en ERES específicos (Figura 21). En la presente tesis nos propusimos evaluar las predicciones más relevantes de este modelo como son el requerimiento de la ceramida C26 presente en el GPI, así como el papel jugado por el receptor p24 en la organización de la ceramida en la membrana del RE. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 49 Figura 20. La ceramida se encuentra enriquecida alrededor de la porción citosólica del tallo transmembrana de Emp24 (A) Imagen lateral de la bicapa lipídica conteniendo DOPC (gris) y ceramida (rojo) con el tallo transmembrana de Emp24 en amarillo. (B) Análisis cuantitativo de la distribución de ceramida C18 (cer C18) o C26 (cer C26) alrededor del tallo transmembrana de Emp24 en el lado luminal (gráfico superior) o citosólico (gráfico inferior). Los gráficos representan el factor de Depleción -Enriquecimiento (D-E factor) que indica la depleción de ceramida para valores por debajo de 1 o el enriquecimiento para valores superiores a 1. El análisis D-E mostró que tanto la ceramida C18 como la C26 eran depletadas alrededor de la porción luminal de Emp24 mientras se enriquecía en la porción citosólica. Los dibujos representan el análisis D-E (DOPC en gris, ceramida en rojo). (C) Vista superior de un mapa D-E para ceramida de C26 alrededor del tallo transmembrana de EMP24 (círculo amarillo) en la parte citosólica de una bicapa formada por DOPC:ceramida. Figura adaptada de (Rodriguez-Gallardo et al., 2020). ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 50 Figura 21. Modelo: Clustering y sorting de las proteínas ancladas a GPI dependiente de las ceramidas muy largas C26 El receptor p24 concentraría localmente a las ceramidas libres C26 en la hemicapa citosólica de la membrana, mientras que uniría a las proteínas ancladas a GPI con ceramida C26 en la región luminal. La presencia de ceramida C26 a ambos lados de la bicapa lipídica generaría fases interdigitadas, lo cual promovería la curvatura de la membrana y el clustering de las proteínas ancladas a GPI junto con la ceramida libre C26 en zonas concretas de la membrana, donde el resto de proteínas transmembrana quedarían excluidas. Finalmente, esto conduciría al sorting de las proteínas ancladas a GPI en ERES específicos y su posterior incorporación en vesículas COPII especializadas. Figura adaptada de (Aguilera-Romero & Muñiz, 2021). ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 51 OBJETIVOS El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que dirigen el proceso de segregación y exportación selectiva de las proteínas ancladas a GPI desde el RE mediado por ceramidas de cadena muy larga utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo celular. Con ello pretendemos entender mejor el papel de los lípidos de membrana en el sorting de las proteínas de secreción en la ruta secretora. Para abordar el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Analizar el posible papel de la ceramida de cadena muy larga de 26 carbonos presente en la estructura del GPI en la segregación y exportación selectiva de las proteínas ancladas a GPI a través de ERES específicos. 2. Determinar la implicación del receptor p24 en el mecanismo de segregación y exportación selectiva de proteínas ancladas a GPI a través de ERES específicos mediado por ceramidas C26 de membrana. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 52 RESULTADOS 53 3. RESULTADOS RESULTADOS 54 RESULTADOS 55 3.1. Análisis del papel de la ceramida presente en la estructura del GPI en la segregación y exportación selectiva de las proteínas ancladas a GPI a través de ERES específicos Dados nuestros resultados previos en los que se demuestra que las ceramidas libres de cadena muy larga C26 presentes en la membrana del RE están implicadas en la segregación y exportación selectiva de las proteínas ancladas a GPI (Rodriguez-Gallardo et al., 2020), el objetivo de este primer capítulo fue analizar si también las ceramidas C26 que forman parte de la propia estructura del GPI intervienen en dicho proceso. Con ello pretendemos testar nuestra hipótesis de partida según la cual ambos tipos de ceramidas interdigitarían entre sí formando un microdominio lipídico que induciría el clustering y sorting de las proteínas ancladas a GPI en ERES específicos. 3.1.1. La ceramida C26 incorporada al GPI por Cwh43 es necesaria para el clustering de Gas1 y su posterior exportación del RE Para determinar el posible papel de la ceramida C26 que forma parte de la estructura del GPI en la exportación selectiva de estas proteínas utilizamos la proteína anclada a GPI Gas1, la cual se ha demostrado que incorpora ceramida C26 tras la remodelación de la porción lipídica llevada a cabo en el RE por la enzima Cwh43 (Rodriguez-Gallardo et al., 2020; Yoko-O et al., 2013). Estudios previos indicaban que la deleción del gen CWH43 produce la acumulación de Gas1 en el RE (Yoko-O et al., 2013; Yoko-O et al., 2018). Estos resultados fueron confirmados por Western Blot, donde se pudo observar que el mutante nulo cwh43Δ acumula la forma inmadura de RE de Gas1 al igual que el mutante nulo bst1Δ (Figura 22A), siendo Bst1 la enzima que inicia la remodelación del GPI deacilando al inositol (Figura 13). Este defecto de cwh43Δ en el transporte RE-Golgi es específico para Gas1 ya que la maduración en el Golgi de la proteína soluble Carboxipeptidasa Y (CPY) no se vio afectada (Figura 22A). Finalmente, comprobamos mediante microscopía de fluorescencia que el mutante cwh43Δ, al igual que bst1Δ, acumula Gas1-GFP en el RE, lo cual se evidencia por la detección de Gas1-GFP en el anillo RESULTADOS 56 perinuclear característico del RE de las células de levadura (Figura 22B). Por tanto, estos resultados confirman que la adquisición de ceramida C26 por parte del GPI de Gas1 es necesaria para su correcta exportación del RE. Nuestros estudios previos muestran que la proteína Gas1-GFP recién sintetizada, se concentra lateralmente en la membrana del RE formando clusters que están íntimamente asociados a ERES específicos (Rodriguez-Gallardo et al., 2020). Dado que la formación de estos clusters requiere de la presencia de la ceramida libre C26 en la membrana del RE, quisimos conocer si también la ceramida C26 del GPI participa en dicho proceso. Para ello, utilizamos el sistema genético optimizado en nuestro laboratorio que permite observar por microscopía de fluorescencia la presencia de clusters de proteínas ancladas a GPI. Como se ha explicado anteriormente, este sistema Figura 22. La deleción de CWH43 causa acumulación de la forma de RE de Gas1 (A) Los extractos de las cepas silvestre y mutantes fueron analizados por western blot para Gas1 y CPY. Madura, forma madura de Gas1 y CPY; ER, forma inmadura de Gas1; p1 y p2, forma de Re y Golgi de CPY respectivamente. Se muestra la cuantificación del porcentaje de Gas1 inmadura. Las barras representan la media de tres replicas biológicas independientes. Las barras de error