Assessment of pesticide contamination in ground water and vegetables using environment friendly methodologies.

Armindo Jorge Alves de Melo Assessment of pesticide contamination in ground water and vegetables using environment friendly methodologies Tese do 3º Ciclo de Estudos Conducentes ao Grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas com especialização em Nutrição e Química do Alimentos Trabalho realizado sob a orientação da: Professora Doutora Isabel Maria Pinto Leite Viegas Oliveira Ferreira e co-orientação de: Doutora Catarina Isabel Guerra Rodrigues de Mansilha Professora Doutora Olívia Maria de Castro Pinho Porto Abril de 2012 ii É autorizada a reprodução integral desta tese apenas para efeitos de investigação, mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete. iii Agradecimentos A realização e compilação desta dissertação envolveu apoio, orientação e esforços de muitas pessoas, que contribuíram para que esta experiência fosse extremamente enriquecedora, tanto a nível científico como pessoal. Portanto, gostaria de deixar aqui os meus mais sinceros agradecimentos, a todos aqueles que, de qualquer forma, contribuíram na conclusão deste trabalho. Inicialmente gostaria de agradecer à Professora Doutora Isabel Ferreira pela orientação, apoio, total disponibilidade e confiança que depositou em mim durante todo este trabalho, tornando este percurso mais fácil. Para além disso, desde o primeiro momento esteve sempre presente mesmo nos momentos mais difíceis, dando-me motivação, força e otimismo para continuar. Pelos bons momentos partilhados, pela boa amizade que criamos e por tudo o que fez por mim, não tenho palavras suficientes para demonstrar toda a minha gratidão. À Doutora Catarina Mansilha pela excelente co-orientação e por me receber no laboratório da Unidade de Água e Solos, do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, na realização do meu programa de doutoramento. O tempo que lá passei teve uma enorme contribuição no meu conhecimento para a realização deste trabalho, de destacar ainda disponibilidade, confiança e amizade que sempre demonstrou. Aos restantes elementos do laboratório, um enorme obrigado, em especial á Sofia pela sua amizade. À Professora Doutora Olívia Pinho pela sua co-orientação, apoio constante e perguntas pertinentes neste trabalho, bem como, pela boa disposição e amizade. Fica o registo na memória de momentos nostálgicos, quando relembrávamos velhas tradições ou ditados das nossas terras. A todas as pessoas do Laboratório de Bromatologia e Hidrologia, e em particular a Drª Eulália, por todos os bons momentos e aqueles “5 min” para pensar noutras realidades. À Professora Doutora Susana Casal, a sua constante disponibilidade para solucionar diferentes problemas, bem como os seus sábios conselhos, ao Professor Doutor José Fernandes por todas as condições proporcionadas enquanto responsável pelo laboratório, bem como enquanto condutor da “poderosa chicolateira” em terras perdidas no meio do mar. Ao Doutor Miguel a boa disposição de um enorme “gaiteiro” e à Doutora Sara Cunha toda a disponibilidade demonstrada, tal como ajuda, conselhos e dicas na condução deste trabalho. À Anabela Borges e Eng.ª Anabela Costa todo o apoio e amizade. Não incluída na lei orgânica do laboratório de Bromatologia, mas sempre presente, a Eng.ª Maria Elisa Soares a quem tenho de agradecer a paciência iv demonstrada comigo, que poderia ir desde o “simples bater de porta” até à correcção da construção frásica ou dicção, mas o mais importante foi a enorme amizade criada. Também gostaria de agradecer à Professora Doutora Ana Aguiar pela ajuda nos trabalhos de campo, bem como à associação de agricultores Horpozim, nomeadamente, à Engª Inês Ramos, por toda a disponibilidade. Também para os diferentes agricultores que possibilitaram algum do trabalho desenvolvido, em especial ao srº António Silva, ao srº Flores e a esposa, pela boa disposição sempre demonstrada e por uma porta sempre aberta, que em muita das vezes ainda atrasava o seu trabalho. De seguida não posso deixar passar em claro todos os meus amigos que sempre me acompanharam e conviveram comigo nos últimos anos, pela boa disposição, pelo bom ambiente de trabalho que me proporcionaram e pela ajuda prestada sempre que necessário. É lógico que não vou falar de todos mas não posso deixar de dizer umas palavras a alguns. Começando pela Catarina, por toda a sua ajuda e por estar sempre presente. À Olga, Cristina, Elsa, Carina, Rebeca e Zita pela enorme amizade e sempre ajudam a quebrar a monotonia. À Trini a espanhola mais portuguesa que conheço, por toda a ajuda e amizade. Agora os meus amigos Edgar (“mineiro”) e Luís Filipe pelos bons momentos, discussões ideológicas, bem como trabalho árduo. Também a todas as outras pessoas que passaram pelo laboratório de Bromatologia. Ao meu amigo David também não podia deixar de escrever umas pequenas palavras, desde um obrigado pelas boleias desde casa, claro “paciência”, disponibilidade e boa disposição. A todos os meus amigos da química-física e as companhias para muitos almoços. A todos os meus amigos do mestrado de Controlo de Qualidade e pelos bons momentos que ainda hoje podemos disfrutar, nos nossos jantares. Aos meus velhos amigos da Covilhã e Felgueiras, que apesar dos diferentes trajetos, os laços de amizade continuam. Ao meu Pai, à minha Mãe e à minha Irmã, por todo o seu apoio e confiança, que sempre me ajudaram nos momentos difíceis, e todo o seu trabalho árduo para me proporcionar as condições necessárias para eu ter chegado até aqui. A toda a minha família por me terem acompanhado desde sempre ajudando-me a crescer, em especial às minhas avós, em que a sua companhia ainda hoje me proporcionam excelentes momentos. Também um agradecimento muito especial para a Amélia, por toda a ajuda, compreensão, sorriso e paciência, ao longo destes anos. Por fim, agradeço à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, por me ter admitido como estudante de doutoramento, disponibilizando todos os meios necessários para a realização deste trabalho. v Agradeço à Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) pelo suporte financeiro referente à bolsa de Doutoramento com referência SFRH/BD/41764/2007 no âmbito do QREN-POPH-Tipologia 4.1 – Formação Avançada, comparticipado pelo Fundo Social Europeu e por fundos nacionais do MCTES. “A vida é uma pedra de amolar: desgasta-nos ou afia-nos, conforme o metal de que somos feitos.” Bernard Cornwell vi Resumo A expansão da utilização de produtos fitofarmacêuticos no combate a pragas, observada a partir das décadas de 50, 60 e 70 do século passado, proporcionou evidentes vantagens agrícolas e económicas. No entanto, devido aos riscos desses compostos para a saúde humana, e aos elevados danos ambientais, a sua aplicação teve que ser moderada. A exposição aos resíduos de pesticidas está associada, a longo prazo, a graves problemas de saúde, tais como, dificuldades respiratórias e aparecimento de cancro. A nível ambiental, o uso intensivo de pesticidas pode levar à degradação dos recursos naturais, em alguns casos de forma irreversível, causando desequilíbrios biológicos e ecológicos, podendo salientar-se, entre eles a contaminação da água, do ar e do próprio solo. Atualmente, a utilização sustentável de produtos fitofarmacêuticos, continua a ser um ambicioso desafio para o mercado global em que nos inserimos, mesmo após terem sido estabelecidas rigorosas medidas destinadas a reduzir os seus efeitos na saúde humana e no ambiente, sem deixar de assegurar a necessária proteção das culturas. A União Europeia está atenta e tem aprovado legislação que controla a utilização de produtos fitofarmacêuticos. A proteção dos consumidores tem sido feita através da permanente publicação e atualização dos limites máximos de resíduos tolerados na água e nos alimentos. Adicionalmente, os pesticidas clássicos têm sido substituídos por novas moléculas, que são menos persistentes no ambiente. Estas imposições legais implicam a utilização de métodos analíticos multirresíduo, sensíveis e fiáveis para a monitorização de pesticidas, em diferentes matrizes e em quantidades vestigiais. A preparação destas amostras implica rigorosos procedimentos de extração e purificação para remover interferências de elevado peso molecular, antes de efetuar a análise, geralmente por técnicas de cromatografia gasosa ou cromatografia líquida de alta performance. Nesta dissertação abordou-se a problemática da exposição do consumidor aos resíduos de pesticidas, através da ingestão de vegetais crus, produzidos em estufa, e da contaminação das águas subterrâneas em zonas de agricultura intensiva. Neste contexto, foram desenvolvidas diferentes metodologias analíticas para a análise de resíduos de pesticidas, e aplicadas na monitorização de resíduos em vegetais, que normalmente são ingeridos crus (como a alface e o tomate), bem como em amostras de águas subterrâneas. As metodologias analíticas otimizadas e validadas possuem, em comum, o facto de recorrerem a processos de extração/purificação com baixo consumo de reagentes: (i) extração em fase sólida seguida de cromatografia gasosa com deteção de massa (SPE-GC/MS) foi adequada para a deteção e quantificação de níveis vestigiais de resíduos de pesticidas e estrogénios em águas subterrâneas; (ii) microextração em fase sólida associada a cromatografia líquida de alta performance e deteção por díodos (SPME-HPLC/DAD) permitiu a análise de pesticidas vulgarmente usados na produção de alface; (iii) a associação da técnica de extração de QuEChERS e um processo de vii microextração líquido-líquido dispersiva para a determinação de resíduos de pesticidas em amostras de tomate (QuEChERS/DLLME) permitiu elevados fatores de enriquecimento e a realização da separação e quantificação por HPLC/DAD ou GC/MS dependendo dos resíduos de pesticidas que se pretendia analisar. De forma a garantir a sensibilidade, fiabilidade e rigor dos métodos analíticos desenvolvidos, foi efetuada uma criteriosa otimização e validação dos mesmos. Para tal, nas metodologias de SPME-HPLC/DAD e QuEChERS/DLLME-HPLC/DAD, efetuou-se uma otimização multivariada, com recurso a curvas de superfície de resposta, de forma a selecionar as condições mais favoráveis na extração dos compostos em estudo. A validação foi efetuada através da avaliação dos efeitos de matriz, dos parâmetros de exatidão e precisão, do intervalo de linearidade, e dos limites de deteção e quantificação. Os métodos analíticos desenvolvidos foram aplicados na monitorização de resíduos de pesticidas de diferentes matrizes. No caso da monitorização dos resíduos de pesticidas em alface pelo método de SPME-HPLC/DAD, foi possível avaliar os níveis de dissipação de alguns pesticidas desde a sua aplicação nas alfaces até à respetiva colheita, confirmando que as boas práticas agrícolas foram seguidas, e que a concentração dos resíduos, quando existentes, era aceitável para os consumidores, pois não ultrapassavam o limite máximo de resíduo, valor que serviu de base à avaliação de risco. É de realçar que a metodologia otimizada permitiu a quantificação dos pesticidas em teores superiores a 100 mg/kg de alface e em níveis vestigiais. A aplicação da técnica de QuEChERS/DLLME - GC/MS, na monitorização de resíduos de pesticidas em amostras de tomates comercialmente disponíveis, revelou que nenhuma das amostras analisadas ultrapassava o limite máximo de resíduo admitindo, corroborando que com boas práticas agrícolas os consumidores não se encontram expostos a níveis excessivos de resíduos de pesticidas nos vegetais crus. A monitorização, por SPE-GC/MS, dos resíduos de pesticidas em amostras de água subterrânea, recolhidas em duas zonas distintas de agricultura intensiva, indicou a presença de níveis de resíduos de pesticidas superiores aos parâmetros legais, em alguns pontos de colheita. Observou-se acumulação de resíduos de diversos pesticidas (herbicidas, inseticidas e fungicidas) na região de produção de hortícolas da Póvoa de Varzim e de herbicidas na região vitícola do Douro. A elevada poluição das águas subterrâneas registada em alguns pontos da colheita, resulta de más práticas agrícolas realizadas no passado recente e longínquo, e pode expor as populações destas regiões a níveis excessivos e preocupantes destes resíduos. viii Abstract From the 50s, 60s and 70s of last century, the great expansion of the use of pesticides to combat pests, provided obvious economic and agricultural benefits. However, due to the risks of those compounds to human health and environmental damage caused, its application had to be controlled. The exposure to pesticide residues is associated with long time health problems, such as breathing difficulties and cancer. Environmentally, pesticide use can lead to the degradation of natural resources, sometimes irreversibly, causing biological and ecological imbalances, such as contamination of water, air and soil. Currently, the sustainable use of pesticides remains a challenge for the global market, even after being established stringent measures to reduce its effects on human health and in the environment, while ensuring the necessary crop protection. The European Union has approved legislation to control pesticide use. Consumer protection has been made through the permanent regulation and updating of maximum residue levels allowed in water and food. Additionally, conventional pesticides have been replaced by new molecules that are less persistent in the environment. These legal impositions need the use of multiresidue analytical methods, sensitive and reliable for monitoring pesticides in different matrices at trace levels. The preparation of these samples requires strict procedures for extraction and purification to remove high molecular weight compounds, before testing, usually by standard gas chromatography or high performance liquid chromatography. This dissertation addressed the issue of consumer’s exposure to pesticide residues through the intake of raw vegetables produced in greenhouses, and the contamination of groundwater in areas of intensive agriculture. For this reason different analytical methodologies were developed for the analysis of pesticide residues and applied in the monitoring of residues in vegetables, which are usually eaten raw (such as lettuce and tomato), as well as in samples of groundwater. The optimized and validated analytical methods have in common the use of extraction / purification processes with low consumption of reagents: (i) solid phase extraction followed by gas chromatography with mass detection (SPE-GC/MS) was suitable for the detection and quantification of trace levels of pesticide residues and estrogens in groundwater; (ii) solid phase microextraction associated with high performance liquid chromatography and diode-array detection (SPME-HPLC/DAD) allowed the analysis of pesticides commonly used in the growth of lettuce; (iii) the combination of QuEChERS technique with liquid-liquid dispersive microextraction for the analyses of pesticide residues in tomato samples (QuEChERS DLLME) allowed high enrichment factors and its ix separation and quantification by HPLC/DAD or GC/MS depending on the pesticide residues which are intended to analyze. To ensure the sensitivity, reliability and accuracy of analytical methods developed, a careful optimization and validation was performed. To this end, the SPME-HPLC/DAD and QuEChERS/DLLME-HPLC/DAD methodologies were optimized by multivariate optimization using the response surface curves, in order to select the most favorable conditions for extraction of the compounds under study. The validation was performed through the evaluation of matrix effects, the parameters of accuracy and precision, linear range, limits of detection and quantification. The analytical methods developed were applied to the monitoring of pesticide residues of different matrices. The monitorization of pesticide residues in lettuce by SPMEHPLC/DAD was useful to assess the dissipation of some pesticides between its application and lettuce harvest, confirming that when good agricultural practices were followed, the residue levels, if present, were acceptable to consumers, because the maximum residue level that formed the basis of risk assessment was not exceeded. It should be pointed out that the methodology enable the quantification of pesticide levels higher than 100 mg/kg of lettuce and also trace levels of the same pesticides. By applying the technique of QuEChERS/DLLME-GC/MS in the monitoring of pesticide residues in commercially available samples of tomatoes, it was found that none of the samples analyzed exceeded the maximum residue level, confirming that consumers are not exposed to excessive levels of pesticide residues in raw vegetables. The monitorization, by SPE-GC/MS, of pesticide residues in groundwater’s collected in two different regions devoted to intensive agriculture, revealed some collecting points presenting levels of pesticides higher than the legal parameters. Accumulation of herbicides, insecticides and fungicides was observed in groundwater from Póvoa de Varzim region that has an intensive horticulture activity, whereas groundwater from Douro region was more prone to contamination by herbicides. The pollution observed in some collecting points is an indicator of bad agricultural practices in recent and distant past, and may expose the population of these regions to excessive levels of pesticides. xvi Índice de figuras Capítulo 1. Introdução Figura 1. Representação esquemática da classificação dos fitofármacos com base na sua origem, modo de ação, natureza química, e as espécies alvo (3, 8). 6 Figura 2. Distribuição do mercado dos produtos fitofarmacêuticos expressa em percentagem de valor monetários (%) por tipo de fitofármaco em 2009 (10, 11). 7 Figura 3. Implicações do uso contínuo de produtos fitofarmacêuticos (3). 13 Figura 4. Esquema geral dos procedimentos necessários para a análise de resíduos de pesticidas em diferentes amostras. 22 Capítulo 2. Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes Figura. 1 Matrix-standard solutions recoveries (350g/L) calculated considering the areas obtained by direct injection as 100%. The dashed lines represent the range of acceptable recoveries of 70–120%. 63 Figura 2. Sums of relative errors (∑%RE) for simple and weighted calibration curves. 63 Figura 3. Percentage of relative errors (%RE) vs. concentration obtained for model 1 (   = 0 ) and model 2 (   =    / ∑     /  ) for estrone. 63 Figura 4. Examples of the variation of global uncertainty with the calibration standard concentration. 64 Figura 5. Histogram and control chart of the percentage of recovery of atrazined5 added to calibration standards and samples. 