"Neurotoxicidade da Dopamina e dos seus Conjugados. Estudos In Vitro em Neurónios Dopaminérgicos Humanos SH-SY5Y, e In Vivo em Ratos Sprague-Dawley"

I Síl ia Alexand a Mo ei a Mon ei o Neu o oxicidade da dopamina e dos seus conjugados. Es udos in i o em neu ónios humanos dopaminé gicos SH-SY5Y e in i o, em a os Sp ague-Dawley. Disse ação de Mes ado em Toxicologia Analí ica Clínica e Fo ense T abalho ealizado sob a o ien ação do P o esso Dou o João Paulo Capela E co-o ien ação do P o esso Dou o Félix Dias Ca alho Se emb o de 2010 II É au o izada a ep odução pa cial des a disse ação, apenas pa a e ei os de in es igação, median e decla ação esc i a do in e essado, que a al se comp ome e. III “I am among hose who hink ha science has g ea beau y. A scien is in his labo a o y is no only a echnician: he is also a child placed be o e na u al phenomena which imp ess him like a ai y ale.” Ma ie Cu ie IV V Dedico es e abalho À minha amília, Aos meus e dadei os amigos, Às pessoas que me de am apoio, À amília de U bino e Ao Supe Má io….. Foi mais 1UP! I dedica e his wo k To my Family, To my ue iends, To he pe sons who suppo ed me, To my amily in U bino and To Supe Ma io….. I ’s ano he 1UP! VI VII RESUMOS VIII IX RESUMO A Doença de Pa kinson (DP) é a segunda doença neu odegene a i a mais comum e a deso dem do mo imen o mais equen e. É diagnos icada com base na p esença dos ês sin omas mo o es mais signi ica i os: b adicinesia ou acinesia, igidez muscula e emo es em epouso. A DP é ca ac e izada pela neu odegene ação especí ica da subs ância neg a acompanhada pela diminuição signi ica i a da dopamina em odos os componen es dos gânglios basais e pela p esença de co pos de Lewi. A doença é de e iologia desconhecida mas pensa-se que a dis unção mi ocond ial, a dis unção p o eossomal e o s essee oxida i o possam es a en ol idos na pa ogénese da DP. Além disso, o am já descobe as algumas al e ações gené icas que le am ao apa ecimen o dos sin omas. Os neu ónios dopaminé gicos são sensí eis à neu odegene ação po á ios mo i os elacionados com a p esença da dopamina, incluindo a o mação de conjugados com a glu a iona e a cis eína, que se conside am neu o óxicos: 5-S-glu a ionildopamina, 5-S- cis einildopamina e 5-S-N-ace ilcis einildopamina. O objec i o des e abalho oi a alia a neu o oxicidade e possí eis mecanismos de oxicidade da dopamina, do seu p ecu so L-DOPA, do me aboli o da dopamina DOPAC, e dos seus conjugados 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, nas concen ações de 10, 100, 500 e 1000 M e empos de exposição de 24, 48 e 72h, na linha celula di e enciada de neu ónios dopaminé gicos humanos SH-SY5Y. Além disso, oi es ada a neu o oxicidade do 5-S-NAC-DA quando injec ada in aes ia almen e a dose de 4,26 ng em a os Sp ague-Dawley com 7 dias, e o seu possí el mecanismo de oxicidade. Es a disse ação mos ou pela p imei a ez que odos os compos os es udados são neu o óxicos nas células dopaminé gicas SH-SY5Y de uma o ma dependen e do empo e da concen ação. Além disso a aliou-se o po encial neu op o ec o da N-ace ilcis eína (NAC) e e i icou-se que a adição p é ia de NAC às cul u as celula es p e eniu em la ga medida a neu o oxicidade dos compos os es udados indicando que in i o o mecanismo de oxicidade des es inclui o s esse oxida i o. Pa a a alia o papel do s esse oxida i o no p ocesso de neu o oxicidade, os ní eis de glu a iona (GSH) in acelula o am de e minados, assim como oi usada a bu ionina sul oximina (BSO), um inibido da enzima limi an e na sín ese de GSH, a γ- glu amilcis eína sin e ase. Como espos a ao insul o de algumas das concen ações dos XVI 2.2.6. Neu oin lamação ............................................................................................... 29 3.IMPORTÂNCIA DA DOPAMINA NA GÉNESE DA DOENÇA DE PARKINSON ........... 30 3.1. Sín ese da Dopamina .......................................................................................... 30 3.2. Me abolismo da Dopamina ................................................................................. 31 3.3. Relação en e a Dopamina e a α-Sinucleina na Génese da Doença de Pa kinson.. .......................................................................................................... 33 3.4. Impo ância da Dopamina e dos seus Conjugados na Génese da Doença de Pa kinson ............................................................................................................ 35 3.4.1. Conjugação da Dopamina com a Glu a iona .................................................... 37 4.MODELOS PARA O ESTUDO DA DOENÇA DE PARKINSON .................................... 45 4.1. Modelos Fa macologicamen e Induzidos ............................................................ 45 4.1.1. α-Me il-p- i osina e Rese pina ........................................................................... 45 4.1.2. 6-Hid oxidopamina ............................................................................................ 46 4.1.3. MPTP ................................................................................................................ 46 4.1.4. Ro enona .......................................................................................................... 48 4.1.5. Pa aqua o ......................................................................................................... 49 4.1.6. An e aminas ...................................................................................................... 50 4.2. Modelos Celula es in i o ................................................................................... 50 4.2.1. Cul u a P imá ia de Neu ónios Dopaminé gicos ............................................... 51 4.2.2. Cul u a de Células Imo alizadas ...................................................................... 51 4.2.3. Linha Celula SH-SY5Y .................................................................................... 53 4.3. Modelos Animais ....................................................................................................................... 55 5.OBJECTIVOS ................................................................................................................ 58 CAPÍTULO II: COMPONENTE EXPERIMENTAL ............................................................ 59 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 61 1. Ma e iais ...................................................................................................................................... 61 2. Sín ese dos Conjugados da Dopamina ............................................................... 61 3. Mé odos in i o ................................................................................................... 63 3.1. Cul u a Celula .................................................................................................. 63 3.2. De e minação da Viabilidade Celula ................................................................ 63 3.3. Doseamen o da Glu a iona ............................................................................... 64 3.4. Análise Es a ís ica ............................................................................................ 65 4. Mé odos in i o .......................................................................................................................... 65 4.1. T a amen o Animal e Adminis ação de Iode o de P opídio ............................. 65 XVII 4.2. Wes e n Blo ing ............................................................................................... 66 4.3. Imunohis oquímica ............................................................................................ 68 4.4. Análise Es a ís ica ............................................................................................ 68 RESULTADOS EXPERIMENTAIS .................................................................................... 69 1. Resul ados das Expe iências in i o com as Células SH-SY5Y .............................. 69 1.1. Ci o oxicidade da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC- DA ..................................................................................................................... 69 1.2. Ní eis de GSH In acelula após Exposição aos Compos os DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA .......................................... 73 1.3. E ei o do P é- a amen o com NAC e BSO na Ci o oxicidade da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA .......................................... 77 1.4. E ei o do P é- a amen o com NAC e BSO nos Ní eis de GSH In acelula .... 81 1.5. Obse ação mic oscópica das células SH-SY5Y ............................................. 84 2. Resul ados das Expe iências in i o nos Ra os Sp ague-Dawley ............................ 86 2.1. Mo e celula p o ocada pelo conjugado 5-S-NAC-DA .................................... 86 2.2. Exp essão da caspase-3, p17, α-espec ina e PKCα no Es iado .................... 89 CAPÍTULO III: DISCUSSÃO E CONCLUSÕES .............................................................. 91 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 93 1. Discussão dos Resul ados das Expe iências in i o com as Células Sh-SY5Y 93 2. Discussão os Resul ados das Expe iências in i o com os Ra os Sp ague- Dawley .............................................................................................................. 101 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 104 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 105 XVIII XIX ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1 - DIFERENÇAS NA ACTIVIDADE DDOS GB NUM INDÍDULO NORMAL (A) E NUM INDIVÍDUO COM DP (B).. ............................................................................................... 11 FIGURA 2 – POSSÍVEIS MECANISMOS DE INFLUÊNCIA DA DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL NA APOPTOSE . ................................................................................................................. 20 FIGURA 3 - PRODUÇÃO DE H2O2 PELA ACTIVIDADE DA SOD (A) E DA MAO (B). ..................... 22 FIGURA 4 - REACÇÕES POSSÍVEIS PARA A ORIGEM DE ROS NOS NEURÓNIOS DOPAMINÉRGICOS. ................................................................................................................................... 23 FIGURA 5 - FACTORES QUE PODEM CONTRIBUIR PARA A NEURODEGENERAÇÃO DA DP, ENVOLVENDO O STRESSE OXIDATIVO.. ........................................................................... 24 FIGURA 6 - CONVERSÃO DA DOPAMINA EM AMINOCROMO. .................................................... 28 FIGURA 7 - ESTRUTURA QUÍMICA DA DOPAMINA. ................................................................... 30 FIGURA 8 - SÍNTESE DAS CATECOLAMINAS. .......................................................................... 31 FIGURA 9 – VIAS METABÓLICAS DA DA ................................................................................. 32 FIGURA 10 - POSSÍVEIS INTERACÇÕES ENTRE A DA E A AS NA GÉNESE DA DP . .................... 34 FIGURA 11- POSSÍVEIS MECANISMOS DE TOXICIDADE DA DOPAMINA E DOS SEUS PRODUTOS QUINÓNICOS NOS NEURÓNIOS DOPAMINÉRGICOS. .......................................................... 36 FIGURA 12 - METABOLISMO DA DA PELA VAM. .................................................................... 39 FIGURA 13 - METABOLISMO DA DA E DOPAC PELA VAM. .................................................... 40 FIGURA 14 – AUTO-OXIDAÇÃO DA 6-OHDA . ........................................................................ 46 FIGURA 15 - ESTRUTURA QUÍMICA DO MPTP (A), DO IÃO MPP+ (B) E DO MPPP (C). ........... 47 FIGURA 16 - ESTRUTURA QUÍMICA DA ROTENONA. ................................................................ 48 FIGURA 17 - CICLO REDOX DO PARAQUATO . ........................................................................ 49 FIGURA 18 - ESTRUTURA QUÍMICA DA METANFETAMINA. ....................................................... 50 FIGURA 19 - NÍVEL A 4110 DO MAPA ESTEREOTÁXICO DE KÖNIG E KEPPEL, MARCADO COM OS 3 NÍVEIS CONSIDERADOS DO ESTRIADO PARA A CONTAGEM DE CÉLULAS PI-POSITIVAS (A, B E C).. ........................................................................................................................... 66 FIGURA 20 – VIABILIDADE DAS CÉLULAS SH-SY5Y APÓS EXPOSIÇÃO AOS DIFERENTES COMPOSTOS AVALIADA PELO ENSAIO MTT. OS DADOS SÃO APRESENTADOS COMO PERCENTAGEM DE CONTROLO, AO QUAL FOI ATRIBUÍDO O VALOR DE 100% (N=18 DE 3EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ................................................................................ 70 FIGURA 21 - PERCENTAGEM DE MORTALIDADE CELULAR APÓS EXPOSIÇÃO DAS CÉLULAS SH- SY5Y AOS DIFERENTES COMPOSTOS. OS DADOS SÃO APRESENTADOS COMO XX PERCENTAGEM DO RÁCIO ENTRE A ACTIVIDADE DA LDH EXTRACELULAR E DA LDH TOTAL (N=18 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ................................................................ 72 FIGURA 22 – NÍVEIS DE GSH INTRACELULAR E CONTEÚDO PROTEICO DAS CÉLULAS SH-SY5Y, 24H APÓS A EXPOSIÇÃO ÀS CONCENTRAÇÕES DE 10, 100, 500 E 1000 µM DOS COMPOSTOS. OS DADOS DE CONCENTRAÇÃO INTRACELULAR DE GSH ENCONTRAM-SE NORMALIZADOS DE ACORDO COM O CONTEÚDO PROTEICO. OS DADOS DO CONTEÚDO PROTEICO SÃO APRESENTADOS COMO PERCENTAGEM DO RESPECTIVO CONTROLO, AO QUAL FOI ATRIBUÍDO O VALOR DE 100% (N=9 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ...... 76 FIGURA 23 - EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO COM COM NAC (1 MM) E BSO (25 µM) NA NEUROTOXICIDADE INDUZIDA PELA EXPOSIÇÃO DURANTE 24H À CONCENTTRAÇÃO DE 500 µM DOS DIVERSOS COMPOSTOS (N=9 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). ................. 80 FIGURA 24 – CONCENTRAÇÃO DE GSH INTRACELULAR AQUANDO DA INCUBAÇÃO DOS COMPOSTOS EM ESTUDO COM O PRÉ-TRATAMENTO COM NAC E BSO (N=9 DE 3 EXPERIÊNCIAS INDEPENDENTES). .................................................................................. 83 FIGURA 25 – FOTOGRAFIAS DAS CÉLULAS SH-SY5Y OBTIDAS NO MICROSCÓPIO INVERTIDO DE CONSTRASTE DE FASE APÓS 24H DE EXPOSIÇÃO AOS COMPOSTOS NA CENCENTRAÇÃO DE 500 M (AMPLIAÇÃO 400X), SEM OU COM PRÉ-INCUBAÇÃO COM NAC (1MM). ................ 85 FIGURA 26 - MARCAÇÃO DAS SECÇÕES DO ESTRIADO COM PI VISUALIZADA EM FOTOGRAFIAS DE MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA (AMPLIAÇÃO 100X). AS SECÇÕES ESTRIATAIS DOS ANIMAIS FORAM OBTIDAS APÓS INJECÇÃO INTRA-ESTRIATAL COM 5-S-NAC-DA OU APENAS PBS.. .......................................................................................................................... 87 FIGURA 27 - NÚMERO DE CÉLULAS PI-POSITVAS NOS ANIMAIS CONTROLO (N=5) E TRATADOS COM 5-S-NAC-DA (N=5) (A) E NÚMERO DE CÉLULAS PI-POSITIVAS EM 3 DIFERENTES ÀREAS DO ESTRIADO (A. B E C) DOS ANIMAIS CONTROLO (N=5) E TRATADOS COM 5-S- NAC-DA (N=5) (B). ...................................................................................................... 88 FIGURA 28 - CO-LOCALIZAÇÃO DA MARCAÇÃO COM PI (VERMELHO) E NEUN (VERDE) VISUALIZADA EM FOTOGRAFIAS DE MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA (AMPLIAÇÃO 100X). AS SECÇÕES ESTRIATAIS DOS ANIMAIS FORAM OBTIDAS APÓS INJECÇÃO INTRA-ESTRIATAL COM 5-S-NAC-DA OU APENAS PBS, NO CASO DOS OS ANIMAIS CONTROLO. .................. 