Perfil de distribuição no rato de nanopartículas de ouro com diferentes revestimentos

ii “Perfil de distribuição no rato de nanopartículas de ouro com diferentes revestimentos.” Tiago André Coutinho Morais Dissertação de Mestrado em Toxicologia Analítica, Clínica e Forense submetida à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto Trabalho realizado sob orientação de: Professora Doutora Maria de Lourdes Pinho de Almeida Souteiro Bastos Universidade do Porto, Porto, Portugal Setembro, 2010 iv É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE. v "There is a theory which states that if ever anyone discovers exactly what the Universe is for and why it is here, it will instantly disappear and be replaced by something even more bizarre and inexplicable. There is another theory which states that this has already happened.” Douglas Adams in “The Hitchhikers Guide To The Galaxy” vi vii À minha família e aos meus amigos viii ix AGRADECIMENTOS __________________________________ Antes de mais, quero agradecer à Professora Doutora Maria de Lourdes não só pela oportunidade que me deu para realizar este trabalho, mas também por toda a sua orientação científica e paciência dispendida comigo em todo este projecto; Agradeço também todo o esforço, dedicação e empenho da Engenheira Elisa, que apesar de ter que me aturar todos os dias, nunca desistiu de encontrar soluções perante as adversidades decorrentes do trabalho e de me providenciar com apoio moral e sábios concelhos; À Doutra Sónia Fraga pela valiosa ajuda nas injecções e por ser uma fonte de boa disposição apesar de todos os pequenos problemas que fomos defrontando; À Doutra Helena Carmo pelo auxilio prestado e pelas maratonas experimentais sem as quais não poderia ter terminado este trabalho; À todos os demais membros e colaboradores do Serviço de Toxicologia da Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto. Não só por me terem acolhido no laboratório e terem proporcionado um óptimo ambiente de trabalho, mas também por tentarem ajudar face às dificuldade iniciais, mesmo depois de se terem hpercebido que os ratos não geravam ouro…; A Professora Doutora Eulália Pereira e a Leonor Soares por doarem gentilmente as nanopartículas utilizadas neste trabalho e o seu tempo para as sintetizar; Ao Professor Doutor José Duarte pela disponibilidade em analisar as amostras por microscopia de transmissão atómica; Uma palavra em especial também para a Dª Ana Margarida por me ter prestado auxílio no biotério e me ter ajudado a tratar dos animais e com a descontaminação do material; Quero também agradecer a todos os meus companheiros de laboratório, sejam investigadores ou alunos, por todo o apoio prestado e gargalhadas partilhadas. À Luciana um obrigado em especial, não só pela amizade e por ser a minha correctora oficial, como xvi xvii Índice AGRADECIMENTOS ...........................................................................ix RESUMO .............................................................................................xi ABSTRACT ....................................................................................... xiii ÍNDICES ............................................................................................ xv Índice ................................................................................................................................. xvii Índice de figuras ................................................................................................................. xxi Índice de tabelas ............................................................................................................... xxiii LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................. xxv ENQUADRAMENTO ........................................................................ xxxi I. INTRODUÇÃO .................................................................................. 1 I.1 Exemplos de NPs .............................................................................................................. 3 I.1.2 Nanopartículas de Ouro ................................................................................................................... 5 I.2 Características físico-químicas das NPs ........................................................................... 9 I.3 Diferentes aplicações das NPs ........................................................................................ 10 I.4 Biocinética das NPs ........................................................................................................ 13 I.4.1 Absorção .......................................................................................................................................... 13 I.4.1.1 Absorção pulmonar das NPs ........................................................................................................ 13 I.4.1.2 Absorção das NPs no tracto gastrointestinal .............................................................................. 15 I.4.1.2.1 Transporte paracelular .............................................................................................................. 16 I.4.1.2.2 Transporte transcelular ............................................................................................................ 17 xviii I.4.1.2.2.1 Transporte pelos enterócitos ................................................................................................ 18 I4.1.2.2.2.2 Transporte pelas Células M ................................................................................................ 19 I.4.1.2.3 A barreira mucosa intestinal ................................................................................................... 22 I.4.1.3 Absorção dérmica ........................................................................................................................ 22 I.4.1.3.1 A estrutura epidérmica............................................................................................................. 22 I.4.1.3.2 Características físico-químicas das NPs que influenciam a absorção dérmica .................... 24 I.4.1.3.3 NPs lipídicas e poliméricas ...................................................................................................... 25 I.4.1.3.3.4 NPs metálicas ........................................................................................................................ 26 I.4.2 Distribuição ................................................................................................................ 30 I.4.2.1 Influência do revestimento das NPs na distribuição ................................................................ 31 I.4.2.2 Influência do tamanho das NPs na distribuição ....................................................................... 35 I.4.2.3 Influência da carga da superfície das NPs na distribuição ....................................................... 37 I.4.2.4 Efeito da forma e do núcleo das NPs na sua distribuição ........................................................ 38 I.4.2.5 Targeting ..................................................................................................................................... 40 I.4.3 Metabolismo & Excreção ............................................................................................. 43 I.4.3.1 Metabolismo das NPs ................................................................................................................. 43 I.4.3.2 Excreção das NPs ........................................................................................................................ 46 I.5 Nanotoxicidade ...............................................................................................................49 I.5.1 Estudos in vitro .............................................................................................................................. 49 I.5.2 Estudos in vivo ................................................................................................................................ 51 II. OBJECTIVOS ................................................................................. 55 III. SECÇÃO EXPERIMENTAL ........................................................... 59 II.1 Síntese e caracterização das Au-NPs ............................................................................. 61 II.2 Reagentes e materiais ................................................................................................... 62 II.3 Instrumentação e condições analíticas ......................................................................... 62 II.4 Validação do método ..................................................................................................... 63 xix II.5 Quantificação de Au nas suspensões de Au-NPs .......................................................... 66 II.6 Estudos de biodistribuição das Au-NPs ........................................................................ 66 II.7 Preparação das amostras para análise por GFAAS ....................................................... 67 II.8 Análise por TEM ........................................................................................................... 67 II.9 Análise estatística .......................................................................................................... 67 IV. RESULTADOS ............................................................................. 69 III.1 Perfil de biodistribuição de Au-NPs revestidas com citrato ao longo de 24 h. ............ 71 III.2 Citrato Vs 11-Mua ........................................................................................................ 73 III.3 Comparação do perfil de biodistribuição das Au-NPs revestidas com citrato e com os diferentes péptidos, 24 h após a injecção. ........................................................................... 74 III.4 – Análise dos tecidos por TEM. ................................................................................... 77 V. DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................... 79 IV.1 Perfil de Distribuição das Au-NPs revestidas com citrato ........................................... 81 IV.2 Perfil de distribuição das Au-NPs revestidas com péptidos ........................................ 83 IV.3 Distribuição intracelular das Au-NPs .......................................................................... 85 IV.4 Considerações finais .................................................................................................... 86 VI. REFERÊNCIAS BIBLGIOGRÁFICAS ............................................ 89 xx xxi Índice de figuras Figura I 1 – Fotografias de suspensões aquosas de Au-NPs esféricas (painel superior) e AuNPs nanobastonetes (painel inferior), estando as respectivas imagens das Au-NPs obtidas por microscopia de transmissão electrónica (TEM) representadas de a-j (a barra de escala tem 100 nm). Para as esferas o tamanho das Au-NPs varia de 4 a 40 nm (a-e), enquanto para os nanobastonestes os tamanhos variam de 1.3-5 nm (f-j) e 20 nm (k) . Estas imagens são representativas da variação das propriedades ópticas em função da forma e do tamanho das Au-NPs (adaptado de [15]). ............................................................................. 7 Figura I 2 – Imagens obtidas por TEM de A) Au-NPs esféricas com15 nm B) Au-NPs esféricas com 45 nm C) nano-jaulas de Au com 33 nm e D) nano-jaulas de Au com 55 nm (adptado de [17]). .................................................................................................................. 8 Figura I 3 – Diagramas esquemáticos das diferentes configurações de PEG quando este reveste as NPs. Em (a) a baixa cobertura da superfície da nanopartícula por parte das moléculas de PEG leva-as a adoptarem a conformação em cogumelo, onde as moléculas de PEG estão mais próximas da superfície da nanopartícula. Em (b) a extensa cobertura da superfície da nanopartícula com as moléculas de PEG leva-as a adoptarem a conformação em “escova”, ficando mais afastadas da superfície. (adaptado de [23]). ............................ 33 Figura III 1 – A) Percentagem de Au injectado sob a forma de Au-NPs revestidas com citrato encontrada em cada um dos tecidos analisados para os diferentes tempos: 30 min, 2 h, 6 h e 24 h (n=4). Os tecidos analisados foram o baço, cauda, cérebro, coração, fígado, intestinos (duodeno), músculo, osso (fémur), pulmão, rim, sangue total e testículos. B) Variação da percentagem de Au em alguns tecidos (baço, fígado, pulmão e sangue total) nos tempos já referidos. Os resultados estão apresentados como % de Au injectado ± SEM (*<0,05 vs Figado 30 min,$ <0,05 vs Figado 2 h, # <0,05 vs Figado 6 h, £ <0,05 vs Figado 24 h). ................................................................................................................................... 71 Figura III 2 – Comparação da percentagem de Au injectado encontrada em cada um dos órgãos analisados para as NPs com revestimentos de citrato e 11-Mua (n=4), 24 h após a injecção. Os tecidos analisados foram o baço, cauda (total), cérebro, coração, fígado, intestinos (duodeno), musculo, osso (fémur), pulmão, rim, sangue total e testículos. Os resultados estão apresentados como % de Au injectado ± SEM. ....................................... 73 xxii Figura III 3 – Percentagem de Au injectado encontrada em cada um dos tecidos analisados para as NPs com diferentes revestimentos utilizados: citrato, CALND, CALNN e CALNS (n=4), ao fim de 24 h. Os tecidos analisados foram o baço, cauda, cérebro, coração, fígado, intestinos (duodeno), musculo, osso (fémur), pulmão, rim, sangue total e testículos. Os resultados estão apresentados como % de Au injectado ± SEM (*<0,05 vs Au-NPs revestidas com citrato). ......................................................................................... 74 Figura III 4 - A) Microfotografia de TEM representativa de tecidos hepáticos, obtidas 24 h após a injecção de Au-NPs revestidas com citrato. As NPs encontram-se dentro de endossomas. B) Microfotografia de TEM representativa de tecidos hepáticos, obtidas 24 h após a injecção de Au-NPs revestidas com 11-Mua. As NPs encontram-se dentro de endossomas. C) Microfotografia de TEM representativa de tecidos hepáticos, obtidas 24 h após a injecção de Au-NPs revestidas com CALND. As NPs encontram-se dentro de endossomas. D) Microfotografia de TEM representativa de tecidos hepáticos, obtidas 24 h após a injecção de Au-NPs revestidas com CALNS. As NPs encontram-se dentro de lisossomas secundários. ...................................................................................................... 77 xxiii Índice de tabelas Tabela II 1 – Resumo das principais características das Au-NPs usadas no estudo de distribuição in vivo. ............................................................................................................ 61 Tabela II 2 – Resumo das condições analíticas usadas para a quantificação de Au. ......... 62 Tabela II 3 – Resumo dos diferentes parâmetros de validação do método. ...................... 63 Tabela II 4 - Resultados estatísticos para a recuperação de Au obtidos pela adição de padrões a amostras dos diferentes órgãos recolhidos ........................................................ 65 Tabela III 1 – Distribuição de Au nos diferentes órgãos de rato, aos diferentes tempos analisados, após a injecção de Au-NPs revestidas com citrato. Os resultados são apresentados em % de dose injectada. ............................................................................... 72 Tabela III 2 – Distribuição de Au nos diferentes órgãos após a injecção com Au-NPs com os diferentes revestimentos, 24 h após injecção. Os resultados são apresentados em % de dose injectada. .................................................................................................................... 