Determinação in vitro da atividade antibacteriana de artemísia vulgaris, coptis chinensis e scutellaria barbata: comparação entre infusão, decocção e óleo essencial

Determinação in vitro da atividade antibacteriana de Artemísia vulgaris, Coptis chinensis e Scutellaria barbata: comparação entre infusão, decocção e óleo essencial Porto 2014 Sónia Raquel Ferreira de Melo Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa Sónia Raquel Ferreira de Melo Determinação in vitro da atividade antibacteriana da Artemísia vulgaris, Coptis chinensis e Scutellaria barbata: comparação entre infusão, decocção e óleo essencial Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Medicina Tradicional Chinesa submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador - Professor Doutor Henry Joahnnes Greten Categoria - Professor Associado Afiliação - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Co-orientador – Natália Ana Pereira da Cruz Martins Categoria – Doutoranda e Especialista em Medicina Natural Afiliação – Centro de Engenharia Biológica, Universidade do Minho Resumo Introdução: Atualmente, o aumento do número de espécies bacterianas com resistência a antibióticos é um problema importante ao nível da saúde pública e saúde animal. Para travar este processo, vários estudos têm sido realizados no sentido de descobrir novos agentes antibacterianos à base de plantas. As propriedades antimicrobianas de fórmulas herbais da Medicina Tradicional Chinesa têm sido amplamente estudadas na medicina ocidental. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antibacteriana de Artemísia vulgaris (Lineu, 1753), Coptis chinensis (Franch, 1897) e Scutellaria barbata (D. Don, 1825) e comparar as diferentes eficácias entre infusão, decocção e óleo essencial. Métodos: A atividade antibacteriana foi efetuada utilizando o ensaio de difusão em disco (padronizado pelo NCCLS). Foram utilizadas cinco espécies de bactérias: duas Gramnegativas - Escherichia coli (ATCC 11775) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e três bactérias Gram-positivas - Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Staphylococcus aureus (ATCC 9144) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990). Resultados: Artemísia vulgaris: atividade antibacteriana foi observada apenas para o óleo essencial sendo mais pronunciada para Enterococcus faecalis (20 µl). Coptis chinensis: sem atividade antibacteriana observada nas espécies Gram-negativas. A preparação de óleo essencial exerceu efeitos inibitórios para todas as bactérias Gram-positivas. Infusão e decocção (20 µl) apresentou atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus. Scutellaria barbata: nenhuma atividade antimicrobiana para as espécies testadas. Conclusão: Este estudo revelou que a atividade antibacteriana de fórmulas herbais da Medicina Tradicional Chinesa é dependente do tipo de preparação e das concentrações testadas. O óleo essencial de Artemísia exerceu atividade antibacteriana contra todas as bactérias testadas. O óleo essencial de Coptis chinensis apenas teve efeito contra as bactérias Gram-positivas. A infusão e decocção de Coptis chinensis barbata também apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus. Scutellaria não apresentou atividade antibacteriana. Apesar das diferenças observadas, é muito importante destacar que os estudos in vitro são apenas uma observação preliminar. Diante de uma situação clínica real, tem que ser escolhido o tratamento fitoterápico mais preciso e adequado. Neste sentido, mais estudos são necessários com vista a um maior conhecimento das propriedades antibacterianas dessas plantas, tais como a existência de efeito sinérgico entre elas, bem como diferentes concentrações de extrato. Palavras-Chave: Atividade antibacteriana, Medicina Tradicional Chinesa, Artemísia vulgaris, Coptis chinensis and Scutellaria barbata Abstract Background: Currently, the increasing number of bacterial species with antibiotic resistance is an important problem at a level of public health. In order to halt this process, several studies have been conducted towards to discover new antibacterial agents derived from plants. Herbal formulae of Traditional Chinese Medicine have been widely studied in Western medicine, regarding their antimicrobial properties. Objectives: The aim of the present study was to assess the antibacterial activity of Artemísia vulgaris (Lineu, 1753), Coptis chinensis (Franch, 1897) e Scutellaria barbata (D. Don, 1825) and to compare the different efficacies regarding infusion, decoction and essential oil preparations. Methods: Antibacterial activity was accessed using the disk diffusion hallo assay (standardized by NCCLS). Five bacterial species were used: two Gram negative – Escherichia coli (ATCC 11775) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), and three Gram positive – Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Staphylococcus aureus (ATCC 9144) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990). Results: Artemísia vulgaris: Antibacterial activity was only observed in the essential oil preparation; the most pronounced activity was observed to Enterococcus faecalis (20µl). Coptis chinensis: No antibacterial activity was observed for Gram negative species. The essential oil preparation exerted inhibitory effects for all Gram positive bacteria. Infusion and decoction at 20µl showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus. Scutellaria barbata: tests revealed no antibacterial activity against all the tested species. Conclusion: This study revealed that the antibacterial activity of Tradicional Chinese Medicine herbal formulae is dependent to the type of preparation and tested concentrations. Artemisia essential oil exerted antibacterial activity against all the tested bacteria. Coptis chinensis essential oil only exerted against Gram-positive bacteria. The infusion and decoction of Coptis chinensis also showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus. Scutellaria had no antibacterial activity. Despite the observed differences, is very important to highlight that in vitro studies are only a primary observation. In face to a real clinical situation, the most appropriate phytotherapy treatment needs to be accessed. Further studies are necessaries in order to achieve an higher knowledge of the antibacterial properties of these plants, such as the existence of synergistic effect between them as well as different extract concentrations. Keywords: Antibacterial activity, Traditional Chinese Medicine, Artemísia vulgaris, Coptis chinensis and Scutellaria barbata Agradecimentos Na vida nada conseguimos sem o auxílio direto ou indireto de outras pessoas, assim cabe-me agradecer a todos aqueles que me ajudaram neste caminho: Ao Professor Doutor Henry J. Greten pela experiência e conhecimento; À Doutora Natália Martins pela orientação e partilha de conhecimentos; Ao Bruno Ramos pela disponibilidade, companheirismo e ajuda; A todos os docentes que desde o início da minha formação me ajudaram e souberam transmitir os seus conhecimentos; Ao Professor Jorge Machado e à Maria João pela motivação para a realização deste trabalho; À Dra. Margarida Saraiva do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (Porto) e à Dra. Fátima Loja, Dr. Hugo Guedes e Ana Maria Schürmann da Silva do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária pela cedência de algumas estripes; Ao Prof. Paulo Martins da Costa, Dra. Lucinda Bessa, Dr. Ângelo Mendes, do Laboratório de Microbiologia e Tecnologia Alimentar – Departamento Produção Aquática do ICBAS pelo apoio e cedência de material; Ao Prof. Jorge Machado pela cedência do Laboratório de Fisiologia Aplicada – Departamento Produção Aquática do ICBAS. À Cristina Moreira por me ter dado a conhecer o Mestrado e por todo o auxílio que deu ao longo do mesmo; À minha família em particular aos meus pais, ao meu irmão, aos meus avós, Isabel e Jorge por me apoiarem nesta caminhada; Por fim ao Filipe pela paciência, por me fazeres feliz e porque não são precisas palavras para falar contigo. És um ser especial. Obrigado por existires. Abreviaturas ADN Ácido desoxirribonucleico ATCC American Type Culture Collection C Cardial CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DAEC Escherichia coli que adere difusamente EaggEC Escherichia coli enteroagregativas EHEC Escherichia coli entohemorragicas EIEC Escherichia coli entoroinvasivas EPEC Escherichia coli entoropatogénicas ETEC Escherichia coli enterotoxigénicas F Vesicula biliar H Hepática IC Intestino Grosso IT Intestino delgado L Baço (Lienal) MRSA Staphylococcus aureus resistentes à meticilina MTC Medicina Tradicional Chinesa NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards OMS Organização Mundial de Saúde P Pulmonar PC Pericárdica R Renal S Estômago STEC Escherichia Coli produtora da toxina Shiga TK Tricalórica Índice Introdução ........................................................................................................................11 1. Fitoterapia .................................................................................................................12 1.1. Fitoterapia Chinesa (Heidelberg Model) ................................................................12 1.1.1. Como caracterizar um Fármaco/Planta ..............................................................13 2. Plantas Medicinais ....................................................................................................19 2.1. Artemísia vulgaris ..................................................................................................20 2.1.1.Artemísia Vulgaris na Medicina Tradicional Chinesa ........................................23 2.2. Rizoma Coptis chinensis .......................................................................................25 2.2.1.Rizoma Coptis chinensis na Medicina Tradicional Chinesa ..............................27 2.3. Radix Scutellariae .................................................................................................28 2.3.1. Radix Scutellaria na Medicina Tradicional Chinesa .........................................32 3. Bactérias...................................................................................................................33 3.1. Escherichia coli .....................................................................................................35 3.2. Pseudomonas aeruginosa .....................................................................................37 3.3. Staphylococcus .....................................................................................................38 3.3.1. Staphylococcus aureus (S. aureus) .................................................................38 3.3.2. Staphylococcus epidermidis ............................................................................39 3.4. Enterococcus faecalis ............................................................................................39 4. Material / Metodologia...............................................................................................40 4.1.Amostras ................................................................................................................40 4.2. Preparação da Infusão e Decocção .......................................................................40 4.3. Avaliação da atividade antibacteriana ...................................................................40 5. Resultados e discussão ............................................................................................41 6. Conclusão .................................................................................................................45 7. Bibliografia ................................................................................................................46 Índice de Figuras Figura 1 Curva sinusoidal, representação do yin e yang .................................................13 Figura 2 Curva sinusoidal, representação das Fases ......................................................14 Figura 3 Curva sinusoidal, representação dos Sapores ..................................................15 Figura 4 Principais grupos da Farmacologia Chinesa (Greten, Understanding Chinese Pharmacology, 2010) .......................................................................................................18 Figura 5 Partes que constituem a planta (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009) .................20 Figura 6 Artemísia vulgaris (parte aérea) ........................................................................20 Figura 7 Artemísia vulgaris (folhas e flores secas) ..........................................................20 Figura 8 J.D.Almeida, J.Lourenço, M.Peixoto, P.V.Araújo. (2015). Artemisia vulgaris L. - mapa de distribuição. Flora-On: Flora de Portugal Interactiva, Sociedade Portuguesa de Botânica. http://www.flora-on.pt/#wArtemisia+vulgaris. ....................................................21 Figura 9 Cineol ................................................................................................................22 Figura 10 Isoborneol .......................................................................................................22 Figura 11 Limoneno ........................................................................................................22 Figura 12 Tujona .............................................................................................................22 Figura 13 Coptis (seco) ...................................................................................................25 Figura 14 Coptis chinensis (parte aérea) .........................................................................25 Figura 15 Berberina (Chen & Chen, 2004) .......................................................................26 Figura 16 Scutellaria (parte aérea) ..................................................................................29 Figura 17 Scutellaria (seca) ............................................................................................29 Figura 18 J.Lourenço, E.Portela-Pereira, P.V.Araújo, M.Porto, J.Farminhão, J.D.Almeida, P.Alves, C.Aguiar, et al. (2014). Scutellaria - mapa de distribuição. Flora-On: Flora de Portugal Interactiva, Sociedade Portuguesa de Botânica. http://www.flora-on .................29 Figura 19 Baicalina .........................................................................................................30 Figura 20 Baicaleina .......................................................................................................30 Figura 21 Wogonina ........................................................................................................30 Figura 22 Consumo na comunidade de antibióticos de uso sistémico na Europa (2010) 34 Figura 23 Mecanismos de resistência bacteriana ............................................................35 Figura 24 Escherichia coli resistente a cefalosporinas de terceira geração, na Europa (2011) ..............................................................................................................................36 Figura 25 Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenemes, na Europa (2011) ....37 Figura 26 Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) na Europa (2011) ......39 Figura 27 Esquema das Placas de Petri para cada Bactéria – I1 (Infusão 10µl), I2 (Infusão 20 µl), D1 (Decocção 10 µl), D2 (Decocção 20 µl), O1 (Óleo essencial 10 µl), O2 (Óleo essencial 20 µl) e C (Gentamicina).........................................................................41 Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 16 | P á g i n a a um comportamento próprio de cada planta que pode ser alterado consoante o tempo e tipo de cozimento (Greten, Understanding Chinese Pharmacology, 2010). Tendência funcional A tendência funcional de um fármaco ou a sua direção efetiva é influenciada pela soma do sapor e da temperatura. Superficial Elevantia Neutral Demittentia Sedativa Grupo Todas as características referidas anteriormente permitem alocar as plantas a um grupo. Foram criados 19 grupos principais organizados