Expressão diferencial dos recetores A1 e A2A da adenosina no hipocampo de doentes com epilepsia mesial temporal (MTLE)

Expressão diferencial dos recetores A1 e A2A da adenosina no hipocampo de doentes com epilepsia mesial temporal (MTLE) Marina Raquel Henriques Mendes Mestrado em Bioquímica Departamento de Química e Bioquímica 2012 Orientador Doutora Fátima Ferreirinha, Técnica Superior, ICBAS Coorientador Professor Doutor Paulo Correia-de-Sá, Professor Catedrático, ICBAS Doutor Miguel Cordeiro, Investigador, ICBAS Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________ FCUP/ICBAS Agradecimentos i AGRADECIMENTOS Gostaria em primeiro lugar de agradecer ao Professor Doutor Paulo Correia-de-Sá por me ter dado a oportunidade de realizar este trabalho no Laboratório de Farmacologia e Neurobiologia do ICBAS e por todo o conhecimento transmitido ao longo do ano. À Doutora Fátima Ferreirinha pela sua zelosa orientação, simpatia e apoio imprescindível, porque sem ela este trabalho não seria hoje uma realidade. A toda a equipa do Laboratório de Farmacologia e Neurobiologia do ICBAS, pela boa disposição, pelos bons momentos, pela partilha científica e por me terem recebido tão bem. Muito obrigada a todos aqueles que me apoiaram ao longo do ano e sobretudo na reta final deste trabalho, com especial agradecimento aos colegas e amigos Bruno Bragança e Sónia Gomes. Aos meus pais, ao meu namorado António e a todos os amigos que me são mais próximos por toda a motivação e carinho que me deram e assim me ajudaram a percorrer e concluir este percurso. À FCT, à Liga Portuguesa contra a Epilepsia, à Universidade do Porto e ao Banco Santander Totta pelo financiamento, sem o qual não seria possível a realização deste trabalho. FCUP/ICBAS Resumo ii RESUMO A adenosina é considerada um neuromodulador, influenciando a atividade neuronal atuando pré-sinapticamente, controlando a libertação de neurotransmissores, pós-sinapticamente, híperpolarizando ou despolarizando os neurónios, e mesmo afetando a atividade extrasináptica das células gliais (Boison et al, 2010) . O impacto da adenosina nas funções cerebrais parece dever-se às suas ações sobre os recetores de elevada afinidade para o nucleósido, A1 e A2A (Fredholm et al, 2005a). O principal efeito da adenosina sobre o sistema nervoso central envolve a ativação de recetores inibitórios do subtipo A1, que reduzem a libertação de neurotransmissores, como o glutamato, e diminuem a excitabilidade neuronal através da hiperpolarização pós-sináptica (Dunwiddie & Masino, 2001; Fredholm et al, 2005a). A ativação dos recetores facilitatórios A2A contraria a ação dos recetores A1 promovendo a libertação de neurotransmissores (Ciruela et al, 2006; Fredholm et al, 2005b). Desta forma, ativando recetores com efeitos opostos sobre a excitabilidade neuronal, a adenosina posiciona-se como uma molécula capaz de regular de forma fina fenómenos excitatórios e inibitórios no sistema nervoso central adaptando-os à atividade das células. Em estudos funcionais realizados no Laboratório de Farmacologia e Neurobiologia do ICBAS-UP observou-se a existência de um desequilíbrio entre a atividade dos recetores inibitórios A1 e facilitatórios A2A no hipocampo de doentes com epilepsia do lobo temporal mesial (MTLE) quando comparado com amostras de cadáveres autopsiados por razões médico-legais. Tendo em conta que a adenosina tem sido considerada um importante antiepilético endógeno, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a expressão dos recetores A1 e A2A da adenosina em várias regiões do hipocampo de doentes com epilepsia do tipo MTLE fármaco-resistente comparativamente com cadáveres sujeitos a autópsias-médico legais (controlos) por imunofluorescência aplicada à microscopia confocal. A avaliação quantitativa da expressão desses recetores foi realizada em lisados totais e terminais nervosos (sinaptossomas) isolados da mesma região pela técnica de Western Blotting. A análise dos níveis de expressão do recetor A1 por Western blotting sugere a existência de uma redução da densidade deste recetor no hipocampo de doentes MTLE comparativamente aos indivíduos controlo. Este fato, por si só, pode justificar a ocorrência de fenómenos de hiperexcitabilidade neuronal nos doentes. Relativamente aos recetores do subtipo A2A, observou-se um aumento significativo da sua expressão no hipocampo dos doentes MTLE. Este aumento deve-se sobretudo à expressão destes recetores em populações celulares não-neuronais, já que o aumento foi FCUP/ICBAS Resumo iii proporcionalmente maior em lisados totais do hipocampo dos doentes MTLE do que em terminais nervosos isolados (sinaptosomas). Estes resultados foram confirmados em estudos de imunofluorescência aplicada à microscopia confocal. Os ensaios de imunolocalização sugerem que o recetor A1 se encontra tanto nos astrócitos (GFAPpositivos) como nos terminais nervosos do hipocampo. Já o recetor A2A localiza-se predominantemente nos astrócitos hipocampais; o aumento da expressão destes recetores correlaciona-se positivamente com a intensa astrogliose característica dos doentes com epilepsia do tipo MTLE. FCUP/ICBAS Abstract iv ABSTRACT Adenosine is considered a neuromodulator influencing neuronal activity acting presynaptically, by controlling neurotransmitter release, postsynaptically, depolarizing or hyperpolarizing neurons, and even extrasinaptically affecting the activity of glial cells (Boison et al, 2010). The impact of adenosine in brain function appears to be due to its action on high affinity receptors for the nucleoside, A1 and A2A (Fredholm et al, 2005a). The main effect of adenosine on the central nervous system involves the activation of subtype A1 inhibitory receptors that reduce the release of neurotransmitters such as glutamate and decrease neuronal excitability via postsynaptic hyperpolarization (Dunwiddie & Masino, 2001; Fredholm et al, 2005a). The activation of facilitatory A2A receptors contradicts the action of A1 receptors promoting the release of neurotransmitters (Ciruela et al, 2006; Fredholm et al, 2005b). Thus, activating receptors with opposite effects on neuronal excitability, adenosine is positioned as a molecule capable of regulating excitatory and inhibitory phenomena in central nervous system adapted them to the activity of the cells. Functional studies performed in the Laboratory of Pharmacology and Neurobiology ICBAS-UP demonstrated that there is an imbalance between the activity of inhibitory A1 and facilitatory A2A receptors in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy (MTLE) when compared to copses subjected to medico-legal autopsies. Given that adenosine has been considered an important endogenous antiepileptic, the present study aimed to investigate the expression of A1 and A2A adenosine receptors in various regions of the hippocampus of patients with drug-resistant MTLE epilepsy when compared with samples from corpses subjected to medico-legal autopsies (controls) by immunofluorescence applied to confocal microscopy. Quantitative expression evaluation of these receptors was performed on total lysates and nerve terminals (synaptosomes) isolated from the same region by the Western blotting technique. Analysis of A1 receptors expression levels by Western blotting suggests the existence of a reduction of this receptor in the hippocampus of patients with MTLE when compared to control subjects. This fact, by itself, can justify the occurrence of neuronal hyperexcitability phenomena in those patients. Regarding A2A receptor subtype, there was a significant increase of its expression in the hippocampus of patients with MTLE. This increase is mainly due to the expression of these receptors in non-neuronal cell populations, since the increase was proportionately larger in total lysates of hippocampus from patients with MTLE than in isolated nerve terminals (synaptosomes). These results were confirmed by immunofluorescence studies applied to confocal microscopy. Immunolocalization assays suggest that the A1 receptor is found in both astrocytes FCUP/ICBAS Abstract v (GFAP-positive) as in nerve terminals in the hippocampus. On the other hand the A2A receptors are located predominantly in hippocampal astrocytes; increased expression of these receptors correlates positively with the intense astrogliosis characteristic of patients with MTLE epilepsy. FCUP/ICBAS Índice vi ÍNDICE Agradecimentos ................................................................................................................ i Resumo ............................................................................................................................ ii Abstract ........................................................................................................................... iv Lista de figuras e de tabelas ........................................................................................ viii Lista de abreviaturas ...................................................................................................... ix I – Introdução ...................................................................................................................1 1.1 – A epilepsia .............................................................................................................1 1.2 – A epilepsia do lobo mesial temporal (MTLE)..........................................................2 1.3 – A adenosina ..........................................................................................................4 1.3.1 – Recetores da adenosina no cérebro ...............................................................6 1.4 – A epilepsia e a adenosina....................................................................................10 1.5 – Papel dos astrócitos na epilepsia ........................................................................12 1.6 - Aplicações terapêuticas baseadas na sinalização pela adenosina na epilepsia ...13 Objetivos ........................................................................................................................15 II – Materiais e Métodos .................................................................................................16 2.1 – Descrição metodológica da obtenção e manuseamento dos tecidos ...................16 2.1.1 - Tecido cerebral de pacientes com epilepsia MTLE ........................................16 2.1.2 - Tecido de cadáver humano proveniente de autópsias médico-legais ............16 2.2 – Western Blotting (WB) .........................................................................................17 2.2.1 – Preparação das amostras .............................................................................17 2.2.1.1 – Homogeneização das amostras .................................................................17 2.2.1.2 – Preparação dos sinaptossomas .................................................................17 2.2.1.3 – Quantificação de proteína ..........................................................................18 2.2.1.4 – Lise das amostras de tecido e sinaptossomas humanos ............................18 2.2.2 – SDS-PAGE ...................................................................................................18 2.2.3 – Transferência de proteínas ...........................................................................19 2.2.4 – Deteção imunológica das proteínas ..............................................................19 2.2.5 – Análise densitométrica ..................................................................................21 2.2.6 – Validação dos sinaptossomas como modelo experimental............................21 2.3 - Imunolocalização por microscopia confocal..........................................................22 2.3.1 – Preparação dos tecidos ................................................................................22 2.3.1.1 - Fixação e Preservação dos tecidos ............................................................22 2.3.1.2 - Seccionamento ...........................................................................................23 2.3.1.3 – Tratamento com Negro de Sudão B ...........................................................23 FCUP/ICBAS Índice vii 2.3.2 - Bloqueio e permeabilização ...........................................................................23 2.3.3 - Marcação com anticorpos ..............................................................................24 2.3.3.1 - Incubação com anticorpos primários ...........................................................25 2.3.3.2 - Incubação com anticorpos secundários ......................................................25 2.3.4 - Microscopia confocal .....................................................................................26 III – Resultados e Discussão .........................................................................................28 3.1 – Identificação das diversas regiões do hipocampo humano ..................................28 3.2 – Padrão anatomopatológico do hipocampo de doentes com MTLE: esclerose hipocampal ...................................................................................................................29 3.3 – Expressão e localização dos recetores A1 e A2A da adenosina no hipocampo de indivíduos controlo e de doentes com MTLE ................................................................30 3.3.1 – Recetor A1.....................................................................................................30 3.3.1.1 – Análise da expressão proteica ...................................................................30 3.3.1.2 – Imunolocalização por microscopia confocal ...............................................31 3.3.2 – Recetor A2A ...................................................................................................34 3.3.2.1 – Análise da expressão proteica ...................................................................34 3.3.2.2 – Imunolocalização por microscopia confocal ...............................................35 Conclusão ......................................................................................................................40 Perspetivas Futuras .......................................................................................................43 Referências Bibliográficas ...........................................................................................44 FCUP/ICBAS Introdução 4 mediados pelo cálcio; a disfunção dos anticonvulsivantes endógenos ou dos sistemas reguladores de neuroproteção (Boison, 2007). A combinação destas disfunções da rede neuronal vai despoletar o aumento excessivo da frequência de descargas dos neurónios, que causam as crises epilépticas e o subsequente dano cerebral (Holmes & Ben-Ari, 2003). Para além da disfunção da rede neuronal, têm surgido cada vez mais evidências que apontam para o envolvimento dos astrócitos no processo epileptogénico, o que acrescenta um novo nível de complexidade aos processos subjacentes a esta patologia (Borges et al, 2006; Tian et al, 2005). Os estudos realizados indicam que os astrócitos podem contribuir tanto para a excitabilidade do foco hipocampal como para os níveis excitotóxicos de glutamato produzidos nesse foco através da sua reorganização molecular. Os astrócitos têm ainda um papel importante nas respostas imunes e inflamatórias do sistema nervoso central (de Lanerolle & Lee, 2005). 1.3 – A adenosina A adenosina é um mensageiro purinérgico que regula muitos processos fisiológicos, particularmente em tecidos excitáveis como o coração e o cérebro (Dunwiddie & Masino, 2001). É um nucleósido ubiquitário que atua como um metabolito envolvido em vias chave do metabolismo primário, nomeadamente no metabolismo de nucleótidos e nucleósidos, no metabolismo de aminoácidos que possuem grupos sulfureto e nas reações de transmetilação e processamento de amónia. Embora a adenosina desempenhe um papel homeostático na maior parte das células, no cérebro este nucleósido desempenha outras funções para além desta, nomeadamente funções de neuromodulação e neuroproteção (Cunha, 2005). Segundo este autor existem diversas linhas de investigação que sugerem que o papel neuromodulador da adenosina é independente das alterações na carga energética das células cerebrais, o que significa que as funções neuromoduladoras do nucleósido são independentes das suas funções homeostáticas (Cunha, 2001a). No cérebro, a adenosina comporta-se como um neuromodulador típico, ou seja, a sua sinalização controla o fluxo de informação entre neurónios, ao contrário do que acontece com os neurotransmissores em que eles próprios são veículos de informação. De fato, em contraste com os neurotransmissores, não existem evidências de acumulação de adenosina nas vesículas sinápticas ou da sua libertação de forma quântica. No entanto, a acumulação de adenosina no meio extracelular nas sinapses está relacionada com a libertação de neurotransmissores e com a frequência e intensidade de disparo neuronal (Cunha, 2005). FCUP/ICBAS Introdução 5 Efetivamente foram identificados nos terminais nervosos do hipocampo dois mecanismos principais de geração de adenosina: um resulta da sua formação através da adenosina trifosfato (ATP) libertada após a sua metabolização extracelular pelas ectonucleotidases (Cunha, 2001b); o segundo mecanismo baseia-se na libertação de adenosina através de transportadores de nucleósidos não concentrativos bidirecionais (ou equilibrativos) (Geiger & Fyda, 1991). Quando as células usam energia, o ATP é hidrolisado em adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP) e finalmente em adenosina (Dunwiddie & Masino, 2001). Grandes quantidades de adenosina são produzidas e libertadas durante situações de uso aumentado de energia, como a elevada atividade neuronal durante convulsões, ou sob condições de deficiente fornecimento energético, como isquémia ou hipoglicémia (Rudolphi et al, 1992). Durante situações de stresse metabólico, o consumo intracelular de ATP provavelmente excede a sua capacidade de refosforilação, conduzindo a um aumento de adenosina intracelular (Masino & Dulla, 2005). Quando os níveis intracelulares de adenosina ultrapassam a sua concentração extracelular, o transporte através de transportadores