76 xxiv xxv LISTA DE ABREVIATURAS xxxii xxxiii ENQUADRAMENTO __________________________________________ Esta dissertação encontra-se dividida em seis secções principais: o Secção I: Introdução o Secção II: Objectivos o Secção III: Secção experimental o Secção IV: Resultados o Secção V: Discussão e considerações finais o Secção VI: Referências bibliográficas xxxiv I. INTRODUÇÃO I. Introdução 3 A nanotecnologia dedica-se ao desenvolvimento, produção e aplicação de materiais numa escala atómica, molecular e macromolecular de forma a produzir novas estruturas com um tamanho compreendido entre algumas centenas de nanómetros até a dezena de nanómetros [1]. Assim, para serem consideradas NPs (NPs), as partículas têm que ter sensivelmente 100 nanómetros (nm) de diâmetro ou menos. A nanotecnologia tem sido alvo de um interesse crescente durante os últimos anos, projectando-se que o mercado desta tecnologia chegue a atingir valores tão elevados como mil milhões de dólares por volta do ano 2015 [2]. No instituto nacional da nanotecnologia dos Estados Unidos da América prevêem-se 4 “eras” para a nanotecnologia, sendo a primeira aquela em que nos encontramos actualmente, em que as nanoestruturas são passivas e estão programadas apenas para fazer uma tarefa. A segunda era envolverá a produção de NPs mais complexas que possam efectuar 2 ou mais tarefas, como por exemplo, servirem de biosensores ao mesmo tempo que servem de veículo para um determinado fármaco, possibilitando a sua libertação controlada. Por fim, a terceira e a quarta eras abrangerão a criação de sistemas complexos envolvendo as NPs e até a replicação dos sistemas e funções celulares [2]. Com o investimento na descoberta e produção de novas NPs expande-se não só os tipos de NPs disponíveis mas também o seu uso. Assim, esta tecnologia tem vastas aplicações comerciais, seja nos cosméticos, na electrónica e até na indústria têxtil ou no fabrico de pneus. No entanto, é o seu potencial na área da medicina que suscita maior interesse da comunidade científica, tendo até cunhado um termo para esta aplicação: a nanomedicina. O uso das NPs neste campo é tão variado como os tipos de NPs existentes, podendo ser utilizadas como ferramentas de diagnóstico, como veículos de fármacos ou ainda como agentes terapêuticos. Existe então uma grande variedade de NPs, cada uma com as suas características particulares e, como tal, podendo ser usadas para determinadas situações em detrimento de outras. I.1 Exemplos de NPs Existem diferentes tipos de NPs, com diferentes constituintes e propriedades, não existindo ainda na literatura um consenso sobre a sua nomenclatura. Uma das classificações recorrentes é dividir as NPs pelo seu constituinte mais básico, isto é, pelo seu núcleo ou pelo seu material base. As NPs constituídas por lípidos serão os lipossomas, as NPs constituídas por polímeros podem ser NPs poliméricas ou micelas, podendo assumir diferentes formas. Outros tipos de NPs bastante comuns são as NPs compostas por carbono ou então por materiais inorgânicos como por exemplo a silicia. Existem 4 também NPs constituídas por materiais semi-condutores, as quantum dot (QD) ou NPs com um núcleo metálico. Os lipossomas são NPs compostas por uma bicamada lipídica, disposta como uma membrana celular, o que forma um interior aquoso que pode servir para transportar fármacos ou marcadores para fins de diagnóstico. Existem 3 tipos de lipossomas que são classificados consoante o seu tamanho e a quantidade de camadas lipídicas (lamelas) que contêm: vesículas pequenas unilaminares ou oligolaminares, vesículas grandes unilaminares e vesículas multilaminares. Recentemente, estes tipos de NPs têm sido revestidas, de forma a terem um maior tempo de circulação, tendo sido apelidadas de NPs furtivas (stealth) [3]. As NPs poliméricas são, tal como o nome indica, constituídas por blocos de polímeros de um ou mais tipos. Estas NPs podem assumir diferentes características dependendo dos polímeros utilizados e da forma como são síntizadas. Estas NPs podem ser: NPs poliméricas esféricas, contendo um núcleo de uma matriz polimérica (geralmente de polímeros biodegradáveis ou polímeros naturais); Nanocápsulas poliméricas, em que o núcleo da NP é uma solução oleosa ou aquosa, rodeado de uma membrana polimérica; Micelas poliméricas que são constituídas por polímeros anfifílicos e geralmente revestidas por uma camada de poli-etileno glicol (PEG) onde se podem ancorar diferentes ligandos [4]. A conjugação destes polímeros com proteínas reduz a imunogenicidade e prolonga o tempo de semi-vida deste tipo de NPs no organismo [5]. Nanoemulsões são NPs semelhantes a uma mistura óleo-água, mas que são estabilizadas com surfactantes de forma a se manterem estáveis, podendo assim o material lipofílico ser dissolvido num solvente orgânico e depois emulsionado numa fase aquosa [6]. As NPs à base de carbono podem dividir-se em 2 grandes grupos: os nanotubos e os fulerenos. Estas últimas partículas são estruturas poligonais, contendo 60 ou 82 átomos de carbono, podendo ser facilmente funcionalizados e tendo assim pontos de contacto extensos com a superfície celular [7]. Os nanotubos têm sido utilizados com vários propósitos, quer no campo da medicina quer na biotecnologia, devido à sua condutividade eléctrica e a sua resistência mecânica. Têm uma forma cilíndrica, podendo ser formados por uma ou mais paredes, sendo que os nanotubos contendo várias paredes são maiores e consistem, essencialmente, em nanotubos de parede simples, uns dentro dos outros [8]. As NPs de cerâmica são sistemas inorgânicos com características porosas e podem ser compostas por partículas de sílica, dióxido de titânio (titânia) ou óxido de alumínio I. Introdução 5 (alumina). Também podem ser produzidas por desgaste dos materiais usados nas cirurgias de substituição óssea uma vez que as próteses são feitas deste tipo de material, e com o desgaste podem desagregar-se pequenas partículas do material mãe [9]. As QD contêm no seu núcleo um material semi-condutor, normalmente constituídos de ligas de metais dos grupos III-V, como por exemplo ligas de índio e arsénio ou então dos grupos II-IV, como zinco e enxofre. Sendo de importância crucial para este tipo de NPs que sejam revestidas com outro tipo de moléculas de modo a permitir a sua dispersão e impedir a interacção do organismo com os metais pesados que compõem o núcleo destas partículas [10]. As NPs com núcleo metálico, tal como óxido de ferro, ouro ou prata são normalmente revestidas por um agente, como por exemplo fosfolípidos, que vão impedir a sua agregação, aumentado assim o seu tempo de semi-vida na circulação sanguínea [11]. I.1.2 Nanopartículas de Ouro Uma vez que nos estudos realizados no âmbito desta dissertação as NPs utilizadas são inorgânicas, metálicas e mais exactamente de ouro (Au), a história centenária do Au coloidal, ou nano Au, será referida de seguida. O uso de Au coloidal encontra-se bem descrito ao longo dos séculos, seja como material de coloração para fazer vidro com cor rubi no século 5 AC, usado por alquimistas que o tentavam reduzir com todo o tipo de substâncias ou usado na Índia como parte da “medicina Ayurveda” [12]. Em termos de investigação metódica às propriedades do Au coloidal, o primeiro grande trabalho é datado de 1857, realizado por Faraday, que se intitula “The Bakerian Lecture: Experimental relations of gold (and other metals) to light”, onde eram obtidas soluções coloidais, relativamente instáveis, com diferentes cores e onde pela primeira vez se determina que o vidro rubi era colorido dessa forma devido a uma fina camada de Au coloidal. Também nestes ensaios, Faraday conseguiu reduzir o Au metálico a Au coloidal através de calor ou reacção com agentes redutores e provar também que o Au nos “corantes” cerâmicos estava disperso numa camada muito fina. Para além disso, estudou ainda as propriedades ópticas assim como o estado de agregação e sedimentação destas partículas [13]. Cerca de 40 anos mais tarde, Zsigmondy comprovou que não é só o estado de agregação do Au que influencia a sua cor em solução, mas também o tamanho das 6 partículas e a sua forma. Aliás, foi o seu trabalho com as partículas coloidais que o levaram a inventar o ultramicroscópio que lhe valeu o prémio Nobel da Química em 1925 [12]. Mais recentemente, o avanço das novas técnicas e nova instrumentação nas áreas da óptica e microscopia electrónica, lasers e computação permitiram a descoberta e a evolução de vários conceitos na química coloidal e do Au que levou a um ressurgimento do interesse nesse metal. Estes novos equipamentos e conceitos permitiram o avanço no nosso conhecimento de vários conceitos básicos do funcionamento das NPs como a mecânica quântica associada aos nano-sistemas, a natureza da interacção entre as partículas coloidais e a dependência de surfactantes para estabilizar as NPs e a biofísica associada à utilização destas NPs em sistemas biológicos, sejam em estudos in vitro ou in vivo, que permitiram desenhar e pensar algumas aplicações reais para estes sistemas [12]. As NPs metálicas com núcleo de ouro (Au-NPs) podem assumir diferentes formas, sendo as mais comuns a forma esférica e a forma de bastonete. Tanto o tamanho como a forma que as NPs têm afecta várias propriedades físicas, tais como as suas propriedades ópticas ou a sua capacidade térmica [14]. Às NPs pode ser adicionado um revestimento de vários tipos de forma a alterar as propriedades físico-químicas destas mas também a ajudar a estabilização da NP, podendo, ainda, estes revestimentos serem ancorados a diferentes ligandos (Fig I 1). I. Introdução 7 Figura I 1 – Fotografias de suspensões aquosas de Au-NPs esféricas (painel superior) e Au-NPs nanobastonetes (painel inferior), estando as respectivas imagens das Au-NPs obtidas por microscopia de transmissão electrónica (TEM) representadas de a-j (a barra de escala tem 100 nm). Para as esferas o tamanho das Au-NPs varia de 4 a 40 nm (a-e), enquanto para os nanobastonetes os tamanhos variam de 1.3-5 nm ( f-j) e 20 nm (k) . Estas imagens são representativas da variação das propriedades ópticas em função da forma e do tamanho das Au-NPs (adaptado de [15]). Aumento do tamanho das NPs Aumento do tamanho das NPs 14 realizado por Oberdorster et al., em 1992 [43], usando NPs de TiO 2 com um tamanho aproximado de 20 e 200 nm. As NPs foram administradas a ratos, por instilação intratraquial, em doses que variaram entre 65 µg e 1000 µg NP, sendo os pulmões dos ratos lavados após 24 h da instilação e a partir do líquido de lavagem foram determinados os parâmetros inflamatórios e a concentração de NPs ainda presentes nos pulmões. Este estudo demonstrou que doses mais elevadas de NPs produziam um efeito inflamatório menor que as doses menos elevadas, sendo este fenómeno explicado pelo facto de mais de 50% das NPs chegarem ao interstício pulmonar e as doses elevadas causarem assim uma mudança de resposta imunitária do espaço alveolar para o espaço intersticial, uma vez que o método utilizado apenas mede a resposta imunológica no espaço alveolar se esta muda para o espaço intersticial não pode ser registada e como tal parece haver uma diminuição desta [43]. Este tipo de translocação é maior e mais proeminente em espécies com um porte físico maior, como cães ou primatas não humanos do que em roedores [44, 45], sendo por isso de esperar que este efeito ocorra nos humanos. Uma vez no interstício pulmonar, estas partículas podem ser translocadas para a corrente sanguínea ou para o sistema linfático, dependendo do tamanho da partícula. Barry et al., em 1977, mostraram que após injecção intratraquial de Au-NPs a ratos (30 nm) houve translocação destas para o epitélio alveolar. Trinta minutos após a administração, foram encontradas grandes quantidades de NPs nos capilares pulmonares, sendo proposto que esta era uma via de absorção de xenobióticos inalados (como as partículas que se encontram presentes no fumo do tabaco) explicando assim a absorção destas partículas pelo organismo [46]. Desde então, uma série de estudos têm sido feitos para tentar entender a via pela qual as NPs passam do espaço alveolar para o espaço intersticial, levando a sua posterior absorção. Foi demonstrado que existem 2 vias pelas quais as NPs (e os xenobióticos em geral) podem ser translocados para o espaço intersticial através das células do epitélio alveolar: a via que envolve a caveolae e a via que envolve a clatrina [9]. A presença de caveolae, que são pequenas invaginações da membrana plasmática que contêm um tipo particular de lipid rafts, é diferente de célula para célula, sendo bastante abundantes nos capilares pulmonares e nas células alveolares do tipo I e não estão presentes, por exemplo, nos capilares cerebrais [47]. Para além do mais, durante os processos de expiração e inspiração há a contracção da parede alveolar que expõe a caveolae, que tem cerca de 40 nm, durante um curto período de tempo permitindo assim às NPs (ou outros xenobióticos) o acesso a esta via de translocação [48]. I. Introdução 15 Um mecanismo de translocação das NPs é a transcitose nas células do epitélio alveolar, mediada por receptores (sensíveis a albumina) via caveolae [49, 50]. Uma vez que a albumina é a proteína mais abundante no interstício, pode adsorver-se à NP, facilitando a sua translocação por esta via. Outro tipo de moléculas que parecem promover esta via de translocação são os fosfolípidos, como as lectinas [51], que também são moléculas particularmente presentes no espaço intersticial. A outra via de translocação proposta envolve as vesículas revestidas com clatrina, tal como foi descrito por Rejman et al. em 2004, que verificaram, in vitro, que células não fagocíticas internalizam micro esferas de látex com tamanhos até 200 nm. Este estudo demonstrou uma dependência entre o tamanho da NP e a via pela qual era internalizada. NPs com tamanho de cerca de 500 nm eram internalizadas preferencialmente pela via da caveolae e as NPs com tamanho menor eram internalizadas pela via que depende da clatrina [52]. No entanto, estas partículas não tinham nenhum ligando na superfície, o que mostra a importância do revestimento. Ou seja, sem moléculas adsorvidas à superfície, o tamanho regula a via de translocação. No entanto, com algumas moléculas específicas adsorvidas, à via de translocação é principalmente regulada pelo tipo de moléculas adsorvidas a superfície da NP, o que permite que partículas menores sejam internalizadas pelas células do epitélio alveolar e posteriormente passem para o espaço intersticial por via da caveolae [9]. I.4.1.2 Absorção das NPs no tracto gastrointestinal A via oral de absorção dos xenobióticos, especialmente os desenhados e sintetizados pelo homem, é considerada a melhor via uma vez que não é invasiva e evita o desconforto associado às injecções e outros tipos de administração de fármacos. As variações de pH que existem ao longo do tracto gastrointestinal podem ser problemáticas para alguns tipos de NPs menos estáveis, como os lipossomas ou as NPs poliméricas, podendo estas degradarem-se antes ainda de chegarem ao local de absorção, neste caso o intestino [53]. Outra limitação desta via de absorção são as barreiras mucosas, onde as NPs têm que permanecer o tempo suficiente para interagirem com as células do epitélio intestinal e serem absorvidas, sem no entanto ficarem presas na rede fibrosa do muco e serem eliminadas via fezes [53]. Assim, a primeira coisa a identificar, neste tipo de estudos de absorção, será a forma como as NPs esta atravessam a barreira gastrointestinal e entram na corrente sanguínea, sabendo que um xenobiótico pode passar a barreira intestinal de duas formas: 16 a forma paracelular