Biomarcadores na Doença Inflamatória Intestinal

0 Dissertação - Artigo de Revisão Bibliográfica Mestrado Integrado em Medicina BIOMARCADORES NA DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL Marcos Miranda da Silva Orientador: Doutor Fernando Manuel de Castro Poças PORTO, 2013 1 BIOMARCADORES NA DOENÇA INTESTINAL INFLAMATÓRIA Dissertação de candidatura ao grau de mestre em Medicina, submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Autor: Marcos Miranda da Silva Categoria: 6º Ano do Mestrado Integrado em Medicina Afiliação: Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar - Universidade do Porto Endereço: Rua de Jorge Viterbo Ferreira n.º 228, 4050-313, Porto E-mail: [email protected] Orientador: Doutor Fernando Manuel de Castro Poças Categoria: Professor Auxiliar Convidado no Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar. Assistente Hospitalar Graduado de Gastrenterologia, Centro Hospitalar do Porto. PORTO, 2013 2 Agradeço ao Doutor Castro Poças pela disponibilidade e orientação. 3 Índice Lista de Abreviaturas ................................................................................................................4 Resumo.......................................................................................................................................6 Abstract .......................................................................................................................................7 1. Introdução ..............................................................................................................................8 2. Marcadores sorológicos de resposta aguda à inflamação ............................................10 2.1 PCR no diagnóstico de DII e diferenciação DC versus CU ....................................10 2.2 PCR na avaliação de doentes com DII ......................................................................11 3. Marcadores sorológicos - Anticorpos ...............................................................................13 3.1 Anticorpos contra agentes microbianos .....................................................................13 3.2 Auto-anticorpos .............................................................................................................14 3.3 Utilidade no diagnóstico das DII .................................................................................15 3.4 Distinção entre DC e CU ..............................................................................................16 3.5 Utilidade na estratificação fenotípica, prognóstico e resposta à terapia ...............18 4. Outros marcadores sorológicos ........................................................................................20 5. Marcadores Fecais .............................................................................................................21 5.1 Calprotectina..................................................................................................................21 5.2 Lactoferrina ....................................................................................................................22 5.3 S100A12.........................................................................................................................22 5.4 M2-PK .............................................................................................................................23 5.5 Utilidade na diferenciação entre DII e doenças gastrointestinais não-DII .............23 5.6 Utilidade na avaliação da atividade da doença.........................................................25 5.7 Utilidade na avaliação à resposta terapêutica e da cicatrização da mucosa .......26 5.8 Utilidade na previsão de recorrência da DII ..............................................................28 6. Biomarcadores do futuro ....................................................................................................29 6.1 Estudos metabólicos ....................................................................................................29 6.2 Perfis de expressão genética ......................................................................................30 6.3 Análises proteómicas ...................................................................................................30 7. Conclusão ............................................................................................................................32 8. Bibliografia ...........................................................................................................................34 9. Anexos ..................................................................................................................................49 4 Lista de Abreviaturas 5-ASA – 5-Aminossalicilatos ACCA – Anti-Chitobioside Carbohydrate Antibody AINE – Anti-Inflamatório Não-Esteróide ALCA – Anti-Laminaribioside Carbohydrate Antibody AMCA – Anti-Mannobioside Carbohydrate Antibody ANCA – Anticorpo anti-citoplasma de neutrófilos Anti-A4-Fla2 – Anticorpo anti-flagelina bacteriana A4-Fla2 Anti-C – Anticorpo anti-quitina Anti-CBir1 – Anticorpo anti-flagelina bacteriana CBir1 Anti-Fla-X – Anticorpo anti-flagelina bacteriana X Anti-I2 – Anticorpo anti-sequência I2 associada à Pseudomonas flourescens Anti-L – Anticorpo anti-laminarina Anti-OmpC – Anticorpo anti-porina C da membrana da Escherichia coli ARN – Ácido Ribonucleico ASCA – Anticorpo anti-Saccharomyces cerevisiae CD14 – Cluster de Diferenciação 14 CI – Colite Indeterminada CU – Colite Ulcerosa DII – Doenças Inflamatórias Intestinais