equilibrativos de nucleósidos é revertido, resultando no aumento de adenosina no meio extracelular (Geiger & Fyda, 1991). Outra fonte de adenosina extracelular é também o ATP colibertado com diversos neurotransmissores, que aquando do aumento da atividade neuronal é libertado para a fenda sináptica atingindo níveis elevados (Cunha et al, 1996b). Aí o ATP é rapidamente desfosforilado em adenosina por uma família de enzimas designadas ectoNTPDases; a adenosina gerada desta forma, provavelmente contribui para a diminuição tónica da transmissão sináptica durante a atividade nervosa excessiva (Cunha et al, 1998; Dunwiddie et al, 1997). A libertação de ATP armazenado nas vesículas sinápticas é tanto maior quanto mais elevada for a frequência de estimulação dos nervos (Cunha et al, 1996b; Wieraszko et al, 1989) e a contribuição da adenosina resultante do ATP aumenta com frequências crescentes de estimulação nervosa. Por outro lado, a contribuição da adenosina libertada através dos transportadores equilibrativos de nucleósidos predomina para frequências de estimulação nervosa mais baixas (Correia-de-Sá & Ribeiro, 1996; Cunha et al, 1996b). A adenosina extracelular pode ser inativada por recaptação celular através de transportadores equilibrativos de nucleósidos (Geiger & Fyda, 1991) ou por desaminação em inosina pela desaminase da adenosina (ADA) (Correia-de-Sá & Ribeiro, 1996). Através da integração destes mecanismos os níveis de adenosina endógena sofrem uma regulação fisiológica constante, influenciando a libertação de neurotransmissores e consequentemente a excitabilidade neuronal. A desregulação patológica deste sistema surge, por exemplo, quando ocorre libertação excessiva de adenosina durante as crises convulsivas (Masino & Dulla, 2005). FCUP/ICBAS Introdução 6 Também a adenosina cinase (AK) das células astrocíticas mostrou regular os níveis sinápticos basais da adenosina (Etherington et al, 2009). Durantes crises convulsivas, a expressão de adenosina cinase é rapidamente diminuída, como uma resposta fisiológica no sentido de aumentar o tónus protetivo da adenosina (Pignataro et al, 2008). A adenosina desempenha ainda outras funções no sistema nervoso central, por exemplo, é conhecida por induzir o sono (Porkka-Heiskanen et al, 2002); existem evidências de que poderá desempenhar um papel nos efeitos do abuso de drogas, uma vez que opiáceos, benzodiazepinas, bem como o etanol inibem a recaptação de adenosina (Dunwiddie & Masino, 2001); tem efeitos analgésicos (Dunwiddie & Worth, 1982); entre outras. 1.3.1 – Recetores da adenosina no cérebro A adenosina exerce as suas funções através da sua ligação a quatro subtipos de recetores designados: A1, A2A, A2B e A3. São recetores metabotrópicos acoplados a proteínas G com sete domínios transmembranares (Fredholm et al, 2001; Fredholm et al, 2005b; Fredholm et al, 2007). De acordo com a revisão feita por Cunha (2005) estes são recetores pleiotróficos, capazes de se acoplarem a diferentes proteínas G e a diferentes sistemas de transdução de sinal de acordo com o seu grau de ativação e com a sua localização celular e subcelular (Figura 2). Figura 2 – Sinalização adenosinérgica. Esquema representativo dos diferentes recetores P1 da adenosina, bem como das diferentes proteínas G às quais estão acoplados e os diferentes sistemas de transdução de sinal (adaptado de http://www.herbalzym.com/2012/01/caffeine-competitively-inhibits-different-adenosine-receptors/). Meio extracelular Adenosina Meio intracelular Proteína cinase Adenilato ciclase AMP cíclico ATP Inibe Excita FCUP/ICBAS Introdução 7 Embora os recetores da adenosina se distribuam um pouco por todo o tecido cerebral, a sua expressão varia de acordo com a região do cérebro (Deckert et al, 1988; Ribeiro et al, 2002). O padrão de expressão específico de cada subtipo de recetor está relacionado com as funções específicas de cada um (Nyce, 1999). A elevada densidade dos recetores A1 e A2A no cérebro em conjunto com o modesto impacto que decorre da manipulação das funções dos recetores A2B e A3, conduziu à ideia de que o impacto da adenosina nas funções cerebrais deverá depender na sua maioria das ações dos recetores A1 e A2A de elevada afinidade para o nucleósido (Fredholm et al, 2005a). Os recetores de adenosina A1 encontram-se um pouco por todo o cérebro, mas mostram maior expressão em áreas vulneráveis como o hipocampo (Dunwiddie, 1985; Dunwiddie & Masino, 2001). Estes recetores localizam-se predominantemente nos neurónios, embora também estejam presentes nas células da glia, onde modulam funções relacionadas com os astrócitos e a microglia no tecido cerebral (Biber et al, 1997; Gebicke-Haerter et al, 1996; Haselkorn et al, 2010; Tsutsui et al, 2004; van Calker & Biber, 2005). Estudos funcionais sugerem que a eficiência da ativação dos recetores A1 e, provavelmente, a sua densidade variam de acordo com os diferentes tipos de terminais nervosos. Os recetores A1 controlam eficientemente a libertação de glutamato, acetilcolina e serotonina, mas são incapazes de modular a libertação de GABA e de noradrenalina no cérebro (Cunha, 2001a). O efeito mais evidente da adenosina nos circuitos neuronais é a depressão da transmissão excitatória (Dunwiddie & Haas, 1985). Isto ocorre através da ativação do recetor A1, que se localiza pré e pós-sinapticamente ou mesmo sem ser a nível sináptico (Fredholm et al, 2005b). Esta inibição da transmissão sináptica excitatória, mas não da inibitória (Lambert & Teyler, 1991; Thompson et al, 1992; Yoon & Rothman, 1991), é sobretudo devido ao recetor A1 pré-sináptico (Lupica et al, 1992; Prince & Stevens, 1992; Scanziani et al, 1992; Scholz & Miller, 1992; Thompson et al, 1992), de acordo com o enriquecimento deste recetor nas sinapses, sobretudo as excitatórias (Rebola et al, 2003; Rebola et al, 2005b; Tetzlaff et al, 1987). O mecanismo da inibição da transmissão sináptica mediada pelo recetor A1 está relacionado com a inibição dos canais de cálcio do tipo N (Wu & Saggau, 1994; Yawo & Chuhma, 1993) levando à diminuição da libertação de glutamato para a fenda sináptica (Ambrosio et al, 1997; Dunwiddie & Haas, 1985). Pós-sinapticamente, a adenosina influencia e reatividade para estímulos excitatórios através de um controlo simultâneo de canais de cálcio do tipo N e de recetores N-metil-D-aspartato (NMDA) (de Mendonça et al, 1995; Klishin et al, 1995). A nível não-sináptico os recetores A1 controlam as correntes de potássio conduzindo à hiperpolarização das células (Greene & Haas, 1991). Em geral, os recetores da adenosina do subtipo A2A estão envolvidos na facilitação do disparo neuronal. Embora se encontrem em todas as regiões cerebrais, estes FCUP/ICBAS Introdução 8 recetores são particularmente expressos no núcleo accúmbens, no tubérculo olfativo e no estriado, onde estão colocalizados com os recetores D2 da dopamina (Kull et al, 1999; Moreau & Huber, 1999; Ongini & Fredholm, 1996). Os recetores A2A extra-estriatais, para além de controlarem a libertação de glutamato (Lopes et al, 2002) e acetilcolina (Cunha et al, 1994; Jin & Fredholm, 1997; Okada et al, 2001; Rebola et al, 2002) podem ainda controlar a libertação de GABA (Cunha & Ribeiro, 2000) e de noradrenalina (Barraco et al, 1995). Embora a sua localização nestas regiões seja predominante neuronal, os recetores A2A estão também presentes em astrócitos (Li et al, 2001; Nishizaki et al, 2002), na microglia (Fiebich et al, 1996; Kust et al, 1999) e nas células endoteliais dos vasos sanguíneos cerebrais (Coney & Marshall, 1998; Ngai et al, 2001). Estes recetores localizam-se sobretudo nas sinapses (Rebola et al, 2005a). Apesar de possuírem um impacto limitado no controlo da transmissão sináptica “basal”, desempenham um papel crucial no controlo da plasticidade neuronal (Cunha, 2008). Assim, pré-sinapticamente os recetores A2A conseguem controlar a libertação de glutamato e a sua principal função é atenuar a profunda inibição da transmissão sináptica mediada pelos recetores A1 (Ciruela et al, 2006; Lopes et al, 1999), o que possibilita um aumento da eficiência das sinapses. A nível pós-sináptico estes recetores podem controlar os recetores NMDA (Higley & Sabatini, 2010; Rebola et al, 2008; Wirkner et al, 2004), o que proporciona um mecanismo base para o entendimento das observações de que o bloqueio farmacológico ou genético dos recetores A2A pode atenuar a potenciação de longa duração (LTP) de diferentes sinapses excitatórias (d'Alcantara et al, 2001; Rebola et al, 2008). Curiosamente, inibidores dos recetores A2A desempenham uma forte ação neuroprotetora e previnem a apoptose (Silva et al, 2007). Os recetores de adenosina A2B encontram-se na maioria dos tecidos, mas geralmente apresentam baixos níveis de expressão, inclusive no cérebro (Dixon et al, 1996) parecendo existir essencialmente em astrócitos (Allaman et al, 2003). Pouco se sabe acerca do papel fisiológico destes recetores, contudo foi sugerido que desempenham um papel na vascularização e no controlo do fluxo sanguíneo cerebral (Grant et al, 2001; Ralevic & Burnstock, 1998; Shin et al, 2000). A estimulação destes recetores mostrou induzir a libertação de fatores de crescimento do