Doença de Machado-Joseph: do diagnóstico à terapêutica

2013/2014 Cláudia Sofia Ferreira e Sousa Lima dos Santos Doença de Machado‐Joseph: do diagnóstico à terapêutica março, 2014 Mestrado Integrado em Medicina Área: Neurologia Trabalho efetuado sob a Orientação de: Doutora Maria Carolina Lobo Almeida Garrett Trabalho organizado de acordo com as normas da revista: SINAPSE Cláudia Sofia Ferreira e Sousa Lima dos Santos Doença de Machado-Joseph: do diagnóstico à terapêutica março, 2014 À memória da minha amiga Mónica Castro Doença de Machado‐Joseph: do diagnóstico à terapêutica Cláudia Santos1 1Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Alameda do Professor Doutor Hernâni Monteiro 4200-319, Porto Portugal Telem: 939306592 [email protected] Doença de Machado‐Joseph: do diagnóstico à terapêutica Cláudia Santos Resumo A doença de Machado-Joseph ou Ataxia Espinocerebelosa tipo 3 é uma ataxia hereditária dominante que, apesar de rara, é a mais frequente em todo o mundo. Existe uma elevada prevalência desta doença, inevitavelmente fatal, em algumas regiões de Portugal com forte impacto na qualidade de vida dos doentes e seus familiares. Esta revisão teve como objetivo descrever diferentes aspetos da DMJ, tais como características clínicas, neuropatologia, genética, mecanismo patogénico e terapêuticas atualmente em desenvolvimento. A DMJ caracteriza-se clinicamente pelo aparecimento tardio de ataxia cerebelosa progressiva, oftalmoplegia, sinais piramidais, e em alguns casos sinais extrapiramidais, principalmente distonia e neuropatia periférica. A nível patológico, os doentes apresentam perda neuronal nos núcleos espinocerebelosos, cerebelo, gânglios da base, ponte, mesencéfalo, bolbo raquidiano. Mais recentemente, foram observadas alterações noutras áreas como tálamo e lobos cerebrais. Estudos de imagem revelaram atrofia da ponte, do bolbo raquidiano e do cerebelo, com o consequente aumento do quarto ventrículo. Esta doença é causada por uma mutação dinâmica no segmento (CAG)n do gene MJD1/ATXN3 (Cr14q32.1), transmitida de uma forma autossómica dominante. Indivíduos normais apresentam genes com 14-44 CAGs, enquanto que, indivíduos doentes apresentam um segmento expandido de 54-86 CAGs. O número de repetições CAG está diretamente relacionado com a gravidade da doença e inversamente relacionado com a idade de início. A expansão de CAGs origina um segmento expandido de glutamina na proteína ataxina-3, o que lhe confere propriedades tóxicas e/ou perda da sua função biológica, por alteração da conformação normal da proteína e consequente agregação em inclusões intracelulares. A ataxina-3 participa no controlo da homeostasia celular como enzima de desubiquitinação, mas o seu papel na célula parece ser muito mais abrangente, o que tem dificultado o esclarecimento do mecanismo patogénico subjacente a esta patologia. Vinte anos após a descoberta do gene MJD1/ATXN3, não existe ainda cura para a DMJ. No entanto, aos doentes pode ser oferecido aconselhamento genético e tratamento farmacológico para os diversos sintomas tais como depressão, alterações do sono, parkinsonismo, dor e distonia. Os doentes podem ainda beneficiar de apoio que lhes assegure uma melhor qualidade de vida, como por exemplo, fisioterapia, terapia da fala e terapia ocupacional. O grande número de trabalhos publicado nos últimos anos no sentido de descobrir o mecanismo através do qual a DMJ se desenvolve e, da forma como poderá ser travada a sua progressão, leva-nos a pensar que num futuro próximo será possível tratar esta patologia bem como outras semelhantes. Palavras-chave: Doenças de poliglutaminas, Doença de Machado-Joseph, Ataxia espinocerebelosa tipo 3, ATXN3, ataxina-3, repetições de CAG Correspondência com o autor: Cláudia Santos Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Alameda do Professor Doutor Hernâni Monteiro 4200-319, Porto Portugal [email protected] Machado‐Joseph Disease: from diagnosis to therapeutics Cláudia Santos Abstract Machado-Joseph disease or Spinocerebellar Ataxia type 3 is a dominant hereditary ataxia that although rare, is the most common worldwide. There is a high prevalence of this inevitably fatal disease in some regions of Portugal with a strong impact on the quality of life of patients and their families. This review aims to describe different aspects of MJD, such as clinical features, neuropathology, genetics, pathogenic mechanism and promising therapeutics. MJD is clinically characterized by delayed onset of progressive cerebellar ataxia, ophthalmoplegia, pyramidal signs, and in some cases extrapyramidal signs, such as dystonia and peripheral neuropathy. Neuropathological studies reveal neuronal loss in spinocerebellar nucleus, cerebellum, basal ganglia, pons, midbrain and medulla oblongata. More recently, changes in other areas such as thalamus and the cerebral lobes were observed. Imaging studies revealed atrophy of the cerebellum, pons and medulla oblongata with a consequent increase of the fourth ventricle. This disease is caused by a mutation in the dynamic segment (CAG)n of the MJD1/ATXN3 gene (Cr14q32.1), transmitted in an autosomal dominant pattern. Normal individuals have 14-44 CAGs, whereas MJD individuals have an expanded segment of 54-86 CAGs. The number of CAG repeats is directly related to the severity of the disease and inversely related to the age of onset. The expansion of CAGs results in an expanded polyglutamine tract in ataxin-3 protein altering its normal conformation. The mutated protein gains toxic properties and/or loss its biological function, and aggregates in intracellular inclusions. Ataxin-3 regulates cellular homeostasis as a Deubiquitinating enzyme, but its role in cells seems far from being completly understood, thus MJD underlying pathogenic mechanism remains elusive. 