Determinación del contenido del triptófano de lana mediante hidrólisis sulfúrica breve.

Determinación del contenido de triptófano de la lana mediante hidrólisis sulfúrica breve'') Por Prof. José Cegarra Sánchez Dr. Joaquín Gacén Guillén Instituto de Investigación Textil y de Cooperación Industrial Escuela Técnica Superior Ingenieros Industriales Tarrasa (España) 1. Introducción Se han realizado bastantes trabajos con el objeto dc poii:r a punto técnicas que permitan dvtzrminar el contenido de triptófano de las protiínas. cspccialmentc dc la lana. Casi todas las técnicas tienen en común la necesidad dc hidrolizar la proteína y el empleo dc un aldehído que al reaccionar con el triptófano da lugar a un compuesto coloreado. Los diferentes métodos difieren entre sí en lo que se refiere al medio hidrolizante, duración de la hidrólisis, necesidad o no de acelerar el desarrollo de la reacción con nitrito sódico, resultados obtenidos y reproducibilidad de los misn~os. Respecto al medio hidrolizante, lógicamente debería ser alcalino, habida cuenta de la inestabilidad del triptófano en medio ácido. No obstante, actualmente la hidrólisis alcalina parece desechada debido a que en estas condiciones se presentan interferencias (1). Así pues, es normal el empleo de ácidos como agentes hidrolizantes. El método de Graham y Statham (2) está basado en el empleo de ácido sulfúrico como medio hidrolizante, mientras que en los de Mazingue, Decroix y Van Overbeke (3) por una parte y Miró (4) por otra, se hace uso de ácido clorhídrico concentrado. En lo que se refiere a los aldehídos utilizados para producir una coloración por reacción con el triptófano, los más empleados han sido la vainillina y el p-dimetilaminobenzaldehído (7, 8 y 9). El primero tiene el inconveniente de que en el caso de lanas alteradas pueden presentarse coloraciones secundarias, por lo que la mayor parte de los trabajos se han centrado en el uso del p-dimetilan~inobenzaldehído. Spies y Chambers (l), Graham y Statham (2) y Mazingue y col., en su método simplificado, emplean nitrito sódico para acelerar la reacción coloreada. La duración de la hidrólisis según los procedimientos de Graham y Statham (2) y de Mazingue y col. (3) es de 7 días, según el método modificado de estos ú1tinios 4 días y según el método de Miró 2 horas. Los resultados expresados en tanto por ciento de triptófano son los siguientes: Miró 0,57 yc (4), Mazingue y col. 0,53 0/, (3), Robson y Corfiel 0,95 yc, Siml monds 2,l 0/,, Block y Boiling 1,5 0/, (5), Traill 0,7 (6) y Graham y Statham 038 0/, (2). Desde el punto de vista de la reproducibilidad, podemos decir que los resultados obtenidos por el método de Miró son reproducibles, hemos venido aplicándolo y nuestros resultados concuerdan totalmente con los que indica en su trabajo. (*) Este articulo ha sido publlcadd en dournal of The Soclety gf Dyers and Colourists.. - 10 - En alguna ocasión, hemos hecho uso también del de Graham y Stathan~ (13), pero la reproducibilidad hallada no ha sido buena. Resulta interesante que la hidrolisis clorhídrica, ya sea lenta (Mazingue y Col.), ya sea rápida (Miró), conduce a resultados bastante bajos (OS3 yc) y (057 01,), en tanto que la hidrolisis sulfúrica da resultados bastante más elevados (del orden del 1 7,. Grahan y Statham). Esta obscrvación nos condujo a estudiar un método de determinación del contenido triptófano de la lana empleando como agente hidrolizante el ácido sulfúrico y haciendo uso de una temperatura superior a la ambiente, con el fin de acortar el tiempo necesario para disolver la lana, lo que a la vez supondría una disminución del tiempo requerido para la determinación del contenido de triptófano. Como quiera que tanto la hidrólisis clorhídrica breve como la hidrólisis clorhídrica prolongada, dan contenidos de triptófano más bajos que la hidrólisis sulfúrica prolongada, pensamos que aquellos resultados podrían ser también más bajos que en el caso de la hidrólisis sulfúrica breve. Si esta suposición se confirmase y los resultados obtenidos presentasen una buena reproducibilidad, supusimos que el desarrollo de un método de determinación del contenido de triptófano de la lana haciendo uso de una li~drólisis breve con ácido sulfúrico podría suponer una contribución al estudio dcl contenido del triptófano de la lana. 2. Parte experimental 2.1. Productos y equipo 2.1 1. Productos Los productos utilizados han sido: Triptófano, Schuchardt p-Dimetilaminobenzaldehído, para análisis, Schuchardt Acido sulfúrico, para análisis. 