Anàlisi comparatiu de vins per cromatografia

- 1 - Memòria “ANÀLISI COMPARATIU DE VINS PER CROMATOGRAFIA” TFG presentat per optar al títol de GRAU en ENGINYERIA QUÍMICA per Antonio Palazzo Barcelona, 4 de Desembre de 2013 Director: Enric Boada Altarriba Departament Enginyeria Química Universitat Politècnica de Catalunya (UPC) Anàlisi de vins per cromatografia - 2 - ÍNDEX MEMÒRIA Index........................................................................................... - 8 - Resum ....................................................................................... - 10 - Resumen……………………………………………………………………………………………………….5 - Abstract ..................................................................................... - 10 - Agraïments……………………………………………………………………………………..………… . 7Capítol 1: Introducció .................................................................... - 8 - Capítol 2: El vi ............................................................................ - 10 - 2.3.Composició del vi ........................................................... - 12 - 2.3.1.Àcids orgànics .......................................................... - 12 - 2.3.2.Alcohols .................................................................. - 12 - 2.3.3.Sucres .................................................................... - 16 - 2.3.4.Substàncies nitrogenades .......................................... - 17 - 2.3.5.Vitamines ................................................................ - 17 - 2.3.6.Sals minerals ........................................................... - 17 - 2.3.7.Esters ..................................................................... - 17 - 2.3.8.Aldehids .................................................................. - 18 - 2.3.9.Compostos fenolics ................................................... - 18 - 2.3.10.Compostos aromàtics ................................................ - 20 - 2.3.11.Dioxid de carboni ..................................................... - 21 - 2.3.12.Oxigen .................................................................... - 22 - 2.3.13.Dioxid de sofre ........................................................ - 22 - 2.4.Mètodes oficials d’anàlisi segons l’OIV ............................... - 24 - 2.4.1.Acidesa total ............................................................ - 25 - 2.4.2.Acidesa volàtil .......................................................... - 27 - 2.4.3.Grau alcohòlic volumètric .......................................... - 30 - 2.5.Presentació de les mostres .............................................. - 41 - Capítol 3: LA CROMATOGRAFIA ..................................................... - 47 - 3.1.Què és la cromatografia .................................................. - 47 - 3.1.1.Cromatografia planar ................................................ - 48 - 3.1.2.Cromatografia de columna ......................................... - 49 - 3.2.Cromatografia de gasos .................................................. - 49 - 3.2.1.Esquema d’un cromatograf de gasos ........................... - 50 - Anàlisi de vins per cromatografia - 3 - 3.2.2.La columna ............................................................. - 51 - 3.2.3.Injecció de la mostra ................................................ - 55 - 3.2.4.Sistemes pneumàtics ................................................ - 55 - 3.2.5.Els detectors ............................................................ - 55 - 3.2.6.Acoblament amb espectromètre de masses .................. - 57 - 3.2.7.Mètodes de calibratge ............................................... - 57 - Capítol 4: Probes cromatogràfiques ................................................ - 60 - 4.1.Materials i reactius ......................................................... - 60 - 4.2.Preparació de la mostra .................................................. - 62 - 4.3.Condicions cromatogràfiques i ......................................... - 63 - identificació dels pics ................................................................. - 63 - 4.4.Assatjos de comparació amb tres vins .............................. - 74 - 4.5.Assatjos d’extracció de components ................................. - 86 - volàtils .................................................................................... - 86 - Capítol 5: Resultats i discussió ...................................................... - 97 - 5.1.Parametres basics .......................................................... - 97 - 5.2.Anàlisis cromatogràfics .................................................. - 103 - 5.3.Anàlisi de components principals ..................................... - 105 - Capítol 6: Conclusions ................................................................. - 111 - Capítol 7: avaluació economica..................................................... - 113 - 7.1.Costos dels reactius ...................................................... - 113 - 7.2.Costos del material de laboratori ..................................... - 114 - 7.3.Costos de l’equipament ................................................. - 115 - 7.4.Costos de l’aigua .......................................................... - 115 - 7.5.Costos de l’energia ....................................................... - 115 - 7.6.Costos del personal ....................................................... - 116 - 7.7.Amortització de l’equipament ......................................... - 116 - 7.8.Costos globals .............................................................. - 116 - Capítol 8: Bibliografìa .................................................................. - 117 - 8.1.Referencies bibliografiques ............................................. - 117 - 8.2.Bibliografia de consulta .................................................. - 117 - Capítol 9: Annexes ..................................................................... - 119 - 9.1.Limits màxims acceptables imposats per l’OIV .................. - 117 - 9.2.Cromatogrames realitzats pels serveis Cientifico-Tecnics UB117 - Anàlisi de vins per cromatografia - 4 - Anàlisi de vins per cromatografia - 5 - RESUM Es van escollir i obtindre sis vins catalans de dues diferents Denominacions d’Origen amb el fi de caracteritzar-los, comparar-los i classificar-los mitjançant la cromatografia de gasos. Es va realitzar una sèrie de probes preliminars per trobar les condicions cromatogràfiques que permeten determinar correctament la proporció relativa dels principals alcohols presents al vi i per identificar els temps de retenció d’aquests components. Al mateix temps es van realitzar els anàlisi d’alguns paràmetres basics dels vins, segons els mètodes oficials de l’Organització Internacional de la Vinya i del Vi. L’ utilització de l’eina estadística de l’anàlisi de components principals (PCA) va permetre de classificar els vins segons la seva Denominació d’Origen. RESUMEN Se escogieron y obtuvieron seis vinos catalanes de dos diferentes Denominaciones de Origen con el fin de caracterizarlos, compararlos y clasificarlos mediante cromatografía de gases. Se realizó una serie de pruebas preliminares para encontrar las condiciones cromatograficas que permiten determinar correctamente la proporción relativa de los principales alcoholes presentes en el vino y para identificar los tiempos de retención de estos componentes. Al mismo tiempo se realizaron los análisis de algunos parámetros básicos de los vinos, según los métodos oficiales de la Organización Internacional de la Viña y del Vino. La utilización de la herramienta estadística del análisis de componentes principales (PCA) permitió clasificar los vinos según su Denominación de Origen. Anàlisi de vins per cromatografia - 6 - ABSTRACT Six Catalans wines, from two different Designations of Origin, were selected and obtained in order to characterize, compare and classify them by the means of gas chromatography. A series of preliminary tests were conducted to find the proper chromatographic conditions allowing to determine the relative proportion of the major alcohols present in wine and to identify the retention time of these components. At the same time were carried out the analysis of some basics parameters of wine, according to the official methods of International Organization of Vine and Wine. The use of the statistical tool of principal component analysis (PCA) allowed classifying the wines by their Designation of Origin. Anàlisi de vins per cromatografia - 7 - AGRAÏMENTS En primer lloc vull agrair al meu director de projecte, Enric Boada, pel seu suport en un moment molt crític, sense el qual no hagués pogut entregar el projecte. Desprès venen els agraïments per els cellers de:  Bernaví, de Vilalba dels Arcs, Terra Alta,  Bàrbara Forés, de Gandesa, Terra Alta,  Finca Parera, de Sant Llorenç d’Hortons, Alt Penedès,  Jaume Giró i Giró, de Sant Sadurní d’Anoia, Alt Penedès. Per haver-me ofert les mostres que es van analitzar en aquest projecte. Per últim agraeixo al meu pare per haver-me donat l’idea del projecte i a la meva mare pel seu suport moral. Anàlisi de vins per cromatografia - 8 - CAPÍTOL 1: INTRODUCCIÓ 1.1. Motivació El vi és una beguda que forma part de la mil·lenària cultura europea. Des de el punt de vista químic, el vi té una composició molt complexa i existeixen moltíssim paràmetres que poden influir en la seva qualitat. En els últims dos segles, amb l’advent de la química moderna, es van desenvolupar mètodes d’anàlisi que permeten controlar de forma eficient el procés de vinificació, embotellat i criança. Al mateix temps es van introduir normatives que reglamenten la Producción de raïm i la seva successiva elaboració, amb el fi de obtindre un producte de qualitat. Les tècniques analítiques actuals son essencials a l’hora de detectar fraus comercials, comprovar la presencia de substancies potencialment nocives pel consumidor i, més en general, caracteritzar, comparar i classificar els vins. Una de les més versàtils d’aquestes tècniques és la cromatografia de gasos instrumental i és la que es va utilitzar en aquest projecte amb el propòsit de determinar els alcohols més importants presents al vi. 1.2. Objectius Els objectius d’aquest projecte són:  Trobar unes condicions cromatogràfiques optimes per determinar el contingut de metanol, etanol, acetat d’etil i alcohols superiors presents al vi.  Analitzar amb aquestes condicions sis vins negres catalans de dos diferents Denominacions d’Origen i de diferents categories de preu. Anàlisi de vins per cromatografia - 9 -  Intentar realitzar també l’extracció d’altres compostos volàtils que són responsables de l’aroma del vi, sempre amb la finalitat de analitzar-los mitjançant la cromatografia de gasos.  Analitzar altres paràmetres basics d’aquests vins: Grau alcohòlic volumètric, pH, sucres residuals, acidesa total i acidesa volàtil.  