3. Patologia e neuroimagem Macroscopicamente os cérebros de doentes DMJ pesam significativamente menos que os cérebros de indivíduos sem patologia (50-51). É igualmente notória a despigmentação da substantia nigra e atrofia do cerebelo, ponte, bolbo raquidiano e nervos cranianos II a XII (30, 33, 51-52). Estudos neuropatológicos convencionais documentaram perda neuronal nos núcleos espinocerebelosos, cerebelar denteado, pálido, subtalâmico, rubro, pôntico, vestibular, substancia nigra e, coluna de Clarke (12, 14, 30, 51-54). Segundo estes estudos a lesão da matéria branca está confinada ao lemnisco medial, trato espinocerebelar e colunas dorsais (51-52, 54). Estudos de neuropatologia utilizando técnicas não convencionais mostraram degeneração em outros locais não descritos anteriormente, nomeadamente na substância cinzenta de múltiplas áreas envolvendo a ansa motora cerebelotalamocortical, a ansa motora gânglio basal-talamocortical, vários sistemas: visual, auditivo, somatossensorial, oculomotor e vestibular, região do tronco cerebral relacionado com a ingestão e pré-cerebelar, sistema pôntico noradrenérgico e sistema dopaminérgico e colinérgico do mesencéfalo e núcleo reticular talâmico GABAérgico (55). A degeneração da substância branca é pouco acentuada e foi apenas observada no cerebelo, medula espinal e tronco cerebral (55). A característica mais frequentemente encontrada na RMN de DMJ é o aumento do quarto ventrículo. Estudos volumétricos utilizando RMN revelaram a atrofia da ponte, cerebelo, pedúnculo médio e superior do cerebelo, dos gânglios da base (putamen, caudado e globo pálido), alterações do diâmetro ântero-posterior e transverso do mesencéfalo e do diâmetro ântero-posterior do bolbo raquidiano (56-60). A utilização de uma nova técnica de imagem associada à RMN ajudou a clarificar o envolvimento do tálamo na DMJ (61). Estudos de espectroscopia RM mostraram ainda alterações metabólicas na substância branca sugerindo disfunção neuronal e axonal extensa (62). A utilização da glucose pelos hemisférios cerebelares, tronco cerebral e córtex cerebral é deficitária, e pode ser detetada por PET em portadores da DMJ mesmo antes de manifestarem os sinais clínicos, o que sugere a existência de uma atividade pré-clinica da doença (63). Outras alterações detetáveis por PET com 18F-fluorodopa revelaram diminuição da ligação do transportador da Dopamina em regiões como cerebelo, tronco cerebral e sistema dopaminérgico nigro-estriado e curiosamente no córtex cerebral e no estriado (58). Nos cérebros de doentes DMJ podem ser encontrados agregados proteicos em três diferentes locais da célula. Foram detetadas inclusões intranucleares (IN) em diversas regiões do encéfalo de doentes DMJ, principalmente na ponte, mas também no tálamo, substancia nigra, e mais raramente no estriado (64-65). Estas inclusões contêm a proteína ataxina-3 (ATXN3) envolvida na DMJ, juntamente com outras proteínas, tais como, ubiquitina e proteínas ubiquitinadas, fatores de transcrição, proteínas contendo cadeias poliglutaminas, sub-unidades do proteassoma e proteínas de Heat-shock (HSP) (64-71). Ao contrário do que inicialmente se pensava, a presença das IN pode ocorrer não só em zonas afetadas pela neurodegeneração mas também em regiões do encéfalo geralmente poupadas (55, 72-73). Assim, apesar das IN serem um marcador da DMJ o seu papel preciso nesta patologia continua por esclarecer. São igualmente observadas inclusões citoplasmáticas contendo a proteína ATXN3 mutada em regiões do encéfalo onde geralmente também se observam IN (72, 74-75). Estas inclusões são negativas para a ubiquitina e consistem em grânulos de 1,5 µm de diâmetro. Agregados da proteína mutada podem, também, ser observados em fibras nervosas que degeneram na DMJ e contêm as proteínas ubiquitina e p62 e subunidades do proteassoma, podendo por isso ser prejudiciais para o transporte axonal e assim contribuírem para a degeneração das células nervosas (76). 4. Genética da DMJ 4.1 Gene MJD1/ATXN3 Em 1993 foi mapeado o gene MJD1, atualmente designado gene ATXN3 no cromossoma 14q24.3-q32.1 em famílias japonesas (77), confirmando-se mais tarde essa localização em famílias açorianas (78). O gene ATXN3 foi clonado em 1994 (79), possuindo uma sequência de repetições do trinucleotídeo CAG que se encontra expandida nos doentes DMJ (79-81). O segmento de trinucleotídios CAG é bastante polimórfico, apresentando os indivíduos normais entre 12 e 44 CAGs, e os indivíduos com DMJ entre 54 e 86 CAGs (31). Casos de alelos de tamanho intermédio foram já descritos, mas são muito raros. Os alelos intermédios provavelmente têm penetrância incompleta e não parecem associar-se a sintomas da doença ou então associam-se apenas a manifestações menos graves de ataxia, como o síndrome das pernas inquietas ou disautonomias (31, 82-85). A confirmação de que alelos entre 44 e os 54 CAG possam estar associados à presença de sintomas associados à DMJ poderá levar à alteração dos intervalos de repetições CAGs patológicos inicialmente propostos. Apesar do gene MJD1/ATXN3 ter sido clonado em 1994, apenas em 2001 foi determinada a estrutura da sua sequência genómica, que compreende 48240 bp, incluindo 11 exões (86). A sequência repetitiva de CAGs encontra-se no exão 10. Foram inicialmente detetados quatro transcritos, expressos ubiquamente, com diferentes tamanhos - 1.4, 1.8, 4.5, e 7.5 kb que resultam provavelmente de splicing alternativo dos exões 2, 10 ou 11 e da