2.12. Materia Lana Cabo de 21p de finura, en floca, lavada a temperatura ambiente con éter, alcohol, agua, alcohol y éter y secada a teniperatura ambiente. Tejido de lana no operado industrialmente, desprovisto de materias extrañas mediante extracción en aparato soxhlet con cloruro de metileno y lavado posterior con un detergente no iónico 2.13. Soluciones El p-dimetilaminobenzaldehído se ha preparado disolviendo 5 gr del mismo en ácido sulfúrico al 10 7' hasta un volumen total de 100 ml. La solución de triptófano se ha preparado disolviendo 600 mg de este aminoácido en ácido sulfúrico 0,03 N hasta un volunien total de 1.000 nil. Se ha conservado en una botella color topacio y al abrigo de la luz. Solución de nitrito sódico 0,01 M. Solución de ácido sulfúrico 18 N. 2.14. Aparatos Ultratermostato COLORA con una ~recisión de it O,l°C. Espectrofotómetro BECKMAN DU. 2.2. Técnica de Trabajo El esquema de los diferentes aparatados estudiados es el siguiente: 2.21. Influencia de la temperatura y concentración del ácido sulfúrico en el tiempo de disolución de la lana. 2.22. Influencia de la cantidad de nitrito sódico y del tiempo de desarrollo en el desarrollo de la colaboración. 2.24. Influencia del tiempo en el desarrollo de la coloración. 2.25. Influencia de la temperatura en el desarrollo de la coloración. 2.26. Curva de calibración. 2.27. Resumen del método y valores hallados en diferentes lanas. 2.21. influencia de la temperatura y de la concentración de ácido sulfúrico en el tiempo de disolución de la luna. Se determinó el tiempo de disolución de 0,06 g de la lana Cabo en ácido sulfúrico de diferentes concentraciones a la temperatura de 70°C, así como en ácido sulfúrico 18 N a varias temperaturas. Los resultados se expresan en la Tablas 1 y 11. TABLA 1 Concentración de ácido Tiempo aproximado de disolución sulfúrico a 70° (minutos) TABLA 11 Temperatura Tiempo aproximado de disolución O C en ácido sulfúrico 18 N (minutos) A la vista de estos datos se adoptaron en principio las siguientes condiciones de hidrólisis: concentración de ácido sulfúrico, 18 N, temperatura, 70°C, y tiempo, 2 horas (con este tiempo la reacción podrá realizarse en fase homogénea). En los ensayos con triptófano se procedió del siguiente modo: En un matraz aforado de 50 m1 de capacidad se introdujeron por este orden, 1 m1 de la solución de triptófano, 2 m1 de ácido sulfúrico 18 N, se agitó el contenido del matraz. se añadió 1 m1 de la solución de p-dimetilaminobenzaldehído, se uniformó el conjunto y finalmente se añadieron 11 m1 de ácido sulfúrico 18 N. Se taparon los matraces, se colocaron en un soporte y se introdujeron en un termostato previamente regulado a 70°C, manteniendo esta temperatura durante 2 horas. Pasado este tiempo, se enrasaron los matraces con agua destilada. Se midieron las densidades ópticas en el espectrofotómetro en cubeta de 1 cm a la longitud de onda de 605 mp. Las densidades ópticas obtenidas fueron muy bajas, por lo que se creyó necesario añadir nitrito sódico. Primeramente se añadió 0,1 m1 de nitrito sódico 0,01 M con lo que se consiguió un aumento muy grande de la densidad óptica; no obstante, se observó que posteriores adiciones de nitrito producían aumentos de la densidad óptica y que ésta aumentaba, al hacerlo, el tiempo de desarrollo. Ello condujo al estudio de la cantidad de nitrito que da lugar a una coloración máxima y de la densidad óptica en función del tiempo. 