Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil

Miriam Aparecida da Silva Miranda Mestrado em Biologia e Gestão da Qualidade da Água Departamento de Biologia Orientador Professor Doutor Vitor Manuel O. Vasconcelos Professor Catedrático Faculdade de Ciência da Universidade do Porto Coorientador Professor Doutor Fernando Antônio Jardim Biólogo COPASA – Companhia de Saneamento de Minas Gerais Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais – Brasil Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais – Brasil Miriam Aparecida da Silva Miranda Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para obtenção do grau de Mestre em Biologia e Gestão da Qualidade da Água. Departamento de Biologia Faculdade de Ciências da Universidade do Porto PORTO, 2014 FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil III Agradecimentos Primeiramente, agradeço a Deus por sempre iluminar meu caminho. E as pessoas que ele colocou neste meu caminhar a fim de me ajudar a concluir este projeto. Agradeço in memoriam meu pai Luiz Alves Miranda Filho que em toda sua existênciase esforçou para me ajudar, acreditando sempre nos meus sonhos. E que teve de partir no momento em que eu iniciei o mestrado, e eu nem o adeus consegui dar. Ficará sempre no meu coração. Nunca questionou de forma negativa qualquer decisão minha em relação a minha formação profissional. Agradeço a minha mãe Alaide da Silva Miranda pela guerreira que demostrou ser. Foi no momento mais difícil, quando eu estava quase a desistir que ela insistiu e me mostrou que apesar da nossa perda a vida continuava e que havia outras pessoas que precisavam de mim. Nesse período de estudo cuidou com muita responsabilidade dos meus filhos para que eu conseguisse concluir meu trabalho. A minhafilha Ana Clara e o meu filho Luiz, obrigada por pacientemente entenderem minha ausência e acreditarem que dias melhores virão. E estaremos sempre juntos peloamor e pela compreensão. Agradeço também aos meus irmãos Cássio e Avilmar, e minha irmã Aline pela compreensão e dedicação. Aos meus sobrinhos e cunhados pelo carinho dedicado não só a mim, mas também aos meus filhos. Muito obrigada aos colegasOlinda Silva, Rita Macieira, Fernanda Bastian, Ana Basto, Marta Figueiredo, Ana Ribeiro pela amizade, carinho e ajuda. Aos professores da FCUPem especial ao Professor Doutor António P. Carvalho, a Professora Doutora Olga Lage, Professora Doutora Aurélia Saraiva e o Professor Doutor José Américo Souzaque nessa caminhada passaram ao meu lado compartilhando conhecimentos. Agradeço profundamente a equipe Legeem especial, DoutoraCristiana Moreira, Doutora Joana Passo, DoutoraMicaela Vale e DoutoraJoão Morais que me orientaram nesse estudo e que agora apresento-o com muito orgulho. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil IV A CIA SAAE de Pirapora-MG que me ajudou nas coletas de amostras em especial a Ana Maria Carvalho que se mostrou muito interessada pela pesquisa. Agradeço a equipe COPASA de Belo Horizonte e Várzea da Palma pela imensa ajuda que me proporcionou com as amostras, análises microscópicas e no teste bioquímico. Pelo interesse que tiveram no projeto, proporcionando dessa forma parte do seu financiamento. AoProfessor Doutor Fernando Antônio Jardim que aceitou ser meu coorientador, e foi o intermediário para que eu conseguisse o financiamento da COPASA para dar continuidade ao projeto, meu muito obrigada pela orientação, aprendi muito e faço votos que mais trabalhos possamos desenvolvermos juntos. Ao Professor Doutor VitorM. O. Vasconcelos pela orientação dada ao longo do trabalho e conhecimento compartilhado durante as aulas. Obrigada por sua paciência e carinho. A Professora Doutora Maria Natividade pelo apoio, orientação, pela amizade e carinho que a mim dedicou como uma mãe. Sentirei imensa saudade. Também sou muito grata pelo conhecimento compartilhado no desenvolvimento desse trabalho. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil V “Tudo posso naquele que me fortalece” Filipenses 4:13 “Para tudo há um tempo, para cada coisa um momento abaixo do céu” Eclesiástico 3:1 FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil VI Resumo Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais – Brasil Durante as últimas décadas tem-se registado um aumento da existência de florações de cianobactérias, em rios, lagos, lagoas e reservatórios. As cianobactérias são microrganismos procariotas, fotoautotróficos, oxigénicos e tem a parede celular semelhante às bactérias gram negativas. Com uma ampla distribuição geográfica, são encontradas numa diversidade de ambientes, desde ecossistemas terrestres, água doce, salobra ou marinhos e mesmo em habitats extremos, tais como fontes termais, desertos, regiões tropicais e polares.Fazem parte da comunidade de microrganismos de um corpo hídrico, isto é, em sistemas de água doce não poluídos, são componente do fitoplâncton, no entanto, devido a fenómenos de eutrofização, ocorre a proliferação destes microrganismos, gerando florações. A ocorrência de florações de cianobactérias tóxicas constituem um problema mundial que vem aumentando em intensidade e frequência. Estes microrganismos são capazes de secretarem toxinas nocivas, que diferem na sua natureza química, bem como na sua ação tóxica, causando efeitos hepatotóxicos, neurotóxicos e dermatotóxicos, representando assim um risco significativo para o ambiente e saúde pública. Perante o problema da contaminação da água dos rios de Minas Gerais – Brasil por cianobactérias, sendo este um dos fatores que influenciam nos padrões da qualidade da água potável, podendo gerar danos a saúde pública, o presente trabalho teve como objetivo analisar a toxicidade da ocorrência de cianobactérias nas águas de cinco importantes rios de Minas Gerais, uma vez que, alguns deles são utilizados para abastecimento público. Na metodologia realizou-se a identificação das espécies através de microscopia, com respetivo isolamento e cultura das mesmas com posterior análise pela técnica ELISA para a deteção de toxinas. Ensaios moleculares foram realizados para a deteção das espécies e suas respetivas toxinas e ensaio filogenético do sequenciamento do gene da anatoxina-a. Para as amostras ambientais foram realizadas a técnica HPLC/PDA para deteção para possível produção de toxina. Para avaliar a eficiência na remoção de microcistina da água para abastecimento público foram ainda realizadas análises de amostras das ETAs de Pirapora e Várzea da FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil VII Palma (MinasGerais). Como resultado foi possível identificar nas amostras, cianobactérias potencialmente tóxicas e não tóxicas, como; Microcystis aeruginosa, Planktothrix agardhii, Cylindrospermopsis raciborskii, Arthrospira sp., Sphaerocavum sp., Geitlerinema sp., Aphanizomenon sp. No rio das Velhas ao norte de Minas Gerais foi detetada pela primeira vez cilindrospermopsina. O ribeirão São Pedro, afluente da Bacia do rio Jequitinhonha teve resultado positivo na análise molecular para espécie de Cylindrospermopsis raciborskii e para toxina cilindrospermopsina, porém no ensaio ELISA não expressou a cilindrospermopsina, mas a saxitoxina foi detetada. Na avaliação das amostras das ETA´s foi possível confirmar em ambas as cidades a eficiência na remoção de microcistina no tratamento convencional associado ao carvão ativado em pó (CAP). Conclui-se que o ensaio molecular é uma ferramenta muito importante no monitoramento das cianobactérias e cianotoxinas para amostras ambientais como forma de minimizar os riscos à saúde pública. Palavras-chave: Cianobactérias, cianotoxinas, eutrofização, qualidade da água FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil VIII Abstract Occurrence of cyanobacteria and cyanotoxins in water of five important rivers in the State of Minas Gerais – Brazil During the last decades has been registered an increasing of cyanobacterial blooms in rivers, lakes, ponds and reservoirs.Cyanobacteria are prokaryotic, photoautotrophic and oxygenic microorganisms with a cell wall similar to gram-negative bacteria.With a wide geographical distribution, they are found in a variety of environments, from terrestrial, freshwater, brackish or marine ecosystems or even in extreme habitats such as hot springs, deserts, tropical and polar regions.Part of microorganisms community in an water body, i. e, in unpolluted freshwater systems are a phytoplankton component, however, due eutrophication phenomena, the proliferation of these microorganisms occurs, thus generating blooms.The occurrence of toxic cyanobacteria blooms, are a worldwide problem, which have been increasing in intensity and frequency. These microorganisms are able to produce harmful toxins, which differ in their chemical nature as well as in its toxic effect, leading hepatotoxic, neurotoxic or dermatotoxic effects, presenting thus a significant hazard to the environment and public health.Faced with the problem of water contamination by cyanobacteria in rivers of Minas Gerais (Brazil), being this one of the factors that influence the standards of water quality, causing damage to public health, the present work aimed to analyze the toxicity of occurrence of cyanobacteria in waters of five important rivers of Minas Gerais, since some of them, are used for public supply.In methodology, species identification was performed by microscopy, with respective isolation and culturing of same with following analysis by ELISA technique to detect toxins. Molecular and phylogenetic assays were performed to detection of species and their respective toxin for sequencing of the gene anatoxin-a, respectively. For environmental