Avaliação da toxicidade do antibiótico doxiciclina isoladamente e na presença de microplásticos na microalga marinha Tetraselmis chuii

Relatório Final de Estágio Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Avaliação da toxicidade do antibiótico doxiciclina isoladamente e na presença de microplásticos na microalga marinha Tetraselmis chuii Joana Correia Prata Orientador(es) Professora Doutora Lúcia Guilhermino Co-Orientador(es) Professora Doutora Beatriz Lavorante Porto 2016 Relatório Final de Estágio Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Avaliação da toxicidade do antibiótico doxiciclina isoladamente e na presença de microplásticos na microalga marinha Tetraselmis chuii Joana Correia Prata Orientador(es) Professora Doutora Lúcia Guilhermino Co-Orientador(es) Professora Doutora Beatriz Lavorante Porto 2016 i Resumo Os objectivos do estágio cujas actividades se resumem no presente Relatório foram (i) adquirir treino nos métodos de cultura da microalga marinha Tetraselmis chuii (ii) avaliar a toxicidade de dois grupos de contaminantes ambientais emergentes, nomeadamente fármacos e microplásticos. Numa primeira fase, foram aprendidas metodologias para cultura da microalga em condições laboratoriais, efectuado um bioensaio utilizando a substância de referência dicromato de potássio para avaliação do estado de saúde das culturas, optimizada metodologia para a determinação das concentrações reais e de decaimento e realizada uma extensa revisão bibliográfica. De seguida, foram testadas as seguintes hipóteses: H01 – A doxiciclina não é tóxica para T. chuii a concentrações de exposição na ordem das partes por milhão (ppm); H02 – Os microplásticos não são tóxicos para T. chuii a concentrações de exposição na gama inferior das partes por milhão (ppm); H03 – A presença de microplásticos na água não influencia a toxicidade da doxiciclina pra T. chuii. Para testar as hipóteses foram realizados 3 bioensaios toxicológicos com T. chuii com a duração de 96 horas, tendo como critério do efeito tóxico a inibição do crescimento. No bioensaio, a doxiciclina inibiu o crescimento da microalga com uma concentração efectiva mediana (CE50) de 19,52 mg/l, rejeitando-se a hipótese H01. Nas concentrações testadas, os microplásticos não apresentaram inibição significativa das microalgas, aceitando-se a hipótese H02. No bioensaio da doxiciclina na presença de microplásticos obteve-se CE50 de 11,90 mg/l e a análise estatística permitiu rejeitar H03. Os resultados permitem sugerir que a presença de microplásticos no meio influencia a toxicidade de alguns fármacos, podendo torna-los mais tóxicos, como no caso da doxiciclina. Este efeito poderá levar à subestimação do impacto de poluentes nos organismos e ecossistemas, sendo necessário aprofundar o conhecimento sobre a toxicidade de outras substâncias na presença de microplásticos. ii Agradecimentos Quero agradecer à minha orientadora, a Professora Doutora Lúcia Guilhermino, pela disponibilidade e pelos ensinamentos. E à Professora Doutora Conceição Branco pelo apoio prestado. À minha co-orientadora, a Professora Doutora Beatriz Lavorante, por me acompanhar no estágio, pela sua disponibilidade e paciência que me ajudaram a desenvolver os conhecimentos e técnicas na área. Aos colegas de laboratório, pela simpatia e apoio prestado ao longo do estágio. Á minha família e amigos, pela compreensão e apoio. E ao meu namorado, o João Nogueira, pela motivação e companhia. Este trabalho foi desenvolvido no âmbito do projeto “EPHEMARE – Ecotoxicicological effects of microplastics in marine ecosystems”, projeto aprovado no âmbito da JPI Oceans, Call microplastics, sendo a componente portuguesa financiada pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (referência: JPIOCEANS/0004/2015). iii Índice 1. Introdução ..................................................................................................................... 1 2. Métodos ......................................................................................................................... 6 2.1. Cultura de Tetraselmis chuii ...................................................................................... 6 2.1.1. Material ....................................................................................................... 6 2.1.2. Meio Enriquecido F/2 de Guillard ................................................................ 6 2.1.3. Culturas de manutenção de Tetraselmis chuii ............................................ 7 2.2. Métodos para determinação do comportamento das substâncias testadas .............. 7 2.3. Condições dos Bioensaios ........................................................................................ 