Asociación de la apolipoproteína J a las lipoproteínas

1 TESIS DOCTORAL ASOCIACIÓN DE LA APOLIPOPROTEÍNA J A LAS LIPOPROTEÍNAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Universidad Autonóma de Barcelona María Martínez Bujidos 2015 2 3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Universidad Autonóma de Barcelona ASOCIACIÓN DE LA APOLIPOPROTEÍNA J A LAS LIPOPROTEÍNAS Memoria presentada por la licenciada en Química María Martínez Bujidos para optar al grado de Doctora por la Universidad Autónoma de Barcelona en el programa de doctorado en Bioquímica y Biología Molecular. La presente tesis ha sido realizada en el grupo de Bioquímica Cardiovascular del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, dirigida por el Dr. José Luis Sánchez-Quesada y el Dr. Jordi Ordóñez Llanos. Los directores de la tesis: Dr. José Luis Sánchez Quesada Dr. Jordi Ordóñez Llanos Grupo de Bioquímica Cardiovascular Grupo de Bioquímica Cardiovascular Institut de Recerca Sant Pau Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Universidad Autónoma de Barcelona La doctoranda: María Martínez Bujidos Grupo de Bioquímica Cardiovascular Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Barcelona, 2015 4 5 AGRADECIMIENTOS En primer lugar a mi director, el Dr. José Luis Sánchez Quesada, por haberme guiado en todo el trabajo de esta tesis, por haberme transmitido parte de sus conocimientos sobre el tema y por su optimismo ante las dificultades. Al Dr. Jordi Ordóñez Llanos, codirector de esta tesis, por aceptarme en su grupo, por las aportaciones al trabajo realizado y porque sin su apoyo y confianza esta tesis no habría sido posible. A mis dos compis de grupo, las brujis Montse Pérez y Anna Rull, porque sin ellas nada hubiese sido lo mismo… Anna Rull no puedo tener hacia ti más que buenas palabras por tu ayuda constante, tus consejos, tu optimismo, tu dedicación y por todos los momentos que hemos pasado juntas… espero que tengas mucha suerte a partir de ahora porque tú lo vales! Y a Montse Pérez porque siempre está dispuesta a ayudar, por tus consejos y por los grandes momentos de risas. Se te ha echado de menos en esta última recta de tesis pero espero que en tu nueva feina te vaya genial! A todos los autores de los artículos por sus aportaciones para que los artículos salieran adelante. A todos mis compañeros del prefabricado de lípidos, que en algún u otro momento me han ayudado. Ha sido un placer teneros como compañeros. A toda la gente del Servicio de Bioquímica del Hospital de Sant Pau que me ayudado y enseñado tanto estos años y en especial a mis compañeros resis, que han sido el mayor apoyo que se puede tener durante la residencia, y que han vivido conmigo la evolución de esta tesis. 6 A mis padres porque sin ellos no habría llegado hasta aquí, por su apoyo incondicional cada día de mi vida y enseñarme que con esfuerzo y trabajo se puede conseguir cualquier meta. Y a Jorge por estar siempre ahí, incluso cuando ha habido kilómetros de distancia. INDICE 7 ÍNDICE ÍNDICE 8 ÍNDICE 9 ABREVIATURAS ....................................................................................................... 13 RESUMEN .................................................................................................................. 17 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 21 1ARTERIOSCLEROSIS ............. …………………………………………………………23 1. 1 Origen y evolución de la placa de ateroma .................................................... 23 2ARTERIOSCLEROSIS Y LIPOPROTEINAS PLASMÁTICAS ................................. 26 2.1 Lipoproteínas plasmáticas............................................................................... 26 2.2 Metabolismo de las lipoproteinas .................................................................... 27 2.3 Transporte reverso colesterol .......................................................................... 29 3IMPLICACIÓN DE LA LDL EN LA ARTERIOSCLEROSIS ...................................... 31 3.1 Características generales de la LDL ............................................................... 31 3.2 Acumulación intracelular de colesterol ............................................................ 32 3.2.1 Receptor de LDL ................................................................................... 32 3.2.2 Receptores scavenger (SR) .................................................................. 34 3.3 Papel de la LDL en la arteriosclerosis ............................................................. 35 3.4 Modificaciones de la LDL ................................................................................ 36 3.4.1 Oxidación ................................................................................................ 36 3.4.2 Agregación y/o fusión .............................................................................. 38 3.4.2.1 Lipólisis ......................................................................................... 39 3.4.2.2 Proteólisis ...................................................................................... 41 3.4.3 Modificación enzimática ........................................................................... 42 3.4.4 Glicosilación ............................................................................................. 43 3.5 Propiedades aterogénicas de las LDL modificadas ........................................... 43 4LDL ELECTRONEGATIVA ..................................................................................... 45 4.1 Propiedades de la LDL(-) .................................................................................. 45 4.2 Mecanismos inflamatorios de la LDL(-) ............................................................. 47 4.3 Agregación de la LDL(-) .................................................................................... 48 ABREVIATURAS 16 nagLDL(-) LDL(-) no agregada NASH estetohepatitis no alcoholica nCLU forma nuclear de clusterina NEFAs ácidos grasos no esterificados NHS N-hidroxisuccinamida oxLDL LDL oxidada PAF-AH acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas PC fosfatidilcolina PCR proteína C reactiva PG proteinoglicanos PLC fosfolipasa de tipo C PON paraoxonasa Qm quilomicrones rLDL receptor de LDL SDS-PAGE geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio SM esfingomielina SMasa esfingomielinasa sPLA2 fosfolipasa A2 secretora SR receptor Stavanger sSMasa esfingomielinasa secretora TEM microscopía electrónica de transmisión TEMED tetrametiletilendiamida TG trigliceridos VEGF factores vasculares de crecimiento endoltelial VLDL lipoproteínas de muy baja densidad RESUMEN 17 RESUMEN RESUMEN 18 RESUMEN 19 La apolipoproteina J (apoJ) o clusterina (CLU) es una chaperona extracelular que forma parte del sistema de control que actúa para estabilizar las proteínas agregadas. Hay evidencias que muestran la existencia de una relación entre la apoJ y el desarrollo de arteriosclerosis ya que se ha visto que la expresión y la deposición de apoJ están aumentadas en zonas de lesión arteriosclerótica mientras que está ausente en la pared arterial sana. Una porción importante de la apoJ se asocia a las lipoproteínas en plasma, siendo más abundante en la HDL pero también hay una pequeña parte unida a la LDL y VLDL. La primera parte de la presente tesis se centra en el papel de la apoJ sobre las propiedades aterogénicas de la LDL. Hemos visto que la apoJ se une en la circulación plasmática preferentemente a las partículas de LDL agregadas. Experimentos llevados a cabo con LDL deplecionada de apoJ muestran que es más susceptible a agregarse que la LDL total. Por otro lado, la adición de apoJ purificada previene la agregación de la LDL. Estos datos demuestran un papel protector de la apoJ en la inhibición de la agregación de la LDL, que es un proceso clave en el desarollo de la arterioesclerosis. La segunda parte analiza la distribución relativa de la apoJ entre las diferentes lipoproteínas y en forma libre. Nuestros datos muestran que un 20% de la apoJ circulante en plasma está asociado a las lipoproteínas y el 80% en forma libre. Clasificando a los pacientes por el perfil lipídico se observó que en los individuos hiperlipémicos presentan una concentración mayor de apoJ que los normolipémicos. Esto indica que la concentración de apoJ en suero es dependiente del perfil lipoproteico, y está asociada positivamente con la concentración de colesterol y triglicéridos. En pacientes normolipémicos un 30% de la apoJ está asociada a lipoproteínas, mientras que en pacientes hiperlipémicos el porcentaje disminuye a un 17% en hipercolesterolémicos y un 15% en hipertrigliceridémicos. RESUMEN 20 INTRODUCCIÓN 21 INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 22 INTRODUCCIÓN 23 1ARTERIOSCLEROSIS La arteriosclerosis es una patología inflamatoria caracterizada por un engrosamiento de la capa íntima de la pared arterial [1, 2]. Esto causa el estrechamiento progresivo de la luz vascular que puede evolucionar hasta la oclusión del vaso impidiendo el flujo sanguíneo por la arteria afectada. La lesión arteriosclerótica, o placa ateromatosa, está formada por diferentes tipos celulares, que incluyen principalmente células endoteliales, células musculares lisas, macrófagos y linfocitos, junto con tejido conjuntivo, restos necróticos, calcio y lípidos, principalmente colesterol oxidado y fosfolípidos degradados. La arteriosclerosis se da principalmente en las arterias de gran y medio tamaño y puede conducir a la isquemia del tejido. La manifestación clínica dependerá de la arteria afectada, infarto agudo de miocardio en el caso de arterias coronarias, accidente vascular cerebral en el caso de las arterias que irrigan el cerebro, etc. 1. 1 ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LA PLACA DE ATEROMA La formación de la placa de ateroma tiene lugar de forma progresiva. En este proceso se pueden distinguir varias etapas: inicio de la lesión, formación de la estría grasa, formación de la placa fibrosa (lesiones avanzadas) y trombosis (figura 1). El primer acontecimiento que tiene lugar en la arteriosclerosis es la acumulación del colesterol, principalmente proveniente de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), en la matriz subendotelial. Cuando existe un exceso de LDL circulante, aumenta el transporte y la retención de las mismas en los lugares dónde la permeabilidad endotelial es mayor. Las LDL difunden a través del endotelio y quedan retenidas debido a la interacción entre la molécula de la apolipoproteína B (apoB) de las LDL y los proteoglicanos de la matriz subendotelial [3]. La acumulación de partículas de LDL INTRODUCCIÓN 24 estimula en el endotelio la producción de moléculas proinflamatorias; esto ocasiona la llegada de monocitos y linfocitos a la pared arterial, que mediante sus receptores scavenger reconocen y captan las lipoproteínas modificadas y otras partículas. La captación indiscriminada de lípidos por parte de los macrófagos produce su acumulación en el interior de la célula transformándose en lo que se conoce como células espumosas. (Figura 1a). Figura 1: Progresión de la lesión arteriosclerótica. a) inicio de la lesion b) formación de la estria grasa c) lesión avanzada o placa fibrosa d) ruptura de la placa/trombosis [2]. El siguiente paso en el desarrollo de la arteriosclerosis es la formación de la placa fibrosa que se caracteriza por un aumento de la masa lipídica extracelular, principalmente colesterol y ésteres de colesterol, la proliferación de células musculares lisas (CMLs) y la formación de una cubierta proteica de matriz extracelular producida por las CMLs [4]. La placa fibrosa se inicia con la migración de las CMLs desde la INTRODUCCIÓN 25 capa media hacia la matriz subendotelial. Allí las células proliferan y captan las lipoproteínas modificadas contribuyendo así, junto con las células espumosas derivadas de los macrófagos, al engrosamiento del núcleo lipídico. Las CMLs secretan proteínas de la matriz extracelular, como colágeno y proteoglicanos, conduciendo al desarrollo de la placa fibrosa [5] (Figura 1b). La respuesta proliferativa de las CMLs y de las células inflamatorias hace que la estría grasa evolucione a una placa arteriosclerótica más compleja llevando la lesión a estadíos más avanzados que implican muerte celular, rotura de las placas, calcificación y procesos trombóticos. (Figura 1c). Las placas ateromatosas más avanzadas presentan un núcleo necrótico que consiste en un gran núcleo lipídico rodeado por una delgada cubierta fibrosa. La ruptura de la placa (Figura 1d) provoca trombosis y ocurre generalmente en sitios donde la cubierta fibrosa es más delgada. Este adelgazamiento de la cubierta es debido a la activación de los macrófagos, que liberan metaloproteinasas y otras enzimas proteolíticas. Estas enzimas provocan la degradación de la matriz y con ello la ruptura del endotelio, lo que puede provocar la formación del trombo y la oclusión de esta arteria. Las placas más complejas también pueden presentar depósitos de calcio lo que ocasiona un cambio en las características mecánicas del tejido arterial, contribuyendo a la inestabilidad de la placa y limitando la flexibilidad de los vasos sanguíneos. Los componentes internos de la placa y el factor tisular inician la cascada de la coagulación que provoca la adhesión de las plaquetas circulantes y que, a su vez, pueden producir trombosis por oclusión de la luz vascular [5]. El estrechamiento progresivo de la luz arterial puede acarrear síntomas isquémicos tales como infarto de miocardio o enfermedad cerebrovascular. INTRODUCCIÓN 32 La proteína principal de estas partículas, la apo B-100, es una de las proteínas monoméricas más grandes. Está situada rodeando la superficie de la lipoproteína y tiene una estructura pentapartita constituida por dominios con hélice α y hoja β [15]. 