utilização de diferentes sinais de poliadenilação (79, 86-87). Com a análise das sequências dos clones de cDNA provou-se a existência de pelo menos 5 produtos do gene ATXN3: o primeiro clone inicialmente descrito, MJD1a (79), utiliza o exão 10 como local de terminação a 3´. Outros clones de cDNA MJD1-1 e MJD5-1 foram descritos por Goto (87) e utilizam o exão 11 como região 3´ terminal. A diferença entre os clones MJD1-1 e MJD5-1 reside na utilização de diferentes sinais de poliadenilação. O clone MJD2-1 também descrito por Goto utiliza o exão 10 como local de terminação 3´ e contém, relativamente ao cDNA MJD1a, uma alteração do codão stop (TAA/TAC1118), um polimorfismo frequente na população (88). O clone H2 salta o exão 2, provavelmente por splicing alternativo mantendo, no entanto, um quadro de leitura idêntico ao clone MJD1-1 (86). Um estudo recente realizado a partir de amostras de sangue periférico mostrou a presença de dois novos exões no gene ATXN3 (6a e 9a) e, ainda, 50 novos transcritos, dos quais 20 com probabilidade de tradução em diferentes isoformas proteicas (89). No futuro, é ainda necessário provar a existência destas variantes no SNC e, ainda, demonstrar o seu nível de expressão nos diferentes tecidos, bem como, determinar a sua relevância funcional e contribuição diferencial para a patologia da DMJ. 4.2 Transmissão genética e diagnóstico A DMJ é transmitida de forma autossómica dominante, o que significa que basta que um dos progenitores (independentemente do sexo) seja portador da mutação para que haja um risco de 50% de os seus filhos ou filhas serem afetados. Na DMJ tal como noutras doenças de repetições de nucleotídeos, ocorre uma correlação inversa entre o tamanho da repetição, a idade de início da doença, e a tendência para uma expansão maior da repetição patogénica em gerações sucessivas (34, 46, 80). Este fenómeno designado por Antecipação explica-se pelo facto de existir instabilidade genética da repetição de CAG entre gerações. Ou seja, o número de repetições pode ser diferente entre pais e filhos, existindo inclusivamente maior tendência para expandir quando o alelo mutado transmitido é paterno. O alelo normal geralmente é estável entre gerações. O alelo expandido apresenta também alguma instabilidade somática, ou seja, apresenta diferentes tamanhos de repetições CAG em diferentes tecidos, fenómeno designado por mosaicismo somático. Contudo a presença de repetições maiores não está preferencialmente associado a locais do cérebro afetados (90). Apesar de estar bem estabelecida uma forte correlação entre o tamanho da repetição, a gravidade da doença e a idade de inicio, ou seja quanto maior for o tamanho da repetição mais grave serão os sintomas e mais precoce será o seu aparecimento. Hoje sabe-se que deverão existir outros fatores modificadores genéticos e/ou ambientais que podem contribuir para as diferenças clínicas encontradas entre doentes. Curiosamente, na DMJ parece haver um efeito de dose, já que doentes apresentando dois alelos expandidos, ou seja homozigóticos para a mutação têm uma idade de início mais precoce e um fenótipo mais grave (91-96). Após a descoberta da sequência do gene ATXN3 passou a ser possível confirmar molecularmente o diagnóstico clínico da DMJ através da determinação do número de (CAG)n utilizando a técnica de polymerase chain reaction (PCR). Atualmente, estão disponíveis testes genéticos para doentes e indivíduos pré-sintomaticos que pertencem a famílias com doentes DMJ. Em alguns países como Portugal podem ser oferecidos aos casais em risco testes pré-natal ou pré-implantatorio para que possam fazer as suas escolhas relativamente à sua descendência já que, conforme foi referido anteriormente, a probabilidade de terem um filho afetado é de 50%. Indivíduos que desejarem realizar os diferentes testes genéticos deverão simultaneamente ser encaminhados para consultas de aconselhamento genético e avaliação psicossocial seguindo protocolos internacionais. Este aconselhamento torna-se particularmente importante em doenças dominantes de início tardio que permanecem sem tratamento pois o apoio médico, psicológico e psicossocial pode contribuir grandemente para a alteração da qualidade de vida dos doentes e dos seus familiares. 5. Proteína ATXN3 O gene ATXN3 codifica a proteína ataxina-3 (ATXN3), uma proteína de apenas 42 kDa. Esta proteína apresenta um segmento variável de glutaminas na região Cterminal que corresponde ao segmento CAG do gene ATXN3 (79), cuja expansão está associada à DMJ. A ATXN3 está conservada em vários organismos eucariotas incluindo plantas (97-98), no entanto, apenas a proteína humana contém uma cadeia de glutaminas longa o que indica que esta não é essencial para a função da proteína. 5.1 Isoformas da proteína ATXN3 As isoformas mais representativas da proteína ATXN3 distinguem-se por terem diferentes regiões carboxílicas, e são atualmente designadas 2UIM e 3UIM. A primeira é uma variante de splicing que corresponde ao clone MJD1a inicialmente descrito que inclui 10 exões (79), e contém um domínio Josephin, dois motivos de interação com a ubiquitina, a cadeia de poliglutaminas e uma região C-terminal hidrofóbica. Esta variante pode conter mais 16 aminoácidos dependendo da ausência de um codão stop prematuro devido a um polimorfismo muito frequente na população e passa a designar-se 2UIM-long. A isoforma 3UIM foi descrita por Goto e corresponde a uma variante de splicing MJD 1-1 que contém 11 exões e apresenta mais um UIM na região carboxílica (87). A isoforma 3UIM é largamente expressa (65) e é a principal isoforma encontrada a nível do encéfalo (99). Um estudo recente