8 2.4. Análise estatística...................................................................................................... 8 3. Resultados e Discussão ............................................................................................. 10 3.1. Metodologia para cultura da microalga e bioensaios ............................................... 10 3.1.1. Cultura de Tetraselmis chuii ...................................................................... 10 3.2. Teste de referência com dicromato de potássio ...................................................... 11 3.2.1. Métodos para determinação do comportamento das substâncias testadas ................................................................................................................. 11 3.2.2. Bioensaio com dicromato de potássio ....................................................... 12 4. Bioensaios ................................................................................................................... 14 4.1. Metodologia para cultura da microalga e bioensaios ............................................... 14 4.2. Avaliação dos efeitos tóxicos ................................................................................... 15 4.2.1. Bioensaio com doxiciclina ......................................................................... 16 4.2.2. Bioensaio com microplásticos ................................................................... 20 4.2.3. Bioensaio com doxiciclina na presença de microplásticos ........................ 21 5. Conclusão .................................................................................................................... 25 6. Bibliografia .................................................................................................................. 26 Anexos ......................................................................................................................... 31 Anexo I: Meio enriquecido F/2 de Guillard ............................................................... 31 Anexo II: Tabelas de pH dos bioensaios .................................................................. 32 Anexo III: Espectros de absorção dos compostos ................................................... 34 1 1. Introdução A presença global de contaminantes ambientais de origem antropogénica poderá ter impacto negativo nos ecossistemas a longo prazo (Nunes et al. 2005). Da elevada diversidade de contaminantes ambientais, os designados contaminantes ambientais emergentes suscitam actualmente elevada preocupação devido às lacunas que ainda existem sobre a sua toxicidade e aos efeitos que podem causar na saúde animal e humana por exposição ambiental. Por exemplo, os plásticos têm uma distribuição universal nos oceanos e a sua produção continua a aumentar, sendo que em 2014 a produção mundial foi de 311 milhões de toneladas (PlasticsEurope 2015; Thompson 2009). Ao sofrerem fragmentação originam partículas heteorogéneas, de tamanho inferior a 5 mm, denominados microplásticos (definido pela National Oceanographic and Atmospheric Agency). Devido à fragmentação de detritos plásticos maiores e à sua lenta degradação, a quantidade de microplásticos nos oceanos tende a aumentar, mesmo que sejam aplicadas medidas para evitar a entrada de plásticos no ambiente (Thompson 2009). Os fármacos são substâncias emergentes de elevada preocupação (Milić et al. 2013). A bioactividade inerente, combinada com a elevada solubilidade em água, baixa degradação e elevados valores excretados sem metabolização poderão, em alguns casos, causar efeitos adversos nos ecossistemas e na saúde pública (Milić et al. 2013). O consumo de antibióticos, fármacos que inibem o crescimento ou eliminam bactérias, tem aumentado anualmente, sendo usados em medicina humana, veterinária e aquacultura (Milić et al. 2013). A presença de antibióticos no ambiente aquático, apesar de em baixas concentrações, tem sido causa de preocupação, pois podem originar resistências bacterianas e ter impacto nos ecossistemas aquáticos e saúde humana (Milić et al. 2013). As tetraciclinas são antibióticos de largo espectro usados em medicina humana e veterinária, sendo um dos antibióticos mais prevalente em águas residuais (Milić et al. 2013). Foram descobertas em 1948 após o isolamento da clortetraciclina de uma cultura de Streptomyces aureofacien e derivados foram obtidos por variação dos ligandos dos carbonos 5, 6 e 7 (Chopra e Roberts 2001; Graeme e Pollack 1996). As tetraciclinas ultrapassam a membrana de organismos gram negativos como um complexo magnesio-tetraciclina e a dos gram positivos na sua