endotélio vascular em células endoteliais cerebrais e periféricas (Feoktistov et al, 2002; Fischer et al, 1995; Grant et al, 2001; Grant et al, 1999). Há indicações de que os recetores A2B estão envolvidos em ações neuroexcitatórias e que a sua estimulação agrava o dano tecidular (Feoktistov & Biaggioni, 1997). Nas células da glia estes recetores mostraram induzir a libertação de IL-6 (Fiebich et al, 1996; Schwaninger et al, 1997). Os recetores A3 estão amplamente distribuídos pelo cérebro, porém o seu papel fisiológico ainda não se encontra claramente esclarecido. A presença destes recetores FCUP/ICBAS Introdução 9 em neurónios já foi confirmada através de estudos de ligação específica (Diaz-Hernandez et al, 2002), de imunohistoquímica (Lopes et al, 2003) e através de estudos funcionais (Brand et al, 2001; Costenla et al, 2001), porém, a sua função é mais evidente em astrócitos (Abbracchio et al, 1997) e na microglia (Hammarberg et al, 2003). Estes recetores modulam, em conjunto com os recetores A1, a inibição da transmissão sináptica (Brand et al, 2001) e desempenham um papel na modulação da plasticidade sináptica (Costenla et al, 2001). Von Lubitz e colegas mostraram que a estimulação dos recetores A3 induz a apoptose do tecido cerebral. A indução da apoptose de neurónios danificados no decorrer de um acidente vascular cerebral é benéfica na medida em que limita a neuroinflamação (von Lubitz et al, 1999). Contrariamente, a estimulação deste recetor com baixas concentrações de adenosina parece induzir efeitos neuroprotetores (Abbracchio et al, 1997; Fedorova et al, 2003). Este paradoxo tem significância fisiológica, uma vez que elevados níveis de adenosina na área afetada pelo dano isquémico induz apoptose através da ação do recetor A3, enquanto no tecido cerebral periférico baixos níveis de adenosina exercem o seu efeito neuroprotetor mediado pelo mesmo recetor, Mais ainda, vários estudos indicam que a estimulação do recetor A3 nas células da glia conduz à neuroprotecção pela indução do rearranjo do citoesqueleto (Abbracchio et al, 2001). Os quatro subtipos de recetores da adenosina têm diferentes afinidades para esta molécula. Enquanto os recetores A1 e A2A têm relativa alta afinidade (na gama dos nanomolar) para a adenosina em roedores, os recetores A2B e A3 têm uma afinidade muito mais baixa e apenas são ativados a concentrações na gama dos micromolar (Dunwiddie & Masino, 2001). Estas diferenças na afinidade de cada subtipo de recetor refletem uma significância funcional. Assim, a coexistência de diferentes recetores pode determinar diferentes respostas funcionais dependendo das concentrações extracelulares de adenosina. Estas observações mostram que o sistema adenosinérgico regula de maneira muito fina uma complexa panóplia de atividades biológicas. 1.3.2 - O papel neuromodulador da adenosina A adenosina é um neuromodulador que opera, sobretudo, como já foi referido através dos recetores inibitórios do subtipo A1, que são os mais abundantes. A adenosina pode, ainda, exercer a sua atividade através de recetores menos abundantes, mas amplamente dispersos, como é o caso dos recetores facilitatórios A2A. É um fato que o cérebro é o tecido que possui maior densidade de recetores A1. É portanto expectável que o efeito predominante da adenosina no cérebro seja a inibição da libertação de FCUP/ICBAS Introdução 10 neurotransmissores. De acordo com estas predições, estudos eletrofisiológicos que se debruçaram sobre o papel da adenosina em fatias de cérebro concluíram que a adenosina tem como principal função inibir a excitabiliddae neuronal e a transmissão sináptica (Greene & Haas, 1991; Phillis & Wu, 1981). Este efeito inibitório da adenosina é mediado pelos recetores A1 e em concordância está o fato da adenosina se encontrar praticamente desprovida de efeitos em fatias de cérebro de ratos transgénicos (knockout) para recetores A1 (Johansson et al, 2001). Também o recetor A2A parece ter um papel ativo no controlo da libertação de neurotransmissores, embora, contrariamente ao recetor A1, a sua função assente na facilitação da libertação da maioria dos neurotransmissores. Em suma, a adenosina, através da sua capacidade de ativar recetores com funções opostas (A1 versus A2) torna-se num regulador chave para o controlo das funções excitatórias e inibitórias do SNC (Boison, 2008). Enquanto os recetores A1 definem um ambiente globalmente inibitório no cérebro e promovem a depressão heterossináptica, os recetores facilitatórios A2A são capazes de potenciar a transmissão sináptica selecionada dentro de uma rede globalmente inibida (Cunha, 2008). 1.4 – A epilepsia e a adenosina A epilepsia corresponde a uma série de distúrbios no disparo neuronal, frequentemente acompanhado pela elevação da atividade encefalográfica (Engel & Pedley, 2007). As crises epiléticas são tradicionalmente vistas como um desequilíbrio entre a transmissão excitatória e inibitória nos circuitos cerebrais, no qual a hiperexcitação ou a hipo-inibição pode resultar num disparo repetitivo anormal dos circuitos cerebrais (Meldrum & Rogawski, 2007). O potencial da adenosina como uma substância antiepilética (Tomé et al, 2010) emergiu com base em duas observações paralelas: primeiro, o recetor A1 está enriquecido nas sinapses excitatórias, onde inibe a libertação de glutamato diminuindo a resposta glutamatérgica, e hiperpolariza os neurónios, ações estas indispensáveis à diminuição da hiperexcitabilidade associada à epilepsia; segundo, os níveis de adenosina endógena extracelular aumentam consideravelmente durante as crises convulsivas, podendo atingir concentrações de ordem micromolar capazes de levar à cessação das convulsões (Berman et al, 2000; Dunwiddie & Worth, 1982; During & Spencer, 1992; Ribeiro et al, 2002), o que pode ser interpretado como um indicador de que a adenosina poderá desempenhar um papel como antiepilético endógeno. Uma variedade de estudos confirmou que a administração aguda tanto de agentes que potenciem o aumento dos níveis de adenosina extracelular (inibidores dos transportadores de adenosina ou do metabolismo da adenosina) como de agonistas dos FCUP/ICBAS Introdução 11 recetores A1, atenua as crises epiléticas ou a atividade convulsiva em diferentes modelos animais. Paralelamente, a administração aguda de antagonistas não-seletivos dos recetores da adenosina (como a cafeína ou a teofilina) ou de antagonistas seletivos dos recetores A1 aumenta a duração e a severidade das crises e/ou convulsões (Boison, 2008; Dragunow, 1988; Dunwiddie, 1999; Malva et al, 2003; Tomé et al, 2010). Porém, vários estudos mostraram uma diminuição da densidade e/ou eficácia dos recetores A1 na região sináptica em modelos animais de epilepsia (Ekonomou et al, 2000; Glass et al, 1996; Ochiishi et al, 1999; Rebola et al, 2003; Rebola et al, 2005b). Assim, o sistema inibitório operado pelo recetor A1 parece funcionar como um obstáculo ativo de maneira a evitar o início de uma crise epilética; uma vez ultrapassado esse obstáculo, ocorre uma dessensibilização do sistema criando condições para a progressão do fenómeno epileptogénico. Um número crescente de estudos, sobre a modulação da epilepsia pela adenosina, concentrou as suas atenções no possível papel facilitatório do recetor A2A no controlo da epilepsia (Tomé et al, 2010). Curiosamente, na epilepsia crónica parece existir um marcado aumento (cerca de 200%) do recetor A2A (Rebola et al, 2005a). Ainda que o impacto do recetor A2A no início de uma crise epilética permaneça duvidoso (Malva et al, 2003; Tomé et al, 2010), estudos recentes mostraram que o bloqueio deste recetor, através de deleção genética ou de antagonista seletivos (El Yacoubi et al, 2009) ou nãoseletivos, como a administração crónica de cafeína (El Yacoubi et al, 2008), pode fornecer proteção contra a evolução da severidade das crises. Assim, o recetor A2A parece controlar a evolução e as consequências das crises, embora o mecanismo envolvido (glial ou neuronal) permaneça por esclarecer (Chen et al, 2007; Cunha, 2005; Tomé et al, 2010). Curiosamente, a fonte de adenosina proposta como preferencial para ativar os recetores A2A (adenosina derivada de ATP formado através da via das ectonucleotidases (Cunha et al, 2008; Cunha, 2001a; Cunha, 2001b; Cunha et al, 1996a)), está alterada em roedores “epiléticos”. Desta forma, o comprometimento da libertação neuronal de ATP associa-se a défices na sua metabolização extracelular por parte das ecto-NTPDases (Bonan et al, 2000; Nagy et al, 1990; Nagy et al, 1997; Rebola et al, 2003). O aumento da densidade e atividade da ecto-5’-nucleotidase (Bonan et al, 2000; Rebola et al, 2003), que é frequentemente o passo limitante da formação de adenosina a partir do ATP extracelular (Cunha, 2001b; James & Richardson, 1993) e a sobrexpressão do recetor A2A, não conseguem compensar a falta do ligando endógeno. Neste contexto, dificilmente se compreende que o uso de antagonistas dos recetores A2A possam trazer efeitos benéficos em modelos animais de epilepsia, a menos que se pressuponha que o bloqueio desses recetores previna a sua sobrexpressão e/ou os efeitos tróficos que lhe podem estar associados. Concluindo, a ativação de recetores A2A gera ainda alguma FCUP/ICBAS Introdução 12 controvérsia, uma vez que estes recetores tanto podem ter características anticonvulsivantes como pró-convulsivantes (Boison, 2005; Boison, 2007). Resta salientar que todos estes estudos realizados em modelos animais de epilepsia têm como limitação o fato de não ser possível reproduzir a cronicidade do processo epileptogénico nestes modelos, bem como as características neuropatológicas que dela advêm, pelo que todas as conclusões que derivam destes estudos necessitam de confirmação em tecido humano epilético. 