3.2 ACUMULACIÓN INTRACELULAR DE COLESTEROL 3.2.1 Receptor de LDL La función fisiológica de la LDL en el plasma es transportar el colesterol a los tejidos periféricos, proceso mediado por el receptor de lipoproteínas de baja densidad (rLDL) [16]. EL receptor de LDL (rLDL) es una proteína transmembrana de una única cadena peptídica con 839 aa 164 kD de peso molecular y que consta de 5 dominios (Figura 6): 1. Dominio de unión rico en cisteínas 2. Dominio de homología con el precursor del factor del crecimiento epidérmico (EGF) 3. Dominio rico en carbohidratos 4. Dominio transmembrana 5. Dominio intracitoplasmático. [17-19] Figura 6: Estructura del receptor de LDL Se sintetiza en el retículo endoplasmático [20] y tras ser sintetizado, es transportado al INTRODUCCIÓN 33 aparato de Golgi, donde se glicosila y pasa a la membrana. Allí se desplaza transversalmente hasta situarse en unas zonas denominadas “hoyos recubiertos” formados por la proteína clatrina, que sirve de anclaje. El rLDL reconoce específicamente la apoB-100 y la apoE. Las lipoproteínas que contienen varias copias de la apo E (VLDL, IDL y varias subclases de HDL) se unen al receptor con más afinidad que la LDL que sólo tiene una copia de apoB-100. El LDL reconoce la apoB de la LDL e internaliza la partícula. Una vez internalizada hay una degradación lisosomal de la LDL que da lugar a la hidrólisis de ésteres de colesterol y a la degradación de la apoB-100. En este proceso se generan aminoácidos, que son reutilizados para la síntesis de nuevas proteínas, y colesterol que es utilizado para la formación de membranas. Figura 7: Mecanismo del rLDL [21]. El aporte de colesterol proveniente de la LDL suprime la actividad del enzima 3hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa), que regula la síntesis del colesterol y activa el enzima colesterol aciltransferasa (ACAT) que reesterifica el colesterol. Este colesterol esterificado se almacena en el citoplasma INTRODUCCIÓN 34 [22]. Por otra parte se inhibe la transcripción del gen de rLDL, lo que permite a las células regular el número de rLDL para que haya el colesterol suficiente para las necesidades metabólicas [22]. Es fundamental el aclaramiento de la LDL a través del rLDL para mantener su concentración en plasma en unos niveles adecuados. Para que la interacción entre el rLDL y la LDL sea adecuada es importante que esta última no tenga su estructura alterada. El colesterol de LDL captado por las células a través del rLDL es no aterogénico porque éste regula negativamente la síntesis celular endógena de colesterol. [21]. 3.2.2 Receptores scavenger (SR) Comprenden un diverso grupo de proteínas diferentes estructuralmente. Fueron identificados por Brown y Goldstein que definieron su capacidad para unirse a LDLs modificadas, incluyendo la LDL acetilada y la LDL oxidada, además de un amplio número de ligandos que presentan la característica común de ser electronegativos. Sin embargo la carga negativa no es el único determinante de la unión de moléculas al receptor sino que se necesitan ciertos requerimientos estructurales para una unión efectiva. Clásicamente se han descrito tres tipos o clases de SR, los receptores tipo A, los tipo B y los C, pero también se han encontrados otros como los de clase E (LOX 1), los de clase F (SREC-I SREC-II), los de clase G (SR-PSOX), Clase D (CD 68). Están presentes en diferentes tejidos vasculares y tipos celulares que van desde macrófagos, a monocitos, plaquetas, células espumosas y células endoteliales. Además están presentes en tejido adiposo y estereoidogénico. INTRODUCCIÓN 35 Figura 8: SR implicados en la arteriosclerosis [23]. 3.3 PAPEL DE LA LDL EN LA ARTERIOSCLEROSIS La arteriosclerosis está caracterizada por la acumulación de colesterol en la pared arterial y se ha demostrado que el descenso de la concentración plasmática de colesterol reduce la aparición de eventos cardiovasculares [24]. El colesterol es transportado por la LDL principalmente, que contiene aproximadamente el 70% del colesterol circulante. El colesterol es el lípido mayoritario que se acumula en las placas de ateroma, además se han aislado lipoproteínas similares a la LDL en lesiones arterioscleróticas, lo que indica que la LDL es la lipoproteína más aterogénica. Esto se pone de manifiesto en el caso de la hipercolesterolemia familiar monogénica (HF) que cursa con concentraciones elevadas de LDL en plasma debido a una alteración en el receptor de la LDL, con el consecuente riesgo arteriosclerótico. La LDL nativa no presenta características aterogénicas pero en el microambiente del espacio subendotelial tienen lugar diversos procesos que modifican las propiedades biológicas de la LDL. Estos procesos incluyen la lipoperoxidación, la lipólisis, la proteólisis y la unión a componentes de la matriz extracelular. La modificación de la INTRODUCCIÓN 36 LDL en la pared arterial juega un papel clave en la iniciación y progresión de la arteriosclerosis, ya que las LDL modificadas tienen la capacidad de promover la acumulación subendotelial de colesterol y desencadenan la respuesta crónica inflamatoria característica de las lesiones ateromatosas [25]. Además, las LDL modificadas se unen más a los proteoglicanos de la matriz extracelular de la pared arterial y favorecen la retención subendotelial de lipoproteínas, que se considera el proceso inicial de la arteriosclerosis [26]. 3.4 MODIFICACIONES DE LA LDL 3.4.1 Oxidación La modificación más estudiada que causa la acumulación de colesterol es la modificación oxidativa que produce numerosas modificaciones químicas en las fracciones lipídicas y proteicas. Las propiedades aterogénicas de la LDL oxidada (oxLDL) se atribuyen a su capacidad para contribuir en la formación de células espumosas así como al reclutamiento de los monocitos circulantes a la intima arterial, induciendo la agregación plaquetaria y otros efectos pro-inflamatorios y protrombóticos [27]. Las bases moleculares de estos efectos son difíciles de establecer debido a la complejidad de la oxidación de la LDL, que envuelve un numero inmenso de modificaciones posibles de las fracciones lipídicas y proteicas. Esto es debido a la heterogeneidad de la LDL y sus productos de oxidación. Estos productos dependen de los oxidantes utilizados, la extensión de la oxidación la composición de la LDL y otros muchos factores. La reacción de oxidación es un proceso continuo, pero se pueden distinguir varias etapas (Figura 9). Primero la oxidación de la LDL ataca al doble enlace de los ácidos grasos insaturados y genera oxisteroles, lisofosfatidilcolina, hidroperóxidos, aldehidos y cetonas [28] y se genera la LDL mínimamente modificada (MM-LDL), que aún tiene afinidad por el rLDL. Cuando estos productos reaccionan con la apoB se modifican las INTRODUCCIÓN 37 propiedades de la LDL, eliminando la carga positiva de los residuos de lisina y arginina de la apoB. Esto provoca un incremento de la carga negativa de la partícula y por tanto aumenta el reconocimiento por los SR de los macrófagos. Así, estos receptores internalizan la oxLDL y esta es degradada. Figura 9: Diferencia entre la OxLDL y la minimamente modificada MM-LDL. [29]. Otro de los mecanismos responsables del aumento de la captación de las LDL oxidadas por macrófagos es su mayor tendencia a la agregación [30] ya que se observa un aumento de la captación por macrófagos después de la acción de agentes oxidantes como el cobre, radicales libres o hipoclorito que promueven la agregación de la LDL. En contrapartida, otros autores han descrito que la fusión de la LDL inducida por calor disminuye gradualmente tras la oxidación progresiva con varios agentes debido a la fragmentación de la apon [31]. Los aspectos relacionados con la aterogenicidad de los procesos de agregación y/o fusión de la LDL se comentan más extensamente en los siguientes apartados. INTRODUCCIÓN 38 En los mecanismos de oxidación hay que considerar que concurren factores adicionales que actúan paralelamente a la oxidación in vivo, como la fosfolipasa A2 asociada a lipoproteínas (Lp-PLA2, también conocida como acetilhidrolasa del factor activador de plaquetas, PAF-AH) que puede generar ácidos grasos libres (FFA), los cuales son agentes inductores de fusión de lipoproteínas [32]. 3.4.2 Agregación y/o fusión Modificaciones de la estructura de la superficie de la LDL pueden provocar una pérdida de su estabilidad que afectará a las interacciones entre las partículas y provocará su agregación y consiguiente fusión. La modificación extensiva de un solo componente de la superficie de la LDL es suficiente para provocar su agregación y/o fusión. La agregación de la LDL pone en contacto la superficie de diferentes partículas de LDL pero produce la fusión de estas partículas, por ello se puede considerar que la agregación no modifica el tamaño de las partículas individuales. Sin embargo, si esta modificación es suficientemente extensa la energía de estabilización provocará la fusión de las partículas, que es un proceso irreversible, a diferencia de la agregación que es reversible [30]. Figura 10: Agregación y fusión de la LDL [33]. INTRODUCCIÓN 39 La agregación de las lipoproteínas es importante en la aterogénesis por al menos dos razones. La primera es que la LDL agregada es un potente inductor de la formación de células espumosas, y la segunda que la agregación de las lipoproteínas en el espacio subendotelial incrementa la cantidad de lipoproteína retenida [34]. La desintegración de las lipoproteínas y liberación de los lípidos apolares del núcleo confluyen en la formación de gotas lipídicas o lipids droplets. El incremento de la captación de las partículas de LDL agregadas, fusionas y los lipid droplets por los macrófagos permite la formación de células espumosas e inicia la arteriosclerosis [33]. 3.4.2.1 Lipólisis Modificación de la LDL por esfingomielinasa Se conocen varios tipos de SMasa, aunque la relacionada con la agregación de la LDL es la SMasa secretora (sSMasa). Este enzima se hiperexpresa en la intima arterial lesionada y es secretado por macrófagos y células del músculo liso. La sSMasa es una enzima dependiente de zinc que hidroliza la esfingomielina (SM) generando fosfocolina y ceramida, es por tanto una fosfolipasa de tipo C (PLC). Tras la hidrólisis, la fosfocolina (polar) se libera de la superficie mientras que la ceramida, que es apolar, queda retenida en la LDL, por lo que hay un incremento de los lípidos apolares en la superficie de la partícula. El aumento de ceramida, a través de las interacciones hidrofóbicas de estas moléculas para protegerse del entorno polar, induce la agregación de la LDL, y estos agregados inducen la formación de células espumosas in vitro. Las LDLs agregadas que se han aislado de lesiones arterioscleróticas están enriquecidas en ceramida, mientras que las partículas no agregadas no [35]. Este dato sugiere que la ceramida y, por tanto, la SMasa, están directamente involucradas en la agregación y fusión de la LDL in vivo. INTRODUCCIÓN 40 Modificación de la LDL por la Fosfolipasa C (PLC) La PLC hidroliza la fosfatidilcolina (PC) para generar fosfocolina y diacilglicerol. La fosfocolina se libera a la superficie mientras que el diacilglicerol al ser apolar se redistribuye desde la superficie hasta el núcleo de la LDL lo que genera un desequilibrio hidrofóbico que promueve la agregación y fusión de la LDL. Es un proceso similar al de la lipólisis mediante SMasa, con la diferencia que, al ser la cantidad de PC mucho mayor que la de SM (70% de los fosfolípidos de la LDL vs 20%) el efecto de inducción de agregación es mucho más drástico. Se ha demostrado que la agregación y fusión provocadas por la PLC puede prevenirse por las apolipoproteínas intercambiables polares que tienen elevada afinidad por la superficie de la LDL [36], lo que corrobora la idea de que la fusión de la LDL después de la hidrólisis por PLC es debida a la exposición en la superficie de zonas hidrofóbicas. Sin embargo, no hay evidencias de que la PLC se exprese de forma aumentada en la lesión arteriosclerótica. No obstante, se ha detectado una actividad de tipo fosfolipasa C en una fracción minoritaria electronegativa de la LDL presente en plasma, lo que podría contribuir al aumento de las propiedades pro-aterogénicas de estas partículas [37]. Los aspectos relacionados con esta actividad de tipo PLC (PLC-like) asociada a la LDL electronegativa son comentados en mayor detalle más adelante. Modificación de la LDL por la Fosfolipasa A2 secretora (sPLA2) La sPLA2 se secreta a la circulación bajo condiciones inflamatorias, similares a las que se dan en la lesión arteriosclerótica, e hidroliza los fosfolípidos en la posición sn-2 liberando FFA insaturados y lisofosfolipidos. Una hiperexpresión de la sPLA2 puede contribuir a la aterogénesis induciendo la agregación de la LDL, fusión y retención por proteoglicanos. INTRODUCCIÓN 41 Modificación de la LDL por la Fosfolipasa A2 asociada a lipoproteínas (Lp-PLA2) La sPLA2 es diferente a la actividad Lp-PLA2 que se ha comentado en el apartado de oxidación de lipoproteínas. La Lp-PLA2 es un enzima asociado a lipoproteínas, principalmente a LDL y HDL. El contenido de Lp-PLA2 esta aumentado en las LDL que se consideran más aterogénicas, las LDLs pequeñas y densas y la LDL electronegativa. Esto sugiere que la Lp-PLA2 contribuye al aumento de las propiedades pro-aterogenicas de las LDL pequeñas y densas y las LDL electronegativas. Sin embargo, en este caso la acción aterogénica de la Lp-PLA2 no sería mediante la estimulación de la agregación de LDL, sino mediante la generación de lípidos inflamatorios y estaría principalmente relacionada con los procesos inflamatorios característicos de la lesión arteriosclerótica. 