e a transcelular, sendo que na primeira o xenobiótico passa através dos espaços entre as células do epitélio e a segunda, tal como o nome indica, é feita através das células que compõem a barreira do epitélio intestinal [53]. I.4.1.2.1 Transporte paracelular O transporte paracelular diz respeito à passagem das NPs através do espaço intercelular, sendo esta a via menos comum para as NPs atingirem a corrente sanguínea, uma vez que a área intercelular é muito reduzida, devido às junções serem muito apertadas (espaço intracelular de cerca de 3 a 10 Å) [54]. No entanto, podem ser usadas estratégias que podem ajudar a absorção das NPs por esta via [55-57]. A inclusão de moléculas de quitosano e ácidos poliacrílicos na solução onde se encontram as NPs aumenta a sua permeabilidade das NPs, quer complexando com os iões de cálcio presentes nas junções [57], quer despolarizando as F-actinas celulares e actuando na proteína de junção ZO-1 e activando a proteína cinase C [56] temporariamente enfraquecendo a força da junção celular [55], permitindo a passagem das NPs. Porém, quando as partículas de quitosano estão adsorvidas directamente na superfície das NPs, este aumento da permeabilidade não é tão marcante [58]. Peppas et al., 2000, demonstraram que NPs revestidas com ácido poliacrílico conseguem estabelecer ligações aos iões de cálcio presentes nas junções entre as células do epitélio intestinal e desta forma enfraquecer a ligação entre as células, permitindo assim as NPs serem mais facilmente absorvidas por esta via [59]. Outro método pelo qual se pode aumentar a absorção pela via paracelular será o uso de polímeros tiolados no revestimento das NPs, que já provaram a sua capacidade de ser absorvidos no intestino de cobaios, pensando-se que este efeito é devido à inibição da tirosina fosfatase, o que causa a expansão da junção, retirando-lhe assim efectividade [60]. Por fim, a inflamação ou a alteração do estado normal do tecido intestinal pode levar ao enfraquecimento das junções [61] e, como tal, aumentar a taxa de absorção das NPs por esta via. Assim, podemos constatar que mais que o tamanho, o que desempenha um papel importante nesta via de absorção intestinal será, acima de tudo, as modificações no revestimento usado na NP (ou a administração de um adjuvante) de modo a poder enfraquecer a junção intercelular e, assim, permitir mais facilmente a passagem das NPs para a corrente sanguínea. I. Introdução 17 Num estudo realizado com Au-NPs revestidas com citrato o objectivo foi verificar se estas eram absorvidas por via oral e chegavam à corrente sanguínea [62]. Neste estudo ratinhos BALB/c foram expostos durante 7 dias, através da água de bebida, a Au-NPs de diferentes tamanhos (4, 10, 28 e 50 nm). Os ratinhos foram subsequentemente sacrificados imediatamente após a substituição da água com NPs por água corrente ou 12 h após a troca, dependendo se os órgãos seriam analisados por microscopia electrónica de transmissão (TEM) ou se seriam submetidos ao estudo quantitativo, respectivamente. Após a análise microscópica ao tecido intestinal dos ratinhos, foi verificado que as NPs de 4 nm e de 10 nm passam por de transporte paracelular, sendo encontradas NPs no espaço intracelular, ao contrário das NPs de maior diâmetro (28 e 50 nm) que apenas foram encontradas no lúmen do intestino [62]. I.4.1.2.2 Transporte transcelular No transporte transcelular, não são só as modificações no revestimento da partícula que são importantes mas uma série de factores, tais como o tamanho ou a carga da superfície da NP [53]. O processo do transporte transcelular começa com um processo endocítico na membrana apical da célula intestinal atravessando depois as partículas através da célula e libertadas na membrana basolateral [63]. Este processo ocorre através de dois tipos de células no intestino: as células M, presentes nas placas de Peyer (que apesar de se terem adaptado a absorverem vários xenobióticos apenas representam 5% das células no intestino humano) e as células epiteliais ou enterócitos (que têm uma baixa actividade no que se refere à endocitose) [53]. O transporte transcelular já foi demonstrado para as Au-NPs. Um dos estudos realizados para demonstrar este tipo de transporte foi efectuado por Sonavanne et al., em 2008, com Au-NPs revestidas com citrato, tendo diferentes tamanhos (15, 102 e 139 nm). Este estudo foi realizado ex-vivo, utilizando intestinos de rato (mais especificamente da parte distal até à junção duodeno-jejunal). Os resultados deste estudo demonstraram uma clara passagem de todas as NPs através da porção de intestino usada, ao fim de 6 h cerca de 60 µg de Au tinha se difundido através do intestino para as Au-NPs com 15 e 139 nm e cerca de 110 µg para as Au-NPs com 102 nm. Este estudo mostra que estas Au-NPs podem ser difundidas através do intestino e assim numa situação in vivo podem chegar à corrente sanguínea. [64]. 18 I.4.1.2.2.1 Transporte pelos enterócitos Apesar de terem uma limitada capacidade de transportar as NPs, os enterócitos devem ser considerados como uma via de entrada já que são a maioria das células existentes no epitélio intestinal [53]. O transporte de NPs pelos enterócitos faz-se normalmente por um de três mecanismos: pinocitose, macro-pinocitose ou a inclusão em vesículas de clatrina [65], sendo todos estes processos activos (já que requerem energia) e que podem ser mediados por receptores (caso das vesículas de clatrina). Tal como foi demonstrado, quer por Desai et al., 1996, quer por Win e Fang, 2004, este é um processo dependente não só do tamanho das NPs (sendo que NPs menores são mais permeáveis) mas também da sua concentração e da temperatura [66, 67]. Desai et al., em 1996, usaram nos seus estudos NPs poliméricas compostas por albumina sérica bovina (BSA) e ácido poliglicólico polilactivo, em iguais proporções, tendo entre 100 nm - 10 µm. A absorção destas NPs foi estudada em ratos recorrendo ao método de “intestinal loop” podendo assim verificar-se a absorção in situ. Este estudo demonstrou que o tamanho das NPs é de facto um factor importante, sendo que as NPs de 100 nm tiveram uma absorção cerca de 15 a 250 vezes superior quando comparadas com as partículas de tamanho superior [66]. Em estudos in vitro, verificou-se que a internalização em células do tipo CACO-2 também depende não só do tamanho e concentração das NPs bem como da temperatura ambiente [66]. Estas conclusões são validadas pelo estudo de Win e Feng, em 2004, em que usaram partículas poliméricas de PLGA, com tamanho entre 200 e 1000 nm, num modelo in vitro, constituído por células CACO-2. Neste estudo, demonstrou-se também que o tamanho e a concentração das NPs influenciam a taxa de internalização já que as NPs menores são mais internalizadas e que a uma concentração de 500 µg/mL estas NPs mostraram uma taxa maior de internalização que a concentrações de 250 e 100 µg/mL. O tempo de incubação também é um parâmetro importante a considerar, uma vez que ao fim de 30 min as mesmas NPs apresentavam taxas de internalização nas células mais baixas que ao fim de 2 h (9% de internalização aos 30 min vs 18% de internalização as 2 h) . Para além disso, a temperatura a que estas células foram incubadas com as NPs também desempenha um papel importante, sendo que com temperaturas mais baixas (4º C vs 37 ºC) a taxa de internalização foi de 25 a 46% mais baixa, mostrando que este processo é efectivamente activo, ou seja, dependente de energia [67]. Este estudo demonstra ainda que o revestimento é outro factor importante para a internalização das NPs. As NPs de PLGA (200 nm) revestidas com acetato de polivinilo (PVA) ou vitamina E conjugada com succinato de d-alfa-tocoferilpolietilenoglicol 1000 (TPGS), aumentando-lhes o tamanho para cerca de 250 a 300 nm, têm uma taxa de internalização superior nas células CACO-2, I. Introdução 19 sendo que as NPs com um revestimento de vitamina E TPGS apresentam internalização cerca de 4 a 6 vezes maior que as restantes NPs desprovidas de revestimento [67]. Assim, podemos ver como o revestimento tem influência na absorção das NPs pelos enterócitos, sendo aceite que as NPs com características hidrofóbicas são mais extensamente absorvidas que as NPs com uma superfície hidrofílica [68]. À medida que a investigação e o conhecimento evoluíram, verificou-se que a hidrofilia não é o único factor que o revestimento influencia, mas também a estabilidade ou a mucoadesão, que são factores que também são importantes para a absorção no tracto gastrointestinal. Assim sendo, o revestimento desempenha um papel importante não só no que se refere a hidrofobicidade da superfície das NPs mas também a um nível de protecção, a exemplo do exercido pelos revestimentos de PEG. Este revestimento diminui a adsorção de proteínas do meio à superfície da NP, impedindo assim a acção enzimática e protegendo a NP de degradação e agregação enzimaticamente induzida [69]. Um outro efeito que este revestimento exerce é o aumento da afinidade das NPs para a membrana celular, no entanto este efeito ainda esta pouco estudado [70, 71]. Outra estratégia a que se tem recorrido para facilitar a absorção das NPs através dos enterócitos é o uso de moléculas adsorvidas à superfície da NP que sirvam de targeting para as células do epitélio intestinal [72]. Uma família de moléculas que tem sido explorada para este fim é a das lectinas. Um dos principais exemplos disto é o uso da aglutinina de trigo proveniente de Tricticum vulgare que se liga especificamente a Nacetil-D-glucosamina (NAG) e ao ácido siálico [73, 74]. O uso desta proteína aumentou em 12 vezes a sua interacção com a superfície de células CACO-2 quando comparado com NPs apenas revestidas com PEG, e a sua internalização aconteceu sem efeitos tóxicos para estas células [75]. Infelizmente, o uso das lectinas provoca uma resposta imunológica que acarreta irritação no tracto gastrointestinal e como tal o seu uso por via oral é limitado [53]. De forma a contornar o problema imunológico, foi criada uma NP de quitosano, desta forma associada ao polissacarídeo glucomanano, com o intuito não só de aumentar a estabilidade mas também facilitar a interacção entre as NPs e o epitélio intestinal que tem receptores de manose, aumentando assim a absorção [76]. I4.1.2.2.2.2 Transporte pelas Células M As células M são células que se encontram nas placas de Payer e, ao contrário dos restantes enterócitos, não tem microvilosidades na sua face apical, nem são secretoras de muco. Estas células que representam uma fracção muito reduzida do número de 20 enterócitos, têm como função permitir a passagem de antigénios do lúmen intestinal para células denditricas ou células T, através de tanscitose, tendo assim um importante papel no sistema imune a nível intestinal [77]. Nas células M, a internalização de NPs ocorre por endocitose de fase fluida, endocitose adsortiva e fagocitose [53], com gasto de energia [78] e é influenciada por factores como o tamanho, a carga superficial e o revestimento, tal como ocorre nas células epiteliais. Há alguma controvérsia se o tamanho óptimo de internalização é abaixo de 1 µm ou abaixo de 200 nm [53]. Em relação à carga da superfície parece haver um consenso que partículas com uma carga neutra ou negativa são mais extensamente absorvidas através das células M que as partículas com carga positiva [79]. Foi demonstrado por Li et al., 2009, que as NPs lipídicas sólidas carregadas com queratina desenvolvidas com um tamanho compreendido entre 20-500 nm, tinham uma taxa de absorção no ílio e no cólon (cerca de 30 e 22%, respectivamente) superior à taxa de absorção no jejuno (13%) e no duoneno (18%). Este estudo ex vivo foi realizado testando as taxas de absorção em diferentes porções de intestino de rato através da canulação de diferentes segmentos do intestino de ratos Wistar e fazendo perfundir a suspensão contendo as NPs, com uma concentração de 50 mg/kg, durante 2 h. Os resultados evidenciaram que as células M influenciam a absorção das NPs, já que as taxas de absorção são maiores nas zonas do intestino onde existem mais placas de Peyer, e como tal mais células M [80]. Tal como nos enterócitos, uma das formas de aumentar a absorção de NPs através das células M consiste em ligar uma molécula à superfície das NPs de forma a conduzi-las até à células M. No entanto, um dos grandes problemas no que diz respeito ao targeting das células M é que ainda não foram encontrados marcadores específicos para estas células, o que torna a tarefa bastante mais complicada [53]. Marcadores como a lectina UEA-1 foram utilizados em ratinhos com um enorme sucesso, uma vez que as NPs de poliestireno revestidas com esta lectina usadas neste estudo (500 nm) foram internalizadas cerca de 100 vezes mais do que as mesmas NPs revestidas com BSA. Para além do mais, foi verificado que este tipo de molécula no revestimento não aumentou a taxa de ligação das NPs a enterócitos, mostrando, assim, especificidade para as células M. Infelizmente, o ligando específico da UEA-1, a alfa-1-furose, não é expressa à superfície das células M dos humanos [81]. Outras lectinas, como a lectina extraída do Triticum vulgaris (WGA) ou a lectina da Aleuria aurantia (AAL), têm sido testadas para este propósito com algum sucesso em modelos in vitro. As WGA, no entanto, provaram que não são específicas para as células M I. Introdução 21 já que também aumentam a internalização por células do epitélio intestinal. Em relação às AAL, os poucos estudos que há mostram um aumento da internalização em sistemas in vitro, quer nas células CACO-2, quer nos modelos FAE (folicule associeted epitelium). No entanto, as NPs utilizadas foram de 2 µm, e, dessa forma, esperava-se uma grande taxa de absorção pelas células M e não pelos enterócitos, devido ao tamanho das partículas. A inclusão deste tipo de lectina na superfície desta NP levou a um aumento significativo da sua internalização nos modelos celulares testados, onde não foram encontradas NPs nos enterócitos adjacentes as células M . No entanto, tal como já foi dito, este tipo de lectina suscita uma resposta imunológica por parte do organismo, tornando assim o seu uso menos viável [82, 83]. Outro método para o targeting de células M consiste em mimetizar os agentes patogénicos capazes de utilizar estas células para chegarem à corrente sanguínea. NPs poliméricas com cerca de 280 nm, conjugadas com extractos de salmonela (18 mµg/mL de NP) foram administradas por via oral a ratos, e verificou-se que cerca de 3 h depois 50% da dose administrada permanecia nos intestinos. As NPs encontravam-se predominantemente distribuídas nas zonas das placas de Peyer. Além do mais, a capacidade das NPs serem absorvidas está diminuída quando foram administradas em conjunto com patogénios intactos. No entanto, quando as NPs foram administradas 30 minutos antes dos patogénios, as bactérias não conseguiram colonizar as zonas das placas de Peyer, como é normal, mostrando assim uma acumular das NPs nesta zona e como tal uma especificidade, das NPs, para esta zona intestinal. Uma vez que as células M são mais permeáveis que os enterócitos desta forma podemos aumentar a quantidade das NPs que são absorvidas no tracto gastrointestinal [53]. Outra das moléculas usadas com o propósito de targeting das células M, assim como para promover a absorção através destas, é a invasina, uma adesina proveniente da Yersinia enterocolitica e que interage com as integrinas β1. Essas integrinas já foram descritas nas células M por alguns autores [84-86] e, apesar de não serem específicas destas células, são mais expressas do que nas células CACO-2 [53]. NPs de poliestireno (PS) (500 nm) contendo a invasina-C192 no revestimento foram administradas por via oral a ratos. Estas mostraram uma maior taxa de absorção considerando que cerca de 13% da dose estava presente em circulação comparando com os 2% das NPs sem a invasina no revestimento; o exame histológico evidenciou que estas partículas se acumularam mais na zona distal do ílio [87]. 