em 5 meta grupos de substâncias que refletem as principais aplicações das mesmas (Figura 4). Sendo assim como meta grupos temos: 1Infeções; 2Desordens psicossomáticas; 3Dor; 4Manifestações crónicas com excessiva exigência do centro; 5Falta de energia/capacidade para a função. As situações mais comuns são as 3 primeiras, no entanto, a cronicidade destas situações leva a pituíta e défices de energia (Greten, Understanding Chinese Pharmacology, 2010). Passando dos 5 meta grupos para os 19 grupos principais temos: 1Grupo I ao IX – Tratamento de infeções agudas Ia) – Liberantia extimae acria et calida; Ib) – Liberantia extimae acria et frigida; II – Antiemetics; III – Purgativa; IVa) – Refrigerantia caloris diffundentia ardoris; IVb) – Refrigerantia orbeeem hepatici et clarificantia oculi; IVc) – Refrigerantia xue; IVd) – Refrigerantia et Torrefacientia; IVe) – Refrigerantia desinfectantia; Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 17 | P á g i n a V – Aromatica Patefacientia; VI – Aromatica transformatoria humoris; VII – Diuretica exstillantia humoris; VIII – Expellentia venti et humoris; IX – Tepefacientia intimae; 2Grupo X – Tratamento de desordens psicossomáticas Xa) – Sedativa deprimentia pavoris; Xb) – Sedativa sustinentia mentis; Xc) – Sedativa pacantia orbeeem hepatici; 3Grupo XI e XII – Tratamento de dor e desordens funcionais XI – Regulatoria qi; XIIa) - Animantia xue; XIIb) - Continentia xue; 4Grupo XIII – Tratamento de doenças crónicas; XIIIa) – Transformatoria pituitae algidae; XIIIb) – Frigida transformatoria pituitae calidae; XIIIc) – Tussostatica; 5Grupo XIV a XVII – Usado em situações de falta de energia XIV – Concoquentia; XVa) – Supplentia qi; XVb) – Supplentia yang; XVc) – Supplentia sustinentia xue; XVd) – Rigantia yin; XVI – Contrahentia cútis; 6Grupo XVII a XIX – raramente usados (Greten, Understanding Chinese Pharmacology, 2010). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 18 | P á g i n a Figura 4 Principais grupos da Farmacologia Chinesa (Greten, Understanding Chinese Pharmacology, 2010) Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 19 | P á g i n a 2. Plantas Medicinais A OMS define planta medicinal como sendo “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semissintéticos” (WHO, 2002). Para o estudo de plantas medicinais é conveniente o conhecimento de alguns conceitos e definições de botânica; salientam-se particularmente a nomenclatura botânica e a organografia das plantas (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009). Nomenclatura botânica É a nominação científica e formal das plantas, com função de universalizar a identidade das espécies vegetais (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009). Nesta nomenclatura incluemse certas regras, sendo elas: - Os nomes das famílias têm terminação em aceae; - Os nomes científicos são expressos por um binômio de substantivos latinos ou latinizados, estes nomes em texto devem ser destacados a negrito, itálico ou sublinhado separadamente; - A primeira palavra corresponde ao género e deve ser escrita com letra inicial maiúscula; - A segunda palavra corresponde ao epíteto específico e deve ser escrito em letra minúscula. Organografia É o estudo da morfologia e estrutura das partes que compõem as planta. Destacam-se principalmente cinco partes (Figura 5): Flor – possui a função de reproduzir as espécies e são compostas pelo pedúnculo, recetáculo, brácteas, cálice e corola, androceu e gineceu; Fruto – é o ovário da flor desenvolvido após a fecundação; é composto pelo pericarpo e pela semente; Folha – parte mais utilizada como medicamento, formada pelo limbo, pecíolo, bainha e, em algumas espécies, por estípulas, podendo ser simples, partidas, ou compostas de vários folíolos; Caule – têm função de sustentar a planta, podendo ser aéreos, subterrâneos ou aquáticos; Raiz – têm função de fixar e absorver nutrientes para a planta, tal como o caule, podem ser aéreas, subterrâneas ou aquáticas (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 20 | P á g i n a Figura 5 Partes que constituem a planta (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009) 2.1. Artemísia vulgaris Artemísia vulgaris conhecida na China como Ai ye (Mugwort Leaf (ai ye), 2014), pertencente à família Asteraceae (Terra, et al., 2007) e é uma planta muito utilizada na MTC, através da moxabustão (Figura 6 e 7). Distribuição Geográfica Artemísia vulgaris pode ser encontrada em quase todo o mundo, nomeadamente, na América do Sul, Europa e na Ásia (Artemisia vulgaris, 2014). Em Portugal esta planta pode ser encontrada na região norte e centro do país. (Figura 8) Figura 6 Artemísia vulgaris (parte aérea) Figura 7 Artemísia vulgaris (folhas e flores secas) Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 21 | P á g i n a Figura 8 J.D.Almeida, J.Lourenço, M.Peixoto, P.V.Araújo. (2015). Artemisia vulgaris L. - mapa de distribuição. Flora-On: Flora de Portugal Interactiva, Sociedade Portuguesa de Botânica. http://www.flora-on.pt/#wArtemisia+vulgaris. Consulta realizada em 8/01/2015 Descrição Planta perene e aromática, pode crescer até 2 metros e possui um sistema de raízes lenhoso (Artemisia vulgaris, 2014). As folhas têm cerca de 5 a 10 cm de comprimento e as margens são frequentemente revertidas. A superfície superior é usualmente de verdeescura e calva, e a superfície inferior apresenta uma pilosidade de cor branca (Juvatkar