88 FIGURA 30 - EXPRESSÃO DA CASPASE-3 (CPP32), CASPASE-3 CLIVADA (P17) (A), DE Α- ESPECTRINA E DE PKCΑ (B) NO ESTRIADO DOS ANIMAIS CONTROLO INJECTADOS COM PBS (N=5) E ANIMAIS TRATADOS COM 5-S-NAC-DA (N=5).. .................................................. 90 XXI ÍNDICE DE TABELAS TABELA 1 - PREVALÊNCIA E INCIDÊNCIA DA DP, EM VÁRIOS ESTUDOS (N), EM VÁRIOS GRUPOS ETÁRIOS (MÉDIA±DESVIO PADRÃO) (ADAPTADO DE TABA ET AL, 2004). ............................ 7 TABELA 2 - SINTOMAS NÃO MOTORES DA DOENÇA DE PARKINSON (ADAPTADO DE CHAUDHURI ET AL, 2005). ................................................................................................................. 9 TABELA 3 - COMPONENTES DOS CL (ADAPTADO DE DICKSON, 2008). ................................... 17 TABELA 4 - ALTERAÇÕES GENÉTICAS COM RELEVÂNCIA NA DP. ............................................ 26 TABELA 5 – SISTEMAS DE CULTURA DE NEURÓNIOS DOPAMINÉRGICOS. AMP – ADENOSINA MONOFOSFATO, AS – Α-SINUCLEÍNA, BDNF – FACTOR NEUROTRÓFICO, D2R – RECEPTOR DA DA, DA – DOPAMINA, DAT – TRANSPROTADOR DA DA, GDNF – FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DAS CÉLULAS DA GLIA, METH – METANFETAMINA, RA – ÁCIDO RETINÓICO, TH – TIROSINA HIDROXILASE (ADAPTADO DE FALKENBURGER E SCHULZ, 2006). ......................................................................................................................... 52 TABELA 6 – EXEMPLOS DE ESTUDOS QUE ENVOLVEM O USO DE NEUROTÓXICOS EM ROEDORES COMO MODELO DE ESTUDO PARA A DP (ADAPTADO DE EMBORG ET AL, 2004). ............... 56 XXII XXIII LISTA DE ABREVIATURAS XXIV XXV LISTA DE ABREVIATURAS AIF – ac o iniciado da apop ose ALDH – aldeído desid ogenase ALR – aldeído edu ase AMPA – α-amino-3-hid oxil-5-me il-4-isoxazole-p opiona o AMPT – α-me il-p- i osinase AS – α-sinucleína ATP – adenosina i- os a o BHE – ba ei a hema oence álica BSA – albumina de so o bo ino BSO – bu ionina sul oximina CL – co pos de Lewi CNAT – N-ace il ans e ase de conjugados de S-cis eína COMT – ca ecol-O-me il ans e ase DA – dopamina DAT – anspo ado da dopamina DDC – 3,4-dihid oxi enilalanina desca boxilase DMEM – meio de Eagle modi icado po Dubelcco DOPAC – ácido 3,4-dihid oxi enilacé ico DOPAL – 3,4-dihid oxi enilace aldeído DOPET – 3,4-dihid o enile anol DP – doença de Pa kinson DHBT – dihid obenzo iazina 4 1. DOENÇA DE PARKINSON 1.1. Pe spec i a His ó ica Os p imei os ela os de sin omas que hoje são associados ao pa kinsonismo da am de 5000 A.C. e são p o enien es da Índia. A doença a que os médicos Ayu édicos designa am de Kampa a a, e a a ada com Mucuna p u iens, uma plan a da amília das abáceas e de nome comum “ eijão a eludado”. Es a plan a é a única on e na u al conhecida de le odopa (L-DOPA), o p ecu so di ec o da dopamina (DA) (3). Ao longo dos séculos o am desc i os sin omas que incluem emo es in olun á ios e pos u as não con encionais. Desde a An iga G écia, passando pelo Impé io Romano, pelos esc i os bíblicos e pela Ilíada de Home o, a é a um passado mais ecen e, onde pe sonalidades conhecidas de á ias á eas de es udo dão o seu con ibu o pa a o conhecimen o do pa kinsonismo, incluindo Leona do da Vinci e William Shakespea e. En e as pe sonalidades mais ma can es da desc ição o mal dos sin omas ligados às deso dens do mo imen o, des acam-se F anciscus de le Böe, F ançois de la C oix e Wilhelm on Humbold . Es e úl imo desc e e nas suas ca as os seus p óp ios sin omas e condição clínica, uma desc ição mui o comple a do que são os sin omas da DP (4). A p imei a desc ição o mal da doença encon a-se na monog a ia “An Essay on The Shaking Palsy”, esc i a po James Pa kinson e publicada em 1817, um médico que desc e e com igo a his ó ia clínica e os sin omas do pa kinsonismo, baseando-se somen e nas suas obse ações (5). Foi em 1861/62, que Jean-Ma in Cha co jun amen e com Al ed Vulpian, desc e em pela p imei a ez, de o ma exaus i a, os sin omas do pa kinsonismo e que a sínd ome an e io men e es udada po Pa kinson é o malmen e econhecida como uma condição pa ológica, adqui indo o nome de doença de Pa kinson (6). Ao longo do empo, Cha co disc imina a di e ença en e b adicinesia e igidez (sin omas mais equen emen e associados à DP), egis a a equência dos emo es, econhece a mic og a ia como uma ca ac e ís ica comum a odos os doen es, e p esc e e os p imei os a amen os (7). Só na década de 50 já no século XX são iden i icadas, po A id Ca lsson, as p imei as al e ações bioquímicas no cé eb o que conduzem à doença. Ca lsson demons ou que a 5 DA é um neu o ansmisso do sis ema ne oso cen al (SNC) e não só um p ecu so da no ad enalina, como se pensa a an e io men e. Ao usa o á maco ese pina (que p o oca a depleção das esículas neu onais das ca ecolaminas) em animais de labo a ó io, e i icou que os ní eis de DA dec escem signi ica i amen e, o que p o oca sin omas semelhan es aos da DP, e admi e a possibilidade da adminis ação de L-DOPA aos doen es pa a o con olo dos sin omas (8). Desen ol eu ainda um mé odo que possibili a a de e minação da concen ação de DA no cé eb o e descob e que es e neu o ansmisso se encon a em ele adas concen ações numa zona ce eb al especí ica, in imamen e elacionada com o mo imen o, os gânglios da base (GB) (9). De ido ao seu abalho, Ca lsson iden i icou a p imei a causa isiopa ológica da DP, e ecebe o P émio Nobel da Medicina e Fisiologia em 2000. As descobe as de A id Ca lsson le a am a que ou os médicos po odo o mundo p esc e essem L-DOPA aos seus pacien es pa a alí io dos sin omas da doença. Nes a ase, des aca-se Geo ge C. Co zias, que adequa a posologia da L-DOPA, com con olo signi ica i o da sin oma ologia e p og essão da doença (10). Na década de 70, oi desen ol ido o p imei o medicamen o cons i uído pela combinação de 2 á macos: L-DOPA e ca bidopa (inibido do me abolismo pe i é ico da L-DOPA). Es a combinação é mais e icaz no a amen o da sin oma ologia, aumen ando a axa de con e são da L-DOPA em DA ao ní el ce eb al (11). Em 1991, es e p odu o é ap o ado pela FDA e e oluciona o a amen o sin omá ico da doença. 1.2. Epidemiologia A DP é conside ada a deso dem do mo imen o que a ec a mais indi íduos em odo o mundo e a segunda doença neu odegene a i a mais comum (sendo a p imei a a doença de Alzheime ). Es ima-se a p e alência da doença en e 1 e 2% da população mundial com mais de 65 anos e 3 a 5% dos indi íduos com mais de 85 anos (12) num o al de 4 milhões de pessoas em odo o mundo (13). Em 2006, a OMS es ima a a incidência da DP en e 4,5 a 10 no os casos po 100.000 indi íduos; es e alo ajus ado pa a a idade da população em ques ão, a ia en e os 9,7 e 13,8. Es ima a-se a p e alência da doença en e 72 e 258,8 casos po 100.000 indi íduos (2). 6 A p e alência é in luenciada pela equência de oco ência da doença (incidência) e pela axa de sob e i ência dos indi íduos. Numa compilação de es udos ob idos ao longo do empo, em á ios países dos á ios con inen es, a p e alência b u a a ia en e 31 e 201 po 100.000 indi íduos e a p e alência ajus ada à idade da população a ia en e 60 e 190. A incidência b u a a ia en e 1,5 e 22 po 100.000 e a incidência ajus ada a ia en e 0,9 e 19 po 100.000 indi íduos (14). De no a que, apesa de se uma doença global, pa ecem ha e di e enças de incidência e p e alência en e di e en es egiões, que podem se de idas a á ios ac o es: idade da população em es udo, c i é ios de diagnós ico da doença, mé odos de análise e ac o es gené icos e ambien ais. É impo an e e em con a os ac o es elacionados com os se iços de saúde, p incipalmen e na es ima i a da p e alência (15). Es udos ecen es apon am pa a uma p e alência mais ele ada em caucasianos, eu opeus e no e-ame icanos, média nos asiá icos da China e Japão e mais baixa nos neg os a icanos. Além disso, pa ece e iden e que nos países mais desen ol idos onde a população idosa é maio , a incidência da doença seja supe io em elação aos países menos desen ol idos (2). Ao longo do empo, com o c escen e aumen o da espe ança de ida e da idade da população, a incidência em endência a aumen a . De ido à melho ia da qualidade de ida po ia da in odução e uso de á macos que isam o con olo dos sin omas da doença, jun amen e com o apoio social p es ado aos doen es, a p e alência ap esen a a mesma endência. Desde o nascimen o a é à mo e, a p obabilidade de um indi íduo desen ol e PD é de 2% nos homens e 1,3% nas mulhe es (a p obabilidade do apa ecimen o dos sin omas de pa kinsonismo é ligei amen e maio ) e o isco aumen a ao longo da ida, com a idade (16) (Tabela 1). 7 Tabela 1 - P e alência e incidência da DP, em á ios es udos (n), em á ios g upos e á ios (Média±des io pad ão) (adap ado de Taba e al, 2004). G upos e á ios 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 P e alência 9,27 12,27 (11) 37,2 35,21 (19) 131,28 78,2 (25) 385,56 182,89 (25) 787,17 456,52 (24) 1142,9 881,73 (22) Incidência 0,78 0,53 (8) 2,93 1,93 (9) 14,94 7,13 (12) 45,98 23,94 (12) 95,43 33,82 (12) 101,10 73,85 (12) Rela i amen e à sin oma ologia, as mulhe es pa ecem e maio p opensão pa a a ins abilidade pos u al, incapacidade de desempenha a e as diá ias e pa a a dep essão, enquan o os homens são mais p edispos os pa a os dis ú bios do sono (17). Além disso, pa ecem exis i di e enças de géne o ao ní el do me abolismo na á ea ce eb al dos GB (18). A mo alidade da DP é di ícil de de e mina pois a doença não é, no malmen e, a causa di ec a da mo e, mas sim os sin omas da doença que diminuem a espe ança de ida (como po exemplo, a p opensão pa a as quedas) (19). Em Po ugal, um es udo de Dias e colabo ado es ealizado em 1992 concluiu que, num o al de 219.928 indi íduos analisados, o am iden i icados 291 casos de DP, es imando- se uma p e alência em 130 doen es po 100.000 indi íduos (20). 1.3. Sin oma ologia O diagnós ico da DP é no malmen e a dio, de ido à inespeci icidade dos sin omas inicias que incluem do es a iadas, dis ú bios do sono, ansiedade e dep essão, mo imen os mais len os em a e as de o ina (po exemplo, di iculdade a es i ) e ma cha mais len a. Mais a de, com o ag a amen o dos sin omas, o indi íduo oma o p imei o con ac o com o médico, o nando-se já e iden es os emo es, a di iculdade em i a -se e baixa -se, o passo i egula , o discu so mais len o e a mic og a ia, odos eles sinais ca ac e ís icos da DP (21). Os c i é ios mundialmen e usados pa a o diagnós ico co ec o da DP são aqueles desc i os pelo UKBB (UK Pa kinson’s Disease Socie y B ain Bank) e pelo NINDS 8 (Na ional Ins i u e o Neu ological Diso de s and S oke), es imando-se que 90% dos diagnós icos baseados nes es c i é ios es ejam co ec os (12). 1.3.1. Sin omas Mo o es Os p incipais sin omas mo o es da DP e os mais signi ica i os são: b adicinesia ou acinesia, igidez muscula e emo es em epouso. Es es são equen es en e os doen es de Pa kinson e causado as do aumen o da mo bilidade e mo alidade elacionada com a doença (22). Os sinais mais ca ac e ís icos da b adicinesia são o balancea ano mal dos memb os supe io es du an e a ma cha, edução da equência de pes aneja e a di iculdade em deglu i . Os doen es de Pa kinson ap esen am amimia ( eduzida exp essão acial) e um discu so monó ono (discu so sussu ado, ápida sequência de sílabas a baixo olume) e azem pouco uso dos b aços du an e a ala. Nos memb os supe io es, a b adicinesia é acilmen e iden i icada pelo apa ecimen o da mic og a ia (22). Os doen es sen em di iculdade em desempenha mo imen os “ inos” (po exemplo, abo oa -se), em execu a mo imen os de o ação co po al (po exemplo, i a -se na cama) e e gue -se de posições sen adas ou baixas. Du an e a ma cha, ap esen am di iculdade em inicia o mo imen o, len idão e dão passos pequenos, que jun amen e com a pos u a desequilib ada e insegu a dão o igem a quedas. A igidez muscula es á elacionada com o aumen o do ónus muscula , jun amen e com a diminuída capacidade de elaxamen o, associada à esis ência de mo imen os impos a an o pelos músculos lec o es como ex enso es (21). Na DP, os emo es são mais usuais em posições de epouso, nos memb os supe io es, a ec ando ambém os memb os in e io es e a cabeça, embo a menos equen emen e. Os emo es nos memb os supe io es encon am-se diminuídos du an e as acções olun á ias, pa icula men e ao es ica os b aços. O enómeno de emo pa ece e o igem na al e nância en e ciclos de con acção e descon acção nos músculos, po sua ez causada pela ac i idade oscila ó ia dessinc onizada dos GB (22). 9 1.3.2. Sin omas Não Mo o es Ao con á io dos sin omas mo o es da DP, os sin omas não mo o es são pouco especí icos e mui as ezes não co elacioná eis com a doença. Os sinais não mo o es são á ios, podendo es a elacionados com o sis ema ne oso au ónomo ou com sis ema cogni i o (Tabela 2) (23). Tabela 2 - Sin omas não mo o es da doença de Pa kinson (adap ado de Chaudhu i e al, 2005). Sin omas Neu opsiquiá icos Dep essão, apa ia, ansiedade Anedonia Dé ices de a enção Alucinações Delí ios Demência Compo amen o obsessi o Deso dens do sono (sonolência e/ou insónias) Sin omas do sis ema au ónomo Dis ú bios enais Noc ú ia U gência em u ina Al e ações de equência de micção Sudo ese Hipo ensão o os á ica Quedas elacionadas com a hipo ensão o os á ica Do es muscula es Dis unções sexuais Hipe sexualidade Impo ência sexual Hipossec eção de es os e ona Sin omas gas oin es inais Baba Ageusia Dis agia Re luxo gas o-eso ágico Vómi os Náuseas Obs ipação Incon inência ecal Sin omas senso iais Do Pa es esia Dis ú bios ol ac i os Ou os sin omas Fadiga Diplopia Visão des ocada Sebo eia Pe da de peso Disa ia 10 1.4. In luência da Neu o ansmissão Dopaminé gica na Doença de Pa kinson Além das á eas co icais ce eb ais pa a o con olo das ac i idades muscula es, duas ou as es u u as são essenciais pa a a unção mo o a: o ce ebelo e os GB. Es as não uncionam isoladamen e, mas in e agem en e si e com ou os sis emas. O ce ebelo é a á ea ce eb al que auxilia a colocação em sequência das ac i idades mo o as e az ajus es co ec i os nessas ac i idades à medida que são execu adas, pa a que sejam ealizadas de aco do com os sinais en iados pelo có ex ce eb al e de ou as pa es do cé eb o. Os GB localizam-se em á eas p óximas do álamo, ocupando uma pa e signi ica i a das egiões in e io es de ambos os hemis é ios ce eb ais. Os GB incluem as seguin es egiões ana ómicas: es iado, o globo pálido, o núcleo subs alámico e a SN (24). Exis e um g ande núme o de pa ologias associadas a es a zona ce eb al, e elacionadas com os neu ónios dopaminé gicos, ca ac e izadas po um lado pelo excesso ou es ição do mo imen o, às quais a comunidade cien í ica designa de deso dens do mo imen o. Exis em ês classes de pa ologias des e ipo: as hipe ciné icas, hipociné icas e dis onias. As doenças hipe ciné icas são ca ac e izadas pelo excesso de mo imen os incon olá eis e ac os mo o es ápidos. Os mo imen os ano mais são a enuados pela adminis ação de an agonis as dos ecep o es da DA e exace bados po agonis as da DA, ou seja, um p o á el excesso de es imulação dopaminé gica es á associado a es e ipo de doenças, das quais é exemplo a doença de Hun ing on. As doenças hipociné icas de em-se à pe da da capacidade de neu o ansmissão dopaminé gica, cujo exemplo mais conhecido é a DP. O úl imo ipo de deso dens do mo imen o é as dis onias, cujo sin oma mais ma can e é a pa agem dos mo imen os du an e uma acção, de ido a con acções muscula es in olun á ias, len as e epe i i as, como na pa alisia sup anuclea p og essi a (25). Os sin omas da DP êm o igem na neu odegene ação dos neu ónios dopaminé gicos (neu ónios p odu o es do neu o ansmisso DA), cujos co pos celula es se localizam na SN e os axónios libe am DA no pu amen e núcleo caudado – designado co po es iado (CS) ou nig oes iado. O CS é a p incipal zona de ecepção da in o mação neu onal p o enien e dos GB, po ês ias di e en es: co icoes ia al, alamoco ical e a nig os ia al (aquela que é mais a ec ada pela neu odegene ação na DP). A ia dopaminé gica nig oes ia al con ém 11 neu ónios dopaminé gicos cujos co pos celula es, localizados na SN (assim denominada de ido à concen ação ele ada de neu omelanina (NM)), en iam axónios pa a o CS (26). A in o mação neu onal é p ocessada nos ci cui os dos GB, en iada pa a o álamo e daí pa a o có ex ce eb al. A in o mação p ocessada no CS pode se ansmi ida aos GB pela ia di ec a ou indi ec a. A ia di ec a, ao inibi os GB, le a à inibição do álamo e à exci ação do có ex ce eb al. A ia indi ec a, ao inibi os GB, p omo e a exci ação de cen os ne osos que conduzem es ímulos à medula espinal (Figu a 1A). Na DP, a inexis ência de ansmissão dopaminé gica p o enien e da SN pode le a à inibição excessi a dos GB e do álamo, p o ocando a diminuição da es imulação do có ex mo o e o apa ecimen o de b adicinesia ou acinesia (Figu a 1B) (27). Figu a 1 - Di e enças na ac i idade ddos GB num indídulo no mal (A) e num indi íduo com DP (B). Se as p e as ep esen am es ímulos exci a ó ios, se as cinzen as ep esen am es ímulos inibi ó ios. GPe - globo pálido ex e no, GPi - globo pálido in e no, NST – núcleo sub alámico, SNc – subs ância neg a pa s compac a, SN – subs ância neg a pa s e icula a (adap ado de Gal an e al, 2008). O pa kinsonismo pa ece se uma deso dem complexa, na qual a ac i idade ano mal de alguns g upos neu onais dos GB a ec a g andemen e a exci abilidade, a ac i idade oscila ó ia, a sinc onia e as espos as sensó ias do có ex ce eb al en ol ido no planeamen o e execução do mo imen o, assim como no sis ema senso ial (27). 