Amb les dades obtingudes en els dos tipus d’anàlisi, realitzar un anàlisi de components principals per veure si és possible diferenciar entre dues Denominacions d’Origen distintes. Anàlisi de vins per cromatografia - 16 - La glicerina, un alcohol amb tres grups hidroxils, ès el tercer component quantitativament mès representatiu en el vi, amb una concentració que varia entre 5 i 20 g/L amb valors mitjans al voltant de 8-10 g/L. La glicerina té un sabor lleugerament dolç i transmet al vi cos, consistencia i suavitat, per aquest motiu en algunes circumstancies, s’afegeix de forma fraudolenta, amb l’objectiu de dissimular defectes en el vi. La glicerina no forma part de l’estudi d’aquest treball ja que la seva determinació, segons els metodes oficials de l’OIV, ès realitza mitjançant metodes enzimatics o per oxidació amb acid periodic seguida de determinació colorimetrica i no per cromatografía de gasos. Un altre polialcohol que es formen en el curs de la fermentació ès el 2,3butanodiol, amb continguts entre 0,4 i 1,3 g/L; molt mès modesta es la presencia de l’acetoina, amb valors mitjans entre 6 i 8 mg/L. 2.3.3. Sucres La vinya accumula en el seus fruits sucres en forma de sacarosa peró durant la maduració l’enzima invertasa l’hidrolitza en glucosa i fructosa, que son els dos sucres principals del raim, arribant a representar entre el 15% i el 25% en pes del raïm madur. El clima influex molt en la producció: les vinyes cultivades en climes calids proporcionen mès sucres i doncs més graduació alcoholica. Mentre que la glucosa i la fructosa son hexoses, ès a dir sucres amb sis atoms de carboni, també son presents trioses, tetroses, pentoses i heptoses. No tots els sucres són fermentables, per exemple els sucres de cinc atoms de carboni arabinosa, ramnosa i xilosa. Normalment no tots els sucres son fermentats completament, també perqué a partir d’un cert contingut alcoholic els llevats moren. Els sucres que queden despres de la fermentació es diuen “sucres residuals”. Anàlisi de vins per cromatografia - 17 - 2.3.4. Substàncies nitrogenades Les sustancies nitrogenades del raïm tenen un paper molt important pel desenvolupament i nutrició dels llevats. El nitrogen esta present en una gran quantitat de formes: en primer lloc el nitrogen amoniacal, que és trova en forma d’amoniac o bé de sals d’amoni. Desprès tenim el nitrogen organic, que basicament esta constituit per aminoacids, polipeptides i proteïnes encara que també existeixen amides, amines biogeniques, purines, piridines i acids nucleics. Els aminoacids quantitativament més importants son l’arginina, la prolina i la treonina, seguits per l’acid glutamic i la serina mentre que els altres son presents en quantitats molt petites. Desprès de la fermentació el nitrogen amoniacal desapareix casi totalment, que és assimilat pels llevats, així com una part dels aminoacids. Continua sent important el contingut en prolina, que ès una caracteristica fortement lligada a la varietat de raïm encara que també influex l’anyada. 2.3.5. Vitamines En el raïm son presents les deu vitamines del grup B i una modesta quantitat d’acid ascorbic (vitamina C), peró en pasar de most a vi el contingut vitaminic decreix notablement. Per tant no es pot dir que el vi sigui una beguda vitamínica, excepte per l’acció vitaminica PP dels polifenols. 2.3.6. Sals minerals L’element mès representatiu ès el potassi, seguit pel calci, que en el raím ès mès abundant que el magnesi, mentre que en el vi, a causa de la precipitación del tartrat de calci pot ocurrir el contrari. El sodi es generalment menys abundant, excepte en el cas particular de raïms que provenen de vinyes cultivades a la vora del mar. Relativament als anions tenim la presencia de fosfats, solfats i clorurs. 2.3.7. Esters L’acetat d’etil és l’ester mès comú en el vi i té un doble origen: els llevats i les bacteries acetiques. En el curs de la fermentació l’acetat d’etil es produeix de forma linial amb l’augment de la graduació alcoholica, mentre que en el cas de la Anàlisi de vins per cromatografia - 18 - fermentació acética ès produeix nomès en la seva primera fase, per ser desprès metabolitzat completament. També aquest compost es presta a la determinació per cromatografía de gasos amb les mateixes condicions dels alcohols superiors i per aixó forma part de l’estudi d’aquest treball. Segon l’estudi de Usseglio-Tomasset citat anteriorment els continguts d’acetat d’etil varien entre 30 mg/L fins a més de 200 mg/L, i es va trobar una correlació significativa entre un’alt contingut d’acetat d’etil i una elevada acidesa volátil. Nivells elevats d’acetat d’etil confereixen igualment al vi el carácter de “picat acetic”. També son presents altres esters peró en quantitats molt mès baixes, aquests formen part de les substancies aromatiques i inclouen els esters etilics dels acids capronic, caprilic, capric, lactic, piruvic, succinic així com els acetats d’isoamil, d’hexil, i de 2-feniletil. Alguns d’aquests esters es formen lentament en el curs de l’envelliment per les reaccions entre els acids del vi i els alcohols presents, esencialment l’etanol; desprès d’un temps molt llarg fins a una decima part de l’acidesa d’un vi es pot trobar en estat esterificat. 2.3.8. Aldehids L’acetaldehid es l’aldehid més important present al vi, i es forma tant com un producte secundari de la fermentació gliceropiruvica, com per l’oxidación química del etanol, si es deixa el vi a contacte amb l’aire. L’acetaldehid está implicat en el procès de maduració dels vins negres i ès el responsable de defectes sensorials, com l’olor a vi excesivament oxidat. Aquest defecte es preveu amb l’addicció de dioxid de sofre, que és lliga amb l’acetaldehid formant l’aldehidbisulfit, un compost sense olor. Aquesta reacció ès espontanea i l’equilibri tendeix cap a la forma combinada, així que nomès quan l’acetaldehid está combinat completament queda SO2 lliure. Aixó significa que els vins amb un alt contingut en acetaldehid necessitaran mès dioxid de sofre per protegir-los de l’oxidació. 2.3.9. Compostos fenolics Anàlisi de vins per cromatografia - 19 - Al vi existeixen uns compostos fenolics anoments tanins, que li donen la caracteristica de l’astringencia, o sigui de contreure el tissuts de la boca. Els tanins tenen la capacitat de combinar-se amb les proteïnes i altres polimers com els polisaccarids, aixó explica l’effecte astringent, provocat per la precipitació de les proteïnes i glucoproteïnes de la saliva. Estructuralment els tanins presents al vi son polimers condensats dels 3flavonols. (-)-Epicatequina (2R,3R), un dels quatre esteroeisomers del 5,7,3’,4’ tetraoxiflavon-3-ol En els mostos i vins joves els tannins presenten pesos moleculars mitjans al voltant de 500-700 (dímers i trímers) mentre que en vins envellits ocurren condensacions amb pesos moleculars de 2000-3000, o sigui unes deu molecules condensades. També son compostos fenolics els pigments, que es diuen antocians, que son els responsables del color caracteristic del vi negre. Els antocians, només es troben a la pellofa del raïm, mentre que la pulpa es incolor. Els antocians son glucósidos de les antocianidines, o sigui es formen de la unió d’una sal de flavilio amb una molecula de sucre. Anàlisi de vins per cromatografia - 20 - Malvidina-3-monoglucosid En l’especie Vitis Vinifera els antocians son presents nomès en forma de monoglucosidos mentre que en altres especies de Vitis es troben prevalentment en forma de diglucosidos, aixó ès molt útil per detectar l’addicció de raïms provinents d’hibrids que no son permesos per la legislació. En el proces d’envelliment els antocians reaccionen amb altres compostos, com l’acid piruvic, els tanins i l’acetaldehid; aixó fa que el vi envellit tingui un color teula. En el raïm també existeixen uns pigments grocs, d’estructura similar a la dels antocians i flavonols. El pigment d’aquest tipus mès frequent tant al raïm negre com al blanc, ès la isoquercitrina, un glucosid en posició 3 de la quercetina, que és un derivat del flavó. Isoquercitrina Juntament amb els tanins i els antocians augmenten l’estabilitat del color del vi. Sembla que els flavons presents al raïm no poden justificar el color del vins blancs: la seva solubilitat i la quantitat que es trova als vins blancs no expliquen l’intensitat del color, que seria més bé deguda a productes de l’oxidació dels tanins. 2.3.10. Compostos aromàtics Les substancies aromatiques es poden dividir en tres grups: el mprimer compren substancies presents en raïms amb aroma caracteristic, com podría ser el Moscatel; el segon gurp compren un gran numero de compostos que deriven del matabolisme dels llevats y que son esencialment responsables del carácter “vinòs” del vi. Anàlisi de vins per cromatografia - 21 - El tercer grup inclou substancies sense olor particular, provinents en part de la uva i en part originades en el curs de la fermentació, les cuals es transformen molt lentament durant el procès d’envelliment per donar origen a altres substancies responsables del “bouquet”, el perfum caracteristic del grans vins. Relativament al primer grup es tracta de compostos terpenics: els mès comuns son el linalol, que ès el mes representat cuantitativament i també el mès actiu organolepticament, l’α-terpineol, el nerol, el geraniol el citronelol i el hotrienol. El segon i el tercer grup esta casi totalment constituit per acids grassos, alcohols de sis atoms de carboni i dels esters resultants, sent els mès representatius l’acid capronic, l’acid caprilic, l’acid capric, la γ-butirolactona, el 2-fenil etanol, i el lactat d’etil, juntament a altres numeroses substancies presents en quantitats molt baixes. Cap dels compostos indicats ès caracteristic d’una varietat particular i per tant les diferencies organoleptiques entre vins diferents s’han de buscar en la composició del medi que, d’alguna forma, determina la formació de compostos volatils durant la fermentació o bé per succesius i lents fenomens de transormació química durant l’envelliment. 2.3.11. Dioxid de carboni Aquest gas ès un dels dos productes principals de la fermentació, segons el seu contingut en SO2 els vins poden ser classificats com: -Vins tranquils: vins que contenen una pressió de CO2 inferior a 1 atm a una temperatura de 20ºC. -Vins d’agulla: vins que contenen una pressió de CO2 d’entre 1 atm i 2,5 atm a una temperatura de 20ºC. -Vins escumosos: vins que contenen una pressió de CO2 natural d’entra 3 atm i 5 atm a una temperatura de 20ºC. -Vins gasificats: vins en els que el CO2 no es produeix de forma naural, sinó hi que és afegit. L’efecte del contingut de dioxid de carboni sobre el sabor dels vins tranquils no ès irrelevant: en l’equilibri apropiat el CO2 pot aixecar els compostos aromàtics i afegir frescor i entusiasme, especialment als blancs, en grans vermells, d'altra banda, fins i tot nivells molt més baixos de CO2 poden fer un vi dur, àcid i excessivament tannic. En els vins negres tranquils joves i afrutats aquest equilibri s’assoleix al voltant dels 500 mg/L, mentre que en els vins envellits aquesta quantitat no deuria de superar els 100-200 mg/L. Relativament als blancs una Anàlisi de vins per cromatografia - 22 - concentració optimal pot variar, segons el tipus de vi, entre els 500 i 1800 mg/L. 2.3.12. Oxigen El paper de l’oxigen sobre la qualitat dels vins está comprobat de forma clara només pels seus efectes negatius: ès suficient una lleugera oxidacio que es produeix en l’embotellat per provocar una modificació i desaparició dels aromes i l’aparició d’un cert amargor, lligat a la presencia d’acetaldehid lliure. Desprès d’un period de varios mesos de conservació en ampolla el carácter “oxidat” desapareix i es recuperen les caracteristiques oloroses tipiques del vi. Per escurçar el desenvolupament d’aquesta oxidació en el cas de vins destinats a un consum rapid, és oportuna l’addicio abans d’embotellar de 20-30 mg/L de SO2. Els vins sotmesos a un prolongat contacte amb l’aire assumeixen caracteristiques de vins oxidats, “maderitzats”, perdint rapidament les seves propietats organoleptiques normals. Es pot dir en general que, amb l’excepció d’alguns vins en els que es busca el carácter oxidat, com pot ser el vi de Madeira, la preocupació constant de l’enotecnic es de mantindre el vi fora del contacte amb l’aire. D’altra banda en el cas dels vins sotmesos a criança en botes de fusta, la lenta i moderada penetració d’oxigen a través de la fusta sembla ser un factor indispensable per la maduració del vi. 2.3.13. Dioxid de sofre El dioxid de sofre té multiples funcions en enología. La primera i mès important es l’acció antimicrobiana, que preserva el vi de defectes deguts a llevats i bacteries indesiderats. Aquesta practica és antiga: els mercaders de vi anglesos i holandesos solien cremar sofre a dins de les barriques on trasportaven el vi abans de omplirles. El dioxid de sofre també té una pronunciada acció antioxidant ja que inactiva les oxidasas i al mateix temps ès ell mateix un compost facilment oxidable i llavors dona protección a altres compostos. Degut al seu poder necrosant sobre les celules vegetals, l’SO2 afavoreix l’extraccio de substancies de les parts solides durant la maceracio: en particular dels antocians peró també dels polifenols. La major part del