DC – Doença de Crohn ECP – Proteína Catiónica Eosinofílica ELISA – Ensaio Imunoenzinático EN-RAGE – Recetor Extracelular para Produtos Finais de Glicosilação Avançada EPX – Proteína X Eosinofílica GAB – Anticorpo anti-células caliciformes GP2 – Glicoproteína 2 HMG-1 – Proteína de alta mobilidade do grupo 1 HMG-2 – Proteína de alta mobilidade do grupo 2 IBP – Inibidor da Bomba de Protões ICAM – Molécula de adesão intercelular IDO1 – Enzima Indolamina 2,3 Dioxigenase-1 IL - Interleucina 5 LBP – Proteína ligante de lipopolissacarídeos M2-PK – Piruvato-quinase dimérica PAB – Anticorpo anti-pâncreas exócrino pANCA – Anticorpo anti-citoplasma de neutrófilos com padrão perinuclear PCR – Proteína C-reativa PCR-as – Proteína C-reativa de alta sensibilidade RAGE – Recetor para produtos finais de glicosilação avançada TNF – Fator de Necrose Tumoral uPa – Ativador do plasminogénio tipo uroquinase VCAM – Molécula de adesão celular vascular VSE – Velocidade de Sedimentação Eritrócitária 6 Resumo A Doença de Crohn (DC) e a Colite Ulcerosa (CU) são as 2 principais entidades clínicas englobadas nas Doenças Inflamatórias Intestinais crónicas idiopáticas. A Doença Inflamatória Intestinal (DII) não classificável é o diagnóstico de exclusão que cobre a zona cinzenta deixada pela incerteza diagnóstica entre a DC e a CU. O diagnóstico deste grupo de patologias baseia-se atualmente na análise de dados clínicos, radiológicos, laboratoriais, endoscópicos e histológicos mas esta abordagem apresenta algumas limitações, especialmente em casos com presença simultânea de características referentes a DC e CU. Marcadores sorológicos e fecais, já presentes na prática clínica, conseguem fornecer ferramentas quantitativas e reprodutíveis que complementam a avaliação clínica por forma a auxiliarem no diagnóstico e gestão das DII. A Proteína C-reativa tem demonstrado valor na avaliação dos processos inflamatórios, na monitorização da atividade da doença e na previsão da progressão da doença. Os marcadores fecais têm sido estudados pela sua capacidade de identificação de pacientes com DII, monitorização da atividade da doença e na previsão de recorrência. A vigente evidência sugere que painéis sorológicos de múltiplos anticorpos poderão ser úteis no diagnóstico diferencial dos subtipos de DII e valiosos na estratificação do risco de complicações em função do fenótipo da doença. Avanços na tecnologia de estudos genómicos, metabolómicos e proteómicos têm facilitado o desenvolvimento de novos biomarcadores para as DII. A descoberta de novos biomarcadores e o seu uso em combinação com os atualmente disponíveis na prática clínica poderá melhorar significativamente a avaliação dos pacientes com DII. Este artigo revê a utilidade e as limitações do biomarcadores atualmente disponíveis e destaca os recentes avanços na descoberta de novos biomarcadores. Palavras-chave: Doença Inflamatória Intestinal, Doença de Crohn, Colite Ulcerosa, biomarcador, anticorpos, marcadores fecais, Calprotectina, marcadores sorológicos, testes genéticos. 7 Abstract Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) represent the two main forms of the idiopathic chronic inflammatory bowel diseases (IBD). IBD-unclassified (IBD-U) is a diagnosis that covers the “grey” zone of diagnostic uncertainty between UC and CD. Current diagnosis of IBD relies on clinical, endoscopic, radiological, histological and biochemical features, but this approach has shortcomings, especially in cases of overlapping symptoms of CD and UC. Currently available blood and stool based biomarkers can provide reproducible, quantitative tools and complement clinical assessment in order to aid clinicians in IBD diagnosis and management. C-reactive protein has been used to assess inflammatory processes and predict the course of IBD progression. Fecal markers have been studied for their ability to identify patients with IBD, assess disease activity, and predict relapse. Current evidence suggests that serologic panels of multiple antibodies are useful in differential diagnosis of IBD subtypes and can be of value in stratifying patients according to disease phenotype and risk of complications. Advances in genomic, proteomic and metabolomic array based technologies are facilitating the development of new biomarkers for IBD. The discovery of novel biomarkers and its use in combination with the currently used in clinical care has the potential to significantly improve patient care. This article reviews the uses and limitations of currently available biomarkers and highlights recent advances in IBD biomarker discovery. Keywords: Inflammatory bowel disease, Crohn’s disease, Ulcerative colitis, Biomarker, antibodies, fecal markers, Calprotectin, serological markers, genetic testing 8 1. Introdução As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) são doenças crónicas que envolvem predominantemente o aparelho digestivo e cuja etiopatogenia continua incompletamente elucidada.1,2 As DII incluem a Colite Ulcerosa (CU) e a Doença de Crohn (DC), duas entidades clínicas cujo diagnóstico se baseia na análise de dados clínicos, radiológicos, laboratoriais, endoscópicos e histopatológicos.3 Sendo a experiência clínica fulcral no diagnóstico, este é, na maioria dos casos, apenas confirmado à luz dos achados endoscópicos e histopatológicos.4 Apesar destas ferramentas diagnósticas convencionais, em cerca de 5% a 15% dos casos não é possível, inicialmente, esta diferenciação, estabelecendo-se o diagnóstico de Colite Indeterminada (CI) ou DII não classificável.3,4 Ainda que, à posteriori, 50% a 80% destes casos sejam