Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp

Autor: Ismael Marín López Tutores: F. Javier Sorribas Ariadna Giné 25 / Septiembre / 2016 Trabajo final de grado Ingeniería Agroambiental y del Paisaje Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 1 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Resum Meloidogyne spp. és una limitació molt important en els cultius hortícoles de les zones mediterrànies. Els productors han confiat en nematicides químics per gestionar les pèrdues de producció per aquesta causa, obviant la capacitat pròpia del sòl de regular les poblacions de patògens. A causa de la preocupació per l'ús d'agroquímics, les conseqüències d'aquests sobre el medi ambient i la regulació en el seu ús, es fa necessari l'estudi d'estratègies per a una gestió correcta i eficient dels ecosistemes agrícoles. Els sols supresius son aquells amb certa capacitat per a prevenir o reduir la propagació de patògens. Es van prendre sis sols de parcel·les agrícoles comercials sota dos sistemes de producció diferents, integrada i ecològica; cinc varen caracteritzar-se com sols supresius y un com a conductiu. Es van realitzar dos tractaments per a cada sol agrícola, un no es va esterilitzar i l’altre es va esterilitzar amb l’objectiu d’eliminar les interaccions biòtiques amb les plantes de tomàquet. Els sòls foren barrejats amb sorra esterilitzada (1:1 v/v) on es va cultivar tomàquet cv. Durinta susceptible a Meloidogyne spp. Es van inocular les plantes amb juvenils de Meloidogyne incognita. Es va mantenir l’assaig fins que es va registrar temperatura acumulada suficient per a que els nematodes foren complert una generació. La supresivitat a Meloidogyne spp. es va determinar en funció del nombre d’ ous parasitats per fong. Els ous extrets de les arrels es van sembrar en medi de creixement restrictiu i foren valorats a les 24, 48 i 72 hores. Pochonia chlamydosporia fou l’únic fong aïllat en els cinc sòls supresius, parasitant entre el 13,5 i el 43,7% dels ous. Es va comprovar com els sòls esterilitzats van generar major massa radiculars així com major tasa de reproducció dels nematodes, fent palès que l'eliminació de la biota del sòl fomenta la reproducció dels nematodes en no tenir antagonistes. Es va observar ,per tant, major parasitisme en els sòls sota gestió ecològica i tractaments sense esterilitzar, sent M10.55 amb 43,7% d’ ous parasitats el sòl amb major potencial antagònic. Paraules clau: Control biològic, hortalisses, producció ecològica, producció integrada, supresivitat. 2 Resumen Meloidogyne spp. es una limitación muy importante en los cultivos hortícolas de las zonas mediterráneas, los productores han confiado en nematicidas químicos para gestionar las pérdidas de producción por esta causa, obviando la capacidad propia del suelo de regular las poblaciones de patógenos. Debido a la preocupación por el uso de agroquímicos, las consecuencias de estos sobre el medio ambiente y la regulación en su uso, se hace necesario el estudio de estrategias para una gestión correcta y eficiente le los ecosistemas agrícolas. Los suelos supresivos son aquellos con cierta capacidad para prevenir o reducir la propagación de patógenos. Se tomaron seis suelos de parcelas agrícolas comerciales bajo dos sistemas de producción diferente, integrada y ecológica; cinco se caracterizaron como suelos supresivos y uno como conductivo. Se realizaron dos tratamientos por cada suelo agrícola, uno no se esterilizó y el otro se esterilizó con el objetivo de eliminar las interacciones bióticas con las plantas de tomate. Los suelos fueron mezclados con arena esterilizada (1:1 v/v) donde se cultivó tomate cv. Durinta susceptible a Meloidogyne spp. Se inocularon las plantas con juveniles de Meloidogyne incognita. Se mantuvo el ensayo hasta que se registró temperatura acumulada suficiente para que los nematodos hubieran cumplido una generación. La supresividad a Meloidogyne spp. se determinó en función del número de huevos parasitados por hongos. Los huevos extraídos de las raíces se sembraron en medio de crecimiento restrictivo y se valoró el parasitismo a las 24,48 y 72 horas. Pochonia chlamydosporia fue el único hongo aislado en los cinco suelos supresivos, parasitando entre el 13,5 y el 43,7% de los huevos. Se comprobó como los suelos esterilizados generaron mayor masa radicular así como mayor tasa de reproducción de los nematodos, haciendo patente que la eliminación de la biota del suelo fomenta la reproducción de los nematodos al carecer de antagonistas. Se observó, por tanto, mayor parasitismo en los suelos bajo gestión ecológica y tratamiento sin esterilizar, siendo M10.55 con 43,7% de huevos parasitados el suelo con mayor potencial antagónico. Palabras clave: Control biológico, hortalizas, producción ecológica, producción integrada, supresividad. Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 3 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Abstract Meloidogyne spp. is a very important horticultural crops limitation at the mediterranean's zones, where the farmer has relied on chemical nematicides to manage the production losses for this cause, obviating the soil's ability to regulate pathogen populations. Due to concerns about the use of agrochemicals, the consequences of these on the environment and regulation in use, it is necessary to study strategies for proper and efficient management of agricultural ecosystems. The suppressive soils are those with some ability to prevent or reduce the spread of pathogens. Six soils of commercial agricultural plots were taken under two different production systems, integrated and organic; five were characterized as suppressive soils and one conductive. Two treatments per agricultural land were conducted, one sterilized and one not, with the goal of eliminating biotic interactions with tomato plants. Soils were mixed with sterile sand (1: 1 v / v) where tomato cv. Durinta, susceptible to Meloidogyne spp., was cultivated. The plants were inoculated with Meloidogyne incognita juveniles. The assay was maintained until enough accumulated temperature was recorded for the nematodes had fulfilled a generation. The supresiveness to Meloidogyne spp. was determined according to the number of eggs parasitized by fungi. The eggs extracted from the roots were seeded in restrictive growth medium and parasitism was evaluated 24, 48 and 72 hours later. Pochonia chlamydosporia was the only fungus isolated in the five suppressive soils, infesting between 13.5 and 43.7% of the eggs. It was verified that the sterilized soils generated greater root mass and higher rate of nematode reproduction, making clear that the removal of soil biota encourages reproduction of nematodes because of the lack of antagonists. It was observed, therefore, greater parasitism in soils under ecological management and unsterile treatment, being M10.55, with eggs parasitized 43.7%, the soil with more antagonistic potential. Key words: Biological control, vegetables, organic production, integrated production, suppressivness. 4 Índice ÍNDICE DE FIGURAS __________________________________________________________________ 5 ÍNDICE DE TABLAS ___________________________________________________________________ 6 AGRADECIMIENTOS _________________________________________________________________ 7 1. INTRODUCCIÓN _______________________________________________________________ 8 Nematodos Fitoparásitos ..................................................................................................................... 10 Meloidogyne spp. ................................................................................................................................. 11 Suelos supresivos .................................................................................................................................. 14 2. OBJETIVO ___________________________________________________________________ 18 3. MATERIALES Y MÉTODOS. _____________________________________________________ 19 Suelos: localización de las parcelas, toma de muestras y gestión de los mismos .............................. 19 Inóculo ................................................................................................................................................... 21 Caracterización del potencial supresor del suelo a Meloidogyne....................................................... 21 Tratamiento estadístico ........................................................................................................................ 