Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência

Departamento de Química e Bioquímica Rui César Gonçalves Ferreira Mestrado em Ciências e Tecnologia do Ambiente Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência II Resumo Neste trabalho recorreu-se a um processo de extração desenvolvido recentemente, a Microextração por Difusão Gasosa (GDME), para a extração de compostos voláteis e semi-voláteis diretamente em amostras sólidas. Nesta técnica a extração dos analitos é realizada utilizando um módulo em Teflon de dimensão reduzida com uma membrana microporosa hidrofóbica no seu fundo. A membrana impede a passagem de líquido hidrofílico solvente mas permite a difusão dos compostos voláteis. Este processo é bastante simples, visto que apenas num passo se consegue realizar a extração, concentrar o analito e realizar uma reação de derivatização dos compostos recolhidos. A deteção e separação dos compostos foi efetuada com recurso à cromatografia líquida de alta eficiência e à radiação UV. A Microextração por Difusão Gasosa foi recentemente patenteada e o seu uso até agora focava-se em extrações in situ de amostras líquidas, especialmente bebidas alcoólicas. Ao longo deste trabalho estudaram-se duas amostras sólidas: o pão e a cortiça. No primeiro caso o objetivo foi quantificar diferentes compostos voláteis existentes no pão, caso do diacetilo, 2,3-pentanodiona e 2,3-hexanodiona. Inicialmente realizaram-se vários testes de otimização do processo de extração abrangendo parâmetros experimentais como a temperatura, o tempo de extração, o volume e a concentração da solução aceitadora, entre outros. No final, concluiu-se que era possível quantificar os compostos α-dicarbonílicos em diferentes tipos de pão, havendo variação na presença desses compostos de amostra para amostra. No caso da cortiça, o objetivo foi acompanhar a variação de aldeídos simples ao longo do processo de produção de uma rolha. Foram estudados todos os passos, desde a chegada de uma placa de cortiça à fábrica até ao produto final. Foram encontrados vários aldeídos simples em diferentes quantidades nos vários passos de fabrico de uma rolha de cortiça. O furfural apresentou as variações mais significativas ao longo do processo, surgindo apenas a partir da cozedura, presumivelmente devido aos efeitos de degradação térmica que ocorrem no passo referido. Palavras-chave: microextração por difusão gasosa, diacetilo, α-dicarbonílicos, aldeídos, cortiça, pão III Abstract In this work a recently developed process of extraction was used, Gas-Diffusion Microextraction (GDME), for the determination of volatile and semi-volatile compounds in solid sample. In this technique a module of reduced size made of Teflon with a hydrophobic microporous membrane at its bottom is used. The membrane prevents the passage of solvent but allows diffusion of volatile compounds. This process is very simple since in only one step is accomplished the extraction, the concentration of the analyte and a derivatization reaction of the compounds extracted. Detection and separation of compounds were made using high performance liquid chromatography and UV light. GDME was recently patented and so far it was focused on in situ extraction of liquid samples, especially alcoholic beverages. Throughout this work two solid samples were studied, bread and cork. In the first case, our aim was to quantify the amounts of diacetyl, 2,3-pentanedione and 2,3-hexanedione in different types of bread. Initially several optimization tests of the extraction process were made including experimental parameters such as temperature, extraction time, volume and concentration of the acceptor solution, among others. In the end, it was concluded that it was possible to quantify the amount of α-dicarbonyl compounds in different types of bread, being detected a variation in the presence of such compounds from sample to sample. As for cork, the objective was to monitor the variation of simple aldehydes during the process of industrial a cork stopper production. All main production steps have been performed, beginning at the arrival of cork in its original state until the corks leave the factory as a final product. Aldehydes were found in varying amounts in different manufacturing steps of a cork. Furfural had the main significant change in the process. It appears only during the cooking step probably due to thermal degradation effects that occur in such procedure. Key words: gas-diffusion microextraction, diacetyl, α-dicarbonyl compounds, aldehydes, bread, cork IV Índice geral Resumo……………………………………………………………………….………….……..II Abstract…………………………………………………………………….………….……….III Índice geral..……………………………………………………………….………….…….IV-V Índice de figuras….………………………………………………………………….……VI-VII Índice de tabelas,.……………………………………………………………………..…….VIII Índice de abreviaturas…………………………………………………………………..........IX I – INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1 1 – O Pão ................................................................................................................................. 1 2 – A Cortiça ............................................................................................................................ 2 3 - Compostos orgânicos voláteis e semi-voláteis ............................................................ 4 3.1 – Compostos α-dicarbonílicos ................................................................................... 5 3.2 – Aldeídos ..................................................................................................................... 2 4 – Microextração por difusão gasosa (GDME)................................................................. 8 4.1 – Funcionamento e princípios do processo de extração ....................................... 9 4.2 – Reação de derivatização ....................................................................................... 10 4.2.1 – Reação de derivatização de compostos α-dicarbonílicos com ofenilenodiamina (OFDA) .............................................................................................. 