65 xvii Capítulo 3. Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode Array method for multiple pesticide screening in lettuce Figura 1. (a) The combined effect of pH and NaCl percentage on the sum of peak area at constant extraction time (30 min); (b) The combined effect of pH and extraction time on the sum of peak area at constant percentage of NaCl (17.6); (c) The combined effect of NaCl percentage and extraction time on the sum of peak area at constant pH (8); (d) The combined effect of pH and extraction time on the desirability at constant percentage of NaCl (17.6). 75 Figura 2 . Chromatograms of lettuce samples after SPME extraction under optimum extraction conditions (pH 8; 17.6% NaCl, 30 min extraction time): uncontaminated sample spiked with pesticides. Peak identification and concentration – 1: pirimicarb (56 mg/kg), 2: acetamiprid (56 mg/kg), 3: cyprodinil (5.6 mg/kg), 4: metalaxyl (56 mg/kg), 5: phosmet (8.4 mg/kg), 6: azoxystrobin (11.2 mg/kg), 7: fludioxonil (8.4 mg/kg), 8: fenehexamid (11.2 mg/kg), 9: folpet (8.4 mg/kg), 10: iprodione (22.4 mg/kg), and 11: tolyfluanid (22.4 mg/kg). 76 Capí tulo 4. Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. Figura 1. (A) Chromatographic separation of 468 the selected group of pesticides added (concentration 1.0 mgkg-1 for dicamba and metalaxyl-M; 0.5 mgkg-1 for 2,4 – D and deltamethrin, 0.1 mgkg-1 for the other nine pesticides) to a sample of organic tomato analysed by HPLC-DAD at their maximum UV absorbance wavelengths (B) Chromatographic separation of a sample of organic tomato sample without addition of pesticides. 108 Figura 2. Effect of different extraction solvents on the total chromatographic peak area of pesticides. Extraction conditions: 5 mL of ultra-pure water with 1 mL of MeCN QuEChERS extract obtained with a tomato sample spiked with a concentration of 3.0mgkg-1 for dicamba and metalaxyl-M; 1.5 mgkg-1 478 for 2,4 – D and deltamethrin, 0.150 mgkg-1 for the other nine pesticides and 100 µl of each extraction solvent. 109 xviii Figura 3. Effect of pH from aqueous phase on the total chromatographic peak area of pesticides. Extraction conditions: 5 mL of buffer with 1 mL of MeCN QuEChERS extract obtained with a tomato sample spiked with a concentration of 3.0 mgkg-1 for dicamba and metalaxyl-M; 1.5 mgkg-1 for 2,4 – D and deltamethrin, 0.150 mgkg-1 for the other nine pesticides and 100 µl of chloroform as extraction solvent. 110 Figura 4. Response surface estimated for the central composite design of QuEChERS /DLLME optimization: (a) amount of PSA and GCB); (b) chloroform amount, NaCl percentage 111 Capítulo 5. Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry. Figura 1. (A) GC-MS chromatographic separation of pesticides added to a sample of tomato analyzed in selected monitoring ion mode (each pesticide was fortified at the concentrations level 2 tested in recovery experiments, see Table 4, the legend of peaks is also in Table 4) (B) GC-MS chromatogram of C1 sample with extracted ion chromatograms in SIM mode of Fenhexamid (ions 97, 177, 179) and Azoxystrobin (ions 344, 388, 403). 136 Figura 2. Distribution of the 30 pesticides according to percentage of matrix effects in tomato samples. 137 Capítulo 6.1 . Vegetables Production in NW Portugal, Agriculture Practices and Groundwater Quality. Figura 1. Dunes with pines, masseira field as they were at the beginning of XX century and enlarged masseira with greenhouse as it has been since 80’s. 148 Figura 2. Nitrate content oscillation in bored and drilled wells in each sampling date. 148 Figura 3. Dendogram obtained from cluster analysis of dug wells and drilled wells according to pesticides quantified in each collection date. 150 xix Capítulo 6. 2 . Impact of intensive horticulture practices on groundwater content of nitrates, sodium, potassium, and pesticides. Figura 1. Map of vulnerable zone no. 1 (VZ1) designed in the framework of the 91/676/EEC Directive and showing the distribution of the collecting points considered in the present. 154 Figura 2. Dendrogram produced by cluster analysis of data organized with eight rows corresponding to the four dug wells and four drilled wells and the column vectors (X1, X2, X3, X4, X5) representing the frequency of pesticides above the LOQ in each collection date. Single linkage method with Euclidean distances was used. 160 Figura 3. Score plot of the first two PCs performed using the concentrations of pesticides. BW1, BW2, BW3, BW4—dug wells; DW1, DW2, DW3, DW4—drilled wells. 161 Capítulo 7. Groundwater from Infiltration Galleries Used for Small Public Water Supply Systems: Contamination with Pesticides and Endocrine Disruptors. Figura 1. Schematic localization of 9 infiltration galleries (fountains for public supply) sampled in the ‘Alto Douro Demarcated Wine region’ (marked on dark grey). 169 xx Índice de tabelas Capítulo 1. Introdução Tabela 1. Tipos de produtos fitofarmacêuticos classificados de acordo com o efeito desejado. 5 Tabela 2. Representação dos benefícios primários e secundários, decorrentes da utilização dos produtos fitofarmacêuticos (12). 10 Tabela 3. Classificação dos produtos fitofarmacêuticos, por parte da OMS, de acordo com a sua toxicidade aguda (adaptado de (20)). 15 Tabela 4. Os três níveis de teste para avaliar a toxicidade de pesticidas em organismos não-alvo. 19 Capítulo 2. Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes. Tabela 1. Optimized GC–MS acquisition method parameters for 32 compounds and atrazine-d5. Analytes, retention times (Rt), precursor ions and product ions for qualitative and quantitative analysis. 59 Tabela 2. Method validation data. Calibration parameters and related uncertainties. 64 Tabela 3. Intra-day, inter-day and instrumental precision (% CV) and accuracy (% Bias). 65 Tabela 4. Mean values of the experimental concentrations and recoveries for each concentration level (n≥3). 66 Capítulo 3. Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode Array method formultiple pesticide screening in lettuce Tabela 1. 2 3 full factorial CCD experimental design matrix, actual and the 74 xxi predicted results. Tabela 2. Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model for sum of peak area. 74 Tabela 3. Maximum residue levels (MRLs) for the pesticides under study, partition coefficients (Kow), detection and quantification limits and calibration curve parameters: linear range tested for each pesticide, linearity [peak area = bC + a] and respective determination coefficients (r2). 76 Capítulo 4. Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. Tabela 1. Independent variables and their coded values used for optimization. 103 Tabela 2 . List of chemical characteristics of the pesticides under study: chemical group, molecular mass (MM), log of octanol-water coefficient (log Kow - at pH=7 and 20 ºC) and acid dissociation constant (pKa) at 25 ºC. 104 Tabela 3. Predicted response value of each studied compound and experimental results using 100 mg PSA, 5.26 mg GCB, 4% NaCl and 400 µL of chloroform. 105 Tabela 4. Calibration parameters, related standard deviations and uncertainties were calculated according (Miller and Miller, 2005). The standards were prepared under the same conditions applicable to the samples. Each test was performed in at least five independent experiments. 106 Tabela 5. Results of the analysis carried out to evaluate the accuracy and repeatability of the purposed QuEChERS and DLLME method combined with HPLC-DAD for the selected pesticides in tomato samples (n = 3 for intraday assays and n = 9 for interday assays). 107 xxii Capítulo 5. Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry. Tabela 1. MS conditions for the analysis of 30 pesticides and IS (Time windows (TW) and ions selected in SIM mode, quantification ions in bold), respective molecular weight (MM), maximum residue level in EU legislation (MRL) and retention time (t R ) 132 Tabela 2. Method validation data. Calibration parameters. 133 Tabela 3 . Results of the analysis carried out to evaluate the accuracy and repeatability. 134 Tabela 4 . Results obtained for the six pesticides detected in tomato samples. 135 Capí tulo 6. 1 . Vegetables Production in NW Portugal, Agriculture Practices and Groundwater Quality. Tabela 1. Occurrence of pesticides in all water samples (n=32). Limit of detection (LOQ) and limit of quantification (LOQ) are expressed in ng/L. Chemical parameters. 149 Tabela 2. Number of pesticides above the limit of quantification (LOQ) present in each sample. 150 Cap í tulo 6. 2 . Impact of intensive horticulture practices on groundwater content of nitrates, sodium, potassium, and pesticides. Tabela 1. Mean values, range of concentration, and the month of maximal and minimal values during 1 year for nitrate, nitrite, potassium, and sodium organized by collecting points. 157 Tabela 2. Occurrence of pesticides in all water samples (n=40). 158 Tabela 3. Pesticides above the limit of quantification present in each sample, arranged by collecting points and dates. 159 xxiii Tabela 4. PCA results for groundwater set. 160 Tabela 5. Classification functions and matrix for stepwise discriminant analysis of collecting points variation. 161 Capítulo 7. Groundwater from Infiltration Galleries Used for Small Public Water Supply Systems: Contamination with Pesticides and Endocrine Disruptors. Tabela 1. Infiltration galleries (fountains for public supply) sampling location data. 169 Tabela 2. Method validation data. Calibration parameters and related uncertainties. 170 Tabela 3. Results obtained in the analysis of estrogens and pesticides from different chemical families (some of them with endocrine disrupting properties) in waters from infiltration galleries used for small public water supply systems in small villages in the North of Portugal. 171 Capítulo 9 . Avaliação da exposição do consumidor aos resíduos de pesticidas através da ingestão de vegetais crus, produzidos em estufa. Tabela 1: Dados do ajuste linear de dissipação para os compostos folpet e fenehexamid em alface, com os valores (R 0 ) correspondentes aos níveis de resíduos iniciais (mg/kg), o tempo de semi-vida para o resíduo de pesticida (t 1/2 ) (dias) e o tempo necessário para atingir o LMR (t MRL ) (dias) para os dois fungicidas estudados. 203 xxiv Lista de abreviaturas Abreviatura Nomes ADI Dose diária aceitável ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AOAC Association of Official Agricultural Chemists APCI Ionização química à pressão atmosférica API Detetores de ionização a pressão atmosférica ARfD Dose aguda de referência ASE Accelerated Solvent Extraction CCD Central Composite Design CE Eletroforese capilar CEE Comunidade Económica Europeia CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CV% Coeficiente de variação CW/TPR Carbowax/Templated Resin DAD Detenção por díodos DDT Triclodo 2.2-BIS (4-clorofenil)etano DL ₅₀ Dose letal média DLLME Microextração líquido-líquido dispersiva d-SPE Extração em fase sólida dispersiva DVB Divinilbenzeno ECD Detetor de captura de electrões EFSA Autoridade Europeia de Segurança Alimentar EI Ionização por impacto electrónico ELCD Detetor de condutividade electrolítica líquido ESI Ionização por electrospray FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration FPD Detetor fotométrico de chama GC Cromatografia gasosa GCB Carvão activado GPC Cromatografia de permeação em gel HF-LPME Hollow fiber liquid-phase microextraction xxv Abreviatura Nomes HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência ICH International Conference on Harmonization INAG Instituto da Água INE Instituto Nacional de Estatística INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia ISO International Organization for Standardization ISO International Organization for Standardization IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry K ow Coeficiente de partição octanol/água LC Cromatografia líquida LC ₅₀ Inalação aguda letal LD Limite de detenção LLE Extração líquido-líquido LMR Limite máximo de resíduo LQ Limite de quantificação MAE Extração assistida por micro-ondas MS Espectrometria de massa MSPD Dispersão de matriz em fase sólida NDPE 2-nitrophenyl ether -NH2 Aminopropil NOAEL Efeito adverso não observado NOEL Ausência de efeitos observáveis NPA 4-nitrophenyl acetate NPD Detetor de ionização de chama alcalina NPD Detetor de fósforo e azoto OMS Organização Mundial de Saúde PA Poliacrilato PDMS Polidimetililoxano PEC Concentração previsível no ambiente PI Padrão interno PLE Extração liquida pressurizada PNA Plano Nacional da Água PSA Amina primária e secundária PTV Temperatura programada de vaporização xxxii A Parte III inclui a discussão global dos resultados obtidos na parte experimental. No Capítulo 8 apresenta-se a discussão dos resultados obtidos na validação das diferentes metodologias analíticas aplicadas à análise de amostras de vegetais e de água. O Capítulo 9 descreve os resultados obtidos nos estudos da evolução da dissipação dos pesticidas em amostras de alface durante o intervalo de segurança e na análise de amostras de tomate produzido em estufas durante o inverno. O Capítulo 10 apresenta a discussão dos resultados obtidos na avaliação do impacto das práticas agrícolas na qualidade das águas subterrâneas, nomeadamente, o impacto da horticultura intensiva na poluição das águas subterrâneas de uma zona vulnerável, e na qualidade das águas subterrâneas provenientes de uma zona dedicada à cultura da vinha. Na Parte IV, o Capítulo 11 resume as conclusões globais da dissertação. Artigos publicados ou submetidos, em revistas internacionais indexadas, no âmbito desta dissertação C. Mansilha, A. Melo, H. Rebelo, I.M.P.L.V.O.Ferreira, O. Pinho, V. Domingues, C. Pinho, P. Gameiro (2010) Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography-tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes. J. Chromatogr. A, 1217 (43), 6681-6691. C. Mansilha, A. Melo, I.M.P.L.V.O. Ferreira, O. Pinho, V. Domingues, C. Pinho, P. Gameiro (2011). Groundwater from Infiltration Galleries Used for Small Public Water Supply Systems: Contamination with Pesticides and Endocrine Disruptors. B. Environ Contam Toxicol, 87, 3, 312-318. A. Melo, A. Aguiar, C. Mansilha, O. Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. (2012) Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode Array method for multiple pesticide screening in lettuce. Food Chem. 130 (4), 1090-1097. A. Melo, E, Pinto, A. Aguiar, C. Mansilha, O. Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Impact of intensive horticulture practices on groundwater content of nitrates, sodium, potassium, and pesticides. Environ. Monit. Assess. DOI 10.1007/s10661-011-2283-4 A. Aguiar, A. Melo, C. Mansilha, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Vegetables Production in NW Portugal, Agriculture Practices and Groundwater Quality. Acta Horticulturae (in press) A. Melo, C. Mansilha, O. Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquid-liquid microextraction followed by highperformance liquid chromatography (submetido) A. Melo, S.C. Cunha, C. Mansilha, A. Aguiar, O. Pinho, I.M.P.L.V.O. Ferreira. Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas-chromatography-mass spectrometry (submetido) xxxiii PARTE I Capítulo 1 Introdução Capítulo 1 Introdução 3 1. Introdução As atividades decorrentes do uso do solo transformaram uma grande percentagem da superfície terrestre. Campos agrícolas e pastagens tornaram-se numa das maiores biomassas do planeta e ocupam 40% da superfície terrestre, rivalizando em extensão com a cobertura florestal (1). A alteração das práticas agrícolas conduziu à duplicação da produção mundial de cereais nas últimas quatro décadas, ultrapassando, neste momento, dois biliões de toneladas por ano. Este facto deveu-se principalmente a dois fatores: aumento de ~12% da área cultivada e novas tecnologias implementadas com a “revolução verde”, nomeadamente a adoção de um sistema de produção intensiva que inclui cultivares de alto rendimento, fertilizantes químicos e fitofármacos, da mecanização e irrigação (2). Neste contexto, os produtos fitofarmacêuticos são um dos componentes mais importantes para a agricultura mundial (3). O uso de produtos fitofarmacêuticos para matar ou controlar pragas não é um conceito novo. Diversos compostos inorgânicos naturais com propriedades tóxicas foram utilizados pelo Homem como fitofármacos desde a antiguidade (4). Os romanos utilizavam o sal para impedir o crescimento das ervas daninhas nas suas estradas e os gregos fumigavam as suas casas com enxofre. No século XVI os chineses usavam o sulfureto de arsénio como um inseticida. O uso de compostos á base de arsénio prosseguiu e, durante a primeira metade do século XX, grandes quantidades de compostos como o arseniato de chumbo foram utilizados para controlar pragas de insetos (3-5). Alguns fitofármacos inorgânicos são relativamente estáveis, apresentando um tempo de semi-vida superior a muitos produtos fitofarmacêuticos orgânicos produzidos na atualidade. A persistência dos fitofármacos inorgânicos, embora vantajosa no que respeita ao controlo de pragas, significa igualmente a persistência da substância ativa nas espécies tratadas e no ambiente por vários anos (5). A era dos produtos fitofarmacêuticos orgânicos sintéticos teve início por volta de 1940, e expandiu-se rapidamente pois, atendendo a que estes produtos químicos apresentavam um controlo muito eficaz de pragas, a sua adoção foi extremamente rápida. Deste modo, novos produtos químicos foram desenvolvidos e usados como fitofármacos (3). O composto denominado 1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano, ou DDT, de fórmula molecular C 14 H 9 C l5 , foi o primeiro produto fitofarmacêutico moderno e um dos compostos mais relevantes produzidos na história da Humanidade, tanto pelos seus efeitos benéficos quanto maléficos, tendo sido largamente usado após a Segunda Guerra Mundial para o combate aos mosquitos vetores da malária e da febre tifóide. O DDT é, no Capítulo 1 Introdução 4 entanto, um poluente orgânico persistente, cancerígeno e comprovadamente disruptor endócrino, tendo sido proibido a sua utilização (6). Os produtos fitofarmacêuticos sintéticos têm desempenhado um papel importante na alimentação humana e animal, produção de fibras, bem como em saúde pública e qualidade ambiental. Os fitofarmacos mais tóxicos e/ou persistentes estão atualmente a ser substituídos por fitofármacos mais ecológicos, com baixa dose de principio ativo e reduzido risco para os seres humanos e organismos não-alvo (6). 