revelou que as duas principais isoformas, 2UIM e 3UIM, partilham a mesma função de desubiquitinação in vitro. Contudo, a variante 2UIM agrega mais facilmente e é mais rapidamente degradada pelo proteassoma. Estes dados indicam que sequências de aminoácidos diferentes conferem propriedade distintas às variantes proteicas da ATXN3, o que associado ao facto da sua expressão ser também diferenciada pode explicar porque só uma população específica de neurónios é afetada na DMJ. 5.2 Padrão de expressão A ATXN3 apresenta uma expressão ubíqua, ou seja, encontra-se distribuída tanto no SNC como em outros tecidos do organismo (65, 97, 100-104). A nível celular a ATXN3 pode ser encontrada no citoplasma e no núcleo (65, 101, 103, 105). Atualmente, existem dados que apoiam o facto da proteína normal se encontrar sobretudo no citoplasma, embora também seja possível a sua localização nuclear. A presença da proteína mutada no núcleo é essencial para a patogénese da doença (106-107), nesse local encontra-se em inclusões nucleares e é completamente imóvel formando verdadeiros agregados (64-65, 108). A presença da proteína no núcleo pode ser explicada pela existência de possíveis sinais de localização nuclear (NLS) na proteína ATXN3 nos resíduos 282-285 e/ou 273-286, este último confirmado por estudos funcionais (109). Uma vez no núcleo, a ATXN3 associa-se à matriz nuclear (103). Na proteína existem igualmente vários possíveis sinais de exportação nuclear (NES) que poderão opor-se à atividade dos NLS, o que explica a presença da proteína normal sobretudo no citoplasma. 5.3 Estrutura e domínios A região N-terminal da ATXN3 tem conformação globular e compacta, sobretudo em αhélice, em contraste com uma porção C-terminal, contendo as poliglutaminas mais flexível, destruturada e desorganizada (110-112). A região N-terminal encontra-se bastante conservada e contém um domínio Josephin, comum a 30 proteínas de diferentes espécies. Hofmann e os seus colaboradores através de um estudo bioinformático propuseram, pela primeira vez, que a ataxina-3 está estruturalmente relacionada com uma classe de proteases específicas da ubiquitina assumindo a mesma conformação das famílias de proteases UCH (Ubiquitin C-terminal hydrolase) e UBP (Ubiquitin specific protease), o “papain fold” (113). Este mesmo estudo mostrou que a ATXN3 mantém conservado o local de atividade catalítica destas proteases e permitiu prever que o domínio Josephin contém um local catalítico de protease cisteínica (Q9-C14-H119-N134), provavelmente envolvido na proteólise da ubiquitina, ou seja na hidrólise de ligações isopeptídicas entre monómeros de ubiquitina ou entre a ubiquitina e outras proteínas (113), observação posteriormente confirmada experimentalmente (112, 114-116). Assim, a ATX3 em conjunto com as restantes proteínas contendo o motivo Josephin foram agrupadas numa nova classe de enzimas de desubiquitinação (DUBs). Foi posteriormente demonstrado que o domínio Josephin é constituído por dois subdomínios, um catalítico e globular e outro com uma conformação essencialmente em gancho helicoidal (helical hairpin) (115-116). O domínio Josephin apresenta na sua superfície dois locais de ligação para a ubiquitina, o primeiro entre os dois subdomínios e o segundo contíguo mas na face oposta (117). A importância estrutural do domínio Josephin originou estudos da sua estabilidade conformacional e tendência para agregar. Um resultado surpreendente provou que este domínio apresenta um comportamento semelhante ao da ATXN3, no que diz respeito à estabilidade e às propriedades de agregação, ou seja, uma transição conformacional de α para β associada à agregação e dependente da temperatura e concentração (111). A região C-terminal da ATXN3 é parcialmente desorganizada, sobretudo na região que contém o segmento poliglutaminas, mas com elevado conteúdo de estrutura secundária nas regiões onde estão localizados os motivos de interação com a ubiquitina (UIMs), que se sabe serem em α-hélice (110, 112). Os domínios UIMs foram inicialmente encontrados na subunidade S5a (Rpn10) do complexo 19S do proteassoma, e estão conservados nos vários ortólogos da ATXN3, o que sugeriu a sua relevância na função normal da proteína. Na ataxina-3, existem dois UIMs localizados antes do segmento de glutaminas, e um outro localizado após o segmento de glutaminas apenas presente na variante proteica 3UIM (118-119). 5.4 Função e interações Apesar do número crescente de trabalhos publicados nos últimos anos tendo como objetivo o esclarecimento das propriedades biológicas da ATXN3, a sua exata função permanece por determinar. As hipóteses propostas para a função da ATXN3 são as seguintes: (i) vários estudos indicam que a ATXN3 pertence a uma classe de proteases da ubiquitina também designadas de enzimas de desubiquitinação (DUBs). As enzimas DUB estão implicadas na remoção de monoubiquitina ou poliubiquitinas de proteínas alvo e também na separação das ligações entre monómeros de ubiquitina. O processo de ubiquitinação é um mecanismo através do qual a célula regula várias atividades celulares, nomeadamente a degradação de proteínas misfolded e proteínas de semivida curta pelo proteassoma, a reparação do DNA, a remodelação da cromatina e o ciclo celular e vias de sinalização. A ATXN3 liga-se a cadeias com mais de 4 ubiquitinas através dos seus dois primeiros UIMs que atuam de uma forma sinérgica (114, 119-122). Foi demonstrado que nos neurónios, a ATXN3 liga-se a proteínas poliubiquitinadas, mais uma vez, de uma forma dependente dos UIMs (123). Quando os seus UIM estão mutados a capacidade de ligação à ubiquitina é perdida. Foi demonstrado in