11 4.2.2 – Reação de derivatização dos aldeídos com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) ........................................................................................................................... 11 5 – Amostras líquidas estudadas recentemente com recurso à GDME e técnicas utilizadas em amostras sólidas .......................................................................................... 12 5.1 - Amostras líquidas .................................................................................................... 12 5.2 – Amostras sólidas .................................................................................................... 12 II - MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 14 6 – Equipamentos e material utilizado .............................................................................. 14 7 – Reagentes utilizados e preparação de soluções ...................................................... 16 7.1 – Preparação de soluções para o trabalho da quantificação de compostos αdicarbonílicos no pão ....................................................................................................... 17 7.2 – Condições cromatográficas utilizadas para o trabalho da quantificação de compostos α-dicarbonílicos no pão ............................................................................... 17 7.3 – Preparação de soluções para o trabalho das rolhas de cortiça ...................... 18 7.4 – Condições cromatográficas utilizadas para o trabalho da evolução dos aldeídos em rolhas de cortiça ......................................................................................... 18 V 8 – Procedimentos de extração.......................................................................................... 19 8.1 – Procedimento geral de extração para o pão ...................................................... 19 8.2 - Procedimento geral de extração dos vários aldeídos da cortiça ..................... 19 III – Resultados ......................................................................................................................... 19 A – Estudo dos compostos α-dicarbonílicos no pão ........................................................... 19 9 – Estudo e otimização dos parâmetros que influenciam o processo de extração do pão .......................................................................................................................................... 19 9.1 – Estudo da temperatura de extração .................................................................... 20 9.2 – Efeito da variação de volume da solução aceitadora ....................................... 21 9.3 – Efeito do tempo de extração ................................................................................. 22 9.4 – Diferença entre o módulo mergulhado e o módulo em headspace ................ 23 9.5 – Influência do efeito da agitação ............................................................................ 24 9.6 - Validação da metodologia ...................................................................................... 24 9.7 - Aplicabilidade em amostras reais ......................................................................... 25 9.8 - Efeito da variação do teor dos compostos α-dicarbonílicos no pão ao longo de quatro dias ................................................................................................................... 27 B – Determinação de aldeídos em cortiça ............................................................................ 28 10 – Estudo e otimização dos parâmetros que influenciam o processo de extração na cortiça ............................................................................................................................... 28 10.1 – Influência do tempo de extração ........................................................................ 28 10.2 – Influência da temperatura de extração ............................................................. 29 10.3 – Influência da variação de volume da solução aceitadora, DNPH ................. 30 10.4 – Variação da concentração de aldeídos nos diferentes passos da formação de uma rolha de cortiça ................................................................................................... 30 10.5 – Composição de 3 tipos de aglomerados diferentes ...................................... 356 IV – CONCLUSÕES ............................................................................................................... 367 V – TRABALHO FUTURO .................................................................................................... 378 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 389 VI Índice de Figuras Figura 2.1 - Representação esquemática do processo de fabrico de rolhas de cortiça…………………………………………………………………………………………....3 Figura 3.1 - Representação esquemática do processo de formação do diacetilo……………………………………………………………………………………..…...5 Figura 4.1 - Representação esquemática do processo de extração para amostras sólidas usado no GDME................................................................................................10 Figura 4.2 – Esquema que representa a reação de derivatização entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos dando origem a quinoxalinas............................................11 Figura 4.3 – Equação que representa a reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos……………………………………………………………………...12 Figura 9.1 - Gráfico representativo da variação das áreas dos picos dos compostos αdicarbonílicos em função da temperatura de extração. O tempo utilizado foi 15 min. O volume da solução aceitadora 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, foi 0,5 mL...20 Figura 9.2 - Gráfico representativo da variação das áreas dos picos dos compostos αdicarbonílicos em função do volume da solução aceitadora. Os volumes testados foram 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 e 0,7 mL. O tempo utilizado foi 15 min. O volume da solução aceitadora 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, foi 0,5 mL ………………....