samples, HPLC/PDA was used for detecting the production of toxins.In order to evaluate the removal efficiency of microcystin in water for public supply, were also carried out analysis of samples in Water Treatment Plant from Pirapora and Varzea de Palma (Minas Gerais).As a result it was possible identify in samples, potentially toxic and non toxic cyanobacteria, such as; Microcystis aeruginosa, Planktothrix agardhii, Cylindrospermopsis raciborskii, Arthrospira sp., Sphaerocavum sp., Geitlerinema sp., Aphanizomenon sp.In Velhas FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil IX river, north of Minas Gerais was detected for the first time cylindrospermopsin. In São Pedro creek, affluent of basin Jequitinhonha river, had positive result in molecular assays to species of Cylindrospermopsis raciborskii and cylindrospermopsin toxin, however, by ELISA assay, cylindrospermopsin was not expressed but saxitoxin was detected. In sample evaluation of Water Treatment Stations, was possible confirmed, for both cities, removal efficiency of microcystin in conventional treatment associated with powdered activated carbon (PAC). It was concluded that the molecular test is a very important tool in monitoring of cyanobacteria and cyanotoxins for environmental samples in order to minimize the risks to public health Keywords: Cyanobacteria, cyanotoxins, eutrophication, water quality FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil XVI LMA – Limite máximo admissível LPS – Lipopolissacarídeo McToxina microcistina mcy – Sintetase da microcistina p.c – Peso corpóreo PDA - Photodiode Array Detector PSTToxina paralisante de saxitoxina Stx – Toxina saxitoxina FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 17 1. Introdução 1.1 Apresentação Perante o problema da falta de água no mundo, tanto em qualidade como em quantidade, o Brasil é um país privilegiado, pois possui cerca de 16% de toda água potável do planeta. Contudo, apesar da abundância de água, o país enfrenta problemas quanto à sua má distribuição e eutrofização nos corpos d´agua. O rápido crescimento populacional a formação de aglomerados urbanos e o aumento da produção agrícola e industrial resultaram no aumento do despejo de poluentes nos corpos d´agua, principalmente matéria orgânica e nutrientes como nitrogénio e fósforo tornando-os cada vez mais eutrofizados. Este fenómeno propicia a proliferação excessiva de algas e cianobactérias potencialmente tóxicas em reservatórios e corpos hídricos usados para abastecimento público. Esses eventos têm sido cada vez mais frequentes, causando impactos sociais, económicos e ambientais (Tundisi, 2008). A ocorrência de florações de cianobactérias é um problema mundial, a implantação de monitoramento em abastecimento de água tem sido realizado, contudo, no Brasil há muitas cidades onde não há tratamento de água residual, dessa forma os rios recebem imensas cargas de resíduos diariamente, promovendo a proliferação das cianobactérias e suas toxinas (IBGE 2011). É uma das consequências mais graves do processo de eutrofização em corpos d’ água, pois ocasiona o aumento da ocorrência de florações tóxicas de cianobactérias e a presença de suas toxinas nos diferentes níveis da cadeia trófica. Essasflorações vêm aumentando em intensidade e frequência, sendo possível visualizar um cenário de dominância desses organismos em muitos reservatórios brasileiros. Ocasionando um grande problema para as empresas destinadas ao tratamento de água. A grande concentração das cianobactérias faz com que a pequena quantidade de toxinas presentes em cada célula se potencialize e provoque consequências nocivas aos organismos que as consomem, inclusive a população humana. A biologia molecular é uma importante ferramenta na identificação de cianobactérias e na avaliação do seu potencial tóxico pela identificação de genes específicos para cada espécie e de genes envolvidos na produção de toxinas, podendo detetar precocemente as florações tóxicas, o que pode facilitar o monitoramento de ambientes aquáticos (Ferrão-Filho, 2009), diminuindo assim os riscos para saúde pública e dessa FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 18 forma, tornando breve o tempo para a obtenção de resultados analíticos, melhorando a produtividade no laboratório, facilitando o trabalho e reduzindo custos. Mais ainda, apresenta uma elevada sensibilidade e especificidade. E como forma de confirmação da produção das toxinas há disponíveis os métodos analíticos;físico-químico, como HPLC-PDA (High-performance liquid chromatography) e bioquímico, como o teste enzimático ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (Carneiro & Leite, 2008). O Estado de Minas Gerais está localizado na Região Sudeste do Brasilentre osparalelos de 14º13'58' ' e 22º54'00´´ de latitude sul e os meridianos de 39º51'32' ' e 51º02'35' ' a oeste de Greenwich, situada num planalto com altitude que varia de 100 a 1500 metrose possui, segundo o IBGE (2010), uma população de 19.597.330 habitantes, distribuídos em 853 municípios em uma área de 586.522,122km2, sendo o quarto Estado maior em extensão territorial. É um estado muito rico em nascentes de água. A rede hidrográfica de Minas Gerais é composta por 17 bacias e possui cerca de 10.000 cursos de água. As grandes bacias hidrográficas do país têm suas origens no território mineiro. São essas inúmeras nascentes que conferem ao Estado o título de Caixa D’Água do Brasil. Esses recursos hídricos são amplamente utilizados pelas usinas hidrelétricas e represas, nos açudes e canais para irrigação, nas atividades de Turismo e lazer.No entanto, grande parte dos rios de Minas se encontra ameaçados pela exploração desenfreada feita pelo homem, de maneira predatória e irresponsável, tanto em decorrência do desmatamento das áreas das nascentes e das matas de galeria, quanto do lançamento de lixo e esgoto, sobretudo aqueles produzidos nos centros urbanos e pelas grandes unidades industriais. O baixo nível de consciência da sociedade em relação à preservação ambiental também contribui para a degradação desses mananciais. Peranteo problema da contaminação da água dos rios de Minas Gerais por cianobactérias, sendo este um dos fatores que influenciam nos padrões da qualidade da água potável, podendo gerar danos a saúde pública, portanto é necessário analisar a toxicidade da ocorrência de cianobactérias nas águas de cinco importantes rios de Minas Gerais, uma vez que,alguns destes são utilizados para abastecimento público. E ainda identificar géneros e espécies de cianobactérias das amostras em estudo, averiguar e quantificar as possíveis toxinas produzidas. E avaliar a eficiência do sistema da Estação de tratamento de água de Pirapora-MG e Várzea Palma-MG na remoção de microcistina. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 19 2 Eutrofização A eutrofização é uma resposta biológica ao aumento da concentração de nutrientes, especialmente fósforo e nitrogénio num ecossistema aquático (Esteves,1998). Pode ocorrer de forma natural ou artificial ( Azevedo, 1998; Jardim, 2011). Quando natural, é um processo lento e contínuo que resulta do transporte de nutrientes transportados pelas chuvas e pelas águas superficiais que lavam a superfície terrestre. Corresponde a um envelhecimento natural de um corpo d’ água (Macedo & Sipaúba – Tavares, 2010). A eutrofização artificial é induzida pelo homem, também conhecida como antropogênica. Neste caso, os nutrientes podem ter diferentes origens, como: esgotos domésticos, efluentes industriais, atividades agrícolas e pecuária ( Anciutti & Cochôa, 2010). Este tipo de eutrofização é responsável pelo envelhecimento precoce de um ecossistema aquático. A eutrofização artificial é um processo dinâmico, o qual resulta em profundas modificações qualitativas e quantitativas nas comunidades aquáticas, nas condições físicas e químicas do meio e no nível de produção do sistema, podendo ser considerada uma fonte de poluição. Está relacionada com o aumento da população humana, da industrialização, do uso de fertilizantes químicos na agricultura e produtos de limpeza contendo compostos polifosfatados. Todos esses fatores resultam na liberação de nutrientes, como fosfato e nitrogénio, que são compostos estimuladores da eutrofização (Macedo & Sipaúba-Tavares, 2010). Os casos de eutrofização artificial no Brasil são, na quase sua totalidade, promovidos pelo lançamento de água residuais domésticos e industriais não tratados (in natura), (Barreto et al., 2013; Macedo & Sipaúba-Tavares, 2010). Os ecossistemas aquáticos próximos aos centros urbanos estão se transformando em verdadeiros depósitos de esgotos, gerando enormes prejuízos económicos e sociais para a população brasileira (Tundisi, 2008). Pesquisa do governo federal indica que cerca de 60% da população brasileira ainda não dispõe de tratamento de esgotos. Destaca-se que apenas 35% do esgoto coletado é tratado, o restante 65% tem seu destino final, os ecossistemas aquáticos do país. E quando há tratamento da água residual na quase totalidade dos casos, não ocorre a FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 20 fase terciária que confere a eliminação de fósforo e nitrogénio, sendo estes os principais agentes da eutrofização artificial. Sendo assim, a grande maioria das ETARsbrasileiras funcionam precariamente e com isto, são de baixa ou baixíssima eficácia ao tratamento das águas residuais (Esteves,1998; IBGE, 2011). São vários os motivos que desencadeiam a eutrofização, e dentre eles, o represamento de um rio (Vasconcelos, 2006) e o consequente aumento do nível da água representa uma grande fonte de nutriente para o meio, proporcionando assim, uma