Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic

Treball de Fi de Grau Grau en enginyeria química Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic MEMÒRIA Autor: Gerlac Via Martinez-Seara Director: Jordi Bou Convocatòria: Gener 2017 Escola Tècnica Superior d’Enginyeria Industrial de Barcelona Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 1 Resum En aquest treball s’ha dissenyat un bioreactor per lots de 350 L per produir 350 kg anuals de l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic a partir de 2-metil-1,3-propandiol mitjançant una fermentació duta a terme pel bacteri Gluconobacter oxydans. Per fer-ne el disseny s’ha pres com a guia l’estudi fet sobre aquesta fermentació per Sang-Hyun Pyo (1). S’ha començat amb una Introducció Teòrica que pretén posar-nos en el context d’aquest projecte. S’inicia amb un primer apartat que fa una descripció del panorama actual de les biorefineries. En el següent es fa una introducció dels microorganismes d’ús industrial i en particular dels que s’usaran en el nostre bioreactor, els Gluconobacter oxydans. A continuació es parla sobre l’estat de l’art de l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic. Per finalitzar aquesta introducció teòrica s’estudien els tipus de bioreactors i els mètodes d’operació típics. En el següent punt, Materials i Equips, es fa una breu explicació de l’origen de les referències que es trobaran al final del treball i dels softwares. Tot seguit, en l’apartat Resultats és on es trobarà tots allò que té relació amb el disseny en sí. En aquest capítol hi ha especificades totes les decisions preses basades en la bibliografia sobre la temàtica. S’hi trobaran també totes les operacions que han calgut pel disseny. Així doncs s’ha dissenyat un bioreactor per lots de 350 L (235L de volum de treball) amb unes dimensions D=650 mm i H= 980 mm i una productivitat de 6.6 g/L al final de les 8 hores que dura la fermentació. S’han usat 4 deflectors per evitar la formació de vòrtex a causa de la forta agitació (500 rpm). Aquesta es basa en una doble turbina Rushton de D= 217 mm impulsada per un motor de 3kW. L’aeració requerirà un motor de 100 W i es donarà mitjançant un anell ruixador d’igual diàmetre que la turbina. Finalment per mantenir la temperatura, al ser una fermentació curta, s’ha usat un aïllant, concretament un de 8 cm de gruix. Aquesta espessor ens assegurarà que la temperatura no baixi de 28ºC durant la fermentació. Ja per finalitzar s’ha fet un Estudi econòmic que ha resultat en un cost total del projecte de 17688,06 € i un Estudi de l’impacte ambiental on es calculen les emissions de CO2, que han resultat en 11415.6 kg anuals. En l’apartat Organització del projecte es pot veure com s’ha planificat tot el treball. 2 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Sumari RESUM ............................................................................................................................................... 1 SUMARI ............................................................................................................................................. 2 1. PREFACI ................................................................................................................................... 5 1.1. Motivació del projecte ..................................................................................................................... 5 1.2. Abast del projecte ............................................................................................................................ 5 2. OBJECTIUS ............................................................................................................................... 6 2.1. Objectiu general .............................................................................................................................. 6 2.2. Objectius particulars ........................................................................................................................ 6 3. INTRODUCCIÓ ........................................................................................................................ 7 3.1. Teoria 1: Les biorefineries, comparativa amb les refineries de petroli ............................................. 7 3.1.1. Definició del concepte Biorefineria ................................................................................................... 7 3.1.2. Biomassa ............................................................................................................................................ 8 3.1.3. Tipus de biorefineries ........................................................................................................................ 9 3.1.3.1. Convencionals ......................................................................................................................... 10 3.1.3.2. Whole Crop Biorefinaries (WCBR) .......................................................................................... 10 3.1.3.3. Biorefineries Oleoquímiques .................................................................................................. 11 3.1.3.4. Lignocellulosic feedstock biorefineries ................................................................................... 11 3.1.3.5. Green biorefineries ................................................................................................................. 12 3.1.3.6. Biorefineries marines .............................................................................................................. 13 3.1.4. Comparativa de les biorefineries amb la refineries petroquímiques .............................................. 15 3.1.4.1. Intermedis base C2 ................................................................................................................. 17 3.1.4.2. Intermedis base C3 ................................................................................................................. 17 3.1.4.3. Intermedis base C4 ................................................................................................................. 18 3.2. Teoria 2: Microorganismes i els seus processos fermentatius. Cinètica del creixement microbià. 19 3.2.1. Microorganismes ............................................................................................................................. 19 3.2.1.1. Arqueus ................................................................................................................................... 20 3.2.1.2. Bacteris.................................................................................................................................... 20 3.2.1.3. Fongs ....................................................................................................................................... 21 3.2.2. Perills associats amb l’ús industrial de microorganismes ................................................................ 23 3.2.3. Necessitats nutritives dels microbis ................................................................................................ 24 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 3 3.2.3.1. Absorció dels nutrients ........................................................................................................... 25 3.2.4. Gluconobacter oxydans ................................................................................................................... 26 3.2.4.1. Efectes de les condicions en el cultiu ..................................................................................... 27 3.2.5. Cinètica del creixement microbià .................................................................................................... 28 3.3. Àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic. Estat de l’art i usos industrials. .................................................. 34 3.3.1. Importància de la quiralitat ............................................................................................................. 34 3.3.2. Obtenció de l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic ............................................................................... 36 3.3.2.1. Mètodes químics .................................................................................................................... 36 3.3.2.2. Mètodes biològics ................................................................................................................... 37 3.3.3. Ús industrial de l’àcid β-hidroxi-isobutíric ....................................................................................... 39 3.3.4. Àcid metacrílic i metacrilat de metil. ............................................................................................... 42 3.3.4.1. Procés d’obtenció ................................................................................................................... 42 3.3.4.2. Reaccions ................................................................................................................................ 43 3.4. Fermentadors i bioreactors ........................................................................................................... 44 3.4.1. Efectes dels paràmetres químics i físics ........................................................................................... 45 3.4.1.1. Temperatura ........................................................................................................................... 45 3.4.1.2. pH ............................................................................................................................................ 46 3.4.1.3. Disponibilitat d’oxigen ............................................................................................................ 46 3.4.1.4. Espuma .................................................................................................................................... 47 3.4.2. Control dels paràmetres químics i físics .......................................................................................... 47 3.4.2.1. Agitació ................................................................................................................................... 47 3.4.2.2. Transferència de calor ............................................................................................................ 48 3.4.2.3. Transferència de massa .......................................................................................................... 49 3.4.2.4. Addició de substàncies. pH i espuma ..................................................................................... 51 3.4.3. Mètodes d’operació i tipus de fermentadors .................................................................................. 52 3.4.3.1. Procés continu ........................................................................................................................ 53 3.4.3.2. Procés discontinu (batch) ....................................................................................................... 54 3.4.3.3. Procés fed-batch ..................................................................................................................... 54 3.4.4. Esterilització ..................................................................................................................................... 55 4. MATERIALS I EQUIPS ....................................................................................................... 57 5. RESULTATS .......................................................................................................................... 58 5.1. Condicions de la fermentació......................................................................................................... 59 5.1.1. Subministrament d’oxigen ............................................................................................................... 59 5.1.2. Temperatura .................................................................................................................................... 61 5.1.3. pH ..................................................................................................................................................... 62 5.1.4. Espuma ............................................................................................................................................. 63 5.1.5. Agitació ............................................................................................................................................. 63 5.1.6. Cultiu i manteniment del microorganisme ...................................................................................... 64 4 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 5.2. Disseny de la fermentació .............................................................................................................. 64 5.2.1. Duració dels cicles i productivitat .................................................................................................... 