Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem

Monitorização de parâmetros físico- -químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem Rita Ferreira Ramos Marinho da Rocha Mestrado em Química Departamento de Química e Bioquímica 2014 Orientador Luis Guilherme de Lima Ferreira Guido Professor Auxiliar do Departamento de Química e Bioquímica Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________ FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem III Agradecimentos À Unicer e ao Requimte por permitirem que este projeto se concretizasse. Ao Professor Luís Guido pela orientação e preciosos ensinamentos mas principalmente por toda a confiança e responsabilidade que depositou em mim durante este ano, valorizando sempre o meu potencial, e pelo interesse que demonstrou constantemente no sucesso da minha vida académica e profissional, incentivando-me sempre a trabalhar com dedicação de modo a alcança-lo em pleno. Aos meus colegas do QuaQua, Daniel, Inês, Luís, Manuela, Rui César e Rui Ramos, pela amizade, boa disposição, paciência, ajuda infindável e inestimável e pelos valiosos conselhos que levo com muito carinho para a minha vida futura. Ao Zé Miguel, pelo companheirismo e por me ajudar a “carregar” este projeto às costas, pela troca de experiências académicas e perspetivas futuras e por sempre se mostrar tão pronto a auxiliar-me no que fosse necessário. À Andreia e à Inês, pela tardes de trabalho no laboratório com sorrisos, cantorias e confidências à mistura, por me permitirem ensinar-lhes o pouco que sei, aprendendo também com elas, por me deixarem orgulhosa, como uma “mãe-galinha”, depois de serem tão bem recompensadas pelo seu trabalho árduo mas, especialmente, pela amizade que criámos e que me motivou ainda mais a levar a cabo este projeto com afinco. Às minhas amigas, por aguentarem a minha companhia tanto em momentos de empolgação como de cansaço e, sobretudo, pelas palavras de força e motivação para ultrapassar este desafio com distinção, fazendo-me sorrir até nos dias mais cinzentos e sentir-me realmente abençoada por as ter na minha vida. E, finalmente, aos meus queridos pais, a quem devo tudo, por me apoiarem em todas as decisões que tomo e incentivarem desde cedo a almejar sempre mais e melhor para o meu futuro. A todos aqueles que me acompanharam ao longo deste ano letivo e contribuíram para a realização deste projeto e para a minha formação académica e pessoal, direta ou indiretamente, o meu muito obrigado! FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem IV FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem V Resumo A cevada é a matéria-prima primordial utilizada no fabrico de cerveja e, em unidades industriais denominadas de malterias, esta é transformada em malte, mediante um conjunto de operações intitulado de maltagem. É de notar que o malte contribui fortemente para as características da cerveja, uma vez que é o dador de proteínas responsáveis pela espuma, influencia a estabilidade de aroma/gosto, muitos dos seus compostos azotados e açúcares vão contribuir para a coloração e perfil aromático, enquanto outros componentes fornecem viscosidade ao meio, contribuindo para a sensação peculiar da bebida na boca do consumidor. Este trabalho teve como objetivo monitorizar o grão de cevada/malte proveniente de diferentes etapas do processo de maltagem através da análise de diversos parâmetros físico-químicos, por espectrofotometria de UV-Vis ou por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). No caso da cevada e do malte, esses parâmetros incluem a determinação da atividade da lipoxigenase, a determinação do teor de polifenóis totais e a determinação da atividade antioxidante. Já no mosto realizaram-se igualmente alguns ensaios como a determinação do poder redutor e a quantificação do potencial nonenal. Por fim, surgiu também a necessidade de correlacionar todos estes parâmetros estudados, assim como alguns adicionais, determinando o grau de associação existente entre as diversas variáveis em análise. Dos resultados obtidos conclui-se que, a etapa de aquecimento (pós “break point”), em condições de elevada humidade (42-45%) contribui para um aumento da capacidade antioxidante do malte. Contudo, na etapa de germinação, a atividade da LOX é diminuída para menores teores de humidade (39-40%) conduzindo a uma menor produção de E-2-nonenal. Palavras-chave: cevada, malte, mosto, potencial nonenal, lipoxigenase, polifenóis, atividade antioxidante, poder redutor, correlação de Pearson, correlação de Spearman. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem VI FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem VII Abstract Barley is the primary raw material used in the brewing of beer and it is converted to malt, in industrial plants named malt houses, through a set of operations called malting. It should be noted that malted barley strongly contributed to the characteristics of beer, since it is the donor of proteins responsible for foam, influences the flavour stability, many of its sugars and nitrogen compounds will contribute to the coloring and aromatic profile, while others provide viscosity to the mean, contributing to the peculiar sensation in the mouth of the consumer. This study aimed to monitor the grain of barley/malt from different stages of the malting process through the analysis of several physical-chemical parameters, by UV-Vis spectrophotometry or by high performance liquid chromatography (HPLC). In the case of barley and malt, these parameters