SO2 que es trova en els vins s’afegeix en la vinificació, encara que una petita quantitat es pot formar a partir dels sulfats del most per obra dels llevats. Anàlisi de vins per cromatografia - 23 - La forma més utilitzada per afegir SO2 al vi ès el metabisulfit de potassi (K2S2O5), normalment en solució aquosa al 10% (m/v). El dioxid de sofre té tendencia per lligar-se tant amb l’acetaldehid com amb els antocians; quan es combina amb aquests ultims dona origen a compostos incolors, aixó porta a una disminuició de la intensitat del color en els vins negres. En l’ambit dels pH d’interès enologics els antocians es troben combinats en un percentatge d’entre el 70% i el 85%. Els vins blancs son els que més necessiten l’addició de SO2, al fi d’impedir qualsevol canvi oxidatiu i del sabor: segon examen organoleptics es troben correlacions postives entre la qualitat i el contingut en dioxid de sofre, encara que existeixen nivells optims variables per cada tipus de vi. Relativament als vins negres ocurreix el contrari: dels mateixos test organoleptics resulta una influencia del SO2 sobre l’aroma, color i sabor netament desfavorable. Aquesta influencia es deu als compostos resultants de la combinació entre el dioxid de sofre i els antocians. Anàlisi de vins per cromatografia - 24 - 2.4. Mètodes oficials d’anàlisi segons l’OIV Classificació dels metodes analitics (Resolució Oeno 9/2000) TIPUS I (METODE – CRITERI DE REFERENCIA) : Ès un metode que defineix un valor que no es possible establir res mès que en els termins del metode mateix i que, per definicio, ès l’unic metode utilitzat per establir el valor acceptat del parametre mesurat (Titol alcoholometric, massa volumica, acidesa total, acidesa volatil, sucres reductors). TIPUS II (METODE DE REFERENCIA) : Un metode de tipus II es que es designa com Metode de Referencia, quan els metodes del tipus I no son aplicables. S’hauria de seleccionar entre els metodes de tipus III (segons es defineix més endavant) recomanant-se la seva utilització en cas de litigi i per a finalitats de verificació (Potassi, àcid cítric). TIPUS III (METODES ALTERNATIUS APROVATS): Els metodes del tipus III son els que satisfan tots els criteris definits per la Subcomissió de Metodes d’Analisi per als metodes que poden emprar-se per a finalitats de control, inspecció o reglamentació (Glucosa i fructosa per via enzimàtica). TIPUS IV (METODES PROVISIONALS): Els mètodes del tipus IV són els que s'han emprat tradicionalment o han començat a emprar-se recentment, però para l'acceptació del qual no s'han determinat encara per la Subcomissió de Mètodes d'Anàlisis els criteris que han de satisfer (Recerca de colorants sintètics, mesura del potencial d'oxido-reducció). Anàlisi de vins per cromatografia - 25 - 2.4.1. Acidesa total Mètode OIV-MA-AS313-01 (mètode de tipus I) Definició L'acidesa total del vi és la suma dels àcids valorables quan és valorat fins a pH 7 amb una solució alcalina normalitzada. El diòxid de carboni no és inclòs en l'acidesa total. Principi Valoració potenciomètrica o valoració amb indicador blau de bromotimol i comparació amb un patró de coloració. Aparells -Bomba de buit -Matràs kitasato de 500 mL -Potenciòmetre amb escala graduada en unitats de pH i elèctrodes. L'elèctrode de vidre s'ha de conservar en aigua destil·lada. L'elèctrode de calomelans de clorur potàssic saturat s'ha de conservar en solució saturada de clorur potàssic. Generalment s'utilitza un elèctrode combinat que es conserva en aigua destil·lada. -Gots de precipitats de 50 mL (en cas de vins) i de 100 mL (en cas de mostos concentrats) Reactius -Solució tampó pH 7.0: Fosfat monopotàssic, KH2PO4 : 107,3 g Solució d'hidròxid sòdic, NaOH, 1M : 500 mL Aigua csp 1000 mL - Solució d'hidròxid sòdic, NaOH, 0,1M -Solució de blau de bromotimol, 4g/L: Blau de bromotimol : 4 g Alcohol neutre, 96% (v/v) : 200 mL Un cop solubilitzat afegir: Aigua sense CO2: 200 mL Solució d'hidròxid sòdic, 1 M, csp coloració verd-blavosa (pH 7) : ≈7,5 mL Anàlisi de vins per cromatografia - 32 - Obtindre abocant acuradament 1 litre d’aigua a 60-70 ºC sobre 120 g d’oxid de calci, CaO. Preparació de la mostra Remoure la majoria del dioxid de carboni dels vins joves i escumosos agitant 250-300 mL del vi en un flascó de 1000 mL. Procediment Mesurar 200 mL del vi amb un flascó volumetric. Registrar la temperatura del vi. Transferir el vi al flascó de destil·lació i introduir el tub de vapor de l’aparell de destil·lació. Esbandir el flascó volumetric cuatre vegades amb 5 mL d’aigua afegida al flascó o al tub de vapor. Afegir 10 mL d’hidroxid de calci, 2 M, i varis trossos de material inert poròs (pumicita, etc.) Recullir el destil·lat en ul flascó graduat de 200 mL utilitzat per mesurar el vi. Recullir un volum d’aproximadament tres quarts del volum inicial si s’esta utilitzant la destillació o un volum de 198 o 199 mL si s’esta utilitzant la destillació per arrosegament de vapor . Portar el volum a 200 mL amb aigua destil·lada, mantenint el destil·lat a una temperatura a dins de 2ºC de la temperatura inicial. Mesclar acuradament amb un moviment circular. Nota: En el cas de vins amb un alt contingut d’ions d’ammoni, el destil·lat hauria de ser redestil·lat amb les condicions descrites abans, peró substituint la suspensió d’hidroxid de calci amb 1 mL d’acid sulfuric diluït 10/100. Mesura de la graduació alcoholica del destil·lat utilitzant un picnometre Aparell Utilitzar un picnometre de pirex estandarditzat com descrit en l’exemple seguent. Procediment Mesurar la densitat aparent del destil·lat a t ºC com descrit en l’exemple. Sigui aquesta densitat ρt. Anàlisi de vins per cromatografia - 33 - Expressió dels resultats -Metode de calcul: Trobar la graduació alcoholica a 20 ºC utilitzant la taula I. En la linea horitzontal d’aquesta taula corresponent a la temperatura T (expressada com un numero sencer) immediatament per sota de t ºC, trobar le densitat mès petita major que ρt. Utilitzar la diferencia tabular just per sota d’aquesta densitat per calcular la densitat ρ a aquesta temperatuta T. En la linia de la temperatura T, trobar la densitat ρ’ immediatament per sota de ρ i calcular la diferencia entre les densitats ρ i ρ’. Dividir aquesta diferencia per la diferencia tabular just a la dreta de la densitat ρ’. El quocient dona la part decimal de la graduació alcoholica, mentre que la part sencera d’aquesta graduació es mostra a la capçalera de la columna en la qual es situa la densitat ρ’. Un exemple del calcul de la graduació alcoholica es dona succesivament. Nota: Aquesta correcció de temperatura va ser incorporada a un programa d’ordenador i es pot dur a terme automaticament. - Repetibilitat (r): r = 0,10 % vol. - Reproducibilitat (R): R = 0,19 % vol. Exemple del calcul del grau alcoholic d’un vi Mesura amb un picnometre sobre una balança monoplat Estandardització del picnometre Massa del picnomentre net i sec: P = 67,7913 g Massa del picnometre omplert amb aigua a temperatura t ºC: P1 = 169,2715 g a 21,65 ºC Calcular la massa de l’aire a dins del picnometre: m = 0,0012 (P1P) m = 0,0012 x 101,4802 m = 0,1218 g Anàlisi de vins per cromatografia - 34 - Valors per enregistrar: Tara del picnometre buit: P - m P - m = 67,7913 – 0,1218 P - m = 67,6695 g Volum a 20 ºC: [P1 – (P – m)] x Ft ºC (Els valor d’F es troben a la taula present a l’annex) F21,65 ºC = 1,002140 V20 ºC = (169,2715 – 67,6695) x 1,002140 V20 ºC = 101,8194 mL Massa de l’aigua a 20 ºC: V20 ºC x 0,998203 M20 ºC = 101,6364 g Massa del flascó de tara: T0 T0 = 171,9160 g Càlculs Pesada del picnometre omplert amb destil·lat: Pes del flascó de tara al moment de la mesura: T1 = 171,9178 g Picnometre omplert amb destil·lat a 20,50 ºC: P2 = 167,8438 g Variació en la flotabilitat de l’aire: dT = 171,9178 – 171,1960 = + 0,0018 Massa del destil·lat a 20,50 ºC: Lt = 167.8438 – (67,6695 + 0,0018) = 100,1725 Densitat apparent del destil·lat: ρ20,50 ºC = 100,1725/101,8194 = 0,983825 Calcul de la graduació alcoholica: Referir-se a la taula de les densitats aparents de les barrejes aigua-alcohol a diferents temperatures, present a l’annex. En la linia 20 ºC de la taula, la densitat immediatament mès gran que la densitat observada de 0,983825 ès 0,98471 en la columna 10% vol, que representa la part entera de graduació alcoholica. Anàlisi de vins per cromatografia - 35 - La densitat a 20 ºC ès: (98382,5 + 0,5 x 24) x 10-5 = 0,983945 0,98471 – 0,983945 = 0,000765 La porció decimal de la graduació alcoholica ès: 76,5/119 = 0,64 Llavors la graduació alcoholica ès: 10,64 % vol. Formula amb la cual son calculades les graduacions alcoholiques de les barrejes aigua-etanol La densitat ρ en kg/m3 d’una barreja aigua-etanol a la temperatura t ºC es dona per la formula seguent com funció de: - la graduació alcoholica en % m/m p expressat com decimal, per exemple per una graduació alcoholica de 12% m/m, p = 0,12; - la temperatura t en ºC (EIPT 68); -els coeficients numerics indicats succesivament. La formula ès valida per temperatures entre – 20 ºC i + 40 ºC. Anàlisi de vins per cromatografia - 36 - Anàlisi de vins per cromatografia - 37 - Tabla 2 Anàlisi de vins per cromatografia - 38 - Anàlisi de vins per cromatografia - 39 - Anàlisi de vins per cromatografia - 40 - Anàlisi de vins per cromatografia - 41 - 2.5. Presentació de les mostres Mostra 1 “Giró i Giró” Denominació d’origen: Penedès D.O. Productor: Jaume Giró i Giró C/ Montaner i Oller 5, Sant Sadurní d’Anoia, Alt Penedès Any de verema: 2009 Raïms: 45% Cabernet Sauvignon, 45% Merlot, 10% Syrah Elaboració: Maceraciò de les pells amb batonnage Criança: 12 mesos minim en bóta de 500 L de roure americà i francés, desprès en ampolla Grau alcoholic declarat: 14% vol. Preu de venda al public: 7,50 € Anàlisi de vins per cromatografia - 48 - La cromatografia és un procés de separació molt especial per dos motius. Primer de tot, pot separar barreges complexes amb una gran precisió: components molt similars, com proteïnes que difereixen només en un aminoàcid, poden ser separades per cromatografia. Efectivament la cromatografia pot separar qualsevol substancia volàtil o soluble si s’utilitza el correcte material absorbent, solvent i condicions operatives. El segon motiu és que la cromatografia es pot utilitzar per separar productes delicats perquè les condicions d’operació no son severes comparat amb les d’altres mètodes analítics. La cromatografia pot ser preparativa o analítica: en el primer cas s’utilitza només per separar els components d’una mescla per un seu ulterior tractament (i doncs com a forma de purificació). La cromatografia analítica només necessita de petites quantitats de material i és per mesurar les proporcions relatives d’analits a la mescla. Aquest dos tipus de cromatografia no son mutualment exclusius. En qualsevol industria química o de bioprocessament, existeix la necessitat de separar, purificar, identificar i quantificar el producte a partir d’una mescla complexa. Avui hi ha un’ampla gamma de tècniques cromatogràfiques que permeten a les industries de complir amb aquest necessitat. 3.1.1. Cromatografia planar En la cromatografia planar la fase estacionaria es troba en un pla. Aquest pla pot ser de paper, en el cas de la cromatografia de paper, que va ser la primera tecnica cromatografica en ser desenvolupada als principis del 1900 pel cientific rus Mikhail Tsvet amb el fi de separar pigments vegetals. En aquesta tecnica es posen une gotes d’una solucio amb la mostra sobre un paper de cromatografia. Aquest paper es posa verticalment en un got que conté una petita quantitat de solvent i que es tanca succesivament. Quan el solvent comença a pujar a traves del paper, s’encontra amb la soluciò amb la mostra, que comença a pujar juntament amb el solvent. El paper esta compost per cellulosa, una substancia polar, i les substancies mès polars presents a la mescla es lliguen a la cellulosa mès facilment, aixi que queden retingudes i es desplaçaran menys comparat amb els compostos prevalentment no-polars, que arribaran mes lluny. El factor de retenciò (Rf), especific de cada compost, pot ser utilitzat com ajuda per l’identificaciò d’una sustancia desconeguda. Una froma més avançada de cromatografia planar utiltza com a fase estacionaria una capa prima de particules solides absorbentes com poden ser gel de silici, alumina o celulosa sobre un support planar inert com pot ser una llamina de vidre. Aquesta tecnica es diu cromatografia de capa fina Anàlisi de vins per cromatografia - 49 - (Thin Layer Cromatography en anglès) i ofereix mès rapidesa, millor separaciò i la possibiltat de triar entre diversos materials absorbents. Els metodes mès moderns i precisos tambè permeten l’analis quantitatiu (High Performance TLC). 