……21 Figura 9.3 - Gráfico representativo da variação das áreas dos picos dos compostos αdicarbonílicos em função do tempo de extração. O volume da solução aceitadora 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, foi 0,5 mL...................................................22 Figura 9.4 - Cromatogramas sobrepostos obtidos para os ensaios de um dos tipos de pão................................................................................................................................26 Figura 9.5 - Gráfico representativo da variação ao longo de quatro dias dos compostos α-dicarbonílicos no pão. Os ensaios foram realizados em triplicado e a moagem da amostra era feita antes de cada extração. As extrações foram efetuadas durante 15 min, a 65 ᵒC e o volume da solução aceitadora 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, foi 0,5 mL.................................................................................................................27 Figura 10.1 - Gráfico representativo da variação das áreas dos picos dos aldeídos em função do tempo de extração. A solução aceitadora escolhida foi DNPH 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, e o seu volume 1,0 mL ……..……………….……….28 Figura 10.2 - Gráfico representativo da variação das áreas dos picos dos aldeídos em função da temperatura de extração. O tempo utilizado foi 15 min. A solução aceitadora escolhida foi DNPH 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, e o seu volume 1,0 mL…………………………………………………………………………………………….29 Figura 10.3 - Gráfico representativo da variação das áreas dos picos dos aldeídos em função do volume da solução aceitadora. O tempo utilizado foi 15 min. A solução aceitadora escolhida foi DNPH 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, e o seu volume 1,0 mL............................................................................................................31 VII Figura 10.4 - Área do pico do acetaldeído em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça.........................................................................................32 Figura 10.5 - Área do pico do benzaldeído em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça………………….……………………………………………..32 Figura 10.6 - Área do pico do decanal em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça.........................................................................................................32 Figura 10.7 - Área do pico do formaldeído em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça.........................................................................................32 Figura 10.8 - Área do pico do furfural em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça……………………………………..………………………………………...32 Figura 10.9 - Área do pico do hexanal em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça……………………………….…………………………………………...32 Figura 10.10 - Área do pico do nonanal em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça.........................................................................................................33 Figura 10.11 - Área do pico do octanal em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça.........................................................................................................33 Figura 10.12 - Área do pico do pentanal em função do passo do processo de formação da rolha de cortiça.........................................................................................................33 Figura 10.13 – Cromatogramas sobrepostos obtidos para a quantificação das rolhas com lavagem Alfa com diferentes concentrações de aldeídos. O inlet foca o pico do formaldeído……………………………………………………………………………………34 Figura 10.13 - Gráfico representativo da composição de 3 tipos de rolha de aglomerado diferentes..................................................................................................35 VIII Índice de tabelas Tabela 3.1 – Algumas propriedades químicas e físicas dos compostos α-dicarbonílicos. ....................................................................................................................................................... 6 Tabela 3.2 – Algumas propriedades químicas e físicas dos aldeídos utilizados neste trabalho. ....................................................................................................................................... 8 Tabela 6.1 - Instrumentação utilizada para a medição de volumes e de massas. ........ 14 Tabela 6.2 – Material utilizado para o processo de extração. ........................................... 14 Tabela 6.3 - Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência utilizado. .................... 15 Tabela 6.4 - Outro tipo de material utilizado. ....................................................................... 15 Tabela 7.1 - Tabela com os reagentes e solventes utilizados ao longo deste trabalho com as respetivas fórmulas moleculares e marca. ............................................................. 16 Tabela 9.1 - Valores obtidos para os ensaios em headspace e mergulhados. ............ 23 Tabela 9.2 - Valores calculados de r2, LOD, LOQ e CV. ................................................... 24 Tabela 9.3 - Concentrações de DC, PN e HX para cinco tipos diferentes de pão. ....... 25 Tabela 10.1 - Concentrações obtidas para cada aldeído numa rolha com tratamento Alfa. ........................................................................................................................................... 