forma lipofilica simples (Chopra e Roberts 2001; Graeme e Pollack 1996; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). No citoplasma, ligam-se reversivelmente a um local de elevada afinidade na subunidade 30s do ribossoma bacteriano. Desta forma, impedem a ligação do aminoacetil-tRNA ao local receptor do mRNA, prevenindo a adição de aminoácidos ao péptido 2 em formação, e impossibilitando a transcrição e consequentemente o crescimento bacteriano (acção bacteriostática) (Chopra e Roberts 2001; Graeme e Pollack 1996; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). A formação de complexos com catiões bivalentes também pode estar envolvida na actividade antimicrobiana das tetraciclinas e interferir com a sua absorção e distribuição (Campbell e Hasinoff 1991; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). A doxiciclina é uma tetraciclina de segunda geração que apresenta maior lipofilicidade, maior tempo de semivida no soro (16 a 18 horas) e maior actividade antimicrobiana, com menos efeitos adversos quando comparada com as restantes tetraciclinas (Chopra e Roberts 2001; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). A forma de cloridrato permite maior solubilidade e estabilidade (Chopra e Roberts 200; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). É utilizada no tratamento de bactérias gram positivas, gram negativas e alguns protozoários, incidindo principalmente em infecções respiratórias, da pele e tecidos moles, sistema genitourinário e intrabdominais (Graeme e Pollack 1996; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). Em veterinária, é administrada na água de bebida (suínos, bovinos, aves), no alimento (suínos) ou em comprimidos (canino, felino) (Almeida et al. 2014). Tem excreção renal, biliar e fecal, sendo a maioria pela última através da difusão para o lúmen do intestino delgado (Graeme e Pollack 1996; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). As tetraciclinas têm sido detectadas com frequência no ambiente aquático em concentrações de μg/l em locais como os Estados Unidos da América e China, onde são usadas como promotores de crescimento em pecuária (Milić et al. 2013). Parte da dose administrada é excretada por via renal e via fecal, havendo contaminação de biossólidos e estrumes que entram no ambiente como fertilizantes agrícolas, podendo acumular-se devido a aplicações recorrentes (Fernández et al. 2004). Assim ocorre exposição directa de organismos terrrestres, principalmente das camadas superiores do solo, e águas de lixiviação poderão transportar estes compostos para os ecossistemas aquáticos (Fernández et al. 2004). A adsorção à fase sólida do solo e complexação com metais em biossólidos leva à acumulação de tetraciclinas e redução da sua fotodegradação, mantendo-se no meio por elevados períodos de tempo (Fernández et al. 2004). A excreção ou aplicação de doses excessivas em alimento ou água de tetraciclinas nas aquaculturas são possíveis vias de contaminação dos ambientes adjacentes a estes sistemas, podendo ocorrer acumulação no sedimento (Hirsch et al. 1999; Rico et al. 2013). A doxiciclina está presente em biossólidos onde apresenta um tempo de dissipação entre 53 a mais de 77 dias (Fernández et al. 2004). Em Portugal, a sua aplicação é principalmente veterinária, sendo que o uso em 2011 foi de 0,247 toneladas em medicina humana e 28 273 toneladas em medicina veterinária (Almeida et al. 2014). Na aquacultura de Pangasius no Vietnam, a doxiciclina representa 34% dos antibióticos usados (Rico et al. 2013). No meio marinho, foram detectadas 3 concentrações de 0,26 ng/l na água e de no 1,33 μg/kg sedimento em Dalian, na China (Na et al. 2013). Apesar da rápida degradação em solução, a doxiciclina poderá apresentar persistência devido à introdução recorrente no ambiente (Brain et al. 2004). As tetraciclinas podem actuar em organelos com maquinaria de transcrição procariótica que possuam subunidades 30S, como os cloroplastos, levando à diminuição da eficiência fotossintética, e as mitocôndrias, ocorrendo a formação de espécies de oxigénio reactivas (Wang et al. 2015). A quelação de cálcio intracelular tem consequências na função celular, podendo interferir com a síntese proteica ou induzir efeito tóxico (Wang et al. 2015). Em organimos marinhos, a oxitetraciclina revelou ter impacto sobre o crescimento da alga Tetraselmis chuii (Ferreira et al. 2007). Para a microalga Clorella vulgaris, a doxiciclina apresentou uma concentração de efeito 50% às 48 horas de 15,2 mg/l (Fernández et al. 2004). A aplicação recorrente de doxiciclina poderá ter consequência na saúde humana através do consumo de alimentos contaminados, sendo que na