incluídos na DC ou CU, verifica-se que há um conjunto de pacientes que não é abrangido pelo alcance destes métodos convencionais e que colocam várias pontos de interrogação aos clínicos.5-7 Mais a mais, a capacidade de previsão do comportamento e curso da doença bem como de identificação de pacientes em risco de rápida progressão para complicações associadas com necessidade de terapias mais agressivas precocemente assentam, atualmente, apenas na identificação de características clínicas de prognóstico adverso.8,9 Além disso, o recurso frequente a estes métodos, nomeadamente os de caráter mais invasivo, quer no estabelecimento do diagnóstico quer pela necessidade de monitorização frequente da atividade da doença e avaliação de possíveis complicações, comporta elevados recursos económicos, é mal tolerado por parte dos pacientes e, por vezes, até impossível de ser realizado em certos grupos, especialmente o pediátrico.10 Um outro problema prende-se com o tempo necessário ao estabelecimento do diagnóstico. Ainda que, em geral, este ocorra ao fim de um mês, uma porção considerável dos pacientes experiencia períodos bem mais alargados (>12 meses), especialmente pacientes com DC.11 Nas crianças, este aspeto ganha maior relevância, uma vez que as DII podem afetar o crescimento e a maturação sexual.12 A tentativa de ultrapassar estas limitações mas também a ideia da possível existência de testes simples, rápidos, não-invasivos e de baixo custo monetário com semelhante ou melhor capacidade diagnóstica, de previsão do curso da doença e sua monitorização, e capaz de permitir a adoção de estratégias terapêuticas 15 partir de biópsias de cólon de pacientes com DC era significativamente maior do que em pacientes com CU.71 As células caliciformes, como células epiteliais intestinais especializadas, regulam a produção de muco e fatores que contribuem para a reparação epitelial e regulação inflamatória.52 Auto-anticorpos dirigidos a estas células foram detetados primariamente em pacientes adultos com CU com uma prevalência a variar entre os 15% e 47%, enquanto que em pacientes com DC esta variava entre 1,4% e 33%.57, 72,73 Anticorpos adicionais como anti-espermatozóides,74 anti-catepsina G,75 anticélulas endoteliais,76 anti-células epiteliais do cólon,77 têm sido reportados numa minoria de pacientes com DII. Estes anticorpos não apresentam, actualmente, um papel claro no diagnóstico, diferenciação ou estratificação da doença. As prevalências individuais dos anticorpos referidos neste trabalho na DC, CU, em outras doenças gastrointestinais e em indivíduos saudáveis são demonstradas na tabela I. 3.3 Utilidade no diagnóstico das DII A avaliação dos anticorpos associados às DII atualmente conhecidos revela que estes ainda não ultrapassam a capacidade diagnóstica dos métodos convencionais.4 ASCA apresenta a melhor combinação sensibilidade/especificidade (41%-45% / 91%-98%) na distinção entre DII e outras patologias gastrointestinais não-DII.78,79 pANCA, por seu lado, apresenta uma sensibilidade entre 17,2%-71% e especificidade de 90%-98% na mesma distinção.57,78 Uma meta-análise de 60 estudos (3841 pacientes com CU e 4019 pacientes com DC) verificou a utilidade dos dois anticorpos nas DII. A presença de qualquer um deles foi capaz de diferenciar DII de não-DII com uma sensibilidade de apenas 63% e especificidade de 93%, com pequena heterogeneidade entre os estudos.80 A opinião corrente indica que painéis de anticorpos, com a adição, por exemplo, de anticorpos anti-glicanos aos já estabelecidos pANCA e ASCA, podem ser bem mais valiosos no diagnóstico de DII, ao invés da utilização individualizada.58,78,81 A adição de anti-OmpC, anti-CBir1 e anti-I2 a ASCA e pANCA constitui um dos primeiros painéis serológicos disponíveis no mercado (Serology 7, Prometheus, San Diego, CA).82 Contudo, num estudo com 300 crianças, referidas para avaliação de DII, este painel demonstrou apenas sensibilidade de 67% e especificidade de 76% no seu diagnóstico.83 16 Um outro aspeto a salientar é o de que ainda que a maioria dos estudos tenha confirmado a alta especificidade dos anticorpos associados à DII, 75%-90% (tabela I), precaução deve ser levada à cabo na consideração dos grupos de controlo das patologias gastrointestinais não-DII.3 Nomeadamente o ASCA, considerado como um anticorpo altamente específico para a DC, foi observado, num estudo, em 30% a 59% de pacientes com doença celíaca.83 Assim sendo, atualmente, nenhum anticorpo, individualmente ou em combinação com outros, apresenta sensibilidade ou especificidade suficientes para substituir os métodos convencionais (colonoscopia, histologia e imagiologia) no diagnóstico de DII.3 Podem, no entanto, ser úteis nos dilemas diagnósticos.4 3.4 Distinção entre DC e CU A maior parte da informação respeitante à utilidade dos anticorpos na distinção entre DC e CU refere-se ao uso de ASCA e pANCA.60,73,78-81,84-90 Uma revisão de Prideaux et al, refere que o ASCA apresenta a melhor combinação sensibilidade/especificidade para a DC e pANCA para a CU.3 A metaanálise de Kaul et al concluiu que, de entre todos os anticorpos disponíveis, ASCA apresenta a melhor sensibilidade, 56%, enquanto anti-L apresenta a melhor especificidade na distinção DC vs CU.86 Contudo, tem sido demonstrado que as combinações ou perfis imunológicos ASCA+/pANCAe pANCA+/ASCAaumentam a especificidade e o valor preditivo positivo para esta diferenciação, em comparação com a análise individualizada, (Tabela II). Alguns estudos reportaram pouca ou nenhuma melhoria nesta diferenciação ao adicionar anticorpos anti-glicanos78,91, enquanto outros58,60,81,84,85 indicaram significativa melhoria na capacidade discriminatória de DC e CU, principalmente devido ao aumento da sensibilidade do teste. Dotan et al declararam que a adição de, pelo menos, 2 dos 3 anticorpos ALCA, ACCA ou AMCA ao anticorpo ASCA aumentaria a sensibilidade na diferenciação de DC e CU (85%-99%) ainda que com uma significativa queda na especificidade (66% para 27%).84 Seow et al verificaram que a discriminação mais eficiente entre DC e CU foi atingida pela adição de anti-L e anti-C à combinação ASCA/pANCA, enquanto que a adição de apenas anti-L à mesma combinação melhorou a diferenciação entre CD cólica e CU.60 Em contraste, a adição de anti-OmpC e anti-CBir1 parece não fornecer nenhuma melhoria nesta diferenciação. 