3.1.2. Cromatografia de columna En aquest cas la fase estacionaria es troba a dins d’un tub. Les particules de la fase estacionaria poden omplir completament la columna (columna empaquetada) o poden ser concentrades al voltant de les paredes del tub, deixant un camì obert al mig per la fase mobil (columna tubular oberta). En 1978 va ser intoduida una nova versiò de cromatografia de columna mès rapida en la que el solvent es impulsat a traves de la columna aplicant pressiò mitjançant una bomba. Això permet realitzar les separacions en un temps aproximat de 20 minuts i amb millor resolucio. El solvent que s’utilitza pot ser un liquid o un gas, en el primer cas es diu cromatografia liquida (Liquid Chromatography); en el segon cas tenim la cromatografia de gasos (Gas Chromatography o GC en anglès). Ja que la cromatografia de gasos és la tecnica utilitzada en aquest treball, a continuaciò es descriurà en detall el seu funcionament. 3.2. Cromatografia de gasos La cromatografia de gasos moderna (GC) s’ha convertit en una de les tècniques mes importants i àmpliament aplicades en el camp de la química. El nostre mon esta compost per barreges molt complexes, per exemple poden detectar més de 100000 components diferents en el petroli, així com més de 100000 proteïnes diferents al cos humà. Es per aquest motiu que és necessita d’un mètode de separació eficaç. Amb la cromatografia de gases s’aconsegueixen separacions mitjançant una sèrie de particions antre una fase mòbil gasosa i una fase estacionaria liquida continguda en un tub de petit diàmetre, la columna, desprès que la mescla sigui injectada. Llavors un detector que monitora la composició del corrent de gas que surt de la columna, dona la senyal necessària per l’adquisició de dades. La cromatografia de gases pot ser aplicada a l’anàlisi de mescles que contenen compostos amb punts d’ebullició des de 0 fins a 700 K o que poden ser escalfats sense descompondre’s per donar una pressió de vapor d’alguns mmHg. El tamany de la mostra pot ser a l’escala de picograms, mentre que en aplicacions preparatives poden ser manejat desenes de grams. Las cromatografia de gasos ès un metode analitic estandar en la recerca, desenvolupament i control de qualitat en moltes industries, en especial la petroquimica i la farmaceutica, i en l’analisi mediambiental, forenç, de contaminants al menjar i de residus de medicaments. Anàlisi de vins per cromatografia - 50 - La invencio de la cromatografia de gasos s’atribueix a A.T. James i A.J.P. Martin en el 1952 quan en el seu informe van descriure un metode de separacio d’acids grassos volatils amb nitrogen com fase mobil i la fase estacionaria composada per oli de silicona/acid esteàric sobre un support de diatomita. A sota es presenta una fotograma de Martin fent una demostraciò de seu primer cromatograf de gasos. En els anys ’50 un dels desafiaments analitics mès importants era la composiciò del petroli, que estaba reemplaçant el carbò com a font predominant de combustibles i reactius quimics. La industria del petroli, va adoptar rapidament la cromatografia de gasos per l’analisi compositional, amb sorprenents desenvolupaments i aplicacions, sobretot gracies als recercadors de Shell (Keulemans i Adlars) i de British Petroleum (Desty). En la decada succesiva la cromatografia de gasos va coneixer un’altra expansiò deguda a les apliacions en la bioquimica, amb l’analisi d’amino-acids i d’altres productes naturals (menjars, aromes, etc..). Almenys 200 articles sobre l’analisi d’acid grassos i dels seus esters habien aparegut en 1960. La rapida expansio d’aquesta tecnica va continuar, amb un creixement exponencial degut a l’us de columnes capillars en els anys ’80. 3.2.1. Esquema d’un cromatograf de gasos En el seguent esquema es mostra l’estructura d’un modern aparell de cromatografia de gasos. El component principal es la columna, de la cual es parlarà mès en detall. El gas portador, originariament nitrogen, ara heli o hidrogen, passa a traves d’un aparat que en controla el cabal, fins a l’injector de la mostra situat a l’entrada de la columna. Quan els components de la mescla, ja separats, son “eluits” de la columna, son detectats mitjançant la mesura d’alguna propietat quimica o fisica. Les senyals aixì obtingudes son grabades i Anàlisi de vins per cromatografia - 51 - elaborades fins a obtindre un cromatograma, en el que apareixen uns pics, un per cada component detectat, la qual area relativa ès proporcional a la seva concentraciò. La eluiciò dels analits es duu a terme mantenint la temperatura de la columna sufficientment elevada com per garantir la solubilitat en la fase gas. En el cas de barreges amb un ampli rang de volatilitats, el retard provocat per els ultims components, pot ser superat amb un programa de temperatura creixent. Per aquesta raò ès important tindre un bon control sobre la temperatura. Aixo al principi s’aconseguia tancant la columna a dins d’una camisa de vapor, però ara es fa amb un forn d’aire calent. També s’ha introduit l’escalfament resistiu de la columna revestida de metall, per permetre un escalfament i refredament extremadament rapid. 3.2.2. La columna La columna ès el centre del sistema analitic sencer; la qualitat de la separacio depen nomès de la mateixa. Els primers cromatografs de gasos utilitzaven columnes empaquetades, amb una llargada de 1-5 metres i un diametre intern de 1-5 mm, omplides amb particules solides recobertes amb la fase estacionaria, liquida o elastomerica. La resoluciò d’aquestes columnes ès limitada per la seva llargada, restringida ella mateixa per la caiguda de pressio deguda a la resistencia al corrent de gas. Aquesta restricciò vas ser superada amb l’introduccio de les columnes capillars, amb un diamentre intern molt mès petit (0,1-0,8 mm) i una llargada considerablement major, d’entre 10 i 100 metres. La fase estacionaria, en aquest cas, pot recubrir la paret interna (wallcoated open tubular) o bé ser impregnada sobre un support poròs (supportcoated open tubular). Anàlisi de vins per cromatografia - 52 - Aixì com les columnes capillars ofereixen millor separacio respecte a les empaquetades, també funcionen a una temperatura mes baixa, i donen una sepracio molt millor en el mateix temps, o la mateixa separacio en temps inferiors. (Veure Fig XX). Els resultats son generats fins a 10 vegades mès rapid que utilitzant una columna empaquetada. Per contra la quantitat mès limitada de fase estacionaria fa que la capacitat de la columna sigui limitada i que es necessitin sistemes especials d’introduccio de la mostra i de detectors sensibles. La columna capillar esta composada per dues parts: la canonada i la fase estacionaria. Relativament als materials utilitzats en la canonada, els primers van ser el coure, nickel, acer inoxidable i fins i tot nilò. Succesivament es van reconeixer els avantatges de les columnes de vidre per la seva relativa inercia i transparencia. Però encara presentaven problemes deguts a la seva fragilitat i activitat amb analits altaments polars, per això a partir del 1980 van començar a ser reemplaçades per les de silice fosa. La silice fosa ès un tipus de quars sintetic d’alta puresa, fabricat amb un proces basat en la teconologia de la fibra optica i té un recobriment exterior que sol ser de poliimida, que ès de color marrò i es torna mès fosca quan s’exposa a altes temperatures. La superficie interior de la silice fosa esta tratada quimicament per minimitzar les interaccions amb la mostra. La temperatura maxima d’aquest tipus de coluna ès de uns 360 °C. Anàlisi de vins per cromatografia - 53 - Les columnes capillars d’acer inoxidable s’utlitzen per aplicacons que requereixen temperatures mès elevades; les canonades d’acer inoxidable son mès resistents, i per això tambè son valides quan s’ha de eliminar la possibiltat de ruptura de la columna. Pel fet que l’acer inoxidable tè interaccions amb molts compostos, la superficie interior de la canonada està tractada quimicament o bé té una capa prima de silice fosa. Relativament a la fase estacionaria pot ser compoesta composada per polimers d’alt pes moleculars, termoestables o per particules poroses com poden ser les zeolites. Els polimers mès comunement utilitzats son els polisiloxans i els polietilenglicols. Els polisiloxans son el material mès comù en la fase estacionaria; son disponibles en una gran varietat i son els mès estables, robustos i versatils. Tots els polisiloxans comparteixen la mateixa estructura basica, formada per un atom d’oxigen i un de silici, que està lligat a dos grups funcionals (Fig. XX). El tipus i la proporcio relativa dels grups R distingueixen cada fase estacionaria i les seves propietats. Els quatre grups mès comuns son: metil, cianopropil, trifluoropropil i fenil. El tipus mès basic de polisiloxà esta sustituit en un 100% per grups metil. Quan altres grups son presents, la quantitat està indicada en percentual. Quan no s’indica el percentatge de grups metil, s’enten que es present en la quantitat necessaria per arribar al 100%, per exemple un siloxà 5% difenil, contè un 5% de fenils i un 95 % de metils mentres que un siloxà 14% cianopropilfenil conté un 7% de fenil, un 7% de cianopropil (que estan lligats al mateix atom de carboni) a mès d’un 86% de metil. Tambè existeixen fases estacionaries que contenen grups fenil a l’esquelet de siloxà (Fig. XX); aquestos tipus de fase estacionaria es diuen arilens. Els grups fenils endureixen i enforteixen l’esquelet del polimer i el preserven de la seva degradaciò a altes temperatures El polietilenglicols (PEG, en la Fig. XX) son l’altre tipus de polimer extensament utilitzat com a fase estacionaria. Els polietlienglicols son Anàlisi de vins per cromatografia - 54 - menys estables, menys robustos, i presenten una vida util mès curta comparat amb els siloxans però tenen unes propietats de separaciò uniques que fan que aquests defectes siguin tolerables. Per millorar les prestacions d’aquestes columnes hi han tecniques avançades que permeten formar enllaços covalents entre les cadenes individuals del polimer (Cross-linked Stationary Phase) i entre la fase estacionaria i les parets de la canonada (Bonded Stationary Phase). Això confereix a la fase estacionaria mes estabilitat relativament a la temperatura i als solvents; per exemple és possible esbandir la columna amb solvents per remoure contaminants. També existeixen, com s’ha explicat abans, les columnes tubulars obertes de capa porosa (PLOT, porous layer open tubular) que tenen una capa fina (<10 µm) de particules solides de petites dimensions. Els materials emprats poden ser derivats d’estiré, oxids d’alumini o bé un tamis molecular (molecular sieve). El compostos de la mostra son sotmesos a un proces de adsorciò/desorciò amb la fase estacionaria, aixì com a processos d’exclusiò de tamany i selectivitat de forma. Les columnes PLOT son molt retentives i per això s’utilitzen per obtindre separacions que serien imposibles amb les fases estacionaries convencionals. Els compostos mes comunement separats amb aquest tipus de columna son solvents amb baix punts d’ebulliciò, gasos nobles, gasos permanents (H2, N2, CO), hidrocarbons i compostos de sofre gasosos. Com s’acaba de veure, els fabricants de columnes ofereixen un’amplia gamma de columnes capillars; l’elecciò de la columna adecuada per una separacio especifica depen de la naturesa quimica dels analits, de la matriu, del solvent i en particular de la naturesa de les interaccions moleculars entre els analits i la fase estacionaria. Les interaccions dispersives (no polars) donen lloc a separacions basades en la volatilitat de l’analit, de la cual una mesura senzilla ès el punt d’ebulliciò. Al contrari una fase estacionaria i/o uns analits que presenten grups polars (per exemple cianopropil o trifluoropropil) produxein unes interaccions dipol-dipol, i per tant una major retenciò i selectivitat. Uns analits capables d’enllaços d’hidrogen poden ser separats amb una fase estacionaria que conté grups hidroxils, com el polietilenglicol. Altres parametres a escollir son el diametre intern (dc), l’espessor de la pellicula (df) i la llargada (L). Com que el numero de plats teorics, N, es proporcional a 1/dc2, quan mès estreta sigui la columna, mès gran serà la resoluciò però menor la capacitat. Valors estandar per dc son 100-500 µm amb df 0,25-0,5 µm. La llargada de la columna pot variar entre 5 m fins a mès de 100 m, els avantatges d’una eficiencia incrementada en columnes llargues son contrastats per un major Anàlisi de vins per cromatografia - 55 - temps d’analisi i pel fet que, si la resolucio depen de N1/2, i llavors de L1/2, es necessari quadruplicar la llargada per duplicar la resolucio. 