22 I.4.1.2.3 A barreira mucosa intestinal Um dos maiores entraves à absorção de NPs administradas por via oral é o facto de a maior parte das partículas atravessar o tracto gastrointestinal e serem eliminadas directamente por via fecal. Podem ainda, tal como já foi referido, ficar retidas na rede de muco, sendo posteriormente eliminadas via fecal ou ainda ser transportadas através do muco para junto das células epitéliais [88, 89]. Estes obstáculos deixam antever o benefício de obter NPs que consigam permanecer no muco de forma a não serem eliminadas de imediato por via fecal, tendo assim mais hipóteses de entrarem em contacto com células do epitélio e serem absorvidas. Para ultrapassar esta barreira fisiológica imposta por esta rede de muco, as NPs tem que ter algumas características específicas que podem ser obtidas através do revestimento. Uma das maneiras de fazer com que as NPs penetrem e ultrapassem rapidamente esta barreira é o revestimento com PEG. No entanto, é preciso considerar que o revestimento tem que ser completo e com moléculas de PEG com um peso molecular ideal, de forma a tornar a NP o mais inerte possível [90]. Para além do mais, tal como já foi dito anteriormente, este revestimento confere estabilidade às partículas e protege-as de interacções indesejadas com as proteínas presentes no muco [91, 92]. I.4.1.3 Absorção dérmica A estrutura da pele é um exemplo de uma barreira contra patogénios ou xenobióticos bastante eficaz e, como tal, sendo de esperar que também as NPs sejam absorvidas. Para efeitos de penetração é preciso considerar a derme e a epiderme, ignorando a hipoderme [93]. A estrutura da epiderme assenta em 5 camadas distintas, compostas por queratinócitos que variam de acordo com a sua camada, quer em forma quer em conteúdo citoplasmático. Estas camadas têm nomenclaturas distintas: basal, espinhosa, granulosa, lúcida (esta não existente em toda a extensão da pele) e córnea, estando a primeira camada em contacto com a derme e a última em contacto com o meio ambiente [94, 95]. I.4.1.3.1 A estrutura epidérmica A camada córnea (CC) contém as principiais funções que conferem à epiderme o papel de barreira defensiva, que resultam de uma interacção intercelular mas também entre as células e a matriz lipídica presentes na pele. A primeira estrutura a ter em conta será a estrutura normalmente classificada como a macroestrutura ou “brick-and-mortar” I. Introdução 23 (“tijolo e argamassa”), onde os tijolos são as células e a argamassa será a matriz lipídica que as rodeia [93]. Os queratinócitos nesta camada são hexagonais e estão dispostos de uma forma particular, formando aglomerados que podem conter até 12 células, e encontram-se separados uns dos outros por uma fronteira que pode atingir alguns µm, sendo a principal via de penetração intra-aglomerados [96, 97]. A microestrutura da CC é composta pelos lípidos da matriz intercelular que se dispõe como uma bicamada lipídica e a composição desta matriz varia ao longo da pele e a sua composição de diferentes lípidos vai determinar a sua organização espacial. Foram caracterizados alguns poros aquosos ao longo desta membrana, que variam entre 0,4 e 36 nm, podendo estes servirem de passagem para as NPs com tamanho adequado. Tanto a água como moléculas polares não penetram apreciavelmente por esta camada [93]. Outra variável a ter em conta é o gradiente de pH que se forma ao longo desta camada, que varia entre os 4,5 e os 5,5 nas camadas superiores e se vai aproximando da neutralidade nas camadas mais inferiores. Este gradiente de pH tem como função providenciar mais uma barreira anti-microbiana, assim como manter a homeostase da epiderme e promover a integridade e coesão da barreira dérmica, o que influencia de forma negativa a permeabilidade cutânea [98-100]. Por fim, para manter esta barreira funcional, é necessário haver uma constante hidratação que é conseguida através da proteólise do conteúdo dos queratinócitos [96]. Tendo em conta estas características, as NPs dependentes unicamente do seu tamanho para passar por difusão devem ser menores que 5 nm ou então ter a capacidade (que ainda não foi confirmada por nenhum estudo) de poder passar para as camadas mais inferiores da derme através dos poros aquosos, podendo assim o seu tamanho chegar até cerca de 35 nm [93]. No entanto, a epiderme não é só composta por queratinócitos compactos, mas também tem glândulas sudoríparas e pêlos que abrem esta barreira defensiva, podendo potencialmente ser locais de mais fácil acesso à derme, formando assim a via transfolicular de penetração [93]. As glândulas sudoríparas são glândulas tubulares que se estendem da derme ou da hipoderme até à CC, tendo cerca de 2 a 5 mm de tamanho, e uma abertura de 60-80 µm de diâmetro [94]. Por seu lado, os folículos estão associados a glândula sebácea, tendo um tamanho de 2 a 4 mm, e têm um poro com um diâmetro que pode ir de 10 a 210 µm, dependendo do local do organismo. Salienta-se que à espessura do pêlo tem que ser subtraída a abertura do poro para podermos ter uma ideia do tamanho real da abertura [94]. No entanto, e apesar de ser uma óptima opção a explorar, é preciso 30 vezes). Sendo assim são necessários mais estudos sobre este assunto de forma a poder existir uma posição mais fundamentada sobre a absorção das NPs por esta via. I.4.2 Distribuição A distribuição é o processo farmacocinético pelo qual um xenobiótico, seja absorvido ou administrado por via intravenosa, se distribui pelos tecidos através da circulação sistémica. Saber como e onde é que as NPs se depositam é essencial para o estudo não só das suas potenciais aplicações como também da sua toxicidade, não surpreendendo que este seja um dos parâmetros farmacocinéticos mais estudados para qualquer tipo de NP. Se para os xenobióticos normalmente estudados (fármacos e compostos orgânicos) é o seu coeficiente de partição óleo/água que vai determinar o seu perfil de distribuição, para as NPs há outros factores em jogo. O primeiro factor a ter em conta nos estudos de distribuição das NPs é a via de administração. Se a exposição às NPs ocorrer através da via inalatória há uma deposição imediata nos tecidos pulmonares, sendo a região pulmonar em que estes se depositam dependente do tamanho da partícula [42]. Partículas com 1 nm de diâmetro vão depositarse sobretudo na zona nasal, da faringe e da laringe, enquanto as partículas com o tamanho de cerca de 10 nm se depositam sobretudo na zona traqueo-bronquial e partículas com 100 nm se depositam na região alveolar [9]. Apesar de estas NPs sofrerem uma rápida translocação para a circulação sistémica e a partir daí se distribuírem pelos restantes tecidos, pode haver um depósito significativo nos tecidos pulmonares, o que influencia o seu perfil de distribuição. No entanto, os estudos que observaram estes depósitos apenas analisaram um espaço de tempo muito limitado (abaixo de 1 mês), ainda não se sabendo qual o destino das NPs acumuladas nos pulmões a longo prazo [9, 121]. No caso das Au-NPs, um estudo realizado por Lipka et al.,em 2010, demonstrou que a via de exposição às Au-NPs afecta em muito a sua biodistribuição. Neste estudo as NPs usadas como controlo foram Au-NPs revestidas a citrato mas com um ligando de bis(p-fenilsulfonato) (Au-Phos) ancorado de forma a aumentar a sua estabilidade e as 2 outras NPs usadas eram em tudo semelhantes a estas mas foram revestidas com cadeias de PEG de 750 e 10000 Daltons (Au-PEG750 e Au-PEG10k, respectivamente). Todas as NPs usadas neste estudo foram marcadas radioactivamente com 198Au. O revestimento influenciou o tamanho das NPs, uma vez que o tamanho das NPs aumentou à medida que os revestimentos foram aumentando. Para as NPs Au-Phos o tamanho era de 11 nm, para as Au-PEG750 21 nm e para as Au-PEG10k 31 nm. O potencial zeta das NPs também variou, de - 28,3 mV para as Au-Phos, - 19,1 mV para as Au-Peg750 e - 10,1 mV para as I. Introdução 31 Au-PEG10k. Estas NPs foram então administradas a ratos da estirpe Wistar-kyoto, quer por via intravenosa, na veia da cauda, quer por instilação intratraqueal, sendo estes sacrificados ao fim de 1 ou 24 h, os seus órgãos recolhidos e submetidos a posterior rádioanálise. O perfil de distribuição foi influenciado pela via de administração das Au-NPs. Após a injecção intravenosa a maior parte das NPs se encontrava concentrada no fígado e no baço ao fim de 24 h mas após instilação as NPs foram retidas na quase na totalidade nos pulmões [122]. O perfil de distribuição mais comum das Au-NPs sem revestimento, e injectadas intravenosamente, consiste essencialmente na acumulação no fígado e no baço, especialmente para as NPs de tamanho superior a 10 nm [123-127]. Au-NPs com diferentes tamanhos, de 10 a 250 nm, foram injectadas em ratos por via intravenosa, sendo os animais sacrificados após 24 h e os seus órgãos recolhidos e analisados. Os resultados deste estudo mostraram que as NPs de 10 nm se distribuíam por vários órgãos como coração, pulmões, rins, cérebro, timo e no sangue, enquanto as NPs com tamanhos maiores apenas se encontravam presentes no sangue, fígado e no baço [124]. Isto acontece uma vez que as NPs são opsonisadas rapidamente e removidas para os órgãos do SRE, composto pelo fígado e o baço. As NPs em circulação entram em contacto com as proteínas plasmáticas que se adsorvem à superfície destas, permitindo assim o reconhecimento pelos monócitos, sendo fagocitadas por estes e rapidamente sequestrados para os órgãos alvo [23]. Para além do mais, foi demonstrada uma correlação entre a carga da superfície das NPs e a opsonisação, que demonstra que as partículas neutras têm menos hipóteses de serem opsonisadas e fagocitadas pelas células do SRE [128]. I.4.2.1 Influência do revestimento das NPs na distribuição A estratégia actualmente utilizada para conseguir contornar o SRE e proporcionar um maior tempo de semi-vida das NPs no sangue ou serem direccionadas para outros órgãos que não o fígado ou o baço, é o uso de moléculas ou grupos funcionais adsorvidos à superfície das NPs. Tais revestimentos exercem um efeito protector nas NPs e impedem assim as interacções electrostáticas e hidrofóbicas que fazem com que as opsoninas se liguem a elas. Estes revestimentos são geralmente moléculas com longas cadeias poliméricas hidrofóbicas ou então surfactantes não iónicos [23]. Um dos revestimentos mais utilizado com sucesso é o PEG ou então o PEG contendo co-polímeros. No entanto, para serem eficazes, estas moléculas têm que revestir a maior parte da NP e estarem bem distribuídas pela sua superfície, caso contrário estas 32 moléculas de revestimento correm o risco de ficar numa conformação em forma de “cogumelo” (Fig I 3). Ou seja, as moléculas vão estar não só mais próximas da superfície da NP mas também com mais espaço entre elas, o que leva a perda do efeito protector uma vez que proporciona espaço para interacções entre as NPs e as moléculas existentes no plasma sanguíneo. Porém, se as moléculas estiverem em quantidade suficiente, bem distribuídas e as suas cadeias poliméricas forem suficientemente longas para exibir uma configuração de “escova”, ou seja, ficarem a uma maior distância da superfície e mais compactas entre si, impedirão a adesão das opsoninas à superfície da NP, uma vez que não têm espaço para interagir com esta [129]. Existe, então, uma área mínima da NP que tem que estar efectivamente revestida para que esta esteja protegida contra o efeito do SER. Foi determinado que a camada de PEG mínima necessária para que esta exerça o seu efeito protector tem que ter de espessura 5% do diâmetro da NP ou então duas vezes o seu raio hidrodinâmico na sua forma solúvel [129, 130]. I. Introdução 33 Fig I 3 – Diagramas esquemáticos das diferentes configurações de PEG quando este reveste as NPs. Em (a) a baixa cobertura da superfície da nanopartícula por parte das moléculas de PEG leva-as a adoptarem a conformação em cogumelo, onde as moléculas de PEG estão mais próximas da superfície da nanopartícula. Em (b) a extensa cobertura da superfície da nanopartícula com as moléculas de PEG leva-as a adoptarem a conformação em “escova”, ficando mais afastadas da superfície. (adaptado de [23]). Por outro lado, existe uma teoria que defende que o PEG e outras moléculas de revestimento não têm influência na adsorção de proteínas do plasma, pelo menos em lipossomas, mas que previne a interacção entre as NPs e como tal a sua a agregação, aumentado desta forma o seu tempo de circulação no sangue uma vez que mantém as partículas dispersas e como tal fora do filtro hepático. Um estudo realizado por Dos Santos et al., 2007, em ratinhos consistiu na administração por via intravenosa de lipossomas revestidos com diferentes níveis de poli(etileno glicol)- diestearoil fosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) (correspondendo entre 0 e 5% da composição da NP), com tamanhos compreendidos entre 40-120 nm. As amostras de plasma foram recolhidas quer através da veia da cauda ou por punção cardíaca, ao fim de tempos determinados (0,25, 0,5, 1, 2, 4 e 34 24 h). Os resultados deste estudo demonstraram que não é necessário o revestimento completo das NPs para evitar a actuação do SER [131]. Independentemente da forma como o revestimento actua sobre a distribuição das NPs, a verdade é que as NPs revestidas com PEG ou outro tipo de revestimentos têm não só maior tempo de circulação como também diferentes perfis de distribuição no organismo. O estudo realizado por Gref et al., 2000, com três tipos de NPs poliméricas contendo ácido poliláctico (PLA) e PLGA, com tamanhos compreendidos entre 160-270 nm e revestidas com PEG de diferentes pesos moleculares (2000-20000 g/mol), verificaram, in vitro, a adsorção de NPs plasmáticas, presentes no soro de sangue humano, a superfície das diferentes NPs e a influência do revestimento na fagocitose destas NPs em células polimorfonucleares humanas. Para verificar a adsorção de proteínas plasmáticas a estas NPs, os autores incubaram as NPs em plasma humano, efectuando depois uma electroforese de 2 dimensões para verificar a quantidade adsorvidas as NPs. Verificou-se que para estas NPs o peso molecular ideal das cadeias de PEG, para evitar a adsorção das proteínas plasmáticas a NP, era de 5000 g/mol, e que há uma espessura óptima da camada de PEG revestindo a superfície da NP para reduzir a adsorção de proteínas à NP. Este valor está situado entre 2% e 5% do tamanho da NP, ou seja a espessura da camada de PEG tem que ter pelo menos 2% do tamanho total da NP. Para uma espessura de PEG correspondente a 5% do tamanho da NP de PLA verificou-se uma redução de cerca de 80% nas proteínas adsorvidas à superfície. Além disso, observou-se que com uma espessura 5% do tamanho total da NP, não há uma redução das proteínas adsorvidas à NP, quando comparada com a espessura de 2%. Em relação à fagocitose pelas células polimorfonucleares humanas, as NPs que continham uma espessura de revestimento de PEG entre 2-5% do tamanho total da NP eram não só estáveis mas também conseguiam escapar à fagocitose pelos leucócitos polimorfonucleares [132]. Lipka et al., 2010, testaram também a influência do revestimento no perfil de distribuição de Au-NPs [122]. Verificaram que as Au-NPs revestidas com PEG-10K, quando injectadas na veia da cauda, tinham um tempo de semi-vida no sangue muito superior às NPs Au-Phos e Au-PEG750. Enquanto 1 hora após a injecção intravenosa, as NPs de Au-Phos e Au-PEG750 estavam maioritariamente no fígado e no baço, cerca de 92% e 89% respectivamente, as NPs de Au-PEG10k estavam maioritariamente (cerca de 95%) no sangue. Mesmo ao fim de 24 h, cerca de 20% destas NPs ainda se