representan la SD. Test T de student, *p < 0,05. (B) Localización de Gas1-GFP analizada por microscopía de fluorescencia convencional en las cepas silvestre y mutantes previamente comentados. Flechas blancas: distribución homogénea de Gas1-GFP mostrando la tinción característica del RE perinuclear. Barra de escala, 5 µm. Figura adaptada de (Rodriguez-Gallardo et al., 2022). RESULTADOS 57 consiste en inducir primero la expresión de Gas1-GFP bajo el control del promotor de galactosa en el mutante termosensible sec31-1, el cual a temperatura restrictiva (37ºC) no puede formar vesículas COPII, acumulando a la proteína Gas1-GFP recién sintetizada en el RE. Posteriormente, al bajar la temperatura hasta los 24ºC, el transporte se restaura, con lo que Gas1-GFP comienza a entrar en ERES específicos para salir del RE. Así, observamos que en la cepa sec31-1, Gas1-GFP muestra un patrón punteado formando clusters, mientras que en las cepas mutantes sec31-1 cwh43Δ y sec31-1 bst1Δ, Gas1-GFP se localizó de forma dispersa y homogénea por toda la membrana del RE (Figura 23). Estos datos demuestran que la remodelación o incorporación de ceramida C26 en el GPI por parte de Cwh43 es esencial para la formación de clusters de Gas1 en el RE. Teniendo en cuenta nuestros resultados previos, en los que la alteración de la ceramida libre de membrana afectaba de forma directa a la capacidad de Gas1 de formar clusters en el RE (Rodriguez-Gallardo et al., 2020), quisimos comprobar que las ceramidas libres de membrana no se veían alteradas en el mutante cwh43Δ y que, por tanto, el efecto observado en este mutante era causado directamente por la carencia de ceramida por parte del GPI. Para ello se analizó en la cepa mutante cwh43Δ la biosíntesis de los esfingolípidos complejos, los cuales se sintetizan en el Golgi a partir de ceramida libre transportada desde el RE. El análisis realizado mediante TLC (Thin Layer Figura 23. Las cepas mutantes bst1Δ y Cwh43Δ son defectivas en la formación de clusters de Gas1-GFP Las cepas sec31-1, sec31-1 bst1Δ, sec31-1 cwh43Δ, que expresaban Gas1-GFP bajo un promotor inducible de galactosa, fueron incubadas a 37 ºC durante 30 minutos, a continuación, a 24 ºC y visualizadas por microscopía de fluorescencia convencional tras 20 minutos de la liberación del bloqueo. Flechas blancas: clusters de Gas1-GFP. Flechas vacías: distribución homogénea de Gas1-GFP mostrando la tinción característica del RE perinuclear. Barra de escala, 5 µm. Figura adaptada de (Rodriguez-Gallardo et al., 2022). RESULTADOS 64 Figura 28. Análisis estructural del glicano del GPI de Gas1-GFP. (A) Los extractos fueron preparados de células que expresaban Gas1-GFP, las cuales fueron tratadas con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC), a continuación, Gas1-GFP fue purificado, digerido con tripsina y analizado por cromatografía líquida y espectrometría de masas con ionización en electrospray (LC-ESI-MS/MS). La tabla muestra los porcentajes de las tres estructuras predominantes del glicano del GPI de Gas1-GFP purificado de las cepas silvestre y mutantes. La abundancia relativa (%) de cada tipo de glicano fue calculada por el pico de intensidad de las masas monoisotópicas de cada estructura. (B) Remodelación del glicano del GPI. En primer lugar, Ted1 elimina la 2ª-EtNP en el RE. Posteriormente, ya en el Golgi, Cdc1 elimina la 1ª-EtNP. Las proteínas ancladas a GPI maduras, en las que ambas EtNP han sido removidas, son transportadas a su destino en la membrana plasmática (PM). RESULTADOS 65 Los resultados anteriores sugieren que la adición de la 2ª-EtNP del glicano del GPI por Gpi7 y su posterior eliminación por Ted1 actúan como un sistema de control de calidad que monitoriza la incorporación de ceramida C26 en el GPI evitando que Gas1 abandone el RE sin la ceramida C26. Este sistema es independiente del control de calidad que monitoriza el plegamiento de la proteína, ya que a pesar de que Gas1 se retenga en el RE en el mutante cwh43Δ, su tasa de degradación no se vio afectada, como pudimos determinar mediante un experimento de pulso y caza (Figura 29). Por tanto, Ted1 ejercería un control de calidad sobre el lípido del GPI, que serviría para incrementar la eficiencia del proceso de remodelación del motivo lipídico del GPI con ceramida. Como se ha comentado anteriormente, hemos demostrado recientemente que la longitud de la ceramida libre presente en las membranas del RE es crucial para la formación de clusters y la segregación en el RE de las proteínas ancladas a GPI que contienen ceramida, como es el caso de Gas1 (Rodriguez-Gallardo et al., 2020). Esto Figura 29. La tasa de degradación de Gas1 no se vio afectada en el mutante cwh43Δ Las células fueron marcadas con [35S]metionina durante 5 minutos a 25 ªC y cazadas a los tiempos indicados. Gas1 fue inmunoprecipitada, analizada por SDS-PAGE y visualizada con un phosphoimager. Se cuantificó la cantidad de Gas1 madura y total restante (%) para los distintos tiempos y la media y SD de tres replicas biológicas independientes fueron representadas. m: Gas1 madura; p: Gas1 preprocesada. Figura adaptada de (Rodriguez-Gallardo et al., 2022). RESULTADOS 66 concuerda con el modelo propuesto, por el cual, las ceramidas libres y las proteínas ancladas a GPI que contienen ceramida serían co-transportadas desde los mismos ERES en las mismas vesículas COPII (Funato et al., 2020; Kajiwara et al., 2008; LoizidesMangold et al., 2012; Muñiz & Riezman, 2016). Dado que el mutante gpi7Δ suprime el defecto de transporte para las proteínas ancladas a GPI que no han remodelado correctamente la porción lipídica, es decir, que no contienen ceramida, nos preguntamos si también haría a este tipo de proteínas independientes de la presencia de ceramida libre para su transporte. Para examinar esta posibilidad hicimos uso de la droga miriocina, un inhibidor específico de la enzima serina-palmitoiltransferasa (SPT), la cual cataliza uno de los primeros pasos de la síntesis de ceramida y, por tanto, de los esfingolípidos (Horvath et al., 1994). Cuando la cepa silvestre fue tratada con miriocina, pudimos observar una mayor acumulación en el RE de Gas1 o Gas1-GFP, pero no de las proteínas no ancladas a GPI, CPY o Mid2-VENUS, sin embargo, el mutante gpi7Δ no se vio afectado (Figura 30A y B). Estos resultados indican que la ausencia de la 2ª-EtNP en gpi7Δ anula, no solo el control sobre la remodelación lipídica del GPI mediado por Ted1, sino también, el requerimiento de ceramida libre para la exportación de este tipo de proteínas del RE. RESULTADOS 67 Figura 30. El mutante gpi7Δ anula la dependencia de ceramida para el transporte de las proteínas ancladas a GPI (A) Extractos de células tratadas con las concentraciones de miriocina indicadas fueron analizados por western blot para las proteínas Gas1 y CPY. Se determinó el % de Gas1 inmadura (RE). Las barras representan la media de tres réplicas biológicas independientes. Las barras de