12 1.5. In luência de Ou os Neu o ansmisso es na Doença de Pa kinsom A maio ia dos es udos exis en es elacionam a pe da de neu o ansmissão dopaminé gica com o apa ecimen o de sin omas mo o es, mas os sin omas não mo o es ca ac e ís icos da DP podem es a associados a ou os sis emas de neu o ansmissão. Os GB dependem da ac i idade de á ios neu o ansmisso es, que podem con ibui pa a as di e sas dis unções associadas à DP. De ac o, os GB es ão não só elacionados com a unção mo o a mas ambém com as unções cogni i as e com o compo amen o emocional (28). As elações neu onais exis en es en e o có ex e os GB (pa icula men e o CS) pa ecem es a en ol idas na modulação da in o mação cogni i a (29), na ap endizagem, na memó ia (30), nas espos as pa lo ianas (31) e no compo amen o associado às d ogas de abuso (32). 1.5.1. Neu o ansmissão Coliné gica A unção mo o a do CS es á dependen e do equilíb io en e a concen ação de DA e ace ilcolina e a dis unção desse equilíb io con ibui pa a o apa ecimen o da DP (33). Além disso, a dis unção cogni i a nes es doen es es á elacionada com a neu o ansmissão coliné gica. Nos pacien es com DP oi de ec ada a pe da neu onal nos núcleos basais de Meyne (localizados na subs ância inomina a, no globo pálido) (34, 35). Es as células são icas em colina ace il asn e ase e neu ónios coliné gicos, que p ojec am axónios pa a o có ex. Foi demons ado que o declínio das unções cogni i as nos doen es de Pa kinson es á in imamen e elacionado com a edução da ac i idade coliné gica no có ex e com a degene ação dos neu ónios nos núcleos de Meyne (35, 36). E idências clínicas demons am que o a amen o com á macos an icoliné gicos podem aumen a os já exis en es dé ices de memó ia nos doen es com DP (37) e que o a amen o com inibido es das colines e ases (po exemplo, i as igmina) melho a as unções cogni i as (38). Foi suge ido que a dis unção na neu o ansmissão coliné gica pode se esponsá el ou con ibui pa a o apa ecimen o de sin omas associados ao sis ema ne oso au ónomo (39). Es es sin omas incluem dis unções nos sis emas sudomo o , gas oin es inal e 13 u iná io, dis ú bios do sono e dis unção sexual. Es e ipo de sin omas é mui o comum nos doen es de Pa kinson, a ec ando ce ca de 70 a 80% dos indi íduos (40). 1.5.2. Neu o ansmissão Se o oniné gica Os ecep o es se o oniné gicos nas células ce eb ais modulam as ias dopaminé gicas de á ias o mas, po exemplo, a ac i ação dos ecep o es da se o onina (5-HT, 5- hid o ip amina) 5-HT1A e 5-HT1B acili am a libe ação da DA, enquan o a ac i ação dos ecep o es 5-HT2C inibem a sua libe ação (41). Fo am de ec ados eduções da o dem dos 50% na concen ação de 5-HT no có ex e GB nos doen es de Pa kinson, podendo es a elacionado com al e ações de humo , dep essão e al e ações na a qui ec u a do sono (42). A do é uma mani es ação equen e da DP, a ec ando ap oximadamen e 83% dos indi íduos, sendo que a mais equen e es á associada ao sis ema musculo-esquelé ico (ap oximadamen e, em 70% dos casos) (43). Foi suge ido que a neu o ansmissão se o oninné gica possa es a en ol ida na modulação da do , uma ez que o a amen o des e sin oma com inibido es da ecap ação de 5-HT e no ad enalina (como a duloxe ina), esul a no alí io da do em 65% dos doen es (44). A obs ipação, ou o dos sin omas da DP, é p o ocada pela diminuição da ac i idade do sis ema gas o-in es inal. Os a amen os com agen es dopaminé gicos (po exemplo, apomo ina e duodopa) mos a am-se bené icos no alí io da obs ipação (45). No en an o, o sis ema se o oninné gico pode es a ambém en ol ido, uma ez que e idências p é- clinicas suge em que a ac i ação dos ecep o es 5-HT4 localizados ao longo do ubo diges i o aumen am a mobilidade in es inal (46). 1.5.3. Neu o ansmissão No ad ené gica Os doen es de Pa kinson possuem baixas concen ações de no ad enalina (47). A pe da de no ad enalina pa ece p o oca o ag a amen o da doença, aumen ando a suscep ibilidade dos neu ónios dopaminé gicos, ou inibindo a epa ação dos neu ónios já dani icados (48). 20 ac o es e e idos an e io men e, que pode acon ece em condições de s esse oxida i o ou inibição da cadeia anspo ado a de elec ões (105). Figu a 2 – Possí eis mecanismos de in luência da dis unção mi ocond ial na apop ose (adap ado de Henchcli e and Beal, 2008). Assim, a dis unção mi ocond ial e a inibição da cadeia espi a ó ia, podem es a na o igem da mo e celula p og amada. Es a si uação assume pa icula impo ância na DP, uma ez que exis em e idências da in luência da dis unção mi ocond ial na sua pa ogénese, em pa icula na inibição do complexo I da cadeia espi a ó ia (71, 102). Recen emen e, oi descobe o uma al e ação p o eica numa das subunidades que cons i uem o complexo mi ocond ial I, que le a à diminuição da axa de ans e ência de elec ões ao longo da cadeia. Suge iu-se que as al e ações uncionais do complexo I pode iam es a na base da pa ogénese da DP, uma ez que es as al e ações não se e i icam nou as doenças que ap esen am sin omas de pa kinsonismo, como a a o ia sis émica múl ipla (106). A exci o oxicidade pa ece se um p ocesso que pode es a elacionado com a ac i idade mi ocond ial. A mo e neu onal como esul ado da exci o oxicidade de e-se à ac i ação dos ecep o es NMDA pelo neu o ansmisso glu ama o, que p o oca o in luxo de cálcio (107). Em condições no mais de po encial de memb ana, o in luxo de cálcio é bloqueado pelo anspo e de magnésio, no en an o, a manu enção do po encial de memb ana é 21 dependen e de ene gia e numa si uação de dis unção mi ocond ial há edução do po encial memb ana e dá-se o in luxo de cálcio (102). O cálcio é seques ado pela mi ocônd ia, o que le a à abe u a dos po os mi ocond iais de ansição, com libe ação do ci oc omo c e ou os ac o es p ó-apop ó icos e consequen e ac i ação da ia apop ó ica (105). As e idências mais cla as do en ol imen o da dis unção mi ocond ial no desen ol imen o da DP p o êm de es udos epidemiológicos que elacionam a exposição a ac o es ambien ais com o desen ol imen o da doença. G ande pa e dos es udos den o des a ma é ia incide sob e a exposição a pes icidas. Vi ualmen e, qualque compos o que possa p o oca as al e ações bioquímicas acima e e idas pode á se um indu o da DP. Assim, oi es udada a po encial in luência do pa aqua o (he bicida) adminis ado em simul âneo com o ungicida maneb (e ilenoepis ioca bama o de manganês), da o enona (insec icida) e pes icidas o ganoclo ados, como a dield ina (108). Os pes icidas e e idos p o ocam sin omas ca ac e ís icos da DP, como acinesia e igidez muscula , em di e en es animais de labo a ó ios, como a os, p ima as, ou ainda em insec os como a D osophila melanogas e , en e ou os. No en an o, nenhum deles consegue ep oduzi na o alidade os sin omas e as suas ca ac e ís icas pa o isiológicas da DP em humanos (76, 109-111). 2.2.2. S esse Oxida i o Todas as células ap esen am um ní el basal de s esse oxida i o e, po esse mo i o, são necessá ios mecanismos an ioxidan es que eliminem o excesso de adicais li es, e ou os que epa em e/ou subs i uam as moléculas dani icadas. Uma alha nes es sis emas de p o ecção pode p o oca a mo e celula e, em pa icula a neu odegene ação, pelo aumen o de espécies eac i as, incluindo as espécies eac i as de oxigénio (ROS), uma amília que inclui os adicais li es de oxigénio e os seus de i ados (112). O cé eb o humano é especialmen e sensí el ao s esse oxida i o. Uma das azões é o ele ado consumo de oxigénio, de ido à g ande necessidade de p odução de ATP pa a a manu enção da homeos asia iónica (112). O cé eb o consome 20% do oxigénio do o ganismo mas ep esen a apenas 2% da massa co po al, ou seja, a po encial p odução de ROS du an e a os o ilação oxida i a é eno me (113). 22 As espécies eac i as podem le a à pe meabilização da ba ei a hema o-ence álica (BHE) di ec amen e, pela diminuição da sín ese de p o eínas essenciais na manu enção das junções ape adas en e as células (114), ou indi ec amen e, pela ac i ação de me alop o einases. A pe meabilização da BHE pe mi e a en ada no SNC de possí eis neu o oxinas, endo oxinas e células in lama ó ias, com po encial ele ância na pa ogénese da DP (115). O O2•- é o mado po á ias ias nos neu ónios, in i o. As mais impo an es são a ac i idade da cadeia mi ocond ial anspo ado a de elec ões (116) e a au o-oxidação de moléculas com es u u a ca ecólica, como a ad enalina, a no ad enalina, L-DOPA, DA, 6- hid oxidopamina (6-OHDA) e ióis, po exemplo, a cis eína. Es es compos os eagem com a molécula de oxigénio, p oduzindo-se O2•- e compos os quinónicos, que podem liga -se e deple a a GSH in acelula e/ou liga -se a p o eínas com g upos SH (117). O me abolismo ce eb al é na u almen e p odu o de H2O2. As enzimas SOD u ilizam o O2•- con e endo-o em H2O2 (Figu a 3A) (118). Exis em, no en an o, ou as enzimas, po exemplo, a monoamina oxidase (MAO) que ca alisa a eacção en e as monoaminas e o oxigénio, com o mação de H2O2 (Figu a 3B) (112). 322222 222 )( 22)( NHOHRCHOONHRCHB OHHOA Figu a 3 - P odução de H2O2 pela ac i idade da SOD (A) e da MAO (B). A ac i idade da SOD, com o objec i o de emo e o O2•-, é complemen ada com a ac uação de ou as enzimas que emo em o H2O2. Po exemplo, o H2O2 pode se eliminado quando ligado à GSH, ia GSH pe oxidase, com o mação de GSH oxidada (GSSG) (Figu a 4a) (119). No en an o, é de salien a que a pe da de GSH de ec ada no cé eb o de doen es de Pa kinson não é acompanhada pelo aumen o de GSSG, não ha endo pe da pela sua me abolização, nem diminuição da capacidade de sín ese, uma ez que não se e i icam al e ações nas enzimas que a p oduzem (88). Es es ac os conjugados podem indica que o s esse oxida i o não é o único enómeno ine en e à pe da de GSH. Nos doen es de Pa kinson, exis em e idências cla as de s esse oxida i o, incluindo os ní eis ele ados de pe oxidação lipídica, dano p o eico (com ele ação dos ní eis de 23 g upos ca bonilo) e dos ácidos nucleicos. O dano lipídico le a à pe da da in eg idade da memb ana celula e ao aumen o da sua pe meabilidade aos iões, ais como o cálcio, que po sua ez conduz à exci o oxicidade. O p odu o do dano lipídico 4-hid oxinonenal é ci o óxico pa a os neu ónios, p omo e o aumen o de Ca2+ in acelula , inac i a os anspo ado es do glu ama o e dani ica os neu o ilamen os (120). Foi de ec ado o aumen o de aduc os p o eicos de 4-hid oxinonenal em doen es de Pa kinson (121). Vá ias egiões ana ómicas neu onais (po exemplo, SN, núcleo caudado, pu amen e globo pálido) ap esen am concen ações ele adas de e o e oi já de ec ada a p esença de concen ações ano malmen e ele adas des e me al em doen es de Pa kinson, com especial ele ância na SN (99). O e o, ano malmen e ele ado na SN dos doen es de Pa kinson, pode se um elemen o que p omo e o s esse oxida i o, uma ez que pode es a en ol ido na con e são do H2O2 em OH•, com oxidação de Fe2+ a Fe3+, na eacção de Fen on (Figu a 4b) ou na eacção de Habe -Weiss (Figu a 4c) (99). Es a in o mação é consis en e com os achados pa o isiológicos que desc e em o aumen o de e o o al e de Fe3+ nas células da SN dos doen es de Pa kinson (99). Mui os es udos elacionam ambém o su gimen o da DP com a exposição a me ais de ansição, como o manganês (122, 123), que ocupacionalmen e, que a a és da die a (124). Os neu ónios dopaminé gicos es ão pa icula men e expos os ao s esse oxida i o uma ez que de e minadas ROS são na u almen e p oduzidos du an e o me abolismo da DA, incluindo O2•-, quinonas e HO- (Figu a 4d e 4e). A deg adação da DA pode oco e espon aneamen e, na p esença de e o, ou enzima icamen e, a a és da enzima MAO-B, com o mação de H2O2 (Figu a 4 ) (125). Pa ece ha e uma es ei a elação en e o desen ol imen o da DP e a concen ação de e o na SN, com o mação de complexos de e o e DA, que p omo em o s esse oxida i o (126). 22322 22 2 22 2 2 3 222 32 22 222 ) 2) 2) ) ) 22) OHNHDOPACOHODA OHSQHODAe HOSQODAd FeOHOHOFeOOHc FeOHOHFeOHb OHGSSGGSHOHa MAO Figu a 4 - Reacções possí eis pa a a o igem de ROS nos neu ónios dopaminé gicos (adap ado de Lo ha ius e B undin, 2002). 24 O s esse oxida i o desempenha um papel undamen al na neu odegene ação, especi icamen e na SN, é ac ualmen e acei e como um ac o undamen al pa a a pa ogénese da DP (Figu a 5). Figu a 5 - Fac o es que podem con ibui pa a a neu odegene ação da DP, en ol endo o s esse oxida i o. DA – dopamina, GSH – glu a iona, NM – neu omelanina, UPS – sis ema p o eossomal da ubiqui ina (adap ado de Be g e al, 2005). 2.2.3. Inibição P o eossomal da Ubiqui ina A neu odegene ação dos neu ónios da SN é acompanhada pela acumulação de p o eínas dis uncionais não deg adadas e pela sua aglome ação em inclusões ci oplasmá icas, os CL. Como já oi e e ido, e i ica-se um dec éscimo da ac i idade p o eossomal em biopsias pos -mo em da SN de doen es de Pa kinson, que pode a ingi os 40% (98). Além disso, e i ica-se que os CL êm na sua cons i uição ubiqui ina e ou as subunidades p o eossomais (68). 