1.1. Conceitos e classes de pesticidas A definição proposta pela Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) estabelece que produto fitofarmacêutico é “qualquer substância ou mistura de substâncias destinadas a prevenir, destruir ou controlar qualquer praga, incluindo vetores de doença humana ou animal, as espécies não desejadas de plantas ou animais que causam danos ou interferindo com a produção, processamento, armazenamento, transporte ou comercialização de alimentos, produtos agrícolas, madeira e produtos á base de madeira, alimentos para animais, ou substâncias que podem ser administrados em animais para o controlo de insetos, aracnídeos ou outras pragas. O termo inclui substâncias destinadas para uso, como um regulador de crescimento da planta, desfolhantes, dessecantes, ou o agente para o desbaste de frutos ou prevenir a queda prematura de frutos, e as substâncias aplicadas a culturas, quer antes ou depois da colheita, para proteger o produto de degradação durante o armazenamento e transporte” (7). Contudo, em geral, pode ser definido como uma substância que exerce ação tóxica sobre uma determinada praga, que pode prejudicar ou ser um vetor de doenças para o Homem (3). Existem diversos tipos de produtos fitofarmacêuticos que se classificam de acordo com as pragas que têm por fim combater, tal como exemplificado na Tabela 1. Capítulo 1 Introdução 5 Tabela 1: Tipos de produtos fitofarmacêuticos classificados de acordo com o efeito desejado. Produtos Fitofarmacêuticos Efeito Herbicidas Combatem ervas daninhas e outras plantas infestantes Inseticidas Combatem insetos e outros artrópodes Fungicidas Combatem fungos Acaricidas Combatem ácaros Nematodicidas Combatem nematóides parasitas Moluscicidas Combatem moluscos (lesmas e caracóis) Rodenticidas Combatem ratos e roedores em geral Algicidas Combatem algas Bactericidas Combatem bactérias Feromonas Permitem o reconhecimento mútuo e sexual dos indivíduos da mesma espécie Reguladores de Crescimento Interferem com os processos fisiológicos das plantas A classificação dos produtos fitofarmacêuticos acima mencionada é uma classificação básica concordante com o objetivo biológico a que se propõem. Devido à grande diversidade de fitofármacos, torna-se difícil elaborar um esquema geral de classificação. No entanto, estes compostos poderão ser classificados com base na sua origem, o modo de ação, natureza química, e as espécies alvo. A Figura 1 apresenta uma categorização esquemática de fitofármacos em diferentes classes. Capítulo 1 Introdução 12 1.3. Desvantagens da utilização de produtos fitofarmacêuticos É cada vez mais indissociável a utilização de produtos fitofarmacêuticos e a problemática ambiental e de saúde pública relacionada com os efeitos nocivos do seu uso, no que concerne a riscos para a saúde humana e animal e efeitos nefastos no meio ambiente. Os fitofármacos são venenos e são produzidos para serem tóxicos para uma ou várias formas de vida. O uso frequente de produtos fitofarmacêuticos favorece os riscos de contaminação do meio ambiente, nomeadamente, a contaminação de solos agrícolas, de águas superficiais e subterrâneas e de alimentos podendo, em episódios mais graves, inviabilizar o seu consumo (9). Inicialmente, o aumento da utilização destes compostos foi considerado um sinal positivo do progresso agrícola. Posteriormente, o Homem apercebeu-se que cada composto adicionado ao ambiente só demonstrava os seus efeitos indesejados ou tóxicos muito mais tarde, sendo este facto evidenciado, principalmente, nos produtos fitofarmacêuticos organoclorados persistentes, como o DDT. É de realçar que este tipo de compostos não possui uma toxicidade aguda muito elevada para humanos ou animais não artrópodes, mas causa graves efeitos prejudiciais ao ecossistema, tais como os descritos por Rachel Carson no livro “Silent Spring” de 1962. Muitos dos produtos fitofarmacêuticos organoclorados persistentes foram mundialmente banidos a partir da década de 70 (o DDT é exceção, sendo que ainda hoje pode ser utilizado em alguns países tropicais no combate da malária). Atualmente continua a ser comum a sua deteção e quantificação, em níveis muito baixos, em humanos, vida selvagem, no meio ambiente, bem como, nalgumas cadeias alimentares devido ao seu longo tempo de persistência (13). Os princípios ativos dos fitofármacos podem movimentar-se no meio ambiente através do ar, solo e água, acabando por chegar às cadeias tróficas superiores. Verifica-se, deste modo, bioacumulação nos tecidos corporais de diferentes organismos, podendo atingir concentrações muito superiores às encontradas no meio ambiente envolvente (14). Consequentemente, tem-se verificado deterioração de ecossistemas pelo uso contínuo de produtos fitofarmacêuticos, tal como esquematizado na Figura 3 (3). Constata-se também, cada vez com maior frequência, situações de envenenamento por fitofármacos de espécies não-alvo, (mortalidade em peixes, insuficiência reprodutiva em aves, e doenças em seres humanos), cuja descrição é cada vez mais pormenorizada. De facto, foi estimado que menos de 0,1% do princípio ativo aplicado às culturas atingia a praga alvo, o restante entrava no ambiente contaminando solo, água e ar, podendo envenenar ou afetar adversamente os organismos não-alvo expostos (14). Capítulo 1 Introdução 13 Figura 3: Implicações do uso contínuo de produtos fitofarmacêuticos (3) A exposição da população aos produtos fitofarmacêuticos ocorre principalmente através da ingestão de alimentos e água contaminada com resíduos de pesticidas. Contudo, existem descritas outras vias de exposição a estes produtos, tais como os casos acidentais ou envenenamentos e a exposição ocupacional (15). A exposição não ocupacional proveniente da contaminação da água, ar e alimentos com resíduos de pesticidas envolve geralmente doses baixas dos compostos e tem carácter crónico (ou semi-crónico) (16). A toxicidade a curto prazo ou aguda pode ser avaliada através de testes toxicológicos, como nos casos de envenenamento, podendo encontrarse, por vezes, certas correlações causa-efeito no decurso de estudos epidemiológicos. Quando se avaliam os efeitos a longo prazo ou crónicos, como os que envolvem cancro, redução de faculdades cognitivas, alergias e efeitos no sistema endócrino, a ciência atual está impossibilitada de responder plenamente a todas estas questões. Provavelmente nunca será possível avaliar o verdadeiro risco de resíduos de pesticidas devido ao elevado número de variáveis envolvidas e aos baixos níveis em que estes compostos ocorrem (13). A preocupação com substâncias ativas que possuem propriedades de disrupção endócrina tem adquirido importância crescente ao longo dos últimos anos. Estes Capítulo 1 Introdução 14 compostos podem contribuir para efeitos adversos no sistema neuroendócrino, tais como puberdade prematura ou infertilidade, através de mecanismos muito variados e complexos. Embora não sendo fácil a correlação com determinado síndrome podem, no entanto, constituir um dos agentes desencadeadores (17). Os disruptores endócrinos apresentam diversos mecanismos fisiológicos, substituindo as hormonas, bloqueando a sua ação natural, ou ainda aumentando ou diminuindo a quantidade original de hormonas, alterando as funções endócrinas. A nível ambiental, a fauna é particularmente vulnerável aos efeitos dos resíduos de pesticidas como os disruptores endócrinos. Diferentes efeitos foram detetados em invertebrados, répteis, peixes, aves e mamíferos (18). Cerca de 105 resíduos de pesticidas foram identificados como disruptores endócrinos e destes, 46% são inseticidas, 21% herbicidas e 31% fungicidas. Alguns deles já foram retirados do mercado mas continuam ainda a ser encontrados no ambiente devido à sua elevada persistência (18). 1.3.1. Riscos da ingestão de resíduos de pesticidas nos alimentos Os resíduos de pesticidas são substâncias que podem estar presentes nos alimentos, forragens, ou no ambiente, sendo resultantes do uso de produtos fitofarmacêuticos. Os resíduos incluem derivados tais como produtos de degradação, metabolitos, produtos de reação e impurezas que podem ter importância toxicológica (9). Se as boas práticas agrícolas e de produção forem seguidas, à partida não serão encontrados níveis de resíduos de pesticidas acima dos valores legalmente estipulados. Em teoria, se todos os agricultores seguissem procedimentos adequados, as análises aos alimentos seriam supérfluas. Porém, o que se verifica na realidade é a existência de práticas agrícolas por vezes inadequadas, ou o seu incumprimento, podendo ocorrer violação dos limites máximos de resíduos (LMR) de pesticidas estabelecidos e, consequentemente, riscos para os indivíduos expostos (13). No Homem, uma avaliação correta dos efeitos adversos dos resíduos de pesticidas numa dieta requer uma comparação intra-individual, em situação de exposição a dieta idêntica isenta dos referidos resíduos. A avaliação dos riscos tem que ter em consideração a presença de outros componentes tóxicos naturalmente presentes nos alimentos, bem como a variabilidade metabólica de cada indivíduo (13). A exposição real pode ser maior do que a prevista devido a determinadas preferências alimentares, à variabilidade dos resíduos presentes nos diversos alimentos ingeridos e ao consumo superior à média de um determinado alimento numa só refeição (19). Capítulo 1 Introdução 15 Atualmente, independentemente das dificuldades em avaliar os riscos da utilização de pesticidas na saúde humana, a autorização para a comercialização de pesticidas na Europa, exige que os potenciais efeitos negativos das substâncias ativas sejam revelados. Essa informação é geralmente obtida a partir de vários testes centrados, por exemplo, no padrão de metabolismo, na toxicidade aguda, sub-crónica ou sub-toxicidade aguda, na toxicidade crónica, carcinogenicidade, genotoxicidade, teratogenicidade, e também ensaios de irritação, usando ratos como mamífero modelo ou, em alguns casos, cães e coelhos. Estes testes incluem experiências como o cálculo da dose letal média (DL 50 ), inalação aguda letal (LC 50 ), efeito adverso não observado (NOAEL), dose diária aceitável (ADI) e dose aguda de referência (ARfD). As experiências in vivo de toxicidade aguda são necessárias para o cálculo da DL 50 , que se traduz na dose de pesticida necessária para matar metade dos animais testados, após administração por determinada via. Isto é, se a substância é ingerida pelo animal, esta dose corresponde a uma DL 50 por via oral, enquanto que se for absorvida através da pele, corresponde a uma DL 50 por via dérmica. Além disso, também pode ser calculada a concentração de LC 50 , que é a concentração de pesticida necessária para matar metade dos animais expostos por inalação (em 4 horas). Estes testes são utilizados para classificação das substâncias ativas por parte da Organização Mundial de Saúde (OMS) (20), através do seu perigo inerente demostrado nos testes de toxicidade aguda (Tabela 3): Tabela 3: Classificação dos produtos fitofarmacêuticos, por parte da OMS, de acordo com a sua toxicidade aguda (adaptado de (20)). Classe Classificação LD 50 para rato (mg/kg de massa corporal) Oral Dérmica Sólidos Líquidos Sólidos Líquidos Ia Extremamente perigoso <5 <20 <10 <40 Ib Altamente perigoso 5-50 20-200 10-100 40-400 II Moderadamente perigoso 50-500 200-2000 100-1000 400-4000 III Pouco perigoso >501 >2001 >1001 >4001 U Diferente de apresentar perigo agudo >2000 >3000 - - Capítulo 1 Introdução 16 A LD 50 oral é normalmente inferior à LD 50 dérmica, uma vez que uma percentagem considerável das substâncias ativas atinge a corrente sanguínea muito mais rapidamente através da absorção ao longo do tubo digestivo do que através da pele. A validação do uso de um determinado produto fitofarmacêutico requer igualmente um estudo de exposição a longo termo, in vivo, numa gama de concentrações abrangente. Estes estudos permitem definir o ponto de referência, ou dose de exposição, abaixo do qual não se verifica a ocorrência de efeitos adversos. Esta dose (ponto de referência), conhecida como nível de efeito adverso não observado (NOAEL) ou ausência de efeito observável (NOEL), é usada para cálculo da dose diária aceitável (ADI) para o Homem. A ADI é um valor numérico, sendo expressa em mg/kg de massa corporal, e determina a quantidade de substância que pode ser consumida diariamente, com segurança, por toda a vida. Este valor de ADI é obtido pela divisão do NOAEL por um fator de segurança ou incerteza, que tradicionalmente é 100. Este fator destina-se a prevenir possíveis diferenças na sensibilidade das espécies, nomeadamente dos animais de ensaio em relação aos seres humanos, bem como as diferenças inter-individuais dentro da população humana (19). A dose aguda de referência (ARfD) também tem de ser calculada, pois por vezes pode verificar-se um consumo de certos géneros alimentares muito superior ao estimado para um só dia. O valor de ARfD é baseado no NOEL e também ajustado por um fator de segurança ou incerteza, tendo em conta grupos sensíveis da população (por exemplo, crianças). O ARfD é apenas definido para as substâncias ativas que têm um potencial de toxicidade aguda (21, 22). No que respeita aos limites máximos de resíduos (LMR) nas diferentes culturas, estes são os limites legais estabelecidos para compostos específicos em géneros agrícolas específicos. Os LMR são calculados a partir dos valores da ADI, tendo em conta a quantidade de cada alimento que é suscetível de ser consumida (21). As decisões sobre os LMR podem ser obtidas não só através dos dados toxicológicos, mas também após condução de exercícios de boas práticas agrícolas nas culturas desejadas. Estas decisões são válidas apenas se o valor de resíduos de pesticidas obtido no primeiro caso for muito inferior ao segundo. Em termos práticos são estabelecidos intervalos de segurança para cada produto fitofarmacêutico, numa determinada cultura, que devem ser respeitados e que dizem respeito ao tempo que medeia entre a aplicação do produto e a colheita. Este período deve estar de acordo com as boas práticas agrícolas e ao mesmo tempo garantir que os limites não são excedidos. O registo de produtos fitofarmacêuticos é um processo moroso que envolve componentes científicas, legais e administrativas, em que se avaliam os efeitos associados à sua Capítulo 1 Introdução 17 utilização sobre a saúde humana e sobre o ambiente, de acordo com normas estabelecidas. No caso de Portugal são normas da União Europeia (UE), nomeadamente o Regulamento (UE) nº 544/2011 (23). O registo é um passo determinante no controlo do uso de produtos fitofarmacêuticos, permitindo às autoridades saber quais os produtos cuja utilização é permitida e para que fins, bem como controlar a qualidade dos produtos fitofarmacêuticos, as taxas de uso, as reclamações, a embalagem, a rotulagem e a publicidade dos pesticidas, garantindo os interesses dos utilizadores finais, bem como a proteção do ambiente. O processo de registo restringe-se à hipótese dos pesticidas serem utilizados apenas para a função pretendida (19). Trata-se de um processo complexo que demora um período de tempo considerável, exige recursos e perícia por parte da autoridade de registo, da indústria de produtos fitofarmacêuticos, e vários grupos de interesse público. Hoje em dia, os produtos para alimentação humana e animal circulam livremente no mercado interno da UE. Deste modo, é indispensável garantir que todos os consumidores estão igualmente protegidos relativamente à exposição a níveis inaceitáveis de pesticidas presentes nos alimentos que consomem (24). No entanto, convém realçar que a segurança dos consumidores de um país não significa, necessariamente, que todos os consumidores da UE estejam protegidos, pois os padrões de consumo alimentar diferem de um Estado-Membro para outro. De forma a minimizar as disparidades existentes, a partir de 01 de setembro de 2008, o Regulamento (UE) n º 396/2005 do Parlamento Europeu e do Conselho relativo aos LMR de pesticidas nos produtos de origem vegetal e animal passou a definir um novo, e totalmente harmonizado conjunto de regras para resíduos de pesticidas. Este Regulamento simplifica a legislação existente e harmoniza os LMR de pesticidas de forma a serem aplicados em todos os países da UE. Os diferentes anexos do Regulamento (CE) nº 396/2005 especificam os limites máximos de resíduos e os produtos a que se aplicam. Os resultados da monitorização de resíduos de pesticidas em diferentes matrizes fornecem dados que podem ser usados para conhecer melhor os riscos associados à utilização de produtos fitofarmacêuticos. (13). No estado atual do uso de fitofármacos, a análise do custo/benefício mostra que o uso adequado de produtos fitofarmacêuticos é compensatório, caso contrário o pesticida não estaria no mercado. No entanto, a longo prazo esta relação custo/benefício só pode ser avaliada após os fitofármacos terem sido utilizados durante um certo período de tempo. Capítulo 1 Introdução 18 Considerando os efeitos adversos relacionados com a utilização dos produtos fitofarmacêuticos na agricultura, a sua seleção criteriosa em termos de eficácia, custo e segurança para o operador e para o ambiente aparece como sendo uma necessidade imperiosa. 