2.22. Influencia de la cantidad de nitrito y del tiempo de desarrollo en el desarrollo de la coloración. Se procedió a la adición de OS, 1, 1,5 y 2 m1 de nitrito sódico 0,01 M y se determinó la densidad óptica a diferentes tiempos. Como no se llegó a un equilibrio de la densidad óptica, se hizo otro ensayo con 2, 2,5, 3 y 3,5 m1 de nitrito. Los resultados están representados gráficamente en las figuras 1 y 2. Cada punto co8 6 7 o ¿a S a 72 LV as % hours Fig. 1. Evolución de la densidad óptica en función del tiempo y de la cantidad de nitrato añadida. I 8 I6 7d 32 40 48 56 64 n 60 a9 % /o¿ hoors Fig. 2. Evolución de la densidad óptica en función del tiempo y de la cantidad de nitrato añadida. rresponde el valor medio de cuatro determinaciones. De la figura 2 se deduce que añadiendo 2 m1 de nitrito se consigue un máximo de densidad óptica y que ésta alcanza el equilibrio con un tiempo de desarrollo de 69 horas. A las 3 h 30 minutos y 96 horas de desarrollo, se determinaron los espectros de absorción para saber si se presenta un desplazamiento del máximo de absorción, provocado por las diferentes adiciones de tiitrito, y a que longitud de triptófano mucho más diluida, 100 mg/l en lugar de 600 mg/l. La posición del máximo no varió y éste se presentó a 585 mp. 2.23. Influencia de la temperatura en la velocidd de desurrollo de la coloración. Como quiera que a temperatura ambiente el tiempo necesario para alcanzar un valor constante de la densidad óptica es muy elevado, se procedió al estudio de la influencia de la temperatura en la velocidad de desarrollo. Los ensayos se hicieron a 40, 50, 60 y 70°C y los resultados se expresan en la figura 3. Cada 0,3504 , , , , , , , , , I73L.5678 10 70 Fig. 3. Influencia de la temperatura en el desarrollo de la coloración. punto de las gráficas representa el valor medio de cuatro determinaciones. A 70°C, el desarrollo alcanza el máximo al cabo de 1 hora, pero, teniendo en cuenta la naturaleza de la curva, se prefirió adoptar la temperatura de 60°C y un tiempo de desarrollo de 2 horas. 2.24. Influencia del tiempo en el desarrollo de la coloración. Fijados la cantidad de nitrito a añadir, 2 ml, y el tiempo y temperatura de desarrollo, 2 horas y 60°C respectivamente, se estudió la influencia del tiempo de contacto con ácido sulfúrico 18 N a 70°C, de la solución de triptófano por una parte y de lana por otra, en la densidad óptica. Los resultados se indican en las Tablas 111, IV y en la figura 4. 1 P 3 Fig. 4. Densidad óptica en función del tiempo de hidrólisis. TABLA 111 Densidades ópticas en función del tiempo de contacto con ácido sulfúrico 18 N a 70°C (Triptófano) Tiempo 30' Ih Ih30' 2h 2h30' 3h 4h TABLA IV Densidades ópticas en función del tiempo de contacto con ácido sulfúrico 18 N a 70°C (referidas a 0,06 g de lana seca) - Tiempo 30' Ih Ih30' 2h 2h30' 3h 4h En los ensayos con lana, se introdujeron 0,06 g de ésta (el peso de la muestra seca se determinó por comparación, poniendo otra muestra, pesada en el mismo momento, en una estufa a 105°C y permaneciendo en ésta hasta un peso constante) en un matraz aforado de 50 m1 de capaicdad, se añadieron 2 m1 de ácido sulfúrico 18 N, 1 m1 de p-dimetil-aminobenzaldehído (uniformización), 11 m1 de ácido sulfúrico 18 N (nueva uniformización) y se taparon los matraces. Los matraces, colocados en un soporte, se introdujeron en el termostato regulado a 70°C durante un tiempo determinado y se agitaron cada 15 minutos. Una vez transcurrido el tiempo, se enfriaron, se añadieron 2 m1 de nitrito sódico 0,01 M, se enrasaron con agua destilada y se introdujeron en el baño termostático previamente calentado y regulado a 60°C. Transcurridas las dos horas que dura el desarrollo, se filtró e1 contenido de los matraces en un embudo de placa filtrante del núm. 3, se dejó enfriar y se procedió a la lectura de la densidad óptica a una longitud