25 O sis ema p o eossomal da ubiqui ina (UPS) exis e na u almen e em odas as células, cuja unção é a deg adação de p o eínas ano mais. Pa a a sua deg adação, as p o eínas êm que se ma cadas com esíduos p o eicos de ubiqui ina pelo p o eossoma, um sis ema p o eico compos o po ês enzimas conjugadas, a E1, E2 e E3 ligases, que p omo em a ligação da ubiqui ina a uma zona especí ica da p o eína ano mal (127). A p esença de AS e ubiqui ina nos CL pa ece es a elacionada com a deg adação incomple a das ib ilas de AS, após ma cação com a ubiqui ina pelo UPS (128). As o mas monomé icas e oligomé icas (na o ma de ib ilas) da AS são solú eis e oco em na u almen e nas células neu onais. Quando p esen e em g andes concen ações, as ib ilas podem o ma ag egados ib ila es, o nando-se insolú eis e podendo conjuga -se com a ubiqui ina, o mando os CL (128). Sabe-se ambém que as p o o ib ilas de AS são moléculas ci o óxicas ( e capí ulo 3.3), e a inibição do complexo UPS le a ia à não deg adação des as p o eínas ano mais (129). Es udos demons am que a inibição do UPS dá o igem a inclusões ci oplasmá icas de AS e p o oca apop ose em células dopaminé gicas in i o (130). Foi já de ec ada uma mu ação gené ica no gene que codi ica a p o eína Pa kin, uma ligase do ipo E3 (131), e uma mu ação no gene codi ican e da ubiqui ina c- e minal hid olase (132), que le am ao desen ol imen o de DP de o igem amilia ( e capí ulo 3.2.4). O sis ema p o eossomal 26S, esponsá el pela p o eólise dependen e da ma cação pela ubiqui ina é compos o pelo p o eossoma 20S (p o einase mul ica alí ica) que se conjuga com o complexo egulado 19S (133). Um es udo de McNaugh e colabo ado es e i icou a inexis ência das subunidades do sis ema p o eossomal 20/26S nas células dopaminé gicas e que a ac i idade do p o eossoma 20S es á diminuída nos casos espo ádicos de DP. Ve i ica am ambém que a ac i idade dos ac i ado es p o eossomais PA700 e PA28 é eduzida e a concen ação des es ac i ado es é p a icamen e inde ec á el na SN nos doen es com DP, compa ando com ou as á eas ce eb ais de doen es de Pa kinson e ou na SN de indi íduos saudá eis (134). 2.2.4. Al e ações Gené icas São conhecidos 11 loci com po encial ele ância no desen ol imen o da DP, 6 deles associados a genes já conhecidos, que dão o igem a p o eínas com unção conhecida (Tabela 4) (135). 26 Fo am descobe as 3 mu ações no gene SNCA, cujo p odu o génico é a p o eína AS, em 3 amílias di e en es, com o mas amilia es de DP: a mu ação A53T (136), A30P (137), e E46K (138). Foi ambém descobe a uma iplicação no gene SNCA (139). As mu ações A53T e A30P p omo em a o mação de p o o ib ilas in i o em elação à p o eína em es ado na u al (140), e a mu ação E46K acele a a o mação de ib ilas, ela i amen e às mu ações an e io es (141). Ve i ica-se que a sob e-exp essão da p o eína na u al AS p o oca o desen ol imen o de ca ac e ís icas de pa kinsonismo e um aumen o da concen ação ci ossólica de ca ecolaminas (142). Tabela 4 - Al e ações gené icas com ele ância na DP. Gene Modo de ansmissão Locus P odu o génico Rele ância da génese da DP Re e ências SNCA Au ossómico dominan e PARK1 α-sinucleína Fo mação CL, s esse oxida i o (136-138) SNCA Au ossómico dominan e PARK4 T iplicação gené ica AS w Fo mação CL, s esse oxida i o (141) Pa kin Au ossómico ecessi o PARK2 E2 ubiqui ina ligase Inibição UPS (131, 134) UCHL1 Au ossómico dominan e PARK5 ubiqui ina c- e minal hid olase Inibição UPS (132, 143) PINK1 Au ossómico ecessi o PARK6 Se ina- ionina cinase 1 s esse oxida i o, dis unção mi ocond ial (13, 144) LRRK2 Au ossómico dominan e PARK8 Se ina- ionina cinase 2 Dis unção mi ocond ial (135, 145) DJ-1 Au ossómico ecessi o PARK7 P o eína DJ-1 s esse oxida i o, CL (146) Foi iden i icada uma al e ação no gene Pa kin com po encial ele ância na DP (131) que codi ica a enzima E2 ubiqui ina ligase, um dos componen es do UPS que pa icipa na ans e ência na ubiqui ina e na sua ligação a pép idos (147). Foi suge ido que a inac i ação des e gene es á en ol ida na pa ogénese da DP de ido à acumulação ci oplasmá ica de alguns dos subs a os do seu p odu o génico, p o ocada pela diminuição da ac i idade ligase (po exemplo, acumulação de ib ilas de AS) (68). Assim, pensa-se que a sob e-exp essão da p o eína Pa kin seja neu op o ec o a em á ias si uações, nomeadamen e, quando há inibição do UPS, sob e-exp essão e/ou acumulação de AS, no a amen o com MPTP e na oxicidade dependen e da DA (135). 27 Também elacionada com a al e ação do UPS es á a mu ação que pode se encon ada no gene UCHL1, que le a ao desen ol imen o de DP amilia (132). Es e gene codi ica a enzima ubiqui ina c- e minal hid olase, um ou o componen e do UPS, cujas unções incluem a eciclagem da ubiqui ina (143). No en an o, oi apenas iden i icada uma amília com es a a ian e da doença e po an o é con o e so se es a mu ação é signi ica i a pa a o seu desen ol imen o (148). A mu ação no gene PINK1 oi descobe a em 3 amílias consanguíneas com DP (13). Células isoladas de indi íduos com a mu ação no gene PINK1 ap esen am eduzida ac i idade do complexo mi ocond ial I e e idências de s esse oxida i o (144). Pensa-se que es e gene possa e um e ei o neu op o ec o , uma ez que se demons ou que a p o eína na u al a enua algumas o mas de apop ose e eduz a libe ação do ci oc omo c quando sob e-exp essa in i o (149). A delecção no gene DJ-1, com a consequen e ausência do seu p odu o génico, p o oca DP (146). A p esença da p o eína DJ-1 na u al p o ege as células con a uma g ande a iedade de danos, po exemplo, no modelo D. melanogas e os mu an es DJ-1 são mais sensí eis à acção da o enona, do pa aqua o (150) e do MPTP (151), e ap esen am ní eis ele ados de ROS e maio sensibilidade ao s esse oxida i o o que esul a na degene ação de neu ónios dopaminé gicos (152). Além disso, e i ica-se que a o ma na u al da p o eína eduz a ag egação da AS (153). As mu ações no gene LRRK2 ep esen am a causa mais comum de pa kinsonismo amilia , ep esen ando 5 a 6% do pa kinsonismo he edi á io e 1 a 2% dos casos de pa kinsonismo espo ádico (13) e os doen es com es a mu ação ap esen am odos os sin omas ep esen a i os da DP idiopá ica (145). O gene LRRK2 codi ica uma p o eína cinase MAP (cinase ac i ada po mi ogénios), p e e encialmen e localizada jun o à memb ana ex e na mi ocond ial. Uma ez que a mu ação nes e gene aumen a a ac i idade cinase da p o eína, pensa-se que a sua hipe ac i idade possa a ec a a unção mi ocond ial (135). 2.2.5. Rele ância da Neu omelanina na Doença de Pa kinson A SN é assim designada de ido à p esença de pigmen os escu os de NM nos seus neu ónios. A NM é uma molécula polimé ica p esen e no SNC humano, localizada em o ganelos de dupla memb ana que se assemelham a lisossomas pigmen ados, sendo 28 que as zonas ce eb ais com maio quan idade de NM são a SN e o locus ce uleus (154). Começa a o ma -se aos 2/3 anos de idade e aumen a com a idade, en e os 50-90 anos (155). A NM possui uma es u u a semelhan e à melanina (156) e g ande pa e des a é o mada a pa i de quinonas e semi-quinonas, p odu os da au o-oxidação da DA, no ad enalina e L-DOPA e conjugados de cis eína com a DA (157). A NM pode se sin e izada enzima icamen e, po exemplo, ia i osinase (158), i osina hid oxilase (TH) (159), pe oxidase (160) ou p os aglandina H sin e ase (161, 162), ou ia au o-oxidação da DA. A sín ese não enzimá ica da NM de e-se à au o-oxidação de ca ecóis a quinonas, com a subsequen e adição de g upos iol, eacção que oi demons ada oco e no cé eb o humano (163). Po exemplo, as quinonas o madas aquando da au o-oxidação da DA podem cicliza e o ma aminoc omos, que são ambém p ecu so es da NM quando polime izados (Figu a 6) (164). Figu a 6 - Con e são da dopamina em aminoc omo (adap ado de Pa is e al, 2009). Ve i ica-se que na DP há pe da selec i a de neu ónios pigmen ados na SN, oda ia os neu ónios não pigmen ados sob e i em (165). Pensa-se que a NM possa e , po um lado, um papel neu op o ec o , seques ando espécies me álicas eac i as e compos os o gânicos óxicos. Po ou o lado, pa ece desempenha ela p óp ia um papel neu o óxico, podendo se uma on e de adicais li es ao eagi com o H2O2 (166). A NM possui g ande capacidade de ligação a me ais como o e o, cob e e zinco (167). Na SN humana, a e i ina es á p esen e nos oligodend óci os e nos as óci os, no en an o não é de ec ada nos neu ónios dopaminé gicos. Assim, o único sis ema de de esa con a o aumen o da concen ação de e o é a sua ligação à NM. Além disso, a NM libe ada po neu ónios em degene ação pode le a à ac i ação da mic oglia, libe ando-se moléculas ci o óxicas que podem dani ica ou os neu ónios, 29 exace bando o p ocesso neu odegene a i o. Po ou o lado, inibe a acção enzimá ica do p o eassoma 26S, in i o (168). A NM pode in e agi com compos os ele an es na génese da DP, demons ando mais uma ez o seu papel neu op o ec o . O MPP+ (ião 1-me il-4- enil pi ídio) pode liga -se à NM ( eduzindo a oxicidade do MPTP in i o) (169) e ao pa aqua o (170), no en an o, pode ambém le a à sua libe ação g adual dos neu ónios, p o ocando pos e io neu odegene ação da SN. 2.2.6. Neu oin lamação O SNC é ele p óp io capaz de desencadea uma espos a imuni á ia, não só con a agen es ex e nos, mas ambém como espos a a um p ocesso imune ine en e ao p óp io SNC. As células e ec o as des a espos a são células da glia, p icipalmen e as células da mic oglia (171). Alguns au o es suge em que o p ocesso neu oin lama ó io pode não se ge ado somen e po p ocessos gliais mas en ol e a p esença de células imuni á ias pe i é icas. O signi icado da sua p esença é desconhecido, mas pode á indica que a ba ei a hema o-ence álica es á de algum modo comp ome ida na DP (172). Ve i ica-se a ac i ação das células da mic oglia nos doen es de Pa kinson (173) e em indi íduos expos os ao MPTP (174), cuja causa é e dadei amen e desconhecida: de ec a-se o aumen o da concen ação de ci ocinas e ou as p o eínas, po exemplo, in e leucinas e TNF-α, na egião nig os ia al e no luído ce eb oespinal (175, 176). Os ecep o es de ci ocinas p ó-in lama ó ias, como o TNF-α, es ão p esen es nos co pos celula es e nas dend i es dos neu ónios nig oes ia ais, o que p o a elmen e os o na suscep í eis ao e ei o ci o óxico das ci ocinas libe adas pelas células da mic oglia ac i adas (177) e a ac i ação des es ecep o es pode ac i a a casca a das caspases que conduz à apop ose (178). A ac i ação da mic oglia pode ambém le a ao s esse oxida i o, com p odução de óxido ní ico (NO), que ao en a nos neu ónios e conjuga -se com o O2•-, o igina pe oxini i o (ONOO-), uma espécie mui o eac i a (179, 180). 36 Figu a 11- Possí eis mecanismos de oxicidade da dopamina e dos seus p odu os quinónicos nos neu ónios dopaminé gicos (adap ado de Miyazaki e Asanuma, 2008). Ve i icou-se que as quinonas de i adas de DA podem liga -se ao DNA, o mando aduc os, que pode á le a a mu ações que es ão na o igem do desen ol imen o de DP (206). As quinonas, de i adas da au o-oxidação das ca ecolaminas, são mui o eac i as na p esença de iola os, o mando-se ca ecol ioé e es. Nos sis emas biológicos, são equen es os ligandos des es compos os à cis eína ou à GSH, pela VAM. Na DP, assume pa icula ele ância a o mação de ca ecol ioé e es de i ados da DA e dos seus me aboli os, no en an o, a no ad enalina e a ad enalina podem so e eacções de au o- oxidação e me abolismo semelhan es. No en an o, a ca ecolamina com maio p obabilidade de en a em ciclo edox é a DA (147). Como já oi e e ido, um dos achados pa o isiológicos nas células neu onais da SN em doen es de Pa kinson é o aumen o da azão 5-S-cis-DA/DA. Ve i ica-se que a deg adação química da neu omelanina dá o igem a p odu os que suge em que a sua composição con ém esíduos indólicos e de i ados de 5-S-cis-DA, suge indo que a 5-S- cis-DA é um dos p ecu so es da neu omelanina (207). No en an o, com o aumen o da concen ação de 5-S-cis-DA in acelula , a p odução de melanina diminui a é que pá a, in 37 i o. Suge iu-se que a p esença de cis eína inibe a ciclização da DA-o-quinona em dopaminoc omo (208), podendo se um dos mecanismos que le e à despigmen ação dos neu ónios dopaminé gicos nos doen es de Pa kinson. 3.4.1. Conjugação da Dopamina com a Glu a iona A GSH é um an ioxidan e que eage não enzima icamen e com ROS e é um auxilia na des oxi icação de alguns xenobió icos. Possui ainda ou as unções nas células, como meio de a mazenamen o e anspo e de cis eína (209), na p oli e ação celula (210) e na egulação da apop ose (211). A sín ese da GSH é ga an ida pela acção consecu i a de 2 enzimas: a -glu amilcis eína sin e ase ( -GS) (que combina os aminoácidos glu ama o e cis eína), seguida da acção da enzima GSH sin e ase (que combina o dipép ido an e io com o aminácido glicina). Pa a a ac i idade des as 2 enzimas é necessá io ATP (113), logo, se a cadeia mi ocond ial espi a ó ia es i e comp ome ida, a sín ese de GSH encon a-se diminuída. A ligação da GSH a ROS pode se de 2 ipos: eacção não enzimá ica ou enzimá ica, uncionando como dado de elec ões na eacção da GSH pe oxidase (GPx) (cuja unção é eduzi o H2O2 a água). Na p imei a, a GSH liga-se a ROS, po exemplo O2•- e NO (212, 213). Na segunda, a GSH é oxidada a GSSG, sendo que a sua egene ação se dá ia GSH educ ase (GR) (214). Nas eacções ca alisadas pela GPx e GR, a GSH não é consumida mas eciclada. No en an o, du an e a o mação de conjugados de GSH ia glu a iona-S- ans e ase (GST) (du an e a ans o mação de possí eis xenobió icos a compos os menos óxicos e mais hid ossolú eis) (215), ou pela libe ação de GSH das células du an e a sua homeos asia (216), a concen ação de GSH in acelula diminui e há necessidade de sín ese de no o. Nos doen es de Pa kinson, a concen ação de GSH es á diminuída en e 40 a 50% na SN (85, 86). A pe da de GSH isoladamen e não é esponsá el pelo dano nig oes ia al na DP, uma ez que a edução da concen ação da GSH ce eb al a a és de in usões c ónicas de BSO (bu ionina sul oximina) não é su icien e pa a eduzi o núme o de neu ónios dopaminé gicos (217) mas pode con ibui pa a o aumen o da suscep ibilidade des as células. A BSO é esponsá el pela depleção de GSH a a és da inibição da enzima limi an e da sua sín ese, a -GS. 38 A ia de conjugação da GSH com xenobió icos ia GST é uma impo an e ia de des oxi icação nas células. Os subs a os pa a es a eacção são elec ó ilos po encialmen e óxicos de ido a sua capacidade de ligação a ou os nucleó ilos (como p o eínas e ácidos nucleicos), causando danos celula es e gené icos, ou compos os que podem acilmen e en a em ciclo edox e causa s esse oxida i o. Os conjugados de GSH denominan-se ioé e es, o mados aquando do a aque nucleo ílico do anião iola o da GSH (GS-) com um á omo elec o ílico do xenobió ico (C, O, N ou S) (218). A con e são dos conjugados de GSH a ácido me cap ú ico, o me aboli o menos óxico e exc e á el do xenobió ico, en ol e a emoção sequencial do ácido glu âmico pela enzima -GT, e da glicina pela alanil-aminopep idase, seguida da N-ace ilação do conjugado de cis eína a ácido me cap ú ico (Figu a 12). Toda ia, em alguns casos, a conjugação do xenobió ico com a GSH aumen a a sua oxicidade. Tal ac o pode oco e de 5 o mas di e en es: (1) o mação de conjugados de haloalcanos, iociana os o gânicos e ni osoguaninas (po exemplo, mecanismo de oxicidade do diclo ome ano), (2) o mação de conjugados de dihaloalcanos (po exemplo, mecanismo de oxicidade do ciclo oe ano e do dib omoe ano), (3) o mação de conjugados de alcenos halogenados, deg adados a me aboli os óxicos no ígado pela enzima β-liase (po exemplo, mecanismo de oxicidade do hexaclo ou adieno), (4) conjugação cíclica com a GSH, le ando à sua depleção (po exemplo, mecanismo de oxicidade dos alil-, benzil- e enoe il- iociana os) e (5) o mação de conjugados de quinonas, quinoneinimas e iso iociana os (po exemplo, mecanismo de oxicidade do b omobenzeno) (219, 220). A VAM inicia-se com a junção in acelula da GSH ao elec ó ilo da O-quinona da DA, que espon aneamen e, que pela acção enzimá ica da GST. Os conjugados de GSH são anspo ados pa a o meio ex acelula , onde são hid olisados pela enzima -GT, jun amen e com pep idases, aos seus co esponden es conjugados de cis eína. Os conjugados de cis eína een am nas células e são me abolizados pela enzima mic ossomal CNAT (N-ace il ans e ase de conjugados de S-cis eína) em conjugados de ácido me cap ú ico (147, 221). A concen ação in acelula de conjugados de ácido me cap ú ico é man ida pelo equilíb io en e a acção das enzimas CNAT (que le am à sua o mação) e das ace ilases (que a o ecem a eacção de deg adação do adical ace il) (183). Nos doen es de Pa kinson, de ido ao s esse oxida i o, a o mação de conjugados de DA e L-DOPA encon a-se acili ada a a és da p odução de quinonas (200).Tendo em con a 39 as O-quinonas de i adas da DA, na VAM dá-se a o mação de 5-S-glu a ionildopamina (5-S-GSH-DA, o conjugado de GSH), de 5-S-cis einildopamina (5-S-cis-DA, o conjugado de cis eína) e 5-S-N-ace ilcis einildopamina (5-S-NAC-DA, o conjugado de ácido me cap ú ico) (Figu a 12) (221). A DA, ao se me abolizada pela MAO-B le a à o mação de DOPAC, que pode so e o mesmo p ocesso de conjugação da VAM (Figu a 13) (147). No sen ido de comp o a a possibilidade da o mação de odos os me aboli os dependen es da DA e en ol idos na VAM, Shen e colabo ado es demons a am que a conjugação de DA-O-quinonas com a cis eína le a à o mação de 5-S-cis-DA (p odu o maio i á io) e 2-S-cis einilDA (p odu o mino i á io), in i o. Es es compos os são apidamen e oxidados, dando o igem a 2,5-bis-S-cis-DA, 2,5,6- is-S-cis-DA, DHBT-1, DHBT-5, e conjugados des es dois úl imos com a cis eína, o mando conjugados 6-S- cis einilDHBT (222). Figu a 12 - Me abolismo da DA pela VAM (CNAT - N-ace il ans e ase de conjugados de S-cis eína, DA – dopamina, DP – dipep idase, GST – glu a iona-S- ans e ase, -GT – -glu amil ans e ase, 5-S-Cis-DA – 5-S- cis einildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S-glu a ionildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-ace ilcis einildopamina) (adap ado de Mon ine e al, 2000). 