vitro que a ATXN3 pode clivar cadeias de poliubiquitina de substratos ubiquitinados, bem como, separar monómeros de ubiquitina de cadeias de poliubiquitina. Esta atividade de desubiquitinação é perdida após mutação da cisteína 14 do local catalítico (112, 114-116). Foi ainda possível verificar o aumento de proteínas poliubiquitinadas em ratinhos KO para a ATXN3 e em células expressando a proteína inativa (123-124). Vários resultados sugerem que a ATXN3 funciona como protease na edição das cadeias de ubiquitina, ou seja encurta o tamanho dessas cadeias em vez de as remover totalmente do substrato alvo (114, 125-127). Desta forma, é proposto que como DUB a ATXN3 recruta as proteínas poliubiquitinadas através dos seus UIMs que juntamente com o local 1 de ligação à ubiquitina situado no domínio Josephin posicionam corretamente as cadeias de ubiquitinas que serão assim expostas ao local catalítico do domínio Josephin responsável pela sua proteólise. O facto de não terem sido ainda encontrados o(s) substrato(s) alvo da desubiquitinação da ATXN3 limita de certa forma o seu enquadramento preciso neste mecanismo celular. (ii) Diversas evidências associam a ATXN3 com a via da ubiquitina-proteassoma, por exemplo, a inibição do proteassoma origina a coprecipitação de proteínas poliubiquitinadas juntamente com a ATXN3 (119, 121). Adicionalmente, as diferentes isoformas da proteína podem ligar-se ao proteassoma e a duas proteínashHR23 e VCPimplicadas no transporte de substratos para o proteassoma para posterior degradação (120). Os homólogos humanos -hHR23A e hHR23B - da proteína de levedura RAD23 interatuam com a ATXN3 através do domínio ubiquitin-like (UBL) (128). As proteínas hHR23A e hHR23B ligam-se ao 2º local de ligação à ubiquitina presente no domínio Josephin da ATXN3 (115, 128). As hHR23 interatuam ainda com a subunidade S5a do proteassoma (Rpn10) (129); ligamse à ubiquitina (130-131), a cadeias de poliubiquitina (132) e a proteínas poliubiquitinadas (133). A ATXN3 através da sua região C-terminal liga-se à VCP (valosin-containing protein)/p97, uma ATPase AAA envolvida no controlo da divisão celular, na fusão membranar, transporte vesicular e na via de degradação ubiquitinaproteassoma (120, 134-136). Foi assim proposto que a ATXN3 participaria num complexo que transporta proteínas para o proteassoma com vista à sua degradação. Adicionalmente, foi proposta que esta função possa estar relacionada em particular com a degradação de proteínas associada com o retículo endoplasmático (ERAD). O ERAD é o mecanismo através do qual ocorre a ubiquitinação de proteínas com defeitos de conformação ou elementos não complexados das vias de secreção que são exportadas do retículo endoplasmático (RE) para o citosol para serem degradadas pelo proteassoma. Sabe-se que o complexo VCP/ATXN3 interatua com componentes da membrana do RE controlando a exportação e a degradação de proteínas misfolded do RE (137-138). Foi assim porposto que o complexo VCP/ATXN3 pode servir para transferir substratos poliubiquitinados, após terem sido editados pela ATXN3, diretamente para o proteossoma ou para outras proteínas transportadoras tal como a hHRAD23A/B (120, 128). Outro aspeto interessante que tem vindo a ser estudado é o possível envolvimento da ATXN3 na regulação da formação de agressomas de uma forma dependente da sua atividade DUB (125, 139). Estes agressomas correspondem a proteínas misfolded agregadas junto ao centro organizador dos microtúbulos (MTOC). Os agressomas são 6.4 Envolvimento na maquinaria de transcrição A ATXN3 tem capacidade de se ligar ao DNA e, por outro lado, interatua com vários reguladores da transcrição. É por isso possível que a desregulação da transcrição contribua para a patogénese da DMJ. As inclusões insolúveis, principalmente nucleares, resultantes da agregação das proteínas mutadas recrutam entre outras proteínas, ativadores e repressores da transcrição, o que indica que o envolvimento da maquinaria de transcrição pode ocorrer de forma generalizada na patologia das doenças de poliglutaminas. Foi detetado o sequestro de ativadores/co ativadores transcricionais tais como TBP, CREB, CREB-binding protein (CBP) e TATA boxbinding protein-associated factor II 130 kDa (TAFII130) para as inclusões formadas pelas proteínas contendo o segmento de poliglutamina expandido (141, 170-172, 185186). O sequestro de ativadores transcricionais para as inclusões formadas pelas proteínas mutadas, pode ser de grande relevância quando estes se encontram em quantidades limitantes na célula como acontece, por exemplo, com a CBP (171). A ATXN3 inibe a acetilação das histonas. Contudo, quando está mutada pela expansão de poliglutamina este mecanismo de repressão da transcrição fica alterado, aumenta a acetilação da histona H3, aumentando também a transcrição. Este efeito foi observado quer em células quer em material humano (143). Em vários modelos celulares e animais DMJ foram reportadas alterações da expressão de vários genes relacionados com a maquinaria da transcrição reforçando a ideia da desregulação desta via nesta doença (98, 187). Contudo, a hipótese da desregulação da transcrição como mecanismo causador da DMJ necessita de mais investigação. 