332 IX Índice de abreviaturas DC - Diacetilo PN - 2,3-pentanodiona HX – 2,3-hexanodiona GDME – Gas-diffusion Microextraction (Microextração por Difusão Gasosa) HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) OFDA - o-fenilenodiamina DNPH - 2,4-dinitrofenilhidrazina COV – Compostos orgânicos voláteis COSV – Compostos orgânicos semi-voláteis SPME - Solid Phase Microextration (Microextração em fase sólida) QuEChERS - Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 7 3.2 – Aldeídos Os aldeídos são um grupo de compostos orgânicos representado pela fórmula molecular geral RCHO, onde R pode ser um hidrogénio ou um grupo alifático, aromático ou heterocíclico. Devido à sua elevada reatividade, os aldeídos alifáticos são muitas vezes utilizados em sínteses orgânicas. [15] O odor dos aldeídos que têm baixo peso molecular é incomodativo, porém, à medida que o número de carbonos aumenta, tornase mais agradável. Os aldeídos de maior peso molecular, que possuem de 8 a 12 átomos de carbono, são muito utilizados na indústria cosmética na produção de perfumes sintéticos. Os aldeídos têm sido bastante estudados visto que podem provocar danos na saúde dos seres vivos. Por exemplo, o formaldeído e a acroleína são conhecidos por causarem irritações nos animais e no ser humano, e o formaldeído é um agente carcinogénico. Estes compostos quando reagem com o ozono formam compostos orgânicos poluentes presentes no smog fotoquímico. A maioria destes compostos presentes na poluição atmosférica provém diretamente da combustão de combustíveis fósseis. [16] O furfural, um dos compostos estudados neste trabalho, é um aldeído heterocíclico com a fórmula química C5H4O2. É um líquido oleoso sem cor e com aroma a amêndoa, mas quando exposto ao ar torna-se amarelo. É um dos compostos encontrados na baunilha. [17] Na Tabela 3.2 são representadas algumas propriedades químicas e físicas de alguns aldeídos utilizados neste trabalho. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 8 Tabela 3.2 – Algumas propriedades químicas e físicas dos aldeídos utilizados neste trabalho. 4 – Microextração por difusão gasosa (GDME) Nas últimas décadas, as técnicas de extração sofreram um desenvolvimento considerável e os instrumentos analíticos são agora muito mais sofisticados, automatizados e multifuncionais. Apesar de todos estes progressos, as amostras são muitas vezes demasiado complexas para determinações diretas. Existe assim a necessidade de se desenvolverem novos métodos de preparação de amostra que sejam simultaneamente simples, rápidos, baratos e que provoquem a mínima alteração na amostra. O processo de preparação da amostra é frequentemente visto como o passo limitante em muitos procedimentos analíticos, visto que pode envolver um consumo elevado tanto de reagentes como de tempo. Também tem um papel importante na precisão e na exatidão global das metodologias. A preparação de amostras inclui muitas vezes uma extração que resulta no isolamento dos analitos desejados da matriz. Se for conveniente, a derivatização pode ser usada de forma a facilitar a separação e/ou deteção dos diferentes compostos. Apesar das técnicas clássicas de preparação, como a extração por Soxhlet, a extração líquido-líquido ou a extração em fase sólida, serem Composto estudado Temperatura de fusão (K) Temperatura de ebulição (K) Massa molar (g/mol) Fórmula molecular Fórmula estrutural Furfural 236,15 435,15 96,08 C5H4O2 Benzaldeído 247,15 451,25 106,13 C7H6O Hexanal <253,15 392,15-397,15 100,16 C6H12O Octanal 285-288 444,00 128,21 C8H16O Nonanal 255,15 464,15 142,24 C9H18O Decenal 369,26 352,15 154,25 C10H18O Decanal 280,15 493,15 156,20 C10H20O FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 9 ainda as mais usadas na prática, têm havido desenvolvimentos notáveis neste campo. Uma inovação interessante no campo das extrações para fins analíticos é a das técnicas baseadas em membranas. Na indústria, o uso de membranas já é antigo e são usadas em bastantes processos industriais. Apesar disto, a utilização de membranas em aplicações analíticas é mais recente e é normalmente associado a sistemas de análises em fluxo. [18] 4.1 – Funcionamento e princípios do processo de extração A microextração por difusão gasosa (Gas-diffusion microextraction, GDME) é uma técnica que foi desenvolvida recentemente e que combina as vantagens da difusão gasosa e da microextração. Difusão gasosa é o nome dado a um sistema no qual a separação dos analitos é baseado na transferência de massa por difusão do analito, sob a forma de vapor, através da camada gasosa que separa as duas fases. Por definição, microextração é uma técnica de extração em que o volume da fase que se extraiu é bastante menor comparativamente com o volume da amostra; normalmente a extração não é exaustiva. Este aspeto é bastante útil para, por exemplo, acompanhar a variação da concentração de um certo composto ao longo do tempo sem se alterar de forma considerável a matriz em estudo. [18] Os componentes principais do sistema de extração utilizado (GMDE) são: um gobelé de paredes duplas, um banho termostatizado e um módulo extrator. O módulo extrator é em Teflon, de dimensão reduzida e tem no seu interior uma pequena membrana microporosa hidrofóbica. A membrana impede a difusão do solvente mas permite a transferência de massa de analitos voláteis e semi-voláteis. A membrana de 10 mm de diâmetro usada no módulo foi obtida a partir de um instrumento de corte artesanal. Na Figura 4.1 encontra-se representado um esquema da extração recorrendo à GDME. [18] FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 10 O módulo é colocado num gobelé que, por sua vez, está ligado a um banho com controlo de temperatura. Uma determinada quantidade de amostra é colocada dentro do gobelé seguindo-se a introdução do reagente derivatizante no interior do módulo. Após a extração ter decorrido durante um período de tempo, recolhe-se a solução obtida. Na maioria das vezes esta solução está pronta para ser diretamente injetada num aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC/UV). [18] Uma das principais alterações do método de extração entre amostras líquidas e sólidas prende-se com a colocação do módulo que no caso das amostras líquidas pode ser mergulhado ou em headspace mas nas amostras sólidas só pode ser em headspace. 