3.2.3. Injecció de la mostra El procediment que sempre s’ha utilitzat per injectar la mostra al corrent de gas es realitza manualment mitjançant una xeringa amb agulla hipodermica que perfora el septum, de material elastomeric resistent a la calor. Les quantitats injectades en cas de una columna capillar solen ser molt petites, del ordre de microlitres. El tipus d’injector mès basic que va ser inventat en 1959 es diu “splitter”, que permet que una petita fracciò de la mostra entri a la columna, mentre que el reste es llença. Aquest injector permet al mateix temps de introduir en la columna quantitas mès grans de mostra en el cas de que estigui molt diluida, simplement tancant la valvula del “split”. Encara aixì hi poden haber problemes en injectar una porciò que sigui efectivament representiva de la mostra o en controlar amb gran precisiò la quantitat injectada. Aquest problemes son superats en el cromatografs moderns amb injectors automatics, que injecten una quantitat controlada de la mostra directament a l’entrada de la columna i que eliminen les imprecisions degudes a la ma del home. 3.2.4. Sistemes pneumàtics Amb l’introducciò de les columnes capillars, es va requerir mès precisiò en els sistemes de control pneumatic amb el fi de mantenir constant la pressiò i el cabal del gas portador i això s’ha aconseguit gracies als modernes sistemes electronics de control. Mentre que abans el control humà sobre la maquina es realitzaba mitjançant un teclat, deprès de l’introducciò del PC es van crear programes de control i adquisicio de dades. Ara es possible escollir si treballar amb control de cabal o amb control de pressiò i fins i tot amb un programa que vagi incrementant la pressiò. 3.2.5. Els detectors El primers cromatogrames eran generats per un sistema de valoraciò automatic però en 1954 va ser introduit el primer catarometre, (tambè conegut com TCD, Thermal conductivity detector), un detector que es basa en el cambi de conductivitat termica de la corrent de gas occasionats per la presencia de molecules de l’analit. Anàlisi de vins per cromatografia - 56 - El sensor d’un catarómetre consisteix en un element escalfat elèctricament, que pot de un fil fi de platì, or o tungstè, on la seva temperatura, a una potència elèctrica constant, depèn de la conductivitat tèrmica del gas circumdant. La resistència del fil dona una mesura de la conductivitat tèrmica del gas. El catarometre es un aparell bastant senzill i robust i respon a la majoria dels analits, pero la seva sensibiltat es baixa (10-5g/L) i per això no es possible el seu us en cromatografs de columna capillar. A partir del 1958 va ser desenvolupat un nou tipus de detector, que es basa en la mesura del corrent que produiexen els ions generats per la combustiò de molecules organiques en una flama d’hidrogen/aire. La generaciò d’aquests ions ès proporcional a la concentracio de la especie organica en el corrent de gas. Els hidrocarburs normalment tenen factors molars de resposta iguals al seu numero d’atoms de carboni, mentre que en el cas de molecules que contenen heteroatoms el factor de resposta sol ser inferior. Aquest detector es diu Flame Ionizacion Detector (FID) i ès mès sensible del TCD d’un factor de 103-104, amb limits de detecciò inferiors al nanogram. Altres avantatges significatius son el seu baix cost i la seva linialitat en un ampli rang de concentacions. Tambè existeixen altres tipus de detectors mès selectius, com l’ElectronCapture Detector (ECD), per als compostos que contenen halogens (que es apte per l’analisi de traçes de pesticides i de clorofluorocarbons), el PhotoIonization Detector (PID), que ès selectiu sobre els compostos aromatics o el ThermIonic Detector (TID), que ès particularment valid en la detecciò dels compostos que contenen nitrogen i fosfor. Altres tipus de detectors que no es basen en la ionitzaciò es el Flame Photometric Detector (FPD), selectiu sobre el compostos ensofrats, i el Atomic Emission Detector (AED), valid per compostos organometallics (en particular V, Sn, Hg, Ni i Pb). En la seguent taula es descriuen les caracteristiques mès importants de tots aquests detectors. Tipus de detector FID ECD PID TID FPD Modalitat d’operaciò Cabal massic Concentraci o Concentraci o Cabal massic Cabal massic Selectivitat Carboni organic Afinitat electonica Hidrocarbur s aromatics N/P S/P Limit de detecciò 0,5 pg/s 1 pg/µL 0,5 pg/µL 25 fg/s (P) 50 pg/s (N) 50 fg/s (S) 0,5 pg/s (P) Linialitat 107 104 107 104 (P) 105 (N) 103 (S) 105 (P) Destructiu Si No No Si Si Anàlisi de vins per cromatografia - 57 - 3.2.6. Acoblament amb espectromètre de masses La cromatografia de gasos es una eina molt util per l’analisi quantitatiu però a vegades no ès possible identificar quin component es el responsable d’un determinat pic al cromatograma, si al laboratori no es disposa del patrò. Per expandir les possibilitat d’aquest metode d’analisi es possible acoblar el cromatograf amb un espectrometre de massa: els gasos que surten de la columna, que porten els components ja separats, entren al espectrometre de massa (del que no s’explicarà en detall el funcionament perqué surtiria del tema d’aquest treball) que en determina la relaciò massa-carrega, a partir de la cual es pot deduir quin ès el component sense identificar. A partir dels anys ’80 aquesta tecnica va esdevindre de rutina en tots els laboratoris avançats. 3.2.7. Mètodes de calibratge Un cop obtingut el cromatograma i identificats els pics segons el temps de retenciò de cada component, si es vol determinar quantitativament l’analit es necessita calibrar l’instument. Existeixen cinc diferents metodes de calibratge: -Metode per normalitzaciò d’arees Aquest és el metode de quantificaciò mès senzill. Es basa en l’assumpciò que el detector respon de la mateixa forma a tots els compostos. Encara que aquesta assumpciò no sigui valida, el metode dona una bona estimaciò de la quantitat de l’analit present a la mescla. El percentatge d’un analit a la mescla serà doncs la relaciò entre l’area del pic corresponent entre la suma de les arees de tots els pics que apareixen al cromatograma. % X = Ax / n En aquest treball s’utilitzarà aquest metode, ja que no es necessita una quantificaciò absoluta ni es disposa de cap reactiu que pot ser útil com estándar intern com, per exemple, el 2-pentanol, sino que ens interessa saber les proporcions relatives dels components a la mescla. -Metode de l’estandar extern d’un sol punt (Single Point External Standard) A diferencia del metode precedent es necessita l’analisi de mès d’una mostra per calcular el factor de resposta del detector relativament a un determinat component. Anàlisi de vins per cromatografia - 64 - La primera injecció va ser d’una barreja aigua/acetona, nomès per verificar el bon funcionament del detector i de l’instrument en general. Desprès de cada injecció es porta la temperatura de la columna a 200 ºC per uns cinc minuts, amb el fi de netejar la columna dels components mes pesats, que sino podrien donar interferencies en la seguent injecció. Succesivament en van realitzar dues injeccions duplicades del destil·lat del vi Navarra D.O. “Viña Ardanche”, preparat com s’ha descrit anteriorment. En la primera injecció, nº 2126, van resultar 10 pics mentre que a la segona, n 2127, nomès en van resultar 6, aixó es deu al fet que a la primera es va injectar mès quantitat de mostra que a la segona, com podem veure del numero de comptes del integrador (10629324 de la primera contra 7506365 de la segona), i llavors l’instrument no va detectar els components presents en una concentració massa petita. Anàlisi de vins per cromatografia - 65 - Relativament a l’identificació dels pics, de moment nomès podem estar segurs de que el primer pic primer correspon a l’etanol, ja que representa la quasi totalitat de la mostra, com s’ha d’esperar. Falta el pic del metanol, que hauria d’haber sortit abans que l’etanol, sent mès volátil, i que molt probablement está solapat amb el pic de l’etanol. S’ha calculat el coeficient de variació percentual per cada pic que va apareixer als dos cromatogrames: CV = Sx/X x 100 On X representa la mitjana de la mostra i Sx la desviació estandard dividida per l’arrel del numero de mostres. Com es pot observar dels resultats de la taula el coeficient de variació ès molt alt per en parell de components, aixó significa que s’han de buscar condicions cromatografiques que permetin una millor resolució i repetibiltat. Pic 2126 2127 X S Sx CV (%) 1 96,1321 99,4238 97,778 2,3276 1,6458 1,68 2 0,2837 0,2281 0,2559 0,0393 0,0278 10,86 3 0,5562 4 0,0253 0,0103 0,0178 0,0106 0,0075 42,13 5 2,6735 6 0,1998 0,2213 0,2106 0,0152 0,0107 5,11 7 0,0169 8 0,0695 0,0817 0,0756 0,0086 0,0061 8,07 9 0,0357 0,0349 0,0353 0,0006 0,0004 1,13 10 0,0073 TOTAL 100 100 Anàlisi de vins per cromatografia - 66 - En les dues injeccions succesives, nº 2128 i 2129, es van cambiar algunes de les condicions: primer de tot es va baixar la pressió del gas portador a 1 Kg/cm3 i en segon lloc es va modificar el programa de temperatura: la temperatura inicial ès la mateixa peró es va atenuar la rampa a 3ºC/min fins a 120 ºC, mantenint al final aquesta temperatura per 10 min. Anàlisi de vins per cromatografia - 67 - En els cromatogrames resultants apareix un nou pic abans del majoritari de l’etanol, amb un temps de retenció de 1,8 min, podem estar gairebé certs de que correpongui al metanol. Quan es calculen els coeficients de variació per cada component, s’observa que son mès acceptables dels anteriors, nomès en un cas, el pic nº4, superen el 10%. Podem doncs afirmar que les noves condicions cromatografiques son millors que les anteriors: finalment apareix un dels analits d’interes i permeten una millor repetibilitat. Pic 2128 2129 X S Xs CV (%) 1 0,3252 0,3733 0,34925 0,034011836 0,02405 6,8862 2 97,8097 97,4351 97,6224 0,2648822 0,1873 0,1919 3 0,1091 0,1228 0,11595 0,009687363 0,00685 5,9077 4 0,1264 0,1672 0,1468 0,028849957 0,0204 13,8965 5 0,2555 0,3025 0,279 0,033234019 0,0235 8,4229 6 0,0054 7 0,0065 8 0,9454 1,1029 1,02415 0,111369318 0,07875 7,6893 9 0,2881 0,3303 0,3092 0,029839906 0,0211 6,8241 10 0,0962 0,1045 0,10035 0,005868986 0,00415 4,1355 11 0,0297 0,0337 0,0317 0,002828427 0,002 6,3091 12 0,0149 0,0158 0,01535 0,000636396 0,00045 2,9316 TOTAL 100,00 100,00 En l’injecció 2130 s’injecta una barreja etanol-metanol: i resulta que el temps de retenció d’aquest ultim component ès de 1,7-1,8 min, confirmant l’hipotesis anterior. Anàlisi de vins per cromatografia - 68 - A continuació es van fer dues injeccions duplicades d’una solució aquosa que conté metanol, etanol, 1-propanol i acetat d’etil: resulta que aquests dos ultims components son detectats als 2,3 min i 2,6 min, peró encara no sabem quin ès quin. A la mateixa dissolució s’afegeixen unes gotes de 1-propanol i es torna a injectar al cromatograf: augmenta considerablement el tercer pic, a 