64 5.2.1. Disseny del fermentador pels microorganismes ............................................................................. 66 5.2.2. Volum de treball i volum del fermentador ...................................................................................... 68 5.2.3. Paràmetres de forma del fermentador ........................................................................................... 69 5.2.4. Determinació de la geometria del recipient .................................................................................... 70 5.2.5. Deflectors ......................................................................................................................................... 71 5.2.6. Agitador i motor ............................................................................................................................... 72 5.2.7. Aeració ............................................................................................................................................. 75 5.2.8. Disseny de l’aïllant ........................................................................................................................... 76 5.2.9. Vàlvules i ports ................................................................................................................................. 77 5.2.9.1. Tapa ......................................................................................................................................... 77 5.2.9.2. Sortides ................................................................................................................................... 78 5.2.9.3. Vàlvules ................................................................................................................................... 80 5.3. Disseny en Solidworks® ................................................................................................................. 80 5.4. Plànols del Disseny ........................................................................................................................ 85 5.5. Pla d’operacions i seguretat ........................................................................................................... 89 6. ESTUDI ECONÒMIC ........................................................................................................... 92 7. ESTUDI DE L’IMPACTE AMBIENTAL ........................................................................... 93 8. ORGANITZACIÓ DEL PROJECTE ................................................................................... 95 CONCLUSIONS ............................................................................................................................. 96 BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................ 97 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 5 1. Prefaci 1.1. Motivació del projecte Entre els objectius de la Química i d’acord a les tendències de respecte pel medi ambient, hi ha la fabricació de productes de gran consum pels mitjans més eficients i nets possibles. Per això darrerament s’han proposat molts processos biològics per a obtenir productes que abans eren derivats dels petroli, indústria altament contaminant i responsable d’un gran impacte ambiental negatiu. Per aquesta raó la recerca de processos biològics amb uns rendiments semblants als que s’obtindria pels camins típics i amb un impacte ambiental molt menor és de gran importància. Actualment l’àcid metacrílic i el metacrilat de metil s’obtenen per l’anomenada via ACH, a partir de la cianhidrina de l’acetona. Aquesta ruta, tot i ser la més utilitzada pels bons rendiments que dóna, usa primeres matèries molt contaminants, té uns costos de procés molt alts i produeix gran quantitat de subproductes. Així doncs trobar una forma alternativa per produir aquests monòmers és d’importància cabdal. El producte que es vol obtenir, l’àcid 2-metil-3-hidròxidpropanoic, és una substància quiral. Sectors com el farmacèutic han augmentat la seva demanda de substàncies enantiomèricament pures, i l’ús d’intermedis quirals és de les millors formes d’obtenir-les. 1.2. Abast del projecte Així doncs en aquest projecte es vol trobar una forma de produir a escala pilot una substància que de ben segur tindrà gran importància pels sectors mencionats: el farmacèutic i el dels plàstics. I aconseguir així una alternativa als processos actuals, molt perjudicials pel medi ambient. El que proposarem aquí és un disseny d’un fermentador a escala pilot mitjançant uns microorganismes que ja tenen certa presència en la indústria, els Gluconobacter oxydans, i que tenen la característica de catalitzar la oxidació incompleta de alcohols i sucres a els corresponents aldehids, cetones i àcids carboxílics. A més a més és un organisme no patogen qualificat com a no perillós per a humans ni animals. Aquesta és una temàtica poc estudiada però que ha pres certa importància darrerament, la majoria dels estudis relacionats amb aquesta fermentació daten dels últims 20 anys. 6 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 2. Objectius 2.1. Objectiu general L’objectiu principal d’aquest treball serà dissenyar un fermentador a escala pilot per a produir 350 kg anuals d’àcid 2-metil-3hidroxipropanoic a partir de Gluconobacters oxydans. I mostrar les competències adquirides al llarg del grau d’Enginyeria Química per determinar totes les condicions operatives així com fer-ne el disseny en 3D i els plànols mitjançant un software pertinent. 2.2. Objectius particulars Per tal d’assolir l’objectiu principal s’aniran assolint una sèrie d’objectius menors que desencadenaran en el disseny del fermentador, aquests són: i. Escollir un bacteri adequat per a la producció de l’àcid a partir de la bibliografia disponible. ii. Estudiar la cinètica de creixement i producció de l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic. iii. Seleccionar el tipus de fermentador i el mètode d’operació idoni pels nostres interessos. iv. Determinar la geometria del fermentador. v. Seleccionar les condicions d’operació pertinents fent un estudi de la bibliografia disponible sobre la temàtica. vi. Presentar un disseny original del fermentador que inclogui les eleccions preses anteriorment. vii. Proposar un pla d’operacions. viii. Fer un estudi econòmic i un estudi de l’impacte ambiental. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 7 3. Introducció 3.1. Teoria 1: Les biorefineries, comparativa amb les refineries de petroli Cada vegada més es fan passes cap a un desenvolupament d’una economia més biològica reemplaçant així els materials fòssils en els processos industrials. Així com per la producció d’energia hi ha varies alternatives (eòlica, solar, nuclear, hidràulica..), per a la producció sostenible de productes comercialitzables com alternativa a la basada en primeres matèries fòssils no n’hi ha tantes. L’esgotament d’aquest materials fòssils, l’extrema volatilitat dels preus i la demanda fluctuant fan que siguin necessaris sistemes més robustos per tal de guanyar en competitivitat a llarg termini (2). Aquest canvi en la economia implica l’ús de les anomenades biorefineries. Però què és una biorefineria? 3.1.1. Definició del concepte Biorefineria Biorefinar és el que s’entén com processament sostenible de biomassa cap a diferents productes comercialitzables i d’energia. Això vol dir que pot ser un procés, una instal·lació o bé una planta de processament. Un dels factors de més importància en l’establiment d’un biorefineria és la seva sostenibilitat al llarg de tot el seu cicle de vida (construcció, operació i desmantellament). Així doncs s’hauran de tenir en compte diferents factors: la disponibilitat d’alimentació i de biomassa, l’impacte en l’ús de l’aigua i la seva qualitat o els riscos toxicològics i l’impacte en la biodiversitat, entre d’altres. Com que l’avaluació de la seva sostenibilitat no es pot fer en termes absoluts, s’acostuma a fer una comparativa amb els sistemes convencionals per a la producció dels mateixos productes i serveis, per exemple comparant un producte fet a partir de matèries fòssils amb un fet a partir de processos biològics. No és un concepte completament nou. Hi ha molts exemples de processos tradicionals de conversió de biomassa que podrien ser quasi considerats com a propis d’una biorefineria. La utilització de la canya de sucre data des de el 6000 aC. a l’Àsia i la importació d’aquesta es va establir des de el s. XV. En aquest camp A.S. Marggraf, 8 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic científic alemany, va publicar el 1748 els seus estudis sobre l’obtenció de sucre a partir d’arrels i remolatxa. Tot i així no és fins els anys 90 que la utilització de recursos renovables per a la producció de productes no alimentaris fomenta la recerca i el desenvolupament, amb un creixement de l’atenció professada per la l’industria i la política del moment. És en aquest moment quan apareix el terme “biorefineria”. Aquest tipus de refinaria combina les tecnologies essencials per a transformar les primeres matèries biològiques en productes intermedis i finals (Il·lustració 1). Il·lustració 1: Principis bàsics d’una biorefineria (3) 3.1.2. Biomassa Les biorefineries utilitzen com a combustible la biomassa. Aquesta pot tenir molts orígens depenent de raons tals com la disponibilitat, la localització o el preu. Pot tenir una procedència forestal, venir de l’agricultura, de residus urbans i industrials o d’altres. Actualment s’utilitzen 6·109 tones de les anualment produïdes, 1.7-2.0·1011 tones. D’aquestes sols del 3 al 3.5% serveixen per aplicacions fora de l’alimentació Hi ha moltes definicions per el terme biomassa, per exemple:  Tota la matèria orgànica viva present en el nostre ecosistema.  Tota la matèria vegetal constantment produïda per fotosíntesis amb un total anual de 170 billons de tones (excloent les plantes marines).  La massa cel·lular de plantes animals i microorganismes usats com a matèries primeres en processos microbiològics Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 15 3.1.4. Comparativa de les biorefineries amb la refineries petroquímiques Actualment gràcies als productes amb base biològica s’arriben a generar entre 10 i 15 bilions de dollars americans dins de la indústria química global (2). Cada vegada més aquests productes guanyen en importància en front dels mateixos obtinguts per la via fòssil. Arribat al punt que oficialment estan descrits pel departament d’energia dels Estat Units els que ells consideren com els productes bàsics que han de ser els fonaments de la indústria bioquímica actual i futura, anomenats per la seva primera publicació del 2004 “the DOE “top 10” report” (9). Taula 2: Llista revisada el 2010 del "DOE "top 10" report" amb els criteris continguts en el mateix (9) A la taula 3 es poden veure algunes de les similituds i diferències entre les refineries de petroli i les biorefineries: l’alimentació, els intermedis base, molècules a partir de les quals es sintetitzen la gran majoria de productes; les tecnologies emprades i els productes que es produeixen en cada tipus de refineria. 16 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Taula 3: Diferències generals entre una refineria fòssil i una biorefineria (2) La principal diferència entre la biomassa i les primeres matèries fòssils és el contingut en oxigen. Així doncs les composicions CHO serien: 85-90% de C, 10-14% de H i entre 01,5% de O pel petroli; 76% de C, 13% de H i 11% de O per olis vegetals i grasses animals; i 50% de C, un 6% de H i fina a un 43% de O en el cas d’una biomassa lignocel·lulòsica. Tot i això encara és atractiu en el panorama actual intentar integrar el que es pugui les refineries fòssils amb les noves biorefineries. Un exemple de la viabilitat d’aquesta interacció la trobem en el “green biodièsel”, produït amplament a partir de la hidrogenació catalítica d’olis vegetals o grassa animal utilitzant hidrogen disponible en les mateixes refineries (Petrobaras H-bio process o UOP/ENI process en són exemples). Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 17 Intermedis base, com ara els olis provinents de la biomassa o el syngas, són alguns dels exemples d’aquesta integració. En aquest dos casos es pot fer el posterior processament cap a recursos més valuosos en instal·lacions petroquímiques (processos de craqueig, hidrotractaments, gasificacions, etc.). A més, les biorefineries són cada vegada més una font alternativa de recursos, com ara en el cas d’intermedis base C2, C3 o C4; fins la seva aparició només produïbles a partir de recursos fòssils com són el carbó, el petroli i al gas natural. 3.1.4.1. Intermedis base C2 Com a font de nutrients, en la biotecnologia s’acostuma a utilitzar la glucosa. Aquesta última a partir d’una fermentació alcohòlica es desintegra obtenint-se com a producte final principal etanol, intermedi base C2. Aquest bioetanol pot ser usat com a combustible o bé deshidratar-se amb un catalitzador (Al2O3MgO o zeolita) portant a l’etilè. Aquest etilè és una font alternativa de la que s’obté en la piròlisis, on s’aplica vapor d’aigua i altes temperatures a les fraccions lleugeres del petroli (GLP, nafta i gasoil). 