4.2 – Reação de derivatização A derivatização envolve uma reação química que altera o analito de modo a promover ou melhorar a sua separação e deteção. [2] A GDME torna-se mais útil se utilizado simultaneamente com uma reação de derivatização visto que aumenta a possibilidade de recolha do analito, facilita a separação, a deteção e a identificação do composto. Para além disso aumenta a eficiência do processo de extração uma vez que promove um efeito de deslocamento do equilíbrio de partição dos compostos entre as fases. Neste trabalho utilizaram-se a o-fenilenodiamina e a 2,4-dinitrofenilhidrazina como reagentes derivatizantes. [19, 20] Figura 4.1 - Representação esquemática do processo de extração para amostras sólidas usado na GDME. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 11 4.2.1 – Reação de derivatização de compostos α-dicarbonílicos com ofenilenodiamina (OFDA) Para se detetar os compostos α-dicarbonílicos com recurso ao HPLC/UV é necessário primeiro fazê-los reagir com a OFDA. Quando este passo acontece, os compostos, neste caso, o DC, a PN e a HX, convertem-se em quinoxalinas e deste modo são detetados por espectrofotometria de UV. Na Figura 4.2 encontra-se a equação que representa reação de derivatização entre os compostos α-dicarbonílicos e a OFDA. [18, 21, 22] 4.2.2 – Reação de derivatização dos aldeídos com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) A determinação de aldeídos é importante visto que estes estão presentes em muitos alimentos e materiais com os quais temos contato diariamente. A sua análise usando o HPLC/UV é difícil devido, muitas vezes, à falta de cromóforos. Com recurso à derivatização consegue-se ultrapassar estes problemas. [23] O DNPH é um dos reagentes de derivatização mais comuns. É usado em estudos que envolvem aldeídos e cetonas visto que reage com o grupo carbonilo destes devido à presença do grupo amino no reagente. Em condições ácidas formam 2,4-dinitrofenilhidrazonas. As derivações resultantes aumentam consideravelmente a absorção por UV e a retenção hidrofóbica facilitando a deteção e separação no HPLC. É, portanto, aconselhado o uso deste derivatizante visto simultaneamente consegue-se analisar diferentes aldeídos. Na Figura 4.3 encontra-se representada a equação da reação de derivatização entre o DNPH e os compostos dicarbonílicos. [19, 27, 28] Figura 4.2 – Equação que representa a reação de derivatização entre a OFDA e os compostos αdicarbonílicos dando origem a quinoxalinas. Figura 1 - Reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos.Figura 2 - Reação de derivatização entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos resultando quinoxalinas. Figura 5 - Reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos.Figura 3 - Reação de derivatização entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos resultando quinoxalinas. Figura 4 - Reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos.Figura 5 - Reação de derivatização entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos resultando quinoxalinas. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 12 5 – Amostras líquidas estudadas recentemente com recurso à GDME e técnicas utilizadas em amostras sólidas 5.1 - Amostras líquidas As primeiras amostras que foram estudadas pela GDME foram amostras líquidas, mais precisamente bebidas alcoólicas como vinhos e cervejas. Esta técnica inovadora surgiu em Outubro de 2010. Nesse trabalho apresentavam-se os fundamentos da microextração por difusão gasosa e faziam a sua aplicação amostras alcoólicas, sendo o objetivo detetar α-dicetonas vicinais. [18] Nos anos seguintes foram publicados outros trabalhos com diferentes amostras e compostos. Os compostos em foco foram aldeídos como o acetaldeído, o metilpropanal e o furfural que foram extraídos da cerveja com recurso ao derivatizante 2,4dinitrofenilhidrazina (DNPH). Mostrou-se que a metodologia proporcionava boa repetibilidade e linearidade assim como bons limites de dete ção e quantificação. A extração foi realizada em poucos minutos e a baixo custo. [24] Outro dos trabalhos realizados prendeu-se com a determinação do diacetilo e da 2,3pentanodiona em cervejas, utilizando como derivatizante o-fenilenodiamina (OFDA). [11] 5.2 – Amostras sólidas Um dos passos mais importantes em qualquer área da química e um dos mais limitantes é a preparação de amostras. Os químicos analíticos procuram encontrar estratégias que lhes permita obter resultados mais rapidamente, mais eficientes e mais simples. Existem diferentes técnicas de preparação de amostras clássicas e modernas. Nas clássicas Figura 4.3 – Equação que representa a reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos. Figura 6 - Reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos.Figura 7 - Reação de derivatização entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos resultando quinoxalinas. Figura 5 - Reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos.Figura 8 - Reação de derivatização entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos resultando quinoxalinas. Figura 9 - Reação de derivatização entre DNPH e compostos dicarbonilos.Figura 10 - Reação de derivatização entre a OFDA e os compostos α-dicarbonílicos resultando quinoxalinas. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 13 temos a extração por Soxhlet e a extração líquido-líquido por exemplo, enquanto que nas modernas a microextração em fase sólida (SPME) e o QuEChERS (Quick Easy Cheap Rugged Effective and Safe) O extrator por Soxhlet é um aparelho de laboratório feito de vidro, inventado em 1879 por Franz von Soxhlet. Este equipamento utiliza refluxo de solvente de modo intermitente. A amostra apesar de não ficar em contato com o solvente que se encontra a uma temperatura elevada, consome muito solvente, pois o volume total deve ser suficiente para atingir o sifão (dispositivo utilizado para transportar um líquido de uma altura para outra mais baixa, passando por um ponto mais alto). O método por Soxhlet é um processo de extração que funciona de forma contínua, e é bastante útil nos casos em que o composto puro é parcialmente solúvel num solvente e as impurezas não. [25] A eficiência deste método depende da natureza do material a ser extraído: polaridade do solvente, ligação dos lípidos com outros