Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desevolvimento de modelos experimentais, modulação farmacologica e nutricional

Dissertação da candidatura ao grau de Doutor apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional Orientador: Prof. Doutor Adelino Leite Moreira Artigo 48, § 3: “A Faculdade não responde pelas doutrinas expendidas na dissertação” (Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto, 29 de Janeiro de 1931, Decreto nº 19337) Corpo Catedrático da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Professores Catedráticos Efectivos Manuel Alberto Coimbra Sobrinho Simões Jorge Manuel Mergulhão Castro Tavares Maria Amélia Duarte Ferreira José Agostinho Marques Lopes Patrício Manuel Vieira Araújo Soares Silva Daniel Filipe Lima Moura Alberto Manuel Barros da Silva José Manuel Lopes Teixeira Amarante José Henrique Dias Pinto de Barros Maria Fátima Machado Henriques Carneiro Isabel Maria Amorim Pereira Ramos Deolinda Maria Valente Alves Lima Teixeira Maria Dulce Cordeiro Madeira Altamiro Manuel Rodrigues Costa Pereira Rui Manuel Almeida Mota Cardoso António Carlos Freitas Ribeiro Saraiva Álvaro Jerónimo Leal Machado de Aguiar José Carlos Neves da Cunha Areias Manuel Jesus Falcão Pestana Vasconcelos João Francisco Montenegro Andrade Lima Bernardes Maria Leonor Martins Soares David Rui Manuel Lopes Nunes José Eduardo Torres Eckenroth Guimarães Francisco Fernando Rocha Gonçalves José Manuel Pereira Dias de Castro Lopes Manuel António Caldeira Pais Clemente Corpo Catedrático da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Professores Jubilados e Aposentados Abel José Sampaio da Costa Tavares Abel Vitorino Trigo Cabral Alexandre Alberto Guerra Sousa Pinto Amândio Gomes Sampaio Tavares António Augusto Lopes Vaz António Carvalho Almeida Coimbra António Fernandes da Fonseca António Fernandes Oliveira Barbosa Ribeiro Braga António Germano Pina Silva Leal António José Pacheco Palha António Luís Tomé da Rocha Ribeiro António Manuel Sampaio de Araújo Teixeira Belmiro Dos Santos Patrício Cândido Alves Hipólito Reis Carlos Rodrigo Magalhães Ramalhão Cassiano Pena De Abreu e Lima Daniel Santos Pinto Serrão Eduardo Jorge Cunha Rodrigues Pereira Fernando De Carvalho Cerqueira Magro Ferreira Fernando Tavarela Veloso Francisco de Sousa Lé Henrique José Ferreira Gonçalves Lecour de Menezes José Augusto Fleming Torrinha José Carvalho De Oliveira José Fernando Barros Castro Correia José Luís Medina Vieira José Manuel Costa Mesquita Guimarães Levi Eugénio Ribeiro Guerra Luís Alberto Martins Gomes De Almeida Manuel Augusto Cardoso de Oliveira Manuel Machado Rodrigues Gomes Manuel Maria Paula Barbosa Maria da Conceição Fernandes Marques Magalhães Maria Isabel Amorim de Azevedo Mário José Cerqueira Gomes Braga Serafim Correia Pinto Guimarães Valdemar Miguel Botelho dos Santos Cardoso Walter Friedrich Alfred Osswald Constituição do Júri da Prova de Doutoramento Professor Doutor José Inácio Guerra Fragata, Professor Catedrático da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Nova de Lisboa Professor Doutor Jorge Mergulhão de Castro Tavares, Professor Catedrático da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Professor Doutor José Carlos Neves Cunha Areias, Professor Catedrático da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Professor Doutor Jorge Manuel Nunes Correia Pinto, Professor Catedrático Convidado da Escola de Ciências da Saúde da Universidade do Minho Professor Doutor Joaquim Adelino Correia Ferreira Leite Moreira, Professor Catedrático da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Professor Doutor Pedro Cabral Teixeira Bastos, Professor Associado Convidado da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto À Ana. Aos meus Pais. À minha Irmã Patrícia. Science does not rest upon solid bedrock. The bold structure of its theories rises, as it were, above a swamp. It is like a building erected on piles. The piles are driven down from above into the swamp, but not down to any natural or 'given' base; and when we cease our attempts to drive our piles into a deeper layer, it is not because we have reached firm ground. We simply stop when we are satisfied that they are firm enough to carry the structure, at least for the time being. The Logic of Scientific Discovery (1959) Some scientists find, or so it seems, that they get their best ideas when smoking; others by drinking coffee or whisky. Thus there is no reason why I should not admit that some may get their ideas by observing, or by repeating observations. Realism and the Aim of Science (1983) Karl Popper hypothesis, sanctioning clinical trials in cardiac cachexia patients. Finally we have demonstrated the close relationship between contractility and relaxation and clearly demonstrated that even baseline systemic arterial pressures can contribute to diastolic dysfunction in heart failure. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional Índice Conteúdo Introdução ............................................................................................................................. 3 Conceitos de fisiopatologia e abordagem clínica actual da hipertensão pulmonar ............................. 5 Fisiologia do ventrículo direito e circulação pulmonar .................................................................... 17 Fisiopatologia da disfunção ventricular direita na hipertensão pulmonar ........................................ 18 Disfunção ventricular esquerda na hipertensão pulmonar .............................................................. 19 Tolerância diastólica à pós-carga .................................................................................................... 21 Activação neuroendócrina na hipertensão pulmonar ...................................................................... 22 Papel da endotelina-1 e efeitos farmacológicos dos seus antagonistas ........................................... 23 Activação inflamatória na hipertensão pulmonar ........................................................................... 25 Metabolismo no miocárdio insuficiente ......................................................................................... 26 Caquexia cardíaca .......................................................................................................................... 29 Nutrição na insuficiência cardíaca e caquexia ................................................................................. 31 Modelos experimentais de hipertensão pulmonar .......................................................................... 32 Objectivos ............................................................................................................................ 35 Resultados ........................................................................................................................... 37 Disfunção miocárdica ventricular esquerda intrínseca e activação neuroendócrina na hipertensão pulmonar experimental.................................................................................................................. 39 Mecanismos de progressão da disfunção ventricular esquerda e avaliação da tolerância diastólica à pós-carga na hipertenso pulmonar experimental ........................................................................... 47 Efeitos de um regime alimentar do tipo Ocidental na progressão da hipertensão pulmonar, insuficiência cardíaca e caquexia cardíaca na hipertensão pulmonar experimental ......................... 59 Efeitos hemodinâmicos e neuroendócrinos do antagonismo agudo e crónico da endotelina-1 na hipertensão pulmonar experimental .............................................................................................. 77 Avaliação da tolerância diastólica à pós-carga em pacientes submetidos a cirurgia de revascularização miocárdica com graus variáveis de disfunção sistólica ........................................ 107 Discussão ........................................................................................................................... 137 Miocárdio ventricular esquerdo na hipertensão pulmonar ........................................................... 137 Mecanismos fisiopatológicos de disfunção ventricular esquerda intrínseca .................................. 138 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional Modulação nutricional da hipertensão pulmonar, disfunção miocárdica e caquexia cardíaca ........140 Efeitos e mecanismos de acção dos antagonistas da endotelina-1 na hipertensão pulmonar e insuficiência cardíaca direita.........................................................................................................143 Tolerância diastólica à pós-carga como teste funcional da função miocárdica ...............................147 Conclusões gerais ............................................................................................................... 149 Trabalhos em curso e perspectivas futuras ......................................................................... 151 Hipertensão pulmonar secundária a doença respiratória crónica ..................................................151 Terapêutica crónica com levosimendan na hipertensão pulmonar ................................................153 Modelo experimental de sobrecarga de pressão por constrição da aorta ascendente ...................155 Avaliação da tolerância diastólica à pós-carga ventricular direita na patologia humana .................156 Bibliografia ......................................................................................................................... 157 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 3 Introdução A hipertensão pulmonar é um síndrome de etiologia diversificada que se define em termos hemodinâmicos pela elevação da pressão média da artéria pulmonar para valores superiores a 25 mmHg (Fishman 2004). Ao longo das duas últimas décadas, este síndrome tem sido alvo de interesse crescente por parte da comunidade médica e científica, particularmente no que concerne a uma das formas etiológicas mais raras, a hipertensão arterial pulmonar. Estas formas de hipertensão pulmonar, para além dos critérios diagnósticos usuais, apresentam um critério hemodinâmico adicional, a normalidade das pressões de preenchimento ventriculares esquerdas, assim como ausência de outras causas prováveis. Apesar da sua incidência e prevalência serem extremamente baixas (Humbert et al. 2006), a elevada morbilidade e mortalidade, com sobrevida estimada de cerca de 50 % aos 2 anos, de acordo com registos da década de 80 (McLaughlin e Suissa 2010), motivaram uma intensa investigação no campo da fisiopatologia e terapêutica que levaram à aprovação, por parte da European Medicines Agency e da Food and Drug Administration dos Estados Unidos da América, de vários fármacos vasodilatadores pulmonares arteriolares que fazem já parte da prática médica corrente, muitas vezes em combinação (Rabinovitch 2008). Estes avanços resultaram numa melhoria global da sobrevida e qualidade de vida destes doentes (Galie et al. 2009). No entanto, as resistências vasculares pulmonares elevam-se inexoravelmente e o ventrículo direito, que inicialmente tolera o aumento progressivo de pós-carga, por vários mecanismos compensatórios, como hipertrofia, dilatação e alteração da sua geometria, acaba por se tornar incapaz de tolerar a elevação sustentada de pós-carga. A falência ventricular, ou insuficiência cardíaca, direita é uma importante causa de mortalidade (Humbert 2009) e um determinante fundamental do prognóstico (D'Alonzo et al. 1991). Apesar do seu papel fulcral, apenas em 2006 foi reconhecida a importância da função miocárdica ventricular direita na qualidade de vida e sobrevida destes doentes, sendo considerada a investigação nesta área uma prioridade nas ciências cardiovasculares (Voelkel et al. 2006). Desde então, vários trabalhos têm contribuído para uma melhor compreensão da fisiopatologia da disfunção ventricular direita; no entanto, esta área dá ainda os seus primeiros passos, encontrando-se ainda por esclarecer, por exemplo, quais as acções miocárdicas dos fármacos recentemente aprovados para terapêutica crónica da hipertensão pulmonar (Bogaard et al. 2009a). Na hipertensão pulmonar crónica severa com atingimento da função ventricular direita, outros mecanismos emergiram como potenciais alvos terapêuticos, nomeadamente o reconhecimento do compromisso concomitante da função ventricular esquerda e da actividade inflamatória e neuroendócrina, sistémica e local, como Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 4 mecanismos que contribuem decisivamente para a deterioração funcional. Adicionalmente, o envolvimento de alterações de metabolismo sistémicas, pulmonares e miocárdicas, condicionadas pela menor perfusão tecidular, congestionamento vascular mesentérico, sobrecarga miocárdica e mediadores neuroendócrinos e inflamatórios , e o desenvolvimento de caquexia cardíaca (Carr et al. 1989; le Roux et al. 2005; von Haehling et al. 2009) também têm sido progressivamente integradas numa visão mais alargada deste síndrome. Como complemento a esta introdução, reproduzimos na íntegra um artigo de revisão que sumaria os principais desenvolvimentos na compreensão fisiopatológica e na abordagem clínica da hipertensão pulmonar. Em seguida, abordamos em maior detalhe outros aspectos que têm vindo a ser apontados como tendo maior relevância actual no esclarecimento da fisiopatologia da hipertensão pulmonar crónica e disfunção ventricular direita. Com os trabalhos desenvolvidos, e incluídos na presente dissertação, pretendemos contribuir para um melhor esclarecimento de alguns destes tópicos. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 5 Conceitos de fisiopatologia e abordagem clínica actual da hipertensão pulmonar Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 6 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 7 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 8 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 9 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 16 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 17 Fisiologia do ventrículo direito e circulação pulmonar A embriologia, anatomia e fisiologia do ventrículo direito e circulação pulmonar diferem substancialmente das do ventrículo esquerdo e circulação sistémica, sendo, portanto, incorrecto extrapolar de conceitos bem estabelecidos da fisiologia cardiovascular quando procuramos compreender a dinâmica do ventrículo direito. A septação ventricular completa e o desenvolvimento de dois sistemas circulatórios em série foi fundamental à adaptação à vida terrestre e à endotermia (Koshiba-Takeuchi et al. 2009). O primórdio cardíaco é uma estrutura tubular única, mas disparidades na expressão génica de factores de transcrição e moléculas de sinalização intracelular condicionam um padrão de assimetria direito-esquerdo que determina uma curvatura das estruturas e a formação de um órgão maduro marcadamente assimétrico (Chen et al. 2010), em que o ventrículo direito é o último componente a desenvolver-se (Moorman e Christoffels 2003). O desenvolvimento embrionário, a partir da curvatura de uma estrutura tubular única, repercute-se na complexidade geométrica da cavidade ventricular direita do adulto, que assume uma forma em crescente, em secção transversa, e uma forma triangular, no plano longitudinal, envolvendo a face antero-medial do ventrículo esquerdo. Durante o desenvolvimento embrionário, os pulmões não participam nas trocas respiratórias, o leito vascular pulmonar apresenta resistências elevadas e as cavidades ventriculares equalização de pressões e idêntica espessura parietal mas, logo após o parto, com o início da ventilação, e participação pulmonar nas trocas respiratórias, há uma rápida transição para o padrão circulatório adulto (Rudolph 2010). O leito vascular pulmonar do adulto é constituído por uma rede capilar extensa e altamente distensível, com baixa resistência e impedância, que lhe permite acomodar com facilidade todo o volume de ejecção, mesmo quando o débito cardíaco aumenta, como acontece durante o exercício físico, mantendo pressões baixas na artéria pulmonar, comparativamente com a circulação sistémica (Sarnoff e Berglund 1954). As baixas pressões da circulação pulmonar repercutem-se em menor trabalho de ejecção e pressão intraventricular direitas (Sarnoff e Berglund 1954), bem como em massa miocárdica e espessura parietal inferiores (Foale et al. 1986; Lorenz et al. 1999). O ventrículo direito, cujo volume tele-diastólico é superior ao do ventrículo esquerdo (Sheehan e Redington 2008), adapta-se facilmente a alterações abruptas de pré-carga e retorno venoso, por exemplo, durante as flutuações inerentes à ventilação (Sheehan e Redington 2008), uma vez que é mais complacente que o ventrículo esquerdo (Joyce et al. 2000). Está, portanto, bem adaptado para encurtar e ejectar facilmente sangue contra as resistências reduzidas do leito vascular pulmonar. No entanto, contrariamente ao que sucede com o ventrículo esquerdo, a espessura parietal reduzida e o menor trabalho de ejecção que é capaz de desenvolver tornam-no Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 18 relativamente incapaz de desenvolver pressões elevadas e, por conseguinte, de ultrapassar elevações agudas de pós-carga. De facto, elevações agudas da pressão na artéria pulmonar superiores a 40-50 mmHg desencadeiam diminuição da fracção de ejecção, dilatação ventricular direita e falência cardíaca direita (Guyton et al. 1954). Fisiopatologia da disfunção ventricular direita na hipertensão pulmonar A insuficiência cardíaca direita pode definir-se, numa analogia com a insuficiência cardíaca esquerda, como um síndrome complexo, de etiologia diversificada, que surge como consequência de qualquer perturbação anatómica ou funcional que limita a capacidade de preenchimento ou de ejecção do ventrículo direito, cursando com retenção de fluidos, redução do débito cardíaco e maior risco de arritmias (Haddad et al. 2008; Voelkel et al. 2006). Contrariamente ao que sucede nas elevações agudas da pressão da artéria pulmonar, o ventrículo direito consegue adaptar-se a elevações progressivas de carga. De qualquer modo, a sobrecarga crónica de volume é melhor tolerada (Marino et al. 1985), ao passo que a sobrecarga de pressão normalmente progride rapidamente para insuficiência cardíaca direita, com excepção dos casos particulares em que esta é exercida desde o nascimento, sobre o miocárdio ventricular direito do recém-nascido, que apresenta maior massa relativa e está adaptado às pressões circulatórias pulmonares elevadas do período fetal, como acontece em muitas cardiopatias congénitas (Hopkins 2005). O miocárdio ventricular direito adapta-se cronicamente à sobrecarga de pressão através de hipertrofia, da adopção de uma geometria mais elipsóide e da dilatação da sua cavidade, que resultam numa redução da tensão parietal e recrutamento da reserva de pré-carga (Boxt et al. 1992; Horan et al. 1981). O miocárdio ventricular direito hipertrofiado aumenta o seu trabalho de ejecção e a capacidade de desenvolvimento de pressão por forma a ultrapassar as resistências vasculares pulmonares, preservando, assim, o débito cardíaco. No entanto, apesar das alterações compensatórias iniciais o miocárdio ventricular direito acaba por entrar num círculo vicioso de descompensação com dilatação ventricular e redução do débito cardíaco. A nível do cardiomiócito, os mecanismos moleculares subjacentes a esta progressão terão semelhanças com os mecanismos de adaptação do ventrículo esquerdo à sobrecarga de pressão, como sucede, por exemplo, na hipertensão arterial sistémica, e posterior descompensação, mas relativamente poucos estudos documentam quais as modificações efectivamente envolvidas (Bogaard et al. 2009a). Para além da sobrecarga, mecanismos adicionais devem estar implicados, uma vez que a constrição da artéria pulmonar raramente desencadeia falência ventricular direita (Bogaard et Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 19 al. 2009b). Foi claramente demonstrada a contribuição da isquemia em doentes com hipertensão arterial pulmonar (Gomez et al. 2001). Realmente, enquanto o ventrículo direito é usualmente perfundido tanto durante a sístole como durante a diástole, uma vez que a pressão aórtica é sempre superior à pressão ventricular direita, na hipertensão pulmonar pode não suceder o mesmo (Urabe et al. 1985), adicionalmente, o consumo energético do miocárdio sobrecarregado aumenta contribuindo para o desequilíbrio entre consumo e aporte de oxigénio (Cross 1962). A progressão de hipertrofia compensatória para disfunção não é uniforme na população de doentes com hipertensão pulmonar, poderão contribuir para esta heterogeneidade diferenças de predisposição genética, relacionadas, por exemplo, com polimorfismos no gene da enzima de conversão da angiotensina (Abraham et al. 1995), e graus diversos de activação neuroendócrina (Nootens et al. 1995), e inflamatória (Sharma et al. 2003). Como mecanismo adicional de agravamento da doença, a dilatação ventricular direita e o desenvolvimento de pressões progressivamente mais elevadas, com elevação da tensão parietal (Quaife et al. 2006), condicionam regurgitação tricúspide por dilatação do anel e incompetência do aparelho valvular. Esta contribui para uma sobrecarga adicional de volume e para um círculo vicioso de dilatação e disfunção ventricular e congestionamento sistémico (Voelkel et al. 2006). Disfunção ventricular esquerda na hipertensão pulmonar O fenómeno de interacção ventricular corresponde ao comprometimento da função, ou débito, de um ventrículo secundária à hipertrofia, distensão, elevação de pressões ou disfunção do ventrículo contralateral. Compreende dois mecanismos distintos, um de interacção em série, pelo qual a queda do débito de um ventrículo condiciona uma redução da pré-carga do outro, e outro de interacção em paralelo, mediado pelo septo interventricular, pericárdio e fibras musculares partilhadas pelos dois ventrículos, que também é designado por interdependência ventricular (Morris-Thurgood e Frenneaux 2000). Originalmente proposta por Bernheim, no início do Século XX, como potencial mecanismo explicativo para o congestionamento venoso sistémico na insuficiência cardíaca, o ventrículo esquerdo dilatado limitaria a complacência ventricular direita e o retorno venoso (Santamore e Dell'Italia 1998). O efeito complementar, pelo qual a distensão e hipertensão ventricular direitas comprometem a função ventricular esquerda recebe, ainda hoje, frequentemente, a designação de efeito de Bernheim reverso. A dilatação e elevação sustentada da tensão parietal ventricular direita comprometem a função ventricular esquerda. Diversos mecanismos têm sido apontados como responsáveis. Classicamente, o desvio do septo interventricular para a esquerda, que se traduz em rectilinização ou deslocamento paradoxal, em conjunto com a restrição pericárdica, uma vez que Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 20 o ventrículo direito dilatado partilha o mesmo espaço físico com o ventrículo esquerdo, contribuem para a redução efectiva da complacência e a perturbação do preenchimento ventricular esquerdo. O mecanismo fundamental parece ser a persistência de pressão intracavitária e elevação do volume ventricular direito durante o relaxamento isovolumétrico e preenchimento precoce do ventrículo esquerdo, como consequência do prolongamento do tempo de ejecção e contracção do ventrículo direito face à maior resistência vascular e impedância do leito vascular pulmonar (Triffon et al. 1988). Durante o preenchimento inicial, o volume e geometria do ventrículo esquerdo são, então, perturbados, sendo claramente evidente o atraso na abertura da válvula mitral e início do preenchimento precoce (Stojnic et al. 1992). No entanto, com a progressão da doença, também o débito do ventrículo direito diminui, condicionando uma redução da pré-carga ventricular esquerda (Gurudevan et al. 2007), e das próprias pressões da artéria pulmonar, sendo talvez por este facto que os melhores preditores de prognóstico não são os níveis de pressão arterial pulmonar mas sim o débito cardíaco e os índices de função ventricular direita (Sandoval et al. 1994). O envolvimento ventricular esquerdo assume particular importância uma vez que a hipoperfusão coronária secundária à hipotensão pode contribuir para o agravamento da disfunção ventricular direita, num círculo vicioso que frequentemente precipita eventos fatais (Zamanian et al. 2007). Para além dos mecanismos mecânicos e hemodinâmicos, várias evidências sugerem que factores adicionais possam contribuir para a disfunção ventricular esquerda. Assim, na hipertensão pulmonar crónica severa, mesmo depois da reversão das alterações de geometria ventricular, após transplantação pulmonar, a disfunção ventricular esquerda persiste frequentemente (Xie et al. 1998), o que motiva a prática de transplantação cardiopulmonar conjunta na maior parte dos casos de hipertensão pulmonar severa com disfunção ventricular esquerda concomitante (Pielsticker et al. 2001). Estes dados poderão ser interpretados admitindo que o miocárdio ventricular esquerdo sofre um processo de remodelagem no contexto da hipertensão pulmonar. Algumas evidências experimentais e anatomopatológicas sugerem isso mesmo (Laks et al. 1969). A redução sustentada de pré-carga, ou unloading, poderá originar esta remodelagem (Lisy et al. 2000). Por outro lado, não seria surpreendente que mecanismos neurohumorais pudessem mediar remodelagem ventricular esquerda. Gomez et al. propuseram que o ventrículo direito, no contexto de sobrecarga, libertasse uma substância que actuasse no ventrículo esquerdo (Gomez et al. 1993). No entanto, estas hipóteses não foram devidamente testadas ou fundamentadas experimentalmente. A avaliação funcional do miocárdio ventricular esquerdo no contexto de hipertensão pulmonar e hipertrofia ou falência ventricular direita é uma tarefa extremamente complexa, será difícil Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 21 destrinçar qual o seu estado funcional intrínseco uma vez que este se encontra sujeito a mediação neuroendócrina sistémica e local e interacção ventricular. Estas limitações podem