78,85,92 17 Anti-A4-Fla2 e anti-Fla-X podem ser úteis nesta temática, uma vez que a sua prevalência é quase exclusiva dos DC (50-60%) em comparação com a CU (6%).93 Um aspeto importante no uso dos painéis de anticorpos é assinalado pelo facto de até 56% da população de pacientes com DC e seroreatividade negativa para o ASCA poder ser identificada com recurso a anticorpos anti-glicanos.78,84,91,94 De forma semelhante, os anticorpos anti-CBir1, este em cerca de 50%, Anti-OmpC e anti-I2 revelaram-se positivos no mesmo subgrupo de pacientes.95,96 Estes diferentes perfis imunológicos, verificados neste subgrupo de pacientes, suportam a teoria da existência de diferentes subtipos de DC.91 O anticorpo anti-GP2 foi confirmado em vários estudos como sendo altamente específico para a DC, ainda que com baixa sensibilidade.57,97-99 A sua grande utilidade poderá ser levada a cabo, então, onde as dificuldades clínicas residem, na diferenciação de DC cólica e CU.98 A combinação PAB/pANCA/ASCA melhorou a diferenciação entre DC e CU, particularmente na DC cólica, quando comparada com a associação pANCA/ASCA.98,100 Outros sugerem que a deteção deste anticorpo pode apenas ser útil em pacientes com elevada suspeita para DC mas ASCA-negativos.97 Relativamente aos anticorpos anti-células caliciformes (GAB), vários estudos reportaram alta especificidade na distinção DC versus CU, mas devido à baixa sensibilidade, principalmente na população pediátrica, ainda é pouco usado nesta temática.72,73,98,100 Contudo, num estudo recente de Homsak et al, foi possível identificar a maioria dos pacientes com CU ao combinar pANCA+/GAB+/PAB-.57 Outro aspeto importante no uso dos vários anticorpos na diferenciação dos diferentes subtipos de DII prende-se com a existência de 10% a 15% de pacientes com DII não classificável.101 Dois estudos prospetivos de pacientes com DII não classificável, com a duração de 6 e 10 anos, verificaram que cerca de 50% dos pacientes apresentaram uma combinação ASCA-/pANCAe que nestes o diagnóstico se mantinha inalterado no fim dos estudos.87,102 Surge então a teoria de que esta combinação pANCA-/ASCApoderá estar associada a este subtipo de DII como uma entidade patológica diferenciada.87 A adição de anti-OmpC e anti-I2 a anticorpos ASCA e pANCA apenas gerou uma pequena melhoria no diagnóstico de DC ou CU em pacientes com DII não classificável.100 Ainda que demonstrem um papel limitado no diagnóstico da DII e não poderem substituir os métodos convencionais nesse capítulo, apresentam, por outro lado, considerável valor na diferenciação entre DC, CU e DII não classificável.3 18 O desempenho dos vários anticorpos, individualmente ou em combinação com outros, na diferenciação entre DC e CU é demonstrado na tabela II. 3.5 Utilidade na estratificação fenotípica, prognóstico e resposta à terapia A estratificação da doença, atualmente, assenta nos fatores de risco clínicos e nos achados endoscópicos.3 Existe crescente evidência de um elo entre a seroreatividade e fenótipos específicos na DII. A capacidade dos anticorpos preverem o comportamento e progressão da doença bem como a resposta ao tratamento farmacológico poderia ajudar na estratificação de pacientes em grupos de alto e baixo riscos. Na DC, 50% dos pacientes desenvolvem complicações estenosantes ou perfurantes nos primeiros 20 anos e requerem cirurgia nos primeiros 6 meses.110 Numerosos estudos examinaram a presença dos diferentes anticorpos associados à DII e o comportamento da DC.3,17,58,60,73,78,79,81,84,85,88,90-93,95,96,98,100,104-114 A associação positiva entre a maioria dos anticorpos anti-microbianos, especialmente os anti-glicanos, com um fenótipo mais agressivo e uma maior frequência de cirurgias abdominais associadas à DC têm sido consistentemente demonstradas, (Tabela III). Esta associação é tão mais forte com a positividade de múltiplos anticorpos e com maiores concentrações destes.4 Resultados semelhantes foram obtidos na população pediátrica. Amre et al demonstraram que elevados valores de ASCA precocemente detetados nesta população se correlacionavam com um risco aumentado de progressão para complicações precoces.111 Dubinsky et al verificaram maior frequência de doença estenosante e/ou perfurante e uma mais rápida progressão para complicações com maior diversidade da resposta imune anti-I2, anti-OmpC, anti-CBir1 e ASCA em pacientes pediátricos com DC, especialmente nos pacientes com positividade para todos os 4 anticorpos.92,112 . A associação entre a presença de PAB e o fenótipo da DC é algo conflituosa. Lakatos et al reportaram a sua associação com doença perianal, manifestações extraintestinais e complicações perfurantes.73 Pelo contrário, outros estudos concluíram não existir qualquer utilidade deste anticorpo na discriminação de fenótipos da doença.113,114 Na CU, a maioria dos estudos não mostraram correlação