1.3.2. Riscos ambientais. Contaminação das águas Os produtos fitofarmacêuticos, além dos potenciais efeitos negativos na saúde, apresentam também efeitos adversos sobre o meio ambiente, nomeadamente contaminação do solo, da água e do ar, assim como efeitos tóxicos sobre organismos não-alvo. Especificando, o uso inadequado de produtos fitofarmacêuticos tem sido associado a: (i) efeitos adversos sobre organismos não-alvo (por exemplo, a redução de populações de espécies benéficas; (ii) contaminação da água a partir de resíduos de pesticidas ou devido à dispersão dos mesmos; (iii) poluição do ar através de pesticidas voláteis; (iv) danos em plantas não-alvo por ação de herbicidas; (v) danos em culturas de rotação por parte de resíduos de herbicidas que permaneceram nos campos; (vi) danos em culturas durante e após aplicação de produtos fitofarmacêuticos devido à utilização de elevadas quantidades, bem como aplicações fora de época ou condições ambientais desfavoráveis (14, 19). Muitos dos efeitos adversos dos produtos fitofarmacêuticos no ambiente dependem das interações entre as propriedades físico-químicas das substâncias ativas utilizadas, nomeadamente, a pressão de vapor, a estabilidade, a solubilidade e o pKa, assim como, a adsorção e a persistência no solo, os fatores relacionados com o solo (pH, presença de componentes orgânicos, superfícies inorgânicas, a humidade, a microflora, e a fauna), as espécies de plantas e a variação climatérica. Além disso, a toxicidade, a dosagem aplicada, as condições climatéricas predominantes após a aplicação do fitofármaco, e o período de tempo que persiste no meio ambiente, podem explicar os seus efeitos adversos (25). Os fatores do solo e as condições climatéricas têm sido reconhecidos como os mais importantes relativamente ao destino dos pesticidas no ambiente e, consequentemente, à atividade, seletividade e efeitos adversos (14). Infelizmente, uma vez que estes fatores variam de local para local e de ano para ano, os resultados de qualquer estudo de campo sobre o destino e comportamento dos pesticidas são específicos no tempo e no espaço. A avaliação dos riscos ambientais, assim como o comportamento e o destino de um pesticida são estimados pelo cálculo da concentração previsível no ambiente (PEC), que tem em consideração a distribuição do pesticida em solo, água, sedimentos e ar. A Capítulo 1 Introdução 19 validação é feita com os dados obtidos em três níveis de testes (necessários para a aprovação do registo) com o intuito de avaliar a toxicidade dos pesticidas sobre os principais organismos não-alvo, Tabela 4 (19). Além disso, também deverá ser calculada a taxa de exposição à toxicidade (TER) para determinar se o risco para um determinado organismo é aceitável ou não. Neste sentido, as taxas de exposição à toxicidade resultantes são comparadas aos correspondentes níveis de teste. Uma taxa de exposição à toxicidade maior que o nível de teste é considerada risco negligenciável para os organismos não-alvo. Em geral, apenas é necessária uma avaliação detalhada do nível 1 de risco quando o TER é inferior a 100 (Tabela 4). Por sua vez é necessária uma avaliação do risco crónico no caso de o TER ser menor que 10. Se o TER for inferior a 5, o anexo VI da Diretiva da UE 91/414 CEE exige que nenhuma autorização seja concedida a menos que seja claramente estabelecida através de uma avaliação adequada e que em condições de campo nenhum impacto inaceitável ocorra após o uso do produto sob as condições de utilização propostas. Tabela 4: Os três níveis de teste para avaliar a toxicidade de pesticidas em organismos não-alvo. Espécies Nível 1 Toxicidade Aguda Nível 2 Testes de reprodução Nível 3 Testes de campo Aves (codornizes ou patoreal) LD 50 (8-14 dias) Estudo do ciclo de vida dos peixes Peixes de água doce (truta arco-íris ou peixinhos) LC 50 (96 h) Efeitos sobre a desova Invertebrados aquáticos (Dáfnia, camarão) LC 50 (48 h) Ciclo de vida completo Invertebrados não-alvo (abelha do mel) LD 50 (48 h) Efeitos de resíduos na folhagem Teste de campo para polinização Invertebrados não-alvo (minhocas) LC 50 (14 dias) Efeitos de resíduos na folhagem Plantas aquáticas (algas) LC 50 (96 h) Vigor da planta Outras espécies benéficas LD 50 (48 h) Capítulo 1 Introdução 20 O solo agrícola é normalmente o destinatário primário dos produtos fitofarmacêuticos utilizados, no entanto, os cursos de água e lençóis freáticos que estão adjacentes a áreas agrícolas são, na grande maioria dos casos, os destinatários finais dos resíduos de pesticidas (25). Por esta razão quando são abordados os potenciais efeitos adversos dos fitofármacos sobre o meio ambiente, as autoridades europeias exigem dados (antes da comercialização de produtos fitofarmacêuticos na Europa) relacionados com os riscos associados à exposição de organismos não-alvo terrestres e aquáticos a resíduos de pesticidas. Capítulo 1 Introdução 21 1.4. Métodos de análise de resíduos de pesticidas Os produtos fitofarmacêuticos têm ajudado as populações a cultivar alimentos em abundância e a eliminar inumeras pragas. Mas infelizmente, tal como referido anteriormente, estes produtos podem também ter diversos efeitos negativos, quer sobre o meio ambiente quer sobre os seres humanos. Assim a utilização de produtos fitofarmacêuticos deve ser cuidadosamente monitorizada e controlada de forma a maximizar os benefícios e minimizar os efeitos prejudicais. Para monitorizar o uso adequado de produtos fitofarmacêuticos, diversos métodos analíticos têm sido desenvolvidos de forma a detetar e quantificar níveis específicos de resíduos de pesticidas quer nos alimentos quer no meio ambiente (26). O número de resíduos de pesticidas a monitorizar de forma a garantir a proteção dos consumidores pode ser substancial, mesmo considerando apenas um produto agrícola específico. Isto deve-se ao facto dos agricultores escolherem diferentes produtos fitofarmacêuticos para controlar a enorme variedade de insetos, fungos ou ervas que atacam as suas culturas. Recomenda-se igualmente a rotação de princípio ativo como forma de reduzir a possibilidade de serem criadas resistências entre as pragas, aumentando assim o número de resíduos possivelmente encontrados. O registo dos produtos fitofarmacêuticos, tanto nos Estados Unidos da América como na UE (Regulamento (UE) nº 544/2011), implica a submissão de um método analítico validado para determinação da substância ativa (e os seus metabolitos farmacologicamente significativos) como ferramenta para a deteção e quantificação dos LMR em alimentos e rações. Estes métodos destinam-se a realizar a análise individual de um resíduo específico (ou de um grupo de compostos relacionados derivados deste) numa determinada cultura, uma vez que no momento do registo tem de ser atribuída uma aplicação particular consoante o género agrícola. Para a confirmação de resultados positivos, estes métodos tornam-se uteis como métodos de referência, por serem destinados a uma combinação específica pesticida/matriz e validados independentemente. Por estas razões os diferentes laboratórios frequentemente adotam um método multirresíduo, isto é, uma metodologia que pode ser utilizada na análise de uma ampla gama de resíduos de pesticidas. A análise multirresíduo em alimentos é um grande desafio devido ao elevado número e diversidade de resíduos, assim como, ao tipo de amostras. As propriedades físico-químicas das espécies a analisar condicionam as abordagens para o sucesso da extração, do processo de limpeza e da deteção. Um aspeto importante a ter em consideração, é a polaridade dos resíduos, que pode ser estimada através da Capítulo 1 Introdução 28 orgânicos, em que o CO 2 utilizado é relativamente pouco dispendioso, não inflamável e ambientalmente seguro (35). No entanto, embora a técnica de SFE seja muito seletiva para extrair, uma vez que extrai simultaneamente os pesticidas polares e não polares, é um processo mais moroso do que os métodos de extração com solvente, podendo ser muito afetada pelos efeitos de matriz e requerendo instrumentos dispendiosos (34). Extração líquida pressurizada (PLE) Outra das técnicas que aumenta a velocidade do processo de extração é a técnica de extração líquida pressurizada (PLE), em que são utilizados solventes orgânicos comuns, mas a pressões e temperaturas elevadas, uma vez que o solvente de extração tem de ser mantido na fase líquida (38). Esta técnica tem uma versão patenteada que dá pelo nome de Accelerated Solvent Extraction (ASE), trata-se de um sistema totalmente automatizado, que requer menores quantidades de solventes que as técnicas tradicionais, reduzindo o tempo de extração. Assim, um procedimento de extração que poderia levar várias horas num dispositivo de Soxhlet, pode ser realizado em alguns minutos e com uma amostra muito mais pequena (34). Após a sua introdução em 1995 teve uma rápida aceitação, tendo como maiores vantagens: o seu processo relativamente simples, rápido, eficiente e ambientalmente mais sustentável. Por outro lado, as condições de operação podem levar a uma menor seletividade, sendo necessário um processo de purificação posterior (38). Extração assistida por micro-ondas (MAE) Na extração assistida por micro-ondas (MAE) as amostras são extraídas com solventes orgânicos comuns e irradiadas com micro-ondas, aquecendo o solvente e a amostra, mas sem permitir a entrada em ebulição. A irradiação pode ser repetida várias vezes, de forma a obter um máximo de extração para os analitos (34). Assim, este método aumenta a taxa de transferência de massa dos compostos a analisar, da matriz da amostra, para o solvente de extração (36). No entanto, pode ocorrer redução da seletividade bem como a degradação de compostos termolábeis. Outras desvantagens residem no facto de apenas ser possível utilizar um recipiente de extração para cada amostra e é uma técnica de difícil automatização (35). Capítulo 1 Introdução 29 Dispersão de matriz em fase sólida (MSPD) Atualmente, as tendências apontam no sentido da utilização de quantidades cada vez menores de amostra, do aumento da seletividade e especificidade da extração, através de uma metodologia mais amiga do ambiente, isto é, em que se verifique um menor desperdício e a utilização de uma menor quantidade de solventes orgânicos. Outro parâmetro a ter em consideração é a possibilidade de automatização dos novos métodos de forma a reduzir a operação manual. Neste contexto, diferentes técnicas de microextração têm vindo a ser desenvolvidas, utilizando quantidades mínimas de solventes e menos etapas na preparação das amostras (13). A dispersão de matriz em fase sólida (MSPD) é outra técnica de extração alternativa que poderá ser aplicada para a extração de resíduos de pesticidas. Uma pequena quantidade de amostra é incorporada num composto sorvente (geralmente inerte como o C 18 ), e a purificação é efetuada ao mesmo tempo que a extração (39). Mas cada vez mais os materiais de suporte utilizados na MSPD são semelhantes aos utilizados na SPE. Assim, tem de se encontrar um bom compromisso entre os tamanhos de partícula e a necessidade de uma grande área de superfície para a dispersão da amostra, de forma a melhorar o contacto com o solvente, reduzindo os custos do suporte sólido e restrições de fluxo, ou mesmo entupimentos da coluna, quando utilizados tamanhos de partículas menores (38). Esta técnica tem algumas vantagens de conveniência sobre a abordagem convencional de extração da amostra, pois a conjugação dos passos de extração e purificação reduz o tempo de análise (40). Por outro lado, a quantidade muito pequena de amostra utilizada (0,1-2 g) embora vantajosa pode transformar-se num problema, pois é difícil obter uma amostra suficientemente representativa e homogénea de forma a auferir resultados consistentes. Microextração em fase sólida (SPME) Outro tipo de técnica de extração dos resíduos de pesticidas é a utilização de dispositivos de extração através da sorção dos compostos da amostra, sendo as formas comercialmente disponíveis para este tipo de extração a microextração em fase sólida (SPME) e extração sortiva em barra de agitação (SBSE). Numa outra variante destas técnicas, o revestimento está contido num tubo, semelhante a um pequeno pedaço de uma coluna capilar de cromatografia gasosa (35). Todas estas técnicas derivam da mesma abordagem, em que um material, tal como o polidimetilsiloxano (PDMS) entre outros, é revestido sobre uma fibra ou barra magnética, de forma a extrair os compostos Capítulo 1 Introdução 30 de interesse a partir de uma solução aquosa ou amostra gasosa (36, 41, 42). O tipo e a quantidade de resíduos de pesticidas que são extraídos para o revestimento dependem do coeficiente de partição (K ow ) do resíduo de pesticida, do volume do revestimento, do volume da amostra, do tempo, da temperatura, dos efeitos da matriz, do pH, da força iónica, da composição do solvente adicionado na extração, assim como, de fatores mecânicos. Quanto maior a afinidade do analito pela fase extratora em relação à matriz, maior será a quantidade de analito extraída (41, 43, 44). Esta técnica eliminou limitações e obstáculos encontrados nas técnicas convencionais, tais como a não utilização de solventes orgânicos, associada a grande purificação do extrato obtido e a simplicidade de manipulação. Assim, as vantagens gerais da técnica de SPME são (i) utilização de um dispositivo compacto; (ii) capacidade de análise de multirresíduos; (iii) operação simples; (iv) possibilidade de tempos de análise curtos; (v) extração seletiva bem como purificação simultânea com o processo de extração (vi) método robusto de injeção em cromatografia gasosa (isto é, os contaminantes não contactam com o liner, nem entram na coluna); (vii) possibilidade de automatização; (viii) análise quantitativa; (ix) baixo limites de deteção para alguns compostos, (x) eliminação de solventes orgânicos; (xi) baixo custo global por análise e (xii) utilização de uma pequena quantidade de amostra. As aplicações mais apropriadas da técnica de SPME relacionam-se com a análise qualitativa dos componentes voláteis de amostras gasosas. Por outro lado no caso da SBSE esta revela-se mais apropriada na análise de resíduos de pesticidas em amostras líquidas, principalmente água. Usualmente, as versões comerciais de SPME disponíveis são utilizadas com um amostrador automático e a injeção no cromatógrafo gasoso é realizada imediatamente após a extração. Ocorre uma extração seletiva dos compostos em associação com um processo de purificação, sendo apenas necessário selecionar os materiais que constituem a fase sólida. Um número reduzido de materiais de revestimento estão disponíveis no mercado e os dispositivos de SPME e SBSE não são suficientemente baratos para a sua eliminação após uma única utilização. Assim, as análises terão de ser efetuadas sequencialmente, isto é, uma nova análise só poderá ser efetuada após limpeza dos dispositivos e nova extração, sendo o ritmo de amostragem limitado pelos tempos de equilíbrio e análise. A sensibilidade de análise pode ser muito elevada (isto é, são alcançados limites de deteção muito baixos para pesticidas relativamente não polares que apresentem bom coeficiente de partição para a fase de revestimento), porém muitas vezes traduz-se no aumento dos tempos de equilíbrio, em que as análises podem durar horas para atingir esses limites (13). Capítulo 1 Introdução 31 Idealmente a extração dos resíduos de pesticidas deveria ser completa, instantânea e seletiva. A dificuldade reside no facto de os compostos apresentarem diferentes coeficientes de partição entre a matriz da amostra e a fase de revestimento da fibra. Os componentes da matriz usualmente afetam esta interação no processo de equilíbrio e condicionam os resultados. Também, o meio líquido em que é possível efetuar esta extração não pode conter uma elevada percentagem de solvente orgânico, uma vez que os compostos de interesse não serão adsorvidos pela fibra devido ao seu coeficiente de partição. Diferentes parâmetros têm de ser tomados em consideração como temperatura, fase aquosa e orgânica, volumes, tempo, e tratamentos da amostra (como por exemplo adição de cloreto de sódio) que podem aumentar a recuperação e o processo de equilíbrio. Extração por QuEChERS Ainda dentro das técnicas de extração, a constante busca e necessidade de uma forma simples e rápida de um método multirresíduo eficaz, capaz de fornecer alta qualidade aos resultados analíticos, levou a que Anastassiades et al. (32) desenvolve-se um novo método de tratamento e extração da amostra. O acrónimo QuEChERS refere-se a "Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe", é uma técnica de preparação da amostra que implica extração por solvente como o acetonitrilo, ou outros solventes orgânicos, seguida de uma partição com sulfato de magnésio ou em combinação com outros sais, geralmente NaCl. Após esta extração inicial segue-se um passo de limpeza usando extração em fase sólida dispersiva (d-SPE), isto é, são adicionadas pequenas quantidades de diferentes fases sólidas ao extrato. O sorvente mais utilizado no d-SPE é a amina primária e secundária (PSA), enquanto outros, tais como C 18 , OASIS HLB, carvão ativado ou Florisil também podem ser usados. Após o processo de limpeza, o extrato é centrifugado e o sobrenadante pode ser diretamente analisado ou, se for necessário, pode ser concentrado (32). Esta técnica tem atraído a atenção de laboratórios de pesticidas em todo o mundo, sendo neste momento a metodologia de extração mais regularmente empregue na análise multirresíduo de pesticidas em frutas e vegetais (45). Ao método original a partir da publicação de 2003 (32), foram efetuadas ligeiras modificações, normalmente de acordo com as preferências pessoais de cada analista ou na tentativa de favorecer a extração de um certo tipo de resíduos em relação a outros, isto é, o método pode ser modificado dependendo do tipo de amostra e dos analitos alvo. Quando foram conduzidas diferentes experiências de validação para centenas de Capítulo 1 Introdução 32 pesticidas em diferentes géneros alimentares, foi descoberto que havia cerca de 10 pesticidas que mostraram dependência do pH nas recuperações, consoante a matriz em uso (46). O tamponamento a pH=5 foi o melhor compromisso para alcançar recuperações aceitáveis para estes pesticidas dependentes do pH (33, 47). A adição de C 18 juntamente com a PSA, no passo d-SPE ajuda a melhorar a limpeza de algumas amostras, em especial aquelas que contêm lípidos, tais como o azeite, embora a congelação também precipite componentes da matriz que possuem solubilidade limitada em extratos QuEChERS. O C 18 na d-SPE é mais rápida e mais fácil. A redução da quantidade de carotenoides e clorofila extraída juntamente nos extratos também pode ser minimizada através da adição de uma pequena quantidade de carvão ativado (GCB), mas neste caso poderá ocorrer uma redução na recuperação de alguns pesticidas com estrutura planar (46). Atualmente existem três métodos de QuEChERS muito populares, sendo o primeiro e designado de original, o método do QuEChERS apresentado em 2003 (32). Depois existem duas tentativas de normalização de método de QuEChERS, através do Oficial Method AOAC 2007.01 (47), e o método CEN Standard Method EN 15662. Depois destas três versões existem dezenas de diferentes modificações, pois o método é extremamente flexível e robusto no sentido em que com pequenas modificações continuam a obter-se elevadas recuperações, para centenas de resíduos pesticidas numa grande variedade de produtos alimentares (46). A grande desvantagem deste método reside nos fatores de enriquecimento que são baixos, e a menos que sejam utilizados detetores cromatográficos sensíveis, é necessário realizar um passo de concentração da amostra. Técnicas de microextração líquido-líquido Retomando a LLE, tem-se tentado atualmente efetuar diversos melhoramentos de forma a contornar algumas das desvantagens descritas anteriormente. A miniaturização deste tipo de técnica levou a uma redução drástica do volume da fase extratora. Baseadas nestas premissas três novas técnicas foram criadas, isto é, a microextração em gota suspensa (“Single drop microextraction” - SDME), microextração em fase líquida com fibra oca (“Hollow fiber liquid-phase microextraction” – HF-LPME) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME), podendo estas técnicas de microextração ser nomeadas de forma muito diferente (48). A SDME é uma técnica