error indican la SD. Test T de student, n.s., no significativo y ***p < 0,001. (B) Localización de Gas1-GFP y Mid2-VENUS en células tratadas o no con miriocina (20 µg/ml, durante 1,5 h a 24 ºC). El efecto observado sobre la Gas1-GFP fue específico, dado que la proteína transmembrana Mid2-VENUS no se vio afectada. Flechas blancas: distribución homogénea de Gas1-GFP mostrando la tinción característica del RE perinuclear. Barra de escala, 5 µm. Figura adaptada de (Rodriguez-Gallardo et al., 2022). RESULTADOS 68 3.1.3. La segregación selectiva de Gas1 en ERES específicos depende de la remodelación de ceramida del GPI Nuestros estudios previos muestran que la proteína anclada a GPI Gas1-GFP sale del RE a través de ERES distintos a los usados por la proteína transmembrana Mid2-iRFP, y que esta segregación, así como su agrupación en clusters, se ven afectados por la reducción de la longitud de la ceramida libre presente en la membrana del RE (Rodriguez-Gallardo et al., 2020). Quisimos determinar, por tanto, si también la ceramida presente en el GPI de Gas1 está implicada en estos eventos de segregación y exportación de Gas1 a través de ERES específicos como predice nuestro modelo. Para abordar esta cuestión utilizamos el mutante gpi7Δ, que genera Gas1 con DAG en lugar de ceramida (Benachour et al., 1999) y además anula el control ejercido sobre la remodelación lipídica por Ted1, ya que restaura la exportación desde el RE de Gas1-DAG en el mutante cwh43Δ (Figura 26). Utilizando el sistema genético basado en el alelo mutante termosensible sec31-1, quisimos comprobar si los eventos de clustering se veían afectados en las cepas sec311 gpi7Δ y sec31-1 gpi7Δcwh43Δ, las cuales carecen de ceramida en el GPI y, sin embargo, son capaces de ser exportadas eficientemente del RE al saltarse el control de calidad ejercido por la enzima Ted1. Tal y como se observa en la Figura 31, ambas cepas eran defectuosas en la formación de clusters en la membrana del RE. Es decir, la agrupación de la proteína anclada a GPI Gas1-GFP en clusters específicos cerca de los ERES se encuentra mediada por la presencia de ceramida en el GPI. Figura 31. La proteína anclada a GPI Gas1-GFP que contiene DAG falla en la formación de clusters en el RE Las cepas sec31-1, sec31-1 gpi7Δ y sec31-1 gpi7Δcwh43Δ, que expresaban Gas1-GFP bajo un promotor inducible de galactosa, fueron incubadas a 37 ºC durante 30 minutos, a continuación, a 24 ºC y visualizadas por microscopía de fluorescencia convencional tras 20 minutos de la liberación del bloqueo. Flechas blancas: clusters de Gas1-GFP. Flechas vacías: distribución homogénea de Gas1-GFP mostrando la tinción característica del RE perinuclear. Escala 5 µm. RESULTADOS 69 Para analizar la segregación en ERES específicos se llevó a cabo un experimento de microscopía de fluorescencia mediante SCLIM. En este caso, se hizo uso de las cepas sec31-1, sec31-1 gpi7Δ y sec31-1 gpi7Δcwh43Δ que además de expresar Sec13-mCherry, expresaban la proteína anclada a GPI Gas1-GFP y la proteína transmembrana Mid2-iRFP bajo el promotor de galactosa. Tras la incubación de 30 minutos a 37 ºC y la consiguiente liberación del sistema a 24 ºC se cuantificó la proporción de ERES con la presencia de un solo cargo, Gas1-GFP o Mid2-iRFP, o la presencia de ambos (Figura 32). En los paneles de la parte derecha de la Figura 32 se muestran solo los cargos que co-localizan con Sec13-mCherry, Gas1-GFP en gris y Mid2-iRFP en cian, es decir, la proporción de cada cargo que se encuentra dentro de los ERES, listo para salir en vesículas COPII. En la cepa sec31-1 la mayoría de ERES, en torno al 75%, contenían un solo tipo de cargo, un 15% contenía ambos cargos que co-localizaban dentro del mismo ERES, mientras un 10% contenía ambos cargos, pero segregados en zonas distintas dentro del mismo ERES. Estos resultados concuerdan con datos previos, en los que Gas1-GFP es segregada en ERES específicos, distintos a los de las transmembranas como Mid2-iRFP, antes de salir del RE. Sin embargo, encontramos que en los mutantes sec31-1 gpi7Δ y sec31-1 gpi7Δcwh43Δ, ambos carentes de ceramida en el GPI, un alto número de ERES, en torno al 40%, contenían ambos cargos mezclados, mientras que el porcentaje de ERES con un solo cargo se vio reducido (Figura 32). De estos resultados podemos deducir que la ceramida presente en el GPI está implicada en la segregación y exportación selectiva de las proteínas ancladas a GPI a través de ERES específicos y, además, que este sorting mediado por lípidos se hallaría controlado por la remodelación del glicano del GPI realizada por Ted1. RESULTADOS 70 Figura 32. La proteína anclada a GPI Gas1-GFP con DAG entra en los mismos ERES que la proteína transmembrana Mid2-iRFP Las cepas sec31-1, sec31-1 gpi7Δ y sec31-1 gpi7Δcwh43Δ, que expresaban Gas1-GFP (verde) y Mid2-iRFP (azul) bajo un promotor inducible de galactosa, y Sec13-mCherry de forma constitutiva como marcador de ERES (magenta), fueron incubadas a 37 ºC durante 30 minutos, a continuación, a 24 ºC y visualizadas por SCLIM tras 20 minutos de la liberación del bloqueo. RESULTADOS 71 Los paneles de la izquierda representan imágenes de semiesferas de células en 3D donde aparecen los dos tipos de cargos y los ERES. Los paneles de la derecha muestran las mismas imágenes, pero procesadas para representar únicamente el cargo que se encuentra dentro de los ERES (Gas1-GFP en gris y Mid2-iRFP en cian). Las flechas señalan los ERES con cargos mezclados. El grafico muestra el porcentaje medio de ERES que contienen un único cargo, los dos cargos mezclados y los cargos segregados dentro del mismo ERES. n = 238 en 32 células (sec31-1), 423 en 46 células (sec31-1 gpi7Δ) y 443 en 51 células (sec31-1 gpi7Δcwh43Δ) de tres réplicas biológicas independientes. Las barras de error representan la SD. Estadístico: T test no pareado de dos colas. **p < 0,001 y *p < 0,05. Figura adaptada de (Rodriguez-Gallardo et al., 2022). RESULTADOS 72 3.2. Implicación del receptor p24 en el mecanismo de segregación selectiva de proteínas ancladas a GPI mediado por ceramidas En este capítulo se trató de dilucidar el mecanismo por el que el receptor p24 y la ceramida C26 libre en la membrana del RE promueven la segregación y exportación selectiva de las proteínas ancladas a GPI con ceramida C26. 