40 Figu a 13 - Me abolismo da DA e DOPAC pela VAM (DA (1) e o mação de DA-O-quinona (2), 5-S-GSH-DA (3), 5-S-cis-DA (4) e 5-S-NAC-DA (5); me aboli o da DA, DOPAC (6), DOPAC-O-quinona (7), 5-S-GSH- DOPAC (8), 5-S-Cis-DOPAC (9) e 5-S-NAC-DOPAC (10). ALDH – aldeído desid ogenase, MAO – monoamina oxidase (adap ado de Zhang e al, 2000). A oxidação do me aboli o 5-S-cis-DA, na p esença de cis eína li e, a pH p óximo de 7,4, aduz-se na o mação de DHBT-1, um dos compos os da amília das benzo iazinas, endo oxinas que po si só podem le a à degene ação dos neu ónios dopaminé gicos, pela inibição do complexo mi ocond ial I e a o mação de ROS (222). 41 Es udos e elam que a VAM e a o mação de conjugados de DA é compa í el com os pa âme os bioquímicos encon ados na SN de animais de labo a ó io e em á ios es udos elacionados com a DP. Ve i ica-se a diminuição da concen ação de DA, a diminuição da concen ação de GSH, pela ligação à DA e o mação de conjugados, o aumen o da ac i idade de enzima -GT, o aumen o da concen ação de anião O2- in aneu onal e o aumen o das eacções de oxidação da DA com consequen e o mação de O-quinonas (223). Ve i ica-se ambém um aumen o da azão 5-S-cis-DA/DA (163). De no a , no en an o, que o aumen o da ac i idade da enzima -GT pode se um esul ado adap a i o da células em espos a à diminuição da quan idade de GSH (224). Desde 1986 que é conhecida a p esença de conjugados de cis eína de i ados da DA, L- DOPA e DOPAC em cé eb os de mamí e os, em egiões ce eb ais onde a DA é encon ada em maio concen ação (163). Foi ambém já de ec ada a p esença de 5-S- cis-DA no cé eb o de humanos, em zonas icas em DA, como o núcleo caudado, o pu amen, o globo pálido e a SN, mas não nou as egiões ce eb ais (como o ce ebelo e o có ex occipi al) (225) e, em doen es de Pa kinson, na SN a concen ação de 5-S-cis-DA, 5-S-cis-DOPA e 5-S-cis-DOPAC é signi ica i amen e maio do que nos indi íduos con olo (117). Apesa da VAM se basicamen e uma ia de des oxi icação, que le a à inac i ação e exc eção de compos os po encialmen e óxicos, pa ece ha e si uações em que a sua exis ência le a à o mação de me aboli os mais óxicos que o compos o o iginal. A oxidação da DA pela VAM pa ece se um desses casos (218). Spence e colabo ado es e i ica am que exis e uma elação cla a en e a diminuição da GSH com a o mação de conjugados de cis eína (117). A incubação in i o de GSH com DA ou L-DOPA não p o oca a diminuição de concen ação da GSH. A incubação de apenas GSH com um sis ema enzimá ico ge ado de ROS (H2O2 e O2-) aduz-se na pe da len a de GSH. No en an o, a incubação simul ânea de GSH com DA (ou L-DOPA) e ROS le a à pe da signi ica i a de GSH, de modo linea e dependen e da concen ação de DA, mime izando o ambien e oxidan e exis en e nos neu ónios dopaminé gicos (117). Es e es udo pe mi iu de ec a po HPLC no os compos os, que se concluiu se em o 5-S- GSH-DA, 5-S-GSH-DOPA, 5-S-cis-DA e 5-S-cis-DOPA (117). A concen ação de conjugados encon ada na maio ia das egiões ana ómicas ce eb ais analisadas nos doen es de Pa kinson não oi signi ica i amen e di e en e dos con olos, com excepção da SN e da subs ância inomina a, onde se encon a am os ní eis mais al os de conjugados de cis eína (5-S-cis-DA e 5-S-cis-DOPA). Pensa-se que nes as zonas g ande 42 pe cen agem de DA e L-DOPA seja oxidada nos seus conjugados. Em eo ia, pode dize - se que qualque mecanismo que esul e na oxidação das ca ecolaminas pode le a à diminuição da concen ação in aneu onal da GSH, pela indução da VAM, e o a amen o dos doen es com L-DOPA pode exace ba es e p oblema, uma ez que es a molécula ambém so e p ocessos de au o-oxidação e o mação de conjugados de cis eína, po encialmen e ci o óxicos (117). Dependendo dos es udos e das condições expe imen ais, a L-DOPA pode ac ua como p ó-oxidan e ou an ioxidan e. Alguns es udos demons am que a exposição de células dopaminé gicas à DA e/ou L-DOPA o igina ci o oxidade mediada pela exposição ao s esse oxida i o (226-228). Pelo con á io, ou os es udos apon am pa a um e ei o neu op o ec o , a a és do aumen o dos ní eis de GSH ou aumen o da p odução de ac o es neu o ó icos (229-231). Os p imei os es udos ealizados com o objec i o que e i ica a possí el neu o oxicidade dos conjugados de cis eína de i ados de DA o am conc e izados po Zhang e colabo ado es. Es e concluiu que exis e uma elação dose- espos a linea en e a concen ação de DA e a apop ose neu onal e que, à excepção da DA e do seu me aboli o 5-S-NAC-DA, que demons a am neu o oxicidade, não ob i e am esul ados cla os ace ca de ou os me aboli os da VAM en ol endo a DA. No en an o, nes e es udo oi usado como modelo a linha celula MES, de i ada de neu ónios mesence álicos de a o, cuja limi ação é o ac o de cons i ui uma população celula homogénea de neu ónios não di e enciados. Ou seja, não oi possí el es a a especi icidade des es me aboli os em elação aos neu ónios humanos dopaminé gicos (147). Picklo e colabo ado es demons a am que a oxidação dos conjugados da DA p o enien es da VAM, o 5-S-cis-DA e o 5-S-NAC-DA, é mais ápida e p omo e maio s esse oxida i o que a p óp ia DA li e in acelula (125). Ou o es udo po Spence e colabo ado es a aliou o po encial neu o óxico dos aduc os de 5-S-cis einilca ecóis, em neu ónios nig oes ia ais, usando a linha celula CSM14.1. Foi es udada a iabilidade celula , o dano nucleico, a p odução de ROS e a ac i idade das caspases-3 (232). Ve i icou-se que a incubação de células com DA p o oca uma diminuição da edução do MTT (o que indica pe da de iabilidade celula ) a concen ações de DA acima de 100 M e empo de exposição en e 24 e 48 ho as. A pe da de iabilidade celula é mais ex ensa quando as células são incubadas com 5-S- cis-DA, a concen ação de 100 M, mas po pe íodos de exposição meno es, en e 12 e 48 ho as. 43 Apesa de não se e i ica mo e neu onal em pe íodos de exposição de 6 ho as com 5- S-cis-DA, e i icou-se um aumen o signi ica i o na de ecção de bases pu ínicas e pi imidínicas oxidadas, o que é indica i o de s esse oxida i o e dano nos ácidos nucleicos. Não se de ec a am bases oxidadas na incubação com L-DOPA ou DOPAC, mas o am de ec adas aquando da incubação com conjugados de L-DOPA e DOPAC, apesa de se em meno ex ensão do que com 5-S-cis-DA. A incubação celula com 5-S- cis-DA em concen ações supe io es p o ocou um aumen o signi ica i o da p odução de ROS, quando compa ado com as células expos as à DA. O mesmo acon ece com a exposição aos conjugados de L-DOPA e DOPAC. O mesmo es udo a aliou a apop ose como mecanismo de mo e celula . Ve i icou-se que a exposição a 5-S-cis-DA (10 M) du an e 6 ho as p oduziu um aumen o signi ica i o na ac i ação das caspases-3. Es e es udo pe mi iu conclui que os 5-S-cis einilconjugados de DA, L-DOPA ou DOPAC são ci o óxicos pa a os neu ónios, p o ocando oxidação de bases azo adas e a p odução de ROS. O aumen o da ac i idade das caspases-3 indica mo e celula po apop ose, possi elmen e com inibição da cadeia espi a ó ia, que pode de e -se ao aumen o da p odução de ROS ou ao a aque di ec o dos cis einilconjugados (232). Ou os es udos demons a am que os compos os da amília das benzo iazinas, que esul am da oxidação dos conjugados de cis eína em DHBT, são apidamen e acumulados nas mi ocônd ias e inibem o complexo I. O mecanismo de inac i ação des as enzimas pode es a elacionado com a bioac i ação do DHBT po oxidação em me aboli os al amen e elec o ílicos que se ligam a esíduos de cis eína (223). Assim, os conjugados de cis eína podem le a à ulne abilidade neu onal não só pela p odução de neu o oxinas de i adas de benzo iazinas (que le am à inibição mi ocond ial) mas ambém aumen ando os ní eis de s esse oxida i o. Es es conjugados são mais apidamen e oxidados que os seus p ecu so es, le ando à o mação de conjugados mais complexos ou ao aumen o dos p odu os oxidan es, como o O2•-, H2O2 ou adicais hid oxilo (232). Um es udo de Mosca e colabo ado es pe mi iu demons a que, na ealidade, o conjugado 5-S-Cis-DA é mais ci o óxico do que o seu p ecu so DA, na linha celula neu onal dopaminé gica SH-SY5Y. Ve i ica am que es e compos o desencadeia ci o oxicidade de o ma dependen e do empo e da concen ação, e após o a amen o com es e conjugado a 100 M, é possí el e i ica um aumen o da p odução de ROS, acompanhado de uma diminuição da de ecção de g upos iol, a pa i das 24h de 44 incubação. Obse a-se ambém uma diminuição ma cada do po encial ansmemb ana da mi ocônd ia acompanhado da inibição do complexo mi ocond ial I, agmen ação do DNA nuclea e aumen o da ac i idade das caspases-3 (233). O s esse oxida i o obse ado aquando da incubação com es e compos o, pela p odução de ROS e diminuição de g upos iol pode de e -se a 2 mo i os: au o-oxidação do conjugado e/ou inibição com complexo I, como já oi obse ado an e io men e com a u ilização da o enona, in i o (234). Po ou o lado, a inibição do complexo I pode de e - se à ac i idade di ec a do 5-S-Cis-DA (235) ou à p odução de benzo iazidas dele de i adas (236). O mesmo es udo desc e eu á ias e idências de mo e apop ó ica aquando da incubação com 5-S-Cis-DA, como a diminuição do po encial ansmemb ana mi ocond ial, que pode á se um enómeno desencadeado da apop ose, agmen ação do DNA nuclea e aumen o da ac i idade das caspases-3. De no a que a 5-S-Cis-DA demons ou maio ci o oxicidade que a DA em odos os pa âme os obse ados (233). 45 4. MODELOS PARA O ESTUDO DA DOENÇA DE PARKINSON Na gene alidade, a u ilidade de um modelo pa a o es udo de uma doença depende da o ma como esse modelo ep oduz a condição humana. No que oca à DP, apesa de nenhum modelo ep oduzi na o alidade as ca ac e ís icas compo amen ais, bioquímicas e his opa ológicas da doença, pe mi em ap o unda o conhecimen o ace ca dos mecanismos ine en es ao desen ol imen o da doença e a sua possibilidade de a amen o (237). De seguida se ão enume ados os p incipais modelos celula es e animais usados pa a es uda a doença de Pa kinson. Além disso, se ão ab odadas as moléculas que pe mi em ob e modelos que pe mi em o melho es udo da DP. 4.1. Modelos Fa macologicamen e Induzidos Tan o em modelos animais como em es udo eco endo a cul u as celula es usam-se moléculas com di e sos mecanismos de acção endo como objec i o de epo duzi as ca ac e ís icas isiopa ológicas da doença. 4.1.1. α-Me il-p- i osina e Rese pina Com o objec i o de al e a a ia de neu o ansmissão dopaminé gica eco e-se ao uso da ese pina ou da α-me il-p- i osinase (AMPT). A ese pina é um á maco que deple a as esiculas das monoaminas. Foi es ado inicialmen e po Ca lsson e colabo ado es, le ando à hipó ese de que a DP se de e à pe da de neu o ansmissão dopaminé gica (8). A AMPT unciona como agen e deple o das ca ecolaminas inibindo di ec amen e a enzima TH (a sín ese de DA é inibida) (238). 52 Tabela 5 – Sis emas de cul u a de neu ónios dopaminé gicos. AMP – adenosina mono os a o, AS – α- sinucleína, BDNF – ac o neu o ó ico, D2R – ecep o da DA, DA – dopamina, DAT – ansp o ado da DA, GDNF – ac o neu o ó ico de i ado das células da glia, Me h – me an e amina, RA – ácido e inóico, TH – i osina hid oxilase (adap ado de Falkenbu ge e Schulz, 2006). Linha celula O igem Fac o de di e enciação Fenó ipo dopaminé gico Pa ologia SH-SY5Y Neu oblas oma humano RA ± TPA DAT, D2R, DA, TH, esículas, libe ação DA Inclusões eosino ílicas ci oplasmá icas aquando co-exp essão de AS e sin ilina-1 PC12 Neu oblas oma de a o NGF DAT, D2R, DA, TH, esículas, libe ação DA Sob e-exp essão de AS após exposição ao NGF, inclusões ci oplasmá icas após inibição do UPS e exposição à Me h MN9D Células mesence álicas de a o GDNF, RA, sob e-exp essão de Nu 11 DA, TH, D2R, sensí el a MPTP ----- 2 CSM14.1 Células emb ioná ias mesence álicas de a o 39ºC (imo alização sensí el à empe a u a) TH ----- 2 MESC2.10 Células mesence álicas humanas (8 semanas de idades) Te aciclina, GDNF, AMP TH, DAT, libe ação DA, elec icamen e ac i as Exp essão de inclusões de AS após exposição à Me h e sob e-exp essão de AS 1 Nu -1 – ac o de ansc ição que es á ac i o nos neu ónios dopaminé gicos. 