24 4. RESULTADOS ________________________________________________________________ 25 5. DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 27 CONCLUSIONES ____________________________________________________________________ 29 BIBLIOGRAFÍA _____________________________________________________________________ 30 Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 5 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Índice de figuras Figura 1: Ciclo patológico de Meloidogyne spp. (Fuente Agrios, 2005) Pag12 Figura 2: Mesas de cultivo donde se observan las plantas de tomate. (Agrópolis 2015) Pag 22 Figura 3: a) Huevo parasitado por Pochonia chlamydosporia. B) Placa de evaluación de parasitismo de huevos de Meloidogyne spp. Pag23 6 Índice de tablas Tabla 1. Relación de los códigos de las parcelas, localización y gestión de las mismas. (Giné et al., 2013) Pag 19 Tabla 2. Características fisicoquímicas de los suelos estudiados. (Giné et al., 2013) Pag 20 Tabla 3: Efecto de la esterilización del suelo y de la no esterilización de los suelos M10.16, M10.41, M10.55, M10.56, M10.45, M10.43, sobre el peso fresco de la raíz, huevos llenos corregidos totales, la tasa de reproducción, el número total de nematodos por planta y el porcentaje de huevos parasitados. Pag25 Tabla 4: Aumento relativo de peso radicular en los tratamientos esterilizados. Pag 27 Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 7 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Agradecimientos Agradecer especial y sinceramente a mis tutores Xavier Sorribas y Ariadna Giné por la oportunidad de trabajar con ellos y compartir pacientemente su conocimiento. Así como a todos los compañeros del Lab-20 con los que he podido compartir horas de trabajo y me han soportado, sobre todo a Anna y Sergi por estar ahí des del primer día. 8 1. Introducción El suelo es un componente de vital importancia en la producción agrícola que a menudo se descuida, o sólo se considera como un soporte físico para el crecimiento de las plantas. Sin embargo, este debe ser considerado como un sistema vivo (Ramirez et al.,1996.) y debe ser tratado como tal (Alabouvette, 2007). La intensificación de la actividad agraria junto con la reducción de la diversidad vegetal que se sucede en rotación y el uso desmesurado de agroquímicos ha comportado el desarrollo de plagas y patógenos que limitan la producción vegetal y con ello un empobrecimiento de la biodiversidad y de los procesos biológicos del suelo, favoreciendo el establecimiento de agentes nocivos para los vegetales dando lugar a suelos conductivos a plagas y enfermedades que requieren del uso de métodos drásticos de gestión para controlarlos, como son la desinfección de los suelos por métodos químicos o físicos. Sin embargo, la adopción por parte de los agricultores de sistemas de producción vegetal que anteponen el uso de métodos de regulación natural de agentes nocivos a los biocidas, podrían favorecer el desarrollo de suelos supresivos a plagas y enfermedades. Es decir, suelos en los que los agentes nocivos no se pueden establecer, o si lo hacen, el desarrollo de las poblaciones y el daño que causan es limitado en relación a un suelo conductivo. La supresividad del suelo frente a plagas y/o enfermedades es un concepto holístico que se ha pretendido explicar y manejar infructuosamente bajo un enfoque reduccionista a través del aislamiento de antagonistas específicos contra plagas y enfermedades y su reintroducción en el suelo en cantidades ingentes para conseguir el control biológico del agente nocivo. En relación a los nematodos fitoparásitos, el control biológico utilizando antagonistas microbianos es una alternativa potencial a los nematicidas químicos (Burkett-Cadena et al., 2008). Se conocen una gran variedad de organismos del suelo depredadores o parásitos de nematodos fitoparásitos (Stirling, 1991). Algunos de estos antagonistas han sido bastante eficaces en la supresión de las poblaciones de nematodos, incluyendo Pasteuria penetrans contra Meloidogyne arenaria (Chen y Dickson, 2004b) y hongos parásitos de huevos contra varios nematodos formadores de quistes (Heterodera spp.) (Chen y Dickson, 2004a; Westphal y Becker, 2001). En términos de supresividad, el parasitismo ha de concebirse como parte de la trama de la vida, constituido por componentes que interactúan a diferentes niveles de organización (Bautista-calles et al., 2008). Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 15 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech patógeno. Por ejemplo, en un suelo que contiene una cepa de una especie de Streptomyces spp. antagónica a Streptomyces scabies, la causa de la sarna de la patata, dio lugar a tubérculos de patata significativamente libres de costras (Agrios,2005). Una manera de cambiar la biología del suelo para mejorar la supresión de los nematodos parásitos de las plantas es aumentar el nivel de aportes de materia orgánica en los suelos. Cuando se añade materia orgánica al suelo, bacterias y hongos comienzan el proceso de descomposición y se multiplican rápidamente, mientras que las poblaciones de otros organismos del suelo (por ejemplo, protozoos y algas) también aumentan. Las bacterias y los hongos nematófagos se multiplican mientras hay alimento disponible. Por último, hay un aumento en el número de omnívoros, nematodos depredadores y en la actividad de los hongos depredadores tales como los hongos que atrapan nematodos. Esto resulta en una red trófica más compleja con una mayor actividad de control biológico (Stirling, 1991). Stirling et al. (2005) observaron que un mes después de la aplicación de enmiendas orgánicas la biomasa microbiana, y el número de bacterias y hongos en el suelo aumentaba y se mantenía hasta 4 meses. La supresividad de un suelo puede ser general o específica. La supresión general se consigue a causa de la comunidad microbiana presente en el mismo. En este caso, es el aumento de la actividad de la comunidad microbiana como un todo, en lugar de los cambios en la actividad de unos pocos organismos antagonistas específicos. La competencia por los recursos y la producción de sustancias antimicrobianas reduce la capacidad de los agentes patógenos resultando en niveles de enfermedad más bajos. La supresión general está relacionada con el concepto biostasis. Está directamente relacionada con la cantidad total de la actividad microbiológica en un momento crítico para el patógeno (Cook y Baker, 1983; Alabouvette, 2007). La supresión específica es la debida a componentes específicos de la comunidad microbiana, que responden a la presencia del patógeno, o a la de una especie vegetal que estimula su desarrollo hasta inhibir al patógeno. Los mecanismos por los que los suelos son supresivos a diferentes patógenos no son siempre muy claros pero pueden implicar factores bióticos y/o abióticos y pueden variar con el patógeno. En la mayoría de los casos, sin embargo, parece que operan principalmente por la presencia en estos suelos de uno o varios microorganismos antagonistas al patógeno. Tales antagonistas, mediante los antibióticos que producen, a través de las enzimas líticas, por competencia trófica, o 16 parasitismo, consiguen regular suficientemente al patógeno evitando que cause enfermedades graves. La teoría moderna de la complejidad postula que a través de las organización espontanea los sistemas de elevada complejidad, encuentran por si mismos las formas óptimas de organización y funcionamiento (Bautista-Calles et al., 2008). Estipula también que los controles externos deben mantenerse a un mínimo, ya que son los que vulneran el sistema y lo llevan al colapso. La capacidad supresora, es un ejemplo de propiedad de autoorganización de los sistemas de alta complejidad. Es probable que la supresividad a ciertas especies de patógenos, observada de manera general en ecosistemas naturales, se deba a la elevada complejidad tanto estructural como de comportamiento de las especies de microorganismos que interactúan en ellos. Es factible que surja supresividad en el suelo de un agroecosistema estimulando la complejidad de este, por ejemplo, al incrementar la diversidad microbiana beneficiosa en el suelo (Bautista-Calles et al., 2008). Bajo un enfoque holístico, y de la teoría de la complejidad, la supresividad del suelo es una propiedad emergente del sistema que resulta de su propio estado complejo de organización; el fenómeno no se puede explicar y manejar diseccionando el sistema para conocer los elementos que lo componen, ya que ninguno de esos componentes puede explicar por si solo la capacidad supresora de un suelo (Bautista et al., 2008). El concepto de supresividad a fitopatógenos por parte de ciertos suelos está bien documentado en diversas partes del mundo (Cook y Baker, 1983; Linderman et al., 1983), lo que ha contribuido a su aceptación generalizada para ser empleada en el control biológico. Sin embargo, el fenómeno aún no está suficientemente entendido como para ser aplicado en campo. Se han identificado suelos supresivos a los nematodos fitoparásitos, es decir, sistemas de producción en los cuales se mantiene un equilibrio entre las poblaciones de nematodos y sus enemigos naturales permitiendo la permanencia de cultivos susceptibles durante varios años sin presentar una reducción en su rendimiento (Kerry et al,. 