3.2.1. Los clusters de la proteína anclada a GPI Gas1 se localizan en zonas del RE con mayor grosor de membrana Nuestros resultados previos sugieren que el receptor p24 podría contribuir a la formación de los clusters de la proteína anclada a GPI Gas1 en el RE promoviendo la generación de un microdominio enriquecido en ceramidas de cadena muy larga C26. El receptor p24 remodelaría localmente la membrana del RE, acumulando asimétricamente a las ceramidas C26 libres en la hemicapa citosólica. A su vez, en el lado luminal el receptor p24 interaccionaría de forma multivalente con las proteínas ancladas a GPI posicionando sus ceramidas C26 en la hemicapa luminal (Figura 21). La disposición enfrentada de ambos tipos de ceramidas C26 en la membrana del RE, podría promover su interdigitación parcial, generando un microdominio lipídico ordenado y de mayor grosor que las zonas de membrana circundante compuesta básicamente por glicerolípidos más cortos (16C y 18C) e insaturados (Ventura et al., 2020). Por tanto, este modelo predice que las proteínas ancladas a GPI deberían localizarse en zonas de la membrana del RE con un mayor grosor que el resto. Para analizar esta predicción se adaptaron a nuestro sistema los marcadores fluorescentes WALP diseñados por el laboratorio de Yves Barral (ETH, Suiza) para mapear el grosor de la membrana del RE en levadura (Prasad et al., 2020). Estos marcadores constan de un dominio transmembrana (TMD) formado por la repetición del dipéptido Alanina (A)-Leucina (L) un número variable de veces, flanqueado por los residuos de triptófano (W) y prolina (P) (WALP). Se utilizaron dos marcadores etiquetados con mRFP en la región luminal con distinta longitud de su TMD, uno de 21 aa (mRFP-WALP21), longitud media de los TMD de las proteínas transmembranas del RESULTADOS 73 RE, y otro de 29 aa (mRFP-WALP29), longitud más similar a los TMD encontrados en las proteínas transmembranas de la membrana plasmática, rica en esfingolípidos (Figura 33A). Cada construcción WALP fue co-expresada con Gas1-GFP en una cepa sec31-1 lo que permitió visualizar mediante microscopía de fluorescencia convencional una posible co-localización de estos marcadores respecto a los clusters de Gas1-GFP. El marcador con TMD largo mRFP-WALP29 mostró un patrón de RE punteado y discontinuo, mientras que el marcador con TMD corto mRFP-WALP21 presentó una distribución homogénea, aunque restringida preferentemente al RE perinuclear. Los puntos discretos observados para mRFP-WALP29 co-localizaban con los clusters de Gas1-GFP (Figura 33B). Este resultado sugiere que los clusters de Gas1-GFP se localizan en zonas de mayor grosor de la membrana del RE, lo que sería consistente con una acumulación local de ceramidas de cadena muy larga C26. RESULTADOS 80 DISCUSIÓN 81 4. DISCUSIÓN DISCUSIÓN 82 DISCUSIÓN 83 4.1. Control de calidad ejercido sobre la segregación selectiva mediada por lípidos de las proteínas ancladas a GPI Las proteínas ancladas a GPI son segregadas del resto de proteínas de secreción, incluidas las proteínas transmembrana, de forma temprana en el RE e incorporadas en vesículas COPII específicas (Muñiz et al., 2001; Muñiz & Riezman, 2016). Sin embargo, no se conoce todavía con exactitud el mecanismo responsable de este fenómeno. Recientemente hemos demostrado que la agrupación en zonas discretas del RE en forma de clusters y la consecuente segregación de las proteínas ancladas a GPI que contienen ceramida C26 como Gas1, depende de la presencia en la membrana de ceramidas C26 libres (Rodriguez-Gallardo et al., 2020). Esta observación apoya la hipótesis basada en las propiedades biofísicas de las ceramidas en la que las proteínas ancladas a GPI que contienen ceramida C26 tienden a coalescer junto con las ceramidas C26 libres para formar dominios lipídicos ordenados en la membrana del RE, favoreciendo la segregación de estas. No obstante, el papel de la ceramida C26 del GPI en este proceso estaba todavía por investigar. En el presente estudio demostramos que el proceso de incorporación de ceramida C26 en el GPI realizado por la enzima Cwh43 es necesario para el clustering de Gas1 (Figura 23) y su segregación en ERES específicos (Figura 32). Es decir, la presencia de ceramida, ya sea libre en la membrana del RE o en la estructura del GPI, es esencial para la correcta exportación de Gas1. De hecho, mostramos que en el mutante cwh43Δ, cuando Gas1 no tiene ceramida C26 en su GPI, esta se acumula en el RE ya que es incapaz de interaccionar con el receptor p24 (Figura 25), lo que se debía a la presencia de la 2ªEtNP del glicano del GPI, como muestra el análisis de espectrometría de masas. Esto sugiere que la incorporación de ceramida en el GPI es supervisada por la enzima fosfodiesterasa Ted1, la cual elimina la 2ª-EtNP, permitiendo el reconocimiento por parte del complejo p24 y su exportación del RE. Por lo tanto, Ted1 podría estar actuando como un sistema de control de calidad en el RE, que elimina la EtNP solo después de que Cwh43 haya previamente incorporado la ceramida en el GPI, garantizando exclusivamente la salida del RE de proteínas ancladas a GPI modificadas con ceramida C26. DISCUSIÓN 84 Los mecanismos de control de calidad de la ruta secretora comienzan en el RE, donde el control de calidad canónico del RE facilita y monitoriza el plegamiento de las proteínas recién sintetizadas, con la consiguiente degradación de las proteínas mal plegadas (Araki & Nagata, 2011; Ellgaard & Helenius, 2003). En concreto, las proteínas ancladas a GPI mal plegadas son ubiquitinadas y degradadas por el proteosoma (ERAD: Endoplasmatic Reticulum Associated Degradation) o mediante un proceso llamado exportación inducida por el estrés del RE (RESET) que depende del sistema de vacuola/lisosomas (Fujita & Jigami, 2008; Satpute-Krishnan et al., 2014; Sikorska et al., 2016). De hecho, ha sido demostrado, que la correcta deacilación del GPI por la enzima Bst1 participa en estos eventos de control de proteínas mal plegadas del RE (Fujita, Yoko-O, et al., 2006). Por esta razón, quisimos comprobar si la incorporación de ceramida por parte de Cwh43 estaba implicada en estos procesos de control de calidad. Sin embargo, a pesar de que la proteína anclada a GPI Gas1 era retenida en el RE en un mutante cwh43Δ (Figura 22), pudimos determinar que presentaba la misma tasa de degradación que la observada en una cepa silvestre (Figura 29). Estos datos indican que las proteínas ancladas a GPI no remodeladas por la enzima Cwh43 no son eliminadas por degradación en el RE, lo que sugiere que la remodelación de ceramida no está implicada en el control de calidad de proteínas mal plegadas. Es más, cuando la 2ª-EtNP no está presente, como ocurre en un mutante gpi7Δ, la proteína Gas1 que contiene DAG (Gas1-DAG) en lugar de ceramida es capaz de salir del RE a través de una ruta que es independiente de ceramida, ya que su exportación no se vio afectada por la miriocina, un inhibidor de la síntesis de ceramida (Figura 30). Además, Gas1-DAG pierde la capacidad de formar clusters en el RE y exportarse selectivamente a través de ERES específicos, siendo redirigida para entrar en los mismos ERES que exportan a las proteínas transmembrana (Figura 32). El hecho de que la actividad de Gpi7 sea necesaria para la incorporación de ceramida por Cwh43 (Benachour et al., 1999; Fujita, Umemura, et al., 2006; Umemura et al., 2007) y que la presencia de esta ceramida en el GPI sea posteriormente supervisada por la enzima Ted1, implica que el anclaje por Gpi7 y eliminación por Ted1 de la 2ª-EtNP actuarían conjuntamente como un sistema