componentes, circulação do solvente através da amostra, tamanho das partículas, humidade da amostra, velocidade de refluxo e quantidade relativa de solvente, entre outros. [25] A SPME é um procedimento que é usado associado à cromatografia gasosa, porque não utiliza solvente. Tem alto poder de concentração; é aplicável a muitos tipos de analitos e é fácil o transporte do material extraído para o cromatógrafo gasoso. A teoria da SPME baseia-se na cinética de transferência de massa entre fases e na termodinâmica que descreve o equilíbrio de partição do analito entre elas. Consiste numa fibra ótica de sílica fundida, coberta com um filme fino de um polímero sorvente, fixado num tubo. O procedimento do SPME divide-se em duas etapas: estabelecer os perfis de extração dos analitos e otimizar a transferência do material extraído para a coluna cromatográfica. A SPME tem aplicações em áreas como análise ambiental e de solos, água, alimentos, produtos naturais e farmacêuticos, análise clínica e forense. [26] A GDME combina as características da difusão gasosa com as vantagens da microextração apresentando resultados eficientes num curto período de espera. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 14 II - MATERIAL E MÉTODOS 6 – Equipamentos e material utilizado Foram utilizados diferentes tipos de instrumentação consoante a tarefa que se pretendia realizar. O material utilizado foi dividido por tarefas para facilitar a consulta e compreensão em cada parte do trabalho. Nas Tabelas 6.1, 6.2, 6.3, 6.4 estão elencados os materiais e respetiva marca utilizados ao longo deste estudo. Tabela 6.1 - Instrumentação utilizada para a medição de volumes e de massas. Instrumentação Marca Balança de precisão Mettler, modelo AE50 Balança analítica Mettler, modelo PE200 Micropipetas Gilson Pipetman Tabela 6.2 – Material utilizado para o processo de extração. Instrumentação Marca Módulo extrator de Teflon --- Membranas microporosas Millipore MitexTM 5.0µm LS Banho termostatizado Medingen E5 Placa de agitação Metrohm, modelo 649 Gobelé termostatizado com paredes duplas FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 15 Tabela 6.3 - Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência utilizado. Sistema de cromatografia Marca Detetor UV/Vis Jasco UV/Vis-2070 Plus Bomba Jasco PU-2089 Plus Quaternary Gradient Pump Injetor AS-2055 Plus Intelligent Sampler Coluna Phenomenex Gemini C18 (250x4.60mm) 5µm Tabela 6.4 - Outro tipo de material utilizado. Instrumentação Marca Sistema de purificação da água Milipore Simplicity Medidor de pH com elétrodo de vidro combinado Metrohm 605 pH-meter Membranas microporosas Supelco 0.45 um x 47 nm FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 16 7 – Reagentes utilizados e preparação de soluções Ao longo deste trabalho foram utilizadas várias soluções. Os reagentes e solventes usados encontram-se na Tabela 7.1. Tabela 7.1 - Reagentes e solventes utilizados ao longo deste trabalho com as respetivas fórmulas moleculares e marca. Reagente Fórmula molecular Marca Acetato de sódio CH3COONa Merck Ácido acético CH3COOH PROLABO Diacetilo C4H6O2 Sigma-Aldrich Pentanodiona C5H8O2 Sigma-Aldrich Hexanodiona C6H10O2 Sigma-Aldrich Ácido clorídrico HCl Panreac Acetonitrilo CH3CN Fisher Chemical OFDA C6H8N2 Sigma-Aldrich Hidrogenofosfato de Sódio Na2HPO4 Sigma-Aldrich Furfural C5H4O2 Sigma-Aldrich Benzaldeído C7H6O Sigma-Aldrich Hexanal C6H12O Sigma-Aldrich Octanal C8H16O Sigma-Aldrich Nonanal C9H18O Sigma-Aldrich Decenal C10H18O Sigma-Aldrich Decanal C10H20O Sigma-Aldrich FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 23 9.4 – Diferença entre o módulo mergulhado e o módulo em headspace A diferença entre colocar o módulo mergulhado e em headspace era um aspeto a estudar visto que até ao início deste trabalho os únicos ensaios realizados tinham sido com o módulo mergulhado. Utilizaram-se 2,0 g de pão triturado em 20,0 mL de água para o ensaio com o módulo mergulhado e 5,0 g para o ensaio em headspace. As concentrações das soluções padrão dos compostos α-dicarbonílicos adicionados para o método de adição padrão foram 15 ppm para o DC e 25 ppm para a PN e a HX. Os melhores sinais foram obtidos com o módulo em headspace para qualquer um dos compostos. No caso do módulo mergulhado, foi quantificado o DC que passou para a água e a partir daí determinou-se a quantidade que existia na amostra; em headspace determinou-se diretamente a concentração na amostra. Existe maior incerteza no caso das PN e da HX. Na Tabela 9.1 podem ser encontrados os sinais relativos a este parâmetro. Os valores de concentração calculados para os dois casos foram os seguintes: 114 µg/kg e 109 µg/kg. Tabela 9.1 - Valores obtidos para os ensaios em headspace e mergulhados. MÓDULO MERGULHADO DC PN HX Volume/ mL m / g Área do pico m / g Área do pico m / g Área do pico 0 0 0,004 0 0,001 0 0,004 0,05 0,00075 0,022 0,00125 0,011 0,00125 0,032 0,1 0,00150 0,032 0,00250 0,025 0,00250 0,045 0,15 0,00225 0,051 0,00375 0,038 0,00375 0,076 MÓDULO HEADSPACE DC PN HX Volume/ mL m / g Área do pico m / g Área do pico m / g Área do pico 0 0 0,025 0 0,022 0 0,008 0,05 0,00075 0,476 0,00125 0,234 0,00125 0,444 0,1 0,00150 0,866 0,00250 0,481 0,00250 1,037 0,15 0,00225 0,995 0,00375 0,545 0,00375 1,191 FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 24 9.5 – Influência do efeito da agitação Foi estudado o efeito da agitação durante o processo de extração. Estes testes foram feitos com 3 quantidades diferentes de volume de solução aceitadora e com ou sem agitação. Em qualquer uma das situações a agitação não influenciou consideravelmente o resultado final devido ao facto de a amostra estar no estado sólido. O objetivo da agitação era facilitar a volatilização dos compostos acelerando a reação com a solução aceitadora. Se estivesse no estado líquido este parâmetro seria mais relevante visto que a agitação seria mais uniforme e acelerava a volatilização dos compostos. Optou-se por não se utilizar a agitação nos ensaios futuros. 