de preparação de amostra simples, de baixo custo, rápida e virtualmente livre de solventes, baseada na grande redução da razão solvente de Capítulo 1 Introdução 33 extração/volume de amostra. Não é uma técnica de extração exaustiva, isto é, apenas uma pequena quantidade dos analitos são extraídos ou pré-concentrados para a análise. Consiste numa técnica de pré-concentração baseada na utilização de uma pequena gota de solvente orgânico, normalmente suportada numa seringa, não solúvel com a água, que é exposta à solução da amostra. Esta exposição tem três formas distintas de acontecer: uma quando é diretamente imersa na solução; outra quando esta gota é apenas colocada no espaço acima da solução sem contacto com a mesma (chamado “headspace”) de forma a extrair compostos voláteis ou semi-voláteis; e quando é utilizado um outro solvente menos denso que a água e a gota é apenas imersa nesse solvente de forma a realizar a extração (49). A principal desvantagem da SDME é a instabilidade da gota em situações de elevada agitação ou temperatura, especialmente quando as amostras apresentam muitos compostos interferentes sólidos, e por outro lado, não podem ser utilizados solventes com solubilidade relativamente alta em água e com baixo ponto de ebulição, devido à sua elevada taxa de dissolução ou evaporação (48). No caso da HF-LPME é utilizado um modo de amostragem em duas fases, em que uma fibra oca hidrofóbica é utilizada para proteger e expor um certo volume de solvente de extração à amostra. O processo de extração ocorre nos poros da fibra oca, onde o solvente foi imobilizado (50). A fibra oca, normalmente, é formada de polipropileno e suportada por uma seringa. O solvente de extração deve ter uma polaridade semelhante ao da fibra oca para ser facilmente imobilizado dentro dos poros. Em geral, a eficiência de extração obtida com HF-LPME é maior do que com SDME, uma vez que as fibras ocas hidrofóbicas permitem o uso de uma velocidade de agitação maior, a fim de acelerar a cinética de extração. Além disso, a área de contacto entre a amostra aquosa e a fase de extração é maior do que no caso de SDME, favorecendo a taxa de transferência de massa. A utilização da fibra oca fornece proteção à fase extrativa e, portanto, a análise das amostras sujas, é viável. Além disso, o reduzido tamanho de poro permite a microfiltração da amostra, produzindo assim extratos muito limpos (49). No caso do DLLME é baseado na formação de suspensão nublosa formada quando uma mistura apropriada de um solvente de extração e um solvente de dispersão são rapidamente injetados numa solução aquosa (51). Esta técnica simples e rápida foi introduzida por Rezaee et. al (52) e é baseada num solvente de extração apropriado, isto é, uma pequena quantidade de um solvente orgânico com alta densidade, tal como o tetracloreto de carbono, o clorofórmio, o dissulfureto de carbono, o nitrobenzeno, o bromobenzeno, o clorobenzeno, ou o 1,2- Capítulo 1 Introdução 34 diclorobenzeno, e um solvente dispersante com miscibilidade elevada, tanto em fase de extração quanto na fase aquosa, tal como o metanol, o etanol, o acetonitrilo ou a acetona. Quando a mistura entre a fase de extração e o dispersor é rapidamente injetada na amostra com uma elevada turbulência, este regime turbulento dá origem à formação de pequenas gotículas, que são dispersas em toda a amostra aquosa. Após a formação da solução turva, a área de superfície entre o solvente de extração e a amostra aquosa é muito grande, de modo que o estado de equilíbrio é conseguido de forma rápida e, por conseguinte, o tempo de extração é muito curto. Na verdade, esta é a principal vantagem do DLLME. Depois de centrifugar a solução turva, a fase sedimentada na parte inferior de um tubo cónico é recuperada e utilizada na deteção analítica mais apropriada. Em DLLME, ao contrário do SDME, a seringa não é utilizada como suporte de gota durante o processo de extração, mas é utilizada na recolha e injeção do extrato, evitando assim problemas, tais como o deslocamento da gota (51). No entanto, esta técnica é limitada a um pequeno número de solventes de extração, que podem extrair eficientemente os analitos de interesse uma vez que têm de ser asseguradas as seguintes condições: ter uma maior densidade do que a água, a formação de uma solução turva e estável, e ser facilmente removido do fundo do frasco cónico após centrifugação. Poucos solventes conseguem atender a estas condições. Além disso, esta técnica de microextração é difícil de automatizar e a sua aplicabilidade a amostras alimentares é limitada (48). As gotículas emulsionadas têm uma grande área interfacial com a amostra. A dispersão líquido-líquido desempenha um papel essencial em processos de separação e sistemas de reação. Isto porque a grande área interfacial devido à dispersão facilita a transferência de massa e velocidade de reação (51). Normalmente nas técnicas miniaturizadas da extração com solvente são utilizados solventes orgânicos, mas nos anos mais recentes começaram também a aplicar-se diferentes líquidos iónicos, de forma a reduzir ainda mais os solventes orgânicos clássicos (49). Capítulo 1 Introdução 35 1.4.2.2. Purificação (CleanUp) e concentração da amostra A maioria dos extratos brutos iniciais das amostras exigem purificação antes da análise, com o objetivo de reduzir os compostos interferentes da matriz e enriquecer a concentração dos resíduos de pesticidas no extrato obtido. Este é constituído por uma mistura complexa do solvente orgânico, água, nutrientes (tais como, lípidos, açúcares, aminoácidos e proteínas), e metabolitos secundários (ácidos orgânicos, alcalóides, terpenóides, etc.) em concentrações elevadas comparativamente às quantidades muito pequenas dos resíduos de pesticidas. Isolar e detetar resíduos de pesticidas quando estes se encontram na presença de níveis elevados de produtos químicos que interferem com a sua deteção é um desafio, pois estes promovem um efeito vulgarmente designado por interferência de matriz. Idealmente, o método de extração atinge os 100% de recuperação dos resíduos de interesse e não contem quaisquer compostos interferentes da matriz a analisar mas, na prática, esta condição não se verifica na maioria das vezes (13). A robustez do sistema analítico é também fundamental para a análise inequívoca dos diferentes compostos, isto é, a separação cromatográfica dos compostos desejados em relação aos elementos da matriz, leva a uma não interferência direta na sua deteção. Embora seja efetuada esta separação por parte dos sistemas cromatográficos, verifica-se frequentemente que os compostos de matriz causam indiretamente a supressão ou aumento do sinal analítico, ou então levam a uma maior necessidade de manutenção do instrumento. Em geral os métodos multirresíduo requerem uma ou mais técnicas de purificação. Normalmente, quanto maior for o número de etapas de limpeza incluídas, maiores são as perdas dos compostos a analisar e mais tempo é despendido na realização da análise. Diferentes abordagens para a limpeza de extrato podem ser utilizadas, nomeadamente processos de separação com base: (i) no tamanho das moléculas (cromatografia de permeação em gel (GPC) ou filtração por membranas), (ii) na volatilidade (destilação), (iii) nas propriedades eletroquímicas (diálise ou troca iónica), (iv) na solubilidade (precipitação) ou (v) na partição líquido-líquido ou sólido-líquido. A utilização de técnicas de GPC é um procedimento adequado para remoção dos extratos de moléculas grandes, evitando a acumulação de compostos não voláteis nos instrumentos analíticos, melhorando assim a robustez do método (42). No entanto, a GPC é um método demorado, com elevados gastos de solvente e procedimentos relativamente dispendiosos. A extração de amostras com elevado teor de gordura requer frequentemente a GPC para remover lípidos extraídos juntamente com os compostos a analisar. Após a utilização de GPC os extratos precisam de ser concentrados antes de serem injetados no equipamento (muitas vezes através de uma partição líquido-líquido Capítulo 1 Introdução 36 com um solvente apropriado, como o acetato de etilo) e reconcentrados novamente após a recolha da fração contendo os pesticidas. Esta técnica funciona bem e melhora a robustez da análise, no entanto, quando os compostos interferentes têm um peso molecular semelhante aos compostos a analisar não permite efetuar a sua remoção. Frequentemente realiza-se GPC em combinação com outros procedimentos de limpeza, tais como a partição líquido-líquido ou sólido-líquido (13). A partição líquido-líquido é comumente utilizada para a purificação de resíduos de pesticidas em alimentos com elevado teor de humidade, quando se utiliza um solvente miscível em água para a extração. Nestes casos, geralmente, a primeira medida tomada é a remoção da maior parte da água presente no extrato, de forma a concentrar os resíduos de pesticidas. Uma grande quantidade de água pode ser removida através da partição entre o solvente orgânico e a adição de diferentes sais à fase aquosa, o que leva a uma melhor separação de fases (26). A utilização de acetona nos extratos aquosos iniciais, requer a partição com um solvente como o diclorometano, o éter de petróleo, ou acetato de etilo/ciclohexano, esta combinação de solventes resulta numa separação de fases, em que as interferências mais polares ficam na fase aquosa (alguns pesticidas polares também se perdem nesta fase), no entanto, a adição de sais e o controlo do pH do sistema ajuda a promover a partição dos resíduos de pesticidas para a fase orgânica. No caso da extração com acetonitrilo, a utilização de sal por si só é suficiente para induzir esta separação de fase aquosa e fase orgânica, não sendo necessário a adição de um solvente apolar. No método de QuEChERS, o sulfato de magnésio anidro é considerado um sal com características excelentes para induzir partição líquido-líquido entre o acetonitrilo e a água e permitir elevadas percentagens de recuperações para os pesticidas polares. A sua combinação com cloreto de sódio serve para modificar a partição dos compostos de modo que os açúcares permaneçam na camada aquosa (32). Outra vantagem do acetonitrilo é que este não é miscível com solventes orgânicos de cadeia longa, como os alcanos. Assim, a partição líquido-líquido pode ser realizada com solventes, tais como hexano ou iso-octano para ajudar a remover lípidos que também tenham sido extraídos (neste caso, os pesticidas apolares tenderão também a passar para o solvente apolar). As técnicas anteriormente referidas são eficazes na remoção de grandes quantidades de água, podendo os vestígios de água remanescentes ser removidos pela adição de sais desidratados higroscópicos (por exemplo, Na 2 SO 4 anidro) à fase orgânica do extrato (26). Nos métodos analíticos baseados em SPE é possível remover diferentes constituintes das plantas (tais como lípidos, ceras, pigmentos e alguns metabolitos secundários) Capítulo 1 Introdução 37 através da passagem do extrato pelo material de enchimento do SPE (34). Dependendo do material utilizado, esta pode ser uma forma eficiente de remover os interferentes altamente apolares. Com uma mistura de solventes adequada são eluídos os resíduos de pesticidas e os interferentes apolares ficam retidos nas colunas. A remoção destes interferentes apolares numa fase inicial de purificação permite uma melhor manipulação da amostra nas fases posteriores. Por exemplo, alguns destes compostos podem precipitar durante a concentração da amostra, afetando a percentagem de recuperação dos resíduos de pesticidas (37, 53). Como referido anteriormente, os resíduos de pesticidas encontram-se nas amostras geralmente em concentrações muito baixas, verificando-se a necessidade de concentrar os extratos, em 100 ou mais vezes, para uma melhor deteção e quantificação. Várias técnicas de concentração podem ser utilizadas, mas as mais usuais são o recurso a evaporadores rotativos ou evaporação através de uma corrente de gás (normalmente azoto). Os evaporadores rotativos são eficazes na remoção dos diferentes solventes orgânicos, encontrando-se já disponíveis no mercado dispositivos que têm em consideração os pesticidas termolábeis e altamente voláteis. A concentração da amostra através do ligeiro aquecimento do extrato sob uma leve corrente de gás (ar ou azoto) também é uma forma eficiente e de baixo custo para atingir a concentração desejada. Os métodos de purificação de extratos de amostras alimentares têm então o intuito de reduzir um fenómeno adverso designado efeito de matriz, que é causado pela presença inevitável de componentes da matriz que são extraídos juntamente com os resíduos de pesticidas. Quando a análise dos resíduos é efetuada em cromatografia gasosa (GC), estes efeitos podem ter impacto em todos os passos da análise (injeção, separação e deteção) levando a uma quantificação imprecisa, diminuição da detetabilidade dos resíduos, redução da robustez do método, podendo mesmo levar à obtenção de falsos resultados, quer positivos quer negativos (54, 55). Os efeitos de matriz ocorrem durante a introdução da amostra no GC, verificando-se uma degradação ou adsorção dos compostos, fenómeno designado por “aumento da resposta cromatográfica por indução da matriz” (ou em inglês “matrix-induced response enhancement”). Quando um extrato é introduzido no sistema cromatográfico, os diferentes componentes da matriz tendem a preencher (ou bloquear) determinados sítios ativos do liner de injeção e da coluna, reduzindo assim as perdas de analitos suscetíveis a ligações irreversíveis de adsorção ou degradação. Este fenómeno resulta numa maior transferência destes compostos para a coluna de GC e, consequentemente, os seus sinais analíticos sofrem um incremento em comparação com a injeção de soluções orgânicas puras dos mesmos compostos. Se as soluções padrão dos resíduos de Capítulo 1 Introdução 44 ervas frescas, sendo o tomate um dos elementos representativos dos frutos e hortícolas/cucurbitáceas. Capítulo 1 Introdução 45 1.4.5. Resíduos de pesticidas em amostras ambientais O uso de fitofármacos em todo o mundo aumentou nas últimas décadas, coincidindo com as mudanças nas práticas agrícolas e com a produção intensiva. Este uso generalizado, resultou na presença de resíduos de pesticidas em várias matrizes ambientais. Os programas de monitorização ambiental são essenciais para a elaboração de descrições extensivas das concentrações de resíduos de pesticidas atuais, tendências, emissões e fluxos, de forma a controlar o cumprimento das normas e parâmetros de qualidade. Além disso, a monitorização ambiental fornece uma base viável para a adoção de medidas, estratégias e políticas eficazes com vista à resolução de problemas ambientais à escala local, regional ou global. A seleção dos pesticidas para monitorização ambiental depende da natureza dos pesticidas e dos objetivos do estudo da monitorização. Estas pesquisas centram-se nos resíduos de pesticidas mais utilizados, quer na área agrícola próxima dos locais estudados quer os resíduos de maior interesse para o país em causa. Esta seleção também tem de ter em conta as diferentes propriedades dos compostos. O meio ambiente não é um sistema simples e, consequentemente, a monitorização de resíduos de pesticidas em qualquer matriz ambiental é sempre desafiadora, pois podem ocorrer em qualquer uma das suas fases (sólida, líquida ou gasosa). As principais matrizes ambientais analisadas para a pesquisa de resíduos pesticidas incluem a água, o solo, os sedimentos, ou o ar. No entanto, cada uma destas matrizes primárias inclui muitos tipos de amostras diferentes. Os sistemas aquáticos são veículos importantíssimos para a dispersão ambiental destes poluentes e, neste sentido, a sua importância como matriz a monitorizar deverá ser considerada. A contaminação da água aparece geralmente relacionada com risco associado a dois cenários diferentes: no primeiro caso, associado à ingestão de água por parte de seres humanos e animais e, no segundo caso, relacionada com os efeitos ecotoxicológicos quando organismos não-alvo (por exemplo organismos aquáticos e anfíbios) estão expostos a resíduos presentes na água nos seus habitats. Por todo o mundo foram adotados limites e legislação referente à presença dos pesticidas na água. No caso da UE, a legislação estabelece os valores paramétricos de pesticidas na água de 0,1 µg/L para um único pesticida, e 0,5 µg/L para o somatório de todos os resíduos de pesticidas encontrados, através da Diretiva 98/83/CE e DL 306/2007. Um método completo para análise de pesticidas na água, como para outras matrizes, inclui sempre a preparação e purificação da amostra e um método de deteção dos analitos. A necessidade de atingir níveis de deteção de resíduos de pesticidas em Capítulo 1 Introdução 46 quantidades vestigiais, como os referidos anteriormente, significa que uma amostra de água deve ser concentrada, de modo a que o extrato da amostra final possa fornecer a sensibilidade adequada para deteção. Capítulo 1 Introdução 47 1.5. Referências 1. Foley JA, DeFries R, Asner GP, Barford C, Bonan G, Carpenter SR, et al. Global consequences of land use. Science. 2005;309(5734):570-4. 2. Matson PA, Parton WJ, Power AG, Swift MJ. Agricultural intensification and ecosystem properties. Science. 1997;277(5325):504-9. Epub 1997/07/25. 3. Nollet LML, Rathore HS. Handbook of Pesticides: Methods of Pesticide Residues Analysis. Boca Raton, FL: CRC Press; 2010. 4. Pimentel D. Encyclopedia of Pest Management. Boca Raton, FL: CRC Press; 2002. 5. Frank R, Braun HE, Ishida K, Suda P. Persistent Organic and Inorganic PesticideResidues in Orchard Soils and Vineyards of Southern Ontario. Can J Soil Sci. 1976;56(4):463-84. 6. Seiber JN, Kleinschmidt LA. Contributions of pesticide residue chemistry to improving food and environmental safety: past and present accomplishments and future challenges. J Agric Food Chem. 2011;59(14):7536-43. 7. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). International Code of Conduct on the Distribution and Use of Pesticides. 2002; Disponível em: http://www.fao.org/WAICENT/FAOINFO/AGRICULT/AGP/AGPP/Pesticid/Code/Download/ code.pdf [Acedido em 2012]. 8. Tadeo JL. Analysis of Pesticides in Food and Environmental Samples. Boca Raton, FL: CRC Press; 2007. 9. Jørgen S. Chemical pesticides: mode of action and toxicology. Boca Raton. FL: CRC Press; 2004. 10. European Corp Protection Association (ECPA). Annual ECPA crop protection statistical review published online. 2010; Disponível em: http://www.ecpa.eu/informationpage/industry-statistics-ecpa-total [Acedido em 2012]. 11. US Environmental Protection Agency (EPA). 2006-2007 Pesticide Market Estimates: Sales. 2007. Disponível em: http://www.epa.gov/pesticides/pestsales/07pestsales/sales2007.htm [Acedido em 2012]. 