de control de calidad que monitoriza la correcta adquisición de ceramida DISCUSIÓN 85 para asegurar la segregación selectiva de las proteínas ancladas a GPI con ceramida en ERES específicos que siguen una ruta de exportación del RE diferente al resto. Nosotros proponemos que, bajo condiciones normales, este control de calidad aseguraría la incorporación de ceramida, retrasando la salida del RE de aquellas proteínas ancladas a GPI basadas en ceramida que todavía no han sido remodeladas. Una vez incorporada la ceramida por Cwh43, lo cual aseguraría su segregación en ERES específicos enriquecidos en ceramidas, Ted1 eliminaría la 2ª-EtNP, permitiendo la interacción con el receptor p24 y la exportación de estas proteínas del RE (Figura 39A). Cuando no se produce la incorporación de ceramida, como ocurre en un mutante cwh43Δ, Ted1 no es capaz de actuar, lo que conlleva la retención en el RE de estas proteínas que no han sido correctamente remodeladas (Figura 39B). Sin embargo, si el control de calidad es eliminado (gpi7Δ), el receptor p24 puede interaccionar de forma prematura con estas proteínas ancladas a GPI en las que la ceramida no ha sido remodelada (cwh43Δ), permitiendo su salida del RE a través de los mismos ERES que el resto de proteínas transmembrana, al perder su capacidad de segregación en dominios ricos en ceramida (Figura 39C). Por tanto, la eliminación del control de calidad lleva a la incorrecta segregación de las proteínas ancladas a GPI basadas en ceramida en la membrana del RE. A pesar de que, como se ha explicado, Ted1 estaría monitorizando la incorporación de ceramida en las proteínas ancladas a GPI, esta debe ser capaz de reconocer algo más allá de la porción lipídica, ya que también actúa en las proteínas ancladas a GPI modificadas con DAG como es el caso de Cwp2 (Manzano-Lopez et al., 2015). Esto implicaría que el control ejercido sobre la remodelación de ceramida dependería de la proteína que estuviera anclada al GPI. De acuerdo con esta hipótesis, se sabe que las proteínas ancladas a GPI modificadas con DAG o ceramida contienen secuencias diferentes aguas arriba del sitio de anclaje al GPI, el omega site, el cual se ha propuesto que podría estar involucrado en esta remodelación diferencial del lípido, decidiendo la incorporación o no de ceramida por Cwh43 (Yoko-O et al., 2018). Es más, se ha descrito que la especie lipídica presente repercutiría en su destino final, ya que se ha encontrado DISCUSIÓN 86 que las proteínas ancladas a GPI con ceramida se localizan en la membrana plasmática mientras las que contienen DAG lo hacen en la pared celular (Yoko-O et al., 2018). De esta manera, nuestros resultados junto con datos previos indican que la especie lipídica presente en el GPI estaría participando en la segregación específica de este tipo de proteínas en el RE, lo que estaría ligado a la determinación de su destino final. Por tanto, esta segregación dependiente de ceramida así como el control de calidad ejercido sobre la misma, podrían estar programando y asegurando de forma temprana, la organización funcional en la membrana plasmática de las proteínas ancladas a GPI modificadas con ceramidas. DISCUSIÓN 87 Figura 39. Modelo: Control de calidad sobre la segregación selectiva de las proteínas ancladas a GPI mediada por lípidos (A) El control de calidad actúa asegurando la salida de proteínas ancladas a GPI que contienen ceramida. Solo tras la incorporación de la ceramida por Cwh43, la 2ª-EtNP es eliminada por Ted1, permitiendo la interacción con el receptor p24 y su segregación selectiva en ERES específicos enriquecidos en ceramida. (B) El control de calidad actúa impidiendo la salida de proteínas ancladas a GPI que no han remodelado correctamente la ceramida. Cuando la ceramida no es incorporada a la estructura del GPI, Ted1 no actúa y la 2ª-EtNP previene la interacción con el receptor p24 y, por tanto, la salida del RE. (C) El control de calidad es eliminado, lo que afecta a la segregación de las proteínas ancladas a GPI, que son ahora concentradas en los mismos ERES que el resto de proteínas. La ausencia de la 2ª-EtNP permite la interacción prematura de estas proteínas ancladas a GPI con el receptor p24, las cuales, gracias a la ausencia de ceramida en su estructura, pueden ser incorporadas en los mismos ERES que el resto de proteínas transmembrana. Figura extraída de (Rodriguez-Gallardo et al., 2022). DISCUSIÓN 88 4.2. ¿Cuál es el mecanismo responsable de esta segregación selectiva mediada por lípidos? Nuestro estudio previo reveló que, además de los lípidos, las proteínas también están implicadas en el proceso de sorting en el RE. De hecho, observamos que la formación de clusters de Gas1-GFP no dependía exclusivamente de la presencia de ceramida C26 en la membrana del RE, ya que las proteínas transmembrana componentes del receptor p24 también fueron necesarias para que se diera este proceso. Con objeto de entender cómo operan las proteínas p24 en el clustering mediado por ceramidas C26, empleamos un tipo determinado de simulación de dinámica molecular que ayuda a predecir como se organizan los lípidos de membrana entorno al dominio transmembrana de una proteína específica. Mediante esta técnica observamos que las ceramidas C26 libres de membrana se acumulan en la hemicapa citosólica alrededor del dominio transmembrana de Emp24, siendo excluidas de la hemicapa luminal (Figura 20), generándose por tanto una distribución asimétrica de las ceramidas C26 en la membrana. No obstante, este enriquecimiento asimétrico en la hemicapa citosólica también se observó para las ceramidas de cadena más corta C18. Dado que solo las ceramidas C26 (pero no las ceramidas C18) son capaces de segregar y exportar selectivamente a Gas1, el mecanismo responsable de este fenómeno debe estar relacionado con propiedades biofísicas únicas y especiales de las ceramidas C26. De hecho, experimentos biofísicos han demostrado que, aunque tanto las ceramidas de cadena muy larga C24 como las de cadena más corta C18 pueden formar dominios lipídicos ordenados en liposomas (Castro et al., 2014; Goñi & Alonso, 2009), solo las ceramidas C24 son capaces de deformar la membrana generando curvatura (Pinto et al., 2011). Es más, esta capacidad de promover curvatura y plegamientos en la membrana se debe a la propiedad exclusiva de las ceramidas C24 para interdigitar parcialmente formando fases de interdigitación que teóricamente incrementan el grosor de la membrana (Pinto et al., 2011; Ventura et al., 2020). De hecho, la existencia de estas fases interdigitadas de ceramida de cadena muy larga estaría en consonancia con el papel decisivo que juegan estos lípidos en el proceso de clustering y sorting, tanto las ceramidas C26 del GPI presente en lado luminal (esta tesis doctoral) como las ceramidas DISCUSIÓN 89 libres, especulativamente acumuladas en la hemicapa citosólica alrededor del TMD de Emp24 según la simulación de dinámica molecular (Rodriguez-Gallardo et al., 2020). Basándonos en estos datos, proponemos el siguiente mecanismo para la segregación dependiente de la longitud de la ceramida de las proteínas ancladas a GPI (Figura 40). El complejo p24 une a las proteínas ancladas a GPI modificadas con ceramida en la cara luminal de la membrana del RE, mientras que, las ceramidas libres C26 serían acumuladas en el lado citosólico. La concentración local de ceramidas C26 alrededor de las proteínas p24 en ambos lados de la membrana del RE daría lugar a la interdigitación de las mismas, generándose fases de interdigitación que causarían la curvatura de la membrana y el clustering de las proteínas. Todo esto promovería finalmente la segregación de las proteínas ancladas a GPI y su incorporación selectiva en ERES Figura 40. Modelo: Segregación de proteínas ancladas a GPI dependiente de la longitud del lípido mediado por el receptor p24 Las Proteínas ancladas a GPI correctamente remodeladas con ceramida interaccionarían con el receptor p24 a través de la sección luminal de su tallo transmembrana, mientras que se produciría una concentración de ceramida libre de C26 en la parte citosólica del mismo. La presencia de ceramidas muy larga a ambos lados de la membrana favorecería la interdigitación de estas lo cual promovería la curvatura de la membrana, llevando a la formación de clusters de proteínas ancladas a GPI y su segregación en ERESs específicos enriquecidos en ceramidas muy largas. Figura adaptada de (Aguilera-Romero & Muñiz, 2021). CONCLUSIONES 96 CONCLUSIONES 97 Los resultados obtenidos permiten concluir que: 1. La incorporación de ceramida C26 en el GPI realizada por la enzima Cwh43 es necesaria para la segregación de la proteína anclada a GPI Gas1 y su posterior exportación selectiva a través de ERES específicos. 2. La enzima remodeladora del glicano del GPI Ted1 garantiza la segregación y exportación selectiva de Gas1 a través de ERES específicos monitorizando la correcta incorporación de ceramida C26 en el GPI. 3. El receptor transmembrana p24 promueve la segregación de Gas1 favoreciendo la generación de dominios lipídicos de ceramidas C26 en la membrana del RE. CONCLUSIONES 98 MATERIALES Y MÉTODOS 99 6. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 100 MATERIALES Y MÉTODOS 101 6.1. Organismos y condiciones de cultivo 6.1.1. Cultivo de Escherichia coli La amplificación y conservación a largo plazo de los plásmidos usados en este trabajo se llevaron a cabo en la estirpe de E. coli DH5. Los cultivos de E. coli se incubaron en agitadores orbitales a 37 ºC y 250 rpm usando medio Luria-Bertani, LB (extracto de levadura 0,5%, bacto-triptona 1%, NaCl 0,5%) suplementado con 100 µg/ml de ampicilina (Amp) cuando fue requerida la selección. En el caso del cultivo en medio sólido se complementó el medio LB con agar bacteriológico al 2%. El material y los medios empleados fueron esterilizados mediante un ciclo de autoclave (20 min, 121 ºC). Los antibióticos se incorporaron al medio a partir de una disolución concentrada, esterilizada por filtración a través de membranas de nitrocelulosa de 0,2 μm de diámetro de poro, y teniendo en cuenta que la temperatura del medio no fuera superior a 50 ºC. El medio LB con Amp puede ser almacenado a 4ºC solo durante tres semanas para evitar la degradación del antibiótico. Para la conservación de las estirpes bacterianas a largo plazo, se congelaron a -80 ºC en una mezcla 1:1 de medio LB y glicerol 50%. 6.1.2. Cultivo de Saccharomyces cerevisiae Las estirpes de levaduras utilizadas son derivadas de dos fondos genéticos principalmente: BY4742 y W303. Tabla 1. Estirpes de S. cerevisiae empleadas en este trabajo. Estirpe Genotipo Referencia BY4742 MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 EUROSCARF BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 EUROSCARF FKY4579 MATα gpi7Δ::KANx6 emp24∆::KANx6 his3 ura3 leu2 met15 lys2 K. Funato MATERIALES Y MÉTODOS 102 FKY4580 MATa emp24∆::KANx6 his3 leu2 ura3 met15 LYS2 K. Funato FKY4600 MATa gpi7Δ::KANx6 his3 le2 ura3 met15 lys2 K. Funato FKY4601 MATα cwh43∆::KANx6 his3 le2 ura3 MET15 LYS2 K. Funato FKY4603 MATa gpi7Δ::KANx6 cwh43∆::KANx6 his3 le2 ura3 met15 lys2 K. Funato BY4742/YI5644 MATα bst1Δ::KanMx4 ura3 leu2 his3 lys2 EUROSCARF BY4741/Y01432 MATa ted1Δ::kanMx4 his3 leu2 ura3 met15 EUROSCARF MMY1528 MATα sec31-1 SEC13-mCherry::TRP ura3 leu2 his3 ade2 S. Sabido-Bozo MMY1562 MATα sec31-1 SEC13-mCherry::TRP bst1Δ::Hph ura3 leu2 ade2 his3 ade2 S. Rodriguez MMY1563 MATα sec31-1 SEC13-mCherry::TRP Cwh43Δ::Hph ura3 leu2 ade2 his3 ade2 S. Rodriguez MMY1583 MATα sec31-1 SEC13-mCherry::TRP GALprom-MID2iRFP::URA3 leu2 his3 ade2 S. Rodriguez MMY1584 MATα sec31-1 SEC13-mCherry::TRP gpi7∆::KAN MID2iRFP::URA3 leu2 his3 ade2 S. Rodriguez MMY1760 MATα sec31-1 sec13-mcHerry::TRP1 Gal-P-MID2iRFP::URA3 gpi7∆::KanMx cwh43∆::Hph leu2 ade2 S. Rodriguez MMY2853 MATα sec31-1 mRFP-WALP29-ssxx::URA3 ura3 leu2 his3 ade2 trip1 S. Sabido-Bozo MMY1854 MATα sec31-1 sec31-1 mRFP-WALP21-ssxx::URA3 ura3 leu2 his3 ade2 trip1 S. Sabido-Bozo RH4442 MATα emp24Δ::kanMx4 ura3 leu2 ade2 ade3 his3 trp1 bar1 (W303) H. Riezman VGY381 MATa ura3-1 leu2-3 his3-11 trp1-1 ade2-1 can1-100 V. Goder MMY1811 MATα emp24Δ::kanMx4 EMP24-inv::TRP1 ura3 leu2 ade2 ade3 his3 trp1 bar1 (W303) S. Sabido-Bozo MATERIALES Y MÉTODOS 103 MMY1594 MATα sec31-1 SEC13-mCherry::TRP emp24Δ::Hph ura3 leu2 his3 ade2 S. Rodriguez MMY1857 MATα sec31-1 emp24Δ::Hph EMP24-inv::TRP1 ura3 leu2 his3 ade2 ade3 trp1 S. Sabido-Bozo Las levaduras se cultivaron en medio completo (YPD) o en medio mínimo sintético (SC). La composición del medio YPD fue 1% de extracto de levadura, 2% de peptona, suplementado con 0.2% de adenina y uracilo y conteniendo 2% de glucosa (YPD), rafinosa (YPR) o galactosa (YPG) como fuente de carbono. Cuando se requirió crecer las células en medios selectivos se usó medio mínimo (SC: glucosa 2% o SG: galactosa 2%, Base Nitrogenada de levadura (YNB; Difco) 0,67%) suplementado con 40 mg/l de aminoácidos y bases nitrogenadas (uracilo, adenina, L-triptófano, L-histidina, L-leucina, L-lisina y/o L-metionina), dependiendo de las auxotrofías de las estirpes a cultivar. Las placas de medio completo, YPD, y medio mínimo, SC, se obtuvieron suplementando con 2% de agar bacteriológico el medio líquido, y su posterior esterilización en autoclave. Cuando fue necesario se añadieron antibióticos al medio sólido a 55ºC: 200 μg/ml G-418 (Sigma) o 150 μg/ml Higromicina B (Amresco). La esterilización se llevó a cabo mediante un ciclo en autoclave (20 min, 121 ºC), excepto las soluciones concentradas de YNB y de L-triptófano que se filtraron y añadieron posteriormente al medio. Las levaduras se incubaron a 24 ºC en agitación (250 rpm) en tubos de 12ml o matraces Erlenmeyer y se dejaron crecer en las mismas condiciones sin sobrepasar una DO600 igual a 1 durante el tiempo necesario para obtener el número total de células necesario para cada experimento. Para la conservación de las estirpes a largo plazo, se congelaron a -80ºC en una mezcla 1:1 de medio YPD y 50% glicerol. Para la esporulación, los diploides crecieron durante 24 horas en medio de preesporulación, Pre-SPO (glucosa 10%, extracto de levadura 0,8%, peptona 0,3%, agar 2%) y posteriormente se transfirieron a medio de esporulación, SPO (acetato potásico 1%, glucosa 0,05%, extracto de levadura 0,1%, agar 2%). Para la determinación del sexo de MATERIALES Y MÉTODOS 104 las cepas tras la micromanipulación se recurrió a placas de halo. Se empleó medio YPD acidificado hasta pH 5,5 con HCl (Panreac), para la base de las placas. Para el medio de cobertera se redujo la concentración de agar bacteriológico hasta 0,8%. Las células hipersensibles al factor alfa (RH123) se añadieron cuando el medio de cobertera esterilizado se enfrió hasta 45ºC. Posteriormente, se añadieron 5 ml de dicha suspensión celular sobre las placas de YPD pH 5,5. 