contornar-se por metodologias de avaliação in vitro, nomeadamente em preparações de coração isolado (Lamberts et al. 2007) e de feixes musculares isolados (Kogler et al. 2003), e in vivo, utilizando índices funcionais independentes da carga (Faber et al. 2006). Actualmente, a melhor avaliação funcional ao nível de feixes musculares isolados é a relação força-frequência (Endoh 2004). A elevação da tensão desenvolvida pelos feixes musculares para frequências de estimulação crescentes é uma resposta fisiológica e um mecanismo importante de regulação da contractilidade que reflecte a reserva contráctil, de forma independente da carga, constituindo uma metodologia adequada para aferir a gravidade da disfunção contráctil do miocárdio: o miocárdio insuficiente apresenta, caracteristicamente, relações força-frequência negativas (Endoh 2004). Contudo, a obtenção de relações força-frequência positivas no miocárdio saudável depende de uma técnica experimental extremamente cuidadosa em que a manutenção da temperatura e oxigenação permanente dos feixes musculares, a utilização de baixas concentrações de cálcio e a dissecção de feixes extremamente finos de cardiomiócitos (evitando a hipóxia das regiões centrais) são fulcrais (Layland e Kentish 1999). Quanto à utilização de índices funcionais independentes da carga convencionais, derivados das relações pressãovolume tele-sistólica e tele-diastólica, que são o padrão na avaliação hemodinâmica invasiva da função intrínseca dos ventrículos (Burkhoff et al. 2005). Estes índices são teoricamente independentes da carga, uma vez que são obtidos com reduções gradativas da pré-carga, durante oclusões agudas da veia cava inferior, no entanto, em grupos experimentais com níveis basais de pré-carga distintos, as variações suscitadas pelas oclusões podem não abranger o mesmo âmbito de pressões e, deste modo, os grupos dificilmente serão comparáveis (Burkhoff et al. 2005). Tolerância diastólica à pós-carga Leite-Moreira et al. desenvolveram um índice funcional que avalia a reserva funcional diastólica por elevação abrupta de pós-carga, forçando a contracção isovolumétrica em ciclos cardíacos isolados, designado por tolerância diastólica à pós-carga. Este índice, de obtenção simples, embora nunca tenha sido aplicado na patologia, ou no ser humano, é teoricamente um índice funcional independente quer da pós-carga quer da pré-carga, que poderá ultrapassar esta limitação (Leite-Moreira e Gillebert 1994; Leite-Moreira et al. 1999). Adicionalmente, correlaciona-se tanto com a função diastólica como com a função sistólica (Gillebert et al. 1997). Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 22 O relaxamento miocárdico é um processo dinâmico que se segue à contracção mas se inicia ainda durante a ejecção ventricular. O miocárdio saudável responde compensatoriamente a elevações ligeiras de pós-carga (Leite-Moreira e Gillebert 1994), mas nas elevações mais acentuadas de pós-carga o relaxamento lentifica-se, estando esta lentificação relacionada com a função sistólica (Eichhorn et al. 1992). A transição entre aceleração e lentificação do relaxamento ocorre a um nível de carga relativa (que pode definir-se pelo cociente entre pressão máxima desenvolvida num ciclo pós-carregado e pressão máxima desenvolvida numa contracção isovolumétrica), que reflecte a reserva de pós-carga (Gillebert et al. 1997). No miocárdio saudável o relaxamento está completo antes do final da diástole (Leite-Moreira e Gillebert 1994; Weisfeldt et al. 1978), portanto o principal mecanismo subjacente à subida das pressões telediastólicas na disfunção diastólica é a maior rigidez miocárdica (Gaasch e Zile 2004; LeiteMoreira 2006). Durante décadas advogou-se que por maior que fosse a perturbação do relaxamento, simples alterações do relaxamento não poderiam ser responsáveis pela elevação das pressões tele-diastólicas (Gilbert e Glantz 1989), no entanto, evidências mais recentes, obtidas experimentalmente, demonstram que, nos extremos de carga, mesmo o miocárdio saudável pode desenvolver elevação das pressões tele-diastólicas como consequência da lentificação do relaxamento (Leite-Moreira e Correia-Pinto 2001). No entanto, estes resultados experimentais ainda não foram reproduzidos em modelos experimentais de insuficiência cardíaca ou no ser humano. Activação neuroendócrina na hipertensão pulmonar De forma análoga à insuficiência cardíaca, no curso da hipertensão pulmonar crónica são activados vários sistemas neuroendócrinos que contribuem para a fisiopatologia deste síndrome. Os mediadores neuroendócrinos que se associam à evolução da disfunção cardiomiocitária são produzidos tanto localmente, pelo miocárdio sobrecarregado, como em outros tecidos, como resposta à hipoperfusão sistémica (Baker et al. 1990; Ferrari et al. 1996). Efectivamente, os mediadores neuroendócrinos são activados precocemente na sequência de eventos que medeia entre a sobrecarga e a hipertrofia ventricular (Roncon-Albuquerque et al. 2006), e têm sido extensivamente investigados na insuficiência cardíaca. Destacam-se a angiotensina II e a endotelina-1, ambas factores parácrinos de crescimento libertados agudamente após sobrecarga miocitária (Ito et al. 1993; Sadoshima et al. 1993). Estes mediadores desempenham um papel primordial não só na resposta hipertrófica mas também na remodelagem miocárdica adversa e disfunção miocárdica (Baker et al. 1990; Rothermund et al. 2000). Com o conhecimento crescente nesta área o papel destes mediadores neuroendócrinos a nível local e tecidular assume cada vez maior relevância, em detrimento das suas acções Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 23 sistémicas (Takemoto et al. 1997). E várias vias e mecanismos subcelulares e moleculares envolvidos nas acções destes mediadores encontram-se já bem estabelecidos (Dorn e Force 2005). O envolvimento de mediadores neuroendócrinos na progressão da hipertensão pulmonar e falência ventricular direita não foi alvo de avaliação tão detalhada, mas é também reconhecido, tanto a nível experimental (Miyauchi et al. 1993) como a nível clínico (Nootens et al. 1995). Papel da endotelina-1 e efeitos farmacológicos dos seus antagonistas Os conhecimentos iniciais de patogenia levaram à construção de uma hipótese fisiopatológica para a hipertensão pulmonar sustentada no desequilíbrio entre agentes vasodilatadores e vasoconstritores (Christman et al. 1992). Nomeadamente, uma redução da actividade da prostaciclina e no óxido nítrico, que preponderam no controlo do tono vascular pulmonar em condições fisiológicas, e uma elevação da endotelina-1 e tromboxano A2. Entre os mediadores neuroendócrinos envolvidos na fisiopatologia da hipertensão pulmonar com acção vasoconstritora pulmonar destaca-se a endotelina-1, que para além da acção vasoconstritora sistémica e pulmonar também tem acções inotrópicas positivas no miocárdio saudável (Brunner et al. 2006). A activação sustentada do sistema da endotelina-1, quer nos vasos pulmonares, quer no miocárdio, é um elemento importante na fisiopatologia da maior parte das formas de hipertensão pulmonar, resultando, para além da vasoconstrição, em remodelagem deletéria (Brunner et al. 2006). Adicionalmente, na activação sustentada o seu efeito inotrópico positivo torna-se irrelevante (Mollmann et al. 2007). O sucesso do antagonismo de sistemas neuroendócrinos na terapêutica da insuficiência cardíaca e dos síndromes coronários agudos (Rehsia e Dhalla 2010), que também foi reproduzido para o antagonismo da endotelina-1 em modelos experimentais (Mulder et al. 1997), não teve igual impacto na aplicação clínica a pacientes com insuficiência cardíaca (Kalra et al. 2002; O'Connor e Colaboradores 2003). Na hipertensão pulmonar, no entanto, o antagonismo crónico da endotelina-1 obteve grande sucesso terapêutico, tendo sido talvez a principal evolução terapêutica pela possibilidade de administração cómoda, por via oral, com benefícios claramente demonstrados na capacidade funcional e hemodinâmica (Channick et al. 2001), e no adiamento da deterioração clínica (Rubin et al. 2002). Efectivamente, os antagonistas da endotelina-1 tiveram bons resultados como fármacos de primeira linha em doentes em classe funcional III modificada da Organização Mundial de Saúde (Provencher et al. 2006). e também em classes funcionais inferiores, e, portanto, com doença menos grave (Galie et al. 2008), e possivelmente melhorarão a sobrevida, de acordo com comparações efectuadas com coortes Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 24 históricas (Sitbon et al. 2005). No entanto, muitos dos seus mecanismos de acção a nível subcelular e molecular encontram-se ainda por esclarecer, particularmente no que concerne às suas acções miocárdicas (Bogaard et al. 2009a). Apesar da disponibilidade oral ser uma vantagem fundamental na terapêutica crónica da hipertensão pulmonar, que esteve, em boa parte, na base da rápida inclusão do Bosentan, um antagonista dual, ou não selectivo, da endotelina-1, na prática médica, esta deixa de o ser na terapêutica aguda, por exemplo durante intervenções cirúrgicas e no ambiente de cuidados intensivos. No entanto, a hipertensão pulmonar é um síndrome muito frequente e com consequências marcantes precisamente nestes contextos em que a via oral muitas vezes não está disponível e em que são desejáveis fármacos com tempos de latência e duração de acção curtos, preferencialmente administráveis por via endovenosa e em perfusão, sendo a velocidade de infusão titulada para obter um efeito hemodinâmico desejado (Blaise et al. 2003; Kerbaul et al. 2005; Zamanian et al. 2007). De facto, a hipertensão pulmonar constitui um risco importante nos doentes críticos (McNeil et al. 2003) e cirúrgicos, tanto na cirurgia cardíaca(Reich et al. 1999) como na cirurgia não cardíaca (Ramakrishna et al. 2005), e a doença crítica e intervenções cirúrgicas constituem factores de risco para agudização da hipertensão pulmonar (Kerbaul et al. 2005), no entanto a investigação nesta área limita-se a pequenos estudos em que se testaram a dobutamina, o levosimendan, a milrinona, os inibidores da fosfodiestérase, os prostanóides e o óxido nítrico. Os antagonistas da endotelina-1 também já foram testados, principalmente no contexto da hipertensão pulmonar aguda. O Tezosentan, um antagonista não selectivo da endotelina-1, desenvolvido para administração por perfusão endovenosa, de curta latência e efeito rápido (Clozel 1999), cuja segurança e tolerabilidade já foi demonstrada em doentes com insuficiência cardíaca (O'Connor e Colaboradores 2003), foi empregue com sucesso em modelos experimentais de hipertensão pulmonar aguda em animais endotoxémicos (Konrad 2007, 2004), com lesão pulmonar aguda induzida pelo ácido oleico (Wang et al. 2004), com hipertensão pulmonar aguda induzida pelo tromboxano (Fitzgerald et al. 2004) e por aspiração de mecónio (Geiger 2008, 2006). Foi também eficaz na redução das pressões da artéria pulmonar num modelo experimental de hipertensão pulmonar sustentada por hiperfluxo em cordeiros recémnascidos (Fitzgerald et al. 2004), mas os seus efeitos na hipertensão pulmonar crónica, quer no contexto experimental quer no âmbito clínico, por exemplo como fármaco de substituição do Bosentan no período perioperatório ou durante o internamento em cuidados intensivos ainda não foram investigados satisfatoriamente. De facto, apenas dois trabalhos abordam esta questão, um ensaio clínico de fase III, levado a cabo em doentes submetidos a cirurgia cardíaca com hipertensão pulmonar pré-operatória secundária a doença cardíaca esquerda, aos quais foi Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 25 administrado Tezosentan nas primeiras 24h pós-operatórias (AC-051-350), que foi interrompido por ausência de diferenças, e um ensaio com Sitaxsentan, um antagonista selectivo dos receptores ETA em que se obtiveram melhorias hemodinâmicas na separação da circulação extracorporal durante a cirurgia de revascularização miocárdica (Joffs et al. 2001; Toole et al. 2010). Os mecanismos farmacológicos de acção vascular pulmonar e miocárdica dos antagonistas da endotelina-1 não estão bem caracterizados a nível funcional e molecular. A maior parte dos vasodilatadores pulmonares é igualmente inotrópica negativa, seja por acção directa no miocárdio, seja por acção indirecta induzindo hipotensão sistémica e menor perfusão coronária (Zamanian et al. 2007), ou simplesmente pela redução da pós-carga (Rex et al. 2008). A vasodilatação na hipertensão pulmonar também agrava frequentemente o acoplamento ventilação-perfusão e favorece o desenvolvimento de hipóxia (Blanco et al. 2010). No caso dos antagonistas da endotelina-1 estes efeitos farmacológicos encontram-se pouco explorados. Sabe-se que o Bosentan parece preservar a contractilidade e o acoplamento ventrículo-vascular (Rondelet et al. 2003) e que parte do seu efeito vasoactivo pulmonar se deve à maior actividade pulmonar da síntase do óxido nítrico constitutiva (Girgis et al. 2005). No entanto, outros mecanismos moleculares, particularmente as acções miocárdicas ainda não são conhecidas. Sabe-se, no entanto, que a endotelina-1 é um importante activador inflamatório (Juergens et al. 2008) e que em modelos experimentais o antagonismo agudo da endotelina-1 teve importantes efeitos anti-inflamatórios (Gamze et al. 2007). Activação inflamatória na hipertensão pulmonar Apesar da perspectiva fisiopatológica da hipertensão pulmonar como resultante do desequilíbrio entre vasoconstritores e vasodilatadores pulmonares ter contribuído de forma decisiva para o advento da maior parte dos fármacos que são correntemente utilizados na terapêutica da hipertensão pulmonar crónica, nomeadamente prostanóides, antagonistas da endotelina-1 e inibidores das fosfodiesterases, esta é francamente incompleta. De facto, as evidências mais recentes apontam para a interpretação fisiopatológica deste síndrome, principalmente na forma de hipertensão pulmonar arterial, como vasculopatia, em que ocorre uma extensa remodelagem das arteríolas pulmonares, infiltração por células inflamatórias e activação inflamatória local, e se desenvolvem lesões angioproliferativas (McLaughlin et al. 2009). O desenvolvimento de linhas celulares endoteliais resistentes à apoptose, a interacção entre as células endoteliais e as células musculares lisas vasculares através da acção de factores de crescimento e a transdiferenciação, quer de células endoteliais quer de fibroblastos em células musculares lisas, contribuem para a Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 32 subnutrição proteico-energética um aspecto crescentemente investigado em doenças crónicas e na caquexia cardíaca (Akner e Cederholm 2001; Azhar e Wei 2006). O papel terapêutico de estimulantes do apetite e de suplementação entérica tem sido investigado, com resultados favoráveis (von Haehling et al. 2009), particularmente na doença crítica (Stapleton et al. 2007). Para além dos efeitos na caquexia, a dieta pode influenciar de forma marcada a progressão da insuficiência cardíaca, tanto no aspecto funcional metabólico como em termos de remodelagem miocárdica. Vários trabalhos experimentais têm investigado o papel de nutrientes particulares e, em muitos destes, surpreendentemente, nutrientes que têm sido conotados com doença cardiovascular, não apresentam efeitos deletérios (Sharma et al. 2007). Assim, uma dieta rica em lípidos aumentou a fosforilação oxidativa mitocondrial, desviando os ácidos gordos de vias citotóxicas, sem agravar a progressão da insuficiência cardíaca num modelo experimental de enfarte do miocárdio (Rennison et al. 2007), e dietas ricas em gorduras atenuaram a disfunção ventricular e a remodelagem induzidas pela sobrecarga de pressão, comparativamente com dietas ricas em glícidos (Duda et al. 2008), e a hipertrofia e remodelagem num modelo experimental de hipertensão arterial sistémica, comparativamente com dietas pobres em gorduras (Okere et al. 2005). O papel dos nutrientes não parece estar apenas limitado à alteração de vias metabólicas e modulação da bioenergética miocárdica mas sim ser mais abrangente, modulando vias de sinalização intracelular. Assim, o enriquecimento alimentar em ácidos gordos de cadeia intermédia preserva a função miocárdica e a fosforilação oxidativa, provavelmente por indução do receptor dos peroxissomas activado por estímulos proliferativos (Iemitsu et al. 2008). De facto, este factor de transcrição é activado pelos lípidos nas dietas hipercalóricas (Clarke et al. 1999; Wu et al. 2001). Modelos experimentais de hipertensão pulmonar Embora nenhum modelo animal recapitule completamente todas as características da hipertensão pulmonar arterial humana, o estudo da fisiopatologia da hipertensão pulmonar tem sido levado a cabo essencialmente em modelos animais de hipertensão pulmonar arterial (Ryan et al. 2011). A combinação de diferentes agressões, de acordo com a hipótese das agressões múltiplas, permitiu desenvolver fenótipos mais severos que mimetizam melhor as características da hipertensão pulmonar arterial humana (Robbins 2004). O modelo experimental mais frequentemente utilizado, pela sua reprodutibilidade e facilidade de execução, é o modelo de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina no rato (Brown et al. 1998; Jasmin et al. 2001; Lalich e Merkow 1961; Werchan et al. 1989). A monocrotalina é um alcalóide pirrolizidínico, isolado a partir da Crotalaria spectabilis, que, após desidrogenação Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 33 pelo citocromo P450 hepático num pirrol reactivo, adquire acção tóxica no endotélio, provocando uma endarterite obliterativa das arteríolas pulmonares. As lesões histológicas pulmonares são semelhantes às da hipertensão pulmonar arterial (Kay et al. 1967; Ryan et al. 2011), sendo a monocrotalina desprovida de acção tóxica directa no miocárdio (Chen et al. 1998). Este modelo experimental contribuiu de forma muito relevante para a evolução terapêutica recente na hipertensão pulmonar arterial. Praticamente todos os fármacos que tiveram sucesso na hipertensão pulmonar arterial humana também foram eficazes neste modelo, com a excepção do Beraprost (Stenmark et al. 2009). Adicionalmente, neste modelo, a activação neuroendócrina assemelha-se à da insuficiência cardíaca (Brunner 1999; Leineweber et al. 2002), pelo que tem sido empregue também no estudo da evolução da resposta hipertrófica do miocárdio da fase compensada para insuficiência cardíaca (Buermans et al. 2005; Werchan et al. 1989) e na comparação entre as alterações funcionais e moleculares dos dois ventrículos, uma vez que o ventrículo esquerdo é influenciado apenas pela activação neuroendócrina enquanto o ventrículo direito é simultaneamente sobrecarregado (Kogler et al. 2003; Leineweber et al. 2002; Schott et al. 2005; Seyfarth et al. 2000). Como característica adicional, este modelo animal evolui rapidamente para insuficiência cardíaca descompensada e fatal, com activação inflamatória, anorexia e caquexia acentuadas e perda de massa músculoesquelética (Dalla Libera et al. 2004; Steffen et al. 2008). Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 34 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 35 Objectivos 1. Caracterizar o fenótipo contráctil do ventrículo esquerdo na hipertensão pulmonar experimental, procurando estabelecer: a. O estado funcional intrínseco do miocárdio in vitro; b. Evolução da disfunção e mecanismos moleculares; c. O papel de mecanismos neuroendócrinos na disfunção ventricular esquerda; d. Se a elevação aguda de pós-carga desencadeia intolerância diastólica à pós-carga e permite detectar disfunção in vivo. 2. Estudar o efeito de um regime alimentar hipercalórico, do tipo Ocidental, na caquexia que acompanha a hipertensão pulmonar experimental, avaliando concretamente: a. As repercussões na hipertensão pulmonar e função ventricular; b. Modificações na composição corporal e ganho ponderal; c. As alterações suscitadas no metabolismo e na activação inflamatória e neuroendócrina; d. Mecanismos subcelulares subjacentes, nomeadamente a modulação de factores de transcrição. 3. Avaliar os efeitos hemodinâmicos e neuroendócrinos, na hipertensão pulmonar crónica experimental, do antagonismo não-selectivo, agudo, da endotelina-1 com o Tezosentan, no intuito de analisar: a. Se os efeitos do antagonismo agudo são sobreponíveis aos do antagonismo crónico, com Bosentan, e mais concretamente: i. Se o antagonismo agudo apresenta benefícios hemodinâmicos; ii. Se o Tezosentan por via endovenosa pode ser usado como um substituto do Bosentan quando a via oral é inconveniente. b. Qual a acção miocárdica da endotelina-1 neste modelo e as consequências do seu antagonismo; c. Quais os mecanismos vasoactivos, reguladores agudos da função contráctil e antiinflamatórios envolvidos nos efeitos miocárdicos e vasculares pulmonares da endotelina-1. 4. Reproduzir em pacientes submetidos a revascularização miocárdica os achados experimentais, animais, de intolerância diastólica à elevação abrupta de pós-carga e correlacionar a disfunção diastólica com a função contráctil. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 36 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 37 Resultados Apresentados sob a forma de artigos publicados ou no prelo. 1. Disfunção miocárdica ventricular esquerda intrínseca e activação neuroendócrina na hipertensão pulmonar experimental Lourenço, A. P., R. Roncon-Albuquerque Jr, C. Brás-Silva , B. Faria , J. Wieland, T. Henriques-Coelho, J. Correia-Pinto e A. F. Leite-Moreira. 2006. “Myocardial dysfunction and neurohumoral activation without remodeling in left ventricle of monocrotalineinduced pulmonary hypertensive rats.”. Am J Physiol Heart Circ Physiol 291(4):H15871594. 2. Mecanismos de progressão da disfunção ventricular esquerda e avaliação da tolerância diastólica à pós-carga na hipertensão pulmonar experimental Correia-Pinto, J. C., T. Henriques-Coelho, R. Roncon-Albuquerque Jr, A. P.Lourenço, G. Melo-Rocha, F. Vásques-Nóvoa, T. C. Gillebert e A. F. Leite-Moreira. 2009. “Time course and mechanisms of left ventricular systolic and diastolic dysfunction in monocrotalineinduced pulmonary hypertension.”. Basic Res Cardiol 104(5):535-545. 3. Efeitos de um regime alimentar do tipo Ocidental na progressão da hipertensão pulmonar, insuficiência cardíaca e caquexia cardíaca na hipertensão pulmonar experimental Lourenço, A. P., F. Vásques-Nóvoa, D. Fontoura, C. Brás-Silva, R. Roncon-Albuquerque Jr, e A. F. Leite-Moreira. 2011. “A Western-type diet attenuates pulmonary hypertension with heart failure and cardiac cachexia in rats.”. J Nutr 141(11):1954-60. 4. Efeitos hemodinâmicos e neuroendócrinos do antagonismo agudo e crónico da endotelina-1 na hipertensão pulmonar experimental Lourenço, A. P., F. Vásques-Nóvoa, J. Oliveira-Pinto, D. Fontoura, R. Roncon-Albuquerque Jr, e A. F. Leite-Moreira. 2011. “Haemodynamic and neuroendocrine effects of tezosentan in chronic experimental pulmonary hypertension.”. Int Care Med (no prelo). 5. Avaliação da tolerância diastólica à pós-carga em pacientes submetidos a cirurgia de revascularização miocárdica com graus variáveis de disfunção sistólica Leite-Moreira, A. F., A. P. Lourenço, R. Roncon-Albuquerque Jr, T. Henriques-Coelho, M. J. Amorim, J. Almeida, P. Pinho, e T. C. Gillebert. 2011. “Diastolic tolerance to systolic pressures closely reflects systolic performance in patients with coronary heart disease.”. Basic Res Cardiol (no prelo). Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 38 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 39 Disfunção miocárdica ventricular esquerda intrínseca e activação neuroendócrina na hipertensão pulmonar experimental Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 40 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 41 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 48 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 49 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 50 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 51 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 52 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 53 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 54 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 55 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 56 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 57 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 64 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 65 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 66 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 67 Supplemental tables Supplemental Table 1. Detailed normal (ND) and Western-type (WD) diet composition1. ND WD Carbohydrates2 Polysaccharides 91 59 Simple 3 42 Fibers 6 0 Aminoacids3 Alanine 5.2 2.6 Arginine 6.2 3.7 Aspartic acid 8.3 6.3 Cystine 1.8 0.3 Glutamic acid 21.6 19.8 Glycine 5.6 2.4 Histidine 2.4 2.7 Isoleucine 3.8 5.4 Leucine 7.6 8.1 Lysine 5.0 7.2 Methionine 2.1 3.5 Phenylalanine 4.8 4.5 Proline 7.8 10.0 Serine 5.0 5.6 Threonine 3.8 4.4 Tryptophan 1.3 1.5 Tyrosine 3.1 5.6 Valine 4.7 6.4 FFA4 Saturated 16:0 19.3 24.8 18:0 2.1 12.3 Other 1.6 2.6 Monounsaturated 16:1 0.7 3.1 18:1 18.5 45.1 20:1 1.2 1.3 Other 1 0.3 Polyunsaturated 18:2 and 18:3 53.9 10 20:4 0.2 0.4 Other 1.6 0 1Values are given in percentage. Composition per kg of diet was similar for vitamins (6 mg calcium pantothenate, 1.3 g choline chloride, 0.75 mg folic acid, 0.63 mg menadione sodium bisulfate, 15 mg niacin, 40 g vitamin B12, 5 mg pyridoxine, 2.25 mg riboflavin, 3 mg thiamin HCl, 0.9 mg vitamin A, 25 g ergocalciferol, and 15 g vitamin E) and minerals (5.53 g Ca, 0.86 g Cl, 5.57 mg Cu, 0.49 mg Cr, 0.3 mg I, 39.44 mg Fe, 0.49 g Mg, 52.24 mg Mn, 3.46 g P, 8.72 g K, 0.17 mg Se, 0.67 g S, and 12.51 mg Zn) except for added salt in the WD. 2Derived from vegetable (wheat, barley, bran wheat and corn grain) in ND, and maltodextrin and corn starch with added sucrose (177.8 g . kg-1) in WD. 3From vegetable and fish isolate origin in ND and from animal origin in WD. 4Derived from vegetable origin and animal lard in ND and WD, respectively. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 68 Supplemental Table 2. Gene specific real –time PCR primers. Gene Sequence Bax fw: 5’ – TGG AGC TGC AGA GGA TGA TTG - 3’ rev: 5’ – ACG CGG CCC CAG TTG AAG T - 3’ Bcl-2 fw: 5’ – GAG GGG CTA CGA GTG GGA TAC - 3’ rev: 5’ – GCG GGC GTT CGG TTG CTC TC - 3’ Edn1 fw: 5’ – CGG GGC TCT GTA GTC AAT GTG - 3’ rev: 5’ – CCA TGC AGA AAG GCG TAA AAG - 3’ Tnf fw: 5’ – TGG GCT ACG GGC TTG TCA CTC - 3’ rev: 5’ – GGG GGC CAC CAC GCT CTT C - 3’ Il6 fw: 5’ – GAA GTT GGG GTA GGA AGG AC - 3’ rev: 5’ – CCG TTT CTA CCT GGA GTT TG - 3’ Pdk4 fw: 5’ – GAG GCC ACC GTC GTC TTG - 3’ rev: 5’ – ACA GGC GTT GGA GCA GTG G - 3’ Acsl1 fw: 5’ – CTA CAG GCA ACC CCA AAG GAG - 3’ rev: 5’ – GGG CGA GAG GCA AGA AAG ATA - 3’ Acadm fw: 5’ – ACG ATA AAA GCG GGG AAT ACC - 3’ rev: 5’ – AGG CCA AGA CCA CCA CAA CTC - 3’ Acadl fw: 5’ – CAT TTT CCG GGA GAG TGT AA - 3’ rev: 5’ – CTT GCC AGC TTT TTC CCA GAG - 3’ Ppara fw: 5’ – TTC CAG CCC CTC CTC AGT CAG - 3’ rev: 5’ – AGC CCT TGC AGC CTT CAC AT - 3’ Adipoq fw: 5’ – GGG CTA CGG GCT GCT CTG A - 3’ rev: 5’ – TAT GGG GAA GGG GAC AAC AAT G - 3’ Lep fw: 5’ – CCG CCA GGC AGA GGG TCA C - 3’ rev: 5’ – TCT GCA GCA CGT TTT GGG AAG G - 3’ Actb fw: 5’ – ATC TGG GTC ATC TTT TCA CGG TTG G - 3’ rev: 5’ – GAT TTG GCA CCA CAC TTT CTA CA - 3’ Gapdh fw: 5’ – CCG CCT GCT TCA CCA CCT TCT - 3’ rev: 5’ – TGG CCT TCC GTG TTC CTA CCC - 3’ Acadm, medium chain acyl CoA dehydrogenase; Acadl, long chain acyl CoA dehydrogenase; Acsl1, Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 1; Actb, -actin; Adipoq, adiponectin; Bax, Bcl-2–associated X protein; Bcl-2, B-cell lymphoma 2; Edn1, endothelin-1; Lep, leptin; Pdk4, pyruvate-dehydrogenase kinase type 4. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 69 Supplemental Table 3. Morphometry of control (C) or monocrotaline (M)-injected rats fed normal (ND) or a Western-type (WD) diet for 5 wk1. C-ND C-WD M-ND M-WD P-Value2 BW3, g 354 ± 6 361 ± 7 242 ± 7* 261 ± 7*† I, P<0.001; D, P=0.043 TL, mm 40.0 ± 0.3 39.3 ± 0.4 38.5 ± 0.2* 38.6 ± 0.4 I, P=0.001 Lung : TL, mg . mm-1 38 ± 1 42 ± 1 65 ± 3* 52 ± 3*† D x I, P=0.005 Gastrocnemius : TL, mg . mm-1 55 ± 1 51 ± 2 38 ± 2* 47 ± 1*† D x I, P=0.002 Liver : TL, mg . mm-1 325 ± 19 369 ± 33 214 ± 12* 284 ± 26*† I, P<0.001; D, P=0.021 Perigonadal fat : TL, mg . mm-1 80 ± 8 116 ± 7† 47 ± 3* 63 ± 4*† I, P<0.001; D, P<0.001 Perirenal fat : TL, mg . mm-1 80 ± 8 124 ± 16† 35 ± 4* 59 ± 4*† I, P<0.001; D, P<0.001 1Values are mean ± SEM; n=7; *Different from corresponding C groups, P<0.05; †Different from corresponding ND group, P<0.05. 2Main effects of diet (D) or injection (I), and interaction (D x I). 3BW, body weight; TL, tibial length. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 70 Supplemental Table 4. Myocardial morphometry, cardiomyocyte diameters and protein:DNA content in control (C) or monocrotaline (M)-injected rats fed normal (ND) or a Western-type (WD) diet for 5 wk1. C-ND C-WD M-ND M-WD P-Values2 Morphometry RV3/TL, mg . mm-1 4.8 ± 0.2 5.1 ± 0.3 8.4 ± 0.2* 8.6 ± 0.5* I, P<0.001 LV+IVS/TL, mg . mm-1 17.4 ± 0.8 17.7 ± 0.5 13.7 ± 0.6* 16.0 ± 0.4*† D x I, P=0.048 Cardiomyocyte diameters RV,  m 15.6 ± 0.7 16.8 ± 0.3 18.5 ± 0.6* 18.7 ± 0.5* I, P<0.001 LV,  m 16.9 ± 0.2 17.1 ± 0.8 17.0 ± 0.3 16.3 ± 0.5 NS Protein and DNA4 RV protein,  g . g-1 124 ± 5 119 ± 8 172 ± 14* 155 ± 15* I, P=0.023 DNA, ng . g-1 296 ± 10 310 ± 11 565 ± 65* 342 ± 15† D x I, P=0.030 protein/DNA,  g . ng-1 0.42 ± 0.00 0.38 ± 0.02 0.30 ± 0.01* 0.47 ± 0.07† D x I, P=0.026 LV protein,  g . g-1 120 ± 12 120 ± 10 125 ± 5 130 ± 10 NS DNA, ng . g-1 299 ± 15 274 ± 36 267 ± 26 261 ± 17 NS protein/DNA,  g . ng-1 0.40 ± 0.05 0.46 ± 0.06 0.49 ± 0.06 0.51 ± 0.04 NS 1Values are mean ± SEM; n=7; *Different from correponding C group, P<0.05; †Different from corresponding ND group, P<0.05. 2Main effects of diet (D) or injection (I), and interaction (D x I); NS, not-significant (P>0.050). 3IVS, interventricular septum; LV, left ventricle; RV, right ventricle ; TL, tibial length. 4DNA and protein to DNA concentration ratio were used as surrogates of cardiomyocyte number and size, respectively. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 71 Supplemental figures Supplemental Figure 1. Representative RV (A) and LV (B) PV loops with their respective ESPVR (upper-left corner of each loop) and EDPVR (lower-right corner) obtained from IVC occlusions. For significant differences please refer to table 2 of the manuscript. EDPVR, end-diastolic pressure-volume relationships; ESPVR, end-systolic pressure-volume relationships; IVC, inferior vena cava; LV, left ventricle; PV, pressure-volume; RV, right ventricle. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 72 Supplemental Figure 2. Representative lung histological sections (Hematoxylin & Eosin) of pulmonary arterioles (200x) of control (C) and monocrotaline (M)-injected rats fed for 5 wk with either normal (ND), C-ND (A) and M-ND (panel C), respectively, or Western-type (WD) diet, C-WD (B) and M-WD (D), respectively. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 73 Supplemental Figure 3. Representative RV (A-D) and LV myocardial (E-H) histological sections of control (C) and monocrotaline (M)-injected rats fed for 5 wk with either normal (ND), C-ND (A and E) and M-ND (panel C and G), respectively, or Western-type (WD) diet, C-WD (B and F) and M-WD (D and H), respectively, stained with Masson’s trichrome (400x). Fibrosis areas are stained blue. Notice also RV cardiomyocyte hypertrophy in M-ND (panel C). LV, left ventricle; RV, right ventricle. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 80 PH experimental model, and to assess whether these were altered by previous chronic therapy with bosentan. Methods Male Wistar rats, 180-200g (Charles-River, Barcelona, Spain), randomly received 60mg.Kg-1 subcutaneous MCT (Sigma Chemical, St Louis, MO) or vehicle. Randomly, 48h later, some MCTinjected animals were gavaged 300mg.Kg-1.d-1 bosentan (30mg.mL-1 in 5% gum Arabic; kindly provided by Actelion pharmaceuticals) (MCT BOS; n=46), while others (MCT; n=125) and controls (Ctrl; n=23) received vehicle. Rats were housed 5 per cage with controlled environment (22oC, 12:12h light-dark). Experiments conformed to the Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health, Pub.No. 85-23, revised 1996). After bosentan interruption for 48h, at days 25-30, rats were anesthetized with 2.5-3% sevoflurane and 150g.Kg-1 intraperitoneal fentanyl, mechanically ventilated (150.min-1, 100% O2, 14-16cmH2O inspiratory pressure, with tidal volume adjusted to animal weight, and 4cmH2O end-expiratory pressure; TOPO Small Animal Ventilator, Kent Scientific Inc.) and kept at 38oC. Ringer’s solution (30mL.Kg-1.h-1) was perfused through the femoral vein and arterial blood gas (ABG) samples collected (Stat Profile pHOx®, Nova Biomedical, Waltham, MA) from femoral artery. After thoracotomy, pressurevolume (P-V) catheters were implanted through the apex in the left ventricle (LV) and RV (SPR838 and PVR-1045, Millar Instruments, Houston, TX, respectively) and a transit-time flow-probe in the ascending aorta (200-367, Triton Technology, San Diego, CA). Data were continuously acquired (MPVS 300, Millar Instruments), digitally recorded at 1000Hz (ML880 PowerLab 16/30, Millar Instruments, Houston, TX), and analyzed (PVAN 3.5, Millar Instruments). After 15min stabilization, recordings were done at sustained end-expiration. Parallel conductance and field inhomogeneity were estimated from 50L 10% saline injections and cardiac output (CO) measurement (Active Redirection Transit Time Flowmeter, System 6, Triton Technology), respectively. First, 0.5, 1, 5, 10, and 20 mg.Kg-1 intravenous tezosentan doses (in saline; kindly Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 81 provided by Actelion pharmaceuticals) were assessed (n=7 each group), then rats randomly received either an intravenous 20mg.Kg-1 dose followed by 10mg.Kg-1.h-1 tezosentan perfusion (TEZO; n=8 per group), or saline (Vehicle; n=8 per group), and recordings and ABG collection were repeated 1h after stable effect. A 2mL venous sample was withdrawn 4h after. Animals were euthanized by exsanguination, the heart, RV and LV and interventricular septum (IVS) and the lungs were weighed and stored (-80oC). A flowchart with experimental methods can be found in Supplemental Fig. 5. Lung and RV free-wall mRNA underwent two-step real-time reverse transcription-polymerase chain reaction as described [16]. Results, normalized for - actin, are presented relative to Ctrl Vehicle. Primers are given in Supplemental Table 1. Cyclooxygenase (COX) and nitric oxide synthase (NOS) activities were quantified in homogenates (760151 and 760871, Cayman Chemical Company, respectively) with or without specific COX-2, DuP-697 (70645, Cayman Chemical Company), and inducible NOS (iNOS), aminoguanidine (396494, Sigma-Aldrich), inhibitors. Circulating ET-1 (S-1171, Peninsula laboratories, San Carlos, CA), interleukin-6 (IL-6; DE4845, Demeditec diagnostics GmbH, Germany) and tumor necrosis factor- (TNF- 45-TNFRTU-E01, Alpco Diagnostics™, Salem, NH) were quantified by enzyme immunoassay. Nitrates and 6-keto-PGF1, stable nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2) metabolites, were also quantified (Cat. No. 760871 and Cat. No. 515211, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, respectively) after ultrafiltration (Amicon Ultra 30K, Millipore, Ireland). Statistical analysis Analysis by two-way repeated-measures ANOVA for dose-response, two-way ANOVA for haemodynamics, ABG, gene expression, neuroendocrine and enzyme activities, and paired t-test for perfusion, with Holm-Sidak's method for post hoc comparisons. ANOVA on ranks was used Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 82 for non-normally distributed data. Chi-square was used to compare mortality. Two-tailed P<0.05. Variables: meanSEM. Results Animal model None of Ctrl animals died during follow-up or haemodynamic evaluation while mortality rates were 77% and 43% (P<0.001) and another 6 and 3 rats were lost during haemodynamic evaluation in MCT and MCT BOS, respectively. MCT and MCT BOS presented lower body weights. MCT showed increased RV weight and RV to LV+IVS weight ratio which was attenuated in MCT BOS. No differences were observed between TEZO and Vehicle (Supplemental Table 2). Dose-response evaluation MCT and MCT BOS showed increased RV maximal pressures that were dose-dependently reduced by TEZO, while no effect was observed in Ctrl. Distinctly, TEZO only reduced LV pressure in Ctrl, not in MCT or MCT BOS. MCT however had lower LV maximal pressures compared with both Ctrl and MCT BOS (Supplemental Fig. 6). Higher doses elicited no additional effects (not shown). Haemodynamic effects of tezosentan Maximal RV pressure and arterial elastance (EA), surrogates of PH and RV afterload, respectively, were increased in MCT, which was accompanied by prolonged time constant of relaxation  , increased end-diastolic volume and pressure, reduced ejection fraction (EF) (Table 1), and lower heart rate (HR) and CO (Fig. 1a) compared with Ctrl, while MCT BOS showed an overall improvement. Though no changes were observed with vehicle, TEZO attenuated maximal and end-diastolic RV pressure and Ea rise both in MCT and MCT BOS and also  , end-diastolic volume, Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 83 EF and CO in MCT without changing HR (Fig. 1a). Load-independent indexes obtained from inferior vena cava occlusions are given in Table 2 and representative RV PV loops in Supplemental Fig. 7. End-diastolic PV relationships were upward-shifted in MCT, not in MCT BOS, and were also normalized by TEZO, whereas end-systolic PV relationships and other loadindependent contractility indexes were similarly increased in MCT and MCT BOS, with no changes after TEZO. Since end-systolic PV relationship slope was preserved and EA was decreased, ventriculo-vascular coupling was improved both in MCT BOS and MCT TEZO compared with MCT (Fig. 1b). As for the LV, MCT showed reduced maximal pressures, reduced end-diastolic volume and EF along with prolonged  (Table 1), while MCT BOS did not. TEZO decreased maximal pressure and maximum rate of LV pressure rise only in Ctrl, while it increased LV end-diastolic volumes and EF in MCT. LV preload recruitable stroke work was unchanged in MCT or after chronic and acute ET-1 blockade. MCT showed upward-shifted LV end-diastolic PV relationships that were restored to normal both by chronic BOS therapy in MCT BOS and by acute TEZO therapy in MCT TEZO (Table 2). Respiratory effects of tezosentan Animals were normoventilated and maintained acid-base balance throughout perfusion. Arterial O2 pressure under stable ventilation was used as surrogate of oxygenation. Both MCT and MCT BOS showed decreased arterial O2 pressures that were not altered by TEZO (Supplemental Table 3). Effects of tezosentan on endothelin-1 and cytokine production MCT showed increased plasma levels of ET-1, IL-6 and TNF- (Fig. 2c), that were accompanied by increased local expression of TNF- and ET-1 in the RV (Fig. 2b) and TNF- and IL-6 in the lung (Fig. 2a). These were partly prevented by chronic ET-1 antagonism and markedly attenuated with acute antagonism in MCT BOS and MCT TEZO, respectively. TEZO also reduced