12. Cooper J, Dobson H. The benefits of pesticides to mankind and the environment. Crop Prot. 2007;26(9):1337-48. Capítulo 1 Introdução 48 13. Ötleş S. Methods of Analysis of Food Components and Additives. Boca Raton. FL: CRC Press; 2012. 14. Arias-Estevez M, Lopez-Periago E, Martinez-Carballo E, Simal-Gandara J, Mejuto JC, Garcia-Rio L. The mobility and degradation of pesticides in soils and the pollution of groundwater resources. Agr Ecosyst Environ. 2008;123(4):247-60. 15. Fenik J, Tankiewicz M, Biziuk M. Properties and determination of pesticides in fruits and vegetables. Trac-Trend Anal Chem. 2011;30(6):814-26. 16. Joshi SC, Sharma P. Male reproductive toxicity of organophosphorous compounds: a review. Toxicol Environ Chem. 2011;93(7):1486-507. 17. Frye CA, Bo E, Calamandrei G, Calza L, Dessi-Fulgheri F, Fernandez M, et al. Endocrine Disrupters: A Review of Some Sources, Effects, and Mechanisms of Actions on Behaviour and Neuroendocrine Systems. J Neuroendocrinol. 2012;24(1):144-59. 18. Mnif W, Hassine AIH, Bouaziz A, Bartegi A, Thomas O, Roig B. Effect of Endocrine Disruptor Pesticides: A Review. Int J Env Res Pub He. 2011;8(6):2265-303. 19. Damalas CA, Eleftherohorinos IG. Pesticide Exposure, Safety Issues, and Risk Assessment Indicators. Int J Env Res Pub He. 2011;8(5):1402-19. 20. Organização Mundial de Saúde (OMS). International Code of Conduct on the Distribution and Use of Pesticides: Guidelines for the Registration of Pesticides. 2010; Disponível em: http://whqlibdoc.who.int/hq/2010/WHO_HTM_NTD_WHOPES_2010.7_eng.pdf [Acedido em 2012]. 21. Lozowicka B, Jankowska M, Kaczynski P. Pesticide residues in Brassica vegetables and exposure assessment of consumers. Food Control. 2012;25(2):561-75. 22. European Food Safety Authority (EFSA). The 2009 European Union Report on Pesticide Residues in Food. 2011; Disponível em: http://www.efsa.europa.eu/de/efsajournal/pub/2430.htm [Acedido em 2012]. 23. Comissão Europeia. Regulamento (UE) nº 544/2011 da Comissão que dá execução ao Regulamento (CE) nº 1107/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho no que diz respeito aos requisitos em matéria de dados aplicáveis às substâncias activas. Jornal Oficial da União Europeia. Série L, nº 155, 1-66. 24. Parlamento Europeu e o Conselho da Uniâo Europeia. Regulamento (CE) nº 396/2005 do Parlamento Eurpeu e do Conselho relativo aos limites máximos de resíduos de pesticidas no interior e à superfície dos géneros alimentícios e dos alimentos para Capítulo 1 Introdução 49 animais, de origem vegetal ou animal. Jornal Oficial da União Europeia. Série L, nº 70, 116. 25. Poissant L, Beauvais C, Lafrance P, Deblois C. Pesticides in fluvial wetlands catchments under intensive agricultural activities. Sci Total Environ. 2008;404(1):182-95. 26. Wheeler WB. Pesticides in Agriculture and the Environment. New York: Marcel Dekker, Inc.; 2002. 27. Ambrus A. Estimation of sampling uncertainty for determination of pesticide residues in plant commodities. J Environ Sci Heal B. 2009;44(7):627-39. 28. Comissão das Comunidades Europeias. Diretiva 2002/63/CE estabelece métodos de amostragem comunitários para o controlo oficial de resíduos de pesticidas no interior e à superfície de produtos de origem vegetal ou animal, Jornal Oficial da União Europeia. Série L, nº 187, 30-43. 29. Ni HG, Zeng H, Zeng EY. Sampling and analytical framework for routine environmental monitoring of organic pollutants. Trac-Trend Anal Chem. 2011;30(10):1549-59. 30. Torres CM, Pico Y, Manes J. Determination of pesticide residues in fruit and vegetables. J Chromatogr A. 1996;754(1-2):301-31. 31. Mastovska K, Dorweiler KJ, Lehotay SJ, Wegscheid JS, Szpylka KA. Pesticide multiresidue analysis in cereal grains using modified QuEChERS method combined with automated direct sample introduction GC-TOFMS and UPLC-MS/MS techniques. J Agric Food Chem. 2010;58(10):5959-72. 32. Anastassiades M, Lehotay SJ, Stajnbaher D, Schenck FJ. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solidphase extraction" for the determination of pesticide residues in produce. J AOAC Int.. 2003;86(2):412-31. 33. Lehotay SJ, Mastovska K, Yun SJ. Evaluation of two fast and easy methods for pesticide residue analysis in fatty food matrixes. J AOAC Int. 2005;88(2):630-8. 34. Ahmed FE. Analyses of pesticides and their metabolites in foods and drinks. TracTrend Anal Chem. 2001;20(11):649-61. 35. Ridgway K, Lalljie SP, Smith RM. Sample preparation techniques for the determination of trace residues and contaminants in foods. J Chromatogr A. 2007;1153(12):36-53. Capítulo 1 Introdução 50 36. Smith RM. Before the injection - modern methods of sample preparation for separation techniques. J Chromatogr A. 2003;1000(1-2):3-27. 37. Pico Y, Fernandez M, Ruiz MJ, Font G. Current trends in solid-phase-based extraction techniques for the determination of pesticides in food and environment. J Biochem Bioph Meth. 2007;70(2):117-31. 38. Ramos L. Critical overview of selected contemporary sample preparation techniques. J Chromatogr A. 2012;1221:84-98. 39. Bogialli S, Di Corcia A. Matrix solid-phase dispersion as a valuable tool for extracting contaminants from foodstuffs. J Biochem Bioph Meth. 2007;70(2):163-79. 40. Barker SA. Matrix solid phase dispersion (MSPD). J Biochem Bioph Meth. 2007;70(2):151-62. 41. Ouyang G, Pawliszyn J. A critical review in calibration methods for solid-phase microextraction. Anal Chim Acta. 2008;627(2):184-97. 42. Fidalgo-Used N, Blanco-Gonzalez E, Sanz-Medel A. Sample handling strategies for the determination of persistent trace organic contaminants from biota samples. Anal Chim Acta. 2007;590(1):1-16. 43. Ouyang G, Pawliszyn J. SPME in environmental analysis. Anal Bioanal Chem. 2006;386(4):1059-73. 44. Aulakh JS, Malik AK, V K, Schmitt-Kopplin P. A review on solid phase micro extraction-high performance liquid chromatography (SPME-HPLC) analysis of pesticides. Crit Rev Anal Chem. 2005;35(1):71-85. 45. Nunez O, Gallart-Ayala H, Martins CP, Lucci P. New trends in fast liquid chromatography for food and environmental analysis. J Chromatogr A. 2012;1228:298323. 46. Lehotay SJ, Son KA, Kwon H, Koesukwiwat U, Fu W, Mastovska K, et al. Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables. J Chromatogr A. 2010;1217(16):2548-60. 47. Lehotay SJ. Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate: collaborative study. J AOAC Int. 2007;90(2):485520. 48. Pena-Pereira F, Lavilla I, Bendicho C. Miniaturized preconcentration methods based on liquid-liquid extraction and their application in inorganic ultratrace analysis and speciation: A review. Spectrochim Acta B. 2009;64(1):1-15. Capítulo 1 Introdução 51 49. Asensio-Ramos M, Ravelo-Perez LM, Gonzalez-Curbelo MA, Hernandez-Borges J. Liquid phase microextraction applications in food analysis. J Chromatogr A. 2011;1218(42):7415-37. 50. Sarafraz-Yazdi A, Amiri A. Liquid-phase microextraction. Trac-Trend Anal Chem. 2010;29(1):1-14. 51. Rezaee M, Yamini Y, Faraji M. Evolution of dispersive liquid-liquid microextraction method. J Chromatogr A. 2010;1217(16):2342-57. 52. Rezaee M, Assadi Y, Hosseinia MRM, Aghaee E, Ahmadi F, Berijani S. Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction. J Chromatogr A. 2006;1116(1-2):1-9. 53. Schenck FJ, Lehotay SJ. Does further clean-up reduce the matrix enhancement effect in gas chromatographic analysis of pesticide residues in food? J Chromatogr A. 2000;868(1):51-61. 54. Hajslova J, Zrostlikova J. Matrix effects in (ultra)trace analysis of pesticide residues in food and biotic matrices. J Chromatogr A. 2003;1000(1-2):181-97. 55. Menkissoglu-Spiroudi U, Fotopoulou A. Matrix effect in gas chromatographic determination of insecticides and fungicides in vegetables. Int J Environ an Ch. 2004;84(1-3):15-27. 56. Poole CF. Matrix-induced response enhancement in pesticide residue analysis by gas chromatography. J Chromatogr A. 2007;1158(1-2):241-50. 57. Zrostikova J, Hajslova J, Godula M, Mastovska K. Performance of programmed temperature vaporizer, pulsed splitless and on-column injection techniques in analysis of pesticide residues in plant matrices. J Chromatogr A. 2001;937(1-2):73-86. 58. Beyer A, Biziuk M. Methods for Determining Pesticides and Polychlorinated Biphenyls in Food Samples-Problems and Challenges. Crit Rev Food Sci. 2008;48(10):888-904. 59. Ravelo-Perez LM, Hernandez-Borges J, Rodriguez-Delgado MA. Pesticides analysis by liquid chromatography and capillary electrophoresis. J Sep Sci. 2006;29(17):2557-77. 60. Torres CM, Pico Y, Manes J. Determination of pesticide residues in fruit and vegetables. J Chromatogr A. 1996;754(1-2):301-31. Capítulo 1 Introdução 52 61. Soler C, Manes J, Pico Y. The role of the liquid chromatography-mass spectrometry in pesticide residue determination in food. Crit Rev Anal Chem. 2008;38(2):93-117. 62. Malik AK, Blasco C, Pico Y. Liquid chromatography-mass spectrometry in food safety. J Chromatogr A. 2010;1217(25):4018-40. 63. Directorate General for Health & Consumers - European Commission (SANCO). SANCO/12495/2011-Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. 2011. Disponível em: http://www.crlpesticides.eu/library/docs/allcrl/AqcGuidance_Sanco_12495_2011_upload2.pdf [Acedido em 2012]. PARTE II Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 60 Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 61 Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 62 Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 63 Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 64 Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 65 Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 66 Capítulo 2 Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes 67 Capítulo 3 Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode Array method for multiple pesticide screening in lettuce Capítulo 3 Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode Array method for multiple pesticide screening in lettuce 76 Capítulo 3 Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode Array method for multiple pesticide screening in lettuce 77 Capítulo 3 Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode Array method for multiple pesticide screening in lettuce 78 Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 81 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography Armindo Melo a , Catarina Mansilha b,c , Olívia Pinho a,d , Isabel M.P.L.V.O. Ferreira a * a REQUIMTE/ Departamento de Química, Laboratório de Bromatologia e Hidrologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, R. Jorge Viterbo Ferreira 228, 4050313Porto, Portugal. b Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Rua Alexandre Herculano n.º 321, 4000055 Porto, Portugal. c REQIMTE/Universidade do Porto, Portugal. d Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto, Rua Dr. Roberto Frias, 4200-465 Porto, Portugal. * Corresponding author: email: isabel.f[email protected]; Telef: +351220428642; Fax: +351226093390 Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 82 Abstract A new sample preparation procedure combining QuEChERS and dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) was optimized for the determination at trace levels of thirteen pesticides from different chemical families (i.e. 2,4-D, acetamiprid, bentazone, cymoxanil, deltamethrin, dicamba, diuron, foramsulfuron, mesotrione, metalaxyl-M, methomyl, pyraclostrobin and tembotrione) in tomato by HPLC with diode array detection (DAD). Target pesticides from tomato samples were isolated by liquid partioning with acetonitrile and salts and cleanup by d-SPE, the analytes were concentrated in chloroform by the DLLME procedure. The disperser solvent from DLLME was used at the same time as carrier of analytes form extraction in QuEChERS method. The main factors affecting sample cleanup by d-SPE in QuEChERS and DLLME yield were optimized by means of an experimental design. Under the optimum conditions, good linearity was obtained, the recoveries of pesticides in tomato samples at spiking levels between 0.01 and 1.00 mg/kg ranged from 85.7-115.6 % (for methomyl and cymoxanil, respectively). Precision was within 15.0% (RSD) except at the LQ for tembotrione, which was 17.4%. Limits of quantification achieved (ranging from 0.0093 to 0.149 mg/kg) were below the maximum residue limits established by the European Union (EU). Keywords: Pesticides, tomato, QuEChERS, DLLME, HPLC-DAD, experimental design Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 83 Introduction The presence of pesticide residues in horticultural products is of concern to human health. European Union and Codex Alimentarius established maximum residues levels (MRLs) to regulate pesticides levels in fruits and vegetables, to ensure consumer safety and regulation of foreign trade (European Commission 2005). Tomato is a typical representative commodity of the category fruiting vegetables (with high water content) (Directorate General Health and Consumer Protection 2009). Consequently, search for pesticide residue in this type of vegetable is of major concern. Development of analytical methods for analyses of pesticides in fruiting vegetables, such as tomato, is difficult due to the fact that compounds of different polarities, solubility’s, volatilities and pKa values have to be simultaneously extracted and analysed (Štajnbaher and Zupančič-Kralj 2003; Ravelo-Pérez et al. 2009). The analytes present diverse properties and polar pesticides are particularly challenging to analyse (e.g. methomyl, acetamiprid, dicamba, cymoxanil, foransufulron, mesotrione, bentazone, 2,4-D). Additionally, the matrix presents a very complex composition and potential interferences can be co-extracted. QuEChERS sample preparation method stands for “quick, easy, cheap, effective, rugged and safe”. The novelty of this extraction procedure, introduced by Anastassiades et al. 2003 for the multiresidue analysis of pesticides in fruits and vegetables was the use of MgSO 4 for salting out extractioning/partioning and dispersive solid-phase extraction (dSPE) for cleanup. This became an AOAC International Official Method 2007.01 and CEN standard method EN 15662, with few modifications (Lehotay et al. 2010). Among other beneficial features, the QuEChERS procedure uses acetonitrile (MeCN), which enables extraction of wide polarity range analytes. Different sorbents and amounts can be used in Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 84 d-SPE, namely: weak ion exchange such as primary secondary amine (PSA), graphitized carbon black (GCB) and C18. Other advantages of QuEChERS methodology are its flexibility, high degree of selectivity and sensitivity (Anastassiades et al. 2003; Lehotay et al. 2010; Lehotay et al. 2005; Kmellár et al. 2010). However, the major disadvantage is its low enrichment factors (Cunha and Fernandes 2011). During the last year’s, miniaturized extraction procedures have been introduced with success, namely dispersive liquid–liquid microextraction (DLLME) (Rezaee et al. 2006). The DLLME method is based on the dispersion of an extraction solvent (immiscible in water) combined with a disperser solvent (miscible in both water and extraction solvents) within an aqueous solution. The ternary component solvent system forms a cloudy suspension, which establishes a very high contact area between the aqueous phase and the extraction solvent (Herrera-Herrera et al. 2010; Rezaee et al. 2010; Dadfarnia and Shabani 2010; Caldas et al. 2010). The DLLME method presents important advantages such as simplicity of operation, quickness, low cost, easier manipulation, fewer amounts of organic extraction solvents, high recovery and enrichment factor and easier linkage to analytical methods (Caldas et al. 2010; Sarafraz-Yazdi and Amiri 2010). Its application has been extended to separation, preconcentration and determination of organic and inorganic compounds in liquid samples, but most studies of pesticides evaluated the extraction of few compounds (Fu et al. 2009) or pesticides that belong to the same chemical group, with the same behaviour (Caldas et al. 2010). Nevertheless the complexity of food samples is a drawback that difficult its application in food analysis. DLMME technique in food analysis requires a previous extraction or cleaning step, especially for solid or semisolid samples (Asensio-Ramos et al. 2011). Combination of QuEChERS with DLLME can be of interest due to the simplicity of Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 85 operation and low costs associated with high recoveries and easier linkage to analytical methods such as GC or LC. The use of powerful mass spectrometric detectors has played a vital role to solve many problems related to food safety (Malik et al. 2010, Sharma et al. 2010). However, these types of detectors are very expensive and not available for all laboratories. Diode Array Detection (DAD), although, presents lower selectivity, sensitivity and specificity, the relatively low cost for equipment setup makes it an attractive detection method (Chou et al. 2009). Thus, validations of low cost methods that enable analyses of trace levels of pesticides in complex matrices using HPLC/DAD are relevant. The aim of this work is the development of a quick and inexpensive sample preparation combining QuEChERS and DLLME methods for the determination of trace levels of thirteen pesticides in tomato using HPLC/DAD. These pesticides (i.e. 2,4-D, acetamiprid, bentazone, cymoxanil, deltamethrin, dicamba, diuron, foramsulfuron, mesotrione, metalaxyl-M, methomyl, pyraclostrobin and tembotrione) belong to different chemical families. Special attention was given to optimization of sample cleanup by d-SPE in QuEChERS procedure and to the nature and amount of extraction solvent, sample pH and salting out effect in DLLME methodology. Experimental design methodology (a full factorial central composite design) was used for the optimization of some experimental parameters, as, PSA and GCB amounts, extraction solvent volume and NaCl percentage, whereas the other parameters were previously optimized by univariate analysis. Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 92 experiments were performed using 5 mL of ultra-pure water with 1 mL of MeCN extract of QuEChERS (after d-SPE with 100 mg of C18 and 175 mg of PSA). A cloudy solution resulted from dispersion of fine droplets of a volume of 100 µL of extraction solvent (chloroform, chlorobenzene, trichloroethylene, tetrachloromethane, tetrachloroethylene) when injected into the 5 mL water placed in the test tube. Fig. 2 shows the effect of different extraction solvents on total chromatographic peak area of the different pesticides. As can be seen from Fig. 2, chloroform gave the highest peak area for all pesticides under study, except for cymoxanil, dicamba, pyraclostrobin and deltamethrin. Therefore chloroform was selected as the extraction solvent. ______________________________________________________________________ Figure 2 ______________________________________________________________________ The pH influences the ionization form of certain compounds, and consequently, their water solubility and extractability. The effect of the pH upon pesticides extractability with DLLME was investigated at pH 1, 3, 5 and 8 (Perrin and Dempsey 1974), using 5 mL of buffer solution, with 1 mL of MeCN QuEChERS extract and 100 µl of chloroform as extraction solvent (Fig. 3). The pH values close to 1 enhance the analytical signal of dicamba, foramsulfuron, mesotrione, bentazone and 2,4-D, whereas the signal of other pesticides was not significantly affected by pH variation (p > 0.05). At pH 1 acidic pesticides present a neutral form and a higher tendency to partition into the organic solvent if compared with ionized form. Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 93 ______________________________________________________________________ Figure 3 ______________________________________________________________________ After selection of extraction solvent and aqueous phase pH, the next step was to study the range of variation for these parameters and the volume of QuEChERS extract to guarantee that cloudy suspension was formed as well as a sedimented phase was clearly obtained in the bottom of the tube. For this purpose, 10 mL of buffer solution and 2 mL of QuEChERS are required, whereas, the volume of extraction solvent was further optimized. Combined QuEChERS and DLLME sample preparation procedure requires slight modification of the QuEChERS protocol usually used for fruits and vegetables in order to increase the detection limits. The cleanup has to be made taking in account the further DLLME extraction . Thus, 3 mL of QuEChERS extract were used in d-SPE (instead of 1 mL of MeCN extract usually used (Anastassiades et al. 2003; Lehotay et al. 2010; Lehotay et al. 2005; Cunha and Fernandes 2011)) in order to recover 2 mL of cleaned extract to be used in DLLME method. Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 94 Co-extracted matrix components: Chromatographic Interferences Chlorogenic acid and rutin are polar compounds and elute before 20 min under the chromatographic conditions used. Carotenoids (mainly lycopene) elute in the chromatogram after 20 min and exhibit a peculiar visible spectrum characterized by the presence of three maxima between 400 and 500 nm. These compounds present in tomato matrix are chromatographic interferences in the proposed extraction procedure. Dispersive-SPE permits the use of different combinations of sorbents in appropriate amounts to act as a “chemical filter” and remove matrix interferences without retain the analytes. The use of C18 sorbent retains trace amounts of lipid matrix components and is commonly used to remove apolar interferences, in combination with PSA (Lehotay et al. 2005). HPLC/DAD analyses of tomato extracts using cleanup with PSA indicated that this sorbent removed and/or decreased chromatographic peaks of some less polar interfering compounds (Lehotay et al. 2010). This type of sorbent has high capacity of removing fatty acids, flavonoids, organic acids, sugars and pigments (Lehotay et al. 2010). GCB has a strong affinity towards planar molecules and removes pigments, such as, chlorophylls and carotenoids (Anastassiades et al. 2003). The combination of PSA and GCB gave improved cleanup of matrix components from tomato, but their amounts must be carefully selected to prevent that analytes are also removed. The use of a mixture of three d-SPE dispersive sorbents (C18, PSA and GCB) was needed to minimize the presence of co-extracted matrix components (results not shown). Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 95 Experimental design Taking in account the results obtained in preliminary studies described above, a full factorial central composite design was built with 30 experimental points (2 4 full factorial design, with eight axial points with α = 2 and 6 replicates for center point) for appropriate optimization of most important factors affecting QuEChERS cleanup (i.e. amount of PSA and GCB) and DLLME extraction yield (i.e. chloroform amount, NaCl percentage). The individual peak areas of all analytes were introduced separately as the response in the statistical program. Each model structure was evaluated by means of analysis of variance (ANOVA) namely by ensuring statistical significance of regression coefficients, regression and evaluating the lack-of-fit (Khodadoust and Hadjmohammadi 2011). The obtained results from individual analysis of each compound were studied. In general, higher amount of extraction solvent lead to a higher analytical signal in almost all analytes. The NaCl percentage also gives an increase of signal, but in this case only was for the first compounds eluted, namely, methomyl, acetamiprid, dicamba, cymoxanil, 2,4-D. The amount of PSA and GCB, reduces the peak area of interfering compounds but also reduces the chromatographic peak area of the analytes that are significant variables in the statistical program. The simultaneous extraction of pesticides with very different properties from a complex matrix such as tomato requires a compromise between each individual extraction optimum condition. For that purpose the optimization tool of the statistical program was used, that explores the response surface and gave a point prediction as a result of defined goals. To achieve this goal the analytical signal of one pesticide that has the lowest MRL (foramsulfuron), the two internal standards (NAP and NDPE) and one usual interfering peak that appear in tomato samples were selected. The goals for each response were set; Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 96 maximize the NAP, NDPE and foramsulfuron and minimize the interfering compound to construct desirability indices. The program combines the individual desirabilities into a single number and then searches for the greatest overall desirability. A value of one represents the ideal case. A zero indicates that one or more responses fall outside desirable limits. Graphical analysis of desirability is presented in Fig. 4. The following optimum experimental conditions were obtained: 100 mg PSA, 5.26 mg GCB, 4% NaCl and 400 µL of chloroform. These optimum conditions were tested (6 runs) and the predicted response value of each studied compound was in agreement with experimental results (Table 3). ______________________________________________________________________ Figure 4 ______________________________________________________________________ Analytical performance Verification of analytical performance of the purposed method was performed by matrix matched calibration, recovery and accuracy studies. The linearity was investigated over the ranges indicated in Table 4 for each pesticide. For this purpose the certified organic tomato samples were spiked with the different amounts of pesticide standards and the same amount of the two internal standards before acetonitrile addition. Calibration curves were calculated from the quotient between analytes area to internal standard versus the concentration of each compound. Analysis of the surface response curves of the experimental design indicate that NPA, 2,4-D, acetamiprid, bentazone, cymoxanil, dicamba, diuron, foramsulfuron, mesotrione, metalaxyl-M, methomyl were more influenced by NaCl percentage, volume of chloroform and PSA amount, thus NPA Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 97 has been used as internal standard for these pesticides. Whereas, for NDPE and deltamethrin, pyraclostrobin and tembotrione the GCB amount was the major as factor that conditioned the analytical signal. Thus, NDPE was used as internal standard for these three pesticides. Calibration curves have been obtained using a weighted least squares linear regression model and the concentration range between levels is presented in Table 4, using seven matrix-calibration standards of each analyte. The calibration parameters, related standard deviations and uncertainties were calculated according to Miller and Miller and Mansilha et al. (Miller and Miller 2005, Mansilha et al. 2010). The weighting factors applied were calculated using the inverse of the variances (s i-2 ), and the sums of relative errors (% RE) were used as quality indicators of adjustment in the assessment of weighted linear regression. Correlation coefficients (r 2 ) higher than 0.9980 were obtained. Each test was performed in at least five independent experiments. The quantification limits (LQs) and detection limits (LDs) were calculated based on the standard deviations of the weighted intercept and calibration curve parameters. It should be noted that the purposed analytical method, combining QuEChRES / DLLME and HPLC/UV allowed the quantitation of pesticides at trace levels, for all pesticides under study the LQs were lower than the MRLs established in the EU regulation (Table 4). A statistical comparison was performed between the calibration equations obtained from standards dissolved in acetonitrile and in spiked sample extracts (matrix matched calibration) in order to evaluate the matrix effect. Comparison of the slopes of the calibration curves were statistical evaluated by F and p-values according to (Zar 2010). For all pesticides statistical differences were observed (p-values for the comparison of the slopes were < 0.001) and as a result, according to EU Guidelines (SANCO) (Directorate Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 98 General Health and Consumer Protection 2009), quantification should be developed using the calibration curves obtained with the tomato sample. Recovery studies at two concentration levels were performed to evaluate the accuracy and repeatability of the whole method (n = 3 for intra-day assays and n = 9 for interday assays). The lower spiking level was near the MRLs of each pesticide for tomato. Mean recoveries ranged between 85.7-115.6 % (for methomyl and cymoxanil, respectively). With respect to intraday RSD it was lower than 3.5 % for retention time and lower than 14.2 % for area. Interday RSD was lower than 5.4 % for retention time and lower than 17.4 % for area. The results obtained highlight that the optimized method achieves acceptable recoveries according to EU Guidelines (SANCO) (Directorate General Health and Consumer Protection 2009). It is required that precision be within 15% (RSD) except at the LQ, which can assume a value ±20%. Conclusions The combination of QuEChERS with DLLME is a simple, quick and inexpensive way to obtain low detection limits for thirteen pesticides from different chemical classes analysed in tomato samples. After isolation of the target pesticides from samples with liquid partioning with acetonitrile and salts and cleanup by d-SPE, the analytes were concentrated in chloroform by the DLLME procedure. The disperser solvent from DLLME was used at the same time as carrier of analytes from extraction in QuEChERS method. The novel sample preparation procedure combined with HPLC-DAD method provided appropriate accuracy and repeatability. The quantification limits achieved were below the maximum residue levels established in EU regulation. Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 99 Acknowledgments One of the authors (A. Melo) wishes to thank Fundação Ciência Tecnologia the grant SFRH/BD/41764/2007. This work has been supported by Fundação para a Ciência e a Tecnologia through Project PTDC/AGR-ALI/101583/2008 and PEstC/EQB/LA0006/2011. References Anastassiades M, Lehotay SJ, Štajnbaher D, Schenck FJ. 2003. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce. J AOAC Int. 86(2):412431. Asensio-Ramos M, Ravelo-Pérez LM, González-Curbelo MÁ, Hernández-Borges J. 2011. Liquid phase microextraction applications in food analysis. J Chromatogr A. 1218(42):7415-7437. Caldas SS, Costa FP, Primel EG. 2010. Validation of method for determination of different classes of pesticides in aqueous samples by dispersive liquid-liquid microextraction with liquid chromatography-tandem mass spectrometric detection. Anal Chim Acta. 665(1):5562. Chou TY, Lin SL, Fuh MR. 2009. Determination of phenylurea herbicides in aqueous samples using partitioned dispersive liquid-liquid microextraction. Talanta 80(2):493–498. Cunha SC, Fernandes JO. 2011. Multipesticide residue analysis in maize combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr A. 1218(43):7748-7757. Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 100 Dadfarnia S, Shabani AMH. 2010. Recent development in liquid phase microextraction for determination of trace level concentration of metals--a review Anal Chim Acta. 658(2):107-119. Directorate General Health and Consumer Protection. 2009. Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. SANCO/10684/2009, 1 January 2010. Brussels (Belgium): Directorate General Health and Consumer Protection, European Commission. European Commission. 2005. Commission Regulation (EC) 396/2005 of the European Parliament and of the Council of 23 February 2005 on maximum residue levels of pesticides in or on food and feed of plant and animal origin and amending Council Directive 91/414/EEC. Off J Eur Comm. L70:1–16. Fu L, Liu X, Hu J, Zhao X, Wang H, Wang X. 2009. Application of dispersive liquidliquid microextraction for the analysis of triazophos and carbaryl pesticides in water and fruit juice samples. Anal Chim Acta. 632(2):289-295. Herrera-Herrera AV, Asensio-Ramos M, Hernández-Borges J, Rodríguez-Delgado MA. 2010. Dispersive liquid-liquid microextraction for determination of organic analytes. Trend Anal Chem. 297:728-751. Khodadoust S, Hadjmohammadi M. 2011. Determination of N-methylcarbamate insecticides in water samples using dispersive liquid-liquid microextraction and HPLC with the aid of experimental design and desirability function. Anal Chim Acta. 699(1):113119. Kmellár B, Abrankó L, Fodor P, Lehotay SJ. 2010. Routine approach to qualitatively screening 300 pesticides and quantification of those frequently detected in fruit and vegetables using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 27(10):1415-30. Capítulo 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 101 Lehotay SJ, Maštovska K, Yun SJ. 2005. Evaluation of two fast and easy methods for pesticide residue analysis in fatty food matrixes. J AOAC Int. 88(2):630-638. Lehotay SJ, Son KA, Kwon H, Koesukwiwat U, Fu W, Maštovska K, Hoh E, Leepipatpiboon N. 2010. Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables J Chromatogr A. 1217(16):25482560. Malik AK, Blasco C, Picó Y. 2010. Liquid chromatography-mass spectrometry in food safety. J Chromatogr A. 1217(25):4018-4040. Mansilha C, Melo A, Rebelo H, Ferreira IM, Pinho O, Domingues V, Pinho C, Gameiro P. 2010. Quantification of endocrine disruptors and pesticides in water by gas chromatography-tandem mass spectrometry. Method validation using weighted linear regression schemes. J Chromatogr A. 1217(43):6681-6691. Miller JN, Miller JC. 2005. Statistics and chemometrics for analytical chemistry. 5th ed. England: Pearson Education Limited. Perrin DD, Dempsey B. 1974. Buffers for pH and metal ion control. London: Chapman and Hall Ltd. Ravelo-Pérez LM, Hernández-Borges J, Asensio-Ramos M, Rodríguez-Delgado MA. 2009. Ionic liquid based dispersive liquid–liquid microextraction for the extraction of pesticides from bananas. J Chromatogr A. 1216(43):7336-7345. Rezaee M, Assadi Y, Milani Hosseini MR, Aghaee E, Ahmadi F, Berijani S. 2006. Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction. J Chromatogr A. 1116(1-2):1-9. Rezaee M, Yamini Y, Faraji M. 2010. Evolution of dispersive liquid-liquid microextraction method. J Chromatogr A. 1217(16):2342-57. Capítulor 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 108 Fig. 1 – (A) Chromatographic separation of the selected group of pesticides added (concentration 1.0 mgkg -1 for dicamba and metalaxyl-M; 0.5 mgkg -1 for 2,4 – D and deltamethrin, 0.1 mgkg -1 for the other nine pesticides) to a sample of organic tomato analysed by HPLC-DAD at their maximum UV absorbance wavelengths (B) Chromatographic separation of a sample of organic tomato sample without addition of pesticides. Capítulor 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 109 Fig. 2 - Effect of different extraction solvents on the total chromatographic peak area of pesticides. Extraction conditions: 5 mL of ultra-pure water with 1 mL of MeCN QuEChERS extract obtained with a tomato sample spiked with a concentration of 3.0 mgkg -1 for dicamba and metalaxyl-M; 1.5 mgkg -1 for 2,4 – D and deltamethrin, 0.150 mgkg -1 for the other nine pesticides and 100 µl of each extraction solvent. Capítulor 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 110 Fig. 3 - Effect of pH from aqueous phase on the total chromatographic peak area of pesticides. Extraction conditions: 5 mL of buffer with 1 mL of MeCN QuEChERS extract obtained with a tomato sample spiked with a concentration of 3.0 mgkg -1 for dicamba and metalaxyl-M; 1.5 mgkg -1 for 2,4 – D and deltamethrin, 0.150 mgkg -1 for the other nine pesticides and 100 µl of chloroform as extraction solvent. Capítulor 4 Analysis of pesticides in tomato combining QuEChERS and dispersive liquidliquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography 111 Fig. 4 – Response surface estimated for the central composite design of QuEChERS / DLLME optimization: (a) amount of PSA and GCB); (b) chloroform amount, NaCl percentage Capítulo 5 Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas-chromatography-mass spectrometry Capítulor 5 Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas-chromatography-mass spectrometry 115 Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gaschromatography-mass spectrometry Armindo Melo 1 , Sara C. Cunha 1 , Catarina Mansilha 2,5 , Ana Aguiar 3 , Olívia Pinho 1,4 , Isabel M.P.L.V.O. Ferreira 1* 1 REQUIMTE/ Departamento de Ciências Químicas, Laboratório de Bromatologia e Hidrologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. 2 Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Portugal. 3 REQUIMTE/Faculdade de Ciências da Universidade do Porto. 