União Europeia em 2014 e 2015 foram reportados resíduos entre 3 a 224 μg/kg em camarões provenientes do Vietnam (RASFF 2016). Em 2014, na Europa, 39,5% da produção de plástico destinou-se a embalagens, sendo uma grande porção descartável (Andrady 2011; PlasticsEurope 2015). A fragmentação de plásticos utilizados diariamente ou presentes no ambiente, sujeitos a acção da radiação ultravioleta, calor e forças físicas, dá origem a microplásticos secundários (Andrady 2011; Thompson 2009). A degradação ocorre por foto-oxidação devido à exposição a luz ultravioleta, e poderá desenvolverse como termo-oxidativa (Andrady 2011). Devido ao elevado peso molecular, não ocorre biodegradação significativa, apenas fragmentação em partículas de menor dimensão (Andrady 2011). Esta ocorre principalmente em praias onde, ao contrário do oceano, há exposição a elevadas temperaturas, intensidades luminosas e concentrações de oxigénio (Andrady 2011). Os microplásticos primários apresentam-se originalmente como partículas, em abrasivos, cosméticos e pellets utilizadas na produção de plásticos (Andrady 2011; Thompson 2009). Os microplásticos apresentam uma distribuição mundial no ambiente marinho, e atingem elevadas concentrações na água e sedimento, principalmente em zonas de maior densidade populacional ou industriais (Frias et al. 2014; Norén 2007; Thompson 2009). Na Suécia foi detectada a concentração de 102 000 nº/m3 na água do mar adjacente a um porto industrial onde se produz polietileno (Norén 2007). Em Portugal, entre diversos locais estudados, os microplásticos são particularmente abundantes na Costa Vicentina e em Lisboa (0,033 e 0,036 nº/m3 respectivamente, em zooplâncton recolhido na costa) (Frias et al. 2014). A contaminação da Costa Vicentina tem uma origem provável na zona industrial e porto de Sines (Frias et al. 2014). No giro oceânico do 4 Pacifico sul, em 2011, a concentração média de microplásticos detectada na água foi de 26 898 partículas/km2, apresentando maior concentração no seu centro, onde atingia as 396 342 particulas/km2 (Eriksen et al. 2013). A presença dos plásticos no ambiente poderá ser lesiva aos organismos devido ao seu efeito em isolado através de danos físicos e toxicológicos ou devido ao aumento do stress provocado por contaminantes tradicionais onde poderão actuar como vectores (Thompson 2009, Besseling et al. 2014). Os microplásticos podem causar inibição no crescimento do fitoplâncton através do seu efeito de sombra, diminuição dos níveis de clorofila e consequente diminuição da fotossíntese (Besseling et al. 2014; Bhattacharya et al. 2010; Sjollema et al. 2016). A internalização de microplásticos em algas é pouco provável devido às suas elevadas dimensões, no entanto a adsorção à superfície poderá causar dano na parede celular com formação de poros e possível penetração de partículas (Bhattacharya et al. 2010; Davarpanah e Guilhermino 2015). Estas partículas poderão aderir à celulose na superfície da célula através de pontes de hidrogénio entre estruturas aromáticas, dependendo da carga de superfície, espécie de alga e concentração de microplásticos no meio (Bhattacharya et al. 2010). A sua adsorção poderá impedir o fluxo de CO2 e nutrientes, promover a produção de radicais livres de oxigénio e comprometer a mobilidade das células através da adsorção ao flagelo (Bhattacharya et al. 2010; Sjollema et al. 2016). No entanto, num estudo realizado em Tetraselmis chuii, utilizando concentrações de microplásticos até 1,472 mg/l não foi possível determinar efeitos negativos estatisticamente significativos (Davarpanah e Guilhermino 2015). Stress em algumas espécies de alga resulta na libertação de exopolissacarídeos, que coagulam e formam partículas originando agregação celular, podendo ocorrer incorporação acidental e concentração de microplásticos (Long et al. 2015). A incorporação de microplásticos altera a permeabilidade e aumenta a densidade dos agregados, resultando numa estrutura menos fractal, podendo explicar a elevada concentração de microplásticos encontrada no fundo oceânico (Long et al. 2015). A biodisponibilidade dos microplásticos pode ser alterada devido à sua incorporação em agregados e biofilmes e a presença de matéria orgânica pode dificultar a sua detecção (Gorokhova 2015; Long et al. 2015). Desta forma, os microplásticos poderão acarretar risco para os seres vivos, como por exemplo em bivalves onde já foram encontrados em células epiteliais digestivas e no sistema circulatório (Vandermeersch et al. 2015). Em juvenis dos peixes Pomatoschistus microps, os microplásticos causaram redução na actividade da acetilcolinesterase podendo ter impactos negativos na sua fisiologia