3.4.2.2 Proteólisis Se ha visto que la degradación proteolítica de la apoB-100 de la LDL provoca agregación y fusión de las partículas de LDL. Para que se induzca la fusión es necesario que fragmentos de los péptidos de la apoB-100 se liberen de la partícula para que se generen zonas hidrofóbicas que sean lo suficientemente inestables como para iniciar la fusión de la LDL. [38]. La apoB-100 es un componente importante de la superficie de la LDL y por lo tanto, cualquier pérdida parcial de apoB-100 de la superficie de la partícula de LDL es probable que produzca la reorganización de la superficie y, como consecuencia, también de los lípidos del núcleo. La modificación de la LDL por proteólisis ha sido ampliamente estudiada in vitro usando α-quimotripsina y se ha observado que el tratamiento de la LDL con αquimotripsina provoca la inestabilidad de la partícula y conduce a la formación de partículas de mayor tamaño y que se unen con mayor fuerza a los proteoglicanos. [39]. INTRODUCCIÓN 48 Se desconoce qué componentes de la LDL(-) son los responsables de sus propiedades inflamatorias. La lisofosfatidilcolina (LPC) y los NEFA se encuentran aumentados en la LDL(-) [72] ambos son mediadores de la inflamación [73] por lo que podrían ser responsables de su efecto inductor de la liberación de quimioquinas en células endoteliales. Recientemente se ha descrito que la generación de ceramida, quizás generada por la actividad PLC-like, también puede tener un papel en la acción inflamatoria. Existen varios mecanismos enzimáticos que al actuar sobre la LDL originan un aumento en su carga negativa y en el contenido de LPC y NEFA: sPLA2, SMasa, colesterol esterasa (CEasa) o Lp-PLA2 (PAF-AH). Además, estas modificaciones enzimáticas afectan a la conformación de la LDL [14] y pueden ser responsables de su menor afinidad por el rLDL y mayor agregabilidad. 4.3 AGREGACIÓN DE LA LDL(-) La LDL(-) agrega espontáneamente formando estructuras de tipo amiloide, estas estructuras están compuestas de una alineación de partículas de LDL(-) no fusionadas que se amontonan. Además de auto-agregarse, la LDL(-) tiene la capacidad de inducir la agregación de la LDL nativa, lo que sugiere que la LDL(-) tiene propiedades amiloidogénicas. Se ha sugerido que esta propiedad es debida a la conformación anormal de la apoB en la LDL(-) con mayor contenido proporcional en estructuras beta, que induce el cambio estructural de la apoB en partículas de LDL nativas. Sin embargo, su actividad PLC intrínseca también parece estar implicada en este proceso. La actividad PLC-like hidroliza los fosfolípidos, generando lipoproteínas agregadas (agLDL(-)) que pueden detectarse en circulación plasmática y que representan el 0,25-0.5% de la LDL total. Análisis de microscopia electrónica de agLDL(-) aislada del plasma han revelado que esta subfracción se encuentra agregada pero no fusionada. Por tanto, estas partículas pueden atravesar la intima de la pared arterial. En áreas de lesión arteriosclerótica hay una hiperexpresión de proteasas y INTRODUCCIÓN 49 lipasas implicadas en la agregación de la LDL. Estos enzimas junto a la actividad PLClike intrínseca pueden acelerar la fusión de la agLDL(-). Estas lipoproteínas fusionadas tienen mayor unión a los proteoglicanos y por tanto quedan fácilmente retenidas en el espacio subendotelial. La Figura 12 esquematiza la posible implicación de la agLDL(-) en el desarrollo de la arteriosclerosis. Figura 12: Mecanismo de formación de LDL(-), agregación y unión a proteoglicanos. [64] INTRODUCCIÓN 50 5APOLIPOPROTEINA J O CLUSTERINA 5.1 GENERALIDADES La apolipoproteína J, (apoJ), también conocida como clusterina (CLU), está codificada en humanos por un único gen de nueve exones, localizado en el cromosoma 8p21p12. La apoJ se puede presentar de acuerdo a su localización en dos isoformas diferentes, la forma nuclear de clusterina (nCLU) y la forma secretora (sCLU o apoJ). Las dos isoformas tienen diferentes funciones como resultado de un mecanismo de “splicing” alternativo que genera cadenas polipeptídicas de diferente longitud. Además, la apoJ sufre una serie de modificaciones post-traducionales, como son la unión entre las dos subunidades por puentes disulfuro, glicosilación, fosforilación y oxidación de los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína (Figura 13).[74] Figura 13: Estructura del gen de la apoJ [74]. La forma predominante de apoJ es la secretora, que es una proteína glicosilada de 7680 kDa heterodimérica unida por puentes disulfuro, con 449 aminoácidos, de los que los 22 primeros corresponden a la secuencia señal secretora hidrofóbica [75]. La cadena polipeptídica se rompe proteolíticamente para eliminar el péptido señal y entre los residuos 227/228 para generar las cadenas α y β, que se unen antiparalelamente por cinco puentes disulfuro para formar la molécula heterodimérica [76]. (Figura 14). INTRODUCCIÓN 51 Figura 14: Estructura de la apoJ [76]. La clusterina se expresa en todos los tejidos y es una proteína abundante en fluidos biológicos incluyendo plasma, orina, fluido cerebroespinal y semen [77-79]. La forma nuclear está estrechamente relacionada con el cáncer y la regulación de la apoptosis, el ciclo celular y la reparación de DNA, mientras que la forma secretora (sCLU o apoJ) juega un papel importante en las enfermedades metabólicas asociadas con la inflamación y el estrés oxidativo como la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes y la arteriosclerosis. Se ha demostrado que la apoJ es una chaperona extracelular, ya que tiende a unirse a proteínas parcialmente desnaturalizadas con dominios hidrofóbicos [80] inhibiendo la precipitación inducida por estrés de diferentes proteinas in vitro [81, 82]. Su acción podría ser protectora reduciendo la extensión de la progresión de enfermedades asociadas con la abundancia de precipitados protéicos. Localización Extracelular/Intracelular de la apoJ La Figura 14 muestra el mecanismo mediante el cual la apoJ es excretada. El mRNA de la apoJ se dirige al retículo endoplasmático (ER) para la tradución (1), la proteína traducida se procesa en el aparato de Golgi y se secreta al espacio extracecular apical INTRODUCCIÓN 52 (1’) o basolateral (1”). En las células que tienen una vía de exocitosis regulada, la secreción de apoJ depende de la señal extracelular apropiada. Figura 14: Mecanismo de excreción de la apoJ [83]. G:aparato de Golgi; NP:Proteinas normales; En: endocitosis; L:lisosoma; Cyt:citosol; DP:proteínas dañadas; Re: Receptor endocítico; M.Mitocondría; N: núcleo; ER:retículo endoplasmático; ERAD: degradación de proteínas asociadas al ER; R:ribosoma; SV:vesicula secretora; P: proteasomas. En el espacio extracelular, la apoJ puede actuar como chaperona con proteínas normales (NP) o unirse a proteínas dañadas (DP) y dirigirlas a los lisosomas (L) por unión al receptor endocítico (Re) gp330/megalina/LRP2 o a otros receptores desconocidos. En algunas células, la apoJ puede evitar la vía secretora (3, 3’) y localizarse en compartimentos intracelulares: la mitocondria, el núcleo y el citosol (Figura 14). INTRODUCCIÓN 53 5.2 FUNCIÓN DE LA apoJ COMO CHAPERONA Las chaperonas moleculares son un grupo diverso de proteínas que interaccionan con proteínas total o parcialmente desplegadas para estabilizarlas y prevenir su agregación y precipitación [83]. Condiciones como el estrés térmico y el oxidativo pueden causar el desplegamiento parcial de las proteínas y su agregación. Se ha propuesto que la apoJ es una de las abundantes chaperonas extracelulares que forman parte del sistema de control que actúa para estabilizar las proteínas agregadas y mediar su aclaramiento a través de endocitosis mediada por receptor y degradación lisosomal. [84, 85]. Figura 15: Mecanismo de acción de la apoJ [86]. Bajo condiciones de estrés, una proteína nativa comienza a desplegarse y adoptar una serie de estados intermedios plegados (I1 y I2) (Figura 15). En este ejemplo, el intermediario I2 tiene mayor exposición de zonas hidrofóbicas que facilitan su agregación mediante una vía irreversible. La apoJ en solución también forma agregados de varios tamaños y su forma activa es un heterodímero de 80kDa, que se INTRODUCCIÓN 54 une al intermediario I2 y forman un complejo de alto peso molecular. Hay dos fases en el proceso de interacción de la apoJ y el estado I2. En primer lugar, I2 se estabiliza y se previene su agregación y, a continuación, se forma un complejo de alto peso molecular con la apoJ. Se ha demostrado que durante situaciones de estrés la apoJ alarga la vida media del estado intermedio I2, lo cual indica que la apoJ estabiliza la forma no agregada (probablemente monomérica) de este intermediario. Todo esto sugiere que la apoJ forma complejos con estados intermedios de agregación [87]. La distribución de la clusterina entre las diferentes formas agregadas es independiente de la temperatura en el rango 37-50ºC. Además, la habilidad de la apoJ de unirse a las proteínas y su capacidad para prevenir la precipitación apenas muestra variación en este rango de temperaturas. Por el contrario, el estado de agregación si es sensible al pH, estando la formación de la forma de 80 kDa monomérica favorecida con una acidez media. Esto está correlacionado con el incremento de exposición de zonas hidrofóbicas de la apoJ y el aumento de su unión a la proteína nativa sin apenas ningún cambio en su estructura secundaria a este pH [88] [89]. Estudios de interacción de la apoJ con formas estructurales diferentes de αlactoalbúmina, -cristalina y lisozima muestran que la apoJ no se une a la forma nativa, sino que permanece estable en disolución como monómero. En cambio, sí que se une a la forma reducida de estas proteínas que agrega y precipita lentamente. Dado que las formas nativa y reducida de la proteína tienen la misma estructura secundaria, las diferencias de afinidad con la apoJ no se pueden explicar en base a esto, sino a pequeñas diferencias de su conformación que favorecen una mayor exposición de zonas hidrofóbicas de la forma reducida. Esta mayor habilidad de la apoJ de interaccionar con proteínas que tienen un proceso de agregación y precipitación lento, y su capacidad para prevenirlo, sugiere que los factores cinéticos son importantes para regular la eficacia de la acción de la INTRODUCCIÓN 55 chaperona. La apoJ se une y estabiliza a proteínas que se agregan y precipitan lentamente pero no tiene la capacidad de estabilizar proteínas que se hayan agregado y precipitado muy rápidamente [87]. 