1.5 – Papel dos astrócitos na epilepsia Pesquisas recentes sugerem a existência de uma base astrocítica para a epilepsia. Os astrócitos estão intimamente relacionados com os neurónios, tanto em termos anatómicos como funcionais, e são atualmente considerados reguladores-chave da função neuronal através de um mecanismo chamado “gliotransmissão” (Haydon & Carmignoto, 2006). Tornou-se claro que os astrócitos e os fatores deles derivados desempenham um papel crítico na modulação da atividade convulsiva aguda e crónica. Embora o glutamato derivado das células neuronais continue a ter o papel principal na atividade convulsiva, tem sido dada cada vez mais atenção aos astrócitos como fonte de glutamato extracelular, quer no cérebro normal quer no epilético. Através da libertação de ATP e de glutamato, frequentemente por intermédio da libertação sináptica regulada, um único astrócito tem a capacidade única de regular a atividade de centenas de dendrites neuronais (Halassa et al, 2007; Oberheim et al, 2008). A perda deste domínio astrocítico parece ter um papel fundamental na patogénese da epilepsia (Oberheim et al, 2008) De fato, a astrogliose é uma das características fisiopatológicas do cérebro epilético e um constituinte ubiquitário da cascata epileptogénica. Vários estudos sugerem que a disfunção dos astrócitos contribui para a epileptogénese e para a ocorrência de convulsões na epilepsia. Já foi demonstrado que a incapacidade da glia tamponar o glutamato extracelular ou a existência de uma disfunção na libertação de glutamato por estas células, pode contribuir para manutenção da mudança do padrão de despolarização que caracteriza a disfunção neuronal na epilepsia (Tian et al, 2005). Assim, as concentrações fisiológicas de glutamato no meio extracelular são controladas sobretudo por dois trasportadores de glutamato astrocíticos, o (GLT)-1 e o GLAST. Estes trasportadores previnem a acumulação de glutamato para concentrações excitotóxicas, tal como foi demonstrado em animais com uma deleção genética das duas proteínas (Rothstein et al, 1996; Tanaka et al, 1997; Watanabe et al, 1999). Estes transportadores seletivos não são os únicos determinantes da concentração extracelular de glutamato relacionados com a função astrocítica, Haydon e colegas (2006) mostraram que a FCUP/ICBAS Introdução 13 estimulação neuronal induz uma resposta de cálcio dependente da frequência em astrócitos vizinhos, que por sua vez libertam glutamato. Este glutamato derivado de astrócitos, por sua vez, modula a transmissão neuronal glutamatérgica (Araque et al, 1999). Assim, qualquer quebra na sintonia desta conversação entre neurónios e astrócitos pode resultar num aumento de glutamato libertado durante a atividade epilética (Fellin & Haydon, 2005), indicando que os astrócitos estão envolvidos na epileptogénese. Para além do que foi referido, os astrócitos têm ainda um papel importante na regulação da disponibilidade extracelular de adenosina (Boison, 2008). A regulação dos níveis de adenosina (intra e extracelular) envolve a fosforilação da adenosina com formação de AMP pela adenosina cinase ou a sua desaminação pela adenosina desaminase que leva à formação de inosina (Wetherington et al, 2008). A enzima adenosina cinase, existente nos astrócitos constitui o principal motor para a recaptação metabólica da adenosina e desta forma regula os níveis extracelulares deste nucleósido (Wetherington et al, 2008). Um ciclo de substrato muito ativo entre a adenosina e o AMP envolvendo a adenosina cinase e a 5’-nucleotidase permite que pequenas alterações na atividade da adenosina cinase se traduzam rapidamente em grandes alterações na adenosina ambiente (Arch & Newsholme, 1978). Níveis elevados de adenosina cinase estão associados a convulsões e ao aumento da suscetibilidade a lesões cerebrais, enquanto níveis diminuídos desta enzima promovem a supressão das convulsões e neuroprotecção. A expressão de adenosina cinase pode ter uma regulação bifásica durante a epileptogénese. Assim, após uma fase aguda de excitação observa-se uma redução da expressão de adenosina cinase com consequente elevação dos níveis de adenosina como mecanismo de neuroprotecção; na epilepsia crónica, por outro lado, observa-se uma sobre-expressão da referida enzima. Uma vez que no cérebro adulto a adenosina cinase é primariamente uma enzima astrocitária, a astrogliose contribui para a sobrexpressão da adenosina cinase na epilepsia crónica. Recentemente, demonstrou-se uma correlação entre a astrogliose, a sobrexpressão de adenosina cinase e o aparecimento de convulsões espontâneas num modelo de epileptogénese na área CA3 do hipocampo de rato, sugerindo que a astrogliose e/ou sobrexpressão de adenosina cinase contribuem para o fenómeno epileptogénico (Li et al, 2008).É também importante referir que os astrócitos para além de mediarem a gliotransmissão podem ainda sintetizar citocinas pró e anti-inflamatórias durante as convulsões (Ravizza et al, 2008). 1.6 - Aplicações terapêuticas baseadas na sinalização pela adenosina na epilepsia Estando a adenosina envolvida em diversas funções fisiológicas, moléculas que interagem com a sinalização pela adenosina podem ser desenvolvidas com a finalidade FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 20 Após transferência proteica, as membranas de PVDF foram bloqueadas numa solução de PBS com 5% leite em pó magro e 0,1% Tween-20 durante duas horas à temperatura ambiente de forma a evitar ligações inespecíficas do anticorpo primário e consequente surgimento de background. Os anticorpos primários e secundários foram diluídos numa solução de PBS com 3% leite em pó magro e 0,1% Tween-20. Os anticorpos usados nestas experiências, bem como as respetivas diluições encontram-se descritos na Tabela 1. Após incubação dos anticorpos primários durante 12-16 horas a 4ºC, seguiram-se três ciclos de lavagem com uma solução de PBS com 0,1% Tween-20 (PBS-TW). Seguidamente, incubaram-se os anticorpos secundários, conjugados com a peroxidase de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) durante duas horas à temperatura ambiente e após três novos ciclos de lavagem com PBS-TW, as proteínas foram detetadas nas membranas através de um método de deteção quimiluminescente com o sistema ECL Plus (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. Tabela 1 – Anticorpos primários e secundários usados para a deteção proteica por Western Blotting Anticorpo primário Hospedeiro Diluição Anticorpo secundário Diluição Recetor A1 da adenosina (abcam) Coelho (rb) 1:600 Anti-rb IgG HRP (abcam) 1:30.000 Recetor A2A da adenosina (Alfa Diagnostic) 1:500 β-Actina (abcam) 1:5000 β-Tubulina (abcam) 1:2500 Proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (Chemicon) Rato (ms) 1:500 Anti-ms IgG HRP (abcam) 1:10.000 Sinaptofisina (SiF) (Chemicon) 1:750 FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 21 2.2.5 – Análise densitométrica As imagens dos géis foram obtidas com o sistema de aquisição de imagens Chemidoc MP Imaging System e analisadas com o software associado, o Image Lab V4.0 (Bio-Rad Laboratories). Sempre que possível as amostras foram normalizadas tendo em conta um controlo de carregamento (loading control) – β-actina ou β-tubulina. 