alteração do estado trófico do reservatório. E dependendo da localização ocupada pelos terrenos agrícolas, pelas florestas, pelas zonas de urbanização ou industriais, a amplitude da eutrofização é variável. Num ecossistema lêntico a profundidade interfere no crescimento de fitoplâncton, sendo que os lagos pequenos e pouco profundos são geralmente lugares mais propícios ao desenvolvimento de fitoplâncton. Para Freire & Bollman (2003), a inter-relação dos inúmeros fatores climatológicos, hidrológicos, morfológicos, físico-químicos e biológicos que ocorrem tanto na bacia quanto no próprio corpo hídrico são motivos que levam ao aumento da densidade de populações de cianobactérias. Segundo Chorus & Bartram, (1999) a temperatura da água, ambientes com disponibilidade de nutrientes, concentrações de N:P e concentrações de CO2, pouca intensidade de luz, pH elevado, alta capacidade de armazenagem de fósforo, são fatores favoráveis aos resultados mais visíveis da eutrofização. Pouca precipitação anual, associada a altas taxas de evaporação, também contribuem para concentrar sais minerais e nutrientes inorgânicos na água. Em condições normais, ofitoplâncton e os organismos zooplanctónicos convivem de modo equilibrado em lagos, reservatórios e rios, não havendo dominância excessiva de uma determinada espécie em detrimento da outra. Mas quando há algum tipo de interferência que enriquece a água com nitrogénio e fósforo, algumas espécies passam a ser dominantes, multiplicando-se de forma excessiva e dando origem ao fenómeno chamada floração, principalmente por cianobactérias (Deberdt, 2004). Em função do nível de eutrofização a qualidade da água pode ser afetada de tal modo a torná-la imprópria para abastecimento público, recreação ou outros usos. Pode também como consequência, a redução de oxigénio dissolvido, perda das qualidades cénicas, aumento do custo de tratamento, morte extensiva de organismos aquáticos (Azevedo, 1998). FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 21 3 Cianobactérias 3.1 Características das Cianobactérias As cianobactérias são organismos procariotas, pois em sua célula há ausência da membrana nuclear. De acordo com sua morfologia podem ser filamentosas ou cocóides, encontradas na forma unicelular ou formando colonias (Campinas et al.,2002; Carvalho, et al., 2013). Sua parede celular é semelhante a das bactérias gram negativas (Beltrame & Pascholati, 2011; Fathalli et al., 2011), uma vez que parte da célula é composta pelo componente lipopolissacarídeo –LPS (Carneiro & Leite, 2008). Porém as cianobactérias não são vistas como organismos patogénicos, pois não existem registos de que possam multiplicar nos organismos hospedeiros (Adams, 2000). Por outro lado são organismos fotoautotróficos, oxigénicos (Anciutti & Cochôa, 2010; Beltrame & Pascholati, 2011; Brito et al., 2012) e contém em suas células diferentes pigmentos fotossintéticos como a clorofila a, que corresponde a coloração esverdeada, ficocianina que lhe confere a cor azul e algumas espécies possuem também um pigmento vermelho, a ficoeritrina (Sant´Anna, 2006). Em algumas espécies há formação de aerótopos (vesículas gasosa) e a bainha de mucilagem, essas estruturas proporcionam as cianobactérias vantagens sobre outros grupos, pois permite flutuação e proteção para locais favoráveis para seu crescimento. Outras espécies de cianobactérias podem ser fixadoras de nitrogénio (Beltrame & Pascholati, 2011), por meio de uma célula vegetativa conhecida como heterocito no qual é expressada quando o meio está desfavorável, ou seja, quando há deficiência de nitrogénio no corpo hídrico. Estácélula vegetativa também pode originar o acineto, está célula possui parede espessa e guarda em seu interior grânulo com substâncias de reserva produzida pela própria cianobactérias (Silva et al., 2013).As cianobactérias são cosmopolitas e apresentam grande tolerância as condições ambientais e climáticas podendo ser encontradas em uma variedade de ambientes,desde dulcícolas, marinhos, salobros e terrestre (Canto de Sá et al., 2010). Estudos relatam fósseis datados de 3,5 milhões de anos e pensa-se que terão sido os organismos responsáveis pela oxigenação da atmosfera terrestre (Fathallietal., 2011; Leão et al., 2012). Entretanto, estudos com base em biomarcadores de DNA, sugerem que estes microrganismos apenas surgiram ha cerca de 2,6 milhões de anos.Com base na FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 22 abordagem filogenética as cianobactérias estão classificadas em cinco subseções, fundamentadas em uma taxonomia bacteriológica, que coincide com a ordem da abordagem botânica (Tabela 1). Tabela 1.Principais características morfológicas e sua ocorrência no ambiente, segundo as diferentes ordens da classificação botânica de cianobactérias e a sua correspondência para subsecções da classificação bacteriana(Brito, et al., 2012;Waterbury, J. B., 2006; Lopes et al., 2012). Classificação botânica Classificação bacteriana Principais recursos morfológicos, ocorrência e espécies típicas Ordem Chroococales Subsecção I Cianobactérias unicelulares que se reproduzem por divisão celular binária ou por rebentos numa única célula, em colónias mantidas juntais pela mucilagem ou então por revestimentos laminados. Muitas espécies são planctónicas e contêm vesículas de gás. Elas ocorrem em águas doces bem como em ambientes marinhos. Os géneros típicos são Synechocystis e Microcystis. Ordem Pleurocapsales Subsecção II Algumas espécies podem sempre ou por vezes reproduzirem-se através de pequenas células esféricas que são produzidas por múltiplas divisões das células-mães. Geralmente crescem em ambientes aquáticos anexadas aos substratos. Um género típico é a Pleurocapsa Ordem Oscillatoriales Subsecção III Filamentosas, maioritariamente unisseriadas. Cianobactérias sem células especiais. Os tricomas normalmente têm uma bainha e muitas espécies têm vesículas de gás. O grupo é ecologicamente diversificado e ocorre em plâncton, bentónica e em habitats periféricos em águas doces e em ambientes marinhos. Os géneros típicos são Oscillatoria, Planktothrix e Spirulina Ordem Nostocales Subsecção IV Filamentosas, maioritariamente unisseriadas. Cianobactérias que podem formar células especializadas (heterócitos e acinetos), sendo que algumas podem formar hormogonia (formação de tricomas dotados de mobilidade que dão origem a novos filamentos). Algumas espécies têm vesículas de gás. Elas ocorrem em plâncton, bentónica e habitats periféricos em águas doces ou ambientes marinhos e podem também ser encontradas em ambientes terrestres. Os géneros típicos são Anabaena, Aphanizomenon e Nodularia. Ordem Stigonematales Subsecção V Filamentosas, normalmente são cianobactérias multisseriadas ramificadas (verdadeira ou falsa) que podem formar células especializadas (heterocitos e acinetos) e alguma forma de hormogonia. Ocorrem em ambientes aquáticos e terrestres mas normalmente não em plâncton. O género é Fischerella. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 23 4 Cianotoxinas Muitas espécies de cianobactérias tem a capacidade de secretar metabólitos secundários que podem causar alterações nas propriedades organoléticas da água, isto é, promovem gosto e odor desagradáveis àágua, devido a geosmina e o 2methylisoborneol (2-MIB) (Campinas et al., 2002; Carneiro&Leite,2008;Sant’Anna et al., 2006). São responsáveis pela produção e liberação de compostos potencialmente tóxicos (Tabela 2). Esses metabólitos são conhecidos por cianotoxinas (Figura 1) (Canto de Sá et al., 2010) são libertadas para o meio externo por rompimento da parede celular, o que acontece por senescência das células ou sob a ação de algicidas, como o sulfato de cobre. Contudo, a cilindrospermopsina pode ser excretada pelas células em condições fisiológicas normais, uma vez que sua estrutura lhe confere alta polaridade, portanto a toxina possui alta solubilidade em água, caracterizando-a como cianotoxina intra e extracelular (Masten & Carson, 2000; Stuken & Jakobsen, 2010). Cianotoxinas com essas características as tornam especialmente importantes, pois não há necessidade de ruptura das células para que a água seja contaminada. Essas substâncias são nocivas a animais terrestres, aquáticos e aos seres humanos, através da ingestão ou contato com a água contaminada (Carneiro& Leite, 2008; Cianca et al.,2012). A principal forma de exposição humana para as cianotoxinas é através do consumo de água contaminada. Por outro lado, a exposição relacionada com os usos recreacionais, quer por consumo acidental, quer por contato da água contaminada com a pele e mucosas ou por inalação, também tem uma importância relativa. Adicionalmente, também pode ocorrer exposição através do consumo de produtos dietéticos que sejam produzidos à base de cianobactérias, transferência a partir da cadeia alimentar, uma vez que, alguns animais têm a capacidade de acumularem toxinas; como por exemplo os filtradores (moluscos e crustáceos) e até mesmo os peixes. E a forma mais perigosa de contaminação é através de exposições intravenosas, por exemplo, nas unidades de hemodiálise.