5.3 RELEVANCIA FISIOPATOLÓGICA La presencia de apoJ está asociada con depósitos de proteínas extracelulares incluyendo depósitos de inmunoglobulinas en enfermedad renal, depósitos de priones en la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, placas amiloides en enfermedad de Alzheimer y placas arterioscleróticas. La presencia de apoJ en estos depósitos sugiere que está asociada con el desplegamiento de proteínas in vivo. La deposición patológica de estas proteínas puede ser consecuencia de que la capacidad de la apoJ de prevenir la acumulación de agregados de proteínas está sobrepasada por concentraciones elevadas de proteínas desplegadas. De acuerdo con estas observaciones, la expresión de la apoJ está aumentada en enfermedades caracterizadas por proteínas mal plegadas, agregación y precipitación, por ejemplo en el Alzheimer y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob [90]. La apoJ ha sido relacionada con diversas enfermedades incluyendo enfermedad cardiovascular, síndrome metabólico, enfermedades degenerativas, inflamación y cáncer [91-93]. Su concentración esta aumentada durante la fase temprana del infarto de miocardio y el daño vascular [94], y se ha observado que, debido a su papel citoprotector, la administración intravenosa de apoJ reduce el tamaño del infarto de miocardio en ratas [95]. Atendiendo a la implicación de la apoJ en el síndrome metabólico, se ha encontrado que la glucosa ejerce una regulación positiva en la expresión de apoJ en hepatocitos [96] y los polimorfismos de su gen están asociados con la diabetes mellitus tipo 2 [97]. El papel de la apoJ durante la neurodegeneración es principalmente citoprotector, debido a su función como chaperona. Se ha identificado la apoJ como un determinante INTRODUCCIÓN 56 genético significativo en la enfermedad de Alzheimer, y se cree que la asociación entre los péptidos amiloidogénicos y la apoJ contribuyen a limitar el mal plegamiento de las especies de péptido amiloide β (Aβ) facilitando su aclaramiento del espacio extracelular [98]. Además, el contenido de apoJ en plasma está asociado con la atrofia del córtex entorrinal, la severidad de la enfermedad y la progresión clínica del Alzheimer [99]. La concentración media de apoJ en plasma es de alrededor de 100 µg/ml, y es 10 veces más alta en semen [100, 101]. La concentración plasmática aumenta en diabetes tipo 2 y durante el desarrollo de enfermedad coronaria o infarto de miocardio. En estudios más recientes, como el estudio de Kujiraoka et al. en población japonesa, han encontrado asociada la concentración de apoJ a la abundancia de lesiones en arterias coronarias en la enfermedad de Kawasaki. Su concentración en plasma está relacionada positivamente con la concentración de glucosa en sangre y se halla aumentada en pacientes con diabetes tipo 2 [102]. Otros estudios han encontrado que la concentración de apoJ está incrementada en pacientes con cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular no diferenciado y cáncer de vejiga. En este último también se han encontrado concentraciones de apoJ aumentadas en orina [103]. INTRODUCCIÓN 57 6IMPLICACIÓN DE LA apoJ EN LA ARTERIOSCLEROSIS La primera evidencia de la relación de la apoJ en el desarrollo de arteriosclerosis es la identificación de apoJ en lesiones arterioscleróticas y el hecho de que su distribución en la pared arterial aumenta con la progresión de la arteriosclerosis [104, 105]. Esto se debe en parte a un aumento de la expresión de apoJ por parte de las células de la pared arterial, pero también probablemente a la filtración de las lipoproteínas del plasma. La apoJ muestra una distribución en la pared arterial similar a la de la apoA-I y apoE, lo que sugiere que la apoJ podría tener un papel protector en la arteriosclerosis favoreciendo el trasporte de colesterol desde la pared arterial al hígado mediante la acción combinada de la apoJ y HDL que contienen apoA-I y apoE [105]. Esta posible acción protectora concuerda con estudios que han mostrado que la apoJ promueve el eflujo de colesterol de líneas celulares de macrófagos humanos THP-1 y U937 [106], lo que sugiere que la apoJ contribuye a remover el exceso de colesterol de las células espumosas en las lesiones arterioscleróticas. Además, ya se ha comentado anteriormente que la concentración de apoJ está aumentada durante la fase temprana del infarto de miocardio [94], y se ha postulado que puede ser un importante agente citoprotector en cardiomiocitos isquémicos [107]. En un estudio in vitro con suero de ratón se ha descrito que la apoJ se une formando complejos a la leptina, una hormona producida por los adipocitos implicada en la regulación del peso corporal mediante el control del apetito. Estos complejos leptina/apoJ se han encontrado presentes tanto asociados a la HDL como en el suero sin lipoproteínas [108]. Esta unión sugirió que la apoJ podría actuar como un posible modulador de la acción de la leptina aunque posteriormente en un estudio en pacientes adolescentes obesos no se encontró correlación entre la apoJ y la leptina. [109]. Por otra parte, en otro estudio en pacientes con enfermedad coronaria, se ha mostrado una correlación negativa entre la apoJ y la leptina, de tal manera que HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 64 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 65 La apolipoproteína J es una chaperona extracelular que forma parte del sistema de control que actúa para estabilizar las proteínas agregadas y mediar su aclaramiento. Una fracción importante de la apoJ se asocia a las lipoproteínas en plasma, siendo más abundante en la HDL pero también hay una pequeña parte unida a la LDL y VLDL. Diversos estudios han descrito que el contenido de apoJ en la HDL de pacientes con alto riesgo cardiovascular se encuentra disminuido. También se ha descrito que la apoJ está aumentada en la LDL de pacientes con diabetes. Estas observaciones sugieren que probablemente la principal función de la apoJ en el desarrollo de la arteriosclerosis esté relacionada con su capacidad para modular la funcionalidad de las lipoproteínas. Sin embargo, su distribución exacta en cada lipoproteína no ha sido determinada con precisión, ni tampoco la proporción de apoJ que se encuentra asociada a las lipoproteínas o en forma libre. Un aspecto que podría ser especialmente relevante es el papel que puede tener la apoJ que está unida a la LDL. Dado que la agregación de la LDL en la pared arterial es un proceso clave en el desarrollo de la arterioesclerosis y que la actividad chaperona de la apoJ regula la formación de agregados protéicos, se deduce fácilmente que la apoJ unida a la LDL podría tener un papel importante en el proceso de agregación y fusión de esta lipoproteína y, en consecuencia, podría modular la retención subendotelial de lipoproteínas. Los objetivos que se han planteado en la presente Tesis Doctoral, agrupados en las dos publicaciones presentadas, son los que se exponen a continuación: Publicación 1 1Determinar el contenido de apoJ en las subfracciones de LDL con mayor o menor aterogenicidad presentes en el plasma. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 66 2Comparar las características físico-químicas de la LDL que contiene apoJ con la LDL que no contiene. 3Estudiar el papel que juega la apolipoproteína J en el proceso de agregación de la LDL. Publicación 2 4Determinar la distribución de la apoJ en cada lipoproteína y en el suero libre de lipoproteínas. 5Analizar el efecto del perfil lipoproteíco en la distribución de la apoJ en las lipoproteínas. 6Comparar la concentración en suero de apoJ y su distribución entre las lipoproteínas, entre sujetos normolipémicos e hiperlipémicos. MATERIAL Y MÉTODOS 67 MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 68 MATERIAL Y MÉTODOS 69 1. OBTENCIÓN DE LIPOPROTEÍNAS 1.1 AISLAMIENTO PREPARATIVO DE LDL A PARTIR DE UN POOL DE PLASMAS. Este es el procedimiento que se ha utilizado en la primera parte de la tesis. Se recogieron plasmas de individuos normolipémicos en tubos vacutainer con EDTA como anticoagulante y se conservaron a -80ºC. A partir de la mezcla de estos plasmas pueden aislarse las diferentes lipoproteínas basándose en su diferencia de densidades, de acuerdo con el siguiente rango: quilomicrones<0,96 g/mL, VLDL 0,961,006 g/mL, IDL 1,006-1,019 g/mL, LDL 1,019-1,063 g/mL, Lp(a) 1,050-1,100 g/mL y HDL 1,063-1,210 g/mL. Con estas diferentes densidades se pueden separar las lipoproteínas utilizando un aislamiento secuencial mediante ultracentrifugación de flotación. El plasma está a una densidad inicial de 1,006 g/mL, para llevarlo a la densidad deseada se añade la cantidad de KBr necesaria según la siguiente fórmula de Radding y Steinberg: Volumen (mL)  (densidad final – densidad inicial) Gramos KBr = 1-(0,312 x densidad final) En nuestro caso, como queremos aislar la LDL trabajamos en un rango de densidad de 1,019-1,050 g/mL. Este rango se escogió para evitar contaminación con la Lp(a). En un primer paso se añade al plasma la cantidad necesaria de KBr para llegar a la densidad de 1,019 g/mL, se agita suavemente para evitar la agregación y se divide el volumen de plasma en tubos de policarbonato de pared rígida de 20 mL. Después se superpone a cada tubo una solución de la misma densidad, se equilibran los tubos por peso y se ponen en los rotores de ángulo fijo (TFT 70.38 o TFT 55.38, Kontron) para llevar a cabo la centrifugación a 100000 g (36000 rpm) durante 20 horas a 4ºC. MATERIAL Y MÉTODOS 70 Las lipoproteínas de densidad inferior a 1,019 g/ml (VLDL+IDL) flotan y quedan separadas del infranadante que contiene LDL, Lp(a) y HDL. Tras la aspiración de la fracción VLDL/IDL por aspiración,el infranadante se recoge en una probeta y se lleva al volumen que teníamos inicialmente de plasma total adicionando solución de densidad 1,019 g/mL. Para llevar el siguiente paso de este aislamiento secuencial necesitamos llevar el plasma a una densidad de 1,050 g/mL añadiendo la cantidad necesaria de kBr. Se vuelve a proceder igual que en el caso anterior y se someten los tubos a un proceso de ultracentrifugación a 36000 rpm durante 20 horas a 4ºC. La LDL flota tras la segunda ultracentrifugación y puede separarse por aspiración. Una vez aislada, se conserva a 4ºC y se elimina el KBr dializándola en saco de diálisis con tampón A. Este tampón está compuesto de Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM (para prevenir la oxidación) a pH 7,4. Después de la diálisis se filtra la LDL por 0,2 m para eliminar los agregados. 1.2 AISLAMIENTO DE LIPOPROTEINAS A PARTIR DE 1 ml DE PLASMA Método KBr: Igual que en el apartado anterior basándose en las diferentes densidades de las lipoproteínas se pueden separar utilizando un aislamiento secuencial mediante ultracentrifugación de flotación. Se utilizan tubos de ultracentrifuga de policarbonato de pared rígida de 2,5 ml en los que se coloca 1 ml de plasma. El primer paso es llevar el plasma que está a una densidad 1,006 g/mL a densidad 1,019, para ello utilizando la fórmula de Radding y Steinberg se cálculan los gramos de KBr que se han de añadir. En vez de pesar el KBr, utilizamos las soluciones de densidad que están preparadas. Por tanto, se añaden 1,402 ml de solución 1,006 + 98 µl de solución 1,340, se agita suavemente y se pone en la ultracentrifuga a 36000 rpm durante 18 horas. MATERIAL Y MÉTODOS 71 A continuación, se recogen por aspiración la VLDL que flota y después se recoge 1 ml del infranadante y se pasa a un tubo limpio de 2,5 ml. Para aislar la LDL, se lleva el plasma a una densidad de 1,063 g/ml añadiendole 1,171 ml de solución 1,019 + 329 µl de solución 1,340, se agita suavemente y se pone en la ultracentrifuga a 36000 rpm durante otras 18 horas. La LDL flota tras la segunda ultracentrifugación y puede separarse por aspiración. Se recoge 1 ml del infranadante y se lleva a una densidad 1,210 añadiendole 288 µl de solución 1,063 + 1,212 ml de solución 1,340 y se vuelve a llevar a cabo la ultracentrifugación a 36000 rpm durante otras 18 horas. Por último se recoge la HDL flotante por aspiración. Método D2O/sacarosa: Utilizamos el método descrito por Stahlman [119] ligeramente modificado. Es similar al descrito para el KBr utilizando soluciones de densidad para llevar a la densidad necesaria para cada lipoproteína, pero en este caso las soluciones se preparan con D2O/sacarosa. Ejemplos de cantidades necesarias para preparar las soluciones de densidad a partir de solución 1,006 y Buffer A que contiene D2O/sacarosa [119]: La VLDL/IDL (densidad <1.019 g/mL) y LDL (densidad 1.019 - 1.063 g/mL) se obtienen después de 18h de ultracentrifugación a 45.000 rpm. La fracción de HDL (1.063 - 1.210 g/mL) se obtiene centrifugando 96h a 45.000 rpm. MATERIAL Y MÉTODOS 72 Las siguiente tabla [119] presenta las cantidades de cada solución que se han de emplear para llegar a las diferentes densidades: 1.3 AISLAMIENTO DE LDL ELECTRONEGATIVA La LDL(-) se separa de la LDL nativa (LDL(+)) mediante cromatografía de intercambio aniónico usando la columna HiLoad 26/10 Q-Sepharosa High Performance (Amersham Biosciences) adaptada a cromatográfo ÄKTA-FPLC (“ÄKTA-Fast Protein Liquid Chromaography”, GE Healthcare). La columna nos permite trabajar con volumen de muestra de hasta 50 mL en cada cromatografía. Como tampón de unión a la columna se utiliza el tampón A que empleamos para la diálisis de la LDL (Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH 7,4) y como tampón de elución se usa el tampón B (Tris-HCl 10 mM, NaCl 1 M, EDTA 1 mM pH 7,4). Primeramente hay que hacer un lavado de bombas y el equilibrado de la columna con tampón A, con un mínimo de dos volúmenes de columna. Después ya se puede cargar la muestra en el loop de 50 mL e inyectar en el cromatógrafo. La separación de las dos fracciones de LDL en función de la carga se realiza utilizando un gradiente de sal escalonado que se detalla a continuación. Volumen (mL) % tampón B 0-120 0 120-163 0-10 (continuo) 163-269 26 269-374 60 374-480 100 480-507 0 MATERIAL Y MÉTODOS 73 Con este método cromatográfico se consiguen aislar las fracciones LDL(+) y LDL(-) las cuales eluyen en los escalones de 26% (0,26 M NaCl) y 60% (0,6 M NaCl), respectivamente. Después se concentran por centrifugación utilizando filtros de 10 kDa de tamaño de poro (Amicon, Millipore). 