2 Não encon ada bibliog a ia que elacione es as células com o apa ecimen o de ca ac e ís icas pa ológicas da DP 53 4.2.3. Linha Celula SH-SY5Y A linha celula SH-SY5Y é uma sublinha celula clonada a pa i da linha celula SK-N- SH, o iginalmen e de i adas de um pacien e com neu oblas oma (267). A linha celula SK-N-SH con ém células com 3 enó ipos di e en es: neu onal ( ipo N), células de Schwann ( ipo S) e in e médias ( ipo I), enquan o a linha SH-SY5Y con ém apenas células com enó ipo ipo N, ou seja, neu onais (268). A linha celula SH-SY5Y pa ece se um bom modelo de neu ónios dopaminé gicos po á ios mo i os. Es as células possuem a capacidade de sin e iza DA e no ad enalina, pois exp essam i osina e DA-β-hid oxílase (269), e exp essam o anspo ado DAT, exp esso apenas nos neu ónios dopaminé gicos (270). Apesa de possui baixos ní eis de exp essão de ecep o es da DA, o uso de agonis as da DA, que são eles p óp ios neu op o ec o es, pode se a aliado nes a linha celula (271). No malmen e, e com o objec i o de ob e uma linha celula com o enó ipo o mais semelhan e possí el ao dopaminé gico, é in oduzido na cul u a das células SH-SY5Y um ac o di e enciado , po exemplo, ácido e inóico (RA), o bol és e de 12-O- e adecanoil o bol-13-ace a o (TPA), ac o de c escimen o neu onal (BDNF) ou adenosina mono os a o (AMP). As des an agens da u ilização da linha celula SH-SY5Y não di e enciada como modelo pa a o es udo da DP são á ias. P imei o, enquan o células não di e enciadas, con inuam a sua di isão celula ao longo dos ensaios expe imen ais, pelo que é di ícil pe cebe se os agen es neu op o ec o es ou neu o óxicos es ão a in luencia a axa de di isão ou de mo e celula (272). Segundo, em cul u a as células c escem assinc onizadamen e e nem semp e exibem os ma cado es neu onais de células madu as, o que le a a ince ezas no abalho expe imen al. Po im, as células SH-SY5Y não di e enciadas exp essam ní eis eduzidos de enzimas da sín ese de DA e de anspo ado DAT (273). Apesa des as células exp essa em a DA-β-hid oxilase e a TH, a sín ese de ca ecolaminas (DA e no ad enalina) é limi ada de ido à baixa ac i idade da DDC (274). Des e modo, a u ilização de ac o es de di e enciação na cul u a celula das células SH- SY5Y é undamen al pa a a aquisição do enó ipo neu onal madu o. Após di e enciação, as células pa am de p oli e a , o nando-se uma população es á el, e demons am c escimen o das neu i es mo ologicamen e semelhan es aos neu ónios do cé eb o humano (275). Mais ainda, exibem uma g ande a iedade de ma cado es neu onais: GAP-43 (p o eína associada ao c escimen o), ecep o es pa a compos os neu o ó icos, 54 neu opep idos, enolase especí ica neu onal, ma cação com NeuN (ma cado especí ico pa a o núcleo neu onal) e p o eínas especí icas do ci osquele o neu onal, incluindo os mic o úbulos, Tau e neu o ilamen os (272). Ou seja, as células di e enciadas possuem mais semelhanças bioquímicas, ul aes u u ais, mo ológicas e elec o isiológicas com neu ónios do SNC (271). As células SH-SY5Y êm sido es udadas e usadas como modelo pa a o es udo de á ias doenças degene a i as, incluindo a DP (276-278). Po exemplo, no es udo de mecanismos de oxicidade de compos os com ele ância na pa ogénese da DP: o MPTP (279, 280), a o enona (281-283), o pa aqua o (152, 284), da DA (285, 286), do seu me aboli o DOPAC e do p ecu so L-DOPA (287). Ess e modelo celula oi u ilizado pa a es uda a in luência da AS na pa ogénse da DP, po exemplo, como neu op o ec o (288) ou como indu o de neu o oxicidade (como já oi e e ido an e io men e) ou pa a e i ica a sua in luência nou os mecanismos elacionados com o desen ol imen o da DP, como a ac i idade p o eassomal (289). Es e modelo em sido la gamen e u ilizado no es udo de mecanismos e compos os que possam se neu op o ec o es. U ilizam-se neu o óxicos que con e em neu o oxicidade especí ica nos neu ónios dopaminé gicos e são es ados compos os que con i am neu op o ecção con a o mecanismo de oxicidade. Po exemplo, são a aliados compos os que possam con e i p o ecção con a a neu o oxicidade do MPTP (290, 291), da 6-OHDA (292, 293), da o enona (123, 271, 294-296) e do excesso de H2O2 (297). Es es compos os em es e pode ão se u ilizados como base pa a o desen ol imen o de u u os á macos usados pa a o a amen o da DP. Além da u ilização de compos os que possam mime iza os mecanismo que es ão na o igem da neu odegene ação dopaminé gica associada à DP, podem combina -se com a indução de al e ações gené icas. Os modelos gené icos êm o igem na manipulação de de e minados genes, cuja exp essão pode se al e ada de á ias o mas: delecção do gene de in e esse (modelo knock-ou ), in odução de um gene mu an e (knock-in) ou al e ação da exp essão do gene de in e esse (knock-down, null ou o e -exp ession). Rela i amen e ao es udo da DP, os genes que no malmen e são modi icados são aqueles que se pensa e em in luência di ec a na pa ogénese da doença ( e capí ulo 2.2.4). Os modelos mais u ilizados incluem al e ações gené icas no gene SNCA (in odução de al e ações da exp essão da AS), Pa kin, DJ-1, UCHL1, LRRK2 e PINK1 (237). 55 4.3. Modelos Animais Os modelos animais o e ecem um g au de complexidade mui o supe io do que os di e sos modelos in i o, pelo que mais acilmen e podem ep oduzi as di e sas ca ac e ís icas de uma doença. A u ilidade de um modelo animal pa a o es udo de uma doença depende da p oximidade com que esse modelo eplica em pa e ou no odo as ca ac e ís icas dessa doença. Exis e uma g ande a iedade de modelos animais pa a o es udo da DP, sendo que cada um dá a sua con ibuição pa icula pa a o es udo da doença. Es es modelos animais de i am de uma g ande quan idade de espécies, como po exemplo, oedo es, po cos e p ima as não humanos. São usadas á ias écnicas, incluindo manipulação a macológica, adminis ação de neu o óxicos e modelos gené icos. Apesa de es es modelos não se em idên icos à condição humana no que diz espei o a ca ac e ís icas compo amen ais, ana omia ce eb al ou p og essão da doença, o e ecem an agens signi ica i as pa a o conhecimen o dos mecanismos e desen ol imen o de possí eis a amen os da DP (237). Assim como oi e e ido pa a as cul u as celula es, os es udos com modelos animais podem combina a u ilização de á macos que causem al e ações na ansmissão dopaminé gica e al e ações gené icas nos genes com ele ância no desen ol imen o da DP. Es es modelos isam ob e um modelo mais p óximo da DP (237). Os oedo es como modelo animal ap esen am algumas an agens em elação ao ou os, nomeadamen e a axa de ep odução ele ada, o espaço eduzido necessá io pa a a sua sob e i ência e os egimes alimen a es simples. Nes es animais, é u ilizada maio i a iamen e a adminis ação de neu o óxicos, p incipalmen e a 6-OHDA e o MPTP, como en a i a de mime ização da DP. No en an o, en o os a os e a inhos exis em di e enças de suscep ibilidade aos óxicos. Po exemplo, os a inhos são mais suscep í eis ao MPTP do que os a os, is o de ido à maio concen ação de MAO-B neu onal (Tabela 6) (298). O géne o, a idade e a massa co po al dos a os usados são ac o es impo an es a e em con a, pois a ec am a sensibilidade dos animais aos óxicos e a ep odu ibilidade das lesões neu onais. Os animais jo ens (menos de 8 semanas de idade), êmeas e com peso co po al in e io a 25 g amas são menos sensí eis e as lesões p oduzidas são mais a iá eis. Os animais mais elhos demons am maio sensibilidade aos e ei os dos neu o óxicos dopaminé gicos (299). 56 No en an o, no caso de lesões es e eo áxicas p oduzidas pela 6-OHDA, é a es i pe do a o que pa ece a ec a mais a e ec i idade do p ocesso do que a sua idade. Po exemplo, pa a induzi uma lesão mensu á el em a os Lewis jo ens ou elhos é necessá ia uma dose maio do que pa a os a os Sp ague-Dawley, p o a elmen e de ido à meno quan idade de anspo ado es DAT que os a os Lewis possuem nos seus e minais dopaminé gicos (300). Tabela 6 – Exemplos de es udos que en ol em o uso de neu o óxicos em oedo es como modelo de es udo pa a a DP (adap ado de Embo g e al, 2004). Neu o óxico Modo de adminis ação Espécie Re e ência 6-OHDA In anig al Ra o (Fische ) (301) 6-OHDA In a en icula Ra o (Sp ague-Dawley) (302) 6-OHDA In aes ia al Ra o (Sp ague-Dawley) (303) MPTP Sis émica aguda Ra inho (C57BL) (304) MPTP Sis émica c ónica Ra inho (C57BL) (305) Pa aqua o/Maneb Sis émica c ónica Ra o (Sp ague-Dawley) (306) Pa aqua o/Maneb In ape i onial Ra o (Sp ague- Dawley/Wis a ) (111) An e amina In aes ia al Ra o (Sp ague-Dawley) (307) Ro enona In anig al Ra o (Sp ague-Dawley) (308) Ro enona Subcu ânea Ra o (Inb ed Lew) (254) Ro enona Sis émica c ónica Ra o (Sp ague-Dawley) (76) Apesa da meno suscep ibilidade aos neu o oxócios, o uso de animais jo ens az an agens pa a o es udo da DP. Nomeadamen e, é mais ácil o seu manuseamen o, é mais ácil a écnica de injecção uma ez que o c ânio é mais maleá el e meno empo de anes esia. Usando um mapa es e eo áxico é possí el selecciona zonas ce eb ais especí icas. Tipicamen e, as lesões são unila e iais e as injecções ealizadas na SN, es iado ou no eixe p oesnce álico medial (309-311). A adminis ação de neu o óxicos e ec uada no eixe p oesnce álico medial ou na SN induzem uma quase comple a pe da neu onal dopaminé gica, compa á el à DP na sua ase inal. Em compa ação, a injecção in aes ia al induz uma lesão g a e mas não comple a das células nig ais, equi alen e à DP na ase sin omá ica. A injecção in a-es ia al é um modelo mais ealis a que pe mi e 57 es uda , po exemplo, po enciais neu op o ec o es. Além disso, como é induzida a mo e celula dos neu ónios dopaminé gicos po anspo e e óg ado do neu o óxico, pe mi e uma abe u a empo al pa a a acção de po enciais neu op o ec o es (298). Os a os Sp ague-Dawley, são um modelo animal ex ensi amen e usado nas ciências biomédicas, nomeadamen e em neu ologia em di e sas á eas, po exemplo, isquemia (312, 313) e neu o oxicidade (314, 315). Além disso, os a os Sp ague-Dawley êm sido usados como modelo animal no es udo da DP, po exemplo, no es udo de al e ações compo amen ais p o ocadas po de e minado neu o óxico, ainda no es udo de de e minados á macos como neu op o ec o es con a o e ei o óxico de compos os que são u ilizados como modelo de es udo da DP e no es udo do e ei o de de e minados compos os no sis ema de neu o ansmissão dopaminé gico (316-318). Os a os jo ens são ambém usados como modelo pa a o es udo da DP. Num es udo, o am usados a os Fishe de 5 dias com o objec i o de es uda o mecanismo de oxicidade da 6-OHDA, após injecção in a-es ia al (319). Basendos-e nos es udos que são e ec uados com a o enona, Nasu e colabo ado es usa am a os Wis a de 8 a 15 dias, expos os o almen e aos pi e óides, pa a es uda o e ei o da exposição a es es pes icidas como possí el ac o de suscep ibilidade pa a o desen ol imen o da DP (320). Num ou o es udo, o am usados a os Fishe jo ens de 13 dias, no sen ido de c ia um modelo pa a o es udo da DP. Fo am injec ados com uma es i pe de í us causado da ence ali e, uma ez que oi e i icado que es a es i pe causa al e ações neu onais semelhan es às encon adas na doença, nomeadamen e a pe da neu onal na SN e a gliose (321). Pa a a alia a neu o oxicidade da L-DOPA o am usados a os Sp ague- Dawley de 2 dias, expos os pela ia subcu ânea ao á maco, o que pe mi e uma dose e ec i a no cé eb o dos animais (322). Apesa da meno suscep ibilidade aos neu o oxócios, o uso de animais jo ens az an agens pa a o es udo da DP. Nomeadamen e, é mais ácil o seu manuseamen o, é mais ácil a écnica de injecção uma ez que o c ânio é mais maleá el e meno empo de anes esia. Além disso, é um modelo que pe mi e o es udo da doença em idades jo ens, pois há si uações em que doença nos humanos su ge em ases p ecoces de ida, nomeadamen e no caso de algumas al e ações gené icas (135). A lesão em animais jo ens pe mi e ainda es uda a e olução das ca ac e ís icas isiopa ologicas ce eb ais nos adul os. 58 5. OBJECTIVOS Apesa de odos os mecanismos p opos os pa a a neu odegene ação especí ica da SN, que causa o desen ol imen o da DP, ainda não se conhecem os mecanismos desencadeado es de odas as ca ac e ís icas e sin omas que a doença ap esen a. A DA e o seu p ecu so L-DOPA pa ecem desempenha um papel undamen al como ge ado es de s esse oxida i o, an o pelo seu me abolismo ia MAO-B e au o-oxidação com o mação de ROS e O-quinonas. O me abolismo da DA, dá o igem aos conjugados 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, cujos mecanismos de neu o oxicidade não são ainda comple amen e conhecidos. Assim, es e abalho, usando modelos in i o e in i o, e e como objec i os: De e mina a neu o oxicidade dos compos os DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH- DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, usando como modelo as células dopaminé gicas di e enciadas de i adas de neu oblas oma humano, SH-SY5Y; A alia o en ol imen o do s esse oxida i o no mecanismo de oxicidade des es compos os in i o, a aliando o e ei o neu op o ec o da NAC e o en ol imen o da GSH no mecanismo de p o ecção des as células, a a és do uso da BSO, na linha celula SH-SY5Y; De e mina a neu o oxicidade do compos o 5-S-NAC-DA in i o, após injecção in a-es ia al em a os Sp ague-Dawley; De e mina o ipo de células e o mecanimso de mo e celula induzida pelo conjugado 5-S-NAC-DA, quando injec ado no es iado de a os Sp ague-Dawley. 59 CAPÍTULO II: COMPONENTE EXPERIMENTAL 60 61 MATERIAIS E MÉTODOS 1. Ma e iais Os eagen es e ma e iais usados pa a a cul u a celula o am ob idos aos seguin es o necedo es: meio de cul u a DMEM (meio de Eagle modi icado po Dubelcco), ampão os a o salino, ipsina/EDTA, penicilina/es ep omicina, aminoácidos não essenciais (NEAA) e so o b ino e al (FBS) à Gibco (In i ogen, Paisley). As placas de cul u a de 6 e 48 poços o am adqui idas à Co ning Cos a (Co ning, NY, USA) e os ascos de 25 e 75 cm3 à TPP (T asadingen, Suiça). Todos os ou os eagen es o am adqui idos à Sigma-Ald ich (S . Louis, MO, USA) ou à Me ck (Da ms ad , Alemanha), sal o qualque excepção que é de idamen e e e enciada. Pa a a sín ese dos conjugados de DA, a GSH, L-cis eína (Cis), N-ace ilcis eína (NAC), DA (sal hid oclo ido) e i osinase (P1000 U/mg, EC 232-653-4), o am adqui idas à Sigma-Ald ich (S . Louis, MO, USA). 2. Sín ese dos Conjugados da Dopamina Os conjugados de DA o am sin e izados e pu i icados como desc i o an e io men e (323). Os espec os de in a e melhos o am ob idos num espec o o ome o Spec um 1000 da Pe kin Elme (Beacons iel, UK). As amos as o am analisadas como pas ilhas de b ome o de po ássio ou ou em ilme, sem agen e dispe san e, em células de clo e o de sódio. Os espec os do isí el o am ob idos num espec o o óme o UV/Vis The mo Elec o Helios, en e 200 e 500 nm. Os espec os de essonância magné ica nuclea (NMR) de p o ão e de ca bono o am ob idos num espec óme o B ucke ARX 400, a 400 e 100,62 MHz, espec i amen e. Os des ios de p o ões o am de e minados em unção do sinal do e ame ilsilano que uncionou como pad ão in e no, e os des ios de ca bono em unção do sinal esidual da água (4,7 ppm) e os des ios de ca bono e e enciado de modo indi ec o ao p o ão da água. 68 de ni ocelulose. Foi usado como con olado do bom ca egamen o do gel a ma cação com o co an e e melho de Panceau, que co a de e melho o con eúdo p o eico das memb anas de ni ocelulose. 