plasma Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 84 levels of TNF- and IL-6 in MCT BOS, whereas it raised ET-1 RV expression and plasma levels in Ctrl compared with Vehicle. Effects of tezosentan on prostaglandin and NO production PGI2 metabolite 6-keto-PGF1 was increased both in MCT and MCT BOS compared with Ctrl, which was attenuated after TEZO perfusion, compared with Vehicle (Fig. 3c). Contrastingly, TEZO increased 6-keto-PGF1 in Ctrl. These plasma changes were accompanied by increased RV activities of both COX-1 and -2 and also by increased gene expression of COX-1 in MCT, that were attenuated by chronic and acute ET-1 antagonism in MCT BOS and MCT TEZO, respectively. While gene expression of COX-2, contrarily, was decreased in MCT with no changes after either BOS or TEZO (Fig. 3b). As for the lung, no changes were observed in either the expression or enzymatic activity of COX-2, whereas COX-1 showed increased gene expression in MCT, that was attenuated by either chronic or acute ET-1 antagonism, and markedly decreased activity both in MCT and MCT BOS, which was attenuated only by acute ET-1 antagonism in MCT TEZO (Fig. 3a). Plasma levels of nitrates were lower in MCT and restored to Ctrl values or higher in MCT BOS. TEZO had no effect compared with Vehicle (Fig. 4c). Plasma changes were paralleled by lower non-inducible NOS activity in the lung (Fig. 4a) and RV (Fig. 4b) of MCT that was attenuated by chronic ET-1 antagonism in MCT BOS but only abrogated in the RV, not in the lung, by TEZO, whilst iNOS was overactive both in the lungs and RV of MCT. TEZO markedly attenuated both lung and RV activities whereas BOS only attenuated RV activity. As for gene expression, while in the RV no changes were observed in either eNOS or iNOS, in the lung eNOS was upregulated in MCT and MCT BOS, with no change after TEZO, and iNOS was downregulated in MCT, which was attenuated both by short-term and chronic ET-1 antagonism. Discussion We demonstrate that an acute intravenous infusion of the short acting dual ET-1 antagonist tezosentan attenuates PH, without compromising VQ matching or systemic pressure and even Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 85 improving CO and ventriculo-vascular coupling, while concomitantly blunting inflammatory and vasoconstrictor mediator production in chronic experimental PH induced by MCT. These effects were also observed after previous therapy with bosentan. MCT-induced PH is a well-established model with extensive neuroendocrine and inflammatory activation that rapidly progresses to RV failure [16]. In MCT we observed PH and increased afterload that were accompanied not only by RV hypertrophy but also by disturbed ventriculovascular coupling, RV dilation, decreased EF and CO output, and compromised diastolic function. As for the LV, MCT showed decreased end-diastolic volumes, compromised diastolic function and lower LV maximal pressures, as expected by ventricular interaction [17] and possibly also due to intrinsic myocardial dysfunction [16]. Regarding gas exchange, under normoventilation MCT showed lower arterial O2 pressures as expected [18]. Also as described, circulating levels of ET-1 and RV gene expression were increased [16], which was accompanied by marked inflammatory activation, as assessed by TNF- and IL-6 gene expression and plasma concentrations [19]. PH is an inflammatory condition with endothelial dysfunction and loss of vascular control mechanisms. The imbalance between vasodilators and vasoconstrictors, namely an altered local ratio of thromboxane A2 (TxA2) to PGI2, decreased expression of eNOS, and increased ET-1 plays an important part in its pathophysiology [20]. Inflammatory activation also compromises myocardial function. As previously reported, plasma NO levels and lung activity of eNOS were reduced in MCT-induced PH [21]. Contrastingly, PGI2 production was increased in MCT-induced PH [22], which could be due to concomitant heart failure, with platelet activation and systemic production [23], since it is normally decreased in human PH [24]. Nevertheless, prostanoid lung synthesis was compromised, since COX-1 activity was markedly reduced, as previously reported in chronically hypoxic pigs that showed a markedly decreased PGI2 to TxA2 ratio [25]. On the other hand, in the RV of MCT, we observed high iNOS and inducible COX-2 activation. iNOS is known to mediate the negative inotropic effects of cytokines, generating high quantities of NO that profoundly depress myocardial function [26]. COX-2, also activated by Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 86 cytokines, produces high levels of prostanoids , mediates TNF- responsiveness through TxA2 production [27], and was shown to be upregulated in the failing heart [28]. Additionally, in the failing RV of MCT we also observed decreased eNOS activity and increased COX-1 activity. eNOS, the major NO source in the normal heart, is typically reduced in heart failure and restoration of its activity exerts protective actions [29], whereas COX-1 is typically increased by oxidative stress and its antagonism exerts beneficial effects in heart failure [30]. RV haemodynamic disturbances were attenuated in MCT BOS and ventriculo-vascular coupling was improved, as previously reported [31]. Systemic hypotension, as assessed by LV maximal pressures, was not observed which could be attributed to preserved CO due to restored LV preload and reduced ventricular interaction, but also to improved myocardial function [16]. Chronic ET-1 antagonism did not alter overall VQ matching. Curiously, and contrarily to what has been reported for earlier stages of disease in MCT-induced PH [32], chronic ET-1 antagonism reduced plasma concentration and RV expression of ET-1, probably due to attenuation of PH and disease progression [16, 31] and not to ET-1 antagonism itself, since plasma ET-1 levels were increased in Ctrl by acute ET-1 antagonism with tezosentan, as described [5]. Alongside haemodynamic benefits and reduced ET-1 activity, MCT BOS also showed increased NO plasma levels and increased eNOS lung activity, as previously reported for bosentan-treated PH patients [33], which could partly account for the attenuation in PH. Nevertheless, our main goal was to evaluate the effects of the short-acting intravenous dual ET-1 antagonist tezosentan in chronic PH. Since perfusion doses were not previously established for this model we carried out a dose-response evaluation. Tezosentan dose-dependently reduced RV maximal pressures up to 20mg.Kg-1, doses higher than previously described [34], without significant reduction of LV pressure, not only in MCT but also in MCT BOS, suggesting an additional benefit of acute ET-1 blockade even after chronic bosentan therapy. Based on previous works that have shown molecular and neuroendocrine changes as soon as 4h after drug perfusion [35], we then evaluated haemodynamic, respiratory and neuroendocrine Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 87 responses to tezosentan perfusion. While vehicle had no effects, tezosentan attenuated PH and RV afterload, both in MCT and MCT BOS. Ventriculo-vascular coupling, EF and CO however were only improved in MCT. Similar to chronic ET-1 antagonism, tezosentan perfusion did not disturb VQ matching. Moreover, tezosentan perfusion was able to acutely reduce circulating levels and RV expression of ET-1 in MCT, as observed after chronic bosentan therapy in MCT BOS. Both chronic and acute dual ET-1 antagonism with bosentan and tezosentan, respectively, attenuated inflammatory activation in MCT, namely TNF- and IL-6 circulating concentrations and tissue expression, which could be due not only to direct ET-1 antagonism, since ET-1 increases the production of inflammatory mediators [36], but also to the beneficial haemodynamic effects and improved CO and thus better tissue perfusion. Additionally, it should be mentioned that the anti-inflammatory effects of ET-1 antagonism might have been partly responsible for improved haemodynamics and lower ET-1 activity in MCT after acute and chronic ET-1 antagonism, as cytokines also induce ET-1 production [37]. Indeed, we also observed a marked attenuation of inflammation induced iNOS and COX-2 activation in the RV of MCT after either an acute tezosentan perfusion or chronic bosentan therapy. The fast haemodynamic, neuroendocrine and anti-inflammatory effects observed with tezosentan perfusion are not surprising, since it has repeatedly been tested with success in experimental models of septic shock and acute lung injury [11]. As additional effect, tezosentan perfusion increased COX-1 activity in the lungs of MCT compared with Vehicle. Although surprising, since ET-1 induces the expression of COX-1 [38], we interpret this upregulation of COX-1 activity after ET-1 blockade as a consequence of decreased pulmonary vascular load and increased flow, as observed in cell culture experiments [39]. Concerning the effects of acute ET-1 antagonism in PH animals that had previously undergone chronic ET-1 blockade. We must stress that even though bosentan was withdrawn for 48h its molecular effects surely will last considerably longer and therefore tezosentan was not expected to exert major actions. Still, although we found no amelioration in CO, we did observe reduced Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 88 PH, improved ventriculo-vascular coupling and further anti-inflammatory effects, which supports its use as a replacement drug. To conclude, we have demonstrated in chronic experimental MCT-induced PH, that acute ET-1 antagonism with tezosentan attenuates PH and improves CO with concomitant reduction of ET-1 and inflammatory cytokine levels, and increased vasodilator production. Part of these beneficial effects were also observed after previous chronic ET-1 antagonism with bosentan, suggesting it may be a good replacement drug when the enteric route of administration is not tolerated or a precise real-time control of haemodynamics is required. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 89 Acknowledgments This work was partly funded by grants from the Portuguese Foundation for Science and Technology (PTDC/SAU-MET/116119/2009, PIC/IC/82943/2007 and PEst-C/SAU/UI0051/2011). Bosentan and tezosentan were kindly provided by Actelion Pharmaceuticals. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 96 Figures Fig. 1 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 97 Fig. 2 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 98 Fig. 3 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 99 Fig. 4 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 100 Supplemental Figure Legends Supplemental Fig. 5. Flowchart of experimental procedures; for details on experimental protocols please refer to the manuscript. ABG, arterial blood gas analysis Supplemental Fig. 6 Acute dose-response haemodynamic effects of tezosentan (TEZO) in right (RV) and left ventricular (LV) maximal pressures of vehicle-injected (Ctrl), monocrotaline-injected (MCT) and monocrotaline-injected bosentan-treated rats (MCT BOS); recordings of RV (black symbols) and LV maximal pressures (white symbols) obtained in Ctrl (circular symbols, solid lines), MCT (triangular symbols, long dash) and MCT BOS (quadrangular symbols, short dash) are shown at baseline and after stable effects of 0.5, 1, 2, 5, 10 and 20mg.Kg-1 cumulative intravenous TEZO bolus administrations. *P<0.05 vs baseline, †P<0.001 vs Ctrl, ‡P<0.01 vs Ctrl and MCT BOS on two-way repeated-measures ANOVA; n=7 per group Supplemental Fig. 7 Representative right ventricular pressure-volume (PV) loops before and after perfusion of vehicle (a and b, respectively) and tezosentan (c and d, respectively) in vehicleinjected (Ctrl), monocrotaline-injected (MCT) and monocrotaline-injected bosentan-treated rats (MCT BOS); PV loops and linear, end-systolic, and exponential, end-diastolic, PV relationships are presented as solid lines for Ctrl (dark gray), MCT (black) and MCT BOS (light gray). Dashed lines represent inferior vena cava occlusions. For differences between groups please refer to tables 1 and 2 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 101 Supplemental Tables Supplemental Table 1. Gene specific real -time PCR primers. Gene Sequence ET-1 fw: 5’ – CGG GGC TCT GTA GTC AAT GTG - 3’ rev: 5’ – CCA TGC AGA AAG GCG TAA AAG - 3’ TNF- fw: 5’ – TGG GCT ACG GGC TTG TCA CTC - 3’ rev: 5’ – GGG GGC CAC CAC GCT CTT C - 3’ IL-6 fw: 5’ – GAA GTT GGG GTA GGA AGG AC - 3’ rev: 5’ – CCG TTT CTA CCT GGA GTT TG - 3’ COX-1 fw: 5’ – AGT ACC ACC TGC GGC TCT TCA - 3’ rev: 5’ – CTT TTC GGG CGG GAC ACC T - 3’ COX-2 fw: 5’ – GCT GCT GCC GGA CAC CTT - 3’ rev: 5’ – CAA CCC GGC CAG CAA TCT - 3’ eNOS fw: 5’ – GTC GGG CCC CTA CAA CAG C - 3’ rev: 5’ – TGC GCC GCC AAG AGG ATA - 3’ iNOS fw: 5’ –CCC AGC CCA ACA ACA CAG GA3’ rev: 5’ –GGC GGG TCG ATG GAG TCA3’ -actin fw: 5’ – ATC TGG GTC ATC TTT TCA CGG TTG G - 3’ rev: 5’ – GAT TTG GCA CCA CAC TTT CTA CA - 3’ ET-1, endothelin-1; TNF-, tumor necrosis factor-; IL-6, interleukin-6; COX-1, cyclooxygenase type 1; COX-2, cyclooxygenase type 2; eNOS, endothelial nitric oxide synthase; iNOS, inducible nitric oxide synthase. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 102 Supplemental Table 2. Morphometry. BW, g RVW/BW, mg.g-1 RVW/(LVW+IVSW), % Ctrl Vehicle 328 ± 13 0.56 ± 0.03 28 ± 1 TEZO 317 ± 16 0.62 ± 0.03 31 ± 2 MCT Vehicle 236 ± 9* 1.46 ± 0.10* 60 ± 4* TEZO 247 ± 9* 1.33 ± 0.09* 62 ± 4* MCT BOS Vehicle 257 ± 9* 1.19 ± 0.11*† 53 ± 4*† TEZO 252 ± 10* 1.16 ± 0.08*† 52 ± 4*† Morphometric evaluation of vehicle-injected (Ctrl), monocrotaline-injected (MCT) and monocrotaline-injected rats chronically treated with Bosentan (MCT BOS) that later underwent either vehicle or tezosentan perfusion (TEZO). BW, body weight; RVW, right ventricular weight; LVW, left ventricular weight; IVSW, interventricular septum weight. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 103 Supplemental Table 3. Blood gas values before and after vehicle and tezosentan perfusion. Before After Ctrl MCT MCT BOS Ctrl MCT MCT BOS Vehicle pH 7.46  0.03 7.50  0.05 7.44  0.01 7.48  0.02 7.50  0.05 7.41  0.02 PaO2, mmHg 324  36 178  36* 164  17* 343  28 223  38* 251  48* PaCO2, mmHg 32.8  3.1 28.0  2.9 28.3  2.7 30.8  2.3 28.0  2.4 28.0  2.5 Tezosentan pH 7.44  0.05 7.43  0.04 7.44  0.01 7.42  0.06 7.39  0.03 7.41  0.02 PaO2, mmHg 320  29 225  23* 183  38* 279  41 230  27* 174  24* PaCO2, mmHg 31.7  2.9 29.2  3.0 32.1  2.6 28.0  4.2 28.2  1.6 28.7  3.7 Arterial blood gas values before and after saline (Vehicle) or tezosentan perfusion in vehicle-injected (Ctrl), monocrotaline-injected (MCT) and monocrotaline-injected bosentan-treated rats (MCT BOS). PaO2, arterial O2 pressure; PaCO2, arterial CO2 pressure. *P<0.01 vs Ctrl on two-way ANOVA; n=8 per group. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 104 Supplemental Figures Supplemental Fig. 5 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 105 Supplemental Fig. 6 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 112 selectively increases afterload with no preload changes, no changes in long term load history, and no neurohumoral adaptations15. Effects of systolic LVP elevations on filling pressures were assessed by subtracting LVEDP at the end of the test beat from LVEDP of the previous control beat (diastolic dysfunction). We previously showed in animal experiments that single beat afterload elevations do not alter LV end-diastolic volume and therefore increases in LVEDP denote a true upward shift of the enddiastolic pressure-volume relation 11. This was confirmed in the present study with pressurevolume measurements. In each patient the maximum systolic LVP, which did not slow relaxation and did not increase subsequent filling pressures was determined, referred to as maximum tolerated pressure. In 3 patients, in whom no additional systolic LVP could be developed without slowing of relaxation, systolic pressure was carefully decreased by transient caval occlusion. As LVP progressively decreased, the time constant  initially decreased, then increased. This was monitored on-line on a dP/dt versus LVP phase-plane plot, as previously described 15,and confirmed by off-line analysis. The level of systolic LVP at which the time constant  was minimal in these patients was deemed to be the maximum tolerated systolic LVP in this subgroup. In 7 patients with EF≥0.30, 500 mL of extracorporeal circulation priming solution were administered. Recordings of baseline and isovolumetric heartbeats were repeated after stabilization. Statistical analysis Quantitative results are presented as mean±SD. Systolic LVP is given in absolute values (mmHg) or as a percentage of the isovolumetric pressure of each patient. Effects of LVP elevations were analysed with repeated measurements one-way ANOVA and Holm-Sidak post hoc test. Volume loading was compared to baseline with paired t-test. Linear regression was Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 113 performed on normally distributed data by least squares regression and the Pearson correlation coefficient was obtained. Statistical significance was set at P<0.05. RESULTS The mean patient age was 638 years, 19 were men. Other preoperative data including drug therapy and comorbidities are summarized in table 1. These consecutive patients constitute a representative sample of CABG patients at our institution. Individual haemodynamic data are presented in supplemental table 1. Patients were pooled in three groups according to their preoperative EF as assessed by 2D-echocardiography (normal ≥0.50; moderately decreased 0.30-0.49; severely decreased<30). Twelve patients had a normal and eight patients a decreased EF. All patients underwent graded aortic constrictions resulting in beat-to-beat elevations of systolic LVP, ranging from a small elevation of a few mmHg to full isovolumetric beats. A representative LVP tracing illustrating the increase in LVEDP after complete aortic occlusion is presented in Figure1. Corresponding tracings from other patients are presented in supplemental figure 1. Tracings, representative of each of the three EF patient categories, are presented in Figure 2. In each panel, three pressure-time curves are superimposed: a control, an isovolumetric beat and one intermediate LVP elevation. Peak isovolumetric LVP was higher in the left panel (normal EF) and lower in the right panel (EF<0.30). In the left panel, LVP elevations did not affect subsequent filling pressures, while the right panel, illustrates a patient with poor EF, who already presented elevated filling pressure at rest and showed further increases with both the intermediate and isovolumetric LVP elevations. As to the middle panel (EF 0.30-0.49), filling pressures were increased in the isovolumetric beat but not in the intermediateafterloaded heartbeat. When we consider the patients with normal EF (n=12), they operate at baseline (under anaesthesia) at a systolic pressure corresponding to 47.85.0% of peak isovolumetric pressure (Supplemental table 2). Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 114 Increasing filling pressures, induced by beat-to-beat interventions, occured without concomitant increases of diastolic volume in the recordings obtained with pressure-volume catheters, representing a true upward shift of the diastolic pressure-volume relation, hence afterload dependent diastolic dysfunction. Representative pressure-volume tracings are presented for a patient with an EF of 0.30-0.49 in supplemental figure 2. The shift in LVEDP induced by the first isovolumetric heartbeat after complete aortic occlusion was then correlated with haemodynamics and with LV function. Significant negative correlations were found with systolic function evaluated by dP/dtmax (r=-0.68) or peak isovolumetric LVP (r=-0.96; Figure 3, left panel). There was no correlation with the baseline value of the time constant  or baseline LVEDP, but a close inverse correlation with the % change in  induced by isovolumetric heartbeats (r=0.95; Figure 3, right panel) was observed. Accordingly, the changes were more prominent in reduced EF categories. For assessing the maximum systolic LVP that the heart could tolerate without slowing of relaxation and elevation of filling pressures, we analyzed multiple graded systolic pressures in each patient. Tolerated systolic LVP ranged from 60 to 100% of peak isovolumetric LVP (Supplement table 3). In 3 patients with normal EF, afterload values of more than 230 mmHg were tolerated. In 3 other patients with EF<0.30, no pressure elevation was tolerated, even when baseline systolic LVP was lower than 90 mmHg. In these patients, the maximum tolerated systolic LVP was derived by caval occlusion (see methods). The remaining 14 patients tolerated intermediate levels of systolic LVP. Similarly to the magnitude of shift in diastolic pressure volume relation induced by isovolumetric heartbeats, tolerated systolic LVP was also strongly correlated with peak isovolumetric LVP (r=0.99, P<0.001; Figure 4) and dP/dtmax (R=0.71, P<0.001, not shown). Of note, the data of the 3 patients, in whom the maximum tolerated pressure was obtained with caval occlusion are well aligned with the other data. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 115 In 7 patients the experimental protocol was repeated after volume loading (Table1). Volume loading increased diastolic and systolic LVP and accelerated myocardial relaxation (shortened time constant  ). Peak isovolumetric LVP was higher after volume loading (FrankStarling). Afterload-induced prolongation of the time constant  was not exacerbated by volume loading, but the shift in LVEDP more than doubled. This is illustrated in Figure 5, which shows in addition that, after volume loading, the onset of pressure fall was delayed (time to dP/dtmin increased, Table 1) and that, at matched HR, the duration of diastole decreased. None of the patients died or suffered from neurological complications in the perioperative or early postoperative period (30 days). One patient was reinterventioned due to immediate post-operative bleeding, one patient needed continuous renal replacement therapy and two patients needed an intra-aortic balloon pump and prolonged cardiovascular support in the intensive care unit (ICU). The lengths of stay were 1.6 ± 1.3 and 8.0 ± 3.9 days in the ICU and in the hospital, respectively. DISCUSSION The present investigation describes how human LV diastole responds to systolic pressure elevation, and defines for the first time how much systolic pressure is tolerated without diastolic dysfunction. The study illustrates a close coupling between the diastolic response and systolic performance, evaluated by peak isovolumetric pressure. In healthy animals, the physiological response of the myocardium to a moderate increase in afterload is a slight acceleration of relaxation15 and no elevation of filling pressures11. This is valid up to a load level that corresponds to a high percentage of peak isovolumetric load15, 16. The analysis of isovolumetric heartbeats allows to refine earlier physiological observations and to apply them to patients with coronary heart disease. There is no precedent of a similar study conducted in humans, except maybe for the analysis of left ventricular systolic Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 116 stiffness in 7 patients by Ritter et al.17 From an ethical point of view it is important to note that we didn’t observe complications, carefully selected patients and performed intra-operative epivascular ultrasonography for excluding atherosclerotic aortic plaques. Given the increasing evidence of cerebrovascular complications with manipulations of the aorta, we however decided not to expand this series of patients. This is a “proof of concept”, translational study, which allows us to draw some important conclusions even with 20 observations. This study describes how the better functioning human LV of CABG patients is able to develop a peak systolic LVP of more than 230 mmHg, with no slowing of relaxation and no increase in LVEDP, hence no diastolic dysfunction. Such a ventricle operates at rest at a systolic LVP that is 40-50% of peak isovolumetric LVP. This baseline load level corresponds to an optimal ventriculo-arterial hydraulic and energetic matching 18, 19. It confers a surprisingly high afterload reserve to the healthy human LV, allowing it to face stress and exercise without compromising filling. This is the case even in the presence of severe coronary heart disease, during anaesthesia and surgery. The remaining patients responded to afterload with variable degrees of slowing of myocardial relaxation and diastolic dysfunction, manifest as an upward shift of the end-diastolic pressurevolume relation. This shift closely and inversely correlated with dP/dtmax and peak isovolumetric LVP: the better the systolic performance, the more limited the shift. In addition, this shift closely correlated with the changes in time constant , suggesting that slowing of relaxation was responsible for the observed shift of the end-diastolic pressure-volume relation. This confirms in cardiac patients a close relation between systolic and diastolic function, previously described in various animal studies11, 16, 20. A limitation of the present study is that we performed volume measurements in only 3 patients. However, the effects of aortic clamping and the relation between delayed relaxation and increased filling pressures were also previously demonstrated in those animal models11, 16, 21. By performing multiple graded aortic constrictions, we determined the maximum level of systolic LVP that the heart could tolerate without elevating its filling pressures and slowing Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 117 relaxation. The maximum tolerated LVP is highly predictive of the peak isovolumetric LVP and ranges from 60 to 100% of the isovolumetric LVP. The tolerated systolic LVP ranged from isovolumetric in some patients to baseline and even less in others. The observations on the maximum tolerated systolic pressures expand the knowledge on the effects of unphysiological isovolumetric pressures and provide a clinically useful translation of the concepts related to load dependence