1.4 SEPARACIÓN DE FRACCIONES LDL AGREGADA Y NO AGREGADA La LDL(-) agregada (agLDL(-)) se separa de la fracción no agregada (nagLDL(-)) mediante cromatografía de gel filtración usando la columna Superosa 6 adaptada a cromatógrafo ÄKTA-FPLC (GE Healthcare). Utilizamos un loop de 2 ml, para inyectar dicho volumen de LDL en el cromatógrafo a un flujo de 0,5 ml/min. Como tampón se utiliza una mezcla de tampón A (Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=7,4) y tampón B (Tris-HCl 10 mM, NaCl 1 M, EDTA 1 mM pH=7,4) al 50%. La separación de las dos fracciones se produce por tamaño, primero eluye la agLDL(-) a los 8-10 ml y después la nagLDL(-) a los 10-16 ml. Se recogen fracciones de 1 ml en eppendorfs y después se concentran en filtros de 10 kDa de tamaño de poro (Amicon, Millipore). 1.5 SEPARACIÓN DE FRACCIONES LDL CON Y SIN APO J 1.5.1 Preparación columa NHS con anticuerpo apoJ El anticuerpo anti-apoJ (PAI-26903; Thermo Scientific) se acopla a una columna HiTrap NHS (GE Healthcare) para después subfraccionar la LDL en la que contiene apoJ y la que no. La resina que usa esta columna es la NHS-activated Sepharose High Performance, diseñada para unir covalentemente ligandos que contengan grupos amino a través de del grupo reactivo N-hidroxisuccinamida (NHS) que se une a la agarosa. Usamos 100 µg de anticuerpo anti-apoJ y columnas HiTrap de 1 ml cada columna. Se prepara el tampón de unión (0,2 M NaHCO3; 0,5 M NaCl; pH 8,3) y se disuelve el anticuerpo en este tampón (en el volumen total de las columnas que usemos). MATERIAL Y MÉTODOS 80 y entre en el gel, después se aumenta la corriente a 100 V hasta que el frente llegue al final del gel. Tampón Tris-glicina: Tris 24 mM, Glicina 190 mM, SDS 0,1% pH 8,8 Tinción del gel: La tinción se realiza en Coomasie (PhastGel Blue, Pharmacia) o en nitrato de plata (Silver Stain Plus, BioRad) que es más sensible. Coomasie: Se pone el gel en el colorante (azul de bromofenol 0,1%, metanol 40%, ácido acético 10% y H2O hasta 1 L) hasta que quede teñido (unos 30 minutos). Después se hacen sucesivos lavados con la solución decolorante (metanol 50%, ácido acético 10%, glicerol 1% y H2O hasta 1 L) hasta que se vean las bandas de proteína. Nitrato de plata: Es un método de alta sensibilidad. Se utiliza el gel Silver Stain Plus de Bio-Rad. Todo el material utilizado ha de ser vidrio y se ha de lavar previamente con ácido nitrico al 50%. No se puede utilizar metal. - Lo primero, hay que fijar el gel con la solución de fijación agitando suavemente 30 minutos. Si el gel esta teñido previamente en Coomasie, nos saltamos este paso. Solución de fijación: 50 ml metanol 10 ml ácido acético 10 ml concentrado de fijador 30 ml agua destilada - Después se decanta la solución y se lavan los geles con agua desionizada durante 10 minutos agitando suavemente, este proceso se repite dos veces. - Se prepara la solución de tinción y solución de aceleración justo antes de usarlas y se mezclan. Solución de tinción: 2,5 mL Silver Complex Solution 2,5 mL Reduction Moderator Solution MATERIAL Y MÉTODOS 81 2,5 mL Image Development Reagent Se enrasa hasta 25 ml con agua Solución de aceleración: 1,25 g Development Accelerator Solution Se enrasa hasta 25 ml con agua Se mezclan estas dos soluciones y se añaden al gel. Se deja agitando hasta que se vean las bandas. - Después se retira esta solución, y se añade la solución para detener la reacción (solución de stop, ácido ácetico al 5%) durante 15 minutos. - Se quita la disolución de stop y lavamos extensamente con agua. 2.3.3 Transferencia electroforética Después de realizar la electroforesis en gel SDS que desnaturaliza las proteínas, estas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa mediante carga eléctrica. Las proteínas se unen a la membrana de nitrocelulosa mediante interacciones hidrofóbicas, lo que permite su detección con anticuerpos. Procedimiento: - Se equilibra la membrana de nitrocelulosa, papel de filtro y esponjas en tampón de transferencia para favorecer el proceso. Tampón de transferencia: 200 ml metanol 400 ml tampón Tris-glicina con SDS (el mismo de la electroforesis en SDS) 400 ml agua destilada - Se coloca el gel con la membrana de nitrocelulosa cubiertas de papel de filtro y esponjas en un casette y se mete dentro de la cámara de transferencia con el tampón de transferencia. Se corre 1 h y media a 30 V en frío. 2.3.4 Western Blot - Se saca la membrana del casette y se bloquea con caseína al 0,1 % en TBS (50 mM MATERIAL Y MÉTODOS 82 Tris, 500 mM NaCl, pH 7,4) para evitar interacciones inespecíficas entre la membrana y el anticuerpo, ya que la caseína se une a la membrana en las zonas donde las proteínas no se han unido. - Se incuba la membrana con el anticuerpo primario anti-apoJ (PAI-26903, Thermo Scientific) diluido 1/1000 en TBS con caseína al 0,1% hasta el día siguiente a 4ºC (o 2 horas a 37ºC). - Se lava 3 veces con TTBS (TBS con 0,1% Tween 20). - Incubación con anticuerpo secundario anti-cabra conjugado con HRP (dilución 1:2000, Jackson Immuno Research) 2 horas. - La membrana se revela con el kit Immune-StarTM HRP de Quimioluminiscencia (BioRad), este reactivo reacciona con la HRP del anticuerpo secundario y produce luminiscencia proporcional a la cantidad de proteína de la muestra. La luminiscencia se capta en una cámara CCD (ChemiDoc, BioRad). 2. 4 MONITORIZACIÓN DE LA AGREGACIÓN 2.4.1 Inducción de la agregación de la LDL Se indujo la agregación de la LDL por diferentes mecanismos. - Agregación espontánea: Las LDLs se igualan a una concentración de 2,5 mM de colesterol con tampón A y se les añade BHT 2 M para prevenir la oxidación. Se incuban a 37ºC agitándose hasta 21 días. - Agregación inducida por esfingomielinasa (SMasa): Las LDLs se igualan a una concentración de 2,5 mM de colesterol con tampón A, a continuación se dializan en columnas PD10 equilibradas en tampón SMasa, ya que el enzima SMasa necesita calcio para que se produzca la reacción. Se les añade BHT 2 M y SMasa (Bacillus cereus sp., Sigma) a una concentración final de 25 mU/ml y se incuba a 37ºC durante 48 horas. MATERIAL Y MÉTODOS 83 Tampón SMasa: Tris-HCl 10 mM, NaCl 40 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 10 mM, pH 7,4. - Agregación inducida por -quimiotripsina (α-CT): Las LDLs se igualan a una concentración de 2,5 mM de colesterol con tampón A y se les añade BHT 2 M. Se incuba a 37ºC durante 48 horas con α-CT a una concentración final de 0,1 g/L, de esta manera el ratio molar LDL/α-CT será 10/1. 2.4.2 Métodos para monitorizar la agregación 2.4.2.1 Absorbancia: Se mide la absorbancia a 450 y 680 nm de 200 l de LDL a 2,5 mM de colesterol usando placas-UV de 96 pozos (Greiner) en un lector de placas (Biotek Synergy HT). La absorbancia a estas dos longitudes de onda es indicativa de agregación. A 450 nm la señal es más intensa, aunque a 680 nm es más específica de este proceso. 2.4.2.2 Precipitación de lipoproteínas: Se cogen 200 l de LDL a 2,5 mM de colesterol y se centrifugan a 15000 rpm durante 10 minutos. La porción de lipoproteína agregada precipita, se separa el sobrenadante y se mide el colesterol. Los resultados se expresan como porcentaje de colesterol no precipitado. 2.4.2.3 Cromatografía de gel filtración (CGF): Se lleva a cabo del mismo modo que el descrito en el apartado 1.3 2.4.2.4 Electroforesis en gradiente de acrilamida (GGE): Se lleva a cabo del mismo modo que el descrito en el apartado 2.2.1. 2.4.2.5 Microscopía electrónica de transmisión (TEM): Las LDLs se tiñen negativamente con fosfotungustato de potasio al 2% y pH 7 sobre rejillas de carbón. Se observan y fotografían las muestras en un microscopio electrónico de transmisión Jeol 120-kV JEM-1400 con una cámara Erlangshen ES100 W CCD (Gatan, Abingdon, UK). MATERIAL Y MÉTODOS 84 2.4.2.6 Dicroismo circular (CD): Se analizaron las muestras de LDL a una concentración de 50 mg de proteina/L en PBS en una cubeta de cuarzo de 0,2 cm a 25ºC. Se realizaron los espectros en un espectropolarímetro JASCO J-175 en la región del ultravioleta lejano (190-250 nm). Este método nos permite predecir el contenido de estructura secundaria de una proteína. 2.4.2.7 ATR-FTIR: Se analizaron muestras de LDL a una concentración de 0,04 mg/dl en PBS a temperatura ambiente. Para ello se transfieren 5 µl de muestra a una superficie de cristal de diamante y se seca al aire durante 10 minutos y a continuación se realizan los espectros de infrarojos en modo absorbancia (4000-400 cm-1) un espectrómetro Variant Resolutions Pro spectrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Para cada medida se recogen 400 espectros y se resta el blanco. 3. AISLAMIENTO DE APOLIPOPROTEINA J. La apoJ se aisla a partir de suero libre de lipoproteinas (LPDS). Para ello se somete el suero a un proceso de ultracentrifugación a 36000 rpm, 18 horas ajustando a una densidad de 1,210 g/mL con KBr. De esta manera todas las lipoproteínas flotan mientras que el LPDS queda en la base del tubo. Una vez se tiene el LPDS, para aislar la apoJ se utilizan dos cromatografias en serie, primero con la columna Blue Sepharose y después con la NHS-apoJ. 3.1 CROMATOGRAFÍA CON LA COLUMNA BLUE SEPHAROSA Utilizamos dos columnas HiTrap Blue Sepharosa de 5 ml conectadas en línea para eliminar el exceso de albúmina de las muestras de suero, ya que se une covalentemente a esta columna. Se inyectan 2 ml de LPDS. Como tampón de unión se utiliza PBS a pH 6, ya que a pH ligeramente ácido la apoJ se encuentra en forma más monomérica. Como tampón de elución (B) se utiliza el tampón de unión con KCl 2M. La muestra se eluye a un flujo de 1 ml/min con el siguiente gradiente: MATERIAL Y MÉTODOS 85 % tampón B minutos 0-20 20 20-100 10 100 20 0 20 El primer pico del cromatograma, correspondiente al LPDS sin albúmina se concentra al volumen inicial y se dializa en PBS a pH 6. 3.2 CROMATOGRAFÍA CON LA COLUMNA NHS-apoJ A partir de la primera fracción obtenida en la cromatografía anterior, se aisla la apoJ mediante cromatografía de afinidad, utilizando la columna HiTrap NHS con el anticuerpo anti-apoJ preparada previamente (apartado 1.4.1) adaptada al cromatográfo ÄKTA-FPLC (GE Healthcare). Inyectamos 1 ml de LPDS en cada cromatografía. Como tampón de unión a la columna se utiliza el tampón A (Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH 7,4). Y como tampón de elución glicina a pH 2,5. Se equilibra la columna en tampón A y a continuación inyectamos la LDL a un flujo de 1 ml/min. Todo el proceso se realiza como se ha indicado en el apartado 1.4.2. 3.3 COMPROBACIÓN DE LA PUREZA DE LA apoJ Se mide su concentración de proteína usando un método comercial (TPUC3, Roche diagnostics) adaptado al autoanalizador Cobas 6000/c501. Se determina su pureza mediante geles de SDS-PAGE (detallado en el partado 2.3.2) y Western Blot (detallado en el partado 2.3.4). MATERIAL Y MÉTODOS 86 PUBLICACIONES 87 PUBLICACIONES PUBLICACIONES 88 PUBLICACIONES 89 1) Martínez-Bujidos, M., Rull, A., González-Cura, B., Pérez-Cuéllar, M., MontoliuGaya, L., Villegas, S., Ordóñez-Llanos, J., Sánchez-Quesada, J. L. Clusterin/apolipoprotein J binds to aggregated LDL in human plasma and plays a protective role against LDL aggregation. FASEB J. 2015 May;29(5):1688-700. 2) Anna Rull1; Maria Martinez-Bujidos1; Montserrat Perez-Cuellar; Antonio Pérez; Jordi Ordoñez-Llanos; José Luis Sánchez-Quesada. Increased concentration of clusterin/apolipoprotein J (apoJ) in hyperlipemic serum is paradoxically associated with decreased apoJ content in lipoproteins. . Atherosclerosis. 