1982; Sikora, 1992). En España se han llevado a cabo diversos estudios para conocer de la presencia de antagonistas de Meloidogyne spp., mayoritariamente hongos (Verdejo-Lucas et al., 1997, 2002 y 2013; Olivares-Bernabeu & López-Llorca, 2002; Giné et al., 2013). Entre los hongos más frecuentes se hallan diversas especies de Fusarium y Pochonia chlamydosporia, encontrándose, esta ultima especie, ampliamente distribuida en Cataluña como muestran los resultados de la última prospección llevada a cabo por Giné y colaboradores (2013) en esta zona. Un aspecto destacable Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 17 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech del estudio es la diversidad de antagonistas detectada en una misma parcela, lo que induce a pensar en la posibilidad de que algunos de estos suelos puedan tener potencial supresor del nematodo. En un estudio posterior llevado a cabo en dos parcelas destinadas a la producción comercial de hortalizas y en las que se detectaban niveles bajos de enfermedad a pesar de las densidades del nematodo en suelo, se concluyó que eran supresivas del nematodo a partir del estudio de la fluctuación de las densidades del nematodo en campo y el porcentaje de parasitismo de huevos durante dos años consecutivos, así como la comprobación mediante bioensayos. Además, se pudo apreciar una mayor similitud de los perfiles microbianos, principalmente de bacterias, entre los suelos supresivos que entre estos suelos y uno conductivo al nematodo (Giné et al., 2016). Estos han sido hasta la fecha los únicos suelos supresivos a Meloidogyne caracterizados en España, aunque podría haber más dados los niveles de parasitismo detectados en el estudio de Giné y colaboradores (2013). La caracterización de dichos suelos y el estudio en profundidad de los perfiles microbianos existentes en ellos pueden aportar una información valiosa para conocer la base biológica de la supresividad, es decir, la presencia y abundancia de los grupos funcionales implicados en la misma, como fluctúan en el tiempo y como les afecta la gestión de las parcelas. 18 2. Objetivo El objetivo del trabajo fue caracterizar la potencial supresividad de suelos destinados a la producción comercial de hortalizas en los que se habían detectado diferentes niveles de parasitismo de huevos de Meloidogyne en un estudio precedente (Giné et al., 2013). Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 19 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech 3. Materiales y métodos. Suelos: localización de las parcelas, toma de muestras y gestión de los mismos Se tomaron muestras de suelo de 6 parcelas de producción hortícola en febrero de 2015. La relación de los códigos de las parcelas, siguiendo la notación usada en el trabajo realizado por Giné y colaboradores (2013), la localización y la gestión de las mismas se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Relación de los códigos de las parcelas, localización y gestión de las mismas. (Fuente: Giné et al., 2013) Las características fisicoquímicas del suelo de cada parcela se presentan en la Tabla 2. En cada parcela se tomó una muestra de suelo compuesta de 48 submuestras, de acuerdo a un muestreo sistemático en zig-zag, tomadas de los 30 primeros centímetros del suelo con una azada. La muestra fue homogenizada y tamizada a través de un tamiz de 4mm de luz de poro para eliminar las piedras y raíces. Suelo Localización Gestión de la parcela M10.43 Mataró Integrada M10.41 Amposta Ecológica M10.16 Pontons Ecológica M10.55 Alcanar Ecológica M10.45 Mataró Integrada M10.56 Alcanar Ecológica 20 Tabla 2. Características fisicoquímicas de los suelos estudiados. (Giné et al., 2013) Suelos Variable M10.43 M10.41 M10.55 M10.16 M10.45 M10.56 Arena (%) 75 33 68 50 67 53 Limo (%) 15 38 0 30 14 29 Arcilla (%) 10 29 32 20 19 18 Textura (USDA) Franco arenoso Franco arcilloso Franco arcillo limoso Franco Franco arenoso Franco arenoso pH (1:2.5 en agua) 