entre pANCA e duração,115,116 atividade,105,115-117 localização,116 extensão,118 ou tratamento da doença,116 bem como necessidade de colectomia.116,118 19 Contudo, outros estudos reportaram uma diminuição dos níveis de pANCA ao longo do tempo com doença em remissão,119 e pós-colectomia.120 No mesmo sentido, mais estudos relataram níveis mais elevados de pANCA com doença ativa,121 doença severa confinada ao lado esquerdo resistente ao tratamento,122 recorrência da doença,123 e um curso da doença mais agressivo requerendo colectomia precoce.122,124 Além disso, Papp et al não encontrou qualquer associação entre fenótipo da CU e anticorpos anti-glicanos.85 Outros anticorpos têm sido alvo de pouca pesquisa na CU. Poucos estudos têm monitorizado longitudinalmente se a presença e/ou a magnitude dos anticorpos altera com tratamento farmacológico, com ou sem resposta. È geralmente aceite que as concentrações de anticorpos permanecem estáveis durante a terapia em pacientes com DC.85,94,96,118 Teml et al demonstraram que os níveis de ASCA não se alteraram significativamente aos 2 e 9 meses após terapia com corticoesteroides ou mesalazina.118 Papp et al reportaram que as concentrações de ASCA, ALCA, ACCA e AMCA, avaliadas às 8 semanas, permaneceram estáveis após indução com infliximab.85 Landers et al concluíram que os níveis de ASCA, anti-OmpC e anti-I2 permaneceram estáveis 6 meses pós-tratamento com infliximab.94 Targan et al evidenciaram a mesma estabilidade nos níveis de anti-CBir1 após 4 meses pósinfliximab.96 Sandborn et al, já no caso da CU, mostraram uma maior frequência de pANCA na doença limitada ao cólon esquerdo e resistente ao tratamento.124 Dubinsky et al também demonstraram que a seroreatividade ao pANCA em crianças estava independentemente associada com falta de resposta à terapia anti-TNFα.125 Isto é apoiado pelo relato da seronegatividade ao pANCA ser um preditor positivo independente para a resposta à terapia com infliximab em pacientes com CU.126 Além disso, pacientes com uma combinação pANCA+/ASCAdemonstraram uma pior resposta clínica ao infliximab.127 20 4. Outros marcadores sorológicos Ao longo dos anos um vasto número de restantes biomarcadores sorológicos têm vindo a ser testados incluindo a α1-glicoproteína ácida, a proteína amilóide A, α2globulina, lactoferrina, trombopoietina, procalcitonina e até a contagem de plaquetas, mas estes têm demonstrado menor validação em relação à PCR.128,129 Recentemente, novos marcadores têm vindo a ser propostos. Entre eles incluem-se as metaloproteinases da matriz,130 marcadores de peroxidação lipídica,131 citocinas como a IL-17A, 23 ou 12,132 a glicoproteína α2 rica em leucina,133 eosinófilos ativados (ECP e EPX),134 o ativador de plasminogénio tipo uroquinase (uPa)135 ou a proteína ligante de lipopolissacarídeos (LBP) e CD14 solúvel.136 Os 2 últimos aliás foram, muito recentemente, reportados como marcadores com capacidade diagnóstica semelhante à PCR-as e preditores fiáveis de recorrência da DC.136 Contudo, e apesar de os estudos preliminares apontarem para conclusões positivas, mais serão precisos para estabelecer o papel destes novos marcadores no contexto global da DII. 21 5. Marcadores Fecais Os marcadores fecais são valiosos na DII face à sua especificidade ao trato gastrointestinal.14 Sob a instalação da inflamação mucosa intestinal, proteínas inflamatórias, produtos leucocitários e os próprios leucócitos são libertados a partir da mucosa permeável para o lúmen intestinal.17 O ‘gold standard’ atual para a identificação do caráter inflamatório intestinal passa pela identificação de leucócitos radiomarcados nas fezes, modalidade esta que se apresenta bastante cara para a prática clínica diária, além dos perigos associadas à exposição da radiação e a demora de 3 dias para colheita de fezes.137 Assim sendo, nasceu a necessidade de encontrar marcadores mais fáceis e rápidos de avaliar. Hoje, os mais usados marcadores fecais são a Calprotectina e Lactoferrina.38 Assim o são devido à sua utilidade no diagnóstico de DII, avaliação da atividade da doença, previsão da recorrência bem como resposta à terapia, além do seu reduzido custo.38 Outros marcadores fecais têm sido investigados para uso clínico na DII ao longo dos anos. Entre eles incluem-se a lisozima, esterase leucocitária, mieloperoxidase, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-10, α1 anti-tripsina, α2-macroglobulina, óxido nítrico retal, proteína eosinófila X, metaloproteinases da matriz.17,38,138,139 De entre todos eles, a M2-piruvato cinase e a S100A12 parecem ser os mais promissores.140 5.1 Calprotectina A calprotectina é uma proteína citosólica ligante do cálcio encontrada principalmente em neutrófilos e em menor quantidade em monócitos e macrófagos reativos.141 Está presente em condições inflamatórias agudas e crónicas bem como patologias oncológicas,142 sendo abundante em vários fluidos corporais na mesma proporção que o grau de inflamação.143 Nas fezes permanece estável até 7 dias à temperatura ambiente devido à resistência à degradação bacteriana144 e apresenta distribuição homogénea, propriedades que permitem a sua identificação em pequenas amostras fecais e pode ser rapidamente quantificada usando ELISA.145 Recentemente, point-of-care testing ou testes à beira do leito da calprotectina fecal que, por permitirem resultados em menos de 30 minutos, se podem tornar bastante vantajosos na prática clínica, especialmente em cuidados primários, tornaram-se disponíveis.146 Foi demonstrada, em estudos iniciais recentes, correlação significativa entre concentrações de calprotectina fecal