6.2. Técnicas genéticas 6.2.1. Técnicas de manipulación de ADN Las técnicas básicas de manipulación de AND fueron realizadas como se describe en el manual Sambrook & Russell (Sambrook, 2001). 6.2.1.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Las PCRs se realizaron con una AND polimerasa de alta fidelidad, VELOCITY DNA polymerase (Bioline) siguiendo las indicaciones del manual de la enzima. Se empleó el termociclador MJ Mini (Bio-Rad). El AND fue purificado usando el producto ISOLATE II PCR and Gel Kit (Bioline). Los oligonucleótidos fueron sintetizados por la empresa StabVida. 6.2.1.2. Restricción enzimática y ligación de plásmidos o fragmentos de ADN Las enzimas de restricción y la ligasa (T4 DNA ligase) fueron adquiridas de la empresa New England Biolabs. Las reacciones fueron llevadas a cabo tal y como se especifica en las recomendaciones del fabricante. Para prevenir la religación de los plásmidos digeridos se desfosforilaron los extremos con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich). MATERIALES Y MÉTODOS 105 6.2.1.3. Separación y visualización de los fragmentos de AND en geles de agarosa La separación de los fragmentos de ADN se llevó a cabo mediante electroforesis en geles de agarosa. Los geles se prepararon en tampón TAE (40 mM Tris, 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA) con una concentración de agarosa (p/v) del 1%. Las muestras se suplementaron con tampón de carga (1 mM EDTA pH 8, azul de bromofenol 0,25%, glicerol 50%). Las electroforesis se llevaron a cabo en cubetas horizontales de BioRad, aplicando un voltaje constante de 120V. Para la detección del ADN en los geles y su visualización, éstos se sumergieron en una solución de bromuro de etidio (1 μg/ml) durante 20 minutos. La visualización de los geles se llevó a cabo con un transiluminador de luz ultravioleta. La extracción y purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa fue realizada usando el producto ISOLATE II PCR and Gel Kit (Bioline). Para estimar la pureza y la concentración del AND obtenido se usó un espectofotómetro Nanodrop ND-1000. 6.2.2. Purificación de ADN desde Escherichia coli La purificación de plásmidos a partir de estirpes de E. coli se realizó por el método de lisis alcalina con las soluciones proporcionadas en el kit MIDIPrep (Sgima-Aldrich). Se partió de cultivos de E. coli suplementados con 100 ug/ml de amplicilina como marcador selectivo, habiendo crecido toda la noche a 37 ºC en agitación, se recogió por centrifugación (5 min a 3.000 g) en tubos de 1,5 ml. El precipitado celular se resuspendió en 100 μl de solución I (Resuspension solution: 25 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM glucosa, 10 mM EDTA pH 8), se añadieron 200 μl de solución II (Lysis solution: 0,2 N NaOH, SDS 1% (p/v)) y se mezclaron las muestras invirtiendo suavemente. Para neutralizar, se añadieron 150 μl de solución III (Neutralization solution: 5 M acetato potásico pH 4,8) y se volvió a mezclar invirtiendo los tubos. A continuación, se centrifugaron las muestras durante 15 min a 13.000 g, tras lo que se retiró el sobrenadante a un nuevo tubo. El ADN se precipitó a partir de los sobrenadantes de la fase acuosa mediante la adición de 1 ml de etanol absoluto e incubación a -20 ºC durante 30 minutos. El precipitado de ADN se MATERIALES Y MÉTODOS 112 durante 15 minutos a temperatura ambiente en una solución que contiene; TBS-Tween20, 100mM de β-mercaptoetanol y 2% de SDS. Posteriormente se eliminaron los restos de este tampón lavando las membranas 3 veces durante 5 minutos con TBS-Tween-20 y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en el tampón de stripping (25mM Glicina-HCl, pH2, 1% SDS). Por último, las membranas fueron conservadas en tampón TBS-Tween-20 complementado con 5% (p/v) de leche en polvo o sometidas a otro Western Blot directamente. 6.3.5. Ensayo de co-inmunoprecipitación Para estudiar la interacción in vivo entre proteínas se realizaron ensayos de coinmunoprecipitación en fracciones enriquecidas en RE, tal y como se describe en (Rodriguez-Gallardo et al., 2020). Para ello, se partió de cultivos de levadura en fase exponencial. Se recogieron 100 x 107 células, las cuales fueron lavadas dos veces en tampón TNE (50 mM tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) suplementado con 0,5 mM PMSF, 1 μg/ml de mezcla de inhibidores de proteasas y rotas con bolas de vidrio en beadbeater. A continuación, las bolas de vidrio y las células no rotas fueron eliminadas mediante centrifugación a 1.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante fue centrifugado a 13.000 g durante 15 minutos a 4 ºC para obtener las fracciones enriquecidas en RE. El pellet fue resuspendido en TNE 1% Digitonina y la suspension fue incubada 1 hora a 4 ºC con rotación. Tras la incubación con el detergente, se eliminaron los contenidos insolubles centrifugando a 17.000 g durante 1 hora a 4 ºC. Para la inmunoprecipitación de Gas1-GFP, las muestras fueron primero preincubadas con bolas de agarosa vacías (ChromoTek) a 4 ºC durante 1 hora (Bloqueo) y posteriormente incubadas con bolas con anticuerpos GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 ªC durante 3 horas. Tras la inmunoprecipitación, las bolas fueron lavadas cinco veces con TNE 0,2 % Digitonina y eluídas en tampón de carga Laemli 2X. Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE e inmunoblot. MATERIALES Y MÉTODOS 113 6.3.6. Pulso y caza El análisis de Gas1-GFP por pulso y caza con [35S]-metionina fue realizado tal y como se describe en (Kajiwara et al., 2008). Las células fueron crecidas toda la noche en SDYE (2% glucosa, 1% extracto de levadura YNB 0,67%, suplementado con 40 mg/l de aminoácidos) y lavadas dos veces con SC sin metionina. Se tomaron 3 x 107 células por punto de tiempo y fueron resuspendidas e incubadas durante 15 minutos en 0,5 ml/punto de SC sin metionina. A continuación, se sometieron a un pulso de 5 minutos con 100 µCi/punto de S35 (Perkin Elmer), tras lo cual se procedió a la caza para los tiempos indicados (0, 30 y 60 minutos). La caza se inició añadiendo el volumen necesario de la mezcla 100X: 0.3% metionina, 0.3% cisteína y 0,3 M de sulfato de amonio. A los tiempos indicados, las muestras fueron tomadas y añadidas a microtubos que contenían azida y fluoruro de sodio a una concentración final de 10 mM. Las células marcadas radioactivamente fueron resuspendidas en TEPI (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 µg/ml inhibidor de proteasas) y rotas en vortex durante 15 minutos a 4 ºC con bolas de vidrio. El lisado se calentó a 95 ºC durante 5 minutos en presencia de SDS al 1%, tras lo cual se centrifugó durante 15 minutos. El sobrenadante se añadió a 5 ml de TNET (TNE al 1% de Triton X-100) y fue incubado con 100 µl de bolas de proteína A-sefarosa (ThermoFisher Scientific) y anticuerpo contra Gas1 durante 3 horas a 4 ºC. Las bolas fuero lavadas cuatro veces con TNET y luego resuspendidas en tampón Laemli. El inmunoprecipitado fue analizado por SDS-PAGE con la consiguiente exposición y cuantificación del gel en un PhosphorImager (FujiFilm FLA5100). El porcentaje de proteína Gas1 madura fue determinado tomando la proporción de la forma madura de 125 KDa con respecto al total de la señal (bandas de 125 KDa y 105 KDa) y multiplicándolo por 100. 6.3.7. Análisis de la composición lipídica celular in vivo El marcaje in vivo de lípidos con [3H]myo-inositol fue realizado tal y como se describe en (Ikeda et al., 2021). MATERIALES Y MÉTODOS 114 Los lípidos marcados fueron extraídos con cloroformo-metanol-agua (10:10:3, vol/vol/vol) y analizados por cromatografía de capa fina (Thin Layer Chromatography) usando un sistema de solventes (cloroformo-metanol-0,25% KCL (55:45:10, vol/vol/vol)) para esfingolípidos complejos. Los esfingolípidos marcados fueron visualizados y cuantificados usando un sistema FLA-7000 (FujiFilm). 6.4. Análisis del glicano del GPI por espectrometría de masas Las células (600 x 107), que expresaban Gas1-GFP, fueron lavadas dos veces en tampón TNE y rotas con bolas de vidrio, tras lo cual, dichas bolas y las células no rotas fueron eliminadas por centrifugación. El sobrenadante se sometió a una centrifugación a 17.000 g durante 1 h a 4 ºC. El pellet fue incubado con 1U de PI-PLC (Invitrogen) en TNE 0,2% Digitonina durante 1 h a 37 ºC. Después del tratamiento enzimático se eliminaron las membranas por centrifugación a 17.000 g durante 1 h a 4 ºC. Para la inmunoprecipitación de Gas1-GFP, el sobrenadante fue incubado con bolas GFP-Trap_A (ChromoTek) durante toda la noche a 4 ºC. Las muestras purificadas de Gas1-GFP fueron sometidas a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), los cuales fueron teñidos con Coomassie Brilliant Blue. Las bandas teñidas correspondientes a Gas1-GFP se extrajeron del gel y, tras la alquilación con idoacetamida y la reducción con DTT, fueron digeridas con tripsina. Los péptidos obtenidos fueron extraídos, secados y resuspendidos en 20 μl de agua. Una parte (8 μl) fue inyectada en la LC (Cromatografía Líquida). Los péptidos fueron separados en una columna ODS (Develosil 300ODS-HG-5; 150 × 1.0 mm ID, Nomura Chemicals) bajo unas condiciones específicas de gradiente. Las fases móviles fueron; solvente A (0,08% ácido fórmico) y solvente B (0,15% ácido fórmico en 80% de acetonitrilo). La columna fue eluída con el solvente A durante 5 minutos, momento en el cual la concentración del solvente B fue aumentando hasta el 40% en 55 minutos con un flujo de 50 μl/min usando un sistema Accela-HPLC (Thermo Fisher Scientific). El eluído fue introducido de forma continua en una fuente ESI (Ionización por Electrospray) y los péptidos fueron analizados por LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Para los MATERIALES Y MÉTODOS 115 ajustes del MS, el voltaje de la entrada a los capilares fue de 4,5 kV y la temperatura fue mantenida a 300 ºC. El voltaje de los capilares y de las lentes tubulares fue de 15 V y 50 V, respectivamente. Los datos de MS fueron obtenidos en el modo de iones positivos en un rango de masa de m/z 300 a m/z 3000 (resolución: 60.000, precisión: 10 ppm). 6.5. Microscopía de fluorescencia Para los experimentos de microscopía de fluorescencia de Gas1-GFP y Mid2-VENUS las células fueron cultivadas en medio YPD durante toda la noche, recolectadas por centrifugación, lavadas dos veces con PBS pH 7,4 e incubadas 15 minutos en hielo previa visualización al microscopio, tal y como se describe en (Rolli et al., 2009). Para la visualización in vivo de los mutantes termosensibles sec31-1, los cuales expresan la construcción de Gas-GFP bajo el promotor GAL1, fueron crecidos toda la noche a 24 ºC en YPR. Después de la inducción durante 1 hora a 24 ºC en YPG, las células fueron incubadas a 37 ºC durante 30 minutos en SG, tras lo cual se produjo la liberación del sistema gracias al cambio a temperatura permisiva (24 ºC). 6.5.1. Fluorescencia convencional La adquisición fue llevada a cabo usando el microscopio Leica DMi8 equipado con un objetivo (HCX PL APO 1003/1.40OIL PH3 CS), un filtro L5, cámara Hamamatsu y el software LASX (Leica Application Suite X) para la toma de imágenes. 6.5.2. Super Resolution Confocal Live Image Microscopy (SCLIM) Para la toma de imágenes usando SCLIM las células fueron inmovilizadas en el portaobjetos usando concavalina A. El SCLIM fue desarrollado combinando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus modelo IX-71 con una lente objetivo de inmersión en aceite UPlanSApo 100× NA 1.4 (Olympus), un escáner confocal spinnind- MATERIALES Y MÉTODOS 116 disk de alta velocidad y alto ratio señal/ruido (Yokogawa Electric), una unidad espectroscópica de diseño propio, un intensificador de imagen (Hamamatsu Photonics) equipado con un sistema de refrigeración propio, un sistema de magnificación final de 266,7X y cámaras EM-CCM (Hamamatsu Photonics) (Kurokawa et al., 2013). La adquisición de imágenes fue realizada gracias a un programa de desarrollo propio (Yokogawa Electric). Para la toma de imágenes en 3D se tomaron secciones ópticas con un espaciado de 100 nm. Las imágenes de Z-stacks fueron convertidas a volúmenes 3D y procesadas por deconvolución gracias al programa Volocity (Perkin Elmer) usando el PSF (point-spread function) teórico para los microscopios confocales con spinning disk. La cuantificación de los ERES que contenían cargo fue realizada por análisis de colocalización con el programa Volocity. 6.6. Análisis estadístico La significancia estadística fue determinada usando la prueba T de Student (n.s. no significativo; * p < 0.05; **, p < 0.01 y ***, p < 0.001). Se muestra la media y la desviación estándar de tres réplicas biológicas independientes. BIBLIOGRAFÍA 117 7. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 118 BIBLIOGRAFÍA 119 Aguilera-Romero, A., Kaminska, J., Spang, A., Riezman, H., & Muñiz, M. (2008). 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