2015 Jun 6;241(2):463-470 1 contributed equally to the work, and both should be considered as first authors. a higher content of free cholesterol, triglycerides, NEFA, and apoE than total LDL. Because of the very low amount of LDL/J+, we were unable to analyze its chromatographic profiles by anion-exchange chromatography or GFC to corroborate increased negative electric charge and increased aggregation. However, both analyses were performed in total LDL and LDL/J2(Supplemental Fig. S2). The 2 LDLs essentially presented the same chromatographic profiles regarding electric charge (anion-exchange chromatography) and presence of aggregates (GFC). Susceptibility to aggregation of apoJ-depleted LDL The very low amount of LDL/J+ did not allow analysis of its susceptibility to aggregation. However, both total LDL and LDL/J2essentially presented the same composition and characteristics, including a similar proportion of LDL(2) and aggregated LDL (Supplemental Fig. S2). Hence, we assumed that the only difference between total LDL and LDL/J2was the lower content of apoJ in the latter. This prompted us to analyze the specificroleofapoJinLDL particles by comparing the behavior against inducedaggregation of LDL/J2and total LDL. Spontaneous aggregation In the first set of experiments, LDLs were induced to spontaneous aggregation by incubation at 37°C in gentle agitation in the presence of EDTA and BHT to prevent oxidation. Supplemental Fig. S3 shows an experiment measuring the increment of absorbance at 450 nm and the precipitation of cholesterol throughout the period of incubation. Turbidity remained stable up to days 11–12 and then rapidly increased. This increase was fasterin LDL/J2 than in total LDL (Supplemental Fig. S3A). Precipitation of the cholesterol method showed a similar pattern, with LDL/J2presenting increased propensity to cholesterol precipitation (Supplemental Fig. S3B).However, although LDL/J2proved to be more susceptible to aggregation than total LDL in all the performed experiments (n=4), the response of LDLs was heterogeneous among batches, with the period to detect evident aggregation ranging from 5daysto3weeks. Aggregation induced by SMase and a-CT To solve the problems with the heterogeneous response of spontaneous LDL aggregation, we added SMase or a-CT to trigger this process. In these experimental conditions, aggregation occurred fast enough to obtain relevant differences at 24 hours after the process started. Absorbance results (Fig. 3A, B) showed that both enzymatic treatments promoted the aggregation of total LDL and LDL/J2,but aggregation was higher in LDL/apoJ2.Thecholesterolprecipitation method yielded results that were similar to the measurement of absorbance (Fig. 3C,D). In the specificconditionsthatweused,SMasetreatmentpromoted stronger aggregation than a-CT proteolysis. Figure 4 shows a representative experiment of SMaseor a-CT–induced aggregation after 24 hours, evaluated by GFC. The results obtained by this method were similar to those obtained by the absorbance or the cholesterol precipitation methods. These findings indicate that LDL/J2 is moresusceptible to aggregation than total LDL whatever the induction mechanism used. In addition, both treatments generated a peak of smaller size, probably corresponding to degradation fragments. These observations were also patent in TEM micrographs (Fig. 4, right), which showed that aggregates in LDL/J2were more abundant andlargerthanintotalLDLafterSMaseanda-CT treatment. CD spectra (Fig. 5A, B)showed that SMase-induced aggregation slightly decreased the elipticity signal in LDL/J2 but not in total LDL. This decrease is more evident at the 208 nm region, where the a-helix contributes; this suggests a relative enrichment of b-structure of apoB in LDL/J2. ATR-FTIR analyses show a noticeable shift to lower wavenumbers, from 1637 to 1622 cm 21 ,inbothLDLs,although TABLE 1. Composition of LDL subfractions containing or not containing apoJ LDL composition Total LDL LDL/apoJ2LDL/apoJ+ Major components a Total cholesterol 37.8 63.1 37.3 62.1 36.0 66.4 Esterified cholesterol 26.8 63.9 26.9 63.3 20.4 67.5 b Free cholesterol 11.0 61.8 10.7 61.8 15.6 62.7 b Triglyceride 10.5 63.9 10.1 63.3 12.3 63.3 b Phospholipids 24.4 63.2 24.4 62.7 23.6 61.4 apoB 27.2 62.1 28.2 62.2 28.1 68.0 Minor components c NEFA 15.0 611.1 16.8 613.0 50.6 628.7 b apoA-I 0.205 60.279 0.103 60.075 0.570 60.265 b apoA-II 0.162 60.279 0.112 60.163 0.252 60.339 apoE 0.171 60.050 0.141 60.033 0.270 60.080 b apoC-III 0.207 60.059 0.146 60.035 0.152 60.039 apoC-II 0.088 60.032 0.067 60.029 0.103 60.042 a Expressed as percent of the particle total mass. Data are mean 6SD of 10 independent experiments. b Statistically significant differences vs. total LDL and LDL/apoJ2. c Expressed as mol/mol apoB. Data are means 6SD of 5 independent experiments. APOLIPOPROTEIN J INHIBITS LDL AGGREGATION 1693 the shift was a bit more evident in the LDL/J2spectrum (Fig. 5C, D). Although both regions of the spectra correspond to b-structures, a shift to lower wavenumbers in the spectra of proteins is indicative of increased hydrogen bonding, of a more planar sheet, or of a larger number of strands (34). However, such a change in the IR spectra of lipoproteins has been attributed to the embedding of bstrands in the lipid monolayer rather than to an increase in b-sheet packing (35), which makes sense after SMase treatment. Whatever the case, both views are consistent with increased SMase-induced aggregation of LDL/J2 particles compared with total LDL. a-CT–induced aggregation promoted a stronger modification of CD spectra than SMase treatment in both LDLs (Fig. 5F, G) possibly because of the extensive proteolysis of apoB, as seen in Fig. 5J. Here, both the relative enrichment of the b-structure of apoB at 2 hours of proteolysis and the aggregation of the particles at 24 hours are more evident in LDL/J2than in total LDL. These differences were not observed in the overall ATR-FTIR spectra (Fig. 5H, I). It must be noted that IR spectroscopy interpretation is not a straightforward procedure because of the sensitivity of IR to combined structural and environmental factors (36), especially when talking about the ATR mode allowing the study of crystallized samples to avoid water contribution to the spectra. The detection of conformational differences in the native b-sheet of apoB would require deconvolution of the spectra, but this would not be reliable with the characteristic 4 cm 21 resolution of ATR-FTIR. Albeit this technical limitation, it is apparent that LDL/J2is more susceptible to SMase and a-CT treatments than total LDL. SDS-PAGE showed that apoB in LDL/J2was more susceptible to proteolytic degradation than total LDL, both when it was promoted by a-CT and when proteolysis was spontaneous in SMase-treated LDLs(Fig. 5E, J).apoJwould therefore not only protect LDLs from aggregation but could also prevent apoB degradation. Because proteolysis of apoB promotes LDL aggregation, the inhibitory effect of apoJ on proteolysis could be a mechanism involved in preventing the aggregation of LDL particles. Effect of the addition of purified apoJ on LDL susceptibility to aggregation Total LDL was submitted to SMaseor a-CT–induced aggregation in presence of purified apoJ at 2 molar ratios in respect to apoB. The first was close to that observed in agLDL(2) in plasma (mol apoJ/mol apoB 1/70, or expressed as mass, mg apoJ/mg apoB 1/500). The second was 10-fold higher (molar ratio 1/7, mass ratio 1/50). The process of LDL aggregation induced by SMase or a-CT was prevented at 4 hours of incubation by both doses of apoJ and was slowed in a dose-dependent manner for periods up to 24 h (Fig. 6A, B). GGE confirmed that the higher concentration of apoJ partially prevented the formation of Figure 3. Aggregation of total LDL and LDL/J2after SMase or a-CT treatments. LDLs were at 0.5 mg/ml apoB (equivalent to 3 mM cholesterol). Aggregation of LDLs was induced by a-CT (A) or SMase treatment (B) and monitored at 2 and 24 hours by measuring absorbance at 450 nm. Proportion of nonprecipitable cholesterol after LDL aggregation induced by a-CT (C) or SMase treatment (D). Data are the mean 6SEM of 6 independent experiments in triplicate (absorbance) or duplicate (cholesterol precipitation). 1694 Vol. 29 May 2015 MART´ INEZ-BUJIDOS ET AL.The FASEB Journal xwww.fasebj.org aggregated particles at 24 hours of aggregation (Fig. 6C, D). GFC also showed the inhibitory effect of the higher concentration of apoJ on theformation of aggregated LDL particles after 24 hours of SMaseor a-CT–induced aggregation (Fig. 6E). Because purified apoJ contained a low amount of contaminating albumin and because albumin is known to inhibit LDL aggregation at high concentrations, we tested theeffectofanamountofalbuminsimilartothosecontaminating apoJ preparations. At this concentration (mol albumin/mol apoB 1/70), no effect on LDL aggregation was observed (data not shown). We used transferrin, trypsin inhibitor, and immunoglobulin (Mab anti-CD14) as negative controls at the same concentration as that used for apoJ. None of these proteins had any effect on LDL aggregation. DISCUSSION The current study shows that the amount of apoJ bound to LDL is increased in the aggregated forms of this lipoprotein present in blood. This increased binding should be attributable to the chaperone function of apoJ, which binds to unfolded proteins with solvent-exposed hydrophobic domains (37). Aggregation of LDL is promoted by the exposure of hydrophobic domains on the surface of LDL particles, which can be induced by chemical (lipolysis or proteolysis) or physical (vortexing) modifications (28, 38). However, from our observation of an increased content of apoJ in agLDL(2), we cannot deduce whether the bindingofapoJtotheaggregatedformsofLDLoccurs merely due to the exposure of hydrophobic domains after LDL aggregation or whether apoJ plays a concrete role in Figure 4. GFC and TEM of total LDL and LDL/J2after 24 hours of SMase or a-CT treatments. LDLs (0.5 ml at 0.4 mg/ml apoB) were chromatographed at a flow rate of 0.5 ml/min using a Superose 6 column in a AKTA-FPLC system (GE Healthcare) as described in Materials and Methods. White bars in TEM micrographs indicate 200 nm. APOLIPOPROTEIN J INHIBITS LDL AGGREGATION 1695 Figure 5. CD and ATR-FTIR spectra. Total LDL and LDL/J2were analyzed at 0 (black lines), 2 (dark gray lines), and 24 hours (light gray lines) of SMase or a-CT treatments. LDLs (0 at 0.5 mg/ml apoB) were incubated for 24 hours with SMase or a-CT, as described in Materials and Methods, and CD or ATR-FTIR spectra were obtained using 50 mg/L apoB on a JASCO J-715 spectropolarimeter in the far-UV region (190–250 nm) or on a Variant Resolutions Pro spectrometer in the amide I region (1700–1600 cm 21 ), respectively. CD and FTIR graphs are representative of 3 independent experiments. A) CD spectra of total LDL after SMase treatment. B) CD spectra of LDL/J2after SMase treatment. C) ART-FTIR spectra of total LDL after SMase treatment. D) ART-FTIR spectra of LDL/J2after SMase treatment. F) CD spectra of total LDL after a-CT treatment. G)CD spectra of LDL/J2after a-CT treatment. H) ART-FTIR spectra of total LDL after a-CT treatment. I) ART-FTIR spectra of LDL/J2 after a-CT treatment. Eand J) SDS-PAGE of total LDL and apoJ-depleted LDL (LDL/J2) after 2 and 24 hours of SMase or a-CT treatments. LDLs (5 mg/well) were electrophoresed in 10% acrylamide gels under nonreducing conditions for 2 hours at 100 V and stained with 0.05% Coomassie. Left gel, LDLs treated with SMase; right gel, LDLs treated with a-CT. 1696 Vol. 29 May 2015 MART´ INEZ-BUJIDOS ET AL.The FASEB Journal xwww.fasebj.org the control of LDL aggregation. TEM micrographs and GGE electrophoresis of LDL/J+ showed that, although aggregated or fused particles in this subfraction were more abundant than in LDL/J2, monomeric particles were more frequent than aggregated/fused particles. This observation suggests that the binding of apoJ does not require the effective aggregation of LDL particles. Instead, such binding could occur in monomeric particles that expose some hydrophobic domains but are still not aggregated. It is on these particles where apoJ could exert some effect controlling aggregation. Experiments performed with apoJ-depleted LDLs demonstrate that apoJ plays an active protective role against LDL aggregation. This protective function was observed whatever method induced aggregation, suggesting that it would be a general mechanism to prevent LDL aggregation. Interestingly, apoJ not only retarded the aggregation of LDL particles but it also diminished the degradation of apoB, either when it was secondary to degradation of phospholipids by SMase or when it was directly induced by a-CT treatment. This function of apoJ in LDL can be compared withthat suggested in HDLs, where apoJ would play a role stabilizing the structure and function of apoA-I or paraoxonase 1 (39, 40). ApoJ could thus be involved in stabilizing the apoB structure and making it less sensitive to proteolysis. These findings in apoJ-depleted LDLs were confirmed in another set of experiments in which purified apoJ added to LDLs was able to partially inhibit the aggregation induced by SMase or a-CT. It is noteworthy that the concentration of apoJ used in our experimentsiswithin thephysiologicrange.Severalstudies report that the concentration of apoJ in blood ranges from 50 to 150 mg/ml (41–45), and the usual concentration of apoB in normolipemic subjects ranges from 0.8 to 1.0 mg/ml. The ratio of apoJ/apoB in blood is therefore around 1/10. The lowest apoJ/apoB ratio (1/500, expressed in protein mass) that we used was similar to that observed in agLDL(2) presentinplasma,andthehighest ratio(1/50) we used is even lower than the ratio usually present in plasma. Taken together, our data demonstrate that apoJ could play a determinant role in preventing the aggregation of LDL particles in blood circulation. The molecular mechanism for apoJ effects on LDL aggregation is unclear. It is probably related to the ability of apoJ to bind to hydrophobic domains exposed by proteins undergoing unfolding. Wilson and colleagues suggested that during amorphous aggregation of proteins, apoJ interacts with slowly aggregating species of the off-folding Figure 6. Effect of the addition of purified apoJ to LDL aggregation induced by SMase or a-CT treatment. Total LDL (at 0.5 mg/ml apoB) was subjected to aggregation by SMase or a-CT treatments up to 24 hours in the presence of 1 and 10 mg of apoJ. The final mass ratios of apoJ/apoB were 1/500 and 1/50, and molar ratios were 1/70 and 1/7, respectively. Increment of absorbance at 450 nm after a-CT treatment (A) or after SMase treatment (B). GGE of LDLs (5 mg apoB/well) after 24 hours of a-CT treatment (C) or SMase treatment (D). E) GFC of total