2,3 min, que llavors queda identificat com el 1-propanol; per exclusió el pic a 2,6 min correspon a l’acetat d’etil. Anàlisi de vins per cromatografia - 69 - En l’injecció 2134 s’injecta la porció del vi que va quedar en el matràs desprès de la destil·lació: no s’observa cap component adicional. En l’injecció sucesiva es torna a injectar el destil·lat de vi peró el cromatograf no va funcionar correctament i es va aturar el procès. En l’injecció 2136 s’injecta el mateix destil·lat barrejat amb una solució aquosa de 2-propanol, un alcohol que no existeix al vi i que podria ser util com estandard intern pel calibratge del cromatograf: el seu temps de retenció es de 2,1 min i es solapa parcialment amb el pic de l’etanol, llavors no ès possible utilitzar-ho com estandard intern. Successivament es prepara una dissolució aquosa de 1-butanol: desprès d’un parell d’injeccions fal·lides, a la tercera s’obté un pic a 3,2 min. Anàlisi de vins per cromatografia - 70 - Es torna a injectar la mateixa dissolució deprès de barrejar-la amb el destil·lat de vi: es confirma el temps de retenció del 1-butanol com 3,2 min. En l’injecció 2140 s’injecta el destil·lat de vi barrejat amb una dissolució aquosa de 1-butanol i 3-metil-1-butanol: hi ha un augment del pic corresponent a 4,5 min, peró si es compara amb el cromatograma anterior, s’observa que en aquest surten dos pics amb un temps de retenció molt similar, llavors l’augment en la concentració de 3-metil-1-butanol fa que els dos pics es solapin. El component que genera l’altre pic podria ser l’altre alcohol isoamilic, el 2metil-1-butanol, ja que tenen un punt d’ebullició molt similar (127,5 ºC i 131,1 ºC). Queda clar que es necesita mès resolució per poder distinguir-los, i nomès es pot aconseguir amb unes condicions cromatografiques que facin que l’eluició dels components de la columna sigui encara mès lenta. El nou programa de temperatura preveu una Ti de 30 ºC, que es mantindrá per 2 minuts, una primera rampa de temperatura de 0,5 ºC/min per 6 minuts, o sigui fins als 33 ºC, i deprés una segona rampa de 4 ºC/min fins arribar als 120 ºC. Anàlisi de vins per cromatografia - 71 - En la primera proba d’aquest programa, l’injecció 2241, realitzada sempre amb el mateix destil·lat de vi, s’observa un augment en la resolució: els pics surten més separats i els temps de retenció son majors. De tota manera es torna a modificar el programa de temperatura augmentant la segona rampa a 5 ºC/min i aturant el procès cromatografic Anàlisi de vins per cromatografia - 72 - als 20 minuts, ja que tots els components que principalment ens interessen surten en els primers 6 minuts i doncs podem reduir el temps d’analisi per permetre de realitzar mès cromatogrames en el mateix temps. Els resultats obtinguts en l’injecció 2142 son exposats a la taula seguent: Pic T r Component Area Area % 1 1,807 Metanol 35631 0,2687 2 2,075 Etanol 13043396 98,3587 3 2,528 1-Propanol 11382 0,0858 4 2,962 Acetat d'Etil 13038 0,0983 5 3,258 ??? 25316 0,1909 6 5,822 Alcohol Isoamilic 96538 0,7280 7 6,045 Alcohol Isoamilic 27389 0,2065 8 9,363 ??? 8364 0,0631 TOTAL 13261054 100,00 S’observa que els temps de retenció, apart el del metanol i del etanol, que son gairebé identics, van augmentar: per exemple l’acetat d’etil, que abans surtia a 2,6 min, ara surt practicament als 3 min. Encara queda per identificar quin ès quin dels alcohols isoamilics. En les tres injeccions succesives apareix una major quantitat de pics respecte al previst i amb temps de retenció diferents: aixó es deu al fet que la columna no s’habia netejat correctament, portant la temperatura a 200 ºC per 5 min, i doncs es van descartar. A continuació es van realitzar una desena d’injeccions de solucions aquoses contenints els patrons de 1-butanol, 2-butanol, 2-metil-1-propanol, 2-metil1-butanol, 3-metil-1-butanol per identificar els temps de retenció d’aquests analits. Anàlisi de vins per cromatografia - 73 - L’ordre d’eluició dels components resulta ser doncs: Pic T r Component 1 1,8 Metanol 2 2,0 Etanol 3 2,5 1-Propanol 4 2,9 2-Butanol 5 3,0 Acetat d'Etil 6 3,2 2-Metil-1-Propanol 7 3,8 1-Butanol 8 5,9 3-Metil-1-Butanol 9 6,1 2-Metil-1-Butanol Si ho comparem amb l’ordre dels punts d’ebullició, reportat en la taula seguent, podem observar que els dos practicament corresponen, amb l’exepció de l’acetat d’etil, que surt depres de l’etanol i del 1-propanol, i dels alcohols isoamilics pels quals s’inveteix l’ordre. Component Punt d'ebullició (ºC) Metanol 64,65 Acetat d'Etil 77,05 Etanol 78,35 1-Propanol 97,15 2-Butanol 98,85 2-Metil-1-Propanol 107,65 1-Butanol 117,45 2-Metil-1-Butanol 127,50 3-Metil-1-Butanol 131,10 Per ultim es torna a injectar un cop mès el destil·lat de vi i es comparen els resultats amb els del cromatograma 2142: els coeficient de variació son més baixos, nomès en dos casos superen el 5%. Component 2142 2156 X S Xs CV (%) Metanol 0,2689 0,2784 0,2736 0,0067 0,0048 1,74 Etanol 98,4207 98,2616 98,3412 0,1125 0,0796 0,08 1-Propanol 0,0859 0,0944 0,0901 0,0060 0,0043 4,72 Acetat d'Etil 0,0984 0,1067 0,1025 0,0059 0,0042 4,06 2-Metil-1-Propanol 0,1910 0,22 0,2055 0,0205 0,0145 7,05 3-Metil-1-Butanol 0,7284 0,8153 0,7719 0,0614 0,0434 5,63 2-Metil-1-Butanol 0,2067 0,2237 0,2152 0,0120 0,0085 3,96 TOTAL 100,00 100,00 Anàlisi de vins per cromatografia - 80 - ANOVA Acetat d'Etil Castilla Penedes Navarra Mesura 1 0,1273 0,1482 0,0984 N = 6 Mesura 2 0,1279 0,1562 0,1067 K = 3 SUMA 0,2552 0,3044 0,2051 TOTAL 0,7647 0,1275 MITJANA 0,1276 0,1522 0,1026 0,1275 Matriu de 0,00000009 0,00001600 0,00001722 quadrats 0,00000009 0,00001600 0,00001722 respecte a la mitjana del grup SUMA 0,00000018 0,00003200 0,00003445 TOTAL 0,00006663 Matriu de 0,00000002 0,00043056 0,00084390 quadrats 0,00000020 0,00082656 0,00043056 respecte a la mitjana del total SUMA 0,00000023 0,00125713 0,00127447 TOTAL 0,00253182 Quadre de ANOVA Suma Quad. Graus Llib. Variança Entre mostres 0,00246519 2 0,0012326 Dins de mostres 0,00006663 3 2,2208E-05 TOTAL 0,00253182 5 0,00050636 Estimacio F 55,50146341 INVF(5%) 9,55208179 INVF(1%) 30,81652035 Anàlisi de vins per cromatografia - 81 - ANOVA 2-Metil-1-Propanol Castilla Penedes Navarra Mesura 1 0,1892 0,2368 0,1910 N = 6 Mesura 2 0,1958 0,2625 0,2200 K = 3 SUMA 0,3850 0,4993 0,4110 TOTAL 1,2953 0,2159 MITJANA 0,1925 0,2497 0,2055 0,2159 Matriu de 0,00001089 0,00016512 0,00021025 quadrats 0,00001089 0,00016512 0,00021025 respecte a la mitjana del grup SUMA 0,00002178 0,00033025 0,00042050 TOTAL 0,00077253 Matriu de 0,00071200 0,00043751 0,00061918 quadrats 0,00040334 0,00217311 0,00001695 respecte a la mitjana del total SUMA 0,00111534 0,00261062 0,00063613 TOTAL 0,00436209 Quadre de ANOVA Suma Quad. Graus Llib. Variança Entre mostres 0,00358956 2 0,00179478 Dins de mostres 0,00077253 3 0,00025751 TOTAL 0,00436209 5 0,00087242 Estimacio F 6,96980033 INVF(5%) 9,55208179 INVF(1%) 30,81652035 Anàlisi de vins per cromatografia - 82 - ANOVA 3-Metil-1-Butanol Castilla Penedes Navarra Mesura 1 0,8226 0,9809 0,7284 N = 6 Mesura 2 0,8519 1,0676 0,8153 K = 3 SUMA 1,6745 2,0485 1,5437 TOTAL 5,2667 0,8778 MITJANA 0,8373 1,0243 0,7719 0,8778 Matriu de 0,00021462 0,00187922 0,00188790 quadrats 0,00021462 0,00187922 0,00188790 respecte a la mitjana del grup SUMA 0,00042925 0,00375845 0,00377581 TOTAL 0,00796350 Matriu de 0,00304520 0,01063305 0,02231538 quadrats 0,00066995 0,03603037 0,00390417 respecte a la mitjana del total SUMA 0,00371515 0,04666341 0,02621955 TOTAL 0,07659811 Quadre de ANOVA Suma Quad. Graus Llib. Variança Entre mostres 0,06863461 2 0,03431731 Dins de mostres 0,00796350 3 0,0026545 TOTAL 0,07659811 5 0,01531962 Estimacio F 12,92798200 INVF(5%) 9,55208179 INVF(1%) 30,81652035 Anàlisi de vins per cromatografia - 83 - ANOVA 2-Metil-1-Butanol Castilla Penedes Navarra Mesura 1 0,2114 0,2754 0,2067 N = 6 Mesura 2 0,2200 0,3134 0,2237 K = 3 SUMA 0,4314 0,5888 0,4304 TOTAL 1,4506 0,2418 MITJANA 0,2157 0,2944 0,2152 0,2418 Matriu de 0,00001849 0,00036100 0,00007225 quadrats 0,00001849 0,00036100 0,00007225 respecte a la mitjana del grup SUMA 0,00003698 0,00072200 0,00014450 TOTAL 0,00090348 Matriu de 0,00092213 0,00113120 0,00122967 quadrats 0,00047379 0,00513133 0,00032640 respecte a la mitjana del total SUMA 0,00139592 0,00626254 0,00155608 TOTAL 0,00921453 Quadre de ANOVA Suma Quad. Graus Llib. Variança Entre mostres 0,00831105 2 0,00415553 Dins de mostres 0,00090348 3 0,00030116 TOTAL 0,00921453 5 0,00184291 Estimacio F 13,79840174 INVF(5%) 9,55208179 INVF(1%) 30,81652035 En la taula seguent s’exposen els resultats de l’ANOVA per tots els components: en vermell estan els components pels cuals s’ha trobat una diferencia altament significativa entre ells, o sigui els que tenen un valor F superior al valor critic de F amb un interval de confiança del 99%. El component pel cual s’ha trobat la diferencia major va ser el metanol: de fet el seu contingut en el vi de Castilla-La Mancha resulta ser gairebé la meitat del contingut dels altres dos vins. En groc estan els component pels cuals s’ha trobat una diferencia significativa, que tenen un valor F superior al valor critic de F amb un interval de confiança del 95%, i en verd está l’unic component pel cual no s’ha trobat una diferencia significativa, el 2-metil-1-propanol. Anàlisi de vins per cromatografia - 84 - Component Estimació F Metanol 378,4569 Etanol 35,6207 1-Propanol 53,4151 F 0,95 9,5521 Acetat d'Etil 55,5015 F 0,99 30,8164 2-Metil-1-Propanol 6,9698 3-Metil-1-Butanol 12,9280 2-Metil-1-Butanol 13,7984 Sembla que els valors F relatius als ultims tres components son mès baixos degut al fet que hi ha mès variabilitat en la seva determinació. Desprès es va realizar un altre tipus d’analisi estadística, l’analisi de components principals (PCA), efectuada mitjançant el programa Minitab 16. L’analisi de components principals s’utilitza sobretot per aconseguir una reducció de la dimensionalitat, o sigui encaixar un subespai j-dimensional en l’espai d’objectes p-variable original (p>j), i permetre un’avalaució primaria de la similitud entre categories. Aquest procediment estadístic utilitza transformacions ortogonals per convertir una serie de variables possiblement correlades en una serie de valors de variables no correlades linialment anomenats components principals. El numero de component principals ès igual o inferior al numero de variables originals. Aquesta transformació es defineix de manera que el primer component principal té la major variança posible i que cada component succesiu té la condició de ser ortogonal al component precedent, o sigui que no estigui correlat amb ell. L’analisi va ser realitzada amb les dades dels cromatogrames 2156, 2160 i 2165, que representen els vins de Navarra D.O., Castilla-La Mancha D.O. i Penedès D.O. respectivament. El programa, un cop introduides les dades, ens va tornar una taula amb els valors propis i els vectors propis de cada component i très grafiques de correlació, el scree plot, el score plot i el biplot. Valors y vectors propis de la matriu de correlació Valor propi 5,3500 1,6500 0,0000 0,0000 0,0000 -0,0000 -0,0000 Proporció 0,764 0,236 0,000 0,000 0,000 -0,000 -0,000 Acumulada 0,764 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Variable PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 Metanol 0,332 0,499 0,189 -0,047 0,290 -0,635 -0,341 Etanol -0,427 0,123 -0,399 -0,351 0,136 -0,451 0,546 1-Propanol -0,366 -0,415 -0,116 -0,129 -0,388 -0,401 -0,594 Acetat d’Etil 0,265 -0,616 0,472 0,080 0,048 -0,402 0,398 2-Metil-1-Propanol 0,413 0,230 -0,003 -0,350 -0,782 -0,044 0,203 3-Metil-1-Butanol 0,393 -0,326 -0,252 -0,689 0,364 0,189 -0,181 2-Metil-1-Butanol 0,423 -0,163 -0,711 0,504 -0,030 -0,184 0,027 Anàlisi de vins per cromatografia - 85 - El scree plot ens indica el valors propis de cada component: els components que tenen el valor propi mès alt son els que recullen la major part de la variança i que s’utilitzaran per construir les altres dues grafiques. En aquest cas els dos primers components principals recullen el 100% de la variança, com es pot observar en la taula en la fila relativa a la proporció: el primer component acumula el 76,4% de la variança i el segon acumula el 23,6%. El score plot ens indica les similituds entre les variables dels dos components principals: en aquest cas els mès similars entre ells son els alcohols isoamilics seguits per el 2-metil-1-propanol i el metanol. Anàlisi de vins per cromatografia - 86 - Per ultim tenim el biplot, el grafic més interessant, que ès un diagrama de dispersió en el que els punts representen a les mostres i els dos eixos a les variables. En aquest grafic la similitud entre mostres ès funció inversa de la distancia entres les mateixes. Com podem veure els punts que representen els tres vins son situats tots en quadrants diferents del grafic i son molt allunyats l’un de l’altre, indicant una similitud molt baixa entre ells. En conclusió podem afirmar que existeixen diferencies significatives en la variança de la composició relativa de vins amb denominació d’origen diferent i que doncs seria posible caracteritzar i clasificar els vins segons el seu contingut en metanol, etanol, acetat d’etil i alcohols superiors. 