PV, 2012). No final do Verão ocorre a produção de pequenas flores petaladas de cor amarela ou vermelha (Artemisia vulgaris, 2014). Propriedades organoléticas Odor - aromática; Sabor - amargo; Cor - flores amarelo-esverdeadas e folhas alternando entre verde e verde acinzentado (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 22 | P á g i n a Principais constituintes químicos Artemísia vulgaris contêm: - Óleo essencial – Cineol (Figura 9), isoborneol (Figura 10), limoneno (Figura 11) e tujona (Figura 12); - Substâncias amargas – Absintina, artabsina; - Flavonóides – eupafolina, diosmetina, kaempferol, luteolina, apigenina; -Taninos, substâncias fenólicas, terpenóides, derivados cumarínicos, resinas (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009). Uso Medicinal Artemísia vulgaris é utilizada como estimulante em situações de astenia e psiconeurose. Possui também ação nas perturbações do ciclo menstrual, amenorreia, dismenorreia, flatulência, anorexia e parasitoses intestinais (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009) (Cunha, Silva, & Roque, 2009). As folhas de artemísia e o caule são utilizados medicinalmente como um tónico digestivo amargo, estimulante uterino e antirreumático. Alguns estudos revelam efeito anti-hipertensivo, anti-inflamatório e antioxidante (Terra, et al., 2007). Figura 9 Cineol Figura 10 Isoborneol Figura 11 Limoneno Figura 12 Tujona Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 23 | P á g i n a Todas as partes da planta possuem propriedades antissépticas, emenagogas e calmantes. A infusão preparada a partir das folhas e partes superiores floridas é utilizada no tratamento de afeções do sistema nervoso, como espasmódicas, em situações de asma e doenças do foro cerebral (Juvatkar PV, 2012). Farmacologia Estudos realizados com o óleo essencial da Artemísia vulgaris demonstraram atividade antimalárica em Plasmodium falciparum (Juvatkar PV, 2012),repelente de insetos e potencial fumigante. Atividade antiviral tem sido também descrita para os extratos desta planta (Terra, et al., 2007).Estudos realizados em animais revelaram que o óleo essencial também produz efeitos antiasmáticos (Chen & Chen, 2004). Também foi relatada atividade antibacteriana das folhas, inibindo o crescimento de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Estreptococcus, E. coli, Bacillus subtilis e Pseudomonas spp. (Ashok & Upadhyaya, 2012). Um outro estudo revelou o efeito inibidor contra Bacillus anthracis, estreptococcus ß-hemolíticos, Corynebacterium diphtheriae, Diplococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus citreus e Staphylococcus albus. (Chen & Chen, 2004). Contra indicações Não deve ser utilizada durante a gestação e lactação, em úlceras gastroduodenais, colon irritável e doentes com problemas neurológicos como epilepsia (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009). Devido à presença de tujona, dosagens prolongadas podem causar danos no sistema nervoso causando psicoses, excitabilidade, tremores e convulsões (Ashok & Upadhyaya, 2012). Posologia A dose máxima diária de planta seca são 1.5-6g (Saad, Léda, Sá, & Seixlack, 2009). 2.1.1.Artemísia Vulgaris na Medicina Tradicional Chinesa Sapor: Amargo; Orbe: F, L, R; Temperatura: Quente; Tendência funcional: Afundante; Grupo: Animantia xue. Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 24 | P á g i n a Indicações Dissipa Fria e alivia a dor Aquece o fígado, baço e estômago condutos responsáveis pela distribuição do frio e alívio da dor. É comumente usada para tratar deficiência e frio do médio e baixo calórico manifestado em situações de dor abdominal, menstruação irregular, dismenorreia e infertilidade (Chen & Chen, 2004). Elimina Frio e humor A aplicação do calor produzido pela moxa nos pontos ou meridianos de acupuntura remove bloqueios de energia que obstruem o seu fluxo pelos meridianos. Na patologia chinesa as doenças reumáticas são classificadas como doenças do frio e de humor. O frio patogênico tem características Yin e consome o Qi Yang. Sinais e sintomas da depleção do Yang pode ser notada por membros frios; palidez, diarreia com fragmentos de alimentos não digeridos nas fezes; urina límpida e abundante. Humor predomina no final do verão, época de chuvas, caracteriza-se por indolência e estagnação além de sintomas como tontura, cansaço, náusea, vômitos, viscosidade e sabor adocicados na boca. Doenças de pele, abcessos, úlceras gotosas são manifestações de seu poder patogênico (Mugwort Leaf (ai ye), 2014). Aquece os condutos e sustem o sanGramento Aquece os condutos e trata de uma variedade de distúrbios hemorrágicos. É especialmente eficaz para parar o sangramento ginecológico causado por deficiência e frio (Chen & Chen, 2004). Aquece o útero e pacifica o feto Síndrome feto inquieto, menor dor abdominal (menstrual), sanGramento vaginal como na ameaça de aborto e infertilidade devido ao útero frio (Mugwort Leaf (ai ye), 2014). Contra Indicações As folhas de Artemísia devem ser evitadas por pacientes com diagnóstico de deficiência de yin ou de calor no sangue (Chen & Chen, 2004). Efeitos Secundários A aplicação tópica do óleo essencial desta planta pode irritar a pele e causar vermelhidão local e calor. A administração oral do óleo essencial estimula o trato gastrointestinal levando a um aumento do apetite (Chen & Chen, 2004). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 25 | P á g i n a 2.2. Rizoma Coptis chinensis Rizoma Coptis conhecido na China como Huang Lian (Wagner, Bauer, Melchart, Xiao, & Staudinger, 2011) provem das raízes secas de Coptis chinensis Franch (Figura 13 e 14), Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao e Coptis teeta Wall, registadas nas Farmacopeias Chinenas e Japonesas (LI JunXian, et al., 2013) ou de outra espécie do mesmo género que contém berberina (WHO, 1999). Figura 14 Coptis chinensis (parte aérea) Distribuição Geográfica Coptis chinensis Franch e Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao podem ser encontradas na China. Quanto a Coptis teeta Wall pode ser encontrada na Índia onde é considerada uma espécie em vias de extinção. Na China esta planta é cultivada e comercializada (WHO, 1999). Descrição do rizoma seco Coptis chinensis Franch Rizoma curvo, reunido em aglomerados que se assemelham a “pés de galinhas”. Possui cerca de 3-6 cm de comprimento, 3-8 mm de diâmetro, áspero, externamente apresenta uma cor entre acinzentado, amarelo ou castanho-amarelado, tendo saliências irregulares. Textura dura, casca de cor vermelho-alaranjando ou castanho escuro, madeira brilhante e de cor amarela ou amarelo-alaranjado. A medula é, por vezes, oca. Apresenta um odor leve e gosto muito amargo (Wagner, Bauer, Melchart, Xiao, & Staudinger, 2011) (WHO, 1999). Figura 13 Coptis (seco) Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 32 | P á g i n a Posologia Dose diária recomendada: 3-9 g de raízes secas, sob a forma de infusão ou decocção (WHO, Radix Scutellariae, 2007). 2.3.1. Radix Scutellaria na Medicina Tradicional Chinesa Sapor: Amargo; Orbe: IT, P, IC, F, L, C; Temperatura: Fria; Tendência funcional: Sedativa; Grupo: IVd) Refrigerantia et Torrefacientia (Greten, 2010). Indicações Elimina o calor e humor Radix Scutellariae trata uma ampla gama de distúrbios relacionados com o calor, caracterizado por febre, plenitude abdominal, falta de apetite, náuseas, sensações de peso, língua vermelha com revestimento viscoso e amarelo, pulso escorregadio e rápido (Chen & Chen, 2004). Também está indicada em casos de disenteria causada por humor-calor no estômago e intestinos. A acumulação de calor húmido no trato gastrointestinal manifesta-se em sintomas de disenteria, diarreia com cheiro forte, febre, sensação de calor no peito e abdómen, irritabilidade, sensação de sede com boca seca, língua com revestimento amarelo e pulso rápido (Chen & Chen, 2004). Elimina calor e sedativo (Fogo) Radix Scutellaria tem excelentes propriedades para eliminar o calor e sedar Fogo do pulmão. As manifestações clínicas incluem tosse com expetoração amarela, febre, dispneia, boca seca, dor de garganta, sede, língua vermelha com revestimento amarelo, e um pulso rápido (Chen & Chen, 2004). Elimina o calor e toxinas Radix Scutellaria é utilizada para tratar distúrbios da pele, olhos, garganta, ouvidos e nariz, como lesões, feridas, ulcerações causadas pelo calor tóxico. Para além destas aplicações, Radix scutellaria também é utilizada para parar o sanGramento e prevenir o aborto (Wagner, Bauer, Melchart, Xiao, & Staudinger, 2011). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 33 | P á g i n a Contra Indicações Esta planta deve ser usada com cuidado, pois pode fazer mal ao Qi do estômago e atingir o yin do Baço. Pacientes com deficiência de sangue, dor abdominal, edema devido à deficiência de Baço, fezes soltas por causa da deficiência renal e gravidez instável causado por excesso de frio devem ter extrema cautela no uso de radix Scutellaria (Chen & Chen, 2004). 3. Bactérias As doenças infeciosas apresentam uma incidência crescente a nível europeu e mundial, sendo inclusive uma das principais causas de morte. Segundo dados da OMS, as doenças infeciosas representam 26% da mortalidade global. Este problema tem vindo a agravar-se devido ao aparecimento de bactérias resistentes aos antibióticos. O uso indiscriminado de antibióticos na criação de animais e, mesmo para uso humano (por prescrição médica ou mesmo automedicação por pacientes), e a capacidade que as bactérias têm de sofrem mutações contribuem para o aumento desta resistência (WHO, Antimicrobial resistance: global report on surveillance, 2014). Portugal, como se pode ver na Figura 22, encontrase entre os 10 países europeus com um consumo mais elevado de antibióticos de uso sistémico na comunidade (Paiva & Pina, 2013). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 34 | P á g i n a Figura 22 Consumo na comunidade de antibióticos de uso sistémico, na Europa (2010) Mecanismo de defesa das bactérias Na generalidade os antibióticos são eficazes contra as bactérias, sendo visíveis diferentes graus de sensibilidade a estes agentes. No entanto, quando uma bactéria adquire resistência, vários fatores poderão estar envolvidos. Apresentam-se na Figura 23 os principais mecanismos de resistência bacteriana: alteração da permeabilidade, mecanismo enzimático, bomba de efluxo e alteração do sítio de ação. Descreve-se sucintamente cada um deles. 1) Alteração da permeabilidade A permeabilidade da membrana celular das bactérias é essencial para que o antibiótico tenha o efeito pretendido. Nas bactérias Gram-negativas, a membrana interna é composta por fosfolípidos e a membrana externa por lípidos. Esta constituição confere uma lenta penetração do fármaco e a passagem pela membrana externa é realizada através das porinas, que formam canais hidrofílicos. Neste tipo de resistência, as alterações da permeabilidade do antibiótico nas membranas celulares podem dever-se a variações estruturais, do número, seletividade ou mesmo tamanho das porinas (R.M., 1998). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 35 | P á g i n a 2) Mecanismo enzimático As bactérias produzem enzimas que inativam ou degradam o antibiótico podendo ocorrer através de hidrólise, transferência de um grupo ou processo redox (R.M., 1998). 3) Bomba de efluxo As bombas de efluxo são proteínas presentes nas membranas das bactérias, que permitem trocas entre os meios intracelular e extracelular. Neste tipo de resistência não é possível o fluxo, não ocorrendo assim, o transporte ativo dos antibióticos do meio intracelular para o meio extracelular. Este mecanismo afeta todas as classes de antibióticos, apresentando maior efeito na presença de macrólitos, tetraciclinas e fluoroquinolonas, pois estes tem a capacidade de inibirem a biossíntese de proteínas e de ADN (R.M., 1998). 4) Alteração do sítio de ação Este tipo de resistência surge por alteração da estrutura do peptidoglicano, interferência na síntese de proteínas ou na síntese de ADN, dando origem à diminuição ou mesmo ausência de afinidade do antibiótico ao local de ligação (R.M., 1998). Figura 23 Mecanismos de resistência bacteriana 3.1. Escherichia coli Escherichia coli (E. coli) é a bactéria Gram-negativa mais comum, pertence à família das Enterobacteriaceae e é um anaeróbio facultativo, em forma de bastonete, com cerca de 0,5 a 2,0 µm de tamanho. É a espécie predominante que compõe o grupo de coliformes Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 36 | P á g i n a fecais de bactérias sendo também um importante constituinte da flora intestinal normal do ser humano e de animais de sangue quente. A maioria das estirpes desta espécie são consideradas como organismos comensais inofensivos, sendo que algumas delas são responsáveis por doenças gastrointestinais. E. coli patogénicas podem causar diarreias, especialmente em crianças (Rice, 1999). É também a causa mais frequente de infeções do trato urinário e um dos microrganismos de origem alimentar mais comuns em todo o mundo (ecdc, 2013). As estripes patogénicas foram classificados em sete grupos com base em características sorológicas e virulência. Os grupos incluem, E. coli enteroagregativas (EaggEc), E. coli entohemorragicas (EHEC), E. coli entoroinvasivas (EIEC), E. coli entoropatogénicas (EPEC), E. coli enterotoxigénicas (ETEC), E. coli que adere difusamente (DAEC) e E. coli produtora da toxina Shiga (STEC) (Rice, 1999). A resistência de E. coli aos antibióticos tem vindo a aumentar sucessivamente, o que requer muita atenção (ecdc, 2013). Esta bactéria já detém resistência a cefalosporinas de terceira geração (Figura 24), aminoglicosídeos, carbapenemos e fluoroquinolonas (ecdc, 2013). Figura 24 Escherichia coli resistente a cefalosporinas de terceira geração, na Europa (2011) Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 37 | P á g i n a 3.2. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa são bacilos Gram-negativos pertencentes à família Pseudomonadaceae. São aeróbios facultativos, podendo ser observados como células isoladas, aos pares, ou em cadeias curtas, apresentando mobilidade devido à presença de flagelos. Patogénico oportunista presente em infeções hospitalares, urinárias, sistema respiratório, pele, oftalmológicas, ósseas e articulares. Pacientes com queimaduras ou fibrose cística, devido ao estado imunodeprimido, são mais propensos a contrair a infeção por esta bactéria, isto porque, uma das características desta espécie é a capacidade de produzirem um pigmento azul-esverdeado, piocianina, denominado de bacilo piociánico, frequentemente encontrado nestes pacientes (Ferreira, 2005). Encontra-se distribuída no ambiente e é capaz de permanecer por longos períodos em ambientes antagónicos e desenvolver resistência a agentes antimicrobianos (Fuentefria, Ferreira, Graf, & Corção, 2008). Esta espécie tem vindo a adquirir resistência a Amicacina, Aminoglicosídeos, Carbapenemos (Figura 25), Ceftazidina, Fluoroquinolonas e Piperacilina (ecdc, 2013). Figura 25 Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenemes, na Europa (2011) Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 38 | P á g i n a 3.3. Staphylococcus O género Staphylococcus tem forma de cocos Gram-positivos, que podem ocorrer como células individuais ou agrupadas em cachos. Espécies deste género são geralmente imóveis, anaeróbias facultativas, catalase positiva e fermentadoras de glicose. Todas as estripes da espécie são potenciais agentes patogénicos (Geldreich, 1999). 3.3.1. Staphylococcus aureus (S. aureus) Enquanto a maioria das espécies Staphylococcus são anaeróbios facultativos, algumas estripes de S. aureus crescem melhor em ambientes aeróbios. Em meio de cultura estas bactérias apresentam uma pigmentação amarelo-alaranjado. S. aureus são frequentes na flora da pele humana e, em menor extensão, em resíduos fecais (Geldreich, 1999). Pode ser transmitido através de água contaminada, no contato com cortes e arranhões na pele, infetando as orelhas ou os olhos durante o banho, ou na água utilizada para preparar alimentos crus. A ingestão de alimentos contaminados é o caminho para intoxicações alimentares (Geldreich, 1999). Portugal apresenta uma taxa crescente de resistência a este microrganismo, nomeadamente à Meticilina, sendo nesta altura o país europeu com a taxa mais elevada (Figura 26) (Paiva & Pina, 2013). Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 39 | P á g i n a Figura 26 Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) na Europa (2011) 3.3.2. Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis é uma das bactérias encontradas na pele humana. É hoje visto como um importante patogénico oportunista sendo a causa mais frequente de infeções hospitalares. Mais de 35% dos isolados possuem resistência à Meticilina, Aminoglicosídeos, Quinolonas e outros antimicrobianos (R.M., 1998). A resistência desta bactéria deve-se à presença de genes resistentes a antimicrobianos e à capacidade de formação de biofilmes, o que representa uma barreira mecânica contra os antibióticos (Michael Otto, 2010). 3.4. Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis é uma bactéria Gram-positiva comensal do intestino. É a causa frequente de muitas infeções humanas graves, incluindo infeções do trato urinário, endocardite e bacteriemia. As infeções urinárias são as mais comuns, cerca de 110.000 casos anuais, muitos dos quais são infeções nosocomiais. O tratamento de infeções por Enterococcus faecalis pode ser particularmente problemático de tratar devido à sua Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 40 | P á g i n a resistência a múltiplos antibióticos, incluindo a Vancomicina, um antimicrobiano de último recurso para muitas infeções por bactérias Gram-positivas (Kau, et al., 2005). Para além da Vancomicina, esta bactéria também apresenta frequentemente resistência à Aminopenicilina e a doses elevadas de Gentamicina (ecdc, 2013). 4. Material / Metodologia 4.1.Amostras Partes aéreas secas (folhas e flores) de Artemísia vulgaris L. e respetivo óleo essencial, fornecido pela empresa Morais e Costa (Porto – Portugal). Raízes secas de Coptis chinensis e de Scutellaria barbata e respetivos óleos essenciais “Konzentrat”, cedidos pela Magnolien Apotheke (Alemanhã). 4.2. Preparação da Infusão e Decocção Para preparação da infusão, foi adicionada uma alíquota de 6g de amostra a 300 ml de água a ferver e deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 10 minutos com o recipiente tapado. Posteriormente procedeu-se à filtração. Para preparação da decocção, adicionou-se uma alíquota de 2,25g de amostra a 300 ml de água procedendo-se ao cozimento da amostra (deixou-se ferver durante 5 minutos). A mistura foi colocada em repouso durante 5 minutos e posteriormente filtrada. O óleo essencial já se encontrava previamente preparado pelo fornecedor. 4.3. Avaliação da atividade antibacteriana A atividade antibacteriana foi avaliada usando o teste de difusão em disco, padronizado pela NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Para esta avaliação foram utilizadas cinco bactérias, nomeadamente, duas espécies Gram-negativo, Escherichia coli (ATCC 11775) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e três Grampositivo, Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Staphylococcus aureus (ATCC 9144) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990). Previamente ao ensaio foi realizada uma nova repicagem das bactérias em meio de cultura Agar Mueller Hinton, colocando durante 24h em crescimento. Posteriormente, uma alíquota das colónias isoladas foi transferida para Água Peptonada Tamponada até a obtenção de uma turvação próxima ao grau 0,5 da escala de MacFarland (1x106 UFC/mL), utilizandose um tubo padronizado desta escala, como meio de comparação. Posteriormente, com o auxílio de zaragatoas, procedeu-se ao espalhamento de cada espécie em meio de cultura Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 41 | P á g i n a Agar Mueller Hinton, previamente preparado e vertido em placas de Petri. Colocaram-se discos impregnados com 10µl e 20µl de cada amostra (óleo essencial, infusão e decocção) e o controlo positivo (Gentamicina) sobre a superfície do meio inoculado. As placas foram incubadas a 37 °C, durante 24h. Passado esse tempo, realizou-se a medição do diâmetro dos halos inibitórios de cada disco com o auxílio de um paquímetro digital. Todas as amostras foram analisadas em triplicado e os resultados são expressos como a média de halos de inibição. A Figura 27 exemplifica o procedimento previamente descrito. 5. Resultados e discussão Para a análise dos resultados, consultou-se uma tabela apropriada fornecida pela CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) que determina se a bactéria em análise é sensível, intermédia ou resistente às amostras em estudo. I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 I1 D1 1 I1 I1 I1 D1 1 I1 I1 I1 D1 1 I1 I1 I1 D1 1 I1 I1 I1 D2 I1 I1 I1 D2 I1 I1 I1 D2 I1 I1 I1 D2 I1 I1 I1 O2 I1 I1 I1 O2 I1 I1 I1 O2 I1 I1 I1 O2 I1 I1 I1 I2 I1 I1 I1 Fi g ur a 2 8 Es q u e m a d as Pl ac as d e P et ri p ar a O1 I1 I1 I1 O1 I1 I1 I1 O1 I1 I1 I1 O1 I1 I1 I1 C I1 I1 I1 C I1 I1 I1 C I1 I1 I1 C I1 I1 I1 Figura 27 Esquema das Placas de Petri para cada Bactéria – I1 (Infusão 10µl), I2 (Infusão 20 µl), D1 (Decocção 10 µl), D2 (Decocção 20 µl), O1 (Óleo essencial 10 µl), O2 (Óleo essencial 20 µl) e C (Gentamicina) Mestrado em Medicina Tradicional Chinesa 48 | P á g i n a WHO. (1999). Em WHO monographs on selected medicinal plants (pp. 105-114). Geneva: World Health Organization. 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