LDL after 24 hours of SMase or a-CT treatment in the presence of 10 mg of purified apoJ. LDLs (0.5 ml at 0.4 g/ml apoB) were chromatographied using a Superose 6 column in a AKTA-FPLC system. APOLIPOPROTEIN J INHIBITS LDL AGGREGATION 1697 pathway (2, 3). Phospholipolysis or proteolysis of LDL promotes the formation of hydrophobic domains both in the lipid and protein moieties of the lipoprotein, favoring the aggregation of LDL. apoJ could bind to these hydrophobic domains, preventing the interaction of LDL particles mediated by hydrophobic surfaces and the subsequent aggregation. Our results concur with the postulated function of apoJ as a part of the quality control system for preventing the accumulation of protein aggregates (4). apoJ expression increases during various physiologic and pathologic stresses (44, 46–48), and its binding to client proteins in blood, such as albumin, fibrinogen, or ceruloplasmin, is promoted after inducing shear stress in plasma (6). In the context of cardiovascular disease, a number of studies have reported different protective effects of apoJ (49). apoJ regulates complement and is released from activated platelets to participate in wound repair (50). The concentration of apoJ increases in areas of atherosclerotic lesions but not in normal arteries (5, 51). This increase could be due in part to the entry of lipoproteins from plasma but also to its enhanced expression by the arterial wall cells. Kim et al. reported a protective role of apoJ against neointimal hyperplasia via an antiproliferative effect on vascular smooth muscle cells and a cytoprotective effect on endothelial cells (52). Another potential protective action of apoJ is that it induces cholesterol export from macrophage-foam cells (53), in a similar manner to that promoted by apoA-I. The role of apoJ in HDLs has been studied in detail by Navab and coworkers. These authors reported that apoJ preserves the anti-inflammatory, antioxidant, and antiatherogenic properties of HDLs (39, 40). Several studies have found that the content of apoJ in HDLs is decreased in subjects with diabetes, obesity, or metabolic syndrome and in patients with active coronary disease (11, 12, 43). In the latter, the antiapoptotic activity of HDLs is compromised in part by its reduced apoJ content (12). Although all proteomic analyses performed in LDL have detected the presence apoJ in this lipoprotein, few studies have investigated the role of apoJ on LDLs. Karlsson et al. reported that apoJ is increased in LDLs from obese subjects (54),and Petterssonet al. described increased apoJ content in small dense LDLs from patients with diabetes and metabolic syndrome (20). These findings suggest that the low content of apoJ in HDLs in these patients could be caused by an altered distribution of apoJ among the lipoprotein fractions. However, these studies do not address the specific role of apoJ associated to LDLs. The only study to date that has investigated a specificfunctionofapoJonLDLs was conducted by Schwartz et al. (21). These authors reported a protective role of apoJ against cytotoxicity promoted by E-LDLs. They modified LDLs with plasmin and cholesterol esterase and obtained a highly inflammatory form of LDL (named E-LDL) characterized by increased content in NEFA and apoB degradation. Both characteristics are shared with LDL(2). These authors reported that apoJ bound to E-LDL but not to native LDL, a finding that is in agreement with our results of increased binding of apoJ to aggregated LDL. It is pertinent to consider that phospholipases and proteases play a relevant role in the triggering of atherogenesis in the arterial wall. SMase expression is increased in atherosclerostic lesions. It degrades SM to ceramide and phosphorylcholine, leading to the formation of hydrophobic ceramide-rich domains that promote LDL aggregation. Regarding a-CT, although this enzyme is not directly involved in atherosclerosis, it is used as a model for proteolysis because several endoproteases are hyperexpressed in atherosclerotic lesions. a-CT induces apoB proteolysis and triggers LDL particle fusion, later destabilizing these lipoproteins. The present findings show a novel mechanism by which apoJ controls the aggregation of LDLs. We propose that the increased expression of apoJ in atherosclerotic lesions could be a response of the arterial walls to LDL aggregation, the initial key step of atherogenesis. This proposal opens the possibility that apoJ-based therapeutic strategies conducted to inhibit LDL aggregation could be useful in the future for preventing cardiovascular disease. The use of mimetic peptides derivedfrom apoJ, for example, has been successfully used to retard atherosclerosis in mice, although the effect on LDL aggregation has not been evaluated. Further research addressing these molecular mechanisms will hopefully contribute to the development of new apoJ-based therapies. The authors thank Carolyn Newey (Sant Pau Biomedical Research Institute; IIB Sant Pau) for editorial assistance. This work was supported by the Spanish Ministry of Health (Instituto de Salud Carlos III/Fondo de Investigaci´ on Sanitaria; ISCIII/FIS) Grants PI10/00265, PI10/00975, PI13/00364, and PI13/01330. M.M.-B., A.R., M.P.-C., J.O.-L., and J.L.S.-Q. are members of the Quality Research Group 2009-SGR-1205 from Generalitat de Catalunya. L.M. and S.V. are members of the Quality Research Group 2014-SGR-00885 from Generalitat de Catalunya. M.M.-B., A.R., M.P.-C., J.O.-L., and J.L.S.-Q. are members of the Cardiovascular Research Network (Red de Investigaci´ on Cardiovascular; RD12/0042/0043) from ISCIII. The authors declare no conflicts of interest. REFERENCES 1. De Silva, H. V., Harmony, J. A., Stuart, W. D., Gil, C. M., and Robbins, J. (1990) Apolipoprotein J: structure and tissue distribution. Biochemistry 29, 5380–5389 2. Yerbury,J.J.,Poon,S.,Meehan,S.,Thompson,B.,Kumita,J.R., Dobson, C. M., and Wilson, M. R. (2007) The extracellular chaperone clusterin influences amyloid formation and toxicity by interacting with prefibrillar structures. FASEB J. 21, 2312–2322 3. Poon, S., Treweek, T. M., Wilson, M. R., Easterbrook-Smith, S. B., and Carver, J. A. (2002) Clusterin is an extracellular chaperone that specifically interacts with slowly aggregating proteins on their off-folding pathway. FEBS Lett. 513, 259–266 4. Yerbury, J. J., Stewart, E. M., Wyatt, A. R., and Wilson, M. R. 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Accepted for publication December 1, 2014. 1700 Vol. 29 May 2015 MART´ INEZ-BUJIDOS ET AL.The FASEB Journal xwww.fasebj.org Author's personal copy Increased concentration of clusterin/apolipoprotein J (apoJ) in hyperlipemic serum is paradoxically associated with decreased apoJ content in lipoproteins Anna Rull a , 1 , Maria Martínez-Bujidos a , b , 1 , Montserrat P erez-Cuellar a , Antonio P erez c , Jordi Ord o~ nez-Llanos a , b , Jos e Luis S anchez-Quesada a , * a Cardiovascular Biochemistry Group, Biomedical Research Institute, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, IIB Sant Pau, Barcelona, Spain b Biochemistry and Molecular Biology Department, Universitat Aut onoma de Barcelona, Spain c Endocrinology and Nutrition Department, Biomedical Research Institute, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, IIB Sant Pau, Barcelona, Spain article info Article history: Received 26 January 2015 Received in revised form 31 May 2015 Accepted 1 June 2015 Available online 6 June 2015 Keywords: Apolipoprotein J Atherosclerosis Cardiovascular risk factors Hyperlipidemia Lipoproteins abstract Objective: Clusterin/apolipoprotein J (apoJ) circulates in blood in part associated to lipoproteins or in unbound form. When bound to HDL, apoJ is antiatherogenic by inhibiting endothelial cell apoptosis; thus, any factor modifying apoJ association to HDL would decrease its antiatherogenic function. However, the exact distribution of apoJ in each lipoprotein fraction, or in lipoprotein-non bound form has not been specifically investigated either in normolipemia or in dyslipemia. Methods: Basic lipid profile and apoJ concentration were determined in sera from 70 subjects, including a wide range of cholesterol and triglyceride concentrations. Lipoproteins were isolated by ultracentrifugation and their lipid and apolipoprotein composition was assessed. Results: In the overall population, serum apoJ positively associated with cholesterol, triglyceride and VLDL-C concentrations, and HDL-C and triglyceride were independent predictors of increased apoJ concentration. Approximately, 20.5% of circulating apoJ was associated with lipoproteins (18.5% HDL, 0.9% LDL and 1.1% VLDL) and 79.5% was not bound to lipoproteins. Serum apoJ concentration was higher in hypercholesterolemic (HC), hypertriglyceridemic (HTG) and combined hyperlipidemic (CHL) sera compared to normolipemic (NL) sera (HC, 98.15 ±33.6 mg/L; HTG, 103.3 ±36.8 mg/L; CHL, 131.7 ±26.8 mg/L; NL, 66.7 ±33.8 mg/L; P<0.001). ApoJ distribution was also altered in hyperlipidemia; approximately 30% of circulating apoJ was associated to lipoproteins in the NL group whereas this proportion rounded 15% in hyperlipidemic subjects. Conclusions: Our findings indicate that hyperlipidemia increases the concentration of apoJ in serum but, in turn, the content of lipoprotein-associated apoJ decreases. The redistribution of apoJ in hyperlipidemia could compromise the antiatherogenic properties of HDL. ©2015 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Clusterin, also known as apolipoprotein J (apoJ), is a highly glycosylated protein involved in ageing, arteriosclerosis, diabetes, cancer, nephropathy and neuron degeneration [1e3]. Although the specific role that apoJ plays in these processes is not well understood, its chaperone activity seems to be involved in a general protective action. ApoJ was the first identified extracellular chaperone and it binds to a wide variety of partially unfolded proteins that present hydrophobic regions, including amyloid-like structures. It is therefore part of the quality control system for preventing extracellular unfolded protein accumulation [1,2]. ApoJ is expressed by numerous cell types and is present in most tissues and body compartments [3e6]. In relation to atherosclerosis, it is hyperexpressed in human atherosclerotic lesions [7e9] and in areas of vascular damage [10,11]. ApoJ is also present in blood, with values ranging from 50 to 200 mg/L, depending on the measurement method [12e19]. ApoJ circulates mainly in free form *Corresponding author. Cardiovascular Biochemistry Group at Biomedical Research Institute IIB-Sant Pau, Sant Antoni MªClaret 167, 08025 Barcelona, Spain. E-mail address: [email protected] (J.L. S anchez-Quesada). 1 AR and MM-B contributed equally to the work, and both should be considered as first authors. Contents lists available at ScienceDirect Atherosclerosis journal homepage: www.elsevier.com/locate/atherosclerosis http://dx.doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2015.06.003 0021-9150/©2015 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. Atherosclerosis 241 (2015) 463e470 Author's personal copy [33] T. Vaisar, S. Pennathur, P.S. Green, et al., Shotgun proteomics implicates protease inhibition and complement activation in the antiinflammatory properties of HDL, J. Clin. Invest. 117 (2007) 746e756. [34] E. Burillo, R. Mateo-Gallego, A. 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Pero además de la apoJ expresada por las células de la pared arterial, existe una porción significativa de la apoJ que se halla asociada a las lipoproteínas, tanto en la pared arterial como en la circulación plasmática [112]. La presente tesis se ha centrado en este segundo aspecto. Es relativamente conocido el papel estabilizador de la apoJ sobre la funcionalidad de la HDL. Sin embargo, el papel de la apoJ sobre las propiedades aterogénicas de la LDL es prácticamente desconocido. De igual manera, aunque se sabe que la apoJ está presente en plasma en forma libre o unida a las lipoproteínas, ningún estudio ha analizado de una manera cuantificable la distribución relativa de la apoJ entre las diferentes lipoproteínas y en forma libre. Estos dos aspectos son los analizados en las dos publicaciones que conforman la presente Tesis. 