9.6 - Validação da metodologia A validação da metodologia proposta foi confirmada por meio de curvas de calibração ajustadas em função da matriz: as extrações foram realizadas em pequenas quantidades de pão “velho”, colocados dentro do módulo de extração, com 40 µL da solução adequada de DC, PN e HX. Os resultados em termos de linearidade (n ≥ 5), limite de deteção (LOD) e limite de quantificação (LOQ), e coeficiente de variação (CV) estão resumidos na Tabela 9.2. O LOD e o LOQ foram calculados multiplicando por 3 e 10, respetivamente, o desvio padrão da interceção/inclinação, para uma massa padrão de 5 g. O CV da metodologia foi avaliado através da análise de cinco ensaios de uma amostra (n = 5) realizados no mesmo dia. Tabela 9.2 - Valores calculados de r2, LOD, LOQ e CV. Composto αdicarbonílico r2 LOD / µg kg-1 LOQ / µg kg-1 CV / % 1 DC 0.996 6.0 20 4.6 PN 0.991 8.6 29 6.4 HX 0.992 12 38 4.9 1 Desvio-padrão expresso em % valor médio (n=5) De modo a se ter confiança nos resultados experimentais foi necessário repetir os ensaios para confirmar a sua repetibilidade. Neste caso, executaram-se 4 ensaios com a mesma amostra, nas mesmas condições e os resultados foram satisfatórios. Ao FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 25 ajustar os dados experimentais por meio de regressão linear, os valores obtidos de r2 foram todos acima de 0,99. 9.7 - Aplicabilidade em amostras reais Como foi referido anteriormente, esta técnica foi aplicada em diferentes tipos de pão de modo a comprovar a sua utilidade na determinação de compostos voláteis em amostras sólidas. Na Tabela 9.3 encontram-se as concentrações obtidas para cinco tipos diferentes de pão. Tabela 9.3 - Concentrações de DC, PN e HX para cinco tipos diferentes de pão. Amostra [DC] / μg Kg-1 [PN] / μg Kg-1 [HX] / μg Kg-1 Pão com frutos secos 99 ± 12 88 ± 29 83 ± 21 Pão branco 190 ± 17 103 ± 19 19 ± 10 Pão de trigo com sementes 169 ± 22 165 ± 6 < LOQ Pão Tigre 218 ± 30 118 ± 14 70 ± 22 Broa de Avintes 66 ± 16 90 ± 15 < LOQ Os valores obtidos na Tabela 9.3 são semelhantes aos que se podem encontrar na literatura. [27] O pão tigre foi o tipo de pão com maior quantidade de DC e de PN. A broa de Avintes foi o único caso em que a concentração de PN foi superior à do DC. Nos restantes tipos de pão apresentados os resultados não têm diferença estatisticamente significativa. Na Figura 9.4 encontra-se representado um gráfico com vários cromatogramas sobrepostos referentes aos ensaios de um dos tipos de pão. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 26 Figura 9.4 – Cromatogramas sobrepostos obtidos para os ensaios de um dos tipos de pão. DC PN HX FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 27 9.8 - Efeito da variação do teor dos compostos α-dicarbonílicos no pão ao longo de quatro dias Neste estudo pretendeu-se avaliar a variação dos compostos α-dicarbonílicos no mesmo pão ao longo de vários dias. Utilizaram-se as condições de extração previamente otimizadas. O pão foi comprado no dia 1 e foi analisado durante 4 dias seguidos. A trituração era efetuada diariamente antes da extração e os ensaios eram sempre feitos em triplicado. O tipo de pão utilizado nestes ensaios foi diferente dos ensaios anteriores. Neste caso, a PN surgiu em quantidades muito reduzidas no dia 1 logo, desaparecendo nos dias seguintes, optou-se por não a colocar no gráfico. A PN não surgiu em nenhum dos ensaios. Verificou-se que a concentração dos αdicarbonílicos diminuiu com o passar dos dias. Visto que a amostra ficava exposta ao meio ambiente entre os ensaios, a justificação para o sucedido pode estar relacionada com a volatilização dos compostos ao longo do tempo. Na Figura 9.5 encontra-se a evolução dos compostos ao longo deste estudo. Figura 9.5 - Gráfico representativo da variação ao longo de quatro dias dos compostos α-dicarbonílicos no pão. Os ensaios foram realizados em triplicado e a moagem da amostra era feita antes de cada extração. As extrações foram efetuadas durante 15 min, a 65 ᵒC e o volume da solução aceitadora 0,1 %, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, foi 0,5 mL. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 28 B – Determinação de aldeídos em cortiça 10 – Estudo e otimização dos parâmetros que influenciam o processo de extração na cortiça À semelhança do que foi feito no estudo anterior também foi necessário realizar algumas otimizações no processo de extração, uma vez que se está a lidar com uma matriz e compostos diferentes. Estudaram-se três parâmetros relevantes: o tempo de extração, a temperatura de extração e a variação de volume da solução aceitadora. 10.1 – Influência do tempo de extração Neste estudo foram determinadas as quantidades de diferentes aldeídos presentes na amostra em função do tempo de extração. Os aldeídos em questão são o furfural, o benzaldeído, o hexanal, o octanal, o nonanal, o decenal e o decanal. Os tempos estudados foram 10, 15, 20, 30, 40, 50 e 60 min. Todos os ensaios foram realizados com 1 mL de DNPH e a 50 °C. O gráfico representativo do efeito do tempo de extração encontra-se na Figura 10.1. Figura 10.1 – Representação da variação das áreas dos picos dos aldeídos em função do tempo de extração. A solução aceitadora foi DNPH 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, e o volume 1,0 mL. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 29 Foi escolhido um tempo que combinasse um curto período de espera com uma boa recolha. O tempo selecionado foi 15 min. 10.2 – Influência da temperatura de extração Como se viu anteriormente, e uma vez que se estudam processos que dependem da volatilização de compostos, a temperatura à qual se realiza a extração é um parâmetro que deve ser corretamente controlado. Para este ensaio utilizaram-se como referência os seguintes aldeídos: o furfural, o benzaldeído, o octanal, o nonanal, o decenal e o decanal foram os compostos utilizados. Os ensaios decorreram durante 15 min e com 1mL de DNPH. Na Figura 10.2 encontra-se o gráfico representativo do efeito da variação da temperatura de extração. Visto que os resultados entre os 50 e os 60 °C não são muito diferentes, excetuando o hexanal, escolheu-se a temperatura 50 °C. A evaporação, fenómeno que surge com o aumento da temperatura, também contribuiu para a escolha desta temperatura. Figura 10.2 - Representação da variação das áreas dos picos dos aldeídos em função da temperatura de extração. O tempo utilizado 15 min. A solução aceitadora foi DNPH 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, e o volume 1,0 mL. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 30 10.3 – Influência da variação de volume da solução aceitadora, DNPH O parâmetro da influência da variação de volume da solução aceitadora, DNPH, também foi estudado neste trabalho. Foram estudados 5 volumes diferentes (0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL), durante 15 min cada, a 50 °C. Devido ao efeito da concentração, quanto menor o volume, maior a área do pico. O gráfico representativo do efeito da variação do volume da solução aceitadora encontra-se na Figura 10.3. O volume escolhido foi 1,0 mL visto que combinava uma quantidade suficiente para injetar no HPLC/UV com uma área do pico satisfatória. Apesar de para volumes inferiores, existirem áreas do pico melhores, a escolha foi 1,0 mL devido aos efeitos de evaporação. A solução aceitadora utilizada neste trabalho evapora mais facilmente do que no trabalho anterior logo o seu volume tem de ser maior. 10.4 – Variação da concentração de aldeídos nos diferentes passos da formação de uma rolha de cortiça Como foi referido anteriormente, foram analisados todos os passos da produção industrial da rolha de cortiça e consequente determinação dos aldeídos presentes em cada etapa. Cada passo foi realizado em triplicado. De uma forma geral os aldeídos com maior predominância e que foram estudados foram o furfural, benzaldeído, hexanal, Figura 10.3 - Representação da variação das áreas dos picos dos aldeídos em função do volume da solução aceitadora. O tempo utilizado 15 min. A solução aceitadora foi DNPH 0,1%, em tampão fosfato 0,1 mol/L, pH 7, e o volume 1,0 mL. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 31 octanal, nonanal, decanal, formaldeído, acetaldeído e pentanal. Na Tabela 10.1 encontram-se os valores das áreas dos picos de cada aldeído em cada passo do processo de formação da rolha. Verificou-se o aparecimento de alguns compostos em alguns passos; houve variação da área do pico dos vários aldeídos encontrados nas rolhas submetidas aos tratamentos Alfa e Sunrise e também existiu diferenças entre as marcações a fogo e a tinta. Estes tratamentos são baseados em lavações oxidantes com o objetivo de as branquear. No caso do tratamento Alfa a rolha fica toda branca enquanto no Sunrise fica com tons mais acastanhados característicos da cortiça. No primeiro caso, as situações mais relevantes prenderam-se com a formação do furfural a partir da esterilização. Este fato pode ser explicado com os tratamentos térmicos que acontecem neste passo. O aumento deste composto também é indicativo que estão a ocorrer reações de Maillard. [4] Outro caso semelhante aconteceu com o aldeído pentanal. A sua presença só surgiu a partir dos tratamentos Alfa e Sunrise. O benzaldeído manteve as suas quantidades constantes ao longo de todo o processo. O acetaldeído, o decanal, o formaldeído, o hexanal e o nonanal obtiveram valores mais elevados durante o tratamento Alfa. Quanto aos tratamentos, verificou-se que o tratamento Alfa originava áreas dos picos superiores comparativamente com o Sunrise. Finalmente, o tipo de marcação também teve resultados interessantes. Como o material aplicado era diferente, os resultados foram também diferentes. Os valores da marcação a tinta foram superiores aos da marcação a fogo. Pode se entender melhor as variações dos aldeídos ao longo dos diferentes passos visualizando as Figuras 10.4-10.12. Para uma desta etapas, em particular numa rolha com lavagem Alfa, resolveu-se proceder à quantificação dos aldeídos existentes na amostra, para tal recorrendo à adição de padrão. Os compostos que estão presentes em maior quantidade são o decanal, o formaldeído e o nonanal. Todos os outros surgem com concentrações semelhantes. Na Tabela 10.2 estão os valores das concentrações de cada aldeído durante a lavagem Alfa. Na Figura 10.13 encontram-se cromatogramas sobrepostos obtidos para a quantificação das rolhas com lavagem Alfa com diferentes concentrações de aldeídos. FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 32 Tabela 10.1 - Áreas dos picos obtidos para os aldeídos estudados durante o processo de produção de rolhas de cortiça. Crua Cozida Esterilizada Brocagem Alfa Sunrise Alfa Fogo Alfa Tinta Sunrise Fogo Sunrise Tinta Alfa Parafina Fogo Alfa Parafina Tinta Sunrise Parafina Fogo Sunrise Parafina Tinta Furfural 0,00 0,00 11335,09 13253,58 3061,25 3273,95 3019,18 4646,17 4247,98 7394,80 3622,78 2446,71 3669,45 4937,43 Benzaldeído 2071,41 2156,70 2277,71 2609,81 2482,76 2483,51 2381,57 2632,14 2835,95 2732,99 2375,32 2771,42 2512,13 2793,38 Hexanal 2119,83 2635,13 3309,62 3221,35 6395,12 3662,31 5312,10 6097,84 4376,70 5001,86 6321,33 7776,53 3802,75 3544,42 Octanal 2245,36 1722,43 1972,35 1515,96 1185,68 0,00 1067,20 802,29 708,62 756,07 913,38 948,72 1020,20 1034,59 Nonanal 1599,15 1464,48 1746,88 1757,91 2573,57 3263,91 2283,26 2043,23 3251,80 3464,44 2389,40 2653,48 1084,52 1040,68 Decanal 2512,39 2208,77 2189,85 2223,96 4296,18 3263,91 5251,58 3587,21 3251,80 3464,44 2871,85 1124,36 1084,52 1040,68 Formaldeído 14784,00 11802,64 19635,94 13531,28 70096,64 19296,16 51879,84 54710,09 26193,70 26698,40 105887,11 166254,65 44601,30 32389,86 Acetaldeído 3414,42 7046,54 9530,53 10219,07 132208,33 10375,00 79825,02 65830,03 19149,18 24497,67 118112,58 159185,02 15710,61 9906,65 Pentanal 0,00 0,00 0,00 0,00 24764,89 24683,60 24566,01 24473,66 24446,15 25241,06 22654,38 23472,61 23991,98 23344,61 FCUP Análise de compostos voláteis e semi-voláteis de amostras sólidas recorrendo à microextração por difusão gasosa (GDME) e à cromatografia líquida de alta eficiência 32 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 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