4.5. Assatjos d’extracció de components volàtils Finalitzada aquesta segona part de l’experimentació previa es van realitzar unes proves d’extracció dels components volatils, principalment esters i acids grassos, per analitzar-los amb el cromatograf. En el primer intent es realitzen, amb uns embuts de decantació, dues extraccions de 50 mL de vi Penedés D.O. “Pere Camps”, la primera amb 50 mL de n-heptá i la segona amb 50 mL d’una barreja de n-heptá/diclorometá 40/60 V/V, agitant l’embut per uns 20 minuts i recullint la fase organica que en el primer cas ès la fase superior mentre que en el segon ès la inferior. Anàlisi de vins per cromatografia - 87 - Quan s’injecten aquestes mostres al cromatograf, amb les condicions utlitzades anteriorment, en els cromatogrames resultants (2168 i 2169) apareixen uns 16-18 pics en total dels cuals n’hi ha tres de majoritari, un que correspon a l’etanol, com s’habia d’esperar, un altre corresponent al diclorometá, amb temps de retenció de 2,9 min i per ultim el del n-heptá que apareix als 5 minuts. Anàlisi de vins per cromatografia - 88 - Queda per verificar si els pics restants son deguts a components presents al vi o bé a o impureses degudes als dissolvents utiltzats en l’extracció: per aixó es fan dues extraccions de 10 mL d’aigua amb 10 mL de n-heptá en el primer cas i amb 6 mL de diclorometá i 4 mL de n-heptá en el segon. En els dos cromatogrames resultants (2170 i 2171) s’oserva que apareixen gairebé tots els pics presents en els cromatogrames anteriors, arribant a la conclusió que serien deguts a impureses del dissolvent, ja que son presents en concentración molt superiors als compostos que s’intenta analitzar (la majoria dels compostos volatils del vi son presents en concentracions inferiors a la part per milió). Per intentar detectar aquests components es modifica el programa de temperatura: la Ti ès de 50 ºC, es manté per 1 min i després a puja la temperatura de 5ºC/min fins als 200 ºC. Amb aquest nou programa s’intenta que la barreja de dissolvents es vagi agrupant en la primera part del cromatograma, per veure si en la segona part apareixen nous pics. 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 5 10 15 20 25 30 Temps(min) Temperatura(ºC ) Anàlisi de vins per cromatografia - 89 - Efectivament en el cromatograma 2172 es nota com tota la barreja de dissolvents es eluïda de la columna en els primers tres minuts, peró desprès no apaereixen altres pics significatius: nomès n’hi ha alguns massa petits per ser quantificats. De tota manera es continua fent proves utilitzant una nova estrategia de preparació de la mostra: desprès de realitzar l’extracció com s’ha descrit anteriorment, la fase organica obtinguda es concentra per evaporació en un bany d’aigua a 80ºC, fins a un volum d’aproximadament 1 mL, amb aixó s’intenta eliminar part del solvent i concentrar els compostos que volem analitzar. En el cromatograma 2183, en el cual s’ha injectat el resultat de l’extracció del vi amb n-heptá, concentrat al volum de 1 mL, sembla que apareixen uns resultats positius: desprès de tota la barreja de dissolvents surten cinc nous pics als 7, 9,9, 12,6 14,7 i 16,2 min. L’injecció sucesiva, amb la mateixa mostra, ho torna a confirmar. Anàlisi de vins per cromatografia - 96 - En la columna relativa als coeficients de variació, son reportats en verd aquells que no superen el 5%, que son 12 sobre un total de 23, desprès n’hi ha 5 que no superen el 10 % i altres 6 que sòn completament inaceptables. Podem observar que els millors coeficient de variació es concentren en la part mitjana del cromatograma, amb temps de retenció d’entre 4,9 min i 11,7 min. En conclusió podem afirmar que tendría sentit realizar un estudi comparatiu sobre els components volatils del vi que apareixen en aquest interval del cromatograma, encara que no sigui possible la seva identificació, ja que no tenim a disposició ni els estandards ni un espectrometre de masses. Anàlisi de vins per cromatografia - 97 - CAPÍTOL 5: RESULTATS I DISCUSSIÓ Un cop terminada la part de probes cromatografiques, es va procedir a analitzar les sis mostres escollides pels análisis definitius, que van ser presentades anteriorment. Es van analitzar tant els parametres basics, o sigui el grau alcoholic volumetric, el pH, els sucres residuals, l’acidesa total i l’acidesa volatil, amb els metodes oficials reportats anteriorment, com la composicó relativa dels varis alcohols per cromatografía. 5.1. Parametres basics En primer lloc es presenten els resultats obtinguts en l’analisi dels parametres basics:   PenedèsD.O.  TerraAltaD.O.  ParametreUnitatsGiróiGiróFosc PereCampsBàrbaraForés3D3BonArea GrauAlcohòlic %v/v13,5513,21 12,61 15,5613,28 12,81 pH 3,523,52 3,52 3,533,40 3,59 Sucresresidualsg/L1,10,7 0,9 1,31,9 0,7 AcidesaTotalgacidtartàric/L5,44,5 4,8 5,26,2 5,5 AcidesaVolatilgacidacètic/L0,660,54 0,47 0,500,42 1,14 Anàlisi de vins per cromatografia - 98 - La dada que mès mereix l’atenció ès l’elevada acidesa volátil del vi “BonArea”, mès del doble de la dels altres vins i lleugerament per sota del limit maxim aceptable imposat per l’OIV, 1,20 g d’acid acetic per litre, correponents a 20 meq/L (La taula amb els limits maxims fixats per l’OIV es pot consultar en l’annex). Amb aquest valor d’acidesa volátil es pot afirmar sense dubte que el vi presenta el defecte del “picat acetic”. Aixó tampoc ens ha de sorprendre, ja que correspon al vi mès barat de tots. El pH es va mostrar molt similars en tots els vins, de fet els tres amb denominació d’origen Penedès presenten exactament el mateix pH. La graduació alcoholica determinada generalment correspon amb la declarada, amb l’excepció del vi “Bârbara Forés” en el que supera d’un grau percentual la declarada (14,5 %). Amb aquestes cinc parametres es va buscar algún tipus de correlació entre ells, per exemple es podría pensar que existeix alguna correlació entre el pH dels vins i la seva acidesa total i entre el pH i l’acidesa volátil com ès reporta en les dues grafiques seguents: Anàlisi de vins per cromatografia - 99 - Com es pot veure no s’ha trobat cap tipus de correlació linial entre els parametres. Llavors es va intentar de trobar altres correlacions que podrien semblar logiques, com per exemple entre l’acidesa total i la volátil.o bé entre el grau alcoholic i els sucres residuals. Anàlisi de vins per cromatografia - 100 - També en aquest cas no s’ha pogut trobar cap relació entre els parametres. Per ultim es va efectuar l’analisi de components principals, sempre amb amb l’intenció de trobar correlacions. Es reporten els resultats succesivament: Análisi dels valors y vectors propis de la matriu de correlació Valor propi 2,8102 1,2127 0,9474 0,0285 0,0012 Proporció 0,562 0,243 0,189 0,006 0,000 Acumulada 0,562 0,805 0,994 1,000 1,000 Variable PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 Grau Alcohòlic Volumètric 0,182 -0,483 0,811 -0,250 -0,119 pH -0,554 -0,020 0,356 0,747 0,090 Sucres residuals 0,586 0,113 0,132 0,286 0,738 Acidesa Total 0,393 0,635 0,283 0,239 -0,552 Acidesa Volatil -0,403 0,592 0,344 -0,491 0,358 Anàlisi de vins per cromatografia - 101 - Com s’observa en el scree plot, els primers tres components principals acumulen la totalitat de la variança. Segons el score plot hi hauria similitud entre el pH i l’acides volátil i entre els sucres residuals i l’acidesa total, tot i que les linees no son molt properes. La primera hipotesi ja s’habia examinat i va quedar descartada. Per confirmar o desmentir la segona hipótesis es dibuixa el grafic sucres residuals Vs. acidesa total: Anàlisi de vins per cromatografia - 102 - Encara que podrien semblar més relacionats entre ells que els parametres anteriors, el coeficient de correlació linial ès molt baix: tampoc aquesta hipotesi es confirma. El biplot ens confirma que tots els intents de trobar correlacions van fracassar: els punts son molt dispersos, nomès es troba una similitud entre dos vins de Penedès, mentre que els Terra Alta queden completament separats. En conclusió podem afirmar que l’estudi d’aquests cinc parametres bàsics per si sòl no ens ha permès de caracteritzar ni de classificar els vins de cap manera. Anàlisi de vins per cromatografia - 103 - 5.2. Anàlisis cromatogràfics A continuació es presenten els resultats dels analisi cromatografics:     PenedèsD.O.    JaumeGiróiGiró2009Fosc2012PereCamps NºPicTrComponent AreaArea%AreaArea%AreaArea% 11,99Metanol74760 0,2273 47485 0,147357850 0,1664 22,19Etanol32570466 99,0409 32014013 99,286134506545 99,2439 32,791‐Propanol7534 0,0229 5131 0,015910516 0,0302 42,95X1N.D. 0N.D. 0N.D. 0 53,15X25992 0,0182 1098 0,00341541 0,0044 63,28Acetatd'Etil24945 0,0759 16031 0,049719051 0,0548 73,392‐Butanol7514 0,0228 6232 0,01934494 0,0129 83,612‐Metil‐1‐Propanol27372 0,0832 17121 0,053117808 0,0512 93,841‐ButanolN.D. 04498 0,0139N.D. 0 105,74X3N.D. 0N.D. 0N.D. 0 116,633‐Metil‐1‐Butanol76153 0,2316 60218 0,186866166 0,1903 126,762‐Metil‐1‐Butanol78381 0,2383 63882 0,198171571 0,2058 139,45X4N.D. 0N.D. 03297 0,0095 1410,67X512770 0,0388 6348 0,019710596 0,0305 1519,56X6N.D. 02132 0,0066N.D. 0   TOTAL 32885887 100,00 32244189 100,0034769435 100,00     TerraAltaD.O.    BàrbaraForés20103D32011BonArea2010 NºPicTrComponent AreaArea%AreaArea%AreaArea% 11,99Metanol57025 0,1567 81908 0,207843439 0,2795 22,19Etanol36149965 99,3367 39111245 99,201315182363 97,6795 32,791‐Propanol17911 0,0492 22178 0,05634340 0,0279 42,95X1 N.D. 0N.D. 0977 0,0063 53,15X2 N.D. 02077 0,0053212610 1,3679 63,28Acetatd'Etil21372 0,0587 25201 0,063918218 0,1172 73,392‐Butanol12037 0,0331 4334 0,011012762 0,0821 83,612‐Metil‐1‐Propanol8842 0,0243 15349 0,03896632 0,0427 93,841‐Butanol4108 0,0113 N.D. 01315 0,0085 105,74X3 N.D. 0N.D. 02826 0,0182 116,633‐Metil‐1‐Butanol48756 0,1340 70569 0,179044403 0,2857 126,762‐Metil‐1‐Butanol62272 0,1711 79696 0,2021N.D. 0 139,45X4N.D. 0N.D. 0N.D. 0 1410,67X57882 0,0217 10528 0,02678385 0,0539 1519,56X61185 0,0033 3066 0,00784773 0,0307   TOTAL 36391355 100,00 39426151 100,0015543043 100,00 Anàlisi de vins per cromatografia - 104 - Cal precisar que aquests analisi no es van realitzar al laboratori de la EUETIB perqué el cromatograf de gasos es va espatllar i no va ser posible la seva reparació, llavors les mostres, preparades amb el procediment usual, es van enviar als Serveis Cientifico-Tecnics de la UB per que les analitzin amb la mateixa columna del cromatograf de la EUETIB. Les condicions cromatografiques també van ser les mateixes, que aquí tornem a recordar: temperatura de l’injector (Tinj) = 250 ºC, temperatura del detector (Tdet) = 250 ºC, pressió de l’heli, 1,0 Kg/cm2, pressió de l’aire i de l’hidrogen 0,5 Kg/cm2, volum de la mostra injectada 0,5 μL. El programa de temperatura ès: Ti = 30 ºC, mantinguda per 2 min, despres una primera rampa de temperatura de 0,5 ºC/min fins als 33 ºC i succesivament una segona rampa de 5ºC/min. El temps total d’analisi va ser de 20 min. Com podem veure s’han detectat i quantificat un maxim de 15 pics, no tots surten en