3.1.4.2. Intermedis base C3 L’obtenció d’aquests intermedis es pot fer mitjançant processos químics o bioquímics a partir de biomassa:  En la producció de combustible per automòbils a partir olis vegetals i grasses animals també es forma propà com a coproducte.  Un altre camí per obtenir biopropilè i biopropà passa per la deshidratació i hidrogenació del glicerol, obtingut per fermentació de la biomassa o en la producció de biodièsel com a subproducte.  També és possible la gasificació de la biomassa per a produir syngas seguida de la sintetització de biometanol, i finalment algun procés de metanol cap a olefines (per exemple Fischer Tropsch) de cara a obtenir biopropilè.  A partir de la fermentació de sucres per a produir bioetanol, deshidratant aquest a bioetilè, dimerització per a obtenir butens, i reacció de metàstasis amb bioetilè per a produir propilè. Així doncs hi ha moltes maneres alternatives d’obtenir propilè, un dels intermedis químics de més demanda, a partir de fonts renovables. El propilè té un paper crucial en la producció de productes químics de tres àtoms de carboni i té un paper com a intermedi 18 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic en l’obtenció de productes molt diversos: explosius, cosmètics, polímers, dissolvents, resines, etc. Il·lustració 7: Camins de síntesis a partir de la biomassa per a obtenir biopropilè (2) Un altre producte químic base de tres carbonis és l’àcid làctic. És sintetizable per dos camins: fermentació de carbohidrats o conversió química a partir del glicerol. Aquest àcid ens porta a l’àcid acrílic mitjançant una deshidratació, pot ésser reduït a 1,2-propandiol o pot usar-se també com a precursor del PLA (polylactic acid). 3.1.4.3. Intermedis base C4 Aquests intermedis són accessibles a partir de residus de blat de moro o canya de sucre com a primera matèria. Fermentacions anaeròbiques amb bacteris com el Clostridium acetobutylicum o el Clostridium beijerincki s’usen per a produir acetona i butanol o acetona, butanol i etanol (ABE, fermentació aceto-butílica-etílica) (10). Aquest últim és un procés que havia entrat en desús degut a la forma més econòmica de produir aquestes mateixes substàncies a partir de primeres matèries fòssils, però l’encariment del petroli i el pensament ecologista ha fet despertar-ne de nou l’interès. Últimament s’han ideat tècniques de fermentació microbiològica amb Escherichia coli alterat genèticament per a produir alcohols de 4 o més carbonis a partir de la glucosa, per exemple 1-butanol, 2-metil-1-butanol i particularment isobutanol. Amb una deshidratació catalítica posterior del isobutanol es produeix una barreja de olefines C4 (1-butè, cis-2butè, trans-2-butè i isobutè) (2). Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 19 3.2. Teoria 2: Microorganismes i els seus processos fermentatius. Cinètica del creixement microbià. Els primers usos de microorganismes per a la producció de productes d’interès daten de temps antics. Exemples d’aquesta afirmació els trobem en l’ús de llevats per produir pa i en la fermentació del vi o de la cervesa. Certament la comprensió dels mecanismes mitjançant els quals es produeixen aquests fenòmens és més recent, però l’ús d’aquestes tècniques per preservar aliments o per produir-ne de nous es desenvolupa des de l’antiguitat. A part del menjar, també s’ha fet ús dels microorganismes per a fabricar productes químics i farmacèutics. En la Segona Guerra Mundial, degut a la necessitat d’utilitzar el petroli i altres matèries primeres per a fins bèl·lics, molts productes com ara la acetona, el glicerol o l’etanol eren produïts mitjançant fermentacions microbiològiques. Més tard, un cop acabat el conflicte i el preu del petroli baixà, aquestes metodologies perderen rellevància en front de mètodes petroquímics. En els últims anys països emergents com ara la Xina o l’Índia han incrementat la seva demanda de petroli i derivats, això sumat al fet de que el petroli és una font no renovable i que s’està esgotant ha fet plantejar-se de nou mètodes fermentatius per a l’obtenció de productes que abans s’obtenien a partir de matèries primeres fòssils. Tampoc s’ha de menystenir l’efecte que té la combustió de fuels en el canvi climàtic com a font d’emissió de diòxid de carboni. 3.2.1. Microorganismes Químicament són semblants a la majoria de cèl·lules vegetals i animals i desenvolupen moltes de les mateixes reaccions. En general els microorganismes són unicel·lulars i requereixen menys nutrients que altres formes de vida més complexes. La cèl·lula és la unit bàsica de tot organisme viu i es divideixen en dos grups, procariotes i eucariotes:  Procariotes: Comprèn els arqueobacteris i bacteris. Són cèl·lules de menys de 5𝜇m de diàmetre amb algunes excepcions. No tenen nucli cel·lular i el seu material genètic es troba dispers en el citoplasma, reunit en una zona 20 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic anomenada nucleoide.  Eucariotes: Comprèn fongs, protozous, algues i altres cèl·lules de plantes i animals. Acostumen a ser més grans que les procariotes i sí que tenen un nucli cel·lular diferenciat. Il·lustració 8: Representació de a) una cèl·lula procariòtica i b) una cèl·lula eucariòtica (4) Tot seguit es farà una petita referència als grups de microorganismes que tenen un cert interès industrial. 3.2.1.1. Arqueus Els arqueus són bastant diferents dels bacteris i tenen certes característiques que els fan més semblants a les cèl·lules eucariòtiques. Molts viuen en condicions extremes i se’ls anomena extremòfils. Hi ha tres tipus fisiològics bàsics: halòfils (adaptats a altes concentracions de sal), metanògens (produeixen metà) i termòfils (adaptats a altes temperatures), i alguns d’aquests també són resistents a altes pressions. Són d’interès dos tipus més d’extremòfils: els acidòfils ( resistents a condicions àcides) i els alcalífils (resistents a condicions bàsiques) (11). Hi ha pocs arqueus que s’utilitzin en la indústria, tot i que cada vegada més estan prenent importància. Sobretot en el cas del arqueus extremòfils, que poden ser una font d’enzims que funcionen en aquestes condicions severes. Per altra banda els metanògens són una part vital del tractament de residus, són un dels microorganismes que duen a terme la digestió anaeròbica i produeixen biogàs. 3.2.1.2. Bacteris També anomenats eubacteris són un grup molt variat dividit en 12 subgrups. Tot i això les industrialment rellevants estan contingudes en només 2: els protobacteris, formats per Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 21 bactèries gramnegatives; i els bacteris grampositius. Solen mesurar uns quants micròmetres de llargada i poden presentar diverses geometries. El nom prové del grec baktērion (“petit bastó”). Són presents en tot tipus d’hàbitats. En destaca la capacitat de degradar determinada matèria orgànica, per aquesta raó s’ha utilitzat molt en el processament de residus o en la bioremediació, que es basa en la utilització d’agents biològics en medis contaminats. Hi ha alguns tipus de bacteris capaços de digerir hidrocarburs del petroli, amb les possibilitats que comporta. Un altre ús important és en l’obtenció de productes químics enantiomèricament purs, com per exemple la producció biocatalítica del 4-cloro-3hidroxibutanoat (CHBE) un intermedi bàsic per a la producció de productes farmacèutics (12). També en control bacteriològic de plagues s’utilitzen bacteris en comptes de pesticides, cas del bacteri Bacillus thuringiensis, un bacteri grampositiu que viu al sòl i que genera una protoxina que al ser consumida i digerida per l’insecte és quan fa efecte el principi actiu, a més són selectives afectant de manera específica a un determinat grup d’insectes (13). Un altre ús clar, que és el que ens ocupa en aquest treball, és la seva participació activa en el funcionament dels fermentadors. 3.2.1.3. Fongs Els fongs són un grup de microorganismes eucariotes que ocupen diferents habitats. La majoria d’espècies creixen en forma de filaments multicel·lulars anomenats hifes, els quals coneixem com floridures. Els llevats en canvi, també del regne fungi, són organismes unicel·lulars. Hi ha milers d’espècies conegudes de fongs filamentosos, però en són poques en comparació les que s’usen en la industria. Un cas de fong que requereix especial atenció són els llevats, essent important la seva contribució com a microorganisme d’ús industrial. En la fabricació de cervesa, de vi o de pa es fan servir llevats, concretament s’usa el Saccharomyces cerevisiae, un dels llevats històricament més utilitzat. Aquest mateix llevat avui en dia també s’utilitza en moltes altres fermentacions, com ara en la producció d’etanol com a combustible o de insulina per ús humà, entre d’altres (11). 22 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Il·lustració 9: Dos exemples de l'ús de fongs al llarg de la història, a) el pa amb floridures s'utilitzà en diverses cultures com a font d'antibiòtics, i b) el llevat S. cerevisiae s'usa en moltes fermentacions actualment. (4) També serveixen per a la bioremediació, en aquest cas s’usa el terme micoremediació, en el qual s’usen fongs per retenir agents contaminants presents en el medi. Moltes especies produeixen substàncies que són utilitzades en medicaments: la penicil·lina, antibiòtic que s’usa en el tractament de malalties infeccioses provocades per alguns bacteris sensibles a ella; la ciclosporina, un fàrmac immunosupressor que s’usa per evitar un possible rebuig en transplantaments d’òrgans, inicialment aïllat del fong Tolypocladium inflatum (14); l’àcid fusídic, derivat del fong Fusidium coccineum i que s’ha usat com antibiòtic contra el bacteri Staphylococcus aureus, resistent a la penicil·lina i la meticil·lina (15). En la taula 4 s’observen arqueus, fongs i bacteris que tenen ús industrial. Taula 4: Microbis amb ús industrial (11) Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 23 3.2.2. Perills associats amb l’ús industrial de microorganismes S’ha de tenir en compte a l’hora de dissenyar qualsevol nou procés que abans de que comenci a operar s’haurà de passar una valoració dels riscs associats a la pràctica d’aquest. Sobretot en casos en els quals s’utilitzin GMMs (gennetically modified microorganisms), que requeriran un anàlisis particular per a cada cas. En cas que es facin servir microbis coneguts aleshores n’hi haurà prou en classificar-los segons el risc que tinguin i actuar conseqüentment. La World Health Organization divideix el perill potencial dels microorganismes en 4 grups, essent el primer referent a aquells que no és probable que causin cap malaltia a persones o animals (taula 5). (11) En casos que sigui requerit i depenent de la perillositat del microbi usat s’usen diferents nivells de barreres i conteniment. El nivell 1 protegeix el personal i les instal·lacions immediates de qualsevol fuita, el nivell 2 involucra l’ús de vestimenta especialitzada, supervisions mèdiques periòdiques i vacunació del personal. Ampliant el nivell 2 es pot arribar a plantejar un disseny específic de les instal·lacions destinades a albergar determinats patògens d’alta perillositat: ús de pressions negatives, filtres d’alta eficàcia, protocols a seguir, etc. En casos de microorganismes de nivell de perillositat 1 només caldrà seguir bones pràctiques per grans sistemes (GILSP: good industrial large-scale practises). Taula 5: Classificació de la World Health Organization dels microorganismes en base el perill que representen (16) 24 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 3.2.3. Necessitats nutritives dels microbis Els microorganismes que s’utilitzen en les fermentacions i en aplicacions industrials en general tenen unes certes necessitats nutritives, un grapat de nutrients diferents segons el microorganisme que són necessaris per tal de créixer, reproduir-se i mantenir-se viu. Es pot veure en la taula 5 un resum de les principals fonts d’energia, electrons/hidrogen i carboni utilitzats per cada organisme. Com a font d’energia, els microbis poden classificar-se en quimiòtrofs, si obtenen energia de l’oxidació de compostos orgànics o inorgànics, al alliberar-se l’energia d’enllaç; o en fotòtrofs, si l’energia s’obté en forma lluminosa. L’obtenció d’hidrogen i d’electrons pot provenir de dues fonts diferents, els organòtrofs n’obtenen de compostos orgànics i els litòtrofs de compostos inorgànics. Taula 6: classificació nutricional bàsica dels microorganismes (11) Una tercera classificació fa referència al carboni, els organismes autòtrofs usen com a font primària o única CO2 mentre que els heteròtrofs poden utilitzar diferents compostos orgànics com a font del mateix: hidrocarburs, lípids, àcids orgànics i polisacàrids. Generalment quan s’opera a nivell industrial s’usen fermentacions heterotròfiques en lloc de autotròfiques, aleshores són requerides altes concentracions de les fonts de carboni, de 10-20 g/L o més. Com a font de carboni i d’energia generalment el que s’utilitzen són sucres, sobretot glucosa. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 31 Teòricament seria una gràfica d’aquest estil: Il·lustració 15: Inhibició (beta<1) i activació (beta>1) causades pel substrat (26) Així doncs degut a que sembla que sí que es dóna aquest tipus de inhibició, es pertinent descriure’n la cinètica. Un model cinètic apte per a descriure el mecanisme és el següent, derivat d’un proposat per Haldane el 1930, i utilitzat per Boon Laudelout (26): 𝜇= 𝜇𝑚𝑎𝑥·𝑆 (𝐾𝑠+𝑆)·(1+𝑆𝐾𝑖) ⁄ Eq. 5 On el segon terme del denominador representa la inhibició. L’elecció del model es fa seguint les indicacions de Edwards, que en un anàlisi de diferents mecanismes per a casos on es donés inhibició del substrat determinà que és el model que descriu millor aquest fenomen. Tot i que altres models també són vàlids aquest és el més fàcil de manipular (26). Altres models vàlids són: 𝜇= 𝜇𝑚𝑎𝑥·𝑆 𝐾𝑠+𝑆+(𝑆2 𝐾𝑖)·(1+𝑆𝐾) 𝜇=𝜇𝑚𝑎𝑥·𝑆·exp (−𝑆 𝐾𝑖) 𝐾𝑠+𝑆 𝜇=𝜇𝑚𝑎𝑥·exp(−𝑆 𝐾𝑖)−exp(−𝑆 𝐾𝑠) Models originaris o derivats de Yano, Aiba i Tessier, respectivament. 32 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Parlant ara del model escollit per Edwards (Eq. 5), el passem a velocitat: 𝑑𝑋 𝑑𝑡=−𝑟𝑠𝑢𝑏=μmax·S·X (Ks+S)·(1+SKi) ⁄ Eq. 6 De cara a resoldre aquesta equació, s’assumeix que la desaparició del substrat és directament proporcional a l’aparició de noves cèl·lules: −𝑑𝑆 𝑑𝑡=1𝑌𝑑𝑋 𝑑𝑡 Eq. 7 Integrant aquesta equació amb unes condicions inicials (X0,S0) i assumint Y constant: 𝑆=𝑆0−(𝑋−𝑋0)/𝑌 Eq. 8 Aïllant la X de l’equació 8, substituint-la en l’equació 6 i fent el pertinent canvi en el diferencial tenim la següent expressió que es pot integrar de cara a tenir una expressió més clara amb la que treballar. 𝜇𝑚𝑎𝑥∫𝑑𝑡=−∫(Ks+S)·(1+S 𝐾𝑖) 𝑆·(𝑋0 𝑌+𝑆0−𝑆) 𝑑𝑆 Eq. 9 Que després d’integrar-la amb condicions inicials (t0, S0): 𝜇𝑚𝑎𝑥·(𝑡−𝑡0)=[𝐾𝑠 𝑆0 1+𝑋0 𝑌·𝑆0]·𝑙𝑛[1+𝑋0 𝑌·𝑆0−𝑆 𝑆0 (𝑆 𝑆0)·(𝑋0 𝑌·𝑆0)]+[𝐾𝑠+𝑆0+𝑋0 𝑌 𝐾𝑖+1]· 𝑙𝑛[1+𝑋0 𝑌·𝑆0−𝑆 𝑆0 𝑋0 𝑌·𝑆0]+[𝑆−𝑆0 𝐾𝑖] Eq.10 Aquesta equació és útil per a analitzar sistemes de creixement microbià amb efectes d’inhibició del substrat. Fent ús d’aquesta equació podem predir els valors de la concentració del substrat en el temps, doncs encara que l’expressió es feixuga s’ha d’observar que t0, S0, X0, Ks, Ki i Y són paràmetres dels quals se’n pot conèixer el valor, essent relativament senzill per mitjà de mètodes numèrics determinar el valor de S per un determinat temps. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 33 Seguint passos semblants als seguits per arribar a l’equació 8 es pot arribar a expressar la creació de producte en funció del substrat quedant de la següent forma: 𝑃=𝑃0+ 𝑌𝑃𝑆 ⁄·(𝑆0−𝑆) Eq. 11 Poden simplificar P0=0, ja que en general no hi haurà producte a l’inici del procés. Així doncs, aïllant la concentració del substrat, S, en funció de la concentració de bactèries, X, en l’equació 8 i la S en funció de la concentració de producte, P, en la equació 11 i substituint per cada cas les variables en la integral resolta (Eq. 10), es poden obtenir expressions semblants per estudiar les concentracions de bacteris i de producte: 𝜇𝑚𝑎𝑥·(𝑡−𝑡0)=[𝐾𝑠 𝑆0 1+𝑋0 𝑌·𝑆0]·ln[2𝑋0 𝑌·𝑆0−𝑋 𝑌·𝑆0 (1−𝑋−𝑋0 𝑌·𝑆0)·(𝑋0 𝑌·𝑆0)]+ [𝐾𝑠+𝑆0+𝑋0 𝑌 𝐾𝑖+1]· ln[2𝑋0 𝑌·𝑆0−𝑋 𝑌·𝑆0 𝑋0 𝑌·𝑆0]+[−(𝑋−𝑋0) 𝑌·𝐾𝑖] Eq. 12 I pel producte: 𝜇𝑚𝑎𝑥·(𝑡−𝑡0)=[𝐾𝑠 𝑆0 1+𝑋0 𝑌·𝑆0]·𝑙𝑛 [ 𝑋0 𝑌·𝑆0−𝑃 𝑆0·𝑌𝑃𝑆 ⁄ (1− 𝑃 𝑌𝑃𝑆 ⁄·𝑆0)·(𝑋0 𝑌·𝑆0) ] +[𝐾𝑠+𝑆0+𝑋0 𝑌 𝐾𝑖+1]· 𝑙𝑛 [ 𝑋0 𝑌·𝑆0−𝑃 𝑆0·𝑌𝑃𝑆 ⁄ 𝑋0 𝑌·𝑆0 ] +[−𝑃 𝑌𝑃𝑆 ⁄·𝐾𝑖] Eq. 13 34 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 3.3. Àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic. Estat de l’art i usos industrials. L’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic o àcid β-hidroxi-isobutíric (1) (18) és una molècula orgànica de 4 carbonis amb dos grups funcionals; un àcid carboxílic i un alcohol. Aquest àcid de fórmula molecular C4H6O2 té una característica que el fa molt útil per a determinats usos, la quiralitat deguda al carboni asimètric. Il·lustració 16: L’àcid 3-metil-1,3-hidroxipropanoic o àcid β-hidroxi-isobutíric. Aquest tipus de compostos químics, els àcids β-hidroxicarboxílics, són de gran importància i s’han usat per la elaboració de nombrosos productes químics. Així doncs, aquests compostos òpticament actius han estat utilitzats com a precursors per la síntesis de vitamines, additius alimentaris, antibiòtics i feromones (27). L’àcid β-hidroxi-isobutíric també és un important intermedi en la degradació enzimàtica de la valina en els mamífers (28). 3.3.1. Importància de la quiralitat Cada vegada més es volen productes enantiomèricament purs per a la producció de substàncies químiques. Tant en medicaments o en qualsevol substància relacionada amb la salut humana com en substàncies que combatin plagues i que podrien causar problemes en els aliments que després s’han de consumir, ens trobem amb productes que contenen com a mínim un centre quiral. Hi ha moltes raons per això, algunes de les quals s’enumeren tot seguit: i. L’activitat biològica pot donar-se només en un dels enantiòmers. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 35 ii. L’activitat biològica pot ésser molt diferent depenent de l’enantiòmer. Produir-ne només un d’ells permet separar-ne els efectes. En la taula 6 hi ha alguns exemples. Il·lustració 17: Propietats diferents en els enantiòmers. Modificada de la publicada en Chiralty in Industry-An overview. (27) iii. El compost òpticament pur pot arribar a presentar més de dues vegades l’activitat de la mescla racèmica. Això és per casos en els que hi ha un antagonisme entre els dos enantiòmers. És el cas d’una feromona sexual produïda per la femella de l’escarabat japonès, Popilla japonica, que s’ha identificat com l’enantiòmer R de la corresponent substància. Tant sols una presència del 1% de l’enantiòmer S redueix molt la resposta dels escarabats mascles a la feromona. (29) iv. També la regulació de cada país pot ser una motivació per obtenir compostos enantiomèricament purs. En determinats països on la quantitat d’impureses està regulada per llei és interessant obtenir només l’enantiòmer que presenta activitat, doncs l’enantiòmer inactiu és considerat un impuresa. (30) v. També s’ha de tenir en consideració l’oportunitat d’incrementar la capacitat d’un procés industrial al passar de la mescla racèmica a l’enantiòmer corresponent. 36 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 3.3.2. Obtenció de l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic Hi ha molts camins citats en la bibliografia per tal d’obtenir aquest àcid. Existeixen tant mètodes químics com mètodes biològics basats en fermentacions, tot i que els darrers són molt més nombrosos, sobretot en els últims anys. Hi ha estudis que fan ús de fongs, altres de llevats o de bactèries o fins i tot bactèries mutants que proporcionin un rendiment major. Tot i que en aquest treball estem partint d’un diol, el 2-metil-1,3-propandiol, que serà el precursor, i que teòricament l’estudi de l’obtenció d’aquest àcid es basa en el seu paper com a precursor en l’obtenció de metacrilat. En determinats articles s’utilitza aquest últim per a la producció d’un àcid amb molta importància en les farmacèutiques. Un altre dels precursors habituals és l’àcid isobutíric el qual es metabolitza a l’àcid βhidroxi-isobutíric. 3.3.2.1. Mètodes químics Un dels mètodes més significatius, utilitzat des de fa molts anys és el descrit per Loring Coes Jr., la patent descriu un mètode mitjançant el qual obtenir àcid metacrílic, que després pot ésser hidrolitzat per obtenir l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic. Utilitza com a matèries primeres metiletilcetona, que s’obté a partir del 2-butanol, que a la vegada s’obté en el cracking del petroli; formaldehid, lleixiu, àcid clorhídric i àcid sulfúric. En un primer pas barreja metiletilcetona, formaldehid i hidròxid de sodi. Es refreda a -30ºC i es deixa reposar 24 h per posteriorment destil·lar-ho i quedar-se amb la fracció que bull entre 90-120ºC a 20 mil·límetres de mercuri. Aquesta fracció és el β-metil-γoxobutanol. En un segon pas usa el β-metil-γ-oxobutanol barrejat amb aigua per addicionar-lo a una solució de lleixiu comercial aigualida. Addició que es fa de manera gradual i barrejant la mescla durant dues hores a una temperatura d’entre 30 i 50ºC. Posteriorment s’afegeix a aquesta mescla àcid clorhídric i s’escalfa a 75ºC durant una hora. Aleshores s’extrau mitjançant dietilèter i aquest extracte es destil·la per eliminar l’èter, quedant l’àcid metacrílic juntament amb algunes impureses. Durant el segon pas es pot utilitzar coure o algun altre inhibidor per tal d’evitar la polimerització de l’àcid. (31) Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 37 Un altre procés per obtenir l’àcid β-hidroxi-isobutíric per mètodes químics és l’esmentat per Robinson el 1963 a partir de formaldehid i α-bromopropionat (32). O Choy que reporta la síntesis dels dos enantiòmers purs mitjançant una condensació aldòlica. (33) 3.3.2.2. Mètodes biològics En els diferents articles que s’han consultat s’han usat distints precursors per obtenir l’àcid, els més habituals són l’àcid isobutíric i l’àcid metacrílic, però últimament també s’han publicat diversos articles en els que s’utilitza com a precursor el 2–metil-1,3propandiol, un producte molt econòmic disponible en el mercat com a subproducte en el procés d’obtenció del butandiol mitjançant una reacció de hidroformilació d’un alcohol al·lílic i gas de síntesis, reacció senzilla i poc costosa. 3.3.2.2.1. Àcid isobutíric com a precursor Il·lustració 18: Àcid isobutíric Un dels mètodes d’obtenció de l’àcid, desenvolupat per Goodhue el 1971, utilitza la bactèria Pseudomonas putida. Aquest procés fermentatiu és dels primers en produir en grans quantitats l’enantiòmer L d’aquest àcid, essent una producció estereoespecífica. El procés es va donar en un fermentador d’acer inoxidable de 15 L de volum amb 4 bafles interiors. Es subministra aire per mitjà d’un difusor d’un sol forat disposat sota un agitador de 6 cares de tipus paddle instal·lat al fons. Hi ha un altre agitador per sobre la meitat del recipient. (34) Un altre procediment que té com a precursor l’àcid isobutíric és el publicat el 1981 per Hasegawa. En aquest s’obté l’altre enantiòmer, el D-β-hidroxi-isobutíric, i s’utilitza el bacteri Candida rugosa. S’aconseguí una concentració de 21.7 g/l i una conversió del 50% (35). Lee i altres van millorar aquest procediment mitjançant un control suplementari de la glucosa en el qual s’anava afegint glucosa de forma controlada de forma que es mantingués la concentració d’aquesta en uns 10-20 g/l. En aquest cas s’obtingué una concentració molt major, 100 g/l , però amb una conversió del 40%. (36) 38 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic En un article del 1999, Kim i altres van dissenyar un procés per obtenir l’àcid mitjançant tres varietats mutants de la Candida rugosa (MME 1027, MME 1259, MME 1559). La idea estava en utilitzar certes bactèries mutades incapaces d’assimilar l’àcid propiònic i per tant que no portessin a una metabolització de l’àcid, i conseqüentment a una major conversió. L’estudi va concloure que la varietat MME1259 és la que dona uns millors resultats: 150 g/l i 81.8% de conversió. (37) 3.3.2.2.2. Àcid metacrílic com a precursor Il·lustració 19: Àcid metacrílic Un dels diferents estudis fets per tal d’obtenir D-β-hidroxi-isobutíric a partir de l’àcid metacrílic és el dut a terme per Lee el 1997. S’utilitzà Candida rugosa i un mutant d’aquesta bactèria. Els rendiments obtinguts després de 120 hores van ser de 65 g/l i 40% de conversió per la bactèria Candida rugosa i 70 g/l i 70% de conversió per la varietat mutant. (38) En general s’ha vist que els organismes amb l’habilitat de produir àcid β-hidroxi-isobutíric a partir d’àcid isobutíric també són capaços de fer-ho a partir d’àcid metacrílic, però amb menor productivitat. En la taula 7 es veuen alguns exemples. (27) Taula 7: Diferents microorganismes que produeixen l’àcid β-hidroxi-isobutíric (β-HIBA) a partir d’àcid isobutíric (IBA) i d’àcid metacrílic (MA). (27) Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 39 3.3.2.2.3. 