2.2.6 – Validação dos sinaptossomas como modelo experimental Os sinaptossomas são terminais nervosos arrancados e resselados, livres da sua integração numa rede neuronal ou mesmo numa sinapse, embora por vezes contendo material pós-sináptico fixado na sua superfície externa (Gray & Whittaker, 1962). Estas estruturas que mantêm a propriedade de libertar neurotransmissores de um modo dependente do Ca2+ (Nicholls, 1989) possuem um potencial de membrana fisiológico estável (Scott & Nicholls, 1980) e preservam uma compartimentação intra-terminal intacta constituída por mitocôndrias, retículo endoplasmático e vesículas sinápticas (Gray & Whittaker, 1962). Os sinaptossomas retêm a função pré-sináptica dos terminais nervosos intactos, possuindo as propriedades bioquímicas, eletrofisiológicas e morfológicas do componente pré-sináptico, nomeadamente possuem vários mecanismos altamente eficazes de regulação de Ca2+ intracelular (Miller, 1991). Neste trabalho prepararam-se sinaptossomas de hipocampo de doentes com epilepsia MTLE e de cadáver humano, de acordo com o procedimento descrito por Wittaker (1965) e Helme-Guizon (1998) e posteriormente modificado por Bancila (2009). Apesar deste método resultar na obtenção de sinaptossomas menos puros (com maior grau de contaminação da componente pós sináptica) que os obtidos pelo método de Percoll foi, no entanto, o escolhido uma vez que aquele leva à obtenção de sinaptossomas com menor viabilidade. Quando o objetivo de um trabalho passa pela deteção de mecanismos neuromoduladores, como é o caso de estudos funcionais (que decorreram em paralelo aos estudos de expressão proteica no Laboratório de Farmacologia e Neurobiologia do ICBAS-UP) a estabilidade da preparação é um fator essencial para a visualização de efeitos que podem não ser muito pronunciados. De maneira a validar estes sinaptossomas como modelo experimental de amostras enriquecidas no componente pré-sináptico (enriquecidas em terminais nervosos) fez-se uma avaliação das componentes glial e pré-sináptica nestas amostras por Western blotting (Figura 3). FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 22 Figura 3 – Validação dos sinaptossomas como modelo experimental. Avaliação da componente glial (anti-GFAP) e présináptica (anti-Sinaptofisina) em lisados totais (LT) versus sinaptossomas (SNPT) de tecido cerebral humano de um indivíduo controlo. Como seria de esperar, e como se pode verificar pela Figura 3, a fração sinaptossomal encontra-se enriquecida em terminais nervosos (enriquecimento de 4x em sinaptofisina - marcador de vesículas sinápticas) relativamente aos lisados totais (enriquecimento de 8x em GFAP - marcador glial) o que parece validar estas amostras para o seu uso no trabalho experimental subsequente. 2.3 - Imunolocalização por microscopia confocal 2.3.1 – Preparação dos tecidos 2.3.1.1 - Fixação e Preservação dos tecidos No presente trabalho, utilizou-se como fixador uma solução de 4% formaldeído em tampão fosfato (PBS: 137mM NaCl, 2.6mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, pH 7.4). As amostras de tecido cerebral (duas de cadáver e uma de doente com MTLE) foram fixadas durante 48 horas a 4˚C e posteriormente lavadas com PBS, realizando-se 3 ciclos de lavagem de 10 minutos cada. Seguidamente, os tecidos foram crioprotegidos com uma solução de sacarose 30% em PBS durante 24 horas a 4ºC e congelados em azoto líquido após terem sido envolvidos numa matriz de congelamento rápido (Shandon Cryomatrix; Thermo Scientific). Finalmente os tecidos foram armazenados a -80˚C para posterior utilização. GFAP Sinaptofisina -Tubulin 0 1 2 3 4 5 6 GFAP SYNAPTOPHYSIN Densidade Ótica (GFAP e Sinaptofisina) Lisados Totais (LT) Sinaptossomas (SNPT) SINAPTOFISINA FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 23 2.3.1.2 - Seccionamento Na altura do seccionamento do tecido este foi removido da arca a -80ºC e colocado num criostato (Leica CM1850) a -25ºC durante 30 minutos para estabilização da temperatura. Seguidamente, e depois do tecido devidamente orientado, cortaram-se secções com 30 µm de espessura as quais foram colocadas free-floating em PBS em placas de cultura de células de 24 poços. 2.3.1.3 – Tratamento com Negro de Sudão B A autofluorescência biológica que advém de fluoróforos endógenos é uma propriedade intrínseca das células e tecidos, contudo, torna-se um obstáculo na imunolocalização de proteínas por imunofluorescência, e pode até mascarar ou mesmo interferir com sinais fluorescentes específicos (Del Castillo et al, 1989; Noonberg et al, 1992). Em tecido cerebral de indivíduos idosos é muito frequente observar-se a acumulação de grânulos de lipofuscina nos neurónios. Uma das características desta substância, que resulta da degradação de organelos celulares danificados, é a autofluorescência. Sob excitação verde (514 nm) a lipofuscina emite comprimentos de onda na faixa do amarelo (550 nm) (Terman & Brunk, 1998). Assim tornou-se essencial reduzir a emissão da radiação proveniente desta substância de modo a possibilitar o uso de toda a gama de comprimentos de onda do espectro de luz. De entre vários reagentes utilizados para eliminar a autofluorescência, o Negro de Sudão B provou ser eficaz em vários tecidos, incluindo o cérebro (Dowson, 1982; Schnell et al, 1999). Foi assim preparada uma solução de Negro de Sudão B 0.5% em etanol a 70% que permaneceu no escuro e foi filtrada com papel Whatman 3mm. Para bloquear a autofluorescência as secções de hipocampo de cérebro humano de doente MTLE e cadáver foram incubadas com Negro de Sudão B por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro e com agitação contínua. De seguida, efetuaram-se 4 ciclos de lavagem de 10 minutos cada, duas com etanol a 70% e duas com PBS. 2.3.2 - Bloqueio e permeabilização Após o processo de redução da autofluorescência as secções foram incubadas com um tampão de bloqueio (soro bovino fetal 10%, albumina sérica bovina 1%, Triton X100 0,3%, NaN3 0,05% em PBS), durante 1h à temperatura ambiente e com agitação contínua. O Triton X-100, que faz parte da composição do tampão de bloqueio, aumenta a permeabilidade das membranas facilitando desta forma a incubação dos tecidos com os anticorpos (Ramos-Vara et al, 2008). A incubação do tecido com o tampão de bloqueio FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 24 é essencial para impedir a formação de ligações inespecíficas do anticorpo primário, diminuindo a probabilidade de ocorrência de marcação inespecífica de fundo (Figura 4) (Ramos-Vara, 2005). Figura 4 - Bloqueio de ligações inespecíficas. O soro normal, adicionado antes dos anticorpos primários (esquerda), bloqueia ligações inespecíficas do anticorpo primário. Quando não se utiliza o tampão de bloqueio (direita), o anticorpo primário pode ligar-se inespecificamente a antigénios no tecido, levando consequentemente à formação de marcação inespecífica de fundo (adaptado de (Ramos-Vara, 2005)). 2.3.3 - Marcação com anticorpos Para visualizarmos a reação que ocorre entre o antigénio e o anticorpo recorremos ao método de marcação indireta (Figura 5) no qual, um anticorpo primário se vai ligar ao antigénio de interesse, seguindo-se a aplicação de um anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo que reconhece especificamente o anticorpo primário (RamosVara, 2005). Figura 5 - Método de marcação indireta (adaptado de (Ramos-Vara, 2005)). Anticorpos (primários) específicos Anticorpos (primários) específicos Soro não imunizado Soro não imunizado adicionado Soro não imunizado não adicionado Anticorpo secundário marcado Antigénios Anticorpo não marcado FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 25 2.3.3.1 - Incubação com anticorpos primários Depois do bloqueio e permeabilização, as amostras foram incubadas com os anticorpos primários escolhidos (ver Tabela 2), diluídos em tampão de incubação (soro bovino fetal 5%, albumina sérica bovina 1%, Triton X-100 0,3%,NaN3 0,05% em PBS), a 4˚C e durante 16 horas. Após o período de incubação com os anticorpos primários, procedeu-se à lavagem dos tecidos com PBS/Triton X-100 0.3%, em 4 ciclos de 10 minutos, preparando as amostras para a marcação com os anticorpos secundários. 2.3.3.2 - Incubação com anticorpos secundários Após a lavagem dos anticorpos primários, as amostras foram incubadas com os anticorpos secundários fluorescentes. Os anticorpos secundários utilizados devem ser escolhidos tendo em conta o hospedeiro do anticorpo primário uma vez que irão reconhecer especificamente as imunoglobulinas deste. Outro aspeto importante é a escolha do fluoróforo acoplado ao anticorpo secundário. Em particular, o fluoróforo escolhido deve ser suficientemente sensível para o comprimento de onda de excitação utilizado. Há ainda que ter em conta o efeito do próprio organismo no fluoróforo, isto é, o ambiente químico em que o fluoróforo se encontra pode afetar a posição dos picos dos espectros de absorção e emissão (Semwogerere & Weeks, 2005). Os anticorpos secundários escolhidos (ver Tabela 2) foram diluídos no tampão de incubação referido no ponto anterior e incubados nas amostras durante duas horas à temperatura ambiente e com agitação contínua. Todos os procedimentos a partir do momento de adição destes anticorpos foram efetuados no escuro para evitar a excitação dos fluorocromos. Após a incubação com os anticorpos secundários, procedeu-se à lavagem dos tecidos com PBS/Triton X-100 0.3%, em 4 ciclos de 10 minutos. No final, procedeu-se à montagem das secções entre lâmina e lamela de vidro com meio de montagem VectaShield suplementado com DAPI (VectorLabs). Fizeram-se ainda controlos negativos, por omissão dos anticorpos primários da solução de reação, que permitem avaliar o grau de ligações inespecíficas estabelecidas pelos anticorpos secundários (Ramos-Vara et al, 2008) FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 26 2.3.4 - Microscopia confocal A microscopia confocal permite otimizar e melhorar a resolução de imagens obtidas por um microscópio convencional. Este microscópio utiliza um laser de excitação, com um comprimento de onda adequado, para fazer a iluminação ponto por ponto de uma determinada secção, sendo que através de um processo de restrição de diâmetro variável (pinhole) toda a fluorescência emitida que esteja fora do plano de focagem é rejeitada. Assim, o objetivo é capturar a imagem que se forma a partir do ponto de focagem escolhido. As imagens dos diferentes planos observados numa secção, são recebidas por um computador ligado ao microscópio confocal. O