encontrava em circulação na corrente sanguínea. I. Introdução 35 Estes dados estão em concordância com um estudo realizado por Niidome et al., 2006, com nanobastonetes de Au (65 por 11 nm). Neste estudo foram utilizados nanobastonetes estabilizados com brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) ou revestidos com PEG. Estes nanobastonetes foram injectados em ratinhos ddY. Os animais injectados com as NPs estabilizadas com CTAB foram sacrificados aos 30 min e os animais injectados com NPs revestidas com PEG aos 30 min, 3, 6, 12, 24 e 72 h após a injecção, sendo diferentes órgãos retirados e analisados por espectrometria de massa acoplada a plasma indutivo (ICP-MS). Ao fim de 30 min, 30% das NPs revestidas com o agente estabilizador CTAB estavam no fígado e muito poucas nos restantes órgãos. As NPs revestidas com PEG, ao fim dos mesmo 30 minutos, ainda se encontravam em quase 60% da dose injectada no sangue, diminuindo progressivamente até 0% ao fim das 72 h e aumentando no fígado até cerca de 20% no tempo final deste estudo [133]. Assim, podemos ver que o revestimento das NPs desempenha um papel importante não só aumentando o tempo de semi-vida no sangue mas também no seu perfil de distribuição, uma vez que escapam ao SER, aumentando assim as hipóteses das NPs se distribuírem no organismo. I.4.2.2 Influência do tamanho das NPs na distribuição Zhang et al., 2009, procuraram verificar qual a influência do tamanho das NPs na distribuição utilizando, para esse efeito, Au-NPs com tamanhos compreendidos entre 20 e 80 nm, revestidas com 4 tipos de revestimentos diferentes, três deles à base de PEG (PEG com peso molecular de 2000 e 5000 e com ácido tectónico (TA) ancorado e PEG com um peso molecular de 5000 com grupos tiol ancorados) e um revestimento de citrato. Inicialmente foi avaliado o efeito deste tipo de revestimento na estabilidade das NPs e verificou-se que as NPs com o PEG 5000-TA eram as mais estáveis, quando incubadas a 37º C com PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) de forma a simular condições fisiológicas, degradando-se mais lentamente que as demais e sofrendo menos agregação [134]. Após terem concluído qual o revestimento das NPs que as tornaria mais estáveis, os autores marcaram o revestimento das Au-NPs de diferente tamanho (20 e 80 nm) com um agente radioactivo, 111-Indio (111-In), e injectaram-nas em ratinhos, sendo o seu sangue recolhido em intervalos periódicos, através da veia da cauda. Verificaram que as NPs menores (20 nm) tinham um tempo de circulação prolongado e tinham uma acumulação menor no fígado e no baço quando comparado às NPs maiores, que se acumulavam no 36 fígado e no baço em cerca de 10 minutos, tendo uma área sob a curva no sangue cerca de onze vezes menor que as partículas de menor tamanho [134]. Torna-se assim evidente que existe uma influência importante do tamanho das NPs na biodistribuição, existindo vários estudos que comprovam que as NPs menores apresentam tempos de circulação maior e maior distribuição que as partículas maiores. Num desses estudos realizado por Liu et al., 1992, lipossomas radioactivamente marcados, com um tamanho entre 50 – 400 nm, foram injectados intravenosamente em ratinhos balb\c. Amostras de sangue foram recolhidas em tempos específicos, os animais sacrificados e os órgãos recolhidos para posterior análise. Os resultados mostraram que 4 h após a injecção, 60% das NPs injectadas que tinham entre 100 e 250 nm ainda se encontravam em circulação no sangue, mas apenas 20% dos lipossomas com tamanho superior a 250 nm ou inferior a 100 nm ainda se encontravam em circulação. Verificaram ainda que cerca de 20% das NPs com diâmetro de 100 nm estavam acumuladas no fígado, mas a quantidade de NPs acumulada no fígado variava com o tamanho das mesmas, sendo que 25% das NPs com 250 nm e 60% das partículas com 50 nm estavam acumuladas no mesmo órgão. Isto acontece devido ao tamanho dos poros dos capilares do fígado (cerca de 100 nm). Assim, as moléculas pequenas passam com facilidade para o interior do fígado, acumulando-se nas células hepáticas. Já no baço o cenário é o oposto, as NPs menores quase não têm acumulação neste órgão, ao contrário das partículas maiores (com 400 nm) em que 40% a 50% da dose injectada se encontra no baço [135]. Outros estudos realizados com Au-NPs mostraram também uma clara influência do tamanho na sua distribuição. Terentyuk et al., 2009, estudaram NPs de sílica-Au, revestidas com PEG, com tamanhos de 15, 50 e 150 nm, injectando-as na veia safena de coelho. Recolheram sangue aos 15, 30, 60 e 120 minutos após a injecção das NPs e sacrificaram-se os animais após 72 h, sendo os seus órgãos recolhidos para posterior análise. Verificaram que as NPs, mesmo tendo revestimentos de PEG, se distribuíam de forma muito semelhante entre si, com maior acumulação no fígado e no baço, sendo que as partículas maiores exibiam maiores concentrações nestes 2 órgãos que as partículas de 15 nm. Para além do mais, as partículas menores exibiam um maior tempo de circulação no sangue (ao fim de 24 h apenas as Au-NPs de 15 nm estavam presentes no sangue) mas, e ao contrário de outros estudos [124], não se verificou a acumulação nos outros tecidos estudados (pulmões, rim, e cérebro) [127]. Noutro estudo realizado por Semmeler-Benhke et al, 2008, verificou-se que NPs de menor dimensão têm um perfil de distribuição bastante diferente das NPs consideradas de I. Introdução 37 tamanho médio. Neste estudo foram estudadas Au-NPs, marcadas radioactivamente com 198 Au, com 2 tamanhos diferentes, 1,4 nm e 18 nm, injectadas nas mesmas concentrações na veia da cauda de ratos da estirpe Wistar-Kyoto. Ao fim de 24 h os animais foram sacrificados, os seus órgãos recolhidos e posteriormente submetidos a rádioanálise. Os autores verificaram que após 24 h as NPs com 18 nm eram totalmente concentradas no fígado, cerca de 93%. Já as NPs menores eram mais distribuídas pelo organismo, e, apesar de se encontrarem maioritariamente no fígado (cerca de 50%), estavam também na carcaça (20%), nos rins (5%) e até nas fezes e na urina (9 e 5%, respectivamente) [136]. No que diz respeito a acumulação de NPs nos tumores, o tamanho tem uma relevância extrema. Alguns estudos in vivo utilizaram o modelo de indução tumoral em ratinhos Balb/c por inoculação subdérmica com células da linha H69 (células da linha celular humana de cancro de pulmão) [137, 138]. Após injecção intravenosa de lipossomas com tamanhos compreendidos entre 120 - 170 nm, carregados com um agente radioactivo contendo Iodo-125, verificaram que 48 e 72 h após a injecção das NPs, as que tinham 120 nm de tamanho estavam interiorizadas cerca 10 a 20 vezes mais nos tumores que as que tinham tamanho maior [137]. No entanto, Torchillini et al., 2003, testou in vivo, micelas formadas por PEG-Poliestireno, com cerca de 10 nm e marcadas com 111-In, que foram injectadas intravenosamente em ratinhos com carcinoma pulmonar de Lewis, sendo os animais sacrificados ao fim de 30 minutos e 2 h após a injecção das NPs. Verificou-se que estas NPs não se acumulavam no tecido tumoral de forma significativamente diferente do 111-In quando injectado sozinho [138]. Apesar destas NPs de PEG-Poliestireno terem uma maior facilidade em penetrar nos tumores, devido ao seu tamanho reduzido, também saem mais facilmente, não permanecendo assim no interior do tecido tumoral. Logo, a nível tumoral, as NPs pequenas têm uma óptima permeabilidade mas pouca retenção [139]. Assim, e com base nos estudos realizados, conclui-se que o tamanho das NPs desempenha um papel importante na distribuição, e que as partículas menores se distribuem por mais tecidos que as maiores uma vez que têm a capacidade de passar pelos poros existentes no endotélio dos capilares fenestrados. I.4.2.3 Influência da carga da superfície das NPs na distribuição Outro dos parâmetros que influencia a distribuição de NPs é a carga da superfície, que, tal como já foi referido, pode ser do núcleo ou então decorrente do revestimento aplicado. Em regra, as NPs carregadas, seja positiva ou negativamente, têm um tempo de 38 circulação mais baixo que as NPs neutras [140]. Para além disso, as partículas carregadas positivamente são as que têm um tempo de circulação mais baixo, uma vez que têm grande tendência a formar aglomerados devido à interacção no plasma com as proteínas carregadas negativamente, podendo inclusive formar coágulos e dar origem a embolias pulmonares. As partículas carregadas negativamente, bem como as positivas dissociadas, são removidas do sangue através do SER, e, como tal, têm tendência para acumular-se no fígado [140]. Os grupos funcionais que podem estar ancorados no revestimento das NPs desempenham um papel importante na determinação da sua carga superficial. Num estudo realizado por Yamamoto et al., 2001, verificou-se que as NPs usadas neste estudo (micelas de acetal-PEG com ácido poli-dl-lactico (PDLLA) com um tamanho de cerca 35 nm, e com Tirosina- (Tyr) ou Try-Glutamato-PEG/PDLLA ancorados à sua superfície), não diferiam muito nos seus perfis de distribuição, apesar da diferença de cargas (Tyr é neutro ao passo que Try-Glutamato-PEG/PDLLA é negativo). Após 24 h da injecção intravenosa a ratos, ainda se encontrava 25% da dose a circular no sangue. No entanto, 4 h após a injecção, as partículas carregadas negativamente não se encontravam acumuladas no fígado e no baço, verificando-se a sua eliminação por via urinária. Os autores deste trabalho especulam que, devido à repulsão electrostática e estérica, a entrada nas células hepáticas foi reduzida [141]. Assim, não só a carga mas também os grupos funcionais (e moléculas específicas) presentes à superfície das NPs são fundamentais ao entendimento e previsão do perfil de distribuição destas. I.4.2.4 Efeito da forma e do núcleo das NPs na sua distribuição Há outros parâmetros a ter em conta como a forma das NPs e o núcleo da partícula. Os estudos realizados acerca do efeito da forma das NPs sobre a distribuição não são abundantes, no entanto os que existem demonstram que esta tem alguma influência no perfil de distribuição. Malugin et al., 2009, realizaram um estudo in vitro para estabelecer uma comparação da penetração celular entre nanoesferas e nanobastonetes de Au. Células tumorais da próstata da linha PC-3 foram expostas a NPs esféricas com um diâmetro de 30 nm, sem revestimento e com um revestimento de PEG e a nanobastonetes revestidos com PEG com um tamanho de 10 x 34 nm. Após a exposição das células às NPs em estudo, as células foram analisadas por ICP-MS e o seu conteúdo em Au determinado. Este estudo I. Introdução 39 demonstrou que as NPs sem revestimento e esféricas são mais extensamente internalizadas pelas células PC-3 (cerca de 3700 Au-NPs esféricas não revestidas por célula e apenas 23 Au-NPs esféricas revestidas por célula). Quando comparamos as AuNPs com revestimento vemos que os nanobastonetes são cerca de 20 vezes mais internalizados pelas células do que as NPs esféricas, mesmo possuindo revestimento semelhante (23 Au-NPs esféricas revestidas por célula vs 479 Au-NPs em forma de bastonete por célula) [142]. Outro estudo que põe em relevância a importância da forma das NPs na maneira como estas interagem com o organismo, influenciando assim o seu perfil de distribuição foi realizado com NPs poliméricas de PEG-poli(etiletileno) (PEE) ou PEGpolicaprolactona (PCL). Estas NPs tem uma forma de verme (longas, cilíndricas e com curvaturas) com um comprimento que varia entre 2 e 12 µm e foram injectadas em ratos e ratinhos, e amostras de sangue recolhidas ao longo de vários dias (até 1 semana após a injecção) [143]. Este estudo mostrou que estas NPs têm um tempo de circulação bastante prolongado, até cerca de 5 dias após a injecção [143]. Uma das razões que podem levar a este tempo de circulação prolongado é descrita por Champion et al., 2009, que criaram NPs de poliestireno, também com uma forma de verme, e que num modelo in vitro usando macrófagos alveolares de rato, mostraram que estas NPs não eram fagocitadas por estas células em claro contraste com as NPs esféricas de mesmo volume. A actividade fagocítica reduzida destas células é devido à limitação das zonas com alta curvatura nas NPs em forma de verme, uma vez que só as duas extremidades das NPs tem os pontos de apoio necessários para a célula as internalizar [144]. Outro factor que pode fazer com que haja uma internalização diminuída das NPs por parte das células do sistema imune, e como tal um aumento no tempo de circulação no sangue, é o facto que a forma de verme faz com que estas sejam arrastadas mais fortemente pela corrente sanguínea, impedindo assim que os macrófagos possam ter oportunidade de realizar a fagocitose [139]. O núcleo das NPs é importante porque não só define a sua agregação (tendo em conta que são partículas nuas, desprovidas de revestimento) mas também o grau de interacção com as proteínas e com os tecidos. Dos estudos realizados até agora em relação ao efeito do núcleo da NP destacam-se os realizados por Shenoy et al. e Sun et al., ambos em 2005. Os primeiros utilizaram NPs poliméricas de poli(óxido de etileno) (PEO) copolimerizadas com poli-β-aminoester (PβAE) ou com PLC para comparar os efeitos destes 46 com revestimento em sílica estavam intactas, quer nas fezes, quer na urina dos ratos, sendo que a única diferença em relação a sua condição inicial foi o seu estado de agregação. Estes investigadores também verificaram que 8,6% das partículas injectadas não eram eliminadas e permaneceram nas células hepáticas até cinco dias (o limite do estudo) sem provocar qualquer tipo de toxicidade e foram recuperadas intactas [165]. Assim, podemos concluir que este tipo de NPs é efectivamente inerte do ponto de vista metabólico, sendo necessário aprofundar a questão do metabolismo, do revestimento e possíveis exposições do núcleo das NPs metálicas para prever melhor a sua consequência. Em relação ao metabolismo das NPs, algumas (nomeadamente os lipossomas, NPs poliméricas e nanoemulsões) podem ser degradadas, de forma mais ou menos controlada, dependendo da sua composição e revestimento, nas suas estruturas mais básicas e estas são depois metabolizadas de acordo com a sua natureza. Já em relação às NPs “biologicamente inertes” existe menos informação disponível, não se sabendo se as NPs são estáveis ao ponto de não serem degradadas durante os longos períodos de tempo que podem permanecer no organismo. Pouco se sabe também sobre o metabolismo do revestimento destas NPs, sabendo que pode acontecer em alguns casos, mas sem se saber a extensão de tal metabolismo e se chega para expor o núcleo metálico das NPs. I.4.3.2 Excreção das NPs A excreção das NPs pode acontecer por várias vias, sendo as mais expressivas a excreção pela via urinária e pela via hepatobiliar que leva à saída das NPs pelas fezes. Existem outras vias de eliminação possíveis, seja através das glândulas mamárias para o leite ou pelas glândulas sudoríparas, mas não existe informação disponível sobre estas 2 vias [1]. Vários parâmetros influenciam a via de excreção que é seguida por uma NP em particular, mas o que parece ser mais determinante é o tamanho da NP, uma vez que os poros dos capilares do glomérulo têm cerca de 70 nm e permitem a passagem de moléculas menores que a albumina, sendo assim concebível que as NPs menores sejam eliminadas por via renal [165]. No entanto, o revestimento da NP também desempenha um papel importante, já que nem todas as NPs que têm menos de 70 nm são filtradas a nível glomerular, podendo ser eliminadas de outra forma ou então depositadas em vários órgãos, existindo vários estudos que suportam esta hipótese [126, 166, 167]. A primeira referência à eliminação de NPs diz respeito a sua retenção nas vias aéreas mais precisamente na zona da traqueia, que