medida a partir de ELISA e estes testes.147 Contudo, elevadas concentrações de calprotectina fecal não são específicas da DII. Estas podem ser encontradas também em neoplasias, na presença de pólipos, na 22 enteropatia por AINEs, com o aumentar da idade, na doença celíaca, na colite microscópica e/ou alérgica e infeções.145,148 O uso de AINEs e IBPs têm sido também associados a elevações significativas deste biomarcador.149,150 A excreção deste biomarcador tem mostrado uma boa correlação com a excreção de leucócitos radiomarcados.148 5.2 Lactoferrina A lactoferrina é uma glicoproteína ligante do ferro identificada em secreções presentes na maioria das superfícies mucosas que interagem diretamente com patogénios externos, incluindo a saliva, lágrimas, secreções vaginais, fezes, fluido sinovial e leite materno.151,152 É um componente major dos grânulos secundários dos neutrófilos e parece ser um fator primário na resposta inflamatória aguda.152 No lúmen intestinal, as concentrações de lactoferrina aumentam rapidamente com o influxo de neutrófilos durante a inflamação140 e é proporcional em relação ao nível de recrutamento neutrófilo para o trato gastrointestinal.152 Apresenta atividade antibacteriana e é resistente à proteólise nas fezes,153 podendo permanecer estável nas fezes até 5 dias.154 Armazenadas a temperatura ambiente durante 48 horas, as concentrações fecais deste biomarcador eram 90% dos níveis iniciais, enquanto as de calprotectina eram 82%.155 Investigações prévias demonstraram que a lactoferrina fecal é altamente sensitiva na deteção da infiltração neutrofílica.154 5.3 S100A12 Também conhecido como EN-RAGE (extracellular, newlyidentified receptor for advanced glycation end-products) ou calgranulina C, esta proteína, como membro da família proteica S100, é uma proteína citoplasmática presente nos neutrófilos e apresenta propriedades pro-inflamatórias incluindo potente atividade quimiotática.156 Como ligando do recetor RAGE, ativa a via de transdução de sinal através do fator nuclear kB conduzindo à produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β) e à expressão aumentada de moléculas de adesão (ICAM-1 e VCAM-1).157 Isto pode sugerir que esta proteína contribui para o processo inflamatório intestinal e as suas concentrações poderão refletir a presença e gravidade da inflamação intestinal.158 O RAGE solúvel (sRAGE) corresponde ao domínio extracelular deste recetor e que apresenta a mesma especificidade de ligação. Consequentemente, pode ligar-se à proteína S100A12 prevenindo assim a ligação ao recetor RAGE de membrana. De 23 facto, sRAGE foi demonstrado em níveis elevados num estudo de pacientes com DII.159 Os níveis serológicos correlacionam-se bem com as concentrações fecais.160 Mais a mais, esta proteína aparece igualmente distribuída nas amostras fecais e permanece estável por 7 dias. Como acontece com a calprotectina, não parecem existir diferenças entre géneros nas concentrações de S100A12 fecal.158 5.4 M2-PK A piruvato cinase (PK) é uma enzima chave na via glicolítica e é expressa por toda as células, em isoformas diméricas ou tetraméricas.161 A última (M1) tem sido encontrada no músculo esquelético, coração e cérebro, enquanto a isoforma dimérica (M2) está presente em tecidos proliferativos e indiferenciados sendo detetada no plasma e nas fezes.161,162 A atividade aumentada desta enzima nos neutrófilos é encontrada em pacientes politraumatizados,163 insuficientes cardíacos,162 em tumores gastrointestinais,164 e, mais recentemente, na inflamação da bolsa ileal.165 M2-PK foi também detetado em fezes de pacientes com cancro colo-rectal e proposto como potencial marcador de rastreio para esta patologia.164 Uma vez que a DII ativa está intrinsecamente relacionada com a rápida divisão e renovação celular (esta retorna ao normal uma vez a inflamação resolvida166), foi postulado que as concentrações fecais desta enzima poderiam estar aumentadas em pacientes com DII.161 5.5 Utilidade na diferenciação entre DII e doenças gastrointestinais não-DII Concentrações significativamente maiores de calprotectina fecal têm sido reportadas nos pacientes com DII, adultos e pediátricos, em comparação com pacientes com SII ou indivíduos saudáveis.142,167-181 Gisbert et al calcularam uma sensibilidade e especificidade combinada de 80% e 76%, respetivamente, na identificação de DII a partir de informação recolhida de 754 pacientes e uma ligeira maior capacidade diagnóstica para DC (sensibilidade de 83%, especificidade de 85%) do que para a CU (sensibilidade de 72%, especificidade de 74%).168 No mesmo sentido, outros estudos reportaram maiores concentrações de calprotectina fecal em DC do que na CU, mas a valor clínico desta conclusão parece questionável na medida em que os valores variaram bastante entre pacientes e estudos.169.170 24 Numa recente meta-análise, von Roon et al sumariaram dados de 30 estudos que incluíam 5983 pacientes. A calprotectina fecal demonstrou sensibilidade e especificidade combinadas de 95% e 91%, respetivamente, nesta distinção.142 Van Rheenen et al, em outra meta-análise, calcularam valores similares na população adulta mas valores significativamente menores na pediátrica, 76%, mas mais significativo foi o cálculo da redução em 67% no número de colonoscopias necessárias com o uso da calprotectina fecal como teste diagnóstico em pacientes com suspeita de DII.171 Kostakis et al, numa recente revisão sistemática de 34 estudos pediátricos verificaram que em pacientes recém-diagnosticados com DII, a sensibilidade para a calprotectina fecal variou entre 73,5%-100% (95,8%–100% para