tratamento digital da imagem, para além de facilitar uma melhor observação de pequenos detalhes permite a construção de modelos tri-dimensionais da região de interesse, por conjugação de imagens sucessivas de diferentes planos da mesma amostra (Semwogerere & Weeks, 2005). Neste trabalho, as lâminas de vidro, foram examinadas com um microscópio confocal de varrimento por laser Olympus FluoView FV1000, usando os seguintes lasers: um díodo de 405nm, que emite portanto, na gama dos 405nm e que possibilita excitar o DAPI; um Multi-line Argon, que emite na gama dos 488nm podendo portanto, excitar o fluoróforo Alexa Fluor 488; um laser de He-Ne, que emite no comprimento de onda de 543 nm e que vai excitar o fluoróforo Alexa Fluor 568, e ainda um laser de He-Ne, que emite a 633nm, o qual nos permitiu obter sinais inespecíficos provenientes de autofluorescência (marcação usada para subtrair à marcação de interesse) dado que não usámos qualquer fluorocromo com este comprimento de onda. As imagens obtidas foram, posteriormente, tratadas usando o software associado ao microscópio confocal, o FluoViewer FV10-ASW1.2. FCUP/ICBAS Materiais e Métodos 27 Tabela 2 – Anticorpos primários e secundários usados em imunofluorescência. Anticorpo primário Hospedeiro Diluição Anticorpo secundário Diluição Recetor A1 da adenosina (Chemicon) Coelho (rb) 1:250 Alexa Flúor 488 Burro anti-rb IgG (Molecular Probes) 1:1500 Neurofilamento 200kDa (NF200) (abcam) 1:900 Alexa Flúor 568 Burro anti-rb IgG (Molecular Probes) Sinaptotagmina (SiT) (SynapticSystems) 1:400 Proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (Dako) 1:600 Recetor A2A da adenosina (Chemicon) Rato (ms) 1:450 Alexa Flúor 488 Burro anti-ms IgG (Molecular Probes) Proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (Chemicon) 1:600 Alexa Flúor 568 Burro anti-ms IgG (Molecular Probes) Neurofilamento 160kDa (NF160) (abcam) 1:800 Sinaptofisina (SiF) (Chemicon) 1:500 FCUP/ICBAS Resultados e Discussão 28 III – RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 – Identificação das diversas regiões do hipocampo humano O hipocampo é essencialmente uma faixa curva de córtex filogeneticamente primitivo (“arquicórtex”), localizada na porção medial do lobo temporal. Medial e inferiormente, o hipocampo é contíguo ao subículo, o pré-subículo e o para-subículo, repousando sobre o córtex entorrinal e giro parahipocampal (Brodal & Bjaalie, 1997). O termo “hipocampo” é comumente utilizado para descrever conjuntamente duas regiões contíguas interligadas: o giro dentado (GD) e o hipocampo propriamente dito (“Corno de Amon”; CA). Ambos possuem uma organização interna em camada tripla, composta por dois tipos de células principais: as células granulares do giro dentado e as células piramidais do Corno de Amon. O Corno de Amon é, por sua vez, subdividido em 4 regiões, CA1-4. O GD é composto pelos estratos molecular e granuloso (assim chamado por conter os corpos celulares das células granulares as quais constituem os principais neurónios excitatórios desta área). Internamente ao estrato granuloso encontra-se o hilo (também designado por estrato multiforme ou polimórfico). Este estrato é frequentemente considerado como independente do GD e muitas vezes referido como CA4 (Forster et al, 2006). Figura 6 - Imagens ilustrativas da formação hipocampal. (A) Imagem de um corte coronal do hipocampo humano obtida por contraste de interferência diferencial. (B) Diagrama esquemático da estrutura do hipocampo. CA1-4 - Setores do Corno de Amon; GD - Giro dentado; Sub - Subículo. Adaptado de: http://neuralnetoff.umn.edu/mediawiki/index.php/Hippocampal_Anatomy FCUP/ICBAS Resultados e Discussão 29 Na Figura 6A é possível observar uma imagem de um corte coronal de hipocampo de um indivíduo controlo obtida por contraste de interferência diferencial com algumas regiões identificadas. Devido à dimensão do hipocampo humano (comparativamente com o dos roedores usados habitualmente nas experiências), foi necessário recolher várias imagens microscópicas parcelares e corrigi-las na montagem final apresentada. Na Figura 6B, encontra-se ilustrado um diagrama esquemático da estrutura do hipocampo para uma melhor compreensão visual das regiões identificadas experimentalmente. 3.2 – Padrão anatomopatológico do hipocampo de doentes com MTLE: esclerose hipocampal Figura 7 – Imagens representativas de esclerose hipocampal (região hilo/CA4) num doente com MTLE comparativamente com o hipocampo de um indivíduo controlo. Os astrócitos foram marcados com um anticorpo anti-GFAP e as fibras neuronais foram marcadas com um anticorpo anti-NF. Observa-se no hipocampo MTLE perda neuronal acompanhada de intensa astrogliose. Barra de escala = 50µm. Na Figura 7, podem-se observar alguns aspetos relacionados com a esclerose hipocampal. Na região hipocampal hilo/CA4 do doente com MTLE observa-se uma perda neuronal significativa, detetada pela redução da imunoreatividade para o neurofilamento (NF), que é acompanhada de intensa astrogliose (aumento do número de astrócitos imunoreativos para o marcador glial GFAP) (Borges et al, 2003), comparativamente com a mesma região no hipocampo de controlo cadavérico. Observa-se, ainda, uma alteração marcada na morfologia das células marcadas positivamente com GFAP, estas aumentam FCUP/ICBAS Resultados e Discussão 36 interessando por isso investigar em que tipo(s) de célula(s) a expressão do recetor A2A seria mais evidente. Figura 13 - Comparação da imunoreatividade do recetor A2A nas regiões giro dentado (GD), corno de Amon (CA1 e CA3) e Hilo/CA4 do hipocampo de um indivíduo controlo e de um doente com MTLE. Observa-se um aumento significativo da expressão do recetor A2A que é particularmente evidente nas regiões GD e hilo/CA4 do hipocampo no doente MTLE. Barra de escala = 50µm. FCUP/ICBAS Resultados e Discussão 37 Figura 14 - Avaliação da localização celular do recetor A2A na região hilar/CA4 do hipocampo humano. Imunoreatividade do recetor A2A (verde) em células reativas para marcadores de terminais nervosos, NF e SiT, e de células gliais, GFAP, no hipocampo de um doente com MTLE e de um indivíduo controlo. Note-se que a intensa astrogliose (marcação positiva para GFAP) observada nas seções do doente MTLE se correlaciona com o aumento da imunorreatividade para o recetor A2A da adenosina. Barra de escala = 50µm. A2A GFAP DAPI MERGE CTR MTLE CTR MTLE A2A NF DAPI MERGE CTR MTLE A2A SiT DAPI MERGE FCUP/ICBAS Resultados e Discussão 38 Na Figura 14, mostra-se claramente que o aumento da imunoreatividade do recetor A2A no hipocampo dos doentes MTLE se faz à custa da sua expressão em células marcadas positivamente para o GFAP, acompanhando o processo de astrogliose descrito anteriormente. Note-se que a marcação A2A no hipocampo do controlo cadavérico é muito reduzida, comparativamente com o sinal observado para o recetor A1 (ver Figura 10). Neste contexto, importa salientar que o recetor inibitório A1 predomina no hipocampo dos controlos cadavéricos e que a sua expressão diminui nos doentes MTLE, para dar lugar ao aumento da expressão dos recetores excitatórios do subtipo A2A, principalmente nas células gliais marcadas positivamente para o GFAP. Os resultados deste trabalho mostram claramente e pela primeira vez que a (des)diferenciação dos astrócitos durante a gliose hipocampal característica do fenómeno epileptogénico se faz acompanhar da substituição dos recetores inibitórios A1 (característica dos indivíduos controlo) pela sobrexpressão dos recetores excitatórios A2A da adenosina nos doentes com MTLE. Trabalhos futuros deverão avaliar o significado fisiopatológico desta alteração. Figura 15 - Pormenor da colocalização do recetor A2A com o marcador de células gliais, GFAP, numa seção do hipocampo de um doente com MTLE. Barra de escala = 50µm. Na Figura 14, mostra-se que as células neuronais positivas para o NF e para a proteína pré-sináptica sinaptotagmina (SiT) não exibem imunorreatividade para o recetor A2A da adenosina. A expressão preferencial dos recetores A2A nas células gliais (marcadas positivamente para o GFAP), que é particularmente evidente nos doentes MTLE (Figura 14, pormenor realçado na Figura 15), consolida a hipótese avançada pela A2A GFAP DAPI MERGE FCUP/ICBAS Resultados e Discussão 39 análise dos níveis de expressão proteica (Figura 12). Naquelas experiências, verificou-se que o aumento da expressão do recetor A2A da adenosina no doente com MTLE é mais evidente nos lisados totais (9.5 vezes o controlo) do que nos terminais nervosos isolados (6 vezes o controlo) mostrando que estes recetores se localizam preferencialmente em células não-neuronais, muito provavelmente gliais. FCUP/ICBAS Conclusão 40 CONCLUSÃO As crises epiléticas são tradicionalmente vistas como um desequilíbrio entre a transmissão excitatória e inibitória nos circuitos cerebrais, no qual a hiperexcitação ou a hipoinibição podem resultar num disparo repetitivo anormal dos circuitos cerebrais (Meldrum & Rogawski, 2007). Esta visão reducionista do fenómeno epiletogénico mantém-se válida apenas para o controlo das crises convulsivas, mas está longe da conceção hoje aceite dos processos eletrofisiológicos (e.g. plasticidade