of diastolic function. The findings are consonant with previous studies documenting in failing hearts the reversal of diastolic dysfunction in response to decreasing systolic pressures22, 23. This was observed in heart failure patients with severely depressed systolic function (low EF’s)22, and in dogs with pacing induced cardiomyopathy23. These findings imply that elevated filling pressures in patients with advanced HF with reduced EF include a load dependent and potentially reversible component. A patient with a severely depressed EF and lower blood pressures works at a high percentage of isovolumetric load and mandatorily has load dependent diastolic dysfunction, which can be limited with even small decreases of systolic pressure. This adds an additional pathophysiological mechanism for the beneficial effects of vasodilators and diuretics in this frequently occurring clinical condition. The effects of increased load on diastolic function were previously acknowledged by other groups. Vatner’s group analyzed the effects of increased systolic pressure and showed that in developing hypertensive heart disease in dogs, diastolic dysfunction was present. This dysfunction was not attributable to structural changes and could be mimicked in healthy animals by acutely increasing preload and afterload 24. Similarly, aged dogs with renal hypertension and increased LV systolic and arterial stiffness presented impaired LV relaxation, but no increase in the coefficient of LV diastolic stiffness. Nevertheless, filling pressures increased with hypertensive episodes due to load-dependent impairment of relaxation25. Even if one should be aware of shifts in the end-diastolic pressure-volume relation, related to pericardial constraint and ventricular interdependence26, these mechanisms were most likely not quantitatively important in the present open chest and open pericardium study Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 118 conditions. Although these conditions might be well suited for the study of the pathophysiological effects of acute overload in the myocardium, they preclude extrapolation to long term pressure elevations and to a clinical setting without anaesthesia and surgery. By studying the effects of selective beat-to-beat afterload elevations on both relaxation rate and diastolic function we were able to better control for confounding alterations of global haemodynamics due to decreased stroke volume, acute backward failure, increased LV filling pressures, neurohumoral responses and possibly afterload-induced myocardial ischemia 11. Furthermore, as myocardial hypertrophy reduces tolerance to ischemia and coronary vasodilator reserve leading to diastolic dysfunction 27, we selected patients with a similar degree of stable 3vessel coronary artery disease and excluded those with other than mild LV hypertrophy. Extent of myocardial ischemia and hypertrophy are therefore unlikely to have contributed significantly to diastolic dysfunction during transient aortic clamps with analysis of the first clamped heartbeat. In 7 patients with a normal or moderately depressed EF, afterload elevations were repeated after volume loading. Volume loading itself accelerated myocardial relaxation, which challenges earlier reports of slowed myocardial relaxation in volume loaded anaesthetized openchest dogs28. This observation is nevertheless consonant with what was shown in the better responding subgroup of coronary patients after leg elevation29. These apparently contradictory results might relate to anaesthesia and operative conditions of those earlier canine observations. After volume loading, the upward shift of the end-diastolic pressure-volume relation was aggravated and this was not attributable to slower myocardial relaxation. This corroborates the recent demonstration in healthy dogs that changes in peak early-diastolic mitral annulus velocity (e’) are not dependent on myocardial relaxation, as assessed by time constant  , after acute preload manipulations30. Therefore it must be due (at least in part) to prolongation of systole Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 119 and abbreviation (at comparable HR) of the duration of diastole, as previously demonstrated in animal experiments21. Other potential mechanisms still are largely speculative and require further investigation. The negative inotropic effects of anaesthetics may have influenced the magnitude of effects, thus our results cannot be readily extended to unanaesthetized patients. The present study is applicable to patients with coronary heart disease with various EF’s but not necessarily to other patients groups. The data however could be relevant for patients with HF with preserved EF (HFpEF) in whom increased vascular load and ventricular systolic stiffness were shown to enhance the sensitivity of systolic pressures to volume changes31. Many patients with HFpEF have concomitant systolic dysfunction abnormalities, particularly in the long axis32, 33, which may limit their tolerated systolic pressures. Beyond the profound structural changes underlying diastolic dysfunction and volume loading, limited tolerance to systolic pressures may provide additional mechanistic information on hypertensive pulmonary edema 5, 34. In summary, the present manuscript extends and refines previous experimental work on load and diastolic function. The physiological response of the human heart to increased systolic pressures (and to volume loading) is the preservation of relaxation velocity and normal filling pressures. When cardiac function deteriorates, however, the LV becomes less tolerant to increased systolic pressures and reacts with slowed relaxation and increased filling pressures even at lower pressure levels. Volume loading further exacerbates such intolerance. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 120 FUNDING SOURCES This work was supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (grant number PIC/IC/82943/2007), through the Cardiovascular R&D Unit (nr. 51/94) and by a grant from the European Comission (FP7-Health-2010;MEDIA261409). DISCLOSURES None. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 121 REFERENCES 1. Mann DL, Bristow MR. Mechanisms and models in heart failure: The biomechanical model and beyond. Circulation. 2005;111:2837-2849. 2. Gaasch WH, Delorey DE, Kueffer FJ, Zile MR. 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Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 128 FIGURE 2 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 129 FIGURE 3 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 130 FIGURE 4 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 131 FIGURE 5 Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 132 SUPPLEMENTAL MATERIAL TABLES SUPPLEMENTAL TABLE 1. Summary of baseline cardiovascular function parameters. Patient Ejection Fraction dP/dtmax (mmHg/s) mean BP (mmHg)  (ms) LV EDP (mmHg) 1 Normal 987 100.0 40.1 18.4 2 Normal 1654 91.7 41.7 9.8 3 Normal 1002 86.7 38.5 6.5 4 Normal 948 68.3 29.2 13.2 5 Normal 922 93.2 36.8 7.9 6 Normal 1653 66.6 57.1 9.8 7 Normal 2399 78.4 28.6 10.6 8 Normal 1111 91.5 49.8 10.8 9 Normal 1245 71.8 44.6 11.1 10 Normal 1312 66.7 32.1 10.4 11 Normal 1552 80.1 39.4 12.8 12 Normal 1139 83.3 37.9 6.0 13 30-50% 1037 103.2 40.2 13.8 14 30-50% 1970 83.4 25.6 9.9 15 30-50% 1265 93.1 25.5 14.3 16 30-50% 1062 78.5 34.0 14.1 17 30-50% 972 76.7 34.8 5.3 18 <30% 645 61.8 23.4 19.4 19 <30% 522 96.5 26.9 20.7 20 <30% 764 98.4 11.0 14.5 dP/dtmax, peak rate of left ventricular pressure rise ; BP, blood pressure;  , time constant of isovolumetric relaxation; LV EDP, left ventricular end-diastolic pressure. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 133 SUPPLEMENTAL TABLE 2. Systolic pressures at baseline and after graded aortic clamping. Patient Baseline Systolic LVP mmHg Tolerated Systolic LVP mmHg Isovolumetric LVP mmHg 1 93.1 (48%) 174.1 (90%) 193.4 2 122.7 (52%) 235.0 (100%) 235.0 3 100.1 (57%) 144.3 (82%) 176.0 4 94.0 (53%) 141.4 (80%) 176.7 5 77.1 (43%) 140.2 (78%) 179.7 6 103.2 (40%) 261.0 (100%) 261.0 7 121.0 (50%) 229.0 (95%) 241.0 8 93.1 (43%) 207.6 (95%) 218.5 9 99.2 (49%) 192.9 (95%) 203.1 10 104.3 (49%) 203.3 (95%) 214.0 11 99.9 (43%) 233.1 (100%) 233.1 12 98.6 (46%) 183.7 (86%) 213.6 13 102.1 (53%) 171.6 (89%) 192.8 14 91.5 (50%) 146.7 (80%) 183.4 15 90.4 (58%) 118.9 (76%) 156.5 16 86.7 (45%) 166.9 (86%) 194.1 17 117.6 (67%) 133.0 (76%) 175.0 18 82.3 (73%) 76.8 (68%) 113.0 19 73.6 (64%) 69.5 (60%) 115.9 20 116.9 (80%) 110.5 (76%) 145.4 LVP, left ventricular pressure. Baseline and tolerated systolic LVP are presented both in absolute values and as a percentage of the peak isovolumetric LVP. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 134 SUPPLEMENTAL FIGURE LEGENDS Supplemental figure 1. Left ventricular pressure (LVP) tracings illustrating the increase in left ventricular end-diastolic pressure (LV EDP) after complete aortic occlusion. Control and isovolumetric cycles obtained after complete aortic occlusion are presented. Diastolic dysfunction, the shift in LV EDP from control to isovolumetric cycle, is indicated for every patient. Supplemental figure 2. The elevation of diastolic pressures induced by systolic left ventricular pressure (LVP) elevations represents true diastolic dysfunction. LVP (upper left), LV volume (lower left) and LV pressure-volume loops (right) in a representative patient with moderate LV systolic dysfunction. Tracings in baseline conditions (black line), during a moderate LVP elevation (blue line) and during an isovolumetric heartbeat (red line) are displayed. The isovolumetric beat elevates filling pressures (upper left) without increasing diastolic volume (lower left). Accordingly, the diastolic segment of the pressure-volume loop is shifted upwards. This corresponds to afterload induced diastolic dysfunction. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 135 SUPPLEMENTAL FIGURE 1. Representative LVP tracing of aortic occlusions in every patient. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 136 SUPPLEMENTAL FIGURE 2. The elevation of diastolic pressures induced by systolic left ventricular pressure (LVP) elevations represents true diastolic dysfunction. Fisiopatologia e tratamento da hipertensão pulmonar: desenvolvimento de modelos experimentais, modulação farmacológica e nutricional 137 Discussão Miocárdio ventricular esquerdo na hipertensão pulmonar Com os trabalhos incluídos nesta dissertação demonstrámos que, num modelo experimental de hipertensão pulmonar severa e insuficiência cardíaca, o miocárdio ventricular esquerdo desenvolve disfunção intrínseca. Apesar dos índices hemodinâmicos independentes da carga obtidos com cateteres de pressãovolume sugerirem isto mesmo, tanto mais que as intervenções foram conduzidas em animais com tórax aberto e pericardiectomizados, por forma a minimizar os fenómenos de interacção ventricular (Slinker e Glantz 1986), a observação experimental que nos permite retirar conclusões sólidas advém das relações força-frequência negativas, próprias do miocárdio insuficiente, verificadas nos feixes musculares ventriculares esquerdos. Este achado original contraria experiências anteriores levadas a cabo, no mesmo modelo, numa fase de hipertrofia ventricular direita compensatória (Kogler et al. 2003). Kögler et al. avaliaram a relação forçafrequência no miocárdio ventricular esquerdo e direito do modelo de hipertensão pulmonar induzida pela monocrotalina, observando relações negativas apenas no ventrículo direito concluíram que a sobrecarga de pressão seria o principal determinante de disfunção ventricular, uma vez que ambos os ventrículos se encontrariam sob uma influência neuroendócrina comum (Kogler et al. 2003). Esta conclusão contraria, no entanto, um paradigma clínico. Foi o antagonismo de sistemas neuroendócrinos que se revelou mais eficaz no tratamento da falência miocárdica (Remme 1994). De facto, na terapêutica crónica com o antagonista não selectivo da endotelina-1, Bosentan, observámos uma reversão da disfunção miocárdica esquerda. Curiosamente, um relato do caso clínico de um paciente com hipertensão pulmonar severa e disfunção ventricular esquerda sugere que o Bosentan possa de facto ter benefícios clínicos, uma vez que após terapêutica prolongada com Bosentan este paciente apresentou melhoria funcional a nível miocárdico e tolerou transplante pulmonar sem complicações cardíacas subsequentes (Brauchlin et al. 2005). No miocárdio ventricular esquerdo documentámos, igualmente, aumento da apoptose cardiomiocitária, comutação para as isoformas- das cadeias pesadas de miosina, algum grau de fibrose e activação neuroendócrina e inflamatória local. Todos os referidos são marcos de remodelagem e regressão para o fenótipo fetal que constituem marcadores de, e contribuem para a, disfunção miocárdica (Bernardo et al. 2010; Borbely et al. 2009; Dhalla et al. 2009; Diwan e Dorn 2007). Adicionalmente, a inclusão de dois pontos temporais de avaliação permitiu-nos esclarecer que algumas destas alterações são mais precoces, acompanhando mesmo estádios de hipertrofia compensatória, enquanto outras,