8.13 8.17 8.10 8.25 7.77 8.32 Materia orgánica (w/w) 1.51 4.38 2.50 1.20 2.50 4.29 Conductividad eléctrica (µS/cm) (1:5) 155.60 516.00 1069.00 300.00 332.00 415.00 B (ppm) 2.82 5.33 1.12 2.62 0.75 1.21 Cambiable Ca (meq 100 g-1) 7.18 14.88 18.16 14.15 9.98 15.89 Disponible Ca (meq 100 g-1) 8.14 14.70 18.99 15.74 10.74 16.96 CaCO3 (%) 1.00 4.00 4.10 6.00 3.80 5.10 Capacidad intercambio catiónico (meq 100 g-1) 9.12 14.06 25.70 26.84 12.22 22.89 Cu (ppm) 28.31 2.50 2.50 2.50 28.77 2.50 Disponible P (ppm) 57.94 247.47 75.79 118.25 86.92 80.19 Fe (ppm) 239.07 5.00 5.00 5.00 79.72 5.00 Cambiable Mg (meq 100 g-1) 0.91 4.80 2.97 1.37 1.41 2.21 Disponible Mg (meq 100 g-1) 1.06 4.43 3.66 1.43 1.58 2.72 Mn (ppm) 92.23 92.44 2.50 55.54 54.26 2.50 N (ppm) 629.80 2388.70 1497.70 522.90 1824.90 2209.80 Cambiable K (meq 100 g-1) 0.15 1.47 0.67 0.59 0.35 0.62 Disponible K (meq 100 g-1) 0.18 1.67 0.69 0.79 0.43 1.05 C/N 13.87 10.64 9.68 13.36 7.94 11.26 Cambiable Na (meq 100 g-1) 0.34 0.57 0.54 0.46 0.36 0.37 Disponible Na (meq 100 g-1) 0.36 1.85 3.17 0.38 0.54 0.62 Zn (ppm) 24.63 7.19 2.5 2.64 24.52 2.50 Ca + Mg/K 53.93 13.39 31.54 26.31 32.54 29.20 P/N 0.09 0.10 0.05 0.23 0.05 0.04 Fluoresceína diacetato de hidrólisis (µg fluoresceína h-1 x g soil) 2.79 4.44 0.95 2.85 3.58 3.86 b-glucosaminidasa (µmols pnitrophenol h-1 x g soil) 0.20 0.30 0.10 0.11 0.33 0.42 Ureasa (µmols N–NH4 h-1 x g soil) 0.57 2.24 0.87 0.57 1.21 1.34 Proteasa (µg tyrosine h-1 x g soil) 8.89 5.42 12.42 5.02 9.49 8.79 Del total de la muestra de suelo se esterilizaron 20 L en autoclave a 121ºC durante una 1 hora y este proceso se repitió 24h después. El resto de la muestra se conservó en cámara frigorífica a 4ºC hasta el inicio del ensayo. El suelo esterilizado se mezcló con arena esterilizada, siguiendo el mismo procedimiento explicado anteriormente, en proporción volumétrica 1:1 para evitar su compactación en las macetas y favorecer el desarrollo de la planta. La misma operación se realizó con la muestra de suelo sin esterilizar. La mezcla se llevó a cabo con una hormigonera. Primero se mezclaron los suelos esterilizados y seguidamente los no estériles con la finalidad de reducir las Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 21 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech posibles contaminaciones entre los suelos. Después de cada mezcla se limpiaba la hormigonera con agua y después de secarla se limpiaba el interior con alcohol de 70o. Inóculo El inóculo consistió en J2 de Meloidogyne incognita procedente de la colección de poblaciones que mantiene el grupo de Nematologia de la UPC en tomate. Para obtenerlo, se extrajeron los huevos de las raíces de tomate por el procedimiento Hussey y Barker (1973), y se dispusieron en bandejas de Baermann (Whitehead y Hemming, 1965) durante una semana a 27 ± 2 ° C. Al final del periodo, la suspensión se filtró por un tamiz de 250 µm de obertura de malla para concentrarlos y traspasarlos a un vial que se mantuvo a 9 oC hasta su utilización. Caracterización del potencial supresor del suelo a Meloidogyne Se extrajeron los nematodos de cada una de las mezclas suelo: arena a partir de dos muestras de 250 cm3 el método de centrifugación flotación (Jenkins, 1964) para determinar la densidad de nematodos al inicio del experimento. A continuación, plantas de tomate cv Durinta (susceptible al nematodo) con 4 hojas bien desarrolladas se trasplantaron individualmente a macetas de 3 L de capacidad que contenían las mezclas de suelo. Seguidamente, el suelo de cada maceta se inoculó con la dosis necesaria para conseguir un total de 3000 J2 por maceta, es decir, 1 J2 / 1 cm3 de suelo. El inóculo se añadió en dos orificios opuestos de 3 cm de profundidad y a 2 cm del tallo. Cada combinación de suelo esterilizado o no esterilizado se repitió doce veces, es decir, un total de 144 macetas que se dispusieron en bandejas de cultivo en el invernadero de vidrio en Agròpolis, desde el 15 de mayo al 7 de julio de 2015, tiempo suficiente para que el nematodo completase una generación. Las plantas se regaron según las necesidades del cultivo mediante sistema de goteo y se fertilizaron con un abono de liberación lenta (15N + 10P + 12K + 2MgO + microelementos). La temperatura y el contenido hídrico del suelo se registraron a 8 cm de profundidad a intervalos de una hora. 22 Al finalizar el experimento se