e comportamento (Oliveira et al. 2013). A presença de microplásticos causa diminuição da eficiência predatória dos peixes, ocorrendo ingestão destas partículas em vez de alimento, o que pode originar diminuição do crescimento, menor eficiência reprodutiva e mortalidade, tendo um impacto negativo na população (Sá et al. 2015). No ambiente, os 11 Por último, segue uma fase senescente com morte e diminuição da densidade de algas (Creswell 2010; Nunes et al. 2008). As culturas foram inoculadas de forma a apresentarem concentrações iniciais de 104 células/ml. Nos primeiros dois dias observou-se um crescimento celular reduzido sugestivo da lag-time phase devido ao reduzido número de células das culturas e consequentemente da sua capacidade de multiplicação (Figura 1). O período de crescimento exponencial decorreu entre o segundo e quarto dia de cultura. O crescimento celular estabilizou entre o quarto dia e o sétimo dia, sendo sugestivo do período estacionário. No período de 96 horas, o pH variou entre 7,8 unidades de pH no início do teste e às 9,9 unidades de pH, o que corresponde a uma variação de 2,1 unidades de pH. Esta variação inerente ao crescimento da microalga ultrapassa a variação de 1,5 unidades de pH recomendada para bioensaios pela OECD (OECD 2011). 3.2. Teste de referência com dicromato de potássio 3.2.1. Métodos para determinação do comportamento das substâncias testadas O espectro de absorção do dicromato de potássio em meio F/2 (Anexo III) revelou a presença de dois picos a 258 nm e 370 nm, em concordância com o referido na literatura (Sena et al. 2000). Para a determinação das concentrações de dicromato de potássio utilizou-se os valores de absorvância medidos a 370 nm (secção 2.2.). Devido aos limites de detecção do espectrofotómetro, apenas foi possível realizar uma leitura da absorvância com exactidão de concentrações entre 2 e 32 mg/l. Obteve-se uma correlação positiva significativa entre a absorvância e a concentração e modelo de regressão linear ajustado (Figura 2). 12 Figura 2: Modelo de regressão linear ajustado aos dados da absorvância e concentração do dicromato de potássio em meio F/2. 3.2.2. Bioensaio com dicromato de potássio Figura 3: Média do número de células com o respectivo erro padrão da média em cada tratamento às 96 horas em algas expostas a dicromato de potássio e na ausência da substância (controlo – 0). Sobre as barras é representada a percentagem média de inibição do crescimento da microalga em cada tratamento e relativamente ao crescimento médio do controlo. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre grupos (p= 0,05) determinadas pelo teste de comparações múltiplas de tukey efectuado após a ANOVA quando esta análise indicou diferenças significativas (p= 0,05) entre tratamentos. 13 Os tratamentos com dicromato de potássio com concentrações elevadas apresentaram uma cor amarela característica da solução deste composto. Durante o teste, a variação média do pH foi de 0,94 unidades, sendo a média do valor inicial de 7,72 e a final 8,67 unidades de pH (Anexo II). A variação média da concentração do teste à nominal foi de 7,15% e o decaimento médio às 96 horas de 0,97%. Estes valores estão de acordo com o recomendado pela OECD e permitem validar o teste. O dicromato de potássio é uma substância de referência que permite avaliar a reprodutibilidade dos testes e sensibilidade dos organismos de laboratório ao longo do tempo sendo recomendado para esse efeito nas normas da OECD para vários organismos (Environmental Science and Technology Center 2007; OECD 2011). Registaram-se diferenças significativas no crescimento das culturas expostas a distintas concentrações do dicromato de potássio (ANOVA, F(7, 16)= 127,976, p= 0,000) tendo ocorrido inibição significativa do mesmo a concentrações iguais ou superiores a 8 mg/l. A CE50 determinado às 96 horas foi de 5,46 mg/l (3,71 – 7,75 mg/l) (Figura 3 e 4, Tabela 1). Em Chlorella vulgaris obteve-se uma CE50 às 96 horas de 0,39 mg/l (Borecka et al. 2016), o que é sugestivo de maior resistência aos xenobióticos por Tetraselmis chuii. Dicromato de Potássio (mg/l) 72 horas 96 horas CE10 CE20 CE50 CE10 CE20 CE50 1,24 (0,29-2,22) 1,88 (0,62-3,04) 4,17 (2,41-6,18) 1,92 (0,74-2,99) 2,75 (1,34-3,99) 5,46 (3,71 –7,75) Tabela 1: Valores de CE obtidos às 72 e 96 horas na alga Tetraselmis chuii exposta a várias concentrações de dicromato de potássio. 14 Figura 4: Curva de toxicidade logaritmo (base 10) da concentração de dicromato de potássio em mg/l versus transformação probit da percentagem de inibição do crescimento de Tetraselmis chuii (y= 2,827X - 2,084). 