totes les mostres, encara que els set components mès importants, metanol, etanol, 1-propanol, acetat d’etil, 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanol i 2-metil-1-butanol apareixen practicament en totes. Els temps de retenció es van allargar una mica: encara que la columna ès exactament la mateixa i també les condicions, l’istrument no ès el mateix. Per exemple el pic corresponent al 3-metil-1 butanol, que amb el cromatograf del nostre laboratori sortia als 5,9 min, va sortir als 6,6 min. Aquest fet tampoc ens estorba, ja que l’ordre d’eluició dels components es conserva. Van quedar sense identificar uns sis components, que van ser anomenats X1, X2, X3, X4, X5 i X6, peró la seva concentració ès baixa comparat amb els components d’interès. Relativament al component X5, amb un temps de retenció de 10,6 min, s’observa que ès present a totes les mostres i que molt probablement correspon al 1-hexanol, peró al laboratori no es disposaba del patró per poder-ho confirmar amb certesa. La composicó relativa que, a cop d’ull, mès es diferencia de les altres ès la del vi “BonArea”, aquell que presenta un valor molt elevat d’acidesa volátil. Primer de tot hi ha un component que representa l’1,37% del total, quan en els altres vins cap component apart de l’etanol supera el 0,30% del total. Aquest component té un temps de retenció de 3,15 min que en tots els altres vins correspon a un component minoritari no identificat que s’anomena X2. Peró com que el pic succesiu, amb temps de retenció de 3,28 min, correspon a l’acetat d’etil i que aquest component es troba en concentracions mès altes en els vins que presenten una elevada acidesa Anàlisi de vins per cromatografia - 105 - volátil, sería llogic pensar que aquest pic inusual efectivament correspongui a l’acetat d’etil. També mereix l’atenció que els components X1 i X3 nomès van ser detectats en aquesta mostra, mentre que el 2-metil-1-butanol, un dels cuatre alcohols superiors mès importants no va ser detectat. En canvi s’observa un pic molt gran per el 3-metil-1-butanol: aixó nomès s’explicaria amb l’hipotesi de que els dos pics hagin sortit solapats. Per ultim si observem el numero de comptes de l’integrador, en el cas del vi “BonArea” aquest ès menys de la meitat dels altres,vins, significant que la quantitat injectada va ser inferior. Totes aquestes observacions ens porten a formular dues hipótesis: Aquest cromatograma no va ser realitzat correctament. Durant l’elaboració del vi o bé durant el procès de criança va ocurrir algún mecanisme de fermentació o bé d’oxidació quimica en proporcións tals que es van formar components que no solen ser presents en concentracions tan elevades en vins correctament elaborats. El fet de que els alcohols isoamilics van sortir solapats i que el numero de comptes de l’integrador ès inferior al de les altres mostres suporta la primera hipotesi. Al mateix temps el resultat de l’analisi de l’acidesa volátil no ens fa descartar la segona hipotesi. Com que els Serveis Cientifico-Tecnics de la UB nomès van realitzar un cromatograma per cada mostra no tenim els elements per poder confirmar o desmentir aquestes hipótesis, encara que és molt probable que aquesta anomalía en la composició relativa del vi “BonArea” es deu a la combinació dels dos factors citats anteriorment. 5.3. Anàlisi de components principals Succesivament es va efectuar l’analisi de components principals amb els resultats del análisis cromatografics i els dels parametres basics, amb vint variables en total, com es presenta a continuació: Análisi dels valors y vectors propis de la matriu de correlació Valor propi 11,635 3,559 2,867 1,248 0,690 0,000 0,000 0,000 0,000 Proporció 0,582 0,178 0,143 0,062 0,035 0,000 0,000 0,000 0,000 Acumulada 0,582 0,760 0,903 0,965 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Valor propi 0,000 0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000 Proporció 0,000 0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000 -0,000 Acumulada 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Anàlisi de vins per cromatografia - 112 -  L’anàlisi de components principals aplicada a les sis mostres oficials, utilitzant com variables 15 components determinats per cromatografia juntament amb els paràmetres basics va donar bons resultats: els vins surten agrupats per Denominació d’Origen  Hi va haver una important excepció en aquesta anàlisi, el vi “BonArea”, que surt completament aïllat de les altres mostres: desconeixem si el cromatograma va ser efectuat malament o si la seva composició resulta molt alterada per algun mecanisme de fermentació o de oxidació química, encara que és molt probable que això és deu a la combinació dels dos factors.  Per aquesta raó seria molt interessant realitzar més anàlisis sobre el vi “BonArea”, comprant més ampolles per verificar si l’elevada acidesa volàtil resulta en totes o només va ser un cas aïllat.  La falta d’equipament funcionant i de patrons al laboratori de la EUETIB ens va impedir de realitzar mès anàlisis cromatogràfics, que haguessin pogut incloure altres components, potser arribant a altres conclusions interessants. Anàlisi de vins per cromatografia - 113 - CAPÍTOL 7: AVALUACIÓ ECONOMICA 7.1. Costos dels reactius Els preus dels reactius van ser obtinguts en la pagina web de Panreac, que ès l’empresa que proveeix principalement el laboratori de la EUETIB. En cada cas s’ha considerat la compra de la quantitat minima disponible. Taula X. Preu dels reactius. ReactiuQuantitatPreu(€) AcetonaQP1L18,21 Acetatd'etilPRS1L30,26 AcidClorhidric37%QP1L13,59 AcidTartaricL(+)‐PA‐ACS 500g53,64 Blaudebromotimol5g43,55 1‐ButanolPS1L29,04 2‐Butanol99%PS1L46,38 DiclorometáPAI1L60,00 Etanol96%v/vPA1L19,77 Fenolftaleïna100g34,14 n‐HeptáPA1L64,09 Anàlisi de vins per cromatografia - 114 - n‐HexáPA1L66,87 HidroxiddesodiQP1Kg19,38 Iode100g42,81 IodurdepotassiPRS250g59,41 Metanol99,5%PS1L16,08 2‐Metil‐1‐butanolPRS1L51,96 3‐Metil‐1‐butanolPRS1L56,70 2‐Metil‐1‐propanolPRS1L30,98 Midó500g27,30 OxiddecalciQP1Kg29,44 1‐Propanol99,5%PS1L30,64 2‐PropanolQP1L19,70 Tetraboratdesodi∙10H20500g35,02 TOTAL 898,96 7.2. Costos del material de laboratori Els preus del material de laboratori es van obtindre en la pagina web de Labbox, ja que son els més barats disponibles al mercat. Taula X. Preu del material de laboratori. Article Quantitat Preuunitari (€/u.)Preutotal(€) Gotdeprecipitats25mL40,371,48 Gotdeprecipitats50mL60,593,54 MatràsErlenmeyer50mL40,722,88 MatràsErlenmeyer100mL20,801,60 MatràsErlenmeyer250mL21,302,60 Probetagraduada100mL,classeB14,014,01 Picnomètre100mL113,0913,09 Pipeta1mLclasseA11,651,65 Pipeta2mLclasseA21,653,30 Pipeta5mLclasseA41,656,60 Pipeta25mLclasseA22,494,98 Pipeta50mLclasseA14,314,31 BuretaambclaudePTFE25mL212,4924,98 Suportdobleperburetes18,038,03 Suportpeudeplat212,4624,92 Peradegoma13,903,90 Xeringa5mL 10,100,10 CartutxC18Varian5mL12,862,86 Filtredeniló0,45μm10,800,80 Matràsesfèricdefonsrodó500mL 29/3225,5911,18 Pinsesdeplastic41,244,96 Anàlisi de vins per cromatografia - 115 - Suportdesuró25,2510,50 Refrigerantrecte500mm110,3010,30 Capdedestil∙lació29/3219,499,49 Adaptadortermometre29/32114,3414,34 Colector29/3213,103,10 Embut11,001,00 Embutdedecantació250mL319,5858,74 MatràsKitasato500mL15,245,24 Espatula11,151,15 Nous42,6710,68 Pinsespermuntatge65,3331,98 Tubd'assaigambtapóderosca120,303,60 Termomètre‐10+110ºC24,929,84 TOTAL  301,73 7.3. Costos de l’equipament Equipament QuantitatPreuunitari(€/u.)Preutotal(€) Integrado/registradorShimadzuC‐R3A130003000,00 CromatografShimadzuGC‐14A11200012000,00 pHmètre1288,58288,58 Banyd'aiguaambtermostat1230,00230,00 MantacalefactoraLBXHM01190,9590,95 Balançadeprecisió1590,00590,00 TOTAL  16199,53 7.4. Costos de l’aigua AiguaVolumconsumit(L)Costunitari(€/L) Costtotal(€) Aixeta200 0,0018 0,36 Desionitzada25 0,15 3,75 TOTAL  4,11 7.5. Costos de l’energia EquipPotencia(KW)Tempsd'utilització(h)Costelectricitat(€/KW∙h)Costtotal(€) Cromatograf0,8160 0,138617,74 Integrador/registrador0,1160 0,13862,22 Banyd'aigua0,420 0,13861,11 Mantacalefactora0,620 0,13861,66 Enllumenat0,3320 0,138613,31 TOTAL   36,04   Anàlisi de vins per cromatografia - 116 - 7.6. Costos del personal Els costos del personal s’han calculat suposant que per realitzar aquest projecte s’ha necessitat d’un tecnic de laboratori a jornada completa per cuatre mesos, un total de 640 hores de les cuals la meitat van ser emprades al laboratori i la meitat en l’elaboració de dades. També s’ha necessitat d’un director de projecte peró amb un carrec de feina inferior, unes 80 hores. PersonalTempsdetreball(h)Salaribrut(€/h)Seguretatsocial(€/h)Costtotal(€) Tecnicdelaboratori640 10,00 3,208448,00 Directordeprojecte80 22,00 7,042323,20 TOTAL    10771,20 7.7. Amortització de l’equipament L’amortització s’ha calculat suposant que la vida mitjana dels equipament de laboratorio ès de 15 anys y el seu valor residual ès zero. Costtotaldelmaterial(€) 16199,53 Vidautildelmaterial(anys)15 Tempsd'utlització(anys)0,33 Amortització(€)359,99 7.8. Costos globals Preureactius898,96 Preumaterialdelaboratori301,73 Amortitzacióequipament359,99 Costaigua4,11 Costenergia36,04 Costpersonal10771,20 TOTAL12372,03 Anàlisi de vins per cromatografia - 117 - CAPÍTOL 8: BIBLIOGRAFÌA 8.1. Referencies bibliografiques Bartle, Keith D. and Myers, Peter. History of gas chromatography. Trends in analytical chemistry, Vol. 21 (9-10) (2002): 547-557. International Organization of Vine and Wine. Compendium of international methods of wine and must analysis, Vol 1, 2, Edition 2013. Ribereau-Gayon, J., Peynaud E., Sudraud P., Ribereau-Gayon P. Ciencias i técnicas del vino, Tomo I, Analisi y control de los vinos. 1980. Editorial Hemisferio Sur. Usseglio-Tomasset, Luciano. Quimica enologica. 1998. Ediciones Mundi-Prensa. 8.2. Bibliografia de consulta García-Martínez T., Bellincontro A., López de Lerma M., Peinado R. A., Mauricio J. C., Mencarelli and F., Moreno J.J. Discrimination of sweet wines partially fermented by two osmo-ethanol-tolerant yeasts by chromatographic analysis and electronic nose. Food Chemistry 127 (2011): 1391-1396. Dong-Sun Lee, Bong-Soo Noh, Sun-Young Bae, Kun Kim. Characterization of fatty acids composition in vegetable oils by gas chromatography and chemometrics. Analytica Chimica Acta 358 (1998): 163-175. Garoglio, Pier Giovanni. Enciclopedia Vitivinicola Mondiale, Vol. 3. Dall’uva al vino. 1973. Edizioni Scientifiche UIV. Juan Garcia Barceló. Tecnicas analiticas para vinos. 1990. GAB. Anàlisi de vins per cromatografia - 118 - López de Lerma N., García-Martínez T., Moreno J., Mauricio J.C. and Peinado R.A. Volatile composition of partially fermented wines elaborated form sun dried Pedro Ximénez grapes. Food Chemistry 135 (2012): 2445-2452. Rodríguez-Bencomo J.J., Conde J.E., Rodríguez-Delgado M.A., García-Montelongo F. and Pérez-Trujillo J.P. Determination of esters in dry and sweet White wines by headspace solidphase microextraction and gas chromatography. Journal of Chromatography A, 963 (2002): 213-223. Schneider, Volker. The enological and sensory significance of acetaldehyde. SchneiderOenologie. http://www.delinat-institut.org/thaka_test/schlagwort/acetaldehyde/?lang=en Stackler B. and Christensen E.N. Quantitative determination of ethanol in wine by gas chromatography. American Journal of Enology and Viticulture, Vol. 25 (4) (1974): 202-207. Ureta C., Fernando. and Brinnkmann E., Cecilia. Contenido de glicerol, 2,3 butanodiol y alcohols amílicos en vinos chilenos, utilización de un método por cromatografía de gases. Agricultura Tecnica (Chile) 46 (4) (1986): 429-434. Wondra Mojimir and Berovič Marin. Analyses of aroma compounds of Chardonnay wine fermented by different yeast strains. Food technology and biotechnology 39 (2) (2001):141148. http://webbook.nist.gov/chemistry http://panreac.es/es/lista-de-precios http://labbox.com Anàlisi de vins per cromatografia - 119 - CAPÍTOL 9: ANNEXES 9.1. Limits màxims acceptables segons l’OIV Anàlisi de vins per cromatografia - 120 - Anàlisi de vins per cromatografia - 121 - 9.2. Cromatogrames realitzats pels Serveis Cientifico-Tecnìcs de la UB