retiraron las plantas de las macetas. El suelo de cada maceta se homogenizó y se tamizó a través de un tamiz de abertura 4 mm para separar las raíces del suelo. Los juveniles se extrajeron de una sub-muestra de 500 cm3 de suelo mediante bandejas de Baermann (Whitehead y Hemming, 1965), tal y como se ha explicado anteriormente. Seguidamente, se limpiaron las raíces con agua para eliminar los restos de suelo, se eliminó el exceso de humedad con papel de filtro, se determinó el índice de agallas según la escala de 0 a 10 de Zeck (1971), donde 0 indica que la raíz no tiene ninguna agalla, y 10 que las raíces y la planta están muertas, seguidamente se cortaron y pesaron las raíces. A continuación, se cogieron 3 o 4 masas de huevos de cada planta por suelo y tratamiento de la mezcla, y se colocaron inmediatamente en un vidrio de reloj con agua destilada esterilizada. El exceso de matriz gelatinosa que envuelve los huevos se eliminó con unas pinzas con el fin de eliminar los posibles colonizadores presentes en la superficie de la misma. Las masas de huevos se colocaron en un tubo Eppendorf al que se le añadió 0,1 mL de agua destilada estéril. Los huevos se dispersaron de la masa gelatinosa utilizando un embolo estéril. Posteriormente se añadió 0,9 mL de agua destilada estéril. La suspensión se homogeneizó con una pipeta en cámara de flujo laminar, y alícuotas de 0,33 mL de la suspensión de huevos se dispensaron y extendieron en cada una de tres placas de Petri de 9 cm de diámetro que contenían medio de crecimiento restrictivo Figura 2: Mesas de cultivo donde se observan las plantas de tomates. Agrópolis 2015. Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 23 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech (estreptomicina, 50 mg L-1; cloranfenicol , 50 mg L-1; clortetraciclina, 50 mg L-1; Rosa de Bengala, 50 mg L-1; tritón, 1 mL-1, y 1% de agar) (López-Llorca y Duncan, 1986). Las placas se incubaron a 25 ºC ± 0,5 ºC. El número de huevos parasitados se contabilizó a las 24, 48 y 72 horas utilizando un microscopio de disección y una placa de Petri con una matriz cuadrada dibujada para facilitar el recuento. Se calculó el porcentaje de parasitismo a partir del número de huevos parasitados por placa referido al número total de huevos por placa. Se consideró que el huevo estaba parasitado cuando las hifas crecían desde el interior. Para estimar la reproducción del nematodo se extrajeron los huevos de las raíces siguiendo el procedimiento de maceración de Hussey y Barker (1973) y se contabilizaron al microscopio óptico. Se calculó la tasa de multiplicación del nematodo a partir del número de huevos no parasitados por planta respecto la dosis de inóculo inicial utilizada en el ensayo (Sorribas et al., 2003; Giné et al., 2016). Figura 3: a) Huevos parasitado por Pochonia chlamydosporia. B) Placa de evaluación de parasitismo de huevos de Meloidogyne spp. 24 Tratamiento estadístico El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo mediante el paquete estadístico SAS V9.2. Los datos de peso de raíz, índice de agallas, número de huevos por planta, número de nematodos por planta y tasa de multiplicación se normalizaron, cuando fue necesario, mediante la transformación raíz cuadrada (x+0,5) y se contrastaron entre mezcla de suelo esterilizada y no esterilizada para cada suelo mediante la prueba t de Student. Se consideró que un suelo tenía potencial supresor de Meloidogyne incognita, la especie utilizada en el experimento, cuando la severidad de la enfermedad y/o la densidad de nematodos al final del experimento era menor en la mezcla de suelo no estéril que en mezcla estéril. Caracterización del potencial antagónico de suelos agrícolas frente Meloidogyne spp. 31 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona UPC - BarcelonaTech Giné, A., López‐Gómez, M., Vela, M. D., Ornat, C., Talavera, M., Verdejo‐Lucas, S., & Sorribas, F. J. (2014). Thermal requirements and population dynamics of root‐knot nematodes on cucumber and yield losses under protected cultivation. Plant pathology, 63(6), 1446-1453. Hornby, D. (1983). Suppressive soils. Annual review of phytopathology, 21(1), 65-85.. Hunt, D. J., & Handoo, Z. A. (2009). Taxonomy, identification and principal species. Root-knot nematodes, 1, 55-88. Hussey, R. S., & Barker, K. R. (1973). 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