4. Bioensaios 4.1. Métodos para determinação do comportamento das substâncias testadas Para avaliação da possível interferência na leitura da absorvância dos compostos, o espectro do meio F/2 foi realizado através da leitura do espectro UV entre 200 e 700 nm. Observou-se um pico de absorvância máxima a 222 nm, impedindo a leitura de compostos com picos de absorvância inferiores a 250 nm (Anexo III). O espectro de absorção da doxiciclina em meio F/2 (Anexo III) revelou a presença de três picos a 245 nm, 272 nm, e 375 nm, em concordância com o referido na literatura (Lofty et al. 2016). Para a determinação das concentrações de doxiciclina utilizou-se os valores de absorvância medidos a 375 nm (secção 2.2.). Devido aos limites de detecção do espectrofotómetro, apenas foi possível realizar uma leitura da absorvância com exactidão de concentrações entre 2 e 32 mg/l. Obteve-se uma correlação positiva significativa entre a absorvância e a concentração e modelo de regressão linear ajustado (Figura 5). 15 Figura 5: Modelo de regressão linear ajustado aos dados da absorvância e concentração doxiciclina em meio F/2. A curva dos microplásticos foi determinada no espectrofluorimetro recorrendo às recomendações do fabricante usando um comprimento de onda de excitação de 575 nm e de emissão de 607 nm (secção 2.2.). Obteve-se uma correlação positiva significativa entre a fluorescência e a concentração e modelo de regressão linear ajustado (Figura 6). Figura 6: Modelo de regressão linear ajustado aos dados da fluorescência e concentração dos microplásticos em meio F/2. 4.2. Avaliação dos efeitos tóxicos 16 4.2.1. Bioensaio com doxiciclina No teste com doxiciclina, as concentrações mais elevadas apresentaram uma coloração vermelho-acastanhada (Figura 9). Durante o teste, a variação média do pH foi de 0,54 unidades, sendo a média do valor inicial de 7,89 e a final 8,42 unidades de pH (Anexo II). A variação média da concentração incial do teste à nominal foi de 14,03% e o decaimento médio às 96 horas de 73,64%. Os valores de pH e variação média da concentração de teste à nominal cumprem as indicações da OECD, permitindo validar o teste. O valor de decaimento médio ultrapassa os 20%, logo deverá considerar-se o resultado com resultante da acção da doxiciclina e dos seus produtos de degradação. Figura 7: Média do número de células com o respectivo erro padrão da média em cada tratamento às 96 horas em algas expostas a doxiciclina e na ausência da substância (controlo – 0). Sobre as barras é representada a percentagem média de inibição do crescimento da microalga em cada tratamento e relativamente ao crescimento médio do controlo. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre grupos (p= 0,05) determinadas pelo teste de comparações múltiplas de tukey efectuado após a ANOVA quando esta análise indicou diferenças significativas (p= 0,05) entre tratamentos. Registaram-se diferenças significativas no crescimento das culturas expostas a distintas concentrações de doxiciclina (ANOVA, F(6, 14)= 159,604, p= 0,000) tendo ocorrido inibição significativa do mesmo a concentrações iguais ou superiores a 16 mg/l. A CE50 determinado às 96 horas foi de 19,52 mg/l (9.9 – 35.92 mg/l) (Figura 7 e 8, Tabela 2). Em Chlorella vulgaris obtevese uma CE50 às 48 horas de 15,2 mg/l (Fernández et al. 2004), o que sugere menor sensibilidade por Tetraselmis chuii, em concordância com o resultado observado no bioensaio do dicromato de potássio. 17 Estudos realizados em T. chuii usando oxitetraciclina foi obtido um CE50 às 96 horas de 11,18 mg/l, valor inferior ao obtido no presente trabalho (Ferreira et al. 2007). A toxicidade da doxiciclina é inferior à da oxitetraciclina apesar da primeira apresentar maior lipofilicidade e maior actividade antimicrobiana (Chopra e Roberts 2001; Riond e Riviere 1988). Com base no CE50 obtido no presente estudo e a CE50 de 316 μg/l para a planta Lemna gibba, que apresenta sensibilidade intermédia entre algas e plantas superiores, seria de esperar maior toxicidade na alga (Brain et al. 2004). Doxiciclina (mg/l) 72 horas 96 horas CE10 CE20 CE50 CE10 CE20 CE50 7,71 (1,25-3,74) 10,4 (2,79-18,11) 20,83 (10,66-37,59) 6,75 (1,01-2,32) 9,72 (2,47-16,55) 19,52 (9,90-35,92) Tabela 2: Valores de CE obtidos às 72 e 96 horas na alga Tetraselmis chuii exposta a várias concentrações de doxiciclina. Figura 8: Curva de toxicidade logaritmo (base 10) da concentração da doxiciclina em mg/l versus transformação probit da percentagem de inibição do crescimento de Tetraselmis chuii (y= 2,777 x – 3,584). A coloração vermelho-acastanhado observada nas concentrações superiores a 16 mg/l (Figura 9) pode dever-se às propriedades do composto ou à formação de produtos de degradação 18 (Ferreira et al. 