2-metil-1,3-propandiol com a precursor En els últims temps degut al renovat interès cap a la producció sostenible s’han començat a investigar noves rutes per obtenir productes químics amb importància en la indústria. En aquest context s’investiga aquesta substància com a possible precursor per obtenir l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic, doncs l’esmentat diol és un subproducte econòmic i de gran disponibilitat. Un dels primers treballs que se’n destaca data del 1979 i va ser dut a terme per Hiromichi Ohta i Hatsuki Tetsukawa que van utilitzar Gluconobacter roseus. (39) Cal destacar en aquest apartat els treballs fets per Molinari. Dos articles publicats per ell i altres colaboradors investiguen sobre les possibilitats que ofereix aquest camí. En un utilitzen com a bactèria una espècie anomenada Acetobacter ALEI i en l’altre utilitzen Acetobacter pasteurianus, essent les dues bactèries de l’àcid acètic. Aquest tipus de bactèries són eficients biocatalitzadors enantioselectius i poden provocar l’oxidació d’alcohols primaris i secundaris. A més com a característica addicional són completament inofensiu pels humans fins al punt de ser comestibles, amb el subsegüent abaratiment de les despeses en seguretat que això comporta. (18) (17) Els rendiments són una conversió del 85% i 29 g/l en el cas dels ALEI i gairebé un 100% i 25 g/l en el cas de l’Acetobacter pasteurianus. En aquest treball ens fixarem més aviat en la publicació feta per Pyo el 2012. Utilitzant l’esmentat diol com a precursor en el procés fermentatiu i una bactèria de l’àcid acètic, els Gluconobacter oxydans, es dona una bioconversió passant pel 3-hidroxi-2-metilpropanal. El procés es va fer en un bioreactor a escala laboratori (3L) connectat a un microfiltre per recircular les bactèries. Es va mantenir l’agitació a 1000 rpm i un flux d’aire de 1 vvm. El pH va ser mantingut a 7.2 mitjançant l’addició de 5N NH4OH i la temperatura a 28ºC. (1) 3.3.3. Ús industrial de l’àcid β-hidroxi-isobutíric La importància d’aquesta substància rau sobretot en la seva quiralitat, com s’ha explicat en l’apartat 3.3.2.1. Així, la demanda d’aquest tipus de substàncies és cada vegada major per les raons explicades en l’apartat referit. Sobretot en l’àmbit de les farmacèutiques, on com és lògic hi ha gran interès per maximitzar els efectes, en aquest cas mitjançant l’obtenció dels enantiòmers adequats que produeixen els efectes d’interès. 40 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Un dels usos més valorats d’aquest àcid és en l’elaboració del Captopril, un fàrmac que provoca entre altres coses una vasodilatació dels vasos sanguinis, raó per la qual és àmpliament usat en la medicina: en casos d’hipertensió, després d’infarts de cor i per problemes de ronyó. Aquest fàrmac era preparat de tal forma que s’obtenia una mescla racèmica dels enantiòmers L i D. Es sap que l’enantiòmer D és fins a 100 vegades més efectiu que l’enantiòmer L, raó per la qual s’usava un procés anomenat Chiral resolution per tal d’aïllar l’enantiòmer corresponent. (40) Il·lustració 1:Mètodes d'obtenció del Captopril. Molècules inicials [A, B] i producte final. a) proposat per Hasegawa i altres, b) mètode partint d'àcid metacrílic que conclou amb mescla racèmica. Simplificat de Chiralty in Industry (27) Hasegawa i altres investigadors van desenvolupar un mètode l’any 1982 mitjançant el qual s’obté directament la configuració desitjada a partir de l’àcid 3-hidroxi-2-Dmetipropanoic, doncs aquest té la mateixa configuració i la mateixa unitat de 4 carbonis que el Captopril (40). Mentre que el rendiment que s’obtenia després de separar l’enantiòmer de la mescla racèmica s’estimava en un 19%, amb el nou mètode proposat per Hasegawa s’arribava a un 65%. (27) En el context de les farmacèutiques també té un ús en la síntesis del ionòfor Calcimycin, substància de propietats antibiòtiques que actua com a transportador de ions a través de la membrana cel·lular. (41) Un altre ús és en la producció de α-tocoferol, una de les formes de la vitamina E i la més activa biològicament, que té funcions d’antioxidant i de regulador de l’activitat enzimàtica. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 47 L’oxigen és poc soluble en l’aigua i s’han d’usar sistemes per a tal de millorar-ne la solubilitat, doncs en cas de microorganismes que necessiten l’oxigen per la respiració aeròbica és necessari que aquest oxigen estigui dissolt. (46) 3.4.1.4. Espuma La espuma és conseqüència de les proteïnes presents en el medi lligades a la interfase entre l’aire i el cultiu. Si no es controla la espuma generada en el fermentador es poden bloquejar els filtres, perdent-se les condicions asèptiques quan són necessàries. Pot arribar a passar que el fermentador es contamini per altres microorganismes que no hi haurien de ser presents. 3.4.2. Control dels paràmetres químics i físics Tots aquests paràmetres i altres s’han de controlar per tal que la fermentació acompleixi els seus objectius. Per tal fi es duen a terme una sèrie d’accions de vegades mitjançant mecanismes, de vegades mitjançant l’addició de substàncies. 3.4.2.1. Agitació L’agitació és dona per tal de mesclar les tres fases dins del fermentador. La fase líquida conté els nutrients, la fase gasosa és predominantment oxigen i diòxid de carboni i la fase sòlida està composta de les cèl·lules bacterianes i dels substrats sòlids en casos d’aquest tipus de fermentacions. La barreja produeix condicions homogènies i promou la transferència de nutrients, gas i calor. La transferència de calor és necessària durant la esterilització i durant l’operació, per mantenir la temperatura. És particularment necessària una bona agitació en casos de fermentacions aeròbiques, on els microbis només poden adquirir l’oxigen que està dissolt en la fase líquida: prolonga la retenció de les bombolles en suspensió, redueix la mida de les bombolles incrementant la superfície de contacte i disminueix el gruix de la capa de contacte de la interfase líquid-gas. (11) (24) Hi ha tres mecanismes: tancs agitats, sistemes pneumàtics i mecanismes hidrodinàmics. 3.4.2.1.1. Tancs agitats (STR) Moviment mecànic mitjançant agitadors o rodets dins d’un recipient cilíndric que habitualment conté deflectors (o bafles), superfícies planes verticals que serveixen per incrementar la turbulència, prevenint la formació de vòrtex i eliminant les “zones mortes”. 48 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 3.4.2.1.2. Sistemes pneumàtics Usen l’expansió de gas comprimit per dur a terme la mescla. Consumeixen menys energia que un STR i provoquen menys vibracions. S’inicia mitjançant la injecció d’aire comprimit a la part baixa d’un tub d’aspiració iniciant un moviment vertical cap amunt del líquid i iniciant un cicle de moviments en el fermentador. Cas del fermentadors airlift. 3.4.2.1.3. Mecanismes hidrodinàmics Utilitzen energia cinètica del líquid per tal de moure el mateix. Això s’aconsegueix mitjançant una bomba exterior que recircula el líquid i el reinjecta de nou. Aquest sistema s’usa en fermentador de tipus deep-jet. Il·lustració 24: Fermentadors amb diferents tipus d'agitacions: a) airlift, b) deep-jet, d) tanc agitat (11) 3.4.2.2. Transferència de calor Un transferència de calor eficient és molt important pel control de la temperatura tant en l’esterilització com per mantenir la temperatura adequada durant la fermentació. La calor generada en una fermentació és deguda a l’activitat metabòlica primerament i als processos d’agitació mecànica. En general aquesta calor ha de ser dissipada mitjançant refredament. Contràriament, en fermentacions que operen a temperatures superiors a l’ambient, es requerirà un input de calor. La transferència de calor s’aconsegueix normalment mitjançant el que s’anomena camisa escalfada o refrigerada, un bescanviador de calor que va per la part externa del Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 49 fermentador, o be mitjançant un serpentí interior, en casos on es requereix un transferència major. En cap cas hi hauria contacte amb el medi, la calor es transporta pels mecanismes habituals a través de les parets, del serpentí o del recipient, i els deflactors. (11) 3.4.2.3. Transferència de massa La transferència de nutrients des de la fase líquida a les cèl·lules bacterianes és relativament assequible ja que en general els nutrients estan disponibles en excés. Unes condicions idònies i una bona agitació són suficients per a garantir-ne la disposició. En canvi amb l’oxigen la cosa es complica, i algunes fermentacions es veuen limitades per aquest aspecte doncs l’oxigen es poc soluble en aigua (7-10 mg/L amb aire i fins a 40mg/L amb O2 pur). Tot i que hi ha fermentacions anaeròbiques, en general s’opera de forma aeròbica i es requereixen grans quantitats d’aire o oxigen que s’ha de dispersar de forma correcte. Per encarar aquest problema l’aire es distribueix en el fermentador mitjançant difusors de mida variable, depenent dels forats, i amb agitació o sense segons les necessitats. (11) Il·lustració 25: Difusor amb agitació i sense (47) Les necessitats d’aeració en una fermentació es pot determinar per un procés relativament simple. 3.4.2.3.1. Determinació de les necessitats d’aeració (46) És necessari mantenir l’oxigen molecular en condicions òptimes per assegurar unes condicions de productivitat màximes. Els dos paràmetres relacionats amb la disponibilitat d’oxigen són la velocitat de transferència de l’oxigen de la fase gas a la fase líquida (kLa) i la velocitat de consum d’oxigen per part del cultiu, OUR (oxygen uptake rate). (11) 50 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic La transferència d’oxigen en la mescla es pot explicar amb la següent fórmula, que depèn de la diferència de concentracions entre les fases i de la superfície de contacte entre el gas i el líquid. 𝑁𝑂2=𝑘𝐿(𝐶𝐿𝐼−𝐶𝐿) Eq. 13 NO2 és el flux d’oxigen [mg/s·m2], KL el coeficient individual de transferència de matèria a la fase líquida [m/s], CLi la concentració d’oxigen a la interfase [mg/m3] i CL la concentració d’oxigen a la fase líquida. Però les concentracions a la interfase són difícils de mesurar, així que s’acostuma a posar l’equació en funció del coeficient global i el gradient global de concentracions. 𝑁′𝑂2=𝐾𝐿𝑎(𝐶𝐿∗−𝐶𝐿) Eq. 14 N’O2 és el flux volumètric d’oxigen [mg/s·m3], KLa el coeficient global de transferència de matèria [m/s] que depèn del cabal d’aeració, la mida de les bombolles, la viscositat i altres paràmetres; C*L la concentració del líquid a la interfase i CL la concentració del líquid. KLa s’ha de determinar en cada procés. Per tal de de saber les condicions idònies necessitarem també valorar les necessitats associades al consum biològic (OUR) a part de l’eficàcia de la transferència (KLa). Fem un balanç de l’oxigen. 𝑑𝐶𝐿 𝑑𝑡 =𝐾𝐿𝑎(𝐶𝐿∗−𝐶𝐿)−𝑂𝑈𝑅 Eq.15 On OUR és la velocitat específica de consum d’oxigen [mg O2/m3·h]. I primer terme a la dreta de la igualtat és l’aportació de O2. La OUR i la velocitat de transferència les podem determinar mitjançant una tècnica anomenada, mètode GAS IN-GAS OUT. Es basa en introduir una pertorbació en el sistema quan està en estat estacionari. S’agafa el recipient on hi ha el cultiu i se’n mesura la concentració d’oxigen en temps zero, que correspondria amb la concentració de saturació. S’afegeix una petita quantitat de substrat en un temps i s’observa que la concentració baixa. Si s’afegís aire també es donaria aquesta situació, i al esgotar-se el substrat l’oxigen tornaria als nivells inicials. Si no hi hagués subministrament l’oxigen no augmentaria i es mantindria lineal en el temps. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 51 Il·lustració 26: A) S'atura l’aeració, B) Es reprèn l'aeració, C) Es manté l'aeració fins assolir la CO2 inicial (46) El pendent de la baixada és essencialment la velocitat global de consum del microorganisme (OUR) ja que canvi de concentració d’oxigen quan no estic airejant es degut exclusivament al consum d’oxigen per part dels microbis. 𝑑𝐶𝐿 𝑑𝑡 =𝐾𝐿𝑎(𝐶𝐿∗−𝐶𝐿)−𝑂𝑈𝑅 Eq.16 Si es linealitza el balanç d’oxigen KLa és la inversa del pendent. La funció és lineal de l’estil y = m·x + n. 𝐶𝐿=−1 𝐾𝐿𝑎(𝑑𝐶𝐿 𝑑𝑡 +𝑂𝑈𝑅)+𝐶𝐿∗ Eq. 17 Il·lustració 27: Equació 17 graficada (46) 3.4.2.4. Addició de substàncies. pH i espuma Per certs paràmetres no disposem de mecanismes que puguin mantenir-los en uns valors adequats pel correcte funcionament del fermentador. En aquestes situacions s’afegeixen substàncies que inhibeixen la formació o en mantenen el valor en un interval adequat. 52 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 3.4.2.4.1. Espuma De cara a controlar la formació d’espuma es poden seguir tres camins: utilitzar una configuració mecànica en el fermentador que trenqui l’espuma, modificar la composició del medi o afegir productes antiespumants. Aquests productes son agents superficials que redueixen la tensió superficial que manté l’espuma unida. L’antiespumant ideal hauria de respondre a les següents característiques: i) rapida dispersió, ii) activitat a poques concentracions, iii) acció prolongada, iv) no tòxic, v) econòmic, vi) termostable, i vii) compatible amb els altres components del medi. S’usen antiespumants naturals derivats d’olis vegetals o sintètics com polialcohols o glicols alquilats. (11) 3.4.2.4.2. pH El control del pH s’acostuma a fer afegint substàncies, ja que a vegades els productes d’una fermentació poden alterar el pH. Normalment s’utilitzen dissolucions tampó, fosfats per exemple, però si la fermentació és llarga pot no ser suficient i es requereix afegir àcids o bases. Aleshores el pH es manté als nivells desitjats mitjançant una addició automàtica propulsada amb una bomba connectada a un recipient que conté l’àcid o la base, i un elèctrode que controli el pH. En casos de fermentacions que produeixen àcids també es pot usar hidròxid d’amoni, que també serveix com a font de nitrogen. (11) (24) 3.4.3. Mètodes d’operació i tipus de fermentadors En general hi ha tres camins per dur a terme un procés de fermentació: procés continu, procés discontinu (Batch) i operació fed-batch, una modificació de l’últim. (48) Il·lustració 3: Per continu (F = Fout ≠ 0; volum constant), per Batch (F = Fout = 0; volum constant), per Fed-batch (F ≠ 0 i Fout = 0; volum augmenta) (48) Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 53 3.4.3.1. Procés continu És un sistema obert on s’hi afegeix contínuament el substrat i el producte es retira constantment també. D’aquesta forma es treballa contínuament. En aquests sistemes, els microbis creixen de forma exponencial durant períodes de temps llargs, amb un índex de creixement constant i especificat. A part, tenen la propietat d’assolir un estadi en el qual la concentració dels nutrients i el nombre de microbis no varia amb el temps. (11) El creixement depèn d’un paràmetre anomenat velocitat de dilució, D, és el que en dona una idea de si s’està produint més o menys producte o consumint-se més o menys substrat. (46) 𝐷=𝐹/𝑉 Eq. 18 Així doncs podrem escriure un balanç de massa del reactor per cada espècie. 