são movidas pelos cílios e envolvidas I. Introdução 47 em muco, passam para o tracto gastrointestinal não sendo normalmente absorvidas a nível intestinal e consequentemente eliminadas pelas fezes [9]. No estudo realizado por Chen et al. em 2008, demonstrou-se que as QD de CdSeS com revestimento de sílica, com 21 nm, se mantinham inalteradas após a injecção em ratinhos. Após a análise das amostras recolhidas ao longo de 120 h verificaram que as NPs eram eliminadas quer pelas fezes quer pela urina, havendo também NPs que não eram excretadas ficando assim retidas no fígado. A distinção entre estas 2 vias de eliminação resulta essencialmente do estado de agregação das NPs. As NPs desagregadas que mantinham o seu tamanho individual de 21 nm eram eliminadas pelo rim e consequentemente estavam presentes na urina. Já as partículas que agregavam proteínas séricas estavam mais propensas à agregação com outras NPs, formando assim aglomerados que se verificaram estar presentes nos hepatócitos e daí serem eliminados pela via hepatobiliar, e consequentemente pelas fezes [165]. Então, neste estudo podemos ver a importância quer do tamanho quer do revestimento das NPs na sua excreção, uma vez que o primeiro define se a NP consegue passar através dos poros do glomérulo, e como tal ser eliminada pela via urinaria, mas é o revestimento que determina quais e a quantidade de proteínas plasmáticas que aderem à NP, definindo assim não só o estado de agregação mas também para que tipo de células hepáticas é que estas partículas são transportadas: se para os hepatócitos ou se sofrem fagocitose pelas células de Kuppfer, sofrendo assim excreção pela via hepato-biliar que leva a eliminação através das fezes ou se são retidas no fígado. Tal como é referido anteriormente o estudo feito por Sadauskas et al., 2009, com as Au-NPs é elucidativo sobre distribuição das NPs para o fígado, uma vez que as partículas de Au que são utilizadas têm 40 nm de diâmetro, com revestimento de citrato e uma carga de superfície negativa. Isto favorece a adsorção de proteínas do plasma a estas NPs e a sua consequente eliminação do sangue através do SRE e posterior localização nas células de Kuppfer de ratos, permanecendo neste local até 6 meses após a sua injecção [126]. Esta situação é demonstrada também por Renaud et al., 1989, que estudaram AuNPs com 20 nm de diâmetro e com um revestimento de lipoproteínas de baixa densidade (LDL). Estas NPs foram injectadas intravenosamente em ratos, foram analisadas as fezes e a urina dos animais em intervalos periódicos, assim como o sangue e, depois de os animais serem sacrificados, foram analisados os seus órgãos. Os resultados deste estudo mostraram que as NPs foram depositadas no fígado e excretadas pelas fezes. Foram 48 também investigadas as mesmas NPs, mas com um revestimento de BSA, e os resultados foram contrastantes. Estas NPs revestidas eram internalizadas pelas células de Kuppfer e aí ficavam retidas, não ocorrendo a sua excreção. No entanto quando era previamente administrado cloreto de gadolineo, que tem como principal acção bloquear a actividade das células de Kuppfer, as NPs eram internalizadas pelos hepatócitos em vesículas endocíticas. Nestas condições, as NPs eram excretadas de forma regular via fezes, cerca de 5% da dose injectada por dia, até ao 12º dia após a injecção, decrescendo esta taxa até que ao fim de 3 semanas já não se detectavam mais NPs nas fezes. Isto sugere que para existir uma excreção pelas fezes, as NPs necessitam ser transportadas para o fígado, mais precisamente para os hepatócitos de forma a poderem ser excretadas pelos canais biliares. Pelo contrário quando as NPs são internalizadas pelas células de Kuppfer ficam retidas nestas a longo prazo [168]. Noutro estudo de avaliação da excreção de NPs, foram testadas NPs de sílica com um tamanho de 45 nm e com três tipos de revestimentos diferentes, consistindo em moléculas de PEG, grupos funcionais COOH ou OH. Estas NPs foram injectadas intravenosamente em ratinhos e a sua distribuição pelo organismo avaliada pelo método de MRI, ao longo de 24 h. Alguns animais foram sacrificados as 4,5 h após injecção, e os seus órgãos analisados pelo mesmo método. Este estudo demonstrou que há pouca biodistribuição destas NPs no fígado, especialmente das partículas revestidas com PEG, existindo no entanto excreção de todos os tipos das NPs testadas pela via urinária, sendo que posterior análise à urina evidenciou que as NPs que tinham sido excretadas por esta vida estavam intactas [167]. Já Cho et al., em 2009, mostraram uma dependência do tamanho das NPs não só na via da excreção mas também na velocidade com que são eliminadas do organismo. Neste estudo, foram testadas NPs de sílica com os tamanhos de 50, 100 e 200 nm, sendo estas NPs injectadas intravenosamente em ratinhos. Os animais foram sacrificados às 12, 24, 48, 72 h e 7 dias após a injecção. A urina e as fezes dos animais foram recolhidas nas 12 h antes de cada sacrifício. Os resultados deste estudo mostram que as partículas menores estão presentes em maior quantidade e mais cedo quer na urina quer nas fezes que as partículas maiores, mostrando assim que a excreção está relacionada com o tamanho das NPs [166]. Existem poucos dados sobre a excreção das NPs mas os que existem parecem suportar a hipótese que partículas mais pequenas sofrem uma rápida eliminação pela via urinária e as partículas de maior dimensão ou com níveis de agregação maiores e que são transportadas até aos hepatócitos são eliminadas pelas fezes. As que são absorvidas pelas I. Introdução 49 células de Kuppfer tem um tempo maior de residência no organismo, não existindo provas da sua eliminação, podendo ficar bioacumuladas em vesículas por tempo indeterminado. I.5 Nanotoxicidade Devido às características completamente diferentes dos materiais que as constituem as NPs comportam-se de forma diferente quando comparadas com o material mãe, nomeadamente quanto à sua interacção com o organismo. Assim, é necessário estudar a toxicidade das NPs tendo em conta as suas propriedades físico-químicas. O mecanismo mais extensamente estudado pelo qual as NPs poderiam causar toxicidade envolve a geração de radicais de oxigénio, gerados de diferentes maneiras, especialmente pelas NPs com um núcleo metálico ou que podem conter impurezas metálicas tais como as NPs de carbono. Uma das formas de produção de radicais livres será a activação dos electrões da superfície da NP por radiação UV causando a quebra de ligações e levando à formação de radicais [2, 9]. A superfície da NP pode já ter em si grupos dadores-aceitadores de electrões activos, assim, podem formar ciclos de oxidação redução, como acontece com as NPs à base de metais sem revestimento. A formação destes radicais pode levar ao stress oxidativo e a todos os efeitos tóxicos que daí decorrem [2]. Outros dos possíveis mecanismos de toxicidade originada pelas NPs podem envolver interacções directas das NPs com as moléculas de DNA, havendo já um estudo com QD que descreve a presença de NPs no núcleo celular de embriões de Xenopus, mostrando que estas NPs conseguem passar das células mães para as células filhas [169]. As NPs podem ainda desencadear processos inflamatórios que podem levar a fibrose, aterogénese ou ainda ao aumento da expressão de proteínas de fase aguda, perturbações das funções mitocondriais ou até inibição da função fagocitária [2]. I.5.1 Estudos in vitro Os estudos existentes com diferentes tipos de NPs e em diferentes modelos celulares sugerem que o que governa a citotoxicidade destas NPs são uma série de diferentes factores, como o tamanho, o facto de serem ou não revestidas e a natureza do revestimento. Devido à extensa literatura já existente com estudos com quase todos os tipos de NPs realizados in vitro, esta secção vai abordar os principais estudos de citotoxicidade realizados com Au-NPs. 50 Pan et al., em 2007, avaliaram os efeitos das Au-NPs contendo monosulfonato de trifenilfosfina (TPPMS) ou trifenilfosfina tris-sulfonada (TPPTS) ancorado, e com tamanhos variando de 0,8 nm até 15 nm (0.8, 1.2, 1.4, 1.8, 15 nm). em células do tipo HeLa (linha imortalizada de células retiradas de tumor cervical), SK-mel-28 (células derivadas de melanoma), L929 (células de fibroblastos de ratinho) e J774A1 (macrófagos de ratinho). As NPs de menor tamanho (0.8, 1.2, 1.4, 1.8 nm) utilizadas neste estudo, exerceram um efeito tóxico em todos os tipos de células testadas e as NPs maiores (15 nm) foram consideradas relativamente não tóxicas nas condições testadas. Para além do mais, constatou-se que as células morriam quer por apoptose quer por necrose o que sugere 2 tipos de interacção das NPs com as células mesmo para estes tamanhos tão semelhantes [170]. Em outro trabalho, o mesmo grupo expôs células HeLa apenas a Au-NPs de tamanhos reduzidos (1.1 e 1.4 nm) ancorados a moléculas de TPPMS ou glutationa (GSH) [171]. Com as NPs revestidas com moléculas de GSH obtiveram um LC50 cerca de 65 vezes superior às NPs com TPPMS ancorado, o que mostra um efeito do revestimento na citotoxicidade. Este estudo demonstrou também que incubando as NPs com TPPMS ancorado com as células houve um claro aumento na morte celular que foi revertido adicionando substâncias anti-oxidantes como GSH, N-acetilcisteína (NAC) e TPPMS mas não ácido ascórbico. Verificou-se ainda que existe um aumento na resposta anti-oxidante por parte das células quando são expostas apenas às NPs, evidenciado pelo aumento da expressão de genes envolvidos no sistema anti-oxidante. Assim, este estudo conclui que um dos mecanismos, pelo qual as NPs causam toxicidade nestas células é a sua capacidade para a formação de ROS [171]. Um estudo realizado em 2006 por Pernodet et al., utilizando fibroblastos do epitélio humano (células da linha CF-13) expostos a Au-NPs revestidas com citrato, com tamanho de 14 nm, mostrou que, não só as NPs penetram facilmente nas células, acumulando-se nos vacúolos, mas que a presença das NPs nas células levava a uma diminuição na proliferação, adesão e mobilidade das mesmas; que pode ser explicado pela formação anormal dos filamentos de actina e modificação da matriz extracelular [172]. O revestimento assume uma particular importância nestes estudos de citotoxicidade uma vez que vai determinar a maior parte das vezes a penetração celular, mecanismo de penetração celular e até a distribuição intracelular das NPs [173]. Um estudo que demonstra a capacidade que certos revestimentos têm de influenciar a penetração através da membrana celular foi realizado expondo células HeLa a Au-NPs com tamanhos entre 13 – 60 nm, revestidas com o péptido CALNN, CALNNR 8 ou uma mistura de ambos os péptidos (numa proporção de 1:9, CALNN:CALNNR 8 ). Os resultados I. Introdução 51 deste estudo demonstraram que as Au-NPs sofrem diferentes destinos consoante os revestimentos, uma vez que as Au-NPs revestidas apenas com CALNN não foram internalizadas, as revestidas com CALNNR 8 penetravam facilmente para o interior da célula e as Au-NPs revestidas com o misto dos 2 péptidos eram não só internalizadas mas capazes de chegar ao núcleo. Estes resultados podem ser explicados pela fraca capacidade que o péptido CALNN tem de se ligar a membrana plasmática, não sendo por isso internalizado. No entanto as moléculas de CALNN conseguem atenuar as mudanças ao potencial zeta e a química de superfície provocadas pelas moléculas de CALNNR 8 , isto é, a adição das moléculas de CALNN modificam a força das interacções entre a nanopartícula e a matriz biológica forma as ajustar, permitindo assim a chegada das Au-NPs com este revestimento misto ao núcleo [174]. Em concentrações que variaram de 0.32 – 0.02 nM os ensaios de viabilidade (azul de triptano) mostraram que para as concentrações mais baixas não ocorre nenhuma perda de viabilidade celular. No entanto, para as concentrações mais elevadas (0.32 nM) ocorre uma perda de viabilidade acentuada uma vez que nestas concentrações apenas cerca de 5% das células sobreviram. Os autores sugerem que este fenómeno é devido a rápida internalização de um número de Au-NPs elevado, o que leva ao colapso da membrana celular [174]. I.5.2 Estudos in vivo Os estudos de toxicidade conduzidos até ao momento mostram que o comportamento das NPs é definido por inúmeros factores. Isso torna impossível a adopção de um modelo de “NP universal” a partir do qual se possa extrapolar resultados de estudos para as demais NPs. Como referido, não são só as diferenças na composição interna das NPs que influenciam as suas propriedades físico-químicas mas também o seu revestimento. Sendo assim, o delineamento de protocolos para estudos de toxicidade com NPs parte da caracterização profunda e precisa destas. No entanto, e ao contrário do que acontece com os estudos in vitro, os estudos de toxicidade in vivo das diferentes NPs são escassos, de forma que nesta secção serão descritos os estudos acessíveis com diferentes tipos de NPs. Estudos publicados em modelos animais, utilizando a via intratraqueal, mostraram efeitos tóxicos provocados por nanotubos de carbono. Um dos estudos utiliza como modelo animal ratinhos B6C3F, os quais são expostos, em dose única, pela via intratraqueal a nanotubos de carbono purificados, isto é não contendo impurezas metálicas decorrentes da síntese, em diferente doses (3.3 e 16.6 mg nanotubos de 52 carbono/kg) com o objectivo de testar os efeitos toxicológicos destas NPs nos pulmões. Noventa dias após a exposição às NPs, os ratinhos foram sacrificados e os efeitos tóxicos nos pulmões foram avaliados através de análise histológica. Verificou-se que a distribuição destas NPs nos pulmões era uniforme e que dois quintos dos animais expostos à menor dose apresentavam sinais de inflamação e a formação de granumlomas. No entanto, todos os animais expostos às doses mais elevadas expostos mostravam sinais de danos a nível do tecido pulmonar, nomeadamente a formação de granumolmas e sinais de uma resposta infamatória local [175]. Num outro estudo realizado com nanotubos de carbono e utilizando a via intratraqueal procurou-se testar o potencial toxicológico deste tipo de NPs em ratos até 3 meses após a exposição, sendo que os ratos foram expostos às NPs em 2 concentrações diferentes, 1 e 5 mg NP/kg, em administração única. O primeiro resultado significativo deste estudo foi a taxa de mortalidade de cerca de 15% dos ratos expostos a dose mais elevada. Este aspecto do estudo pode ser explicado pela agregação das NPs na via aérea dos ratos, levando-os a sufocar, não sendo um efeito toxicológico directo que leva a morte destes [176]. Os resultados deste estudo mostram que existiu uma inflamação temporária nos pulmões e a subsequente formação de granulomas sem no entanto existir a produção de biomarcadores de dano pulmonar, o que é comum acontecer para a exposição a materiais pulverizados tóxicos como o quartzo ou o amianto [176]. Recentemente foram publicados 2 estudos sobre o potencial toxicológico de AuNPs. Utilizando Au-NPs revestidas com citrato, com um tamanho de cerca 20 nm, injectadas por via intravenosa em ratos Wistar, com uma dose de 0.01 mg Au/ kg (administração única) os autores deste estudo verificaram a modificação da expressão genética causada por estas NPs no baço e no fígado, avaliada por microarray, 2 meses após a injecção. O gene que tem a sua expressão mais aumentada é o Cyp1a1, sendo que existem outros genes da família do citocromo P450 que também estão com a sua expressão aumentada (Cyp4a e Cyp3). Isto sugere um potencial tóxico das Au-NPs uma vez que estes são os genes que controlam as vias de detoxicação e remoção de xenobióticos da célula. Outros genes com a sua expressão aumentada no fígado prendem-se com o metabolismo lipídico, como o gene que regula a expressão da esqualeno monoxigenase, a enzima que catalisa o