2007; Sanderson et al. 2005). Os principais produtos de fotodecomposição de compostos pertencentes ao grupo das tetraciclinas são 4-dedimetilaminotetraciclina, 5,6-anidrotetraciclina e quinona (Halling-Sørensen et al. 2002). A foto-oxidação das tetraciclinas, induzida pela radiação ultravioleta, ocorre a taxas relativamente elevadas em meios alcalinos e com elevada concentração de oxigénio, formando uma quinona, que apresenta cor vermelhaacastanhada e tem absorção a 530 nm (Moore et al. 1983). É pouco provável que a cor se deva ao composto principal, visto que este sofreu degradação ao longo do período de teste e a cor se manteve. As condições do ensaio e coloração vermelho-acastanhada observada sugerem degradação da doxiciclina em quinona. Apesar destas semelhanças, a determinação da quinona às 96 horas com pico de absorção a 530 nm não foi possível. Apesar de não terem sido identificados, os produtos de degradação em conjunto com a doxiciclina, são responsáveis pelo efeito tóxico obtido no ensaio. A fotólise da doxiciclina promove sua a degradação, mas nem sempre resulta na diminuição da toxicidade, uma vez que os produtos de degradação intermediários revelam ser mais tóxicos e terem maior facilidade na penetração nas células (Yuan et al. 2011). Figura 9: Bioensaio da doxiciclina às 96 horas observando-se a câmara de incubação, os frascos com diversas concentrações e o sistema de ar. À esquerda estão presentes os controlos e concentrações inferiores, apresentando uma cor verde intensa devido ao crescimento das algas. Na imagem à direita, observam-se as concentrações superiores que apresentam uma coloração vermelho-acastanha, possivelmente devido à degradação do composto. A diminuição da transmissão de luz devido à formação da cor vermelho-acastanhada poderá contribuir para a inibição do crescimento de microalgas (Sanderson et al. 2005). Por outro lado, a redução da transmissão de luz poderá originar menor multiplicação celular, havendo menos impacto dos tóxicos e levando a que substâncias de cor apresentem maiores CE50 19 (Cleuvers e Weyers 2003). O efeito de sombra não deverá ser considerado como simples aditivo, visto que o movimento e agitação das algas permitem que sejam expostas a zonas iluminada (Cleuvers e Weyers 2003). A coloração vermelho-acastanhada observada durante o ensaio poderá ser em parte responsável pelo efeito tóxico observado, porém a sua contribuição não pôde ser determinada. As tetraciclinas podem inibir a síntese proteica do cloroplasto através da ligação à subunidade ribossomal 30S, resultando em decréscimo do conteúdo de clorofila e menor eficiência fotossintética (Wang et al. 2015). A mitocôndria sofre por um mecanismo semelhante, resultando em peroxidação lipídica e formação de espécies de oxigénio reactivas (Wang et al. 2015). A doxiciclina pode então actuar nos cloroplastos e mitocôndrias da alga, diminuindo a eficiência fotossintética e originando radicais livres de oxigénio, causando inibição do seu crescimento. A formação de complexos insolúveis com catiões metálicos bivalente pode formar precipitado (Brain et al. 2004; Campbell e Hasinoff 1991; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). A formação de complexos poderá estar envolvida na toxicidade, podendo provocar deficiência de minerais ou a forma complexada ultrapassar membranas biológicas com maior facilidade (Brain et al. 2004; Campbell e Hasinoff 1991; Katsung et al. 2012; Riond e Riviere 1988). A quelação de cálcio intracelular pode interferir na função célular através da inibição da síntese proteica ou efeito tóxico (Wang et al. 2015). Por outro lado, a quelação poderá reduzir a disponibilidade de tetraciclinas no meio e diminuir a sua toxicidade (Halling-Sørensen et al. 2002). O meio F/2 é constituído por água de mar suplementada rica em catiões sendo favorável à formação de complexos, resultando em concentrações de CE50 superiores e menor recuperação da substância às 96 horas (Ferreira et al. 2007). Bioensaios toxicológicos em microalgas envolvendo a exposição a antibióticos presentes no ambiente são importantes visto que estes organismos apresentam elevadas sensibilidades devido à sua constituição unicelular (Ferreira et al. 2007). O valor da CE50 da doxiciclina para T. chuii é superior aos valores detectados no ambiente actualmente. Concentrações ambientais mais elevadas poderão ser detectadas localmente após administração de antibióticos em aquacultura ou após descarga de biossólidos no meio aquático (Fernández et al. 2004; Hirsch et al. 1999; Rico et al. 2013) Os dados relativos à determinação de antibióticos no ambiente, apesar de estarem a aumentar em número, ainda são limitados para uma avaliação global do impacto destes fármacos nos ecossistemas. Por outro lado, seria interessante a realização de mais testes 20 em organismos marinhos de níveis tróficos superiores para compreender o seu impacto na cadeia trófica marinha, assim como a realização de testes em organismos de outros compartimentos ambientais, como o solo ou o sedimento, onde este fármaco se acumula. 