𝑑𝑋 𝑑𝑡=𝜇𝑋−𝐷𝑋 Eq. 19 𝑑𝑆 𝑑𝑡=−1𝑌𝜇𝑋+𝐷(𝑆𝑖−𝑆) Eq. 20 𝑑𝑃 𝑑𝑡=1 𝑌𝑃𝜇𝑋−𝐷𝑃 Eq. 21 Donant la volta a l’equació 18 tindríem el temps de residència. 𝜏=𝑉/𝐹 Eq. 22 Un aspecte interessant en aquest tipus d’operació és el seu estudi en estat estacionari. En el cas que dX/dt=0 implicarà que 𝜇=D, el que significa que podem regular el creixement del nostre cultiu (𝜇) regulant el volum (V) o el cabal (F). S’han de tenir en compte algunes consideracions: i) Es pot regular la 𝜇 fins un límit, 𝜇màx, a partir de la qual les cèl·lules ja no creixeran, sinó que es produirà un rentat del bioreactor. ii) Si prenem el tipus Monod com a cinètica de creixement aleshores hem de tenir en compte que en la situació D= 𝜇màx l’equació ens donarà error, doncs serà una situació en que no tindrem substrat. Hem de tenir en compte que sempre hi haurà substrat en un procés continu. iii) La concentració de biomassa en el reactor en continu no varia, depèn del 54 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic rendiment o del substrat que entra menys el que surt. Per això quan fixem el cabal que entra o el volum, i per tant la velocitat de dilució D, tot el demés ens quedarà fixat. A cada D li corresponen una concentració de biomassa i de substrat úniques que quedaran fixades. El que acaba interessant en aquest mode d’operació és acostar-nos a 𝜇màx però no sobrepassar-la, és a dir treballar per sota encara que no sigui el màxim creixement que les cèl·lules puguin tenir. Treballar molt a prop del valor màxim de creixement podria portar a que una petita variació aleatòria de les condicions provoqués el rentat del bioreactor. (46) 3.4.3.2. Procés discontinu (batch) En un procés per lots hi ha certes condicions que són canviants, la concentració de nutrients, la concentració de productes i el creixement microbià. Les cèl·lules passen pels processos descrits en la il·lustració 13 de la secció 3.2.5. de manera que mai s’arriba a unes condicions d’estat estacionari. Els processos per lots típics segueixen els següents passos: i) carga del fermentador amb el medi de cultiu, ii) esterilització, iii)inoculació, iv) obtenció de productes microbians, v) separació de productes, vi) neteja del recipient. Això té certes repercussions econòmiques doncs durant bona part temps no s’està produint res. (11) La cinètica de creixement microbià en un procés discontinu ha estat descrita en la secció 3.2.5. 3.4.3.3. Procés fed-batch És pot considerar una variació d’un procés discontinu. Ha estat utilitzat per obtenir llevats alimentaris i penicil·lina. La diferència amb un procés discontinu està en que s’afegeixen nutrients un cop començada la fermentació, cosa que incrementa el volum de la fermentació. Les addicions es poden fer de forma intermitent, afegint l’extra de nutrients en punts determinats i especificats, o bé afegir-los tan sols en un punt pel final de la fase de creixement. La raó està en estendre la producció, i és útil en casos en que els substrats presentin inhibició o bé en casos de substrats que es metabolitzen molt ràpidament. També és fa servir en fermentacions en que el substrat causa problemes relacionats amb la viscositat. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 55 Aquesta operació és molt típica, ja que permet controlar molt bé les condicions mantenint certes substàncies als nivell desitjats i a la vegada permet altes concentracions en productes. Acostumen a haver-hi dos criteris per l’estratègia de l’alimentació: 1. Mantenir la concentració del substrat constant. 2. Mantenir el creixement volumètric dels organismes constants (o el consum d’un substrat). S’aplica la primera en casos en que hi hagi inhibició de substrat, aleshores la concentració escollida serà depenent del grau d’inhibició conjuntament amb el desig de mantenir un cert creixement molecular. El creixement volumètric constant (o consum d’un substrat) s’aplica quan hi ha limitacions, com ara en el subministrament d’oxigen o en la dissipació de la calor. (48) (11) (24) 3.4.4. Esterilització Per evitar la contaminació tant de la fermentació a causa de microbis aeris o de l’entorn a causa de productes de la fermentació, les entrades d’aire i les sortides incorporen filtres. Estan dissenyats per atrapar i contenir els microbis i estan fets de fibra de vidre, fibres minerals, politetrafluoroetilè o PVC. S’han de poder canviar i netejar fàcilment. En situacions on s’usen microorganismes patògens, els sobrants de la fermentació podrien requerir utilitzar tècniques d’esterilització de calor seca, incineració. Aquesta tècnica es fa mitjançant forns d’aire calent a 160ºC durant 2 hores. En quan al fermentador també requereix esterilitzar-se, tant el recipient com el medi de cultiu. Per operacions a escala industrial o escala pilot aquesta esterilització es pot fer amb el recipient buit. A escala petita, com en un laboratori, s’acostuma a omplir el fermentador amb medi de cultiu i posteriorment s’esterilitza amb vapor a pressió, normalment s’escalfa a una temperatura de 121ºC durant 15 minuts. Per fermentadors més grans s’acostuma a usar temperatures més altes i més temps d’esterilització amb la intenció d’obtenir una probabilitat de contaminació menor al 0.1%. (11) Una forma de conèixer les necessitats d’esterilització és a través de l’anomenat Del factor. Com més gran és el valor més grans seran les necessitats d’esterilització. ∇=ln 𝑁0𝑁𝑡 ⁄ Eq. 23 56 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic N0 és el nombre de microorganismes que hi ha inicialment i Nt en representa el número al cap d’un temps t. El valor de Nt quan s’ha assolit l’objectiu d’un risc de contaminació del 0.1% és de 10-3. El valor total del Del factor ve donat tant per l’escalfament com el refredament, a part es clar del temps que roman a la temperatura indicada. ∇𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙=∇𝑒𝑠𝑐𝑎𝑙𝑓𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡+∇𝑚𝑎𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡+∇𝑟𝑒𝑓𝑟𝑒𝑑𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡 Eq. 24 Si coneixem ∇escalf i ∇refred per un sistema determinat aleshores podem calcular el valor de ∇mant sabent el valor de la constant de defunció del microorganisme (k). 𝑡=∇/𝑘 Eq. 25 Una simplificació del mètode és la que va fer Richards el 1968. Assumeix que tota la destrucció es dona quan la temperatura és superior a 100ºC guanyant molta simplicitat i perden poca precisió. (24) Il·lustració 29: esterilització d'un fermentador amb simplificació de Richards (11) La metodologia per portar a terme l’esterilització és fer passar vapor a pressió per la jaqueta de refredament o pel serpentí interior, si n’hi ha. També es pot injectar directament a l’interior del recipient però pot haver-hi problemes per canvis de volum en el medi de cultiu. Aquesta metodologia, usant vapor, es més barata que utilitzant tècniques de calor seca, i és efectiva. (11) A vegades hi ha components sensibles a la calor que poden destruir-se. En aquests casos s’acostumen a utilitzar sistemes d’esterilització per filtres. S’acostumen a utilitzar filtres absoluts o de porus fix, que es basen en porus menors a les partícules que s’han de retirar i son 100% eficients en remoure microorganismes. (24) Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 63 És important tenir en compte que la duració d’un elèctrode no es infinita ja que l’elèctrode es un sensor basat en una cel·la electroquímica. Aquesta cel·la comença a sofrir desgast des de el moment de la seva fabricació. Aquest elèctrode en concret durarà depenent de la cura amb que es tracti de 3-12 mesos. 5.1.4. Espuma Per tal de controlar la formació d’escuma s’han tingut en compte dues consideracions, una referent al disseny i l’altre referent al medi de cultiu. En el medi de cultiu el que es fa en l’article de Sang-Hyun Pyo és afegir un agent antiespumant, específicament el polipropilenglicol. Per altra banda si bé no s’ha afegit cap trencador d’espuma en el disseny si que s’ha deixat un espai a la part superior perquè la formació d’escuma o la agitació no provoqui xocs contra la part de dalt del fermentador o es produeixi obturació dels ports 5.1.5. Agitació En el cas de l’estudi de Sang-Hyun Pyo l’agitació es mantenia a 1000 rpm (1). Molinari després de fer un estudi de diferents velocitats de rotació determinava que la millor opció eren 300 rpm (17). Com s’ha explicat anteriorment l’agitació es necessària per la transferència de nutrients entre fases així com per la correcta transferència de l’oxigen a la fase líquida. En el fermentador dissenyat s’escull una agitació de 500 rpm, un punt entremig per l’alt consum energètic que suposarien 1000 rpm. En el cas de les reaccions microbianes s’acostuma a utilitzar una turbina Rushton i aquest és el cas d’aquest treball. Il·lustració 35: Turbina Rushton extreta de la web de Fusion Fluid Equipment 64 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 5.1.6. Cultiu i manteniment del microorganisme Si procedim igual que procediren Sang-Hyun Pyo i els seus col·laboradors i adquirim els Gluconobacter oxydans de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) el procediment a seguir serà el següent. El cultiu ve disposat en un medi conformat per glucosa, llevats, CaCO3 i agar-agar. Els agar inclinats s’inoculen amb el cultiu mare en una solució al 20% de glicerol, i posteriorment son incubats a 28ºC durant 2 dies, i després guardats a 4ºC. Per fer el precultiu, les cèl·lules superficials dels tubs inclinats es posen en 100 mL en un medi de fermentació en Erlenmeyers de 1L que contenen: 10 g de glicerol, 10 g d’extracte de llevat, 5 g de KH2PO4 a pH 5.5. Els flascons s’incuben en un agitadorincubador orbital a 28ºC i 200 rpm 4 dies. Passat aquest temps s’utilitza per a inocular un fermentador per a produir la quantitat necessària de microorganismes. 5.2. Disseny de la fermentació 5.2.1. Duració dels cicles i productivitat A partir de l’estudi publicat el 2012 per Sang-Hyun Pyo i altres col·laboradors (1) s’han escollit les condicions d’operació referents a la duració dels cicles. A partir del gràfic proporcionat en l’estudi es pot escollir quin es el cicle ideal de treball. Il·lustració 36: Conversió del substrat (♦, 2-metil-1,3-propandiol), de l'intermedi (■, 2-metil-3-hidroxipropanal) i del producte (▲, àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic) utilitzant 2.6 mg/mL de bactèries (matèria seca) a ph=7.2 i 29ºC utilitzant 7.5 g/L de substrat. (1) Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 65 Llegint aquest gràfic i tota la informació relacionada amb aquest en l’estudi de Pyo s’acaba decidint per una fermentació de 8 hores, s’observa que durant les 3 primeres hores s’ha assolit una conversió del 60% i que posteriorment la conversió del substrat comença a davallar, tornant-se marginal al cap de 8h. En aquest punt l’intermedi aldehid s’ha consumit quasi tot i sembla per tant un bon moment per aturar la fermentació, doncs si deixem que continuï assolirem gaire bé la mateixa conversió però en un temps molt major Així doncs a les 8 hores de fermentació tindríem una bona conversió del substrat i quedarien les proporcions de la següent forma:  Un 2% en forma de l’intermedi 2-metil-3-hidroxipropanal: 0.02·7.5 𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑙𝑖𝑡𝑟𝑒 =0.15 𝑔/𝐿  Un 9% queda en forma de substrat que no ha reaccionat: 0.1·7.5 𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑙𝑖𝑡𝑟𝑒 =0.75 𝑔/𝐿  Un 88% del substrat s’hauria transformat a l’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic, és a dir que s’assoleix una productivitat de: 0.88·7.5 𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑙𝑖𝑡𝑟𝑒 =6.6 𝑔/𝐿 Aquesta concentració serà la productivitat que esperem obtenir en la nostra fermentació al cap de les 8h que durarà. Un altre punt important a tenir en compte és a les 3 hores:  Un 37.8% restaria en la forma de substrat sense reaccionar: 0.378·7.5 𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑙𝑖𝑡𝑟𝑒 =2.835 𝑔/𝐿 66 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic  Un 56.1% s’hauria convertit en àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic: 0.561·7.5 𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑙𝑖𝑡𝑟𝑒 =4.207 𝑔/𝐿  Un 6.1% en l’intermedi aldehid2-metil-3-hidroxipropanal: 0.61·7.5 𝑔 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑙𝑖𝑡𝑟𝑒 =0.4575 𝑔/𝐿 En aquest moment tot i que la concentració de l’àcid no ha assolit un valor elevat és el moment on la concentració d’intermedi és major. Aquest intermedi té molt valor tant per la seva quiralitat com per l’alta reactivitat dels aldehids. Per aquesta raó s’ha dissenyat el bioreactor dotant-lo d’una aixeta a la part inferior mitjançant la qual se’n pot extreure el contingut quan es vulgui. Si es vol precedir d’aquesta forma aleshores s’hauria de dissenyar un procés de separació adequat a tal efecte. Per exemple fent passar la solució per membranes selectives a àcids de cara a separar el component majoritari i posteriorment separar la mescla de substrat i intermedi mitjançant un procés de destil·lació, aprofitant els diferents punts de condensació de les substàncies, 212ºC (PubChem) i 162ºC (Chemspider) respectivament per el 2-metil-1,3-propandiol i el 2-metil-3-hidroxipropanal. 