passo limitante na formação de colesterol. Já o o gene ttk, que regula a expressão da proteína cinase TTK, que é importante para a proliferação celular, têm a sua expressão reduzida. Este resultado mostra que as células estão num estado não proliferativo, podendo indicar que estas NPs interferem com o ciclo celular. Já em relação ao baço, parece que os genes que regulam a resposta a estímulos exteriores possuem I. Introdução 53 expressão reduzida, podendo significar uma resposta imune comprometida. Tendo em conta estes resultados parece que estas NPs têm um potencial toxicológico, interferindo com a expressão genética e podendo ter um efeito sobre o funcionamento dos órgãos em estudo [123]. O outro estudo de avaliação da toxicidade das Au-NPs foi realizado em ratinhos C57/BL6, nos quais foram injectadas intraperitonealmente, durante 8 dias consecutivos, Au-NPs revestidas com citrato (12,5 nm) em doses que variaram entre 40 – 400 µg Au/kg. Os ratinhos foram sacrificados 24 h após a última injecção, os seus órgãos recolhidos para análise histológica, a quantificação de Au foi realizada por ICP-MS e espectrometria de absorção atómica em câmara de grafite (GFAAS) e no sangue mediram também diferentes parâmetros bioquímicos. A acumulação de NPs nos diferentes órgãos foi dependente da dose, sendo que para as maiores concentrações existia uma menor acumulação das NPs nos diferentes órgãos. O órgão onde se acumularam mais NPs foi no fígado. Quando os ratos foram injectados com 40 µg/kg cerca de 2% da dose injectada foi distribuído para o fígado, e estes valores foram os mais elevados que se encontraram com qualquer das doses injectadas. Os autores atribuem este facto a uma eficácia muito grande do organismo em excretar as Au-NPs quando estas são injectadas por via intraperitonial [177]. A análise histológica realizada a 5 tecidos (cérebro, baço, rim, pulmão e fígado) não evidenciou qualquer diferença a nível histologico em relação ao controlo. O mesmo acontecendo com os paramentos bioquímicos analisados (teor de bilirrubina, fosfatase alcalina, acido úrico, ureia e creatinina). Assim, podemos ver que mesmo injectando repetidamente as Au-NPs intraperitonealmente não existiu uma acumulação no organismo, nem produziram qualquer efeito toxicológico, pelo menos detectável com os parâmetros avaliados [177]. Recentemente tem surgido alguma preocupação sobre a toxicidade das NPs que são inaladas. Epidemiologicamente, foi verificado que estas não provocam um efeito local mas sim exercem um efeito sistémico, aumentando, entre outras coisas, o risco de doenças cardiovasculares [178], não se sabendo no entanto se este aumento se deve às NPs em si ou à cascata de eventos que estas podem iniciar (como por exemplo levar um estado de stress oxidativo) [1]. Nemmar et al., 2002, demonstraram o potencial das NPs inaladas atingirem a circulação sistémica em humanos. Neste estudo, NPs de carbono marcadas com 99mTechnetium, (<100 nm) foram inaladas por 5 voluntários, sendo rapidamente absorvidas e detectadas no sangue, 1 minuto após a inalação, onde permaneceram até cerca de 1 hora [179]. No entanto, estes resultados não puderam ser reproduzidos por 54 nenhum dos 3 estudos que os tentaram replicar [180-182] talvez devido aos baixos limites de detecção das técnicas empregadas, uma vez que estes estudos são realizados em humanos [19]. Considerando a dificuldade de utilizar métodos analíticos invasivos em estudos em humanos (como por exemplo recolha de biopsia de tecido pulmonar), os estudos in vivo em modelos animais são fundamentais para obtenção de dados relacionados ao potencial tóxico das NPs, especialmente em casos de exposição ambiental e ocupacional. II. OBJECTIVOS 62 II.2 Reagentes e materiais Todas as soluções utilizadas foram preparadas utilizando água duplamente desionizada e os reagentes usados acido clorídrico (HCl), acido nítrico (HNO 3 ) e peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 ) foram todos de grau suprapuro (Merk). As soluções padrões de Au foram preparadas diariamente através de uma diluição de uma solução mãe contendo 1000 µg Au / mL (PerkinElmer). A solução modificadora de matriz usada foi preparada contendo 0,75 mL magnésio (Mg), 1,25 mL paladio (Pd) e 35 mL de ácido nítrico (HNO 3 ). De forma a evitar contaminação, um rigoroso procedimento de descontaminação foi realizado em que todo o material que entrou em contacto com as amostras (recipientes de Teflon, pontas de micropipeta, cuvetes descartáveis e tubos de plástico graduados de diferentes tamanhos) foi mergulhado em HNO 3 (15% v/v) durante 24 h, depois passados por água duplamente desionizada e por fim secos numa área livre de pó. II.3 Instrumentação e condições analíticas A quantificação de Au foi efectuada utilizando um espectrómetro de absorção atómica com câmara de grafite A Analyst 600 (PerkinElmer) equipado com um pipetador automático. Um resumo das condições analíticas encontra-se na tabela II 2. Tabela II 2 – Resumo das condições analíticas usadas para a quantificação de Au. As leituras foram efectuadas ao pico de absorção de 242,8 nm, com uma lâmpada de cátodo oco de Au. O amostrador automático foi programado para pipetar 20 µL da Passo Temperatura (ºC) Rampa de temperatura (s) Temperatura Constante (s) Fluxo do Gás (mL/min) 1 (Secagem) 110 15 25 250 2 (Secagem) 140 15 25 250 3 (Pirólise) 800 25 25 250 4 (Atomização) 1800 0 5 0 5 (Limpeza) 2450 1 3 250 III. Secção Experimental 63 solução a analisar e 10 µL da solução de modificadora de matriz para o interior da câmara de grafite. II.4 Validação do método Os parâmetros que consistiram na validação deste método foram a linearidade, precisão, exactidão, os limites de quantificação e detecção e a recuperação. A linearidade foi medida utilizando 5 soluções padrão de Au analisadas em condições analíticas óptimas, sendo o intervalo de linearidade 0.65 – 50 µg Au/L (tabela II 2). Os limites de quantificação (LQ) e detecção (LD) para este método foram calculados usando as seguintes fórmulas: LQ = 10 s/m e LD = 3 s/m, onde s é o desvio padrão das leituras feitas a uma solução apenas contendo o branco e m o declive da curva de calibração. O LD deste método foi 0.65 µg Au/L e o LQ fixou-se em 2.15 µg Au/L (tabela II 3). A precisão foi avaliada em 5 órgãos diferentes (baço, fígado, pulmões, rins e sangue) tendo 1 amostra de cada um dos órgãos sido contaminada com 1 concentração conhecida de Au previamente a sua digestão. 20 leituras repetidas destas amostras foram lidas pelo método analítico utilizado para chegarmos ao valor da precisão. Os valores encontrados para a precisão do método foram de 3,3% para o baço, 6,4% para o fígado, 1,4% para o pulmão, 3,7% para o rim e 5,7% para o sangue Tabela II 3. Tabela II 3 – Resumo dos diferentes parâmetros de validação do método. Precisão (cv %) Linearidade Limite de Detecção Limite de Quantificação Baço Fígado Pulmões Rim Sangue µg/L µg/kg µg/kg Au 3.3 6.4 1.4 3.7 5.7 0.65-50 0.65 2.15 A exactidão do método após a digestão ácida das amostras foi avaliada pelo método da adição padrão. Foram adicionados a amostras de 5 órgãos (baço, fígado, pulmões, rins e sangue) várias concentrações conhecidas de Au (2.5, 5, 10 µg Au /L) previamente a digestão ácida destas, sendo depois calculado a quantidade de ouro recuperada. Destas 5 amostras apenas as amostras de fígado provieram de um animal injectado apenas com 64 soro fisiológico sendo que as amostras dos outros órgãos provieram de ratos previamente injectados com 300 µL de uma suspensão contendo Au-NPs revestidas com citrato (115 µg Au/ mL). Verificou-se que a recuperação nunca esteve abaixo dos 85%, sendo um resumo destes resultados apresentado na Tabela II 4. III. Secção Experimental 65 Tabela II 4 - Resultados estatísticos para a recuperação de Au obtidos pela adição de padrões a amostras dos diferentes órgãos recolhidos Órgão C 1 (µg/kg) C 2 (µg/L) C 3 (µg/kg) Recuperação (%) Baço 170.03±6.6 n= 5; cv(%)= 3.9 2.5 191.8±5.6 n= 6; cv (%) = 2.9 94.1±2.1 n= 6; cv (%) = 2.2 5.0 213.2±9.6 n=5; cv (%) = 4.5 92.7±7.9 n= 5; cv (%) = 8.6 10.0 262.9±6.7 n=6; cv (%) = 2.6 96.4±2.6 n=6; cv (%) = 2.4 Fígado < LD 2.5 61.7±3.6 n=12; cv (%) = 6.3 100.4±6.0 n=12; cv (%) = 6.0 5.0 100.4±6.7 n=12; cv (%) = 6.4 85.8±4.5 n=12; cv (%) = 5.3 Pulmão 121.0±3.1 n= 5; cv(%)= 2.5 2.5 173.3±3.2 n=6; cv (%) = 1.9 104.6±7.2 n=6; cv (%) = 6.9 5.0 224.9±2.8 n=6; cv (%) = 1.2 103.9±3 n=6; cv(%) = 2.9 10.0 312.8±3.4 n=6; cv (%) = 1.1 95.9±1.9 n=6; cv (%) = 2.0 Sangue 18.8±0.8 n= 5; cv(%)= 4.4 2.5 37.3±2.7 n=10; cv (%) = 7.4 94.0±9.2 n=10; cv (%) = 9.8 5.0 56.3±2.2 n=9; cv (%) = 4.0 93.8±5.6 n=9; cv (%) = 5.9 Rim 3.1±3.1 n= 5; cv(%)= 101.2 2.5 30.2±1.3 n=6; cv (%) = 4.4 108.6±5.3 n=6; cv (%) = 4.8 5.0 53.6±2.1 n=6; cv (%) = 4.0 101.0±4.3 n=6; cv (%) = 4.2 10.0 99.3±2.8 n=6; cv (%) = 2.8 96.3±2.8 n=6; cv (%) = 2.9 C 1 - Concentração inicial de Au (µg/Kg) encontrada nos diferentes órgãos após a injecção de 300 mL de uma solução contendo 115 µg/ml Au (Baço, Pulmão, Sangue e Rim) ou soro fisiológico (Fígado); C 2 - Concentração da solução padrão de Au (µg/L) adicionada as amostras dos diferentes órgãos antes do processo de digestão; C 3 - Concentração final de Au (µg/kg) encontrada nas amostras contaminadas (por adição padrão); cv (%) – Coeficiente de variação 66 II.5 Quantificação de Au nas suspensões de Au-NPs A determinação da concentração das NPs nas suspensões foi realizada utilizando a técnica acima descrita. A suspensão a testar foi sonicada durante 5 minutos de forma a homogeneizar completamente, sendo retirado 1 mL desta suspensão que foi diluído em 12 mL de ácido clorídrico (HCl) 0,2% (v/v). Esta solução foi homogeneizada vigorosamente por meio de um vortex e foram diluídos 50 µL desta solução em 5 mL de HCl 0,2% (v/v), obtendo assim uma diluição de 2400 vezes. Cerca de 1 mL desta solução foi utilizada para preencher uma cuvete descartável que foi colocada no amostrador automático do espectrómetro de absorção atómica com câmara de grafite. Um resumo dos resultados encontra-se na Tabela II 1. II.6 Estudos de biodistribuição das Au-NPs Os animais usados nesta experiência in vivo foram machos da estirpe Wistar (Charles River Laboratories, Barcelona, Espanha) com pesos compreendidos entre 200 e 300 g. Água e ração foram providenciadas durante toda a experiencia ad libitum. Os animais foram condicionados e tratados segundo as normas definidas pelo Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the Institute for Laboratory Animal Research [184], licenciadas pela direcção geral de veterinária e realizadas obedecendo à lei portuguesa. As suspensões dos diferentes tipos de Au-NPs foram injectadas por via intravenosa, pela veia da cauda, num volume de suspensão de 1 mL por rato. Os ratos controlo (n=2) foram injectados com uma solução de soro fisiológico com volumes equivalentes. Anteriormente à injecção de Au-NPs, os ratos foram ligeiramente anestesiados com tiopental (30 mg / kg). As injecções de Au-NPs foram bem toleradas e nenhum efeito adverso foi observado nas 24 h seguintes. Os ratos foram colocados em gaiolas metabólicas, 1 rato por gaiola, e sacrificados ao fim de 24 h (n=4). Para os ensaios com as Au-NPs revestidas com citrato, os ratos foram também sacrificados ao fim de 30 min, 2 h e 6 h (n=4 para todos os tempos). No tempo indicado, os ratos foram anestesiados com tiopental (60 mg/kg). O sangue foi recolhido através da veia cava ou directamente do coração, para tubos heparinizados. Os ratos foram depois sacrificados e o baço, cérebro, coração, fígado, intestinos (duodeno), músculo, osso (fémur), pulmão, rim e testículos foram recolhidos assim como a cauda. As amostras foram depois lavadas rapidamente em soro fisiológico, secas em papel de filtro, pesadas e posteriormente congeladas à -40ºC até a altura da análise. III. Secção Experimental 67 II.7 Preparação das amostras para análise por GFAAS Para preparar as amostras para a análise por GFAAS, foi escolhido o método de digestão ácida. As amostras foram colocadas em recipientes de Teflon sem preparação previa, com a excepção do tecido de fígado que foi homogeneizado e cerca de 1 g de tecido foi colocado em cada recipiente de Teflon. Uma mistura de HNO 3 (65%) e H 2 O 2 (numa proporção de 4:1) foi adicionada às amostras que foram colocadas na estufa a 105ºc durante cerca de 24 h. Após este período de tempo, as amostras foram retiradas da estufa e arrefecidas a temperatura ambiente, sendo adicionado HCl (37%) e colocadas de novo na estufa (105ºC, 24h). As soluções líquidas e acidificadas contendo a amostra digerida foram então transferidas para tubos de plástico, sendo adicionada água até estas perfazerem o rigoroso volume desejado. Antes de serem analisadas por GFAAS algumas amostras foram previamente diluídas (fígado, baço e pulmão) devido ao seu alto conteúdo em Au. Cerca de 1 mL destas soluções foram utilizadas para preencher uma cuvete descartável e esta foi colocada no espectrómetro de absorção atómica com câmara de grafite. II.8 Análise por TEM A para a análise por este tipo de técnicas de microscopia as amostras foram passadas por soro fisiológico, secas em papel de filtro e 2 pequenas porções foram cortas dos seguintes órgãos: baço, fígado, pulmão e rim. Estas amostras foram preservadas em gluteraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio (0,2 M; pH7,2-7,4; 4ºC), sendo depois imediatamente refrigeradas e armazenadas para posterior análise. A análise foi realizada pelo grupo CIAFEL da Faculdade de Desporto da Universidade do Porto. II.9 Análise estatística A análise estatística foi realizada utilizando o teste de Kruskal-Wallis, seguido de um teste pos-hoc de Student-Newman-Keuls. A significância estatística foi assumida para um p <0,05, 68 IV. RESULTADOS 70 IV. Resultados 71 III.1 Perfil de biodistribuição de Au-NPs revestidas com citrato ao longo de 24 h. Figura III 1 – A) Percentagem de Au injectado sob a forma de Au-NPs revestidas com citrato encontrada em cada um dos tecidos analisados para os diferentes tempos: 30 min, 2 h, 6 h e 24 h (n=4). Os tecidos analisados foram o baço, cauda, cérebro, coração, fígado, intestinos (duodeno), músculo, osso (fémur), pulmão, rim, sangue total e testículos. B) Variação da percentagem de Au em alguns tecidos (baço, fígado, pulmão e sangue total) nos tempos já referidos. Os resultados estão apresentados como % de Au injectado ± SEM (*<0,05 vs Figado 30 min,$ <0,05 vs Figado 2 h, # <0,05 vs Figado 6 h, £ <0,05 vs Figado 24 h). A) Baço Cauda Cerebro Coração Figado Intestinos Musculo Osso Pulmão Rim Sangue Testiculos 0 2 4 6 8 10 50 60 70 80 90 100 30 min 2 H 6 H 24 H 30 min 2 H 6 H 24 H 0 2 4 6 8 10 50 60 70 80 90 100 Figado Baço Pulmão Sangue B) * * * $ # # £ V. DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS 80 V. Discussão e considerações finais 81 Neste estudo, o nosso principal objectivo foi a comparação dos perfis de biodistribuição de Au-NPs com diferentes revestimentos, nomeadamente, revestidas por citrato, 11-Mua, CALND, CALNN, CALNS. IV.1 Perfil de Distribuição das Au-NPs revestidas com citrato Após injecção intravenosa, o perfil de biodistribuição das Au-NPs revestidas com citrato, ao longo das 24 h avaliadas, permanecem constante, isto é, sem variações significativas da quantidade de Au nos diferentes órgãos (Figura III 1 A e B). Estas NPs acumulam-se essencialmente no fígado (74,53 % ± 6,62 6 h após a injecção), podendo-se encontrar quantidades apreciáveis também no baço. Este perfil de distribuição está de acordo com os dados encontrados na literatura onde já foi descrito a acumulação de AuNPs com este revestimento no fígado de ratos injectados por via intravenosa de até 6 meses após a injecção, sugerindo a não existência de nenhuma via eficaz de eliminação pelo organismo [126]. No presente estudo, verificou-se que as NPs revestidas