de onda de 585 mp. La baja densidad óptica correspondiente al tiempo de media hora, se debe a que la lana no se disolvió completamente. Como se puede observar, la evolución de la densidad óptica en el caso del triptófano solución y en el caso de la lana es muy semejante. Al no presentarse un máximo para un tiempo determinado, se consideró bueno el tiempo de hidrólisis provisionalmente adoptado, ya que, si para un tiempo de una hora la densidad óptica es más elevada, la lana no se había disuelto totalmente, habiéndose observado, por otra parte, que el tiempo de disolución puede variar de unas lanas a otras. Esto último nos confirmó en la idea de mantener el tiempo inicialmente adoptado. 2.25. Influencia de h temperatura en el desarrollo de la coloración Se estudió también la influencia de la temperatura del tratamiento con ácido sulfúrico 18 N en el desarrollo de la coloración. Los ensayos se hicieron con solución de triptófano y con lana. Los resultados obtenidos se indican en las Tablas V y VI y en la figura 5. Como puede observarse, las densidades ópticas disminuyen de forma sensiblemente lineal al aumentar la temperatura. La evolución de la densidad óptica es bastante similar en el caso del triptófano solución y en el -0triptófano -0lana a,?5017 50 60 70 40 &T ten1pmture Fig. 5. Densidad óptica en función de la temperatura de hidrólisis. caso de la lana. Al no presentarse un máximo de densidad óptica a una temperatura determinada, se consideró buena la temperatura de hidrólisis provisionalmente adoptada. TABLA V Densidades ópticas en función de la temperatura para tiempos de 2 horas (triptófano) Tempe80°C ratura 50°C 60°C 70°C 80°C TABLA VI Densidades ópticas en función de la temperatura para tiempos de 2 horas (referidas a 0,06 g de lana cabo seca) Temperatura 60°C 6S°C 70° C 7S°C 80°C 2.26. Curva de calibración A partir de una solución de triptófano de una concentración de 600 mg/l se prepararon soluciones de 450, 225 y 100 mg/l. Los ensayos se hicieron por triplicado. Los resultados medios se representan gráficamente en la fig. 6. Un segundo ensayo dio resultados coincidentes. l Fig. 5. Curva de calibracióii. 2.27. Resumen del método y valores hallados en diferentes lanas En el apartado 2.24 se ha detallado el método operatorio, aquí sólo indicaremos las condiciones de hidrólisis y desarrollo: Medio hidrolizante: ácido sulfúrico 18 N. Temperatura de hidrólisis: 70°C. 4.14. Acción de la exposición en Fade-Ometer Muestras de un tejido de lana fueron expuestas en un Fade-Ometer durante varios tiempos. Los tiempos de exposición fueron 10, 20, 30, 40, 60, 80 y 100 horas. Se eligió este tipo de exposición por la riqueza en radiaciones ultravioleta de las radiaciones a que se somete una muestra en el Fade-Ometer. Los resultados se expresan en la tabla XI y en la figura 10. Agradecimientos Los autores agradecen al Patronato de la Esculea Técnica Superior de Ingenieros Industriales de Tarrasa la ayuda que ha hecho posible la ejecución del presente trabajo. También desean agradecer al Dr. Pedro Miró, del Patronato de la Cierva (C.S.I.C.), sus valiosos comentarios y a la señorita Ana M.a Gil su ayuda en el trabajo experimental. BIBLIOGRAFIA Spies y Chambers. - Anal. Chem., 20, 30 (1948); 21, 1249 (1949). Graham y Stathum. - Tex. Res. Journal, 30, 136 (1960). Mazingue, Decroix y Van Oberbéke. - Bull. I.T.F., 47, 37 (1966). Miró. - Investigación e Información Textil, 4, 25 (1961). Block y Bolling. - The aminoacid composition of proteins and foods, Charles C. Thomas Spring-field, Ed. Illinois, U.S.A., 1951, 489. Trail. - J. Soc. Dyers and Colourists 7, 257 (1951). Kraus. - J. Biol. Chem., 63, 157 (1925). Schirlé. - Bull. I.T.F., 41, 21 (1953); Ibid, 42, 43 (1953). May y Rose. - J. Biol. Chem., 54, 213 (1922). Graham y Stathum. - Tex. Res. Journal, 32, 908 (1962). Miró. - Investigación e Información Textil, 7, 223 (1964). Cegurra, Ribé y Gacén. - I.W.T.O. Tech. Com. París, 1962.