5.2.1. Disseny del fermentador pels microorganismes La fermentació que es vol dur a terme en aquest treball, l’oxidació del 2-metil-1,3propandiol per l’acció dels Gluconobacter oxydans, requereix una contribució important d’aquestes bactèries. Per aquesta raó en aquest cas no es pot dur a terme un procediment habitual d’inocular el mateix fermentador que produeix l’àcid, el que s’ha de fer és un fermentador que funcioni en paral·lel mitjançant el qual obtinguem els bacteris. L’objectiu d’aquest treball no és dissenyar aquest fermentador, per tant no se’n farà un disseny en 3D ni tampoc els plànols per a la seva construcció o la determinació de la seva geometria. El que sí que farem en aquest apartat es designar quines són les condicions de funcionament. En l’estudi fet per Sang-Hyun Pyo es proporcionen certes dades d’interès per a saber Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 67 més coses sobre aquest fermentador (1). Aquestes es recullen a la taula 6. Temperatura 28ºC pH 5.5 Agitació 500 rpm Aeració 1 vvm Duració 48h Productivitat (matèria seca) 1.3 g/L Taula 9: Condicions de la fermentació dels Gluconobacter oxydans Per el control del pH a 5.5 s’utilitzen dues solucions, NH4OH com a base i HCl com a àcid. A part per evitar problemes amb l’espuma s’afegirà polipropilenglicol quan sigui necessari. És necessària una concentració de bactèries de 2.6 g/L en termes de matèria seca, per a que es donin les conversions desitjades d’àcid. El volum inicial de substrat que es posa en el fermentador és de 235 litres, i fent un càlcul fàcil es sap que el que necessitarem per respectar aquesta concentració de bactèries seran 612 g d’aquestes per a cada fermentació. La fermentació dels microorganismes ens dóna una productivitat de 1.3 g/L de matèria seca, per tant: 612𝑔 1.3𝑔/𝐿·2=940𝐿 Que és el volum de treball necessari per a produir la quantitat desitjada. S’ha de tenir en compte que la fermentació principal dura 8 h, i aquesta en dura 48 h. En termes absoluts la diferència és molt gran, però si pensem en jornades laborals la única diferència és que la fermentació principal la farem un cop al dia i la referent als microorganismes un cop 68 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic cada dos. Per aquesta mateixa raó serà necessari doblar la productivitat de la més llarga per tal d’adaptar-la al ritme de la fermentació més curta. Així doncs es poden plantejar diverses alternatives per aquest sistema de reactors: OPCIÓ 1 2 fermentadors de 470L + 1 de 235L OPCIÓ 2 5 fermentadors de 235L OPCIÓ 3 1 fermentador de 940L + 1 de 235L Taula 10: Opcions de combinacions de reactors Sembla que les dues primeres opcions són les més vàlides, doncs un fermentador de 940L s’allunyaria bastant del paràmetres típics de l’escala pilot. Per altra banda l’opció 2 seria important considera-la, doncs el fet que la concentració de bactèries obtinguda sigui just la meitat que la requerida per la fermentació principal, 1.3 i 2.6 respectivament, possibilita que puguem utilitzar el mateix disseny que en el fermentador per a la producció de l’àcid. Tot i així s’ha de tenir en compte que com més reactors s’utilitzin més costos associats al consum energètic o a l’establiment de sistemes de control hi haurà. Finament el sistema escollit serà el corresponent a l’opció 1, una opció entremig de les altres dues. Les dimensions estaran dins dels paràmetre típics de l’escala pilot i no s’usen un nombre tant elevat de bioreactors. Aquesta configuració té dues avantatges. Cada bioreactor per si sol produeixi la quantitat necessària de bactèries per una fermentació, per tant ens estalviarem els costos associats a la conservació de les bactèries. Això no passaria amb la opció 3, la meitat de la producció del qual s’hauria d’emmagatzemar fins el dia següent. L’altra avantatja és sobre l’opció 2, que implicaria un operari altament especialitzat, doncs hauria de controlar a la vegada 5 bioreactors. 5.2.2. Volum de treball i volum del fermentador Per tal de començar a fer el disseny el que s’ha fet primer de tot és escollir quina seria la producció desitjada. S’ha decidit fixar-se un objectiu de 350 kg d’àcid. A partir d’aquesta producció s’ha pogut determinar el volum final del fermentador de la següent forma. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 69 Es volen produir anualment 350 kg i habitualment en un any es treballen uns 225 dies en jornades de 8h, que és el que dura la fermentació: 350,000 𝑔 à𝑐𝑖𝑑 1 𝑎𝑛𝑦 ·1 𝑎𝑛𝑦 225 𝑑𝑖𝑒𝑠 𝑡𝑟𝑒𝑏𝑎𝑙𝑙𝑎𝑡𝑠·1 𝑑𝑖𝑎 1 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó=1555.56 𝑔 à𝑐𝑖𝑑/𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó A partir d’aquesta dada i de la productivitat, 6.6 g/L, podem calcular el volum de treball: 1555.56 𝑔 à𝑐𝑖𝑑 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó·𝐿 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó 6.6 𝑔 à𝑐𝑖𝑑 =235.69 𝐿 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó El volum de treball és un 70-80% del volum total del fermentador per contrarestar la formació d’espuma. En aquest cas no hi ha informació referent a aquest problema, però en l’estudi que s’està prenent com a guia es fa ús d’un agent antiespumant en el cultiu de les bactèries, per tant s’ha decidit ser prudents en aquest aspecte i deixar espai suficient. 𝑉𝑡𝑟𝑒𝑏𝑎𝑙𝑙=𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙·0.7 𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙=235.69 0.7 =336.7 𝐿 Aquest volum per tal de facilitar el disseny s’arrodoneix a l’alça a 350L que serà el volum definitiu del fermentador dissenyat en aquest treball. 5.2.3. Paràmetres de forma del fermentador El tipus de fermentador que s’ha escollit per a la producció de l’àcid ha estat un reactor discontinu de tanc agitat, amb una mètode d’operació de tipus Batch. Per a fer el disseny s’han seguit una sèrie de dimensions relatives totes elles recollides en la taula 5. (52) Il·lustració 37: Geometria típica d'un fermentador de tanc agitat (52) 70 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Altura del líquid en relació a l'altura del reactor Hl/Ht 0.7 Altura del reactor en relació al diàmetre Ht/Dt 1.5 Diàmetre de la turbina en relació al diàmetre del tanc Da/Dt 0.33 Diàmetre dels deflactors en relació al diàmetre del tanc Dd/Dt 0.09 Altura de la fulla de la turbina en relació amb el diàmetre de la turbina W/Da 0.2 Amplada de la fulla de la turbina en relació al diàmetre de la turbina L/Da 0.25 Distància de l'anell ruixador al mig de la turbina E/W 1 Taula 11: paràmetres de disseny d'un fermentador de tanc agitat. Valors extrets de (52) 5.2.4. Determinació de la geometria del recipient Arribats a aquest punt és necessari trobar les dimensions característiques del fermentador. El fermentador que s’ha dissenyat és de cos cilíndric amb una cúpula a la part de dalt i una cúpula invertida a la part de baix, per tant a l‘hora de considerar el volum s’han de considerar que aquestes dues també. Per a fer-ho es planteja la següent equació de cara a fer una primera estimació, que descriu que el volum és només degut al cilindre. 𝑉=𝜋4·𝐷2·𝐻 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 71 I dels paràmetres de disseny sabem que H=1.5·D, i per tant: 0.35=𝜋4·(𝐻 1.5)2·𝐻 D’on trobem que H=1.00089 m≅1 m. Així decidim que la cúpula de dalt tindrà una altura h1=12 cm=0.12 m i la de baix una lleugerament inferior, h2 =10 cm=0.1 m. Ara podem trobar les dimensions exactes. Sabent el volum d’una cúpula: 𝑉𝑐=𝜋·ℎ2 3·(3𝑅−ℎ) 𝑖 𝑅=𝐷2=23·𝐻 Podem escriure el volum total del reactor de la següent forma: 𝑉=𝜋4·𝐷2·𝐻+𝜋·ℎ12 3·(𝐻−ℎ1)+𝜋·ℎ22 3·(𝐻−ℎ2) Eq. 26 On substituint: 0.35=𝜋4·(𝐻 1.5)2·𝐻+𝜋·0.122 3·(𝐻−0.12)+𝜋·0.12 3·(𝐻−0.1) Obtenim finalment uns valors de: 𝐻=0.9793≅0.98 𝑚 𝐷=0.65286≅0.65 𝑚 5.2.5. Deflectors La importància dels deflectors rau en evitar la formació de vòrtex i de forts corrents, és molt habitual l’ús d’aquests i se solen usar nombres parells. En el cas del nostre treball s’utilitzaran 4 deflectors instal·lats a les parets del fermentador a 90ºC l’un de l’altre. El diàmetre dels deflectors s’ha calculat amb els paràmetres de disseny mostrats anteriorment: 72 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 𝐷𝑑 𝐷𝑡=0.09 𝐷𝑑=0.09·0.65=0.0585 𝑚 L’espessor dels deflectors s’ha escollit que sigui de 1 cm donat que és habitual que siguin plaques planes, l’altura serà igual a la de la part cilíndrica del fermentador. Il·lustració 38: La figura de l'esquerra esquematitza el funcionament d'una turbina axial o radial sense deflectors, la de la dreta una que si que en disposa. (53) 5.2.6. Agitador i motor Com ja s’ha explicat l’agitador escollit és una turbina Rushton, d’ús habitual en reactors biològics. S’ha escollit una turbina de 6 pales i a continuació es mostren els càlculs fets per saber-ne la geometria. 𝐷𝑎 𝐷𝑡=13 ; 𝑊 𝐷𝑎=15 ; 𝐿 𝐷𝑎=14 ; 𝐸 𝑊=1 𝐷𝑎=13·0.65=0.216667 𝑚≅0.217 𝑚 𝑊=15·0.217=0.0434 𝑚≅0.043 𝑚 𝐿=14·0.217=0.05425 𝑚≅0.054 𝑚 𝐸=0.043 𝑚 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 79 líquid calculada anteriorment a l’apartat 5.2.7., ja que està a sota de tot; i integrant aquesta velocitat en tota l’altura del líquid. 𝑣=1 𝐻𝑙·∫√2𝑔ℎ 𝐻𝑙 0·𝑑ℎ Eq. 32 𝑣= 1 0.78∫ √2·9.81·ℎ·𝑑ℎ=5.678· 0.78 0[2√ℎ3 3]00.78=2.6𝑚 𝑠 𝑄=𝑣·𝐴→𝐴=1.5·10−3𝑚2=15 𝑐𝑚2 Com que la sortida és per una canonada cilíndrica en podrem saber el radi. 𝑆=𝜋·𝐷42→𝐷=√𝑆𝜋=4.37 𝑐𝑚 𝑜 43.7 𝑚𝑚 Per evitar problemes deguts a l’estimació que s’ha fet s’augmentarà un 30% quedant en 57 mm. Així doncs aquest serà el diàmetre de la sortida principal que es connectarà a una canonada o mànega. Pel cas de l’aixeta l’elecció del diàmetre no ha estat possible, doncs difícilment dissenyarem una aixeta quan és molt més senzill adquirir-ne una. D’aquesta manera s’ha trobat un model interessant i s’ha dissenyat la canonada segons les especificacions d’aquest model, mitjançant una unió per roscat de pas 1.814 mm i un diàmetre de 21 mm. Il·lustració 43: Model d'aixeta escollit. Extret del domini públic de GRABCAD (A) i detall de la canonada de sortida amb renderitzat (B). En aquest cas el buidat no es donarà en menys de un minut. Però no és un impediment doncs aquesta aixeta està pensada per a extreure mostres per saber en quin punt de la fermentació estem, o extreure l’intermedi aldehid si interessa. 80 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 𝑄=2.6·3.46·10−4=9·10−4𝑚3 𝑠 𝑡=𝑉𝑄=0.2356 9·10−4=261.62 𝑠→4min𝑖 21𝑠 5.2.9.3. Vàlvules En totes les entrades i sortides s’utilitzaran vàlvules. En general en tots els casos només ens interessen les posicions d’obert i tancat així que el que utilitzarem seran les vàlvules de bola, adequades per a aquest ús. Il·lustració 44: Vàlvula de bola de l'empresa GENEBRE i vàlvula de seguretat de seguretat de GENERANT En el cas de la sortida d’aire s’utilitzarà una vàlvula de seguretat. Aquest tipus de vàlvula s’usa per evitar pressions grans i s’obre de cop quan la pressió és excessiva. 