( Aráoz et al., 2010;Ferrão-Filho, 2009; Pearson et al., 2010; Vasconcelos, 2006). Os fatores que favorecem a produção de toxinas são variáveis. Há evidências de que a produção e a acumulação estão relacionadas com o crescimento das células. De fato, nos períodos de crescimento exponencial, a produção de toxinas tende a aumentar enquanto, na fase estacionária de crescimento, a produção tende a diminuir. Outros fatores como a temperatura, pH, produção FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 24 primária de clorofila–a, radiação solar e a função de defesa contra herbívoraocasionam o aumento da produção da toxina (Anciutti & Cochôa, 2010). No entanto, convém relatar que nem todas as espécies de cianobactérias produzem toxinas, e na mesma espécie podem encontrar estirpes tóxicas e não-tóxicas vivendo no mesmo ambiente (Molica & Azevedo, 2009; Osswald et al., 2007; Regueiras, 2009). Estão identificados cerca de 150 géneros de cianobactérias englobando perto de 2000 espécies, dentre as quais pelo menos 40 espécies (Molica & Azevedo, 2009) são consideradas como produtoras de cianotoxinas. Os principais géneros são Anabaena, Aphanizomenon,Cylindrospermopsis, Lyngbya, Microcystis, Nostoc, Oscillatoria e Planktothrix (Carmichael,2001; Fastner et al., 1998).Conforme a estrutura química podem ser classificadas como peptídeo cíclico, alcalóide e lipopolissacarídeo (Carmichael et al., 2001;Carneiro & Leite, 2008; Jardim, 2008).As cianotoxinas de acordo com os efeitos gerados nos animais são classificadas como: hepatotoxina, neurotoxina, e dermatotoxina (Lopes et al., 2012;Pinho et al., 2012). Fig. 1 Classificação das cianotoxinas conforme ação farmacológica e estrutura química FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 25 4.1 Dermatotoxinas As dermatotoxinas consistem em lipopolissacarídeos, existentes na membrana externa da parede celular das cianobactérias. A sua toxicidade é evidenciada pelo simples contato com a pele ou mucosas corporais, desenvolvendo-se uma reação alérgica (Silva et al., 2013). De um modo geral, as dermatotoxinas apresentam uma produção ubíqua dentro das cianobactérias, contudo, o seu grau de toxicidade não é tão elevado como o de outros lipopolissacárideos, desaparecendo os sintomas se o contato for interrompido (Caneiro & Leite, 2008). 4.2 Neurotoxinas As neurotoxinas são compostos alcalóidesdo tipo carbamato, de rápida ação, e têm como alvo o sistema neuromuscular. Provocam amorte de animais no intervalo depoucos minutos e ou a poucas horas, devido à parada respiratória. Produzidos por espécies de Aphanizomenon, Oscillatoria, Anabaena, Lyngya, Cylindrospermopsis e Trichodesmium (Sant´Anna, 2006). Três tipos foram descritos até o momento: saxitoxina, anatoxina-a e a anatoxina-a(s) ( Silva et al., 2013). 4.2.1 Saxitoxina A saxitoxina atua ao nível dos canais de sódio dos axónios, bloqueando-os e impedindo a propagação do impulso nervoso (Aráoz et al., 2010; Pearson et al., 2010). Em relação a toxicidade aguda, resulta na paralisia dos músculos respiratórios, seguida de morte por paragem respiratória (Kellmann et al., 2008). Também conhecido como PSP´s ( Paralytic Shellfish Poisons). Essas substâncias, das quais existem mais de 18 variantes, podem ser divididas em três grupos, de acordo com sua estrutura: as saxitoxinas (SXT), de estrutura não sufatada, as goniautoxinas (GTXS) monossulfatadas e as Ctoxinas dissulfatadas, demonstrada na (Figura 2).Em geral FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 32 5 Cianotoxinas: Danos a saúde pública Pelo fato das cianotoxinas serem hidrossolúveis e passarem pelo sistema de tratamento convencional de água, sendo inclusive resistentes à fervura, sua presença na água para consumo humano implica em sérios riscos à saúde pública. Portanto, sendo necessário o monitoramento das cianobactérias tóxicas e suas toxinas nos reservatórios de água para abastecimento público, com a finalidade de identificar os locais com sérios riscos potenciais. Também sendo prioridade estudos epidemiológicosde populações expostas a estas cianotoxinas nocivas a saúde humana, uma vez que, estudos tem mostrado resultados adversos, dentre estes o desenvolvimento de câncer. Em 1878 na Austrália ocorreu o primeiro relato de intoxicação de animais, causada por floração de cianobactérias (Carvalho et al., 2013; Lopes et al., 2012). A partir de então, os registos de ocorrência de florações em reservatórios de abastecimento público, tem sido cada vez frequentesmundialmente. Países, como Austrália, Inglaterra, China e África do Sul descreveram ocorrências de intoxicações de populações humanas pela ingestão de água contaminada por cianobactérias. Em 1983, uma população rural localizada na Austrália foi abastecida com água de um reservatório com floração de Microcystis aeruginosa, onde este, teve seu tratamento com algicida (sulfato de cobre) o que ocasionou rompimento das células e liberação da toxina na água, promovendo sérios danos hepáticos na população.Em 1979 em Palm Island, Austrália, cerca de 140 crianças e 10 adultos foram hospitalizados após ingestão de água de um pequeno reservatório tratado com sulfato de cobre para corrigir problemas de odor e gosto na água. Em uma semana, muitas pessoas apresentaram um quadro de hepatoenterite grave, levando ao tratamento de terapia intravenoso. Nas investigações resultaram no género Cylindrospermopsis e da toxina cilindrospermopsina (Carvalho, et al., 2013). Azevedo,1998 relata forte evidência da correlação entre a ocorrência de florações de cianobactérias, no reservatório de Itaparica (Bahia) e a morte de 88 pessoas, entre as 200 intoxicadas, pelo consumo de água do reservatório, entre março e abril de 1988. No entanto,o primeiro e mais grave relato de intoxicação humano por cianotoxinas confirmado, ocorreu no Brasil em1996, onde 116 de131 pacientes renais crónicos , após terem sido submetidos a sessões de hemodiálise em uma clínica da FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 33 cidade de Caruaru(PE), sofreram um quadro de intoxicação, destes 76 vieram a óbito (Carmichael et al., 2001). Após as análises feita com amostras de sangue e fígadoconfirmaram a presença de microcistina e análise com os filtros de purificação da clínica foram identificadas para além da microcistina a toxina cilindrospermopsina (Azevedo et al., 2002). Essa contaminação ficou conhecida como a Síndrome de Caruaru. A ocorrência de florações de cianobactérias é um problema mundial, a implantação de monitoramento em abastecimento de água tem sido realizado, contudo, há casos onde o rio recebe imensas cargas de resíduos indústrias, domésticos e agrícolas diariamente, dessa forma promovendo a proliferação das cianobactérias e suas toxinas. 6 Legislação Brasileira O Brasil foi o primeiro país do mundo a ter uma lei federal (Portaria n. 1469/2000 do Ministério da Saúde) sobre a obrigatoriedade de se fazer a deteção das cianobactérias e das cianotoxinas na água para abastecimento público ( Jardim & Viana, 2003). Em relação ao abastecimento público, a Portaria 2914/2011do Ministério da Saúde (Tabela 3) estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumohumano e seu padrão de potabilidade. A primeira versão, no ano de 2000,foi o precursor ao inserir numa norma legal a obrigatoriedade do monitoramento das cianobactériasno manancial. A portaria em vigor exige que os responsáveis pelo controle da qualidade da água de sistemas de abastecimento supridos por mananciais superficiais monitorem as cianobactérias no ponto de captação de água mensalmente, quando o número de células de cianobactérias não exceder 10.000 células/mL como nível de vigilância e semanalmente,quando o número de células de cianobactérias exceder este valor. Também exige que sempre que o número de cianobactérias no ponto de captação exceder 20.000 células/mL seja realizada aanálise semanal das cianotoxinas, pois neste caso as células de cianobactérias após a lise, já podem liberar uma concentração de cianotoxinas prejudicial a saúde humana. Dessa forma, é exigida a análise de microcistinas e saxitoxinas, devido ao seu efeito agudo e carcinogénico. As microcistinas ocorrem FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 34 com frequência e podem chegar a altas concentraçõesna água não tratada.As saxitoxinas são neurotóxicas e sua presença vem sendo detetada em diferentes mananciais brasileiros.Os limites máximos admissíveis (LMA) de cianotoxinas nas águas de abastecimento público foram propostos por vários pesquisadores, a fim de evitar os efeitos danosos à saúde pública. A Organização Mundial da Saúde -OMS adotou como valor máximo permitido 1,0 µg/L de microcistina em água potável, e este valor também foi incluído na Portaria MS 2914/2011, como valor máximo aceitável em água para abastecimento público no Brasil.Para saxitoxina estabelecido pela Portaria do Ministério da Saúde também segue o valor da OMS: 3,0 µg/L (Brasil, 2011).Em relação à cilindrospermopsina,a Portaria do Ministério da Saúde recomenda essa análise sempre que for detetada a presença de géneros potencialmente produtores, observando o valor máximo aceitável de 1,0µg/L. Também existe recomendação para a análise da presença de anatoxina-a (s) quando for detectada a presença de géneros decianobactérias potencialmente produtores no monitoramento de cianobactérias, porém sem estabelecimento de um (LMA). Quando os valores do (LMA) na água bruta forem atingidos ou ultrapassados, se torna necessário a tomada de várias medidas diferenciadas tanto no manejo como no tratamento de água, além do monitoramento e a prevenção de risco à saúde humana. Conforme a Portaria quando detetada a presença de cianotoxinas na água tratada, na saída do tratamento, será obrigatória a comunicação imediata às clínicas de hemodiálise e às indústrias de injetáveis (Brasil, 2011). Tabela 3 Limites máximos admissíveis para cianotoxinas, conforme a Portaria 2914/11 Toxinas Condições Limites Máximos Admissíveis Microcistina Análise obrigatória em água para consumo humano 1µg/L Saxitoxina 3µg/L Cilindrospermopsina Recomendação de análise em água para consumo humano quando forem observadas cianobactérias potencialmente produtoras 1µg/L Anatoxina-a (s) Não foi