7. Estratégias terapêuticas A doença de Machado-Joseph, tal como todas as outras doenças de poliglutaminas, permanece sem cura. Contudo, o tratamento farmacológico e não farmacológico pode ser utilizado nestes doentes de forma a minimizar a sintomatologia e a melhorar a sua qualidade de vida (18, 188). Conforme está padronizado em guidelines internacionais, aos doentes DMJ e familiares em risco deve ser oferecido aconselhamento genético. Estes doentes devem ser informados da forma como se transmite a doença, do risco para os seus filhos e outros membros da família, bem como, da atual impossibilidade de tratamento curativo. Aos familiares em risco pode ser oferecida a possibilidade de realizarem testes preditivos se assim o desejarem. Os casais que pretendem ter filhos têm a possibilidade de realizar o diagnóstico pré-natal ou em alternativa o teste préimplantatorio com seleção de embriões. Atualmente, estão disponíveis tratamentos para os diferentes sintomas da doença. Por exemplo, na depressão podem ser utilizados antidepressivos ou em alternativa psicoterapia comportamental. As alterações do sono devem ser estudadas por polissonografia e tratadas em consonância. Por exemplo, no síndrome das pernas inquietas podem ser utilizados agonista da dopamina e/ou levodopa. A dor deve ser tratada consoante a sua etiologia, músculo-esqueletica, neuropática, devido à distonia ou mista. O Parkinsonismo, a distonia e espasticidade podem ser tratados com Levodopa. Como alternativa podem ser utilizados anticolinérgicos, benzodiazepinas, baclofeno ou carbamazepina. As caimbras podem ser tratadas com magnésio, mexiletina ou carbamazepina. A fadiga pode melhorar com tratamento farmacológico com metilfenidato, modafinil e amantidina, ou não farmacológico, exercício físico, educação e modificação comportamental. Os doentes podem também beneficiar de fisioterapia e terapia da fala para avaliar e melhorar a sua disartria e disfagia. A maioria dos doentes vão precisar de alterações em casa para assegurar a sua segurança. A médio prazo será necessária a utilização de auxiliadores da marcha como canadianas ou andarilhos e mais tarde cadeira de rodas. Como é evidente, o tratamento sintomático não consegue aliviar totalmente o sofrimento destes doentes, e por isso torna-se urgente conseguir-se um tratamento curativo para esta doença. Há vários anos que os cientistas se empenham na obtenção e estudo de modelos celulares e animais que melhor imitem as características fenotípicas da DMJ com vista a encontrarem possíveis agentes terapêuticos preventivos. Várias estratégias estão atualmente ser utilizadas em diferentes estudos com modelos da doença. Suportando a ideia de que o silenciamento do gene mutado pode ser uma terapêutica efetiva nesta doença, um estudo realizado por Boy e colaboradores demonstrou que o fenótipo de um ratinho transgénico condicional expressando o gene ATXN3 humano mutado, foi revertido após se “desligar” a expressão da proteína mutada (189). A técnica de silenciamento pós-transcricional de genes por RNA interference (RNAi) permite silenciar de uma forma eficiente vários genes causadores de doenças genéticas, através da degradação do mRNA e consequente diminuição da síntese das respetivas proteínas mutadas (190). Foi já testada a técnica de RNAi em transcritos do gene ATXN3 em ratos modelo conseguindo-se suprimir a ATXN3, diminuir o número de inclusões e a degeneração (191-193). Curiosamente, o silenciamento em simultâneo da proteína mutada e normal foi bem tolerada, o que indica que a estratégia de suprimir a expressão do gene ATXN3 mesmo que de forma não especifica, pode ser considerada como uma estratégia terapêutica eficaz. Contudo, esta hipótese terá que ser melhor estudada, antes de se passar para ensaios clínicos humanos. Adicionalmente, a técnica RNAi foi bem sucedida num modelo de ratinhos transgénicos DMJ contendo um fragmento C-terminal ATXN3 já que conseguiu melhorar o fenótipo motor e as anomalias patológicas mesmo quando realizada em estadios avançados da doença (194). Contudo, um outro modelo animal em ratinho DMJ que se aproxima mais do modelo da doença, a técnica de RNAi conseguiu silenciar o gene no cerebelo sem que, no entanto, consiga anular o fenótipo motor (195). Outra estratégia que pode ser utilizada para inibir a expressão da ATXN3 mutada utiliza um diferente tipo de moléculas, os oligomeros antisense complementares ao mRNA, que atuam com base nas diferenças de tamanho da sequência CAG. Estas moléculas foram já testadas em fibroblastos mostrando uma redução dos níveis da ATXN3 in vitro (196-197). Foi igualmente proposto, um novo método de modificação de proteínas que consiste na remoção da repetição de poliglutaminas expandida da ATXN3 através de uma técnica de exon skipping sem alterar a função normal da proteína (198). A vantagem desta técnica é que mantém os níveis de mRNA e da proteína na célula, já que apenas uma porção da proteína é retirada, mas não foi ainda avaliada a possibilidade de modificar o fenótipo de animais DMJ (198). Uma alternativa às técnicas referidas anteriormente são os procedimentos que permitem o aumento da degradação da proteína mutada, por indução da autofagia ou da via ubiquitina-proteassoma. Um éster da rapamicina, o temsirolimus, aumenta a degradação da ATXN3, reduz o número de agregados e melhora o fenótipo motor de um modelo da DMJ em ratinhos por aumento da autofagia (199). Outro aspeto que suporta a indução de autofagia como terapêutica eficaz é o facto da sobreexpressão da proteína beclina-1 aumentar a degradação da proteína ATXN3 mutada, diminuir os agregados por ela formados e melhorar coordenação motora em modelos de ratinho principalmente quando administrada em fases iniciais da doença (200). Recentemente, o composto H1152, através da indução do proteassoma conseguiu reduzir os níveis da ATXN3 mutada e mostrou capacidade de redução da morte neuronal e do fenótipo neurológico de ratinhos DMJ (201). Um outro estudo mostrou a possibilidade da utilização do lítio num modelo DMJ em Drosophila (202). Este