5.3. Disseny en Solidworks® En aquest apartat es mostraran diferents vistes del disseny fet amb Solidworks®. Il·lustració 45: Vista de la tapa superior. Sense renderitzar Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 81 Il·lustració 46: Vista en detall de la tapa amb renderitzat Il·lustració 47: Vista en detall de la part baixa amb renderitzat 82 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Il·lustració 48: Vista de secció en perspectiva amb renteritzat Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 83 Il·lustració 49: Vista amb perspectiva dimètrica del fermentador amb renderitzat 84 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Il·lustració 50: Vista posterior del fermentador amb renderitzat Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 85 5.4. Plànols del Disseny 86 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 87 88 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 95 8. Organització del projecte 96 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Conclusions L’objectiu d’aquest treball era el disseny en 3D i l’elaboració dels plànols d’un reactor de 350L per a produir 350 Kg d’àcid 2-metil-3-hidroxipropanoic per mitjà d’una fermentació microbiològica. Això s’ha fet utilitzant els programes Solidworks i eDrawings. Primerament s’ha hagut d’escollir el bacteri a fer servir i per això s’ha fet una recerca bibliogràfica d’estudis sobre la temàtica concloent en els Gluconobacter Oxydans, usats en l’estudi fet per Sang-Hyun Pyo (1), que s’ha pres com a guia. El tipus de reactor triat ha estat de tanc agitat (H=98cm i D=65cm) funcionant per lots, amb una fermentació de durada 8h i una productivitat de 6.6 g/L d’àcid. Per tal d’evitar la formació de vòrtex s’han usat 4 deflectors i, pel fet de ser una fermentació curta, s’ha usat un aïllant per a mantenir la temperatura adequada, desestimant la possibilitat d’usar una camisa tèrmica. En l’estudi (1) es mencionen problemes d’inhibició pel substrat de manera que s’ha estudiat la cinètica microbiana. A (26) Edwars considera que el model matemàtic proposat per Haldane és el que millor descriu el fenomen i la seva expressió matemàtica és senzilla. Per aquest motiu és el model escollit. L’elecció del sistema d’agitació s’ha basat en els estudis de Davis (54) i Armenante (57), decidint-nos per una doble turbina Rushton. L’estudi de Pyo feia ús d’una agitació de 1000 rpm però això portava a uns costos molt elevats de consum elèctric (22kW, 20€/fermentació) de manera que, anàlogament a (17), s’ha decidit rebaixar-les a 500 rpm i un motor de 3 kW. Degut a la necessitat de contar amb una fermentació prèvia pel creixement del bacteri, s’ha dissenyat un pla d’operacions. Són necessaris dos operaris per dur a terme les 10 fermentacions setmanals necessàries per arribar a la producció 350 kg d’àcid anuals. L’estudi econòmic ha resultat en un cost total del projecte de 13352,86€. En l’estudi de l’impacte ambiental s’han calculat les emissions de CO2 per kilogram de producte; les emissions degudes a la fermentació principal no són molt elevades, 4.7, però considerant les degudes a la fermentació prèvia les emissions són molt majors, 32. Aquest últim valor, degut a la baixa productivitat i l’alta agitació, ens fa plantejar-nos la necessitat d’investigar alternatives per tal de reduir les emissions. Una bona manera seria seguir les indicacions d’un altre estudi fet per Molinari el 2003 (17) amb una altra bactèria, els acetobacter pasteurianus, en el qual assolí una productivitat molt major (25 g/L) i usà un agitació molt menor (300 rpm). Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 97 Bibliografia 1. Sang-Hyun Pyo et al. A new route for the synthesis of methacrylic acid from 2-methyl1,3-propanediol by integrating biotransformation and catalytic dehydration. Green Chemistry, 2012, Vol. 14, p. 1942-1948. 2. E. de Jong and G. Jungmeier. Industrial Biorefineries & White Biotechnology. 2015. p. 3-33. 3. B. Kamm, M. Kamm. Principles of biorefineries. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, Vol. 64, p. 137-145. 4. Diverses fotografies extretes del domini públic de Wikipedia. [En línia]. http://www.wikipedia.org. Consultat desembre 2016. 5. M. Ringpfeil. Biobased Industrial Products and Biorefinery Systems–Industrielle Zukunft des 21. 2002. 6. Neste Oil. Neste Renewable Diesel (NEXBTL). [En línia]. https://www.neste.com/en/ companies/products/fuels/neste-futura-diesel. Consultat Novembre 2016. 7. A. R. Womac, C. Igathinathane, P. Bitra, P. Miu, T. Yang, S. Sokhansanj, S. Narayan. Biomas Pre-Processing Size Reduction with instrumented Mills. Minneapolis 2007. ASABE Annual International Meeting. 8. Johan Sanders. Biorefinery, the bridge between Agriculture and Chemistry. Gent 2005. International Conference on Renewable Resources & Biorefineries. 9. Joseph J. Bozell and Gene R. Petersen. Technology development for the production of biobased products from biorefinery carbohydrates. Green Chemistry, 2010, Vol. 12, p. 525-728. 10. Mark R. Wilkins and Hasan K. Atiyeh. Food and Industrial Bioproducts and bioprocessing. Stillwater, Wiley-Blackwell, 2012. p. 195-199. 11. M. J. Waites, N. L. Morgan, J. S. Rockey, G. Higton. Industrial Microbiology: An introduction. London, Blackwell Science, 2010. 12. Andreas Liese and Murillo Villela Filho. Production of fine chemicals using biocatalysis. Current Opinion in Biotechnology, 1999, Vol. 10, p. 595-603. 13. Arthur I. Aronson and Yechiel Shai. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbiology letters, 2001, 98 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Vol. 195, p. 1-8. 14. H. Svarstad, H. C. Bugge and S. S. Dhillion. From Norway to Novartis: Cyclosporin from Tolypocladium inflatum in an open access bioprospecting regime. Biodiversity and Conservation, 2000, Vol. 9, p. 1521-1541. 15. D. Dobie and J. Gray. Fusidic acid resistance in Staphylococcus aureus. Archives of Disease in Childhood, 2004, Vol. 89, p. 74-77. 16. World Health Organization. Laboratory biosafety manual. Ginebra. World Health Organization publications, 2004. 17. F. Molinari, R. Gandolfi, R. Villa, E. Urban and A. Kiener. Enantioselective oxidation of prochiral 2-methyl-1,3-propandiol by Acetobacter pasteurianus. Tetrahedron: Asymmetry, 2003, Vol. 14, p. 2041-2043. 18. R. León, D. M. F. Prazeres, P. Fernandes, F. Molinari and J. M. S. Cabral. A Multiphasic Hollow Fiber Reactor for the Whole-Cell Bioconversion of 2-Methyl-1,3propanediol to (R)-β-Hydroxyisobutyric Acid. Biotechnology Progress, 2001, Vol. 17, p. 468-473. 19. Hiromichi Ohta, Hatsuki Tetsukawa, and Naoko Noto. Enantiotopically Selective Oxidation of alpha,omega-Diols with the Enzyme Systems of Microorganisms. The Journal of Organic Chemistry, 1982, Vol. 47, p. 2400-2404. 20. A. Gupta, V. K. Singh, G. N. Qazi and A. Kumar. Gluconobacter oxydans: Its Biotechnological Applications. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 2001, Vol. 3, p. 445-456. 21. Kenneth C. Fugelsang. Wine Microbiology. Fresno. Springer Science+Business Media Dordrecht, 1997. 22. Sue Macauley, Brian McNeil, and Linda M. Harvey. The Genus Gluconobacter and its Applications in Biotechnology. Critical Reviews in Biotechnology, 2001, Vol. 21, p. 125. 23. W. Olijve and J. J. Kok. An Analysis of the Growth of Gluconobacter oxydans in Chemostat Cultures. Archives of Microbiology, 1979, Vol. 121, p. 291-297. 24. P. F. Stanbury, A. Whitaker and S. J. Hall. Principles of Fermentation Technology. Burlington. Butterworth and Heinemann, 2003. 25. Jacques Monod. The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology, 1949, Vol. 3, p. 371-394. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 99 26. Victor H. Edwards. The Influence of High Substrate Concentrations on Microbial Kinetics. Biotechnology and Bioengineering, 1970, Vol. 12, p. 679-712. 27. A. N. Collins, G. N. Sheldrake and J. Crosby. Chiralty in Industry: The commercial Mannufacture and Applications of Optically Active Compounds. Manchester. John Wiley & Sons, 1992. 28. William G. Robinson, Roy Nagle, Bimal K. Bachhawat, Floyd P. Kupiecki, and Minor J. Coon. Coenzyme a thiol esters of isobutyric, methacrylic and bethahydroxyisobutyric acids as intermediates in the enzymatic degradation of valine. The Journal of Biological Chemistry, 1957, Vol. 224, p. 1-11. 29. M Midland, N Nguyen. Asymmetric Synthesis of y-Lactones. A Facile Synthesis of the Sex Pheromone of the Japanese Beetle. Journal of Organic Chemistry, 1981, Vol. 46, p. 4107-4108. 30. Wilson H. De Camp. The FDA Perspective on the Development of Stereoisomers. Chiralty, 1989, Vol. 1, p. 2-6. 31. Loring Coes, Jr. Manufacture of methacrylic acid. Du Pont. Estats Units. US2379625. 3-07-1945. 32. William G. Robinson and Minor J. Coon. Synthesis of Malonic Semialdehyde, BHydroxypropionate and B-Hydroxyisobutyrate. Methods in ezimology, 1963, Vol. 6, p. 549-553. 33. William Choy, Philip Ma and Satoru Masamune. Enantioselective synthesis of bhydroxyisobutyric acid: a useful synthon in the synthesis of polypropionate-type natural products. Tetrahedron Letters, 1981, Vol. 22, p. 3555 - 3556. 34. Charles T. Goodhue and James R. Schaeffer. Preparation of L (+) PHydroxyisobutyric Acid by Bacterial Oxidation of Isobutyric Acid. Biotechnology and bioengineering, 1971, Vol. 13, p. 203-214. 35. J. Hasegawa, M. Ogura, S. Hamaguchi, M. Shimazaki, H. Kawaharada, and K. Watanabe. Stereospecific conversion of isobutyric acid to D-betha-hydroxyisobutyric acid by microorganism. Journal of fermentative technology, 1981, Vol. 59, p. 203-208. 36. Y. Lee, W. K. Hong, Y. B. Hwang, C. H. Kim, E. S. Choi,S. K. Rhee and Y. H. Park. Production of D-β-Hydroxyisobutyric Acid from Isobutyric Acid by Candida rugosa. Fermentation and bioengineering, 1996, Vol. 81, p. 79-82. 37. C. H. Kim, W. K. Hong , I. Y. Lee , E. S. Choi, S. K. Rhee. Enhanced production of D-β-hydroxyisobutyric acid through strain improvement. Journal of Biotechnology, 1999, 100 Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic Vol. 69, p. 75-79. 38. I. Y. Lee, C. H. Kim, B. K. Yeon, W. K. Hong, E. S. Choi, S. K. Rhee, Y. H. Park, D. H. Sung, W. H. Baek. High production of D-β-hydroxyisobutyric acid from methacrylic acid by Candida rugosa and its mutant. Bioprocess Engineering, 1997, Vol. 16, p. 247252. 39. Hiromichi Ohta and Hatsuki Tetsukawa. Enantiotopically selective oxidation of 1,3diols with a microorganism. Chemistry Letters, Vol. 8, 1979, p. 1379-1380. 40. M. Shimazaki, J. Hasegawa, K. Kan, K. Nomura, Y. Nose, H. Kondo, T. Ohashi and K. Watanabe. Synthesis of Captopril starting from an Optically Active β-Hydroxy Acid. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1982, Vol. 30, p. 3139-3146. 41. D. A. Evans, C. E. Sacks, W. A. Kleschick and T. R. Taber. Polyether Antibiotics Synthesis. Total Synthesis and Absolute Configuration of the Ionophore A-23187. Journal of American Chemical Society, 1979, Vol. 101, p. 6789-6791. 42. N. Cohen, W. F. Eichel, R. J. Lopresti, C. Neukom, and G. Saucy. Synthetic Studies on (2R,4'R,8'R)-α-Tocopherol. An Approach Utilizing Side Chain Synthons of Microbiological Origin. Journal of Organic Chemistry, 1976, Vol. 41, p. 3505. 43. Quirico Branca and Albert Fischli. A chiral economic synthesis of (R)- and (S)- muscone using the cyclofragmentation of epoxysulfones. Helvetica Chimica Acta, 1977, Vol. 60, p. 925-944. 44. Robert Wilczynski and Jamie Jerrick Juliette. Methacrylic Acid and Derivatives. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, 2003. 45. William Bauer, Jr. Methacrylic Acid and Derivatives. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Weinheim. Wiley-VCH, 2005. 46. Universitat de Barcelona. Apunts Enginyeria Bioquímica i Biotecnologia. Barcelona, 2016. 47. TEESING. [En línia]. https://www.teesing.com/en/page/product-information/filters/ spargers. Consultat Gener 2017. 48. E. M. T. El-Mansi, C. F. A. Bryce, B. Dahhou, S. Sanchez, A. L. Demain and A. R. Allman. Fermentation Microbiology and Biotechnology. Boca Raton. Taylor & Francis Group, 2012. 49. J. De Ley and K. Kersters. Oxidation of Aliphatic Glycols by Acetic Acid Bacteria. Bacteriological Reviews, 1964, Vol. 28, p. 164-180. Disseny d’un bioreactor per a produir àcid 3-hidròxid-2-metilpropanoic 101 50. E. B. Chain, S. Paladino, D. S. Callow, F. Ugolini and J. Van der Sluis. Studies on aeration-I. Bulletin of World Health Organization, 1952, Vol. 6, p. 73-97. 51. Mott corporation. Bio-Fermentation Study. Mott Laboratory Test Report. Farmington. [En línia]. http://mottcorp.com/products/biofermentation-sparger. Consultat Desembre 2016. 52. Kurt Eyer. Development of an Industrial Biotechnologyl Proces. [En línia]. http://moodle.epfl.ch/pluginfile.php/1519946/course/overviewfiles/ScaleUP.pdf?forcedown load=1. Consultat Desembre 2016. 53. Dynamix Agitators INC. [En línia] http://www.dynamixinc.com/baffled-by-baffles. Consultat Desembre 2016. 54. Ryan Z. Davis. Design and Scale-Up of Production Scale Stirred Tank Fermentors. Utah State University, Logan, 2010. 55. Paulo Rogério Meneses de Sousa. Escalonamento de tanques condicionadores utilizados na flotação de apatita. Escola Politécnica da Universidade de São Paulo. São Paulo, 2010. 56. A. W. Nienow and M. D. Lilly. Power Drawn by Multiple Impellers in Sparged Agitated Vessels. Biotechnology and Bioengineering, 1979, Vol. 21, p. 2341-2345. 57. Piero M. Armenante and Gwo-Ming Chang. Power Consumption in Agitated Vessels Provided with. Industrial and Engineering Chemistry Research, 1998, Vol. 37, p. 284-291. 58. James A. Mueller, William C. Boyle and H. Johannes Pöpel. Aeration: Principles and Practice. Boca Raton. CRC Press, 2002. 59. Sigma-Aldrich Corporation. [En línia] http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product /aldrich/z672998?lang=es®ion=ES. Consultat Gener 2017. 60. Oficina Catalana del Canvi Climàtic. Guia pràctica per al càlcul d’emissions de gasos amb efecte d’hivernacle (GEH). [En línea]. http://canviclimatic.gencat.cat/web /.content/home/redueix_emissions/guia_de_calcul_demissions_de_co2/160411_Guiapractica-calcul-emissions_sense-canvis_CA.pdf. Consultat Gener 2017.