cut-off de 50 μg/g e 73,5%–100% para 100 μg/g); enquanto a especificidade variou entre 65,9%–100% (65,9%–92,9% para um valor de cut-off de 50 μg/g e 69,2%–100% para 100 μg/g).172 Entre a literatura disponível, as concentrações usadas para cut-off na calportectina fecal variam entre os 18,6 e 250 μg/g.169,181 Atualmente, o valor de cut-off mais usado e referenciado é o de 50 μg/g.182 A lactoferrina fecal tem uma sensibilidade e especificidade de 80% e 82%, respetivamente, tendo em conta uma média ponderada calculada a partir de 19 estudos incluindo 1001 pacientes, onde pacientes com DII foram comparados com pacientes com SII, outras doenças do cólon e indivíduos saudáveis.183 As precisões diagnósticas da calprotectina e lactoferrina parecem ser similares e superiores relativamente a marcadores agudos de inflamação como a PCR e o VSE ou anticorpos como pANCA ou ASCA.175,178,179 Os 2 biomarcadores fecais mostraram diferenciar DII ativa de inativa e pacientes com SII em 80% dos casos comparando com 74% para a elastase leucocitária e 64% para a PCR.178 Mesmo com a junção de marcadores fecais e anticorpos, a precisão diagnóstica melhorou apenas ligeiramente quando comparada com a utilização apenas da calprotectina.179 Num estudo de de Jong et al, S100A12 distinguiu pacientes pediátricos com DII de indivíduos saudáveis com uma sensibilidade de 96% e especificidade de 92% usando um valor de cut-off de 10mg/kg.158 Valores similares foram demonstrados por Sidler et al num estudo prospetivo de 61 crianças com sintomas intestinais e avaliadas com S100A12 e calprotectina fecais, usando o mesmo valor de cut-off (10mg/kg).180 Contudo, num posterior estudo, Manolakis et al calcularam que um valor de cut-off de 54,4 ng/ml poderia distinguir entre DII e SII mas apenas com sensibilidade de 66,7% e especificidade de 64,4%.160 31 diferenciação dos seus subtipos e na previsão da resposta à terapia anti-TNFα e em providenciar esclarecimentos sobre a sua patofisiologia.225-229 32 7. Conclusão O diagnóstico e o acompanhamento dos pacientes com DC e CU dependem, essencialmente, de parâmetros clínicos, endoscópicos e histológicos. A análise radiológica e laboratorial parece ser aditiva e acessória. Contudo, existem algumas limitações inerentes ao uso destes métodos convencionais devido essencialmente à presença de casos com DII não classificável, ao caráter oneroso e invasivo do repetido uso do método endoscópico e à falta de ferramentas de previsão do curso da doença. Os biomarcadores parecem poder dar resposta a estas limitações na medida em que fornecem dados reprodutíveis, quantitativos, rápidos e, preferencialmente, menos dispendiosos sendo já usados na prática clínica na assessoria do diagnóstico das DII, diferenciação entre os seus subtipos, avaliação da atividade da doença e previsão de recorrência. Apesar de ser o marcador sorológico melhor estabelecido e mais usado em termos históricos nas DII, a PCR apresenta, pelo facto de ser um marcador de inflamação sistémica, limitada utilidade no diagnóstico e na diferenciação entre os subtipos da DII. Contudo, a presença de elevados valores de PCR-as aquando do diagnóstico, principalmente da DC, correlacionam-se com maior probabilidade de recorrência clínica, fenótipo agressivo e necessidade de terapia biológica. Devido à rapidez da obtenção da sua análise, pode, em conjunto com a avaliação clínica, ser suficiente para prever inflamação ativa da mucosa. Devido à falta de sensibilidade, os anticorpos não são aconselháveis para o uso no estabelecimento do diagnóstico de DII mas antes na diferenciação dos seus subtipos, particularmente com o uso de painéis de anticorpos. De acordo com a crescente evidência da associação entre a magnitude da seroreatividade aos anticorpos e fenótipos clínicos específicos, talvez a importância maior da utilidade destes marcadores seja a estratificação de pacientes de acordo com o risco para fenótipos agressivos da doença e complicações associadas, especialmente na DC. Tal score de risco que integre marcadores da resposta imune, características clínicas e também genéticas poderia permitir a aplicação de estratégias terapêuticas personalizadas e melhor monitorização dos pacientes em risco. Contudo, há evidência insuficiente na sua utilidade na monitorização do tratamento. Os marcadores fecais pela sua especificidade ao trato gastrointestinal revelamse altamente úteis, especialmente a calprotectina e lactoferrina, na diferenciação entre DII e doenças gastrointestinais não inflamatórias com clara superioridade em relação a todos os outros biomarcadores neste aspeto. Ainda que não substituam a capacidade diagnóstica da colonoscopia, a criação de um algoritmo com valores de cut-off 33 validados poderiam intervir na redução de colonoscopias necessárias para o estabelecimento de DII. Demonstram também uma melhor correlação na avaliação da inflamação da mucosa do que todos os outros marcadores e até índices clínicos e ainda que a colonoscopia com biópsia da mucosa se apresente como gold-standard na avaliação da extensão e gravidade da atividade da doença, os marcadores fecais podem permitir uma avaliação não-invasiva da monitorização da atividade da doença e avaliação à resposta terapêutica, especialmente quando uma dinâmica de avaliações repetidas se impõe. A elevação dos valores de marcadores fecais aquando do diagnóstico e até em pacientes em remissão clínica estão fortemente associados com um alto risco de recorrência num follow-up de 12 meses, indicando que avaliações repetidas podem ser bastante úteis na previsão de recorrências. Neste aspeto, os marcadores S100A12 e M2-PK carecem ainda de mais estudos. Melhorias nos estudos genómicos, proteómicos e metabolómicos têm facilitado a descoberta de novos biomarcadores. Metabolitos como o triptofano ou a L-arginina, perfis de expressão genética ou miARNs associados a DC ou UC ou até componentes proteicos celulares e subcelulares parecem bastante promissores na identificação da doença ativa, na diferenciação dos subtipos da DII e na previsão da resposta à terapia e podem abrir um novo caminho na etiopatogénese destas doenças com consequente melhoria dos cuidados. 