com citrato são rapidamente removidas do sangue, uma vez que ao fim de 30 minutos após a injecção apenas 0,81 % ± 0,25 da dose injectada é encontrada neste tecido. O pico de concentração sanguínea foi atingido 2 h após a injecção (2,36% ± 1,48 da dose injectada) (Figura III 1 A e B). Estes dados estão de acordo com alguns estudos já descritos na literatura que demonstram que NPs semelhantes (Au-NPs revestidas com citrato), ainda que com tamanhos ligeiramente diferentes (1,4, 15, 18, 50, 100, 200 nm) são rapidamente removidas da corrente sanguínea [125, 136]. No entanto, também já foi descrito na literatura a presença de Au-NPs deste tipo, após injecção intravenosa em ratos, no sangue ao fim de 24 h [124, 127]. De Jong et al., 2008, injectaram em ratos Au-NPs revestidas com citrato com tamanhos variados (10 a 250 nm) e verificaram que uma grande percentagem das doses injectadas ficava acumulada no sangue mesmo ao fim de 24 h. Este perfil verificava-se para as Au-NPs com tamanho mais semelhante as utilizadas no presente estudo, 10 e 50 nm, em que cerca de 36% e 31%, respectivamente, ficavam acumuladas no sangue [124]. O mesmo acontece no estudo de 2009, realizado por Terentyuk et al., também em ratos, utilizando Au-NPs de diferentes tamanhos (15, 60, 150 nm) onde se verificou uma acumulação no sangue das NPs de menor tamanho, atingindo valores superiores aos das Au-NPs acumuladas no baço, ao fim das 24 h [127]. Este facto pode relacionar-se com o estado de agregação das NPs utilizadas nos diferentes estudos, já que quanto mais agregadas estiverem as NPs maior é o seu tamanho. Como já se sabe, o 82 tamanho influencia o tipo e a quantidade de proteínas que se podem adsorver à superfície da NP [185, 186] e como tal a sua opsonisação, afectando assim a capacidade das NPs evitarem o SER [23]. O estado de agregação pode estar alterado nestes diferentes estudos já que de Jong, 2008, utiliza a solução de NPs diluída 9:1 em PBS e Terentyuk, 2009, utiliza uma solução bastante menos concentrada que a utilizada no âmbito do presente estudo (58 µg/mL vs 249 µg/mL), o que poderia explicar as diferenças nos estados de agregação, e consequentemente, a possível discrepância dos resultados obtidos. A maior quantidade de Au, e consequentemente das NPs, encontra-se acumulada no fígado ao longo das 24 h, atingindo o seu valor máximo às 6 h com 74,53 % ± 6,62 da dose injectada acumulada neste órgão. No baço, observou-se uma clara tendência de diminuição da quantidade de Au ao longo do tempo (2,55 % ± 0,38% da dose injectada aos 30 minutos comparado com os 1,34 % ± 0,23 da dose injectada ao fim de 24 h) (figura III 1 A e B/tabela III 1). O perfil de distribuição verificado neste trabalho ao longo de 24 h é semelhante ao já previamente encontrado em diferentes estudos efectuados com NPs semelhantes [127, 136, 177], uma vez que as NPs se acumulam essencialmente no fígado e no baço. Esta acumulação preferencial por estes 2 órgãos do SRE, que é o sistema biológico responsável pela detecção e eliminação das NPs do sangue, levando-as então para estes órgãos onde se acumulam [23]. No pulmão, existe uma quantidade inicial de Au relativamente elevada (5,58 % ± 2,28 da dose injectada aos 30 min), que parece ser removida rapidamente uma vez que os valores detectados ao fim de 2 h menores que 1% da dose injectada, permanecendo assim até o fim do estudo (figura III 1 A e B). Outro factor importante que condiciona a distribuição das NPs, é a via de administração. Já foram descritos na literatura, estudos com Au-NPs revestidas com citrato administradas por via gastrointestinal [62], por instilação traqueal [121, 136] ou por injecção intraperitonial [177]. Comparando os nossos resultados após injecção intravenosa das Au-NPs a ratos com outras vias de administração de Au-NPs revestidas com citrato, como esperado, podemos constatar algumas diferenças. O perfil de biodistribuição de Au-NPs revestidas a citrato (4, 10, 28 e 58 nm) fornecidas a ratinhos através da água durante 7 dias mostra uma clara dependência do tamanho para ultrapassar a barreira intestinal, uma vez que as NPs 58 nm não são praticamente detectadas nos animais a não ser no intestino e no estômago [62]. As NPs com tamanho intermédio de 10 nm e 28 nm acumulam-se, para além dos intestinos e estômago, nos rins e no baço, respectivamente. No caso das NPs menores (4 nm), estas ficam concentradas essencialmente nos rins, sendo também V. Discussão e considerações finais 83 descritas em órgãos como o fígado, o baço, os pulmões e, em menor quantidade, no sangue e no cérebro [62]. Existem também alguns estudos realizados com este tipo de NPs com instilação traqueal [121, 136]. Num dos estudos foram usadas Au-NPs revestidas com citrato com tamanho 2, 40 e 100 nm, e verificou-se através de técnicas de imagiologica (microscopia óptica e TEM) a presença de todas estas nos pulmões. A quantidade da dose instilada acumulada no fígado foi medida através de ICP-MS e verificou-se que para todas estas NPs as % das doses encontradas foram mínimas, nomeadamente cerca de 1,35‰ para as NPs com o tamanho de 2 nm e não foi possível detectar NPs de tamanho superior [121]. Aliás, o mesmo foi observado por Semmler-Behnke et al., 2008, que verificou o perfil de biodistribuição de Au-NPs revestidas com citrato, com tamanhos de 1,4 e 18 nm, após instilação traqueal. Aproximadamente 100% das NPs de 18 nm instiladas estavam acumuladas nos pulmões (99,8 ± 0,2 das NPs de 18 nm) e 91,5% ± 2,8 das NPs de 1,4 nm estavam também nos pulmões, sendo encontrados apenas 0,7% ± 0,3 no fígado [136]. Uma outra via para introduzir as NPs no organismo será por injecção intraperitonial. Um estudo onde se avaliou o perfil de distribuição de Au-NPs com 12,5 nm, após a injecção intraperitonial destas NPs com diferentes doses e durante 8 dias consecutivos mostrou um perfil distinto dos já apresentados até agora. O perfil encontrado foi grande acumulação das NPs no sangue com uma baixa distribuição, sendo que a quantidade máxima encontrada no fígado foi cerca de 2% da dose injectada e em todos os outros órgãos analisados (cérebro, baço, rim e pulmão) foram encontrados apenas cerca de 0,5% [177]. Como podemos constatar, existem diferenças ao nível do perfil de distribuição, com certeza relacionadas com o tipo de barreira que estas NPs têm que atravessar de forma a chegar à corrente sanguínea. IV.2 Perfil de distribuição das Au-NPs revestidas com péptidos Para verificar a influência das propriedades físico-químicas das Au-NPs no perfil de distribuição, comparou-se a distribuição das NPs revestidas com citrato com as NPs revestidas com 11-Mua. Verificámos que o perfil de distribuição destas duas NPs é muito semelhante, com as NPs concentradas essencialmente no fígado e no baço, o que nos leva a concluir que as mudanças introduzidas a nível de tamanho e de potencial zeta, em consequência dos dois tipos de revestimentos, não afectam o perfil de distribuição das NPs avaliadas (figura III 2). 84 O perfil de distribuição de todas as NPs revestidas com péptidos CALND, CALNN e CALNS difere significativamente do perfil de distribuição das NPs revestidas com citrato, em particular existe uma maior acumulação de Au-NPs no fígado e uma menor quantidade de Au-NPs presentes no sangue, 24 h após a injecção (figura III 3). Em relação aos valores de Au presentes no fígado, verificámos que para as NPs revestidas com CALND, CALNN e CALNS os valores encontrados são 77,47 % ± 2,52, 86,11 % ± 7,13 e 73,66 % ± 4,84 respectivamente, enquanto para as NPs de citrato 57,94 % ± 2,57, evidenciando assim uma acumulação significativamente maior no fígado das Au-NPs revestidas com os péptidos. No sangue, acontece o fenómeno oposto, isto é, as 24 h após administração há uma significativamente menor % das NPs revestidas com péptidos injectadas (0,18 % ± 0,09, 0,24 % ± 0,12, 0,36 % ± 0,06 para as NPs revestidas com CALND, CALNN e CALNS respectivamente) em relação as NPs revestidas com citrato (1,14 % ± 0,40). Para além do mais, existe um aumento significativo na acumulação no baço das NPs revestidas com CALNN (2,79 % ± 0,30) em relação às NPs de citrato (1,34 % ± 0,23) (tabela III 2). Estes dados sugerem uma potencial acção do SRE em relação a estas NPs, uma vez que estas são eliminadas da corrente sanguínea mais extensamente e são acumuladas nos órgãos tipicamente envolvidos com a acção deste sistema. Este efeito pode ser devido ao facto de os péptidos que constituem o revestimento das NPs promoverem a adsorção de diferentes tipos de proteínas plasmáticas e/ou o aumento de adsorção das proteínas que já se ligam às NPs de citrato, fazendo com que a interacção entre as NPs e a matriz biológica seja diferente, e como tal, altera o seu perfil de distribuição [132, 187]. Já está bem estabelecido que os revestimentos mudam o perfil de distribuição das NPs [23], sendo que geralmente são usados para direccionar as NPs para um local específico no organismo ou então para prolongar o seu tempo de semi-vida na corrente sanguínea. A adição de um revestimento de PEG a Au-NPs (13 nm) fez com que estas permanecessem no sangue de ratinhos até 7 dias após a sua injecção, tempo após o qual os níveis de Au no sangue caiam para valores semelhantes ao background, da mesma forma que os níveis de Au no fígado aumentaram progressivamente [188]. Revestimentos peptídicos aplicados a outro tipo de NPs, neste caso em específico uma NP polimérica com um revestimento PLGA-CONH-GlicinaL -FenilalaninaD -Treonina-GlicinaL -FenilalaninaL -LeucinaL -Serina(O-β-d-glucose)-CONH 2 , conseguem modificar as propriedades da NP de forma a que esta consegue atravessar a barreira hematoencefálica e assim modificar o perfil de distribuição desta NP [149]. V. Discussão e considerações finais 85 IV.3 Distribuição intracelular das Au-NPs Após estarem bem definidos quais os locais de acumulação, no organismo do rato, das Au-NPs utilizadas neste estudo, tentou-se avaliar a localização celular das NPs através de uma técnica imagiológica, TEM. Dos tecidos testados (baço, fígado, pulmão e rim) apenas foi possível detectar NPs no tecido hepático (figura III 4 A-D). Neste tecido, todas as NPs são detectadas em organelos intra-hepatocitários num estado de agregação elevado, sendo que as NPs revestidas por citrato, 11-Mua e CALND estavam essencialmente presentes em endossomas e as NPs revestidas com CALNS são encontradas em lipossomas secundários. Esta é uma observação reportada neste estudo pela 1ª vez, uma vez que na literatura os estudos realizados in vivo até ao momento com Au-NPs revestidas com citrato estão no interior de macrófagos, seja no fígado ou no baço, quando as NPs são injectadas por via intravenosa [122, 126, 188] ou nos pulmões, quando há uma instilação traqueal [121]. Alguns estudos in vitro demonstram que as Au-NPs têm potencial toxicológico quando penetram no interior de diferentes tipos de linhas celulares humanas como HeLa, SK-mel-28, L929, J774A1 [170, 171, 189] ou ainda hepatócitos de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) [190]. Neste estudo, os hepatócitos de truta arco-íris foram expostos a soluções contendo Au-NPs revestidas com citrato, com tamanho entre 5-10 nm, em concentrações progressivamente crescentes (0,058 – 17,4 mg/L). Os resultados deste estudo mostram que os hepatócitos, 2 h após a exposição as concentrações de 17,4 mg/L de Au-NPs, têm a produção de ROS aumentada para valores cerca de três vezes superiores aos registados nas células controlo. No entanto não foi detectado nenhum efeito a nível do metabolismo celular nem ao nível da integridade da membrana citoplasmática [190]. A toxicidade deste tipo de Au-NPs já tem sido demonstrada em outras linhas celulares, nomeadamente HeLa [170, 171], SK-mel-28 [170], L929 [170], J774A1 [170, 189], MRC-5 [191], CF-31 [172], mostrando que estas Au-NPs, revestidas com citrato [172, 189, 191] ou com alguma molécula ancorada [170, 171], podem causar apoptose e necrose celular [170, 171] para além de aumentarem os níveis de ROS [191], modificar a expressão genica especialmente para os genes que controlam algumas interleucinas e o TNF-α [189] ou ainda alterar a mobilidade, adesão e proliferação celular [172]. Estes dados evidenciam a necessidade de se realizar estudos para avaliar a biocompatibilidade das NPs utilizadas no presente trabalho. 86 IV.4 Considerações finais No âmbito deste trabalho procurou-se caracterizar-se qual o perfil de biodistribuição de Au-NPs, revestidas com citrato, após injecção intravenosa no rato, ao longo de 24 h, assim como verificar se o revestimento destas NPs com 3 tipos de péptidos diferentes tem influência sobre o perfil de biodistribuição. Nos resultados apresentados pudemos constatar uma eliminação rápida da corrente sanguínea das Au-NPs revestidas com citrato e sua subsequente acumulação em órgãos chave do SER, fígado e o baço. Verificamos também uma mudança no perfil de biodistribuição destas NPs após o seu revestimento com os 3 péptidos utilizados (CALND, CALNN e CALNS), levando a uma maior acumulação destas no fígado e uma menor concentração a nível sanguíneo ao fim de 24 h. Já as Au-NPs revestidas com 11-Mua não têm o seu perfil de distribuição alterado sendo em tudo semelhante ao das Au-NPs revestidas com citrato. Por fim, verificamos que todas as Au-NPs utilizadas neste estudo conseguem ser internalizadas pelos hepatócitos, sendo observadas em estruturas secundárias intra-hepatocitárias. Os estudos já realizados in vitro mostram um potencial toxicológico deste tipo de Au-NPs, especialmente para os tamanhos mais reduzidos, sempre que estas NPs conseguem penetrar a membrana citoplasmática e alcançar o interior da célula [170, 172, 190]. Os resultados deste estudo de biodistribuição conjugados com a prova imagiologica que estas Au-NPs conseguem ser internalizadas pelos hepatócitos sugerem que existe o potencial de estas NPs exercerem um efeito tóxico no organismo. Aliás, estes resultados demonstram a importância de realizar estudos in vivo para determinar os parâmetros farmacocinéticos das Au-NPs e demonstrar de forma mais clara quais são as principais características das NPs que vão influenciar estes parâmetros [1]. Será necessário também investigar qual o parâmetro que mais influencia a distribuição se o tamanho ou se o revestimento e de que forma é que estes afectam não só a distribuição ao nível do organismo mas também ao nível celular, isto é, quais as propriedades que influenciam não só o órgão em que se distribuem as NPs mas também em que tipo de células desse órgão e para que organelos celulares estas se dirigem. Em suma, os estudos in vivo, aliado a informação prévia retirada dos estudos in vitro podem nos ajudar a prever para onde os novos tipos de NPs sintetizadas se distribuem e sintetizar assim NPs mais eficientes para os propósitos desejados. Em relação a perspectivas futuras deste trabalho, mais estudos in vivo serão necessários para compreender o impacto destas Au-NPs nas funções hepáticas, uma vez que foi demonstrado que estas conseguem penetrar para o interior dos hepatócitos, e se V. Discussão e considerações finais 87 existe perda de função ou lesões a nível hepático. Outro ponto a testar será qual a interacção destas Au-NPs com as proteínas plasmáticas e o sistema imune, uma vez que o perfil de distribuição está alterado quando aplicados os revestimentos peptídicos. Seria interessante perceber se o tipo e a quantidade de proteínas plasmáticas adsorvidas a estas proteínas estão alterados. Uma vez que este estudo demonstrou in vivo a internalização de Au-NPs revestidas com citrato em hepatócitos, seria também relevante verificar qual a via de internalização destas Au-NPs e se diferiam das Au-NPs revestidas, quer com péptidos, quer com o 11-Mua. 94 37. 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