composto foi utilizado num estudo clinico fase II/III mas, segundo os resultados publicados, não provocou alterações significativas na progressão da doença utilizando a escala “Neurological Examination Score for the Assessment of Spinocerebellar Ataxia” (NESSCA) após 48 semanas de estudo. Contudo, o estudo foi limitado no tempo e em termos de amostra (62 doentes divididos por dois grupos de estudo) (203). À medida que o mecanismo patogénico vai sendo desvendado, outras estratégias possíveis vão surgindo, já que certos elementos chave da patologia que participam na formação de agregados, desregulação da transcrição, alterações da sinalização e dos padrões de interação proteica podem ser sérios candidatos a alvos terapêuticos. Outros candidatos a alvos terapêuticos na DMJ são também os genes modificadores da doença. Por exemplo, sabe-se que as proteínas chaperones podem neutralizar a toxicidade induzida por proteínas misfolded ou por agregados in vitro e in vivo e por isso tornam-se um alvo terapêutico atrativo (149, 204-205). Por exemplo, em Drosophila e C. elegnas foi observada diminuição da agregação da ATXN3 após tratamento com o composto 17-(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), um inibidor da HSP90 (heat shock protein) que aumenta a expressão de várias chaperones (206-207). Um composto análogo o 17-DMAG utilizado em ratinhos DMJ fez com que melhorassem os aspetos motores, para além da diminuição da proteína mutada e redução dos agregados nucleares. Contudo, embora tenha havido um atraso do aparecimento dos défices motores em 8 semanas, o efeito protetor foi perdido às 30 semanas de vida destes ratinhos DMJ (208). Na tentativa de diminuir a produção de fragmentos tóxicos da ATXN3 pelas calpainas, um grupo de trabalho testou a sua inibição pela calpastatina, em modelos de ratinho transgénico DMJ, verificando uma diminuição da toxicidade e da agregação proteica (209). Da mesma forma, num outro modelo de ratinho DMJ quando os inibidores endógenos das calpainas são retirados o número de agregados nucleares aumenta, assim como, a neurodegeneração havendo agravamento do fenótipo dos animais (182). Outra possibilidade em estudo tem como objetivo atuar na desregulação da transcrição, outro mecanismo alterado na DMJ, focando-se na reversão da hipoacetilação das histonas H3/H4 em ratinhos DMJ tratados com butirato de sódio, um inibidor da desacetilação de histonas (HDAC). Este composto consegui induzir um atraso no aparecimento dos sintomas, aumento da sobrevida e progresso na performance motora (210). Outro inibidor HDAC, o valproato foi testado em vários modelos DMJ com sucesso, com a vantagem de já ser usado há várias décadas em doentes com epilepsia e doença bipolar, sendo portanto um composto seguro e bem tolerado (206, 211). Uma vez que, é possível que, a homeostasia do cálcio esteja alterada na DMJ, uma outra estratégia foi analisada em ratinhos DMJ, utilizando Dantroleno com o objetivo de estabilizar a sinalização do Ca+ intracelular, permitindo uma melhoria do fenótipo motor e redução da perda neuronal (212). Um ativador de canais de potássio dependentes do cálcio, o SKA-31 conseguiu, para além de melhorar a função motora de ratinhos DMJ, corrigir as alterações na despolarização das células Purkinje (213). Por último, foi descrita a possibilidade da cafeína através do antagonismo dos recetores Adenosina A2A conseguir diminuir a neuropatologia num modelo ratinho SCA3 (214). Devido à sua administração segura os autores propõem que esta substância possa ser implementada como medida profilática. Os trabalhos referidos anteriormente mostram todo o esforço que nos últimos anos tem vindo a ser aplicado no sentido de se encontrar o tratamento da DMJ. Embora haja ainda um longo percurso a percorrer, o elevado número de trabalhos publicados nos últimos anos e os resultados por eles revelados criaram a expectativa de que é possível encontrar uma cura para esta doença devastadora num futuro próximo. Qualquer fármaco que possa ser utilizado na prevenção ou tratamento da DMJ muito provavelmente terá sucesso em outras doenças de poliglutaminas tais como a Doença de Huntington. Conclusão Este ano completam-se 20 anos desde que foi descoberto o gene MJD1/ATXN3 responsável pela DMJ. A partir dessa extraordinária descoberta passou a ser possível oferecer aos doentes a confirmação molecular do diagnóstico clínico e disponibilizar testes preditivos aos familiares em risco. Para além disso, a descoberta da mutação responsável pela doença, um segmento de repetições de CAGs permitiu integrar a DMJ num leque de nove doenças neurodegenerativas designada no seu conjunto de doenças de poliglutaminas. Esta classe, que inclui igualmente a doença de Huntington tem sido extensivamente estudada, pela particularidade de terem por base proteínas contendo segmentos repetitivos de glutaminas que lhes confere propriedades tóxicas e que as leva a precipitar em inclusões neuronais. A possibilidade de haver um mecanismo neurotóxico comum a estas doenças foi apoiada pela presença de inclusões intracelulares em todas estas doenças. Se inicialmente parecia óbvio que os agregados eram tóxicos, atualmente coloca-se a hipótese de estes serem um epifenómeno ou até mesmo um processo benéfico para a célula. Na verdade, só o cabal esclarecimento da função das proteínas envolvidas em cada uma destas patologias e da forma como o segmento poliglutaminas pode alterar essa mesma função vai permitir o conhecimento do mecanismo patogénico subjacente. Assim, a ATXN3 passou a ser alvo dos mais variados estudos estruturais e de função e atualmente sabe-se que atua como enzima de