1. ARTÍCULO 1: PAPEL DE LA APOJ EN LA AGREGACIÓN DE LA LDL. Diversos estudios han mostrado un papel protector de la apoJ en la HDL. Los estudios se centraron en la HDL ya que durante mucho tiempo se consideró que la apoJ únicamente se asociaba a esta lipoproteína. Sin embargo, los recientes análisis proteómicos que han analizado la composición de VLDL y LDL humana han detectado apoJ en estas partículas [60, 115, 120], aunque su contenido de apoJ es mucho más bajo que en la HDL. DISCUSIÓN 116 1.1 CONTENIDO DE APOJ EN LAS SUBFRACCIONES DE LA LDL (LDL(+), nagLDL(-) Y agLDL(-)). La primera observación relevante del artículo 1 es el diferente contenido de apoJ en las distintas subfracciones de LDL aisladas del plasma. Aunque el contenido de apoJ es muy bajo en todas las fracciones de la LDL, éste es 6 veces superior en la LDL(-) respecto a la LDL(+), y dentro de las fracciones de LDL(-), es 7 veces superior en la fracción de LDL(-) agregada (agLDL(-)) respecto a la LDL(-) no agregada (nagLDL(-)). Es decir, que la apoJ es mucho más abundante en las fracciones de LDL con mayor potencial aterogénico. Esta observación se presta a una doble interpretación. Por una parte, podría pensarse que la apoJ contribuye de alguna manera a la aterogenicidad de estas partículas. En contrapartida, también puede considerarse que su presencia es debida a que podría representar una función protectora frente a la modificación de la LDL. Considerando la función chaperona de la apoJ, uniéndose a los dominios hidrofóbicos de proteínas que quedan expuestos en su superficie durante su desnaturalización [87], es factible pensar que la apoJ se una preferentemente a la LDL(-) cuando estas partículas sufren algún tipo de modificación que estimule el proceso de agregación. El hecho de que el contenido en apoJ en la LDL(-) no agregada ya sea más elevado que en la LDL(+) indica que no es imprescindible que exista una agregación real de la LDL para la unión de la apoJ. Este hallazgo podría interpretarse como que la apoJ se uniría a zonas hidrofóbicas que se generan en la LDL(-) durante las fases más tempranas del proceso de agregación, previniendo que la agregación de la LDL llegue a ser efectiva. 1.2 CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DE LA LDL QUE CONTIENE apoJ (LDL/J+). Con el fin de confirmar la observación de un mayor contenido de apoJ en las fracciones de LDL(-), se utilizó la estrategia contraria, es decir, se aislaron las DISCUSIÓN 117 partículas de LDL con apoJ y se determinó si sus características se correspondían con las de las fracciones de LDL(-). Mediante cromatografía de afinidad se obtuvieron dos fracciones de LDL, la que no contiene apoJ (LDL/J-) (> 99.7%) y la que contiene apoJ (LDL/J+) (< 0.3%). El contenido de apoJ de estas subfracciones y de la LDL total fue comprobado por ELISA y Western blot. Las características físico-químicas de estas fracciones se estudiaron por varías técnicas, aunque debido a la pequeña cantidad de LDL/J+ no pudo realizarse un análisis más exhaustivo. La mayor parte de resultados indican un alto grado de similitud entre la agLDL(-) y la LDL/J+. Respecto a la composición lipídica, la LDL total y la LDL/Jpresentan una composición similar, mientras que la LDL/J+ contiene menos colesterol esterificado y más colesterol libre, triglicéridos, NEFAS y apoE, características que también comparte con la agLDL(-). La electroforesis de SDS-PAGE mostró la degradación de la apoB en la LDL/J+ apoJ, al igual que muestra la agLDL(-). En la electroforesis en gel de gradiente no desnaturalizante, tanto en la LDL como en la LDL/Jse muestra una única banda del monómero de LDL, mientras que en la LDL/J+ se aprecian dos bandas, la monomérica y una banda superior que indica agregación, es decir, conviven partículas mpnoméricas con partículas agregadas. Mediante microscopía electrónica se puede observar que la LDL/Jpresenta una composición de partículas monoméricas de un tamaño muy regular, mientras que la LDL/J+ presenta partículas muy heterogéneas en tamaño, estando algunas de ellas agregadas. No obstante, las partículas monoméricas siguen siendo las más abundantes. Esta observación está de acuerdo con la idea, planteada en el apartado anterior, de que la apoJ se une a partículas agregadas, pero también a partículas de LDL no agregadas. El análisis de la estructura de la apoB por dicroísmo circular (CD) y ATR-FTIR muestra que la LDL/J+ presenta una pérdida de estructura secundaria (disminución de señal en el espectro de CD, y desplazamiento del máximo en el ATR-FTIR), lo cual es compatible, tanto con DISCUSIÓN 118 una agregación parcial, como con alteraciones en la apoB que todavía no han dado lugar a agregación. 1.3 PAPEL DE LA apoJ EN LA AGREGACIÓN DE LA LDL. DEPLECIÓN DE LDL/J+. De los resultados discutidos anteriormente solo puede afirmarse que la apoJ es más abundante en las partículas de LDL agregadas, y aunque su presencia en LDLs no agregadas podría sugerir un papel preventivo en el proceso de agregación, no se puede saber cuál es su función específica. Por ello, fue necesario llevar a cabo experimentos para definir el papel proo anti-agregante de la apoJ. Sin embargo, la cantidad que se puede aislar de LDL/J+ es tan pequeña que evita un análisis detallado que permita determinar la función de la apoJ. En contrapartida, la coincidencia prácticamente total entre las características de la LDL total y la LDL/Jsi que permite hacer un análisis comparativo para determinar el efecto de la ausencia de apoJ sobre el proceso de agregación de la LDL. Para analizar el papel de la apoJ en la agregación de la LDL se indujo la agregación de la LDL total y la LDL/Jpor diferentes métodos, incluyendo agregación espontánea, lipólisis con esfingomielinasa (SMasa) y proteólisis con α -quimotripsina (α-CT). Con cualquiera de los métodos utilizados, y a pesar de que la cantidad de LDL/J+ en la LDL total es muy pequeña (siempre inferior al 0.3%), se vio que la LDL/Jes más susceptible a agregarse que la LDL total. Estos datos demuestran que, a pesar de su escasez, la apoJ juega un papel protector muy importante en el proceso de agregación de la LDL. Los análisis mediante CD y ATR-FTIR confirman que aumenta la agregación inducida con SMasa (disminución de señal en el CD y desplazamiento de máximo en ATR-FTIR) en la LDL/Jpero no en la LDL total. El hecho de que la disminución de la señal sea más acusada en la región de 208 nm, donde contribuye la -hélice, sugiere un enriquecimiento de estructura β de la apoB en la LDL/J-. DISCUSIÓN 119 Un aspecto no esperado de los resultados fue la observación en los geles de SDSPAGE de que en la LDL/Jla apoB es más susceptible a la degradación proteolítica que en la LDL total. Esto fue observado tanto cuando la proteólisis fue inducida por la α-CT, como cuando ésta se produjo de forma espontánea durante el tratamiento con SMasa. No conocemos el mecanismo por el cual la apoJ previene de la degradación a la apoB, pero,este hecho que podría estar involucrado en la prevención de la agregación de la LDL, ya que es bien sabido que la proteólisis de la apoB induce el proceso de agregación. 1.4 PAPEL DE LA apoJ EN LA AGREGACIÓN DE LA LDL. ADICIÓN DE apoJ. Para confirmar los resultados obtenidos en los experimentos de depleción de LDL con apoJ se hicieron los experimentos inversos, esto es, adicionando apoJ purificada de plasma en concentración fisiológica a LDL cuya agregación era inducida mediante tratamiento con α-CT y SMasa. Estos experimentos confirmaron el papel de la apoJ inhibiendo la agregación de la LDL. 1.5 FUNCIÓN ANTIATEROGÉNICA DE LA apoJ ASOCIADA A LA LDL. Los datos obtenidos en este primer artículo demuestran un papel protector de la apoJ en un aspecto clave en el desarrollo de la arteriosclerosis, como es la inhibición de la agregación de la LDL, considerado el evento inical que inicia el proceso arteriosclerótico. Esta función protectora la podría ejercer la apoJ en dos espacios bien diferenciados, la circulación plasmática y el espacio subendotelial. A nivel de de la circulación plasmática la apoJ podría evitar la formación de partículas agregadas de LDL, partículas que generalmente son lipoproteínas envejecidas que han sido modificadas por mecanismos que las hacen potencialmente más aterogénicas. Pero no solo puede ser importante la inhibición de la agregación de la DISCUSIÓN 120 LDL, sino que la apoJ podría jugar otro papel protector, que estaría mediado por su capacidad para facilitar el aclaramiento de los espacios extracelulares de proteínas desplegadas o desnaturalizadas. La apoJ tiene un dominio de unión al LRP2 (también conocido como megalina) un receptor de la familia del receptor de LDL, que facilita la internalización de los complejos apoJ/proteína desnaturalizada [134]. Este es el caso del péptido beta-amiloide en la enfermedad de Alzheimer. El LRP2 también participa en la internalización de complejos apoJ/leptina, regulando las vías de señalización de la leptina a nivel del hipotálamo [135]. Existen ciertas discrepancias respecto a si la apoJ es reconocida por otros receptores de la familia del receptor de LDL, pero no puede descartarse que otros receptores pudiesen estar implicados en el reconocimiento de los complejos apoJ/LDL. En cualquier caso, son necesarios estudios dirigidos a determinar si realmente la apoJ facilita el aclaramiento de partículas agregadas de LDL, tanto en circulación plasmática como en otros espacios fisiológicos. La función de la apoJ en el espacio subendotelial podría ser similar al descrito anteriormente, aunque en este caso es remarcable que la expresión de apoJ está aumentada en la pared arterial lesionada [133], siendo, quizás, un mecanismo para prevenir la agregación de partículas de LDL. Otro aspecto a considerar es que el LRP2 no es expresado por las células de la pared arterial, por lo que los complejos apoJ/LDL deberían ser internalizados por las células a través receptores alternativos. La identificación de estos posibles receptores requiere el desarrollo de futuros estudios. Aparte de nuestro estudio, únicamente otro grupo ha analizado previamente el efecto de la apoJ sobre la LDL (Schwartz et al) [124]. En este estudio los autores demuestran que la apoJ es capaz de inhibir el potencial citotóxico de LDL modificada enzimáticamente (E-LDL) mediante una combinación de proteasas (plasmina) y colesterol éster hidrolasa. La E-LDL tiene propiedades similares a la LDL que se encuentra en las lesiones arterioescleróticas con un contenido elevado de NEFAS y DISCUSIÓN 121 una gran degradación de la apoB, características que hemos visto en la LDL agregada que contiene apoJ. La E-LDL activa el complemento y promueve la formación de células espumosas. Schwartz et al demuestran que la apoJ se une a la E-LDL pero no a la LDL nativa, reduciendo la citotoxicidad de la E-LDL sobre células endoteliales. Además encontraron que en lesiones arterioescleróticas la apoJ se colocaliza con la E-LDL. Estas observaciones están de acuerdo con nuestros resultados en los que describimos que la apoJ se une a la LDL agregada con mucha mayor afinidad que a la LDL total. En conjunto estos datos indican que la expresión aumentada de apoJ en lesiones arterioescleróticas podría 1) inhibir el potencial citotóxico de la LDL modificada, 2) ser una respuesta inhibitoria a la agregación de la LDL, que es el primer paso de la aterogénesis, y 3) favorecer la captación celular de LDL agregada evitando su acumulación extracelular. La figura muestra esquemáticamente los posibles mecanismos protectores de la apoJ relacionados con la aterogenicidad de la LDL. DISCUSIÓN 128 CONCLUSIONES 129 CONCLUSIONES CONCLUSIONES 130 CONCLUSIONES 131 CONCLUSIONES 1La apoJ se une en la circulación plasmática a las partículas modificadas de LDL y preferencialmente a las partículas agregadas, posiblemente debido a su función como chaperona uniéndose a dominios hidrofóbicos. 2La apoJ juega un papel protector muy importante en el proceso de agregación de la LDL. El proceso de agregación de la LDL podría ser una diana terapéutica sobre la que actuar con péptidos miméticos derivados de la apoJ que podrían inhibir este proceso. 3Del total de la apoJ circulante un aproximadamente un 20% está asociado a las lipoproteínas y el 80% se encuentra en forma libre. De la apoJ unida a lipoproteínas la mayor parte se encuentra en la HDL, aproximadamente el 18%. 4La concentración de apoJ en suero es altamente dependiente del perfil lipoproteico, y está asociada positivamente con la concentración de colesterol y triglicéridos. Los pacientes hiperlipémicos presentan una concentración aumentada de apoJ. 5La distribución de apoJ en plasma es diferente en normolipemia e hiperlipemia. En pacientes normolipémicos un 30% de la apoJ está asociada a lipoproteínas, porcentaje que desciende en pacientes hiperlipémicos hasta un 17% en hipercolesterolémicos y un 15% en hipertrigliceridémicos. CONCLUSIONES 132 BIBLIOGRAFÍA 133 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 134 BIBLIOGRAFÍA 135 1. Ross, R., The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993. 362(6423): p. 801-9. 2. Ross, R., Atherosclerosis--an inflammatory disease. N Engl J Med, 1999. 340(2): p. 115-26. 3. Boren, J., et al., Identification of the principal proteoglycan-binding site in LDL. A single-point mutation in apo-B100 severely affects proteoglycan interaction without affecting LDL receptor binding. J Clin Invest, 1998. 101(12): p. 265864. 4. Lusis, A.J., Atherosclerosis. Nature, 2000. 407(6801): p. 233-41. 5. Glass, C.K. and J.L. Witztum, Atherosclerosis. the road ahead. Cell, 2001. 104(4): p. 503-16. 6. Parets, A.D. and D. Adlersberg, Hereditary hypercholesterolemia; a factor in the genesis of coronary atherosclerosis; studies of patients under age of 50. J Clin Invest, 1948. 27(4): p. 551. 7. Wieland, H., et al., Serum lipoproteins and coronary artery disease (CAD). 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