estabelecido valor Fonte: Portaria 2914/11 FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 35 A Resolução CONAMA nº 274, 29 de novembro 2000 (Brasil, 2000), referente às condições de balneabilidade, estabelece restrições à recreação de contato primário quando verificada a ocorrência de florações de algas e considera passível de interdição pelos órgãos de controle ambiental trechos dos corpos d´água em que ocorram toxicidade ou formação de spuma decorrente de florações de algas e cianobactérias. A Resolução 357/2005 do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA) dispõe sobre a classificação dos corpos de água, além de estabelecer condições e padrões de lançamentos de efluentes, incluindo limites de densidade de cianobactérias (Tabela4), (Brasil, 2005) Tabela 4 Valor máximo permitido conforme resolução 357/2005 para três diferentes classes de água doce 7 Remoção de cianobactérias no tratamento de água Segundo Veiga, 2008 refere-se em sua pesquisa, que nos últimos anos tem sido muito frequente a florações de cianobactérias em reservatórios de abastecimento público. Gerando interferência na qualidade da água, uma vez que, promove efeitos negativos FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 36 de ordem organolética, pois altera a cor, odor e saborda água durante a produção de metabólitos secundários potencialmente tóxicos e de efeitos carcinogénicos(Canto de Sá et al., 2010). Estas cianotoxinas são na sua maioria endotoxinas, porém podem ser encontradas tanto dentro como fora da célula. Quando a célula da cianobactéria sofre lise, as toxinas são libertadas. A lise pode ocorrer naturalmente, ou seja, por senescência ou causada por produtos químicos como a utilização prévia de algicida durante as florações ou por ação mecânica (turbulência e bombeamento) que ocorrem nas etapas de tratamento da água (Cybis, 2006). No tratamento da água em abastecimento público, a remoção das cianotoxinas não pode ser realizada a partir do processo de tratamento convencional, como: coagulação, floculação, sedimentação, filtração e cloração; é preciso utilizar outros meios para a eficiência da remoçãodestas toxinas. No entanto, método de tratamento convencional é eficiente para remoção das células intactas de cianobactérias (Muller, et al., 2009). Portanto, para a remoção das toxinas deve-se considerar a fração solúvel e a fração particulada. Sendo assim, os sistemas de tratamento de água que promove o rompimento das células durante o processo de tratamento, apresentam um potencial de risco a saúde pública, uma vez que podehaver libertação de cianotoxinas na água (Cybis, 2006). Para haver eficiência na remoção de toxina extracelular nos sistemas de tratamento de água há aplicação dos métodos de adsorção e/ou de oxidação. Para o método de adsorção é utilizado o carvão ativado em pó (CAP) ou granulado, de material de carbono com porosidade, capaz de coletar seletivamente gases, líquidos ou impurezas no interior dos seus poros, tem a função de clarificação, desodorização e purificaçãode líquidos ou gases. Este método é muito eficaz na remoção de cianotoxinas solúveis na água. Porém é necessário calcular bem a dose a ser utilizada, o tempo de contato, o tipo do carvão, ou seja, material de origem e tipo de ativação. A desvantagem do método é o fato do CAP sofrer uma única utilização durante o processo, gera resíduo sólido (lodo) e tornando-se assim, um procedimento dispendioso (Campinas et al., 2002). SegundoMuller e col., 2009 o carvão ativado em pó, cujo material de origemmadeira mostrou-se uma capacidade máxima de adsorção de microcistina, após terem utilizado carvão ativado a base de casca de coco, de osso e antracito. Para o método de oxidação são empregados o cloro, o ozônio, permanganato de potássio, dentre outros. O cloro é o método de oxidação mais utilizado no Brasil. Éeficiente na remoção de toxina da água, entretanto depende da dosagem a ser utilizada, da concentração, do tempo de exposição e do pH. O ozônio utilizado na pre-oxidação potencializa a remoção de células de cianobactérias. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 37 Pesquisas realizadas relatam que a oxidação de toxina gera a produção de subprodutos que devem ser investigados afim de saber se há um grau de toxicidade. O permanganato de potássio é eficiente na remoção das toxinas microcistina e anatoxina-a, porém depende da dose e tempo de contato (Campinas et al., 2002). 8 Características dos locais de amostragem 8.1 Bacia do rio das Velhas A Bacia do rio das Velhasé o maior afluente em extensão do rio São Francisco, desagua neste, na cidade da Barra do Guaçuí latitude -17º 12´44´´, longitude -44º 49´30´´, 480 de altitudeno município de Várzea da Palma. Sua nascente está localizada na cidade de Ouro Preto. Possui 801 km de comprimento, uma área 29173 km2.Ocorrendo captação de água na Estação de tratamento de água na cidade de Bela Fama e Várzea da Palma. O rio sofre graves interferências na região Metropolitana de Belo Horizonte, recebendo enorme carga de esgoto através dos afluentes Ribeirão Arrudas e o Ribeirão do Onça, que por sua vez, atravessam a cidade de Belo Horizonte. Devido a presença de minério de ferro no solo da região as águas do rio das Velhas apresentam-se de cor avermelhada, excessivamente poluído e assoreado. É utilizado na irrigação da agricultura, na pecuária para dessedentaçãodo gado e dragagem na região de Várzea da Palma (Melo Jardim, 2011; Nonato et al., 2007). 8.2 Bacia do rio São Francisco A Bacia do rio São Francisco é um dos mais importantes cursos de água do Brasil, uma vez que atende a população no consumo de água e fornecimento de alimentos, seja este retirado do mesmo como o peixe e a utilização de irrigação da agricultura e dessedentação dos animais na pecuária, avicultura, suinocultura e outros. A nascente está localizada na cidade de MedeirosMG, abrange uma área de drenagem em torno de 641.000 km2 e atinge 2830 km de extensão, FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 38 passando pelo estados de Minas Gerais, Bahia, Pernambuco, Alagoas e Sergipe, desaguando no oceano Atlântico. Há cinco usinas hidrelétricas. Em seu percurso diversos biomas são observados: Mata Atlântica, Cerrado e a Caatinga. A ocupação económica na região abrange atividade mineradora, siderurgia, agrícola, industrial têxtil e pecuária. As principais causas de degradação do Rio São Francisco são o avanço descontrolado da agricultura com intensiva irrigação com superexploração dos mananciais, desmatamento do Cerrado, supressão da mata ciliar, produção de carvão vegetal, barragens e hidrelétricas, mineração, siderurgia e a falta de saneamento básico na bacia, pois recebe grande carga de esgoto ao longo do seu percurso (Wikipedia/Bacia do rio São Francisco, 2014). 8.3 Represa de Furnas A represa de Furnas éum dos maiores reservatórios do Brasil com 1.440 km2 e 3500 km de perímetro, banha 34 municípios de Minas Gerais. Localizado na cidade do Carmo do Rio Claro com uma população estimada em 20.426 habitantes, com coordenadas geográficas de latitude 20ºC 58´19´´S, longitude 46ºC 07´08´´W, altitude 830m e área de 1.065,8 km2. Com clima subtropical – invernos secos e verões úmidos. A temperatura média no inverno é aproximadamente 16ºC e a média no mês mais quente fica por volta de 27ºC. O período entre dezembro e fevereiro é quando mais chove. Os meses mais secos vão de abril a setembro. A represa de Furnas é afluente da Bacia do rio Grande, esta bacia, com 9 milhões de habitantes e 393 municípios, pertence ao Estados de Minas Gerais (região sul) e São Paulo (região norte). É uma bacia com grande diversidade de ambientes, além de possuir marcante potencial hidrelétrico já explorado em seu curso e diversas atividades do ramo da agroindústria. Segundo IGAM, 2011 é uma bacia em geral com IQA de médio a bom, além de uma contaminação por tóxicos de baixa a média (Wikipédia/Usina Hidrelétrica deFurnas, 2014). 8.4 Ribeirão São Pedro Localizado na cidade de Medina-MG com uma população estimada em 14.493 habitantes na área urbana e de 7.148 habitantes na área rural, segundo IBGE 2010. Com coordenada geográfica de latitude 16º 31´21´´S, longitude 41º 28´37´´W, altitude de 587m e uma área de 1447km2.O ribeirão são Pedro é um pequeno rio que abastece a cidade, sendo afluente do Rio FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 39 Jequitinhonhaque tem sua nascente situada na Cidade do Serro – Minas Gerais e deságua no Oceano Atlântico na cidade de Belmonte - Bahia. Possui um comprimento de 1090 km e uma área de 70.315 km2. Atualmente foram construídas duas grandes barragens, uma em Itapebi no Sul da Bahia e a Usina hidrelétrica de Irapé localizado no município de Berilo – Minas Gerais (Wikipédia/ Medina-MG, 2014). 8.5 Lagoa dos Namorados Localizado na cidade de Nanuque - MG com uma população estimada em 41.876 habitantes. Com coordenada geográfica de latitude 17º 50´21´´S, longitute 40º 21´14´´W, altitude 103m e área 1515,5 km2. A lagoa dos Namorados é afluente da Bacia do rio Mucuri (Figura 18) que nasce em Malacacheta nordeste de Minas e desagua no Oceano Atlântico no Sul da Bahia, possui um comprimento de 446 km. Estende-se por 17 municípios e limita-se com outras bacias, dentre elas a Bacia do rio Jequitinhonha e a Bacia do rio Doce. Atualmente a principal atividade económica é a pecuária e agricultura (Wikipédia/ NanuqueMG, 2014). 