34 8. Bibliografia 1. Funayama B, Orsatti GM, Roberto CV. Pesquisa de anticorpos anticitoplasma de neutrófilos no soro de doentes com doenças inflamatórias intestinais. Rev Bras Reumatol 2001;41(6):347353. 2. Kasper DL, Braunwold E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jamesom JL. Harrison’s – Principles of Internal Medicine. 16 ed.; 2005; p.1776-1789 3. Prideaux L, De Cruz P, Ng SC, Kamm MA. 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Prevalência individual de anticorpos serológicos (%) Anticorpos Imunoglobulinas Prevalência (%) Referências DC CU ODGI Saudáveis ASCA IgG e/ou IgA 29-80 0-29 0-23 0-16 43,60,78,79,81, 84,87,88,94,95, 105-107 ACCA IgA 8-25 5-7 3-20 0.5-12 58,84,81,85,60 ALCA IgG 17.7-27 3-8 9 2 77-79,81 AMCA IgG 12-28 7 8 9 Anti-L IgA 11-26 3-7 23 1-10 60, 77,81,86 Anti-C IgA 10-25 2-11 11 2-12 Anti-OmpC IgA 24-55 2-24 5-11 5-20 78,81,86,88,94, 95, 106,107 Anti-I2 IgA 38-60 2-10 19 5-15 94,73,81,86,95, 106 Anti-CBir1 IgG 50-56 6 14 8 64,96 Anti-Fla-X IgG e/ou IgA 52-57 6-10 26 2-7 93,103 Anti-A4-Fla2 IgG e/ou IgA 48-59 6-8 29 0-7 93,103 pANCA IgG 2-38 20-85 8 0-8 57,64,68,80,81, 88,94,105,107 Anti-GP2 IgG e IgA 22-39 0-24 0-22.3 0-8 57,71,78,97,100, 104 GAB IgG e IgA 1.4-33 12-46 0-9.3 1.9 57,72 73,100 DC, Doença de Crohn; CU, Colite Ulcerativa; ODGI, outras doenças gastrointestinais; ASCA, anti-Saccharomyces cerevisiae; ACCA, anti-chitobioside carbohydrate antibody; ALCA, anti-laminaribioside carbohydrate antibody; AMCA, anti-mannobioside carbohydrate antibody; Anti-C, anti-chitin carbohydrate antibody; Anti-L, anti-laminarin carbohydrate antibody; Anti-OmpC, anti-outer membrane porin C antibody; Anti-I2, anti-I2 antibody; Anti-CBir1, antiCBir1 antibody; anti-Fla-X, anti-flagellin X antibody; anti-A4-Fla2, anti-A4flagellin2 antibody; pANCA, atypical perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody. Anti-GP2, anti-glycoprotein 2 antibody; GAB, anti-goblet cells antibody; 50 Tabela II. Anticorpos na diferenciação entre DC e CU Anticorpos Sensibilidade (%) Especificidade (%) VPP (%) VPN (%) Referências DC ASCA+ 37-72 82–100 87–95 38–68 3,60,78,79, 81,85-89,97 pANCA52 91 85 65 43,85-87,97 ACCA 9-21 84–97 78–87 24–52 60,78,79,81, 85-87 ALCA 15-26 92–96 78–90 25–53 60,78,79,81, 85-87 AMCA 12-28 82–97 65–92 25–52 60,78,81,8587 Anti-L 10-25 93–97 90–91 30–40 60,81,86,87 Anti-C 18-26 90–98 87–88 29–39 60,81,86,87 Anti-OmpC 20-55 81–88 83 25 78,87 Anti-I2 42 76 - - 87 PAB 22-46 77–100 69-100 48–75 57,73,97,98, 100 ASCA+/pANCA46-64 92–99 86–97 44–82 73,86-88,97 PAB+/ASCA+/ pANCA16-34 97–100 100 66–72 98,100 CU pANCA+ 50-71 75–98 74–95 49–84 3,57,86,87, 97 pANCA+/ASCA42-58 81–100 93-100 43 57,86,87,97 GAB 12-46 98 75–93 70–74 57,87,98 pANCA ou GAB+/PAB82 98 96 89 98 VPP: Valor preditivo positivo; VPN: Valor preditivo negativo 51 Tabela III. Associação de anticorpos com fenótipo DC (%) Anticorpos Características fenotípicas DC Referências ASCA (ASCA+/pANCA-) Atingimento GIS, Oral e ID Início precoce Penetrante e/ou estenosante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia 17,84,85,60, 93,78,79,81 88,95,105,10 6,107,9092,109-112 Sem atingimento ID 91,96 ACCA Penetrante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia 78,85 Sem associação a fenótipo complicado 81,84 Com ou sem atingimento ID (dados conflituosos) 60,78,84,85 ALCA Penetrante e/ou estenosante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia Sem associação a fenótipo complicado 78,84 78,81,85,91 Sem atingimento ID 60,78,85 AMCA Penetrante e/ou estenosante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia Sem associação a fenótipo complicado 78,81 81,84 Anti-L Atingimento ID Penetrante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia 60,81,84 Sem atingimento ID 60,81 Anti-C Penetrante Forte associação com necessidade cirurgia Anti-OmpC Sem atingimento ID Penetrante e/ou Estenosante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia 85,78,88,95, 106,108,92, 112, Anti-I2 Sem atingimento ID Estenosante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia 95,106,108, 112 Anti-CBir1 Atingimento ID* Início precoce Penetrante e/ou Estenosante ** 108,96 Anti-A4-Fla2 Anti-Fla-X Atingimento ID Estenosante e/ou Penetrante > risco de progressão para complicações e necessidade de cirurgia 93,103 pANCA (ASCA-/pANCA+) Doença “UC-like” localizada ao Cólon Não-estenosante e não-penetrante Baixo risco de necessidade cirurgia 78,86,87,101 DC, Doença de Crohn; ASCA, anti-Saccharomyces cerevisiae; ACCA, anti-chitobioside carbohydrate antibody; ALCA, anti-laminaribioside carbohydrate antibody; AMCA, anti-mannobioside carbohydrate antibody; Anti-C, anti-chitin carbohydrate antibody; Anti-L, anti-laminarin carbohydrate antibody; Anti-OmpC, anti-outer membrane porin C antibody; Anti-I2, anti-I2 antibody; Anti-CBir1, anti-CBir1 antibody; anti-Fla-X, anti-flagellin X antibody; anti-A4-Fla2, anti-A4flagellin2 antibody; pANCA, atypical perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody. ID, Intestino Delgado; GIS, Gastrointestinal superior 52