4.3. Imunohis oquímica Após da la agem das lâminas em TBS com 0,1% T i on X-100, incubou-se com 1,5% de BSA em TBS/T i on po 1h à empe a u a ambien e. Os seguin es an ico pos o am usados: pa a a p o eína nucleica neu onal (an i-NeuN, an ico po monoclonal de a o, 1:200, Chemicon) e pa a a p o eína associada aos mic o ubulos (an i-MAP2, an ico po policlonal de a o, 1:200, DAKO). As lâminas o am inubadas com o an ico po p imá io du an e a noi e a 4ºC e depois com an ico po secundá io (1:200, FITC IgG an i- a o de cab a) po 1 ho a à empe a u a ambien e. As secções o am o og a adas e analisadas eco endo ao mic oscópio de luo escência BX-51 Olympus, na ampliação de 100x. 4.4. Análise Es a ís ica Os esul ados ap esen am-se sob a o ma Média SEM. Pa a a compa ação de 2 g upos (con olo esus a ado) oi usado o es e não pa amé ico de Mann-Whi ney. Os alo es de p in e io es a 0,05 o am acei es como es a is icamen e signi ica i os. 69 RESULTADOS EXPERIMENTAIS 1. Resul ados das Expe iências in i o com as Células SH-SY5Y 1.1. Ci o oxicidade da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC- DA A Figu a 20 mos a os e ei os da DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S- NAC-DA em concen ações c escen es (10, 100, 500 e 1000 M) e di e en es empos de exposição (24, 48 e 72h) na iabilidade celula da linha neu onal di e enciada SH-SY5Y a a és do ensaio da me abolização do MTT. Ve i icou-se que odos os compos os es ados p o oca am a diminuição da iabilidade celula de uma o ma dependen e da concen ação e do empo de incubação. A DA (Figu a 20A) p o ocou diminuição da iabilidade celula es a is icamen e signi ica i a na concen ação de 100 M, quando as células são incubadas du an e 48h e 72h, mas pa a a concen ação de 500 M a diminuição da iabilidade celula é já es a is icamen e signi ica i a após o pe íodo de exposição de 24h. No caso da L-DOPA (Figu a 20B) e do DOPAC (Figu a 20C), me aboli o da DA, a iabilidade celula é eduzida pa a alo es es a is icamen e di e en es do con olo apenas a pa i da concen ação de 500 M, sendo que es a edução é isí el a odos os empos de incubação es udados. Ao con á io da DA, es es compos os não p o oca am diminuição da iabilidade celula pa a a concen ação de 100 M. Os compos os conjugados da DA, a 5-S-GSH-DA e a 5-S-NAC-DA (Figu a 20D e 20F, espec i amen e) são aqueles que mais eduzi am a iabilidade celula após 24h de exposição, po compa ação com o conjugado 5-S-Cis-DA (Figu a 20E). Pa a empos de exposição supe io es a 24h es es 3 compos os eduzi am a iabilidade celula de uma o ma semelhan e. Os compos os 5-S-GSH-DA 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA (Figu a 20D, 20E e 20F, espec i amen e), causa am uma diminuição da iabilidade celula es a is icamen e signi ica i a a pa i da concen ação de 100 M. Nes a concen ação, em odos os 70 empos de incubação, e pa a os 3 conjugados, a di e ença ob ida em elação ao con olo oi es a is icamen e signi ica i a. Figu a 20 – Viabilidade das células SH-SY5Y após exposição aos di e en es compos os a aliada pelo ensaio MTT. Os dados são ap esen ados como pe cen agem de con olo, ao qual oi a ibuído o alo de 100% (n=18 de 3expe iências independen es). As compa ações en e g upos pelo es e de S uden -Newman-Keuls o am e ec uadas após o es e de K uskal-Wallis. **p<0,01 con olo s. compos o; ++p<0,01 compos o 24h s. compos o 48h; ##p<0,01 compos o 48h s. compos o 72h. DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4- dihid oxi enilacé ico, L-DOPA – le odopa, 5-S-Cis-DA – 5-S-cis einildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S- glu a ionildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-ace ilcis einildopamina. 71 A Figu a 21 ap esen a a mo e celula a aliada pela ac i idade da enzima LDH, aquando da incubação da linha celula SH-SY5Y com os compos os DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S- GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA, a di e en es concen ações (10, 100, 500 e 1000 M) e di e en es empos de exposição (24, 48 e 72h). Ve i icou-se que pa a odos os compos os es udados a libe ação da LDH oco e de uma o ma dependen e da concen ação e do empo de exposição. Ve i icou-se que a mo e celula p o ocada pela exposição à DA é es a is icamen e di e en e ela i amen e ao con olo pa a as concen ações de 500 e 1000 M em odos os empos de exposição (Figu a 21A). Na DA na concen ação de 1000 M às 24h de exposição a mo e celula é já supe io a 50%. No caso da L-DOPA (Figu a 21B) e i icou-se que na concen ação de 500 M (a 24h e 48h) e de 1000 M (a 24h), a mo e celula não ul apassa os 25%, apesa de se signi ica i amen e di e en e do con olo. Tal como a DA, a exposição ao DOPAC (Figu a 21C) p o ocou mo e celula es a is icamen e signi ica i a ela i amen e ao con olo pa a as concen ações de 500 e de 1000 M, em odos os empos de exposição, sendo que na concen ação de 500 M às 72h de exposição a mo e celula é já supe io a 75%. Os conjugados 5-S-GSH-DA e 5-S-NAC-DA (Figu a 21D e 21F, espec i amen e) causa am mo e celula es a is icamen e signi ica i a ela i amen e ao con olo pa a concen ações supe io es a 100 M a odos os empos de exposição. A pa i da concen ação de 500 M ambos os compos os p o ca am ap oximadamen e 100% de mo e celula , pa a odos os empos de incubação. O compos o 5-S-Cis-DA (Figu a 21E) p o ocou a mo e celula pa a concen ações supe io es a 500 M, a odos os empos de exposição, de modo es a is icamen e signi ica i o em elação ao con olo. Pa a a concen ação de 1000 M nos empos de exposição de 48 e 72h e i ocu-se ap oximadamen e 80% de mo e celula . 72 Figu a 21 - Pe cen agem de mo alidade celula após exposição das células SH-SY5Y aos di e en es compos os. Os dados são ap esen ados como pe cen agem do ácio en e a ac i idade da LDH ex acelula e da LDH o al (n=18 de 3 expe iências independen es). As compa ações en e g upos pelo es e de S uden - Newman-Keuls o am e ec uadas após o es e de K uskal-Wallis. **p<0,01 con olo s. compos o; ++p<0,01 compos o 24h s. compos o 48h; ##p<0,01 compos o 48h s. compos o 72h. DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4-dihid oxi enilacé ico, L-DOPA – le odopa, 5-S-Cis-DA – 5-S-cis einildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S- glu a ionildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-ace ilcis einildopamina. 73 1.2. Ní eis de GSH In acelula após Exposição aos Compos os DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA A Figu a 22 ap esen a a concen ação de GSH in acelula e o con eúdo p o eico das células SH-SY5Y, 24h após a exposição às concen ações de 10, 100, 500 e 1000 M dos di e en es compos os. Ve i icou-se que, na gene alidade, os compos os es udados p o oca am a diminuição do con eúdo p o eico de uma o ma dependen e do aumen o da concen ação e do pe íodo de exposição. No en an o, hou e um aumen o da concen ação de GSH in acelula após exposição a algumas das concen ações es adas. Ve i icou-se que quando as células são expos as à DA du an e 24h, na concen ação de 100 M, o con eúdo p o eico aumen ou de modo es a is icamen e signi ica i o em elação ao con olo. Pelo con á io, pa a concen ações mais ele adas o con eúdo p o eico diminuiu, a ingindo alo es p a icamen e nulos na concen ação de 1000 M. No en an o, e i icou-se que a concen ação de GSH in acelula aumen ou de o ma es a is icamen e signi ica i a em elação ao con olo pa a concen ações iguais ou supe io es a 100 M, apesa da diminuição acen uada do con eúdo p o eico. Ve i icou-se que a exposição à L-DOPA (Figu a 22C e D) p o ocou uma espos a das células semelhan e àquela p omo ida pela DA, ela i amen e à concen ação in acelula de GSH e con eúdo p o eico. No en an o, o aumen o da concen ação de GSH é es a is icamen e di e en e do con olo pa a concen ações iguais ou supe io es a 500 M. O compos o DOPAC (Figu a 22E e 22F) p o ocou o aumen o da concen ação de GSH in acelula pa a concen ações iguais ou in e eio es a 500 M. Is o apesa da diminuição es a i icamen e signi ica i a, em odas as concen ações es adas, do con eúdo p o eico, de uma o ma depende da concen ação. Dada a eduzida quan idade de células p esen es, após o pe íodo de exposição não oi possí el quan i ica a concen ação de GSH e o con eúdo p o eico pa a o compos o DOPAC na concen ação de 1000 M assim como pa a o conjugado 5-S-NAC-DA pa a as concen ações de 500 M e 1000 M. Pa a o conjugado 5-S-GSH-DA, não oi possí el quan i ica a concen ação de GSH pa a as concen ações de 500 M e 1000 M, nem o con eúdo p o eico pa a a concen ação de 1000 M. Nes es casos, a quan idade que de GSH que de p o eína encon a a-se abaixo do limi e de de ecção do mé odo. 74 Quando as células são expos as ao conjugado 5-S-Cis-DA (Figu a 22I e J), e i icou-se um aumen o da concen ação da GSH in acelula dependen e da concen ação usada, apesa des e não se es a is icamen e signi ica i o em elação ao con olo. No en an o, e i icou-se uma diminuição do con eúdo p o eico de uma o ma dependen e da concen ação, cujas di e enças são es a is icamen e signi ica i as em elação ao con olo pa a as concen ações de 500 e 1000 M. Ve i icou-se que os conjugados 5-S-GSH-DA (Figu a 22G e H) e 5-S-NAC-DA (Figu a 22K e L) p o oca am um aumen o da concen ação de GSH, apenas pa a a concen ação de 100 M. Apesa de pa a a concen ação de 500 e 1000 M não e sido possí el quan i ica a concen ação de GSH, pa a as concen ações de 10 e de 100 M hou e um dec éscimo do con eúdo p o eico, de uma o ma dependen e da concen ação. No en an o, esse dec éscimo apenas oi es a is icamen e signi ica i o no caso do conjugado 5-S-NAC-DA na concen ação de 100 M. 75 76 Figu a 22 – Ní eis de GSH in acelula e con eúdo p o eico das células SH-SY5Y, 24h após a exposição às concen ações de 10, 100, 500 e 1000 µM dos compos os. Os dados de concen ação in acelula de GSH encon am-se no malizados de aco do com o con eúdo p o eico. Os dados do con eúdo p o eico são ap esen ados como pe cen agem do espec i o con olo, ao qual oi a ibuído o alo de 100% (n=9 de 3 expe iências independen es). As compa ações en e g upos pelo es e de S uden -Newman-Keuls o am e ec uadas após o es e de K uskal-Wallis. *p<0,05 con olo s. compos o; **p<0,01 con olo s. compos o. DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4-dihid oxi enilacé ico, L-DOPA – le odopa, 5-S-Cis-DA – 5-S- cis einildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S-glu a ionildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-ace ilcis einildopamina. 77 1.3. E ei o do P é- a amen o com NAC e BSO na Ci o oxicidade da DA, L- DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA Tal como oi e e ido na secção da me odologia expe imen al, pa a os ensaios com os compos os BSO e NAC, escolheu-se a concen ação de 500 M e o pe íodo de exposição de 24h pa a odos os compos os. A Figu a 23 mos a a iabilidade celula , a aliada pelo es e da me abolização do MTT, e a mo e celula , a aliada ensaio da libe ação da LDH, aquando da incubação das células SH-SY5Y po um pe íodo de 24h. As células o am subme idas ao p é- a amen o com NAC (1 mM), BSO (25 M) ou ambos, 30 minu os an es da exposição aos compos os em es udo. A p é-incubação apenas com NAC, BSO ou ambos, não a ec a pe si a iabilidade celula , na concen ação e empos de exposição es udados. Ve i icou-se, em odos os compos os, que a p é-incubação das células com NAC, an es da exposição ao compos o em es e, e i ou em la ga medida a mo e celula . Ve i icou-se, ainda, que de uma o ma ge al a odos os compos os a p é-incubação com BSO p omo eu uma diminui ção da iabilidade celula . No caso da incubação com a DA (Figu a 23A e B), e i icou-se que o p é- a amen o com NAC e NAC com BSO p e eniu la gamen e a pe da de iabilidade celula . O p é- a amen o apenas com BSO p o ocou um ag a amen o signi ica i o da mo e celula ela i amen e à condição em que as células são apenas incubadas com a DA Pa a os compos os L-DOPA (Figu a 23C e D) e DOPAC (Figu a 23E e F) o p é- a amen o com NAC e NAC com BSO e i ou la gamen e a mo e celula de uma o ma es is icamen e signi ica i a. Po ou o lado, a p é-incubação com BSO po enciou a mo e celula de uma o ma es is icamen e signi ica i a. Pa a os compos os DA, L-DOPA e DOPAC, o p é- a amen o com NAC e i ou na quase o alidade a ci o oxicidade dos compos os. De igual o ma, a p é-incubação com NAC jun amen e BSO e i ou na quase o alidade a ci o oxicidade dos compos os. Rela i amen e ao conjugado 5-S-GSH-DA (Figu a 23G e H) e i icou-se que o p é- a amen o com NAC p e eniu de uma o ma es a is icamen e signi ica i a a neu o oxicidade em elação ao a amen o apenas com o conjugado. O p é- a amen o com BSO p o ocou um aumen o bas an e signi ica i o da mo e celula . Além disso, 84 1.5. Obse ação mic oscópica das células SH-SY5Y A obse ação mic oscópica das células SH-SY5Y após exposição aos compos os DA, L- DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC (500 M) pelo pe íodo de 24h de exposição (Figu a 25) demons a uma cla a e idência de mo e celula , com algumas ca ac e ís icas apop ó icas: desin eg ação de dend i es, agmen ação do núcleo e encolhimen o do ci oplasma. O p é- a amen o com NAC p e ine em la ga medida os e ei os ci o óxicos a ní el mo ológico no caso de DA, L-DOPA, DOPAC, 5-S-GSH-DA e 5-S-Cis-DA mas não no caso dos compos os 5-S-NAC-DA. 85 Figu a 25 – Fo og a ias das células SH-SY5Y ob idas no mic oscópio in e ido de cons as e de ase após 24h de exposição aos compos os na cencen ação de 500 M (ampliação 400x), sem ou com p é-incubação com NAC (1mM). DA – dopamina, DOPAC – ácido 3,4-dihid oxi enilacé ico, L-DOPA – le odopa, NAC – N- ace ilcis eína, 5-S-Cis-DA – 5-S-cois einildopamina, 5-S-GSH-DA – 5-S-glu a ionildopamina, 5-S-NAC-DA – 5-S-N-ace ilcis einildopamina 86 2. Resul ados das Expe iências in i o nos Ra os Sp ague-Dawley 2.1. Mo e celula p o ocada pelo conjugado 5-S-NAC-DA Ra os Sp ague-Dawley de 7 dias de idade o am injec ados a ní el es ia al com 4,26 ng de 5-S-NAC-DA. Após 24h, e i icou-se a mo e celula causada pela adminis ação do conjugado da DA a a és do uso do co an e PI, al como desc i o na secção da me odologia. As células PI-posi i as o am encon adas no lado ipsila e al (di ei o) do es iado nos a os adminis ados com 5-S-NAC-DA mas não no lado con a-la e al (esque do), nem no es iado dos animais con olo, injec ados apenas com PBS (Figu a 26). Ve i icou-se que a quan idade de células ma cadas com PI no es iado dos animais a ados com 5-S-NAC-DA é signi ica i amen e maio que nos animais a ados com PBS (Figu a 27A). Além disso, quando analisadas 3 zonas di e en es do es iados e i icou-se que em odas essas zonas, a quan idade de células ma cadas com PI é signi ica i amen e maio nos animais a ados do que nos animais con olo (Figu a 27B). Apesa de e em sido ealizados co es his ológicos a é à á ea ce eb al da SN, não se encon a am nessa á ea células PI-posi i as. Pa a e i ica se e am as células neu onais as mais a ec adas pela oxicidade do compos o, as secções p e iamen e ma cadas com PI o am subme idas a ma cação imunoci oquímica com um an ico po especí ico pa a o núcleo neu onal, NeuN. Ve i icou- se uma o e co-localização en e os 2 ma cado es, indicando que as células a ec adas pela neu o oxicidade do compos o são undamen almen e neu onais (Figu a 28). 87 Figu a 26 - Ma cação das secções do es iado com PI isualizada em o og a ias de mic oscopia de luo escência (ampliação 100x). As secções es ia ais dos animais o am ob idas após injecção in a-es ia al com 5-S-NAC-DA ou apenas PBS. D – lado di ei o, ipsila e al; E – lado esque do, con ala e al. 88 Figu a 27 - Núme o de células PI-posi as nos animais con olo (n=5) e a ados com 5-S-NAC-DA (n=5) (A) e núme o de células PI-posi i as em 3 di e en es à eas do es iado (A. B e C) dos animais con olo (n=5) e a ados com 5-S-NAC-DA (n=5) (B). As compa ações en e g upos o am e ec uadas pelo es e de Mann- Whi ney. *p<0,05 animais con olo s. animais a ados, es e de Mann-Whi ney. CC – có ex ce eb al, HC – hipocampo, ST – es iado. D – lado di ei o, ipsila e al; E – lado esque do, con ala e al. Figu a 28 - Co-localização da ma cação com PI ( e melho) e NeuN ( e de) isualizada em o og a ias de mic oscopia de luo escência (ampliação 100x). As secções es ia ais dos animais o am ob idas após injecção in a-es ia al com 5-S-NAC-DA ou apenas PBS, no caso dos os animais con olo. 89 2.2. Exp essão da caspase-3, p17, α-espec ina e PKCα no Es iado Pa a a alia o ipo de mo e neu onal após adminis ação in a-es ia al do me aboli o 5-S- NAC-DA aos animais, e i icou-se a exp essão de caspase-3 (CPP32) não cli ada e cli ada (p17). No es iado dos animais a ados é maio a quan idade de caspase-3 do que nos animais con olo, apesa des a di e ença não se es a is icamen e signi ica i a. Não oi de ec á el a exp essão de caspase-3 cli ada nos dois ipos de a amen o (Figu a 31A). Usou-se, ainda, como ma cado especi ico do dano neu onal, a cli agem da p o eína α- spec ina (ASP). A o mação de agmen os com 150/145 kDa de peso molecula daquela p o eína é signi ica i amen e maio no es iado dos animais a ados com 5-S-NAC-DA do que nos animais con olo, com um aco aumen o da o mação de agmen os com 120 kDa. Ve i icou-se ainda uma diminuição da quan idade da subunidade α da p o eína cinase C (PKCα) no es iado dos animais a ados com 5-S-NAC-DA em compa ação com os animais a ados apenas com PBS, apesa de es a não se es a is icamen e signi ica i a (Figu a 31B). 