8.6 Estação de tratamento de água residual de Matozinhos A Estação de Tratamento de água residual de MatozinhosMG localiza-se na latitude 19ºC 33´ 28´´ S, longitude 44º, 04´53´´ W, altitude 812 m e área 253,6 km2.Atende a uma população de 40.705 habitantes e tem capacidade de 111,8 L/s,tem como corpo recetor o Ribeirão da Mata e faz parte da bacia hidrográfica do rio das Velhas.Esse corpo recetor nasce no município de Matozinhose, após percorrer cerca de 80 quilómetros, deságua no rio das Velhas, no município de Santa Luzia. A estação de tratamento é composta dos tratamentos primário e secundário, portanto promove a remoção de sólidos grosseiros e de matéria orgânica, respectivamente. Pelo fato da ausência do tratamento terciário, no qual há remoção de agentes contaminantes, a COPASA é aempresa responsável pelo tratamento da água residual, monitoriza a toxicidade com testes ecotoxicológicos da água, atendendo à resolução 357/2005 do CONAMA. A unidade operacional possui duas lagoas anaeróbicas que, devido às suas menores dimensões e à maior profundidade, a fotossíntese ocorre lentamente, predominando, no entanto, as condições anaeróbias, consumindo mais oxigénio do que produzindo, uma vez que, as bactérias anaeróbias têm taxa metabólica e reprodução mais lenta do que as bactérias aeróbicas (Jardim, 2012) FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 40 8.7 Represa da Pampulha É um reservatório urbano localizado na cidade de Belo Horizonte – MG (coordenadas UTM WGS84 607050, 7804600), foi construído em 1936 e tinha por objetivo inicial ampliar o abastecimento de água na região norte de Belo Horizonte e amenizar os efeitos das chuvas que causavam inundações. Porém nos anos 50 iniciou um crescimento populacional desordenado e a represa sofreu um grande e veloz processo de degradação, (assoreamento, descarga de esgoto doméstico e industrial). Como consequência, desde os anos 70 a represa é exposta a eutrofização, a partir daí surgiram as florações de cianobactérias e crescimento de macrófitas aquáticas. E na década de 80, após seguidas florações de Cianobactérias a represa da Pampulha perdeu a função de abastecimento público. Sua bacia hidrográfica compõe a bacia hidrográfica do rio das Velhas, que por sua vez, é afluente da bacia do rio São Francisco. A área total do reservatório possui 97,91 km2 dividida entre os municípios de Belo Horizonte (44,9%) e contagem (55,1%). Sua fluviografia inclui 40 córregos, dos quais 19 estão em Belo Horizonte e 21 no município de contagem. O ribeirão Pampulha, onde está construído o reservatório, possui oito tributários diretos, com destaque para os afluentes Ressaca e Sarandi, que juntos respondem por cerca de 70% do aporte de água na lagoa da Pampulha (Resk, Bezerra-Neto & Pinto-Coelho, 2007). FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 41 9. Materiais e Métodos 9.1 Pontos de amostragem Fig. 7 - Representação dos pontos da amostragemFonte: IGAM, 2013 FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 48 Tabela 7 - Programa do gradiente de eluição Tempo (min) Canal A MeOH (%) Canal B Água ultra pura (%) 0 55 45 5 65 35 10 80 20 15 100 0 15.1 55 45 20 55 45 9.6 Extração, deteção e quantificação de cilindrospermopsina por HPLC-PDA Realizada com a amostra ambiental 4MMB e 9MMB do rio das velhas da cidade da Barra do Guacuí (Tabela 5). A amostra foi liofilizada. A deteção e quantificação de cilindrospermopsina, foi realizada da mesma maneira que para a amostra de Microcistina, entretanto foi utilizado como solvente de extração,água com Ácido Trifluoroacético (ATF a 0.1%). As frações purificadas de cilindrospermopsina foram então quantificadas no Water Alliance e2695 sistema de HPLC acoplado com um PDA 2998 numa coluna fase Atlantis® HILLIC (250 mm x 4,6 mm i.d., 5 µm) da waters a 40ºC.A gama de PDA foi de 210-400 nm com um comprimento de onda fixo de 262 nm. A eluição isocrática foi também uma solução de metanol a 50% contendo 2 mMde sódio 1heptanosulfonato mono – hidratado (99%) com um fluxo de 0,9 mL/min e um volume injetado foi de 20 µL.O sistema foi calibrado usando um conjunto de sete diluições padrão de cilindrospermopsina (0,08 a 0,5 µg/mL-1) em água ultrapura. O tempo de retenção do pico de cilindrospermopsinafoi de 7,35 min. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 49 9.7 Extração do DNA Amostras do cultivo Foram utilizadas amostras de células aderidas ao filtro de membrana que foram congeladas previamente a -20ºC para manter a integridade da amostra (Tabela 5). Para iniciar o processo de extração foi usado uma pinça e um bisturi para realizar a raspagem dos filtros (descongelados). O material (células) foi colhido em uma placa de petri e posteriormente, transferido para um eppendorf.Em seguida foi utilizado o kit Purelink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen), tendo seguido as indicações do fabricante para a extração de DNA genómico (Figura 9). Foi adicionado na amostra 540µL de buffer (genomic digestion) e 60µL de proteinase khomogeneizou e incubou no Eppendorf Thermomixer Compact a 55ºC overnight. Foiadicionado 20µl de RNAse A vortexzou e incubou durante 2 min a temperatura ambiente. Adicionou 200µl genomic lysis/Binding Buffer e vortexzou. Adicionou 200µl 96-100% etanol vortexzou durante 5 segundos. Foi adicionado 640 µL da soluçãolysate homogeneizou e centrifugou a 10,000 g por 1 minuto na temperatura ambiente. Em seguida a amostra foi lavada por duas vezes com 500µL da solução de lavagem e centrifugado a 10.000 g por 1 minuto na temperatura ambiente e descartado o tubo coletor. Logo adicionou 200 µL do tampão de eluição incubou por 1 minuto na temperatura ambiente e centrifugou 16.000 g por 1 minuto, descartou o tubo coletor e preservou o tubo com o DNA extraído que foi armazenado no frigorífico na temperatura -20ºC para integridade do material genético. Amostra ambiental Amostra com volume de 100ml foi homogeneizado e colhido 2ml para um eppendorf, encaminhado a centrífuga Eppendorf 5415R durante 5 min em rotação 16000g. Em seguida coletou o pellet.Foi utilizado o kit Purelink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen), tendo seguido as indicações do fabricante para a extração de DNA genómico (Figura 8). O pellet foi suspenso em 180µl (genomic digestion buffer). Logo foi adicionado 20µl de proteinase k, homogeneizou e incubou no Eppendorf Thermomixer Compact a 55ºC overnight. Foiadicionado 20µl de RNASE vortexzou e incubou durante 2 min a temperatura ambiente. Adicionou 200µl genomic lysis/Binding Buffer e vortexzou. Adicionou 200µl 96-100% etanol vortexzou durante 5 segundos. Foi adicionado 640 µL FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 50 da solução lysatehomogeneizou e centrifugou a 10.000 g por 1 minuto na temperatura ambiente. Em seguida a amostra foi lavada por duas vezes com 500µL da solução de lavagem e centrifugado a 10.000 g por 1 minuto na temperatura ambiente e descartado o tubo coletor. Logo adicionou 200 µL do tampão de eluição incubou por 1 minuto na temperatura ambiente e centrifugou 16.000 g por 1 minuto, descartou o tubo coletor e preservou o tubo com o DNA extraído que foi armazenado no frigorifico na temperatura -20ºC para integridade do material genético. Em seguida O marcador utilizado no trabalho foi o 1Kb plus DNA Ladder da Invitrogen (fragmentos de 100 bp a 12 Kb). Fig. 9 Purificação de DNA por adsorção em coluna 9.8 Amplificação do PCR O PCR foi usado na deteção de genes específicos para cianobactérias com amostras ambientais e isolados obtidos. Para além foi utilizado na deteção de genes codificadores de cianotoxinas.Os genes utilizados no presente estudo encontram-se listados na (tabela 5). Nas realizações do PCR foram utilizados par de primers num volume final de 20µl. Os reagentes foram obtidos através da Promega (Madison WI, USA).Cada reação de PCR se utilizou: 1x Go Taq buffer, 2,5 mM de MgCl2,10.0 pmol de cada primer, 125 µM de dNTP´s, 0,5 U de GoTaqR Flexi DNA polimerase e 10 ng de DNA utilizadas tanto nas amostras ambientais como nos isolados. As reações realizaram-se no termociclador ( Biometra Profissional Thermocycler). A amplificação do PCR foi confirmada por eletroforese num gel de agarose (UltrapureTM Agarose, Invictrogen) a 1,5% seguindo os procedimentos standard da eletroforese utilizando uma solução de tampão de Tris-Acetato EDTA (TAE 1%, BioRad-40mMácido acético, 1mM EDTA, pH 8,3).A voltagem usada foi de 100 Voltsnum período de 30 minutos. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 51 Em princípio foi adicionado ao gel de agarose 3 µl de brometo de etídio (BioRad) de uma solução stock de 10 mg/ml. Foram carregados nos poços de gel 10µl de DNA. 9.9 Sequenciamento Foi realizada amplificação do PCR dos fragmentos do gene específico para anatoxinaa com os primers anac gen forward ( 5´TCTGGTATTCAGTCCCCTCTAT 3´)anac gen reverse (5´CCCAATAGCCTGTCATCAA3´)(Tabela 6). A reacção de PCR foi preparada para um volume final de 40µL por amostra. Manteve-se a mesma proporção de reagentes na realização do PCR de modo a efetivar esta reação. A amplificação foi validada através da eletroforese de gel Red a 1%. A partir daí, os fragmentos que continham somente uma banda foram submetidos a um processo de purificação a partir do kit Rapid Tip for PCR Purification – Diffinity genomics - Made in USA. Foi coletado 25µL da amostra de PCR e em seguida o tratamento foirealizado conforme o protocolo do fabricante. Logo, foi feito um mix da amostra tratada com opar de primers específicos (anac gen F e anac gen R), ou seja, 5µL da amostra de PCR tratada e 5µL de cada primer separadamente. E em seguida foram identificados (etiquetados) conforme normas do laboratório responsável pelo sequenciamento e encaminhado ao mesmo. 