desubiquitinação participando em mecanismo de homeostasia celular e na regulação da transcrição. Nos últimos anos, foram criados inúmeros modelos celulares e animais na tentativa de recriarem a DMJ. Estes modelos permitiram o reconhecimento da participação da ATXN3 em diversos mecanismos celulares e oferecem uma oportunidade única de se testarem diversas estratégias terapêuticas preventivas. Estas estratégias atualmente estão focadas na tentativa de silenciar a expressão do gene mutado ou diminuir os níveis da proteína alterada. Em alternativa, estão a ser testados agentes farmacológicos que possam interferir nas vias celulares provavelmente envolvidas na patogénese da doença. Por enquanto, pode ser oferecido aos doentes aconselhamento genético e apoio psicossocial, tratamentos farmacológicos e não farmacológicos que aliviem os seus sintomas. Apesar do longo caminho percorrido, e dos resultados promissores entretanto obtidos é ainda necessário ultrapassar várias etapas até que se possam iniciar ensaios clinico em doentes DMJ. Na verdade, há uma forte esperança de que estratégias terapêuticas bem sucedidas em qualquer uma das doenças de poliglutaminas possam ser utilizada na prevenção/tratamento das restantes doenças dessa classe. Bibliografia 1. Kremer EJ, Pritchard M, Lynch M, et al. Mapping of DNA instability at the Fragile X to a trinucleotide repeat sequence (pCCG)n. Science 1991;252:1711-1714. 2. Oberle I, Rousseau F, Heitz D, et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science 1991;252:1097-1102. 3. Verkerk AJMH, Pieretti M, Sutcliffe JS, et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhbiting length variation in fragile X syndrome. Cell 1991;65:905-914. 4. Yu S, Pritchard M, Kremer E, et al. 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Doença Modo de Gene Locus Proteína Tamanho da repetição CAG transmissão normal mutada Atrofia muscular espino-bulbar recessiva ligada ao X AR Xq13-21 receptor de androgénio 9-36 38-66 (Doença de Kennedy) Doença de Huntington autossómica dominante HD 4p16.3 huntingtina 6-35 36-121 Atrofia dentatorubropalidoluysiana autossómica dominante DRPLA 12p13-31 atrofina-1 6-35 49-88 (Sindroma de Haw-River) Ataxia espinocerebelosa tipo 1 autossómica dominante ATXN1 6p23 ataxina-1 6-44 39-82 Ataxia espinocerebelosa tipo 2 autossómica dominante ATXN2 12q24.1 ataxina-2 15-31 36-63 Ataxia espinocerebelosa tipo 3 autossómica dominante ATXN3 14q32.1 ataxina-3 12-44 54-86 (Doença de Machado-Joseph) Ataxia espinocerebelosa tipo 6 autossómica dominante CACNA1A 19p13 subunidade canal cálcio 1A 4-18 21-33 Ataxia espinocerebelosa tipo 7 autossómica dominante ATXN7 13p12-13 ataxina-7 4-35 37-306 Ataxia espinocerebelosa tipo 17 autossómica dominante TBP 6q27 TATA binding protein 30-42 45-63 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer à minha família especialmente aos meus pais por todo o apoio que me deram ao longo destes anos. Ao meu irmão, à minha cunhada Paula e sobrinha Inês agradeço o carinho com que sempre me brindaram. À Doutora Carolina Garrett agradeço-lhe a disponibilidade e por ter aceite a minha orientação. Um especial agradecimento aos meus colegas de curso ano 2008/2014 pelo excelente ambiente que me proporcionaram durante estes 6 anos. Ao Paulo pela compreensão e por ter estado sempre ao meu lado. Anexos Anexo Normas de candidatura Revista SINAPSE 1. Os trabalhos candidatos a publicação serão inéditos, e não deverão ser enviados para outras publicações. 2. Deverão ser remetidos por correio electrónico, em documentos anexos (attached files) Microsoft WordTM, em qualquer versão actual. 3. Deverão ser evitados símbolos, sublinhados, palavras em maiúsculas, bolds, itálicos, notas de topo ou de rodapé, e artifícios formais. 4. As páginas não deverão ser numeradas. 5. Deverão ser redigidos em português ou em inglês. Poderão, excepcionalmente, aceitar-se trabalhos em francês ou espanhol. 6. Da primeira página constarão: título do trabalho, nome próprio, apelido, departamento ou serviço, instituição, profissão, cargo, endereço, telemóvel e correio electrónico de todos os autores. 7. A segunda página incluirá: o título do trabalho, o nome dos autores, o resumo, as palavraschave e o título de cabeçalho; a morada institucional e o endereço de correio electrónico a incorporar no artigo. 8. A terceira página será a versão em inglês da segunda página, se o artigo foi redigido em português (e vice-versa). Se o artigo for redigido em francês ou espanhol, a terceira e quarta página serão versões em português e Inglês, respectivamente. 9. As restantes folhas incluirão as diferentes secções do trabalho. Os trabalhos originais incluirão as seguintes secções: introdução/objectivos, metodologia, resultados, discussão/conclusões e bibliografia. Os casos clínicos serão estruturados em introdução, caso clínico, discussão e bibliografia. As revisões incluirão, pelo menos, introdução, desenvolvimento, conclusões e bibliografia. Os editoriais e as cartas estarão isentos de organização em secções. No texto das secções, a identificação institucional será evitada, podendo ser acrescentada, se imprescindível, no fim do processo de avaliação e antes da publicação do artigo. 10. As tabelas e figuras deverão ser enviadas em documento adicional Microsoft WordTM, uma por página, precedidas por uma página que inclua as notas correspondentes. As figuras serão enviadas em ficheiros GIF ou JPEG. 11. Os agradecimentos ou menções particulares constarão em página própria. 12. Os compromissos particulares ou institucionais (patrocínios, financiamentos, bolsas, prémios) serão expressos obrigatoriamente em página adicional.