90 Figu a 29 - Exp essão da caspase-3 (CPP32), caspase-3 cli ada (p17) (A), de α-espec ina e de PKCα (B) no es iado dos animais con olo injec ados com PBS (n=5) e animais a ados com 5-S-NAC-DA (n=5). As compa ações en e g upos o am e ec uadas pelo es e de Mann-Whi ney (*p<0,05 animais con olo s. a ados). * 91 CAPÍTULO III: DISCUSSÃO E CONCLUSÕES 92 93 DISCUSSÃO 1. Discussão dos Resul ados das Expe iências in i o com as Células SH- SY5Y Nes e es udo oi a aliado o po encial neu o óxico da DA, do seu p ecu so L-DOPA, do seu me aboli o DOPAC e dos seus conjugados 5-S-GSH-DA, 5-S-Cis-DA e 5-S-NAC-DA,, na linha neu onal dopaminé gica di e enciada SH-SY5Y de i ada de um neu oblas oma humano. Es e es udo é o p imei o a a alia a neu o oxicidade de odos es es compos os em células humanas dopaminé gicas. Nes e abalho oi usado como ac o de di e enciação da linha celula a incubação das células 6 dias com RA, de modo a aumen a o seu enó ipo dopaminé gico. Em es udos an e io es e i icou-se que não há di e enças en e a exp essão de DAT e TH em células di e enciadas com RA e não di e enciadas (272, 273, 329). Com ou o p o ocolo de di e enciação, as células di e enciadas com RA/TPA exibem maio ci o oxicidade e dis unção mi ocond ial, como consequência do a amen o com MPTP, que pode á se de ido ao aumen o da suscep ibilidade das células di e enciadas des e modo, uma ez que exp essam mais DAT e TH (mas meno VMAT) (273). Po ou o lado, a di e enciação apenas com RA aumen a a exp essão de Bcl-2 (p o eína an i-apop ó ica) e diminui a exp essão de p53 (p o eína p ó-apop ó ica) (330). O RA ac i a casca as de sinalização que p omo em a sob e i ência celula e eduzem a suscep ibilidade a neu o óxicos (331). O RA é ambém usado com o objec i o de ob e p o piedades mais semelhan es com os neu ónios madu os, como o c escimen o de neu i es (332). Demons ou-se que odos os compos os es udados p omo em neu o oxicidade de uma o ma dependen e da concen ação e do empo de exposição. Reco endo aos ensaios de me abolização do MTT e de libe ação da enzima LDH, e i icou-se que os compos os que p omo em maio oxicidade são os conjugados 5-S-GSH-DA e 5-S-NAC-DA, pois são aqueles que p o ocam maio ci o oxicidade em concen ações e empos meno es. O compos o 5-S-Cis-DA, e elou uma neu o oxicidade meno que os dois an e io es. Além disso, e i icou-se que são aqueles que p o ocam uma diminuição mais acen uada do con eúdo p o eico da cul u a celula , chegando a alo es não quan i icá eis, pelo mé odo usado, na concen ação de 500 M às 24h de exposição. 100 e es ando a enzima -GS inibida, a concen ação de GSH pode á diminui de ido à conjugação da GSH com os compos os. Ve i icou-se que, aquando da exposição das células aos conjugados 5-S-GSH-DA e 5-S- NAC-DA na concen ação de 500 M pelo pe ído de 24h não oi possí el a quan i icação da GSH in acelula . Is o de eu-se á ele ada ci o oxicidade des es compos os nes as condições. No en an o, a p é-incubação com NAC, an es da exposição à 5-S-GSH-DA p omo eu o aumen o da GSH, inclusi amen e sendo maio que em elação às células incubadas só com NAC. Nes e caso, a NAC ao exe ce a sua unção an ioxidan e e dado a de cis eína, es á a exe ce uma unção neu op o ec o a con a a oxicidade do conjugado, e i ando pa cialmen e a mo e celula , o nando-se possí el quan i ica o con eúdo de GSH in acelula . Ve i icou-se que a concen ação de GSH quando as células são a adas com 5-S-Cis-DA ou com NAC e 5-S-Cis-DA não é es a is icamen e di e en e. Sabendo-se que o conjugado 5-S-Cis-DA é um es ímulo à p odução de GSH, a NAC pode es a a se dado de cis eína e exe ce a unção de an ioxidan e e, po an o, a concen ação de GSH não a ia com o p é- a amen o com NAC. Ve i icou-se que quando as células são a adas com 5-S-NAC-DA, apesa de p é- incubadas com NAC, BSO, ou ambas, não oi possí el aze quan i ca as p o eínas e i adas do poço de cul u a. A concen ação de 500 M des e compos o é mui o ci o óxica, pelo que quase a quase o alidade das células p esen es na cul u a celula mo e am nes e pe íodo de exposição. Mesmo na p esença da NAC, como an ioxidan e e dado de cis eína, o s esse oxida i o ge ado pa ece se de al o dem que a neu op o ecção con e ida po es e compos o nes e pe íodo oi insu icien e. É impo an e e e i que o meio de cul i o usado na cul u a das células SH-SY5Y, p incipalmen e após incubação com os compos os em es udo, ap esen a uma co p e a/acas anhada, mais escu a após incubação com os conjugados da DA Es a colo ação co esponde à o mação de políme os do ipo melanina, de i ados da au o- oxidação dos compos os usados, nomeadamen e da DA e dos seus conjugados (164). Nou os es udos publicados e i ica-se que o meio de cul u a escu ece aquando da incubação das células em cul u a com α-MeDA (α-me ildopamina) e N-Me-α-MeDA (N- me il-α-me ildopamina), em consequência da sua oxidação aos co esponden es aminoc omos e conjugação com GSH, é acompanhada da diminuição da sua concen ação no meio. Os aminoc omos podem ainda se oxidados e conduzi à o mação de um políme o do ipo melanina (346, 347). O mesmo acon ece com os 101 conjugados de DA, podendo so e oxidação, ciclização e o ma em-se aminoc omos (147, 207, 222). 2. Discussão dos Resul ados das Expe iências in i o com os Ra os Sp ague-Dawley Pa a os es udos in i o com os a os Sp ague-Dawley de 7 dias, oi seleccionado o conjugado 5-S-NAC-DA pois oi, en e odos os compos os es udados, aquele que p o ocou maio ci o oxicidade in i o nas células SH-SY5Y. Além disso, dado que es e compos o esul a da me abolização e minal ia àcidos me cap u icos, a pa i de ou os conjugados com GSH. Impo an e é ambém e e i que não exis em es udos que enham e i icado a neu o oxidade des e conjugado em animais. Como já oi e e ido na in odução, os a os jo ens podem se usados como modelo de es udo da DP, nomeadamen e, no es udo de ac o es que pode ão aumen a a suscep ibilidade pa a o desen ol imen o da doença. Sabendo-se que os conjugados da DA se o mam nos neu ónios dopaminé gicos os animais jo ens podem se usados como modelo pa a o es udo da suscep ibilidade que es es compos os con e em. A u ilização de animais jo ens e ela-se ainda ú il como con i mação dos esul ados ob idos in i o. Po exemplo, num es udo comp o ou-se que a L-DOPA, que p o ocou neu o oxicidade in i o, mas não p o ou se neu o óxica quando injec ada em animais de 2 dias, mesmo quando injec ados p e iamen e com BSO (322). Nes e caso oi usada a injecção in a-es ia al como mé odo de exposição ao 5-S-NAC- DA, pois des a o ma é induzida uma lesão não comple a das células nig ais, equi alen e à DP na ase sin omá ica e inicial (298). O PI é um co an e usado em es udos in i o e in i o pa a ma ca células nec ó icas pois é incapaz de a a essa memb anas não dani icadas (312). Ve i icou-se nes e abalho que, quando o compos o 5-S-NAC-DA é injec ado no es iado do cé eb o de a o, há mo e celula em quan idade signi ica i a. As células a ec adas p o a am se undamen almen e neu ónios de ido à co-localização de células PI-posi i as e NeuN- posi i as, uma ez que o NeuN é um an ico po especí ico usado pa a ma cação do núcleo neu onal (348). Não o am encon adas células PI-posi i as na SN, p o a elmen e de ido à não di usão do conjugado a é es a zona do cé eb o. A caspase-3 (CPP32 ou apopaína) é uma p o eína apóp ica. A p esença de um sinal apop ó ico p o oca a cli agem des a p o eína (32 kDa) pa a na sua o ma ac i a, que 102 consis e em subunidades de 17 kDa (ASP175) e 12 kDa, p omo e a cli agem e ac i ação de ou as p o eínas apop ó icas (349). Ve i icou-se nes e es udo que o compos o 5-S-NAC-DA le a ao um aumen o, não es is icamen e signi ica i o, da exp essão da CPP32, sem o co esponden e aumen o da p17, ou seja, apesa de ha e mo e celula es a pa ece se independen e da ac i ação da capase-3. A p o eína α-especc ina (ASP, ambém chamada α- od ina) é uma componen e es u u al da memb ana celula dos neu ónios, abundan e nos axónios e e minais p é- sináp icos, e pensa-se es a en ol ida na libe ação de neu o ansmisso es (350). É ainda um subs a o de p o eínas en ol idas da nec ose, como as calpaínas, e na apop ose como a caspase-3 (351). A ASP é cli ada pela calpaína em 2 agmen os, SBDP150 (150 kDa) e SBDP145 (145 kDa), e é cli ada pela caspase-3 em 2 agmen os, SBDP150 e SBDP120 (120 kDa), sendo que es e úl imo é maio i á io (351, 352). Assim, é possí el dis ingui uma si uação de mo e nec ó ica da apop ó ica a a és do pe il de deg adação da ASP. Ve i icou-se a p esença des es agmen os em modelos de dano neu onal apop ó ico e nec ó ico in i o (353) e in i o em a os (312) e em es udos de dano aumá ico neu onal em humanos (354, 355). Ve i icou-se nes e es udo um aumen o da de ecção dos agmen os de 145/150 kDa da ASP, sem exp essão de agmen os de amanho 120 kDa, indicando a p esença de mo e neu onal do ipo nec ó ica, quando os animais são injec ados com 5-S-NAC-DA. A de ecção des es agmen os nos animais con olo (injec ados com PBS) pode de e -se ao auma ismo p o ocado pela punção da agulha no es iado, algo ine en e ao mé odo. A di e ença en e os animais con olo e a ados é signi ica i a, podendo admi i -se que o 5-S-NAC-DA p omo e mo e neu onal essencialmen e po nec ose. A amília das p o eínas cinases C (PKC) es á en ol ida num g ande núme o de p ocessos celula es como o c ecimen o, di e enciação e sec eção de ci ocinas (356). A iso o ma α (PKCα, 82 kDa) é um subs a o da calpaína (357), que numa si uação em que há ac i ação des a enzima, como na nec ose, há deg adação de PKCα. Ve i icou-se uma diminuição da exp essão da PKCα nos animais a ados, apesa de não se es a is icamen e signi ica i a. Is o mos a uma endência e iden e pa a a indução de nec ose pelo compos o 5-S-NAC-DA, conjun amen e com os dados ob idos com a ASP, ou seja, uma ac i ação das enzimas calpaínas, que po um lado deg adam a ASP nos seus agmen os 145/150 kDA e ambém deg adam a PKCα. Ve i icou-se que du an e o desen ol imen o do cé eb o ima u o a apop ose neu onal é um mecanismo que con ola o núme o de neu ónios e as conecções neu onais. Pensa-se que o cé eb o ima u o p o ege-se que qualque e en o aumá ico des a o ma, ac i ando 103 a ia apop ó ica dependen e das caspases (319). Es e ac o dá mais ele ância à mo e celula po nec ose causada pela exposição dos animais ao conjugado, uma ez que os dados ob idos e idenciam que, apesa de ha e algum aumen o de ac i idade apop ó ica (pelo aumen o da ac i idade das caspases-3), e i icou-se uma endência e iden e pa a a mo e celula po nec ose. Assim sendo, o p ocesso p omo ido neu o óxico p omo ido pelo compos o não se encon a elacionado com a ac i ação de casca as de mo e celula deco en es do no mal p ocesso de ma u ação ce eb al. Os animais o am sac i icados 24h após injecção in a-es ia al de 5-S-NAC-DA po que, apesa de in i o já se ob e diminuição de iabilidade celula a concen ações mais baixas que pa a ou os compos os em es udo, es udos an e io es pe mi i am e i ica que a injecção in a-nig al de 6-OHDA em a os Sp ague-Dawley p o ocou a mo e celula neu onal ao im de 12h (358). Um ou o es udo pe mi iu e i ica que a injecção de doses subc ónicas de MPTP em a inhos p o ocou a ac i ação de caspases ao im de 24-48h (359). A é à da a, não o am encon ados ou os es udos que pe mi am compa a os esul ados ob idos in i o com o conjugado 5-S-NAC-DA, após injecção in a-es ia al ou ou o meio de adminis ação. Es e es udo e ela-se de maio impo ância pa a, pela p imei a ez, demons a que es e compos o causa neu o oxicidade in i o quando a os Sp ague- Dawley são subme idos a injecção in a-es ia al. Os es udos in i o em a os Sp ague-Dawley pe mi i am con i ma in i o a neu o oxicidade do conjugado da DA 5-S-NAC-DA, ob ida in i o na linha celula de neu ónios dopaminé gicos humanos SH-SY5Y. Além disso, es e es udo em a os con i ma o pe il de mo e celula p edominan emen e nec ó ica que es e compos o p omo e. Ao se acumulado no cé eb o humano, a pa i do momen o em que a DA es eja a se p oduzida e me abolizada, que enzima icamen e que pela conjugação com a GSH, a o mação des e conjugado pode con e i um ac o de suscep ibilidade impo an e pa a o u u o desen ol imen o da DP. Além disso, num indi íduo que possua ou os ipos de ac o es de suscep ibilidade, como al e ações gené icas ele an es ou exposição c ónica a alguns dos compos os neu o óxicos, como os pes icidas o enona ou pa aqua o, pode encon a no 5-S-NAC um ac o de suscep ibilidade adicinal pa a o desen ol imen o da doença. 104 CONCLUSÕES A doença de Pa kinson é a segunda doença neu odegene a i a mais equen e. È ca ac e izada pela neu odegene ação especí ica da subs ância neg a acompanhada pela diminuição signi ica i a de dopamina em odos os componen es dos gânglios basais e pela p esença de co pos de Lewi. A doença é de e iologia desconhecida mas pensa-se que a p esença de dopamina nos neu ónios dopaminé gicos pode á se um impo an e ac o pa a a neu odegene ação.Os conjugados de dopamina, cuja exis ência e o mação se comp o ou no cé eb o de humanos pode ão se mais eac i os que a p ó p ia dopamina, con ibuindo pa a a neu odegene ação dopaminé gica e o desen ol imen o da doença de Pa kinson. Es e abalho pe mi iu conclui que:  Todos os compos os es udados o am neu o óxicos nas células dopaminé gicas SH-SY5Y de uma o ma dependen e do aumen o do empo de exposição e do aumen o da concen ação;  As células SH-SY5Y aumen a am a concen ação de GSH in acelula como espos a ao insul o neu o óxico p omo ido pelos compos os es udados;  O p é- a amen o com NAC con e iu neu op o ecção signi ica i a con a a oxicidade dos compos os, indicando que in i o o mecanismo de oxicidade des es inclui o s esse oxida i o;  O p é- a amen o com BSO, um inibido da enzima limi an e da sín ese da GSH, aumen ou a oxicidade dos compos os es udados nas células SH-SY5Y, indicando que a GSH é um mecanismo de neu op o ecção impo an e con a o insul o des es compos os;  O compos o 5-S-NAC-DA, que e elou ele ada neu o oxicidade in i o, p o ocou neu o oxicidade in i o p omo endo a mo e celula po nec ose, quando injec ado no es iado de a os Sp ague-Dawley  O mecanismo de oxicidade dos conjugados da DA, que in i o que in i o, dependeu la gamen e do s esse oxida i o que es es compos os p omo em. 105 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 106 107 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 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