9.10 Análise filogenética Afim de conhecer o grau de similaridade em um contexto filogenético das sequênciasde anatoxina-a das amostras estudas,foi usado o programa Mega 6.06 (6140226). A árvore filogenética foi calculada usando a metodologia de estatística Maximum Likelihood Tree.O teste foi realizado a partir da metodologia Bootstrap com base em 100 replicações, utilizando o modelo Tamura – Nei.Cada sequência foi usado de forma independente com a consulta em uma pesquisa BLASTno banco de dados de nucleotídeos do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 52 Tabela 8 Caracterização dos genes alvos utilizados no PCR ao longo do presente estudo. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 53 Controlos positivos: IZ 21Estirpe Microcystis aeruginosa; IZ 2 – Estirpe Microcystis aeruginosa; MEcyA 40 – Estirpe Aphanizomenon gracile; AQS – Estirpe Cylindrospermopsis raciborskii gDNA 309 – Estirpe Anabaena sp. 37 Legex-002 FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 54 10. Resultado e discussão 10.1Identificação dos géneros A partir das análises qualitativas das amostras, observaram-se variados géneros de cianobactérias, como: Sphaerocavum, Microcystis, Arthrospira, Planktothrix, Geitlerinema, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Dolichospermum, Oscillatoria, Radiocystis (Figura 11).Em alguns dos estudos realizados em Minas Gerais, os mesmos géneros foram referenciados por (Jardim et al., 2008; Jardim, Carvalho & Couto, 2010; Jardim et al., 2011) e para além,também foram relatados a presença do género Anabaena (Jardim & Viana, 2003; Jardim et al., 2007). Em São Paulo no alto Tietê Sant´Anna et al., (2007) relata a ocorrência de cianobactérias em cinco reservatórios analisados no período de seis anos, foram catalogados os géneros Microcystis, Sphaerocavum, Radiocystis, Synechocystis, Synechococcus, Merismopedia,Aphanocapsa, Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis, Geitlerinema, Limnothrix, Planktothrix.No nordeste do Brasil no Estado do Pernambuco, Bittencourt-Oliveira et al., (2014) observou Microcystis, Planktothrix, Cylindrospermopsis, Geitlerinema, Sphaerospermopsis e Merismopedia. A ocorrência de florações de cianobactérias em corpos d´água para abastecimento público tem sido cada vez mais frequente, favorecido pela situação do ambiente, que se encontra eutrofizado, rico em nutrientes, como o fósforo e o nitrogénio (Barreto et al.,2013). O clima da região tropical também é um fator que estimula o desenvolvimento das cianobactérias. Encontra-se duas estações, uma fria e seca no período do inverno que corresponde aos meses de abril a setembro e outra quente e chuvosa no período do verão nos meses de outubro a março. Entretanto, as florações ocorrem em diversas regiões do mundo, inclusive no clima temperado. A temperatura e pH tambémsão fatores importantes para a proliferação das cianobactérias.Segundo Muller e colaboradores, (2009) os géneros de cianobactérias que se destacam são Microcystis, Anabaena, Aphanizomenon, Planktothrix, Cylindrospermopsis e Nodularia, correspondendo algumas das estirpes encontradas ao longo do trabalho realizado. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 55 10.2 Isolamento e cultura dos géneros Dentre os géneros cultivados, as condições laboratoriais foram favoráveis para o crescimento das cianobactérias da ordem Nostocales 53%, seguida pela ordem Oscillatoriales 35% e logo pela Chroococcales 12% (Figura10). Na ordem Nostocales destacaram-seCylindrospermopsis e Aphanizomenon. Na ordem Oscillatoriales houve crescimento favorável do Planktothrix, Arthrospira e Geitlerinema. Já para as Chroococcales ocorreu crescimento somente para o género Microcystis.Segundo técnicas desenvolvidas para procedimentos de isolamento, é aconselhável que para tal procedimento devem ser utililizado uma variabilidade de meio de cultura para garantir melhor resultado, a não ser que já conheça previamente qual o melhor meio para o cultivo da estirpe de interesse. Porém para as culturas deste trabalho foi usado somente o meio ASM-1 com nitrogénio e ASM-1 com 10% de nitrogénio. O meio de cultura com 10% de nitrogénio seria para induzir as Nostocales a desenvolverem as células especiais, como heterocito e acineto. Pois, a formação dos heterocitos está relacionada ao teor de nitrogénio do meio, quanto mais baixa a concentração de nitrogénio, maior o número de heterocitos formados para promover a fixação de nitrogénio (Sant´Anna et al., 2006). E muitas das espécies da ordem Nostocales são identificadas morfologicamente a partir da formação e localização do heterocito (Figura 11 C e I). Por exemplo, Cylindrospermopsis tem tricomas com heterocitos terminais e acinetos subterminais. O género Aphanizomenon possui heterocitos (Figura 11 G) e acinetos subterminais com tricoma atenuados. Portanto, as cianobactérias que possuem para além das células vegetativas as células especiais (heterocito e acineto), são denominados heterocitados. As demais cianobactérias filamentosas com apenas células vegetativas são chamadas de homocitados, como o género Planktothrix (Sant´Anna et al., 2006).O procedimento de isolamento, cultivo e manutenção de estirpes em laboratório podem promover a seleção de linhagens, conforme o metabolismo mais adequado para as condições laboratoriais oferecidas, tais como; concentrações de nutrientes, intensidade luminosa, altas temperaturas e altos valores de pH; podendo dessa forma selecionar estirpes tóxicas ou não tóxicas (BittencourtOliveira, 2003). FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 56 . Fig. 10 Distribuição das cianobactérias isoladas no presente estudo Tabela 9 Estirpes identificadas e submetidas a cultura. CODIGO LOCAL CORPO HÍDRICO ESTIRPES 1 HBRP Belo Horizonte Represa Pampulha Microcystis aeruginosa 2 HBRP Belo Horizonte Represa Pampulha Cylindrospermopsis spp 3 HBME Medina Ribeirão São Pedro Cylindrospermopsis raciborskii 4 HBNA Nanuque Lagos dos Namorados Cylindrospermopsis spp 5 HBCL Carmo do Rio Claro Represa de Furnas Cylindrospermopsis spp 6 HBCL Carmo do Rio Claro Represa de Furnas Cylindrospermopsis spp 7 HBCL Carmo do Rio Claro Represa de Furnas Aphanizomenon spp 8 HBRF Pirapora Rio São Francisco Cylindrospermopsis spp 9 HBRF Pirapora Rio São Francisco Aphanizomenon spp 10 HBRF Pirapora Rio São Francisco Cylindrospermopsis spp 11 HBRP Belo Horizonte Represa Pampulha Geitlerinema spp 12 HBRP Belo Horizonte Represa Pampulha Arthospira spp 13 HBRP Belo Horizonte Represa Pampulha Planktothrix agardhii 14 HBRP Belo Horizonte Represa Pampulha Microcystis sp., Microcystis aeruginosa, Cylindrospermopsis raciborskii 15 HBME Medina Ribeirão São Pedro Geitlerinema spp 16 HBRV B.Guacuí Rio das Velhas Microcystis aeruginosa 17 HBVP V. Palma Rio das Velhas Microcystis sp., Microcystis aeruginosa 18 HBMT Matozinhos ETE de Matozinhos Planktothrix agardhii 19 HBLA Lassance Rio das Velhas Arthospira spp Obs.: Amostras 14 e 17 referem-se a amostras ambientais e as demais amostras são isolados. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 57 Fig. 11. Microfotografias óptica da morfologia dos géneros de cianobactérias, representando a diversidade nos rios de Minas Gerais. A.Microcystis aeruginosa(200x) rio das Velhas (bainha de mucilagem marcada pelo uso do nanquim); B.Microcystis aeruginosa(200x) Represa Pampulha (bainha de mucilagem marcada pelo uso do nanquim); C. Cylindrospermopsis sp. (400x) Bacia do Mucuri (presença de heterocito); D. Planktothrix agardhii (200x) Represa Pampulha; E. Geitlerinema sp. (200x); F. Arthrospira sp. (200x) Represa Pampulha (foto com epifluorescência); G. Aphanizomenon sp. (400x) Represa de Furnas (presença de heterocito intercalar); H. Sphaerocavum sp.(200x) rio das Velhas; I. Cylindrospermopsis raciborskii (400x) Represa Pampulha (presença de heterocitos terminais); J. Cylindrospermopsis raciborskii (200x) rio São Francisco (a. Presença do heterocito; b. Formação do heterocito). B A D E C G J F H b a I FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 64 pelo fato de não haver formação de células especiais (heterocito e acineto), o filamentoresponsável por essa Fig. 17. Índice de similaridade referente a amostra do rio das Velhas toxina tenha passado despercebido, ou também há hipótese das células terem sofrido ruptura e a toxina ter se libertado para o meio, uma vez que a amostra foi transportada do Brasil a Portugal, apesar do cuidado nas condições para assegurar o transporte das amostras, pode ter ocorrido a lise das células. Devido a escassez de material genético não foi possível realizar ensaio molecular para identificar o gene para espécie. A técnica HPLC/PDA é dispendiosa e trabalhosa, porém ao final do procedimento garante precisão nos resultados, pois é capaz de detetar a toxina e suas variantes, a partir dos padrões utilizados, e ainda se tratando de uma amostra purificada livre de contaminantes, ao contrário da técnica ELISA,que não permite detetar as variantes e quando se trabalha de uma amostra ambiental pode haver outros compostos que venham alterar o resultado, podendo até resultar um falso positivo. Contudo, a técnica ELISA é muito utilizada no Brasil pelas empresas de saneamento; corresponde as exigências da legislação é de fácil manipulação e o procedimento é rápido. 10.6 Análise molecular – extração de DNA, amplificação do PCR, sequenciamento e filogenia De acordo com a (Figura 18) é possível identificar as amostras (01 HBRP, 14HBRP, 16HBRV e 17HBVP) que foram positivas para o gene DNA gyrase para a espécie Microcystis aeruginosa. A análise foi validada com o controlo positivo IZ 21 (Microcystis aeruginosa). As amostras trata-se da represa da Pampulha e do rio das Velha, essa espécie de cianobactéria é frequente e responsável pelas florações nesses corpos d´agua. As amostras 14 e 17 referem-se a amostras ambientais e as amostras 01 e 16 referem-se a estirpes isoladas. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 65 Fig. 18. Resultado PCR para Microcystis aeruginosa A Tabela 12 representa o resultado do PCR referente aos genes das cianotoxinas testadas para o cluster de genes para microcistina. Todas as amostras analisadas demonstraram ser toxigénicas, pois expressaram parte dos fragmentos do gene mcy. As amostras positivas para o fragmento do gene mcyA indicam forte evidência de produzir microcistina (Hisbergues et al., 2003). Entretanto, quando o operon da microcistina não está presente ou parte do cluster mcy encontra-se incompleta, possivelmente a estirpe não é capaz de produzir a toxina (Regueiras, 2009). No entanto no teste ELISA a amostra14HBRP demonstrou uma concentração de 0.9µg/Le a amostra 16HBRV uma concentração de 1.4µg/La 5.9µg/L para microcistina. No entanto, o resultado da análise molecular para o cluster mcy demostrou-se incompleto para alguns fragmentos do gene mcy. Bittencourt-Oliveira et al., (2003) afirma que os genótipos responsáveis por produzirem toxinas nem sempre são expressos, talvez seja uma hipótese para ambas as amostras (14HBRP e 16HBRP). Contudo, as amostras (1HBRP e 17HBVP) obtiveram resultados negativos para toxina na técnica ELISA e na análise molecular o cluster do gene mcy demostrou-se incompleto, sendo assim, essas duas amostras se enquadra na afirmação citada acima; na incapacidade da estirpe em produzir toxina, a partir da ausência de algum fragmento do gene mcy. A amostra 18HBMT corresponde a espécie Planktothrix agardhii e no teste molecular foi realizada somente gene mcyA, resultando em uma espécie toxigénica, no entanto no método analítico (ELISA) para microcistina ficou abaixo do limite de deteção. Muitos estudos têm relatado essa situação, em que o cluster do gene mcy é encontrado, porém a presença da toxina não é confirmada por métodos analíticos; tal fato pode esta associado a uma concentração abaixo do limite de deteção do método utilizado (Bittencourt-Oliveira et al., 2010). Considerando que esta amostra (18HBMT) trata-se de uma estação de tratamento de água residual, e sendo efluente do ribeirão da Mata, afluente do rio das Velhas é preciso que seja constantemente monitorado para evitar os pontenciais riscos adversos ao meio ambiente e consequentemente a saúde de animais e até mesmo do ser humano. 01 16 14 500 400 FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 66 Tabela 12. Resultado PCR para conjunto génico mcy (toxina microcistina) Amostras mcyA mcyB mcyC mcyD mcyE mcyG 01 HBRP - - - - - + 13HBRP - 14 HBRP + - + - + - 16 HBRV + - + + - - 17 HBVP - - + - - - 18 HBMT + Ambas as amostras 3HBME e 14HBRP foram positivas para o gene da espécie Cylindrospermopsis raciborskii e para o gene da toxina cilindrospermopsina (Tabela 13), no entanto no ensaio Elisa não foi detetada a toxina cilindrospermopsina. Portanto essas estirpes mostraram ter o potencial genético para a produção da toxina, todavia, devido às condiçõesde exposição, as toxinas não foram produzidas e detetadas no momento da avaliação, o que não quer diz, que não poderam vir a produzir quando estiverem expostas em condições ambientais favoráveis para a produção das toxinas (Bittencourt-Oliveira, 2003). O método molecular para o gene da saxitoxina (Tabela 13) foram todas negativas, entretanto para o ensaio ELISA de onze amostras, novedemonstraram positivas (Tabela 11). A hipótese para esse resultado pode ser atribuído a questão da seleção de estirpes tóxicas e não-tóxicas existente numa mesma espécie, pois o ensaio molecular foi realizado com cultura de uma segunda repicagem. Contudo a manutenção dessas estirpes em laboratório pode ter promovido a seleção de linhagens não-tóxicas. Ou outra hipótese para o resultado negativo para o gene da saxitoxina seria a pequena quantidade de DNA presente nas amostras tornando a análise inviável, pelo fato da análise molecular também ter um limite de deteção. Talvez o fragmento do clusterutilizado na análise não tenha correspondido ao DNA das amostras. Hoff-Risseti et al., (2013) afirma a presença do gene sxtl e cyr numa estirpe isolada de Cylindrospermopsis raciborskii brasileira e sequências do gene cyrA foram traduzidos em aminoácidos e as funções das proteínas confirmaram a sua identidade como sendo genes da síntese de cilindrospermopsina, sendo relatado pelo autor que os resultados obtidos neste estudo foi o primeiro registo de cilindropermopsina encontrado em estirpe isolada do Brasil. FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 67 Tabela 13. Resultado PCR´s ( sxtl, anaC, Cyn/cyrB e Cyn/cyrC) para as amostras do presente estudo Amostras sxtl anaC Cyn cyrB Cyn cyrC 1 HBRP + 2 HBRP - - 3 HBME - + - 4 HBNA - - - 5 HBCL - - - 6 HBCL - - - 7 HBCL - - - - 8 HBRF - - - 9 HBRF - + - - 10 HBRF - + - - 11 HBRP 12 HBRP + 13 HBRP - + 14 HBRP - + - + 15 HBME 16 HBRV + 17 HBVP - + - - 18 HBMT + 19 HBLA + FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 68 Na (figura 19) é possível verificar as amostras (4MMB e 9MMB) positivas para gene ps para cilindrospermopsina. Estas amostras foram da primeira coleta realizada a jusante do rio das Velhas na cidade da Barra do Guaicuí no município de Várzea da Palma-MG. A partir desse resultado do ensaio molecular, que se confirmou a presença da toxina com o ensaio da cromatografia. Uma vez, que o ensaio molecular indicou a presença do gene, mas não havia garantia da produção da toxina. A toxina estava solúvel no meio e não foi possível identificar que espécie a produziu. Para esse trecho do rio das Velhas é a primeira vez que há confirmação da toxina cilindrospermopsina, apenas há referências para saxitoxina, como já foram referidos anteriormente (Jardim et al., 2008). Segundo BittencourtOliveira, (2011) foi detetado em florações de cianobactérias em 3 reservatórios, no nordeste do Brasil, as análises foram realizadas com ensaio molecular (cyrB e cyrC) e o teste ELISA; e a autora relata ser o primeiro estudo com resultado positivo para cilindrospermopsina em água de abastecimento público no Brasil. E refere ainda, que a presença do gene pks e ps para cilindrospermopsina é indicação que a estirpe tem o gene para cilindrospermopsina. Fig. 19. Resultado do PCR para gene cyrB - Cilindrospermopsina 650 500 9 M M B 4 M M B FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 69 A (Figura 20) demonstra o resultado do PCR, que determina o potencial genético para a produção de anatoxina–a nas amostras (1HBRP, 9HBRF, 10HBRF, 12HBRP, 13HBRP, 14HBRP, 16HBRV, 17HBVP, 18HBMT e 19HBLA) que foram validadas com o controlo positivo. Segundo a legislação brasileira, Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde, exige monitoramento somente para microcistina e saxitoxina.Para cilindrospermopsina e anatoxina-a(s) somente quando for detetada a presença de géneros de cianobactérias potencialmente produtoras da toxina. Portanto não há exigência na legislação federal quanto anatoxina-a, mesmo existindo pesquisas demonstrando suaação nociva a saúde humana e de animais (Molica & Azevedo, 2009 ; Rodríguez et al., 2006). Asamostras (9HBRF, 14HBRP, 16HBRV, 17HBVP, 18HBMT e 19HBLA) foram sequenciadas, e submetidas a análise filogenética. Fig. 20. Resultado do PCR para anatoxina-a. A (Figura 21) representa o resultado da análise filogenética, demonstrando que não ocorreu similaridade genética entre as amostras do presente trabalho e as amostras do banco de dados fornecido pelo BLAST,demonstraram uma distância genética entre as estirpes analisadas. Provavelmente devido a diferença biogeográfica das amostras em estudo. As amostras do banco genómico correspondem a estirpes da Europa e as amostras do presente trabalho do Sul da América (Brasil). No entanto, entre as amostras (16HBRV, 18HBMT, 19HBLA) houve uma similaridade de 100% numa amostragem com base em 100 replicações. São amostragens de locais distintos, porém fazem parte da Sub-bacia do rio das Velhas.Stuken & Jakobsen, (2010) relata que a sequência de nucleótidos dosdiferentes genes mcy tem sido demonstrado uma variação entre 67 e 81%; já a similaridadeda saxitoxina 1 7 - FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 70 produzida por diversos géneros de cianobactérias de água doce comparadas entre os genes de sxt de Aphanizomen, Anabaena e Cylindrospermopsis revelou uma identidade de nucleótidos de 53 um 99% dos diferentes genes ortólogos.Os mesmos autores ainda relatam que os genes envolvidos na síntese de cyn são altamente conservadas, não só entre estirpes da mesma espécie, mas também entre as estirpes de géneros diferentes. Fig. 21 Análise filogenética da sequência do gene anatoxina-a Amostras da Europa Amostras do Brasil FCUP Ocorrência de cianobactérias e cianotoxinas na água de cinco importantes rios no Estado de Minas Gerais - Brasil 71 11 Conclusão Com base na pesquisa realizada pode-se concluir:  O método molecular é uma ferramenta de grande importante na identificação de cianobactérias, na avaliação do potencial tóxico de genes específicos para as espécies e para deteção de genes envolvidos na produção de toxinas.  É um recurso que permite detetar precocemente florações tóxicas, facilita a monitorização de ambientes aquáticos e minimiza riscos para saúde pública.  As informações geradas no presente estudo fornecem um contributo para o conhecimento da diversidade das cianobactérias e cianotoxinas nos corpos hídricos tratados neste estudo.  Os resultados obtidos proporcionarão uma nova visão relativa a futuras monitorizações para evitar riscos para saúde pública nas bacias hidrográficas em estudo. 12. 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