4.2.2. Bioensaio com microplásticos As esferas de microplásticos conferiram uma tonalidade rosa ao meio, semelhante à sua cor, nas concentrações mais elevadas. Durante o teste, a variação média do pH foi de 1,54 unidades, sendo a média do valor inicial de 8,05 e a final 9,61 unidades de pH (Anexo II). A variação média da concentração inicial do teste à nominal foi de 5,67% e o decaimento médio às 96 horas de 41,9%. A variação média da concentração de teste à nominal cumpre as indicações da OECD. A variação média de pH foi superior às 1,5 unidades de pH recomendadas pela OECD, podendo dever-se ao elevado crescimento das algas devido à ausência de toxicidade (secção 3.1.1.). O decaimento médio dos microplásticos ultrapassou os 20% recomendados na OECD, sendo uma provável causa a adsorção deste material ao vidro dos recipientes utilizados. Figura 10: Média do número de células com o respectivo erro padrão da média em cada tratamento às 96 horas em algas expostas a microplásticos e na ausência da substância (controlo – 0). Sobre as barras é representada a percentagem média de inibição do crescimento da microalga em cada tratamento e relativamente ao crescimento médio do controlo. No presente estudo não foi possível determinar a CE50 de microplásticos para a alga T. chuii (Figura 10), pois não se verificaram diferenças estatisticamente significativas entre o crescimento das culturas expostas a diferentes concentrações de microplásticos (ANOVA, F(7, 16)= 1,516, p= 0,231). Os resultados do presente estudo estão de acordo com os obtidos num estudo 27 1596 – 1605 Bakir A, Rowland SJ, Thompson RC (2012) "Competitive sorption of persistent organic pollutants onto microplastics in the marine environment" Marine Pollution Bulletin 64, 2782 – 2789 Bhattacharya P, Lin S, Turner JP, Ke PC (2010) "Physical adsorption of charged plastic nanoparticles affects algal photosynthesis" Journal of Physical Chemistry 114, 16556 – 16561 Besseling E, Wang B, Lürling M, Koelmans AA (2014) “Nanoplastic affects growth of S. obliquus and reproduction of D. magna” Environmental Science & Technology 48, 12336 - 12343 Borecka M, Białk-Bielińska, Haliński ŁP, Pazdro K, Stepnowski P, Stolte S (2016) “The influence of salinity on the toxicity of selected sulfonamides and trimethoprim towards the green algae Chlorella vulgaris” Journal of Hazardous Materials 308, 179 – 186 Brain RA, Johnson DJ, Richards SM, Sanderson H, Sibley PK, Solomon KR (2004) Effects of 25 pharmaceutical compounds to Lemna gibba using a seven-day static-renewal test" Environmental Toxicology and Chemistry 23, 371 – 382 Campbell NRC, Hasinoff BB (1991) “Iron supplements: a common cause of drug interactions” British Journal of Clinical Pharmacology 31, 251 – 255 Chopra I, Roberts M (2001) "Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance" Microbiology and Molecular Biology Reviews, 232 – 260 Cleuvers M, Weyers A (2003) “Algal growth inhibition test: does shading of coloured substances really matter?” Water Research 37, 2718 – 2722 Creswell LR (2010) “Phytoplankton culture for aquaculture feed” Southern Regional Aquaculture Center 5004, 1 – 12 Davarpanah E, Guilhermino L (2015) "Single and combined effects of microplastics and copper on the population growth of the marine microalgae Tetraselmis chuii" Estuarine, Costal and Shelf Science 167A, 269 – 275 Engler RE (2012) "The complex interaction between marine debris and toxic chemicals in the ocean" Environmental Science and Technology 46, 12302 – 12315 Environmental Science and Technology Center (2007) “Biological test method: growth inhbition test using a freshwater alga” Environment Canada EM 1/RM/25, 27 – 29 Eriksen M, Maximenko N, Thiel M, Cummins A, Lattin G, Wilson S, Hafner J, Zellers A, Rigman S (2013) "Plastic pollution in the South Pacific subtropical gyre" Marine Pollution Bulletin 68, 71 – 76 European Chemicals Agency (2008) “Guidance on information requirements and chemical 28 safecty assessment. 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Observam-se picos de absorvância a 274 nm e 370 nm. Figura 2: Espectro de absorção do meio F/2. Observa-se o pico a 222 nm. 35 Figura 3: Espectro de absorção da doxiciclina em meio F/2 na concentração de 32 mg/l. Observam-se picos de absorvância a 245 nm, 272 nm e 375 nm.