sináptica, difusão da atividade elétrica cerebral) e anatomopatológicos (e.g. alteração da morfologia, apoptose/morte neuronal, proliferação glial, inflamação cerebral) subjacentes à epiletogénese. A adenosina é considerada um importante modulador da atividade cerebral em várias vertentes (e.g. controlo da atividade neuronal, regulação do metabolismo e da perfusão cerebral, papel na inflamação cerebral) e, como tal, tem sido apresentada como um antiepilético endógeno, muito embora a maioria dos estudos subjacentes a esta análise tenham sido realizados em modelos animais. Ora, atendendo à cronicidade do fenómeno epiletogénico e às diferenças intrínsecas aos modelos animais comparativamente ao fenómeno no Homem, urge desenvolver esforços no sentido de estudar as alterações fisiopatológicas no tecido humano epilético. Neste trabalho avaliaram-se os níveis de expressão e a localização celular dos dois recetores da adenosina considerados mais abundantes no cérebro A1 e A2A, que por sinal também apresentam maior afinidade para o nucleósido, no hipocampo humano. Neste estudo, utilizaram-se amostras de hipocampo de cadáver proveniente de autópsias médico-legais e de doentes portadores de epilepsia fármaco-resistente do tipo MTLE submetidos a cirurgia ablativa do foco epileptogénico. A escolha do hipocampo prendeu-se com o fato desta região cerebral ser especialmente suscetível à lesão que deriva da libertação de substâncias excitotóxicas tal como o glutamato, que acontece durante as crises convulsivas recorrentes. Também pesou o fato do hipocampo possuir uma grande densidade de terminações nervosas excitatórias (Auer & Siesjo, 1988; Olney et al, 1983) e da sua estrutura / atividade se encontrar particularmente alterada num grande número de doentes com epilepsia fármaco-resistente do tipo MTLE. É importante referir que dada a enorme limitação em termos de obtenção de tecido cerebral humano, em particular de hipocampo, as experiências efetuadas estão em parte incompletas e por outro lado também carecem de confirmação. As peças usadas no estudo nem sempre se apresentavam nas melhores condições e grande parte não continha a estrutura do hipocampo completa o que justifica FCUP/ICBAS Conclusão 41 por vezes a ausência de imagens de imunolocalização na zona onde o dano provocado pela MTLE é descrito como tendo maior impacto (região do CA1). Assim, a estratégia seguida foi, de acordo com as regiões presentes na peça em estudo escolher (de entre regiões descritas como afetadas na MTLE: CA1, CA3, Hilo/CA4) aquela para a qual se verificaram resultados mais evidentes. De todas, o Hilo/CA4 foi a região eleita para descrever os resultados obtidos tanto para o recetor A1 como A2A. Os resultados obtidos confirmaram os achados anatomopatológicos encontrados tradicionalmente no hipocampo dos doentes MTLE, nomeadamente no que respeita à perda da arquitetura normal do hipocampo devido à morte neuronal e à intensa astrogliose verificada sobretudo nas regiões de CA1 e Hilo/CA4, com relativa preservação das regiões CA2, CA3 e GD. Neste contexto, têm surgido dúvidas devido ao aparente paradoxo sobre como é possível que uma uma região empobrecida em neurónios possa gerar crises convulsivas. Diversos autores apontam a componente glial como aquela que poderá ter um papel essencial no desenvolvimento da doença, mercê da capacidade destas células reagirem, libertarem, captarem e metabolizarem inúmeros mediadores apontados como sendo importantes no fenómeno epiletogénico, desde logo neurotransmissores como o glutamato e o GABA, mas também neuromediadores como o ATP e a adenosina, fatores neurotróficos, citocinas inflamatórias, etc. Os resultados deste trabalho mostram claramente e pela primeira vez que a astrogliose associada à esclerose hipocampal humana parece acompanhar-se da (des)diferenciação dessas células por fenómenos ainda desconhecidos resultando, nomeadamente, na substituição dos recetores inibitórios A1 da adenosina (característicos dos indivíduos controlo) por recetores excitatórios do subtipo A2A evidenciados em grande abundância nos doentes com MTLE. Curiosamente, o grupo de D. Boison mostrou um aumento paralelo da atividade da cinase da adenosina (a enzima que fosforila intracelularmente o nucleósido em AMP) nas células gliais do hipocampo em modelos animais de epilepsia, justificando por esse fato a redução dos níveis de adenosina encontrados no meio extracelular e, por conseguinte, a sua atividade antiepilética. Para além disso, mostrou-se que o hipocampo dos animais epiléticos liberta intrinsecamente menor quantidade de ATP que os controlos e, também, parece que a atividade das ecto-NTPDases responsáveis pela conversão do ATP em adenosina está comprometida nos epiléticos. O significado fisiopatológico da mudança na sinalização purinérgica astrocitária durante o fenómeno epiletogénico agora tornada evidente está longe de ser conhecido, requerendo a sua exploração num futuro próximo. Se não restam dúvidas sobre a importância da componente glial no fenómeno epiletogénico, por maioria de razão a perda neuronal verificada no hipocampo dos doentes epiléticos parece estar diretamente envolvida na epilepsia. Os resultados obtidos FCUP/ICBAS Conclusão 42 neste estudo permitiram verificar uma diminuição da densidade dos recetores inibitórios A1 expressos nas terminações nervosas (positivas para o marcador neuronal, SiF) no hipocampo dos doentes epiléticos comparativamente com os controlos cadavéricos. Este fenómeno parece acompanhar de perto a perda neuronal observada na região hilar/CA4 e, com menor preponderância, na região GD. Devido à escassez de tecido cerebral humano, não foi possível excluir nesta fase o envolvimento da região do CA1, assim como de outras regiões tradicionalmente menos afetadas pelo processo epiletogénico no hipocampo, como a CA2 e a CA3. Ainda assim, pode avançar-se que a redução da expressão do recetor inibitório A1 da adenosina no hipocampo epilético humano pode estar relacionada com o aumento da excitabilidade neuronal naquela região cerebral e estar na base da epilepsia. FCUP/ICBAS Perspetivas Futuras 43 PERSPETIVAS FUTURAS  Alargar o estudo das experiências de imunofluorescência aplicadas à microscopia confocal para as restantes zonas de interesse do hipocampo, nomeadamente CA1 e CA3. Alargar também este tipo de estudo ao neocórtex adjacente ao foco hipocampal uma vez que está descrito que procedimentos neurocirúrgicos onde ocorre a remoção do tecido cortical adjacente ao foco epilético hipocampal são acompanhados de uma recuperação mais favorável (Avoli et al, 2005) quando comparado com a remoção apenas do hipocampo esclerosado;  Avaliação da existência de correlação entre os resultados dos estudos de expressão dos recetores da adenosina e ensaios funcionais realizados no Laboratório de Farmacologia e Neurobiologia do ICBAS-UP o Estudar o controlo purinérgico sobre os níveis intracelulares de Ca2+ em terminais nervosos isolados do cérebro (hipocampo e neocórtex adjacente) de doentes com MTLE comparativamente com indivíduos controlo. o Avaliar a libertação de ATP (bioluminescência) e adenosina (HPLC) no hipocampo humano (controlo vs MTLE), bem como realizar cinéticas de metabolização dos nucleótidos de adenina e da adenosina neste tecido. A distribuição das ecto-NTPDases, da ecto-5’-nucleotidase, da desaminase da adenosina e da cinase da adenosina, também poderia ser avaliada por microscopia confocal.  A avaliação da atividade dos recetores A1 e A2A da adenosina em astrócitos em cultura isolados de indivíduos controlo e de epiléticos com MTLE poderia ajudar a esclarecer o seu papel no contexto da epilepsia, já que a sua expressão diferencial foi observada nos dois grupos de indivíduos.  As tarefas sugeridas implicam um aumento do número de amostras de tecido cerebral processadas para garantir significado estatístico, objetivo que infelizmente não depende exclusivamente dos investigadores, mas sim de uma equipa multidisciplinar que é responsável pela seleção e colheita do tecido. Ora, como facilmente se pode antever, o ritmo das colheitas de tecido cerebral é o principal óbice à realização deste projeto, pelas razões éticas, clínicas, metodológicas e outras que se podem determinar. FCUP/ICBAS Bibliografia 44 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Abbracchio MP, Camurri A, Ceruti S, Cattabeni F, Falzano L, Giammarioli AM, Jacobson KA, Trincavelli L, Martini C, Malorni W, Fiorentini C (2001) The A3 adenosine receptor induces cytoskeleton rearrangement in human astrocytoma cells via a specific action on Rho proteins. Ann N Y Acad Sci 939: 63-73 Abbracchio MP, Ceruti S, Brambilla R, Franceschi C, Malorni W, Jacobson KA, von Lubitz DK, Cattabeni F (1997) Modulation of apoptosis by adenosine in the central nervous system: a possible role for the A3 receptor. Pathophysiological significance and therapeutic implications for neurodegenerative disorders. Ann N Y Acad Sci 825: 11-22 Allaman I, Lengacher S, Magistretti PJ, Pellerin L (2003) A2B receptor activation promotes glycogen synthesis in astrocytes through modulation of gene expression. 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