4 Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto 5 REQUIMTE/Universidade do Porto * Corresponding author, email: [email protected] ABSTRACT A multiclass and multiresidue method for pesticide analysis in tomato has been validated. Extraction and pre-concentration of the pesticide residues from acetonitrile extract was performed by using dispersive liquid–liquid microextraction (DLLME) technique followed by gas chromatography–mass detection. DLLME was performed using carbon tetrachloride as extractive solvent and acetonitrile extract as dispersive solvent, in order to increase enrichment factor of extraction procedure. Parameters of validation indicated the suitability of the method for routine analyses of thirty pesticides in a large number of samples. In general, pesticide recoveries ranged between 70-110% and repeatability ranged between 1 and 20%. The proposed method was applied to the monitoring of pesticide Capítulor 5 Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas-chromatography-mass spectrometry 116 levels in tomatoes grown during winter in greenhouses. Among compounds considered in this work, cyprodinil was found in tomato at concentrations of 0.33 mg/kg, other pesticides like azoxystrobin, fenhexanid, tolyfluanid, λ-cyhalothrin and trifloxystrobin were also detected but not quantified. Keywords: tomato, pesticides, improved extraction procedure, dispersive liquid–liquid microextraction, gas chromatography–mass detection 1. Introduction Tomatoes (Lycopersicum esculentum sin.: Solanum lycopersicum, Lycopersicum lycopersicum) belong to the Solanaceae family and corresponds to one of the most widely grown vegetables in the world (Engindeniz, 2006). This fruit vegetable is typically produced in spring-summer season, however, in south Europe it is produced during all year in greenhouses (Bidari, Ganjali, Norouzi, Hosseini, & Assadi, 2011). Thus, consumers can eat fresh tomato, usually in salad dishes that are consumed without cooking treatment, even during winter. Commercial greenhouses are widely utilized to produce premium-quality fruits and vegetables by providing optimal growth conditions for these plants (Acquaah, 2002). Yet moderate temperature and high humidity accrue plant development it also contributes to pests and diseases spread. Moreover, in greenhouses the cultures follow up each other in a non-stop rotation by the virtually year-round culture of crops, allowing the survival of pests and diseases. Indeed, greenhouse requirements for best tomato production are also favorable for development of fungus diseases as late blight (Phytophtora infestans) and grey mould (Botrytis cinerea) (Angioni, Porcua, & Dedolab, 2011). Also insects and mites Capítulor 5 Monitoring pesticide residues in greenhouse tomato by combining acetonitrile-based extraction with dispersive liquid-liquid microextraction followed by gas-chromatography-mass spectrometry 117 are ever-present in greenhouses and so, insecticides are widely used in tomato protection programs ( Nelson, 1998). For this reason, integrated pest management strategies requires spraying with different types of fungicides and insecticides (Bidari et al., 2011; Acquaah, 2002). Consequently, monitoring of pesticide residues in greenhouse tomato becomes essential to ensure food safety to the consumers, preventing bioaccumulation of pesticide residues through the food chain. Concentrations of pesticides in food commodities such as tomato are normally low. Thus, pretreatment /extraction procedures are required in order to isolate the analytes from the complex tomato matrix, remove interfering compounds and achieve a sufficient sensitivity to guarantee that the detection limits of the method are in agreement with EU legislation requirements, established by maximum residue levels (MRL) (Regulation (EC) N ◦ 396/2005, 2005). Gas chromatography coupled to mass detection is widely used in the analysis of pesticide of high volatility ( Likas, Tsiropoulos, & Miliadis, 2007), whereas liquid chromatography is preferred in the analysis of pesticides of low volatility (Sannino, & Bandini, 2005). Miniaturized sample preparation methods for analyzing pesticide residues in tomato matrix have been reported (Bidari et al., 2011; Angioni et al., 2011; Likas et al., 2007; Sannino, & Bandini, 2005; Lehotay, Son, Kwon, Koesukwiwat, Fu, Mastovska, Hoh, & Leepipatpiboon, 2010). QuEChERS analysis based on acetonitrile extraction of difference classes of pesticide residues widely used to control tomato pests are described (Angioni et al., 2011; Likas et al., 2007; Lehotay et al., 2010). Advantages of this methodology are its flexibility, high degree of selectivity and sensitivity (Anastassiades, Lehotay, Štajnbaher, & Schenck, 2003; Lehotaya, Maštovska, Yun, 2005). Its major disadvantage is the low enrichment factors ( Cunha, & Fernandes, 2011). Other methodologies enabled higher enrichment factors, namely, single-drop microextraction (SDME) coupled with gas Capítulo 10 Contaminação das águas subterrâneas em zonas de agricultura intensiva 220 25. Kresic N. Hydrogeology and Groundwater Modeling. Secund edition ed. Florida: CRC Press-Taylor & Francis Group; 2007. 26. Miller GW. Integrated concepts in water reuse: managing global water needs. Desalination. 2006;187(1-3):65-75. 27. Instituto Nacional de Estatística IP. Estatísticas Agrícolas 2008. Lisboa: INE; 2008. 28. Amaro P. A Protecção Integrada. Lisboa: ISA/Press; 2003. PARTE IV Capítulo 11 Conclusões 225 Capítulo 11. Conclusões Neste capítulo reuniram-se as conclusões globais do trabalho desenvolvido no âmbito desta dissertação, organizadas de acordo com os objetivos delineados e os resultados obtidos. A descoberta, após a 2ª Guerra Mundial, de numerosas moléculas altamente eficazes no combate a pragas e de fácil utilização pelo agricultor, produzidas por empresas com poderosas estruturas comerciais, conduziu a uma utilização massiva dos produtos fitofarmacêuticos. Consequentemente, verificou-se um aumento da produção agrícola, associado a uma melhoria das condições de vida. No entanto, não se deve esquecer, que os resíduos de pesticidas podem provocar efeitos negativos no Homem e no meio ambiente. Um dos grandes desafios que se coloca, atualmente, consiste em criar condições que permitam contribuir para que a proteção das culturas se faça com o mínimo impacto na saúde humana e no ambiente. Neste contexto, tornou-se imperiosa a monitorização dos resíduos de pesticidas, como forma de prevenção da exposição a estes contaminantes, ou com o intuito de estabelecer medidas de remediação. Diversas entidades regulamentares limitaram a utilização dos produtos fitofarmacêuticos e, assim, tornou-se urgente e essencial o desenvolvimento de métodos analíticos multirresíduo, com recurso a técnicas de preparação da amostra fiáveis, que permitam a monitorização dos resíduos de pesticidas em diferentes matrizes. As metodologias otimizadas e validadas neste trabalho revelaram-se adequadas para a deteção e quantificação de diferentes resíduos de pesticidas de várias famílias químicas, permitindo obter resultados analíticos rigorosos de alta qualidade, com a vantagem de minimizar o consumo de solventes orgânicos e de reagentes. A técnica de SPE é o método mais utilizado e convencionalmente aceite como método de extração de resíduos de pesticidas em amostras de águas. O método de SPE-GC/MS foi validado, de acordo com as orientações emanadas pela International Conference on Harmonization (ICH), para a determinação de pesticidas de diferentes famílias químicas e estrogénios, em água. A preparação da amostra por SPE apresentou boa eficiência de extração, fácil utilização, e baixo consumo de solventes orgânicos. A utilização de um modelo de regressão linear ponderada diminuiu os erros relativos no extremo inferior da curva de calibração e permitiu maior exatidão perto do limite de deteção. O método de SPME-HPLC/DAD foi apropriado para a determinação de resíduos de pesticidas, vulgarmente usados na produção de alface, permitindo a sua quantificação em níveis inferiores ao respetivo limite máximo de resíduo. A otimização das condições de extração por RSM permitiu selecionar as melhores condições para a extração dos 226 resíduos da matriz, permitindo realizar, simultaneamente, a extração e a purificação dos extratos, reduzindo, significativamente, o tempo necessário para a preparação das amostras. As principais vantagens associadas a este método consistiram na obtenção de um elevado grau de purificação dos compostos em estudo, aliado a uma redução do consumo de solventes orgânicos e à utilização de um detetor, geralmente disponível nos laboratórios que fazem controlo de qualidade destas amostras. A combinação do processo de extração de QuEChERS com o processo de DLLME constituiu uma forma simples e pouco dispendiosa de purificar e concentrar os extratos de tomate, para a seguir se proceder à separação e quantificação dos resíduos de pesticidas por HPLC/DAD e por GC/MS. O método QuEChERS/DLLME foi associado à separação por HPLC e deteção por DAD para a análise de pesticidas, de diferentes famílias químicas, em amostras de tomate. De realçar, que este detetor embora menos sensível que o de MS, tem a vantagem de ser mais fácil de adquirir e utilizar. Adicionalmente, aplicando a técnica de HPLC é possível a análise de compostos polares que não são facilmente analisados por GC. Os resíduos de pesticidas foram quantificados em níveis inferiores aos seus LMR, na matriz de tomate, que é rica em compostos interferentes, nomeadamente, carotenóides, ácidos clorogénicos e rutina. Este facto, deve-se em grande parte, ao elevado fator de enriquecimento alcançado por DLLME em conjunto com a purificação proporcionada pela SPE dispersiva do QuEChERS. Com recurso a uma otimização por RSM, foi possível obter as condições apropriadas das diferentes variáveis de extração e um compromisso entre a purificação da amostra e a maximização do sinal analítico. A metodologia de extração por QuEChERS/DLLME, foi também, acoplada a GC-MS, pois, este tipo de instrumento apresenta uma grande robustez e sensibilidade, permitindo diferenciar, claramente, os resíduos de pesticidas das interferências. Deste modo, foi possível analisar um maior número de resíduos de pesticidas em cada análise cromatográfica e, simultaneamente, quantificar os resíduos de pesticidas em níveis inferiores aos seus LMR. Os dois métodos de QuEChERS/DLLME associados a diferentes técnicas cromatográficas e detetores foram validados para a determinação de resíduos de pesticidas em amostras de tomate. Estes métodos podem complementar-se, uma vez que os resíduos determinados por DAD apresentam uma melhor performance na análise por HPLC, e os resíduos determinados por MS apresentam uma boa performance analítica, quando analisados por cromatografia gasosa. De realçar, que devido à maior eficiência e robustez da técnica de GC/MS na análise dos resíduos de pesticidas, não foi necessária uma purificação tão elevada como na técnica de HPLC e por isso as etapas 227 de SPE dispersivo da técnica de QuEChERS foram eliminadas, o que permitiu simplificar a preparação da amostra. A validação dos métodos analíticos desenvolvidos foi especialmente relevante para obter resultados rigorosos e fiáveis. Deste modo, foram avaliados os efeitos de matriz, a exatidão e precisão de cada método, os limites de deteção e de quantificação, intervalo de linearidade, eficiência da extração, estabilidade e robustez. Os efeitos de matriz foram determinados em todas as metodologias otimizadas, por avaliação da intensificação ou supressão de sinal analítico obtido na injeção dos extratos em comparação com a injeção de soluções padrão com as mesmas concentrações. O efeito de matriz foi ultrapassado realizando sempre as calibrações na matriz em estudo, sem resíduos de pesticidas, à qual foram adicionadas as quantidades de padrão desejadas e extraídas nas mesmas condições que foram aplicadas às amostras. Por sua vez, as calibrações efetuadas com recurso a um modelo de regressão linear ponderada permitiram a diminuição dos erros relativos das medições nas concentrações mais baixas e, consequentemente, a obtenção de maior exatidão. As metodologias analíticas validadas foram aplicadas na avaliação de resíduos de pesticidas em amostras de alface, tomate e águas subterrâneas de diferentes origens, pois estas são importantes vias de exposição dos humanos e animais aos resíduos de pesticidas. A técnica de SPME-HPLC/DAD foi usada na monitorização de resíduos de pesticidas, geralmente usados na produção de alface, produzida em estufas durante o inverno, com o intuito de avaliar a dissipação de alguns pesticidas desde a sua aplicação até à colheita. A análise das amostras de alface revelou que os produtos fitofarmacêuticos aplicados tinham como princípios ativos os compostos fenhexamid e folpet. Somente estes dois pesticidas foram quantificados em algumas das amostras de alface. Os restantes pesticidas avaliados neste trabalho (azosxystrobin, cyprodinil, fludioxonil, iprodione, metalaxyl M, tolyfluanid, acetamiprid, pirimicarb), não foram detetados nas amostras analisadas. Os resultados obtidos neste trabalho confirmaram que no final do intervalo de segurança estipulado, os resíduos de pesticidas já se encontravam em níveis inferiores ao LMR estabelecido, em conformidade com a legislação europeia, não apresentando risco para o consumidor. Na outra matriz monitorizada neste trabalho, o tomate, foi usada a técnica de QuEChERS/DLLME com deteção por GC/MS, e aplicada na análise de 20 amostras de 4 variedades de tomate, comercialmente disponíveis. Não foi detetado nenhum dos 30 pesticidas em estudo em 13 amostras das 20 amostras analisadas. Somente 7 amostras apresentavam 1 ou 2 resíduos de pesticidas abaixo do respetivo LMR estabelecido pela 228 UE. Os resultados indicam que o tomate, mesmo o que é produzido em estufa durante o inverno, que é a fase do ano em que se pode verificar maior necessidade de utilização de produtos fitofarmacêuticos, é seguro no que respeita aos resíduos de pesticidas presentes. Somente a quantidade detetada de tolyfluanid em duas amostras de tomate revelou alguma preocupação, porque este produto fitofarmacêutico não é homologado pela legislação portuguesa para esta matriz. A monitorização de pesticidas em águas subterrâneas com recurso a uma técnica de SPE-GC/MS, realizada em duas regiões de intensa atividade agrícola, confirmou que este compartimento pode ser um perigoso reservatório das substâncias ativas dos produtos fitofarmacêuticos utilizados na agricultura. No que respeita à qualidade das águas subterrâneas na zona de horticultura intensiva, verificou-se que esta não se encontrava apenas poluída com nitratos (como o esperado), mas, também, com resíduos de pesticidas. As amostras recolhidas de poços apresentavam, geralmente, níveis superiores de resíduos de pesticidas, quando comparados com as amostras obtidas através de furos artesianos localizados na mesma zona. No caso da monitorização da água subterrânea proveniente de 9 minas utilizadas para abastecimento público, verificou-se que somente a água de 2 minas não apresentou vestígios de pesticidas, e que nas restantes 7 minas foi possível detetar a presença de pelo menos um pesticida. A água de 2 minas apresentou uma poluição difusa, em que alguns pesticidas apresentavam níveis de pesticidas superiores aos limites máximos de resíduos permitidos nas águas para consumo humano. Os resultados obtidos contrariaram a ideia generalizada de que este tipo fontes de água apresenta sempre uma elevada qualidade da água. Os níveis elevados de resíduos de diversos pesticidas são indicadores de más práticas agrícolas utilizadas no passado recente ou longínquo. Nas zonas agrícolas estudadas, demonstra-se que foram aplicadas, nas últimas décadas, grandes quantidades de pesticidas para destruir pragas, doenças e infestantes que competem com a produção, e que devido a fenómenos de lixiviação, entraram nas águas subterrâneas onde permanecem e dificilmente se degradam. Nestas zonas, que constituem importantes zonas agrícolas com forte necessidade de água de rega, urge resolver a questão da qualidade da água através do controlo da sua poluição. Para este efeito deverão ser realizadas importantes obras de engenharia de transporte da água de outras regiões, ou através de processos de remediação com o recurso a produtos biológicos e químicos, com uma organizada coordenação a nível regional. 229 Este trabalho vai de encontro às tendências já evidenciadas na Europa de abandono da agricultura intensiva, nascida com a revolução verde, e substituída por exigentes formas de agricultura sustentável, como a produção integrada e a agricultura biológica. Perspetivas futuras Na atualidade, está disponível uma grande quantidade e diversidade de métodos analíticos para a determinação de resíduos de pesticidas. No entanto, os métodos frequentemente utilizados para a extracção destes compostos, em diferentes tipos de amostras, são muito demorados, envolvem múltiplos passos, que propiciam a perda de analitos, e utilizam grandes quantidades de solventes orgânicos. As estratégias modernas em química analítica envolvem o recurso a métodos multirresíduo, que tentam conciliar no mesmo método, de uma forma simples e rápida, a análise de diferentes compostos, com elevada qualidade dos resultados analíticos. As metodologias de QuEChERS e DLLME seguem a tendência atual de miniaturização e redução de solventes e mostraram-se muitos eficientes na extração e concentração dos diferentes resíduos de pesticidas. No caso da extração por DLLME poderão vir a ser utilizados novos solventes de extracção, de forma a melhorar os factores de enriquecimento, minimizando também o consumo de solventes utilizados hoje em dia. Uma alternativa é a utilização de líquidos iónicos, que apresentam a vantagem de serem pouco voláteis, e não apresentarem risco de explosão ou toxicidade elevada, deste modo, será possível reduzir a perigosidade do solvente de extracção. Normalmente, os solventes utilizados na extração por DLLME são incompatíveis com a injeção direta no HPLC, pois, a sua elevada hidrofobicidade implica que não sejam miscíveis com os eluentes geralmente utilizados. Por outro lado, é de prever que irão surgir novas formas engenhosas de automatização deste tipo de técnicas, para reduzir o tempo de preparação da amostra. Esta técnica devido ao elevado fator de enriquecimento dos compostos a analisar, é promissora na aplicabilidade em novas matrizes de interesse. A utilização de novos sorventes de d-SPE na metodologia de QuEChERS e novos materiais de revestimento das fibras de SPME poderá contribuir para melhorar a seletividade e a remoção de compostos interferentes, permitindo obter extratos mais puros e livres de interferências. No que respeita à monitorização dos diferentes resíduos de pesticidas em amostras ambientais e alimentares, a preocupação têm-se centrado nos resíduos dos princípios ativos utilizados nas atividades agrícolas, no entanto, surge, atualmente, a preocupação