include the determination of the lipoxygenase activity, the determination of total polyphenolic content and the determination of the antioxidant activity. As regarding the wort, some tests were carried out as well such as the determination of the reducing power and the quantification of the nonenal potential. Finally, there was the need to correlate all these studied parameters, as well as some additional, by determining the degree of association between several variables in analysis. From the results obtained one can conclude that the heating step (post break-point) of the malting process in high moisture (42-45%) conditions contributes to an increase in the antioxidant capacity of malt. However, in the germination step, the activity of LOX is decreased by applying lower moisture contents (39-40%) leading to a lower production of E-2-nonenal. Keywords: barley, malt, wort, nonenal potential, lipoxygenase, polyphenols, antioxidant activity, reducing power, Pearson correlation, Spearman correlation. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem XIV FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem XV Lista de Abreviaturas 13-LOOH – 13-hidroperoxi-ácido 9-LOOH – 9-hidroperoxi-ácido DCI – 2,6-diclorofenolindofenol EAG – Equivalentes de Ácido Gálico ET – Equivalentes de Trolox FRAP - Ferric Reducing Antioxidant Power HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (“High Performance Liquid Chromatography”) ITT – Indicator Time-Test LOX – Lipoxigenase NP –Potencial Nonenal (“Nonenal Potential”) r – Coeficiente de correlação de Pearson SPSS – Statistical Package for Social Sciences TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazina Trolox – ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico Tween 20 – Polissorbato 20 ρ – Coeficiente da correlação de Spearman σ – Desvio padrão Sig. – Significância da correlação FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem XVI FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 1 1. Introdução 1.1. Aspetos gerais sobre a cerveja ............................................ 3 1.2. O processo cervejeiro........................................................... 4 1.2.1. Matérias-primas .............................................................. 4 1.2.2. Maltagem ........................................................................ 6 1.2.3. Brassagem ................................................................... 11 1.2.4. Fermentação, Enchimento e Acondicionamento ........... 12 1.3. O envelhecimento da cerveja ............................................. 13 1.3.1. E-2-nonenal e Lipoxigenase ......................................... 14 ________________________________________________________ FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 2 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 3 1. Introdução 1.1. Aspetos gerais sobre a cerveja A cerveja é uma bebida com milhares de anos de existência, produto da mais antiga atividade biotecnológica de que há memória. A sua produção, feita durante muitos séculos de um modo empírico desde os tempos da Babilónia Antiga, alterou-se decisivamente no século XIX, quando métodos e conceitos científicos foram adotados pelos produtores de então. Graças a eles foi possível começar a obter cerveja com prolongada estabilidade, mais reprodutível e de qualidade mais consistente. Como resultado destes avanços, as unidades produtoras foram-se tornando cada vez maiores, originando o aparecimento de uma verdadeira indústria [1]. Posto isto, a cerveja pode então ser definida como uma bebida obtida por fermentação alcoólica, mediante leveduras selecionadas do género Saccharomyces, de um mosto preparado a partir de malte de cereais, principalmente cevada, e outras matériasprimas amiláceas ou açucaradas, ao qual foram adicionadas flores de lúpulo e/ou seus derivados e água potável [2]. É o resultado de um processo biotecnológico, tradicionalmente descontínuo, que engloba um conjunto de processos biológicos e enzimáticos, realizados com o apoio de diversas operações unitárias [1]. Equacionar a produção de um tipo de cerveja implica, basicamente, estudar qual o grau alcoólico que deverá ter, qual o seu perfil aromático e sensação sensorial que deve deixar na boca e qual a estabilidade (biológica, de espuma, coloidal e organolética) para ela pretendida. Quantificados todos estes parâmetros, a monitorizar, cuidada e regularmente, logo que se atinge a fase de produção industrial, importa avaliar as características (tipos e exigências qualitativas) das matérias-primas e condições processuais que são exigidas (maltes e forma de lúpulo a adquirir, perfil do mosto a fabricar, estirpe e concentração da levedura a empregar, diagrama de fermentação versus fermentadores disponíveis). As exigências de estabilidade coloidal e biológica e as condições de armazenagem são igualmente avaliadas, bem como a estabilidade de aroma/gosto requerida para o período de tempo exigido para a comercialização [1]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 4 1.2. O processo cervejeiro 1.2.1. Matérias-primas As principais matérias-primas utilizadas no processo de fabrico de cerveja são a cevada, o lúpulo, as leveduras e a água. A cevada é a matéria-prima primordial empregada neste processo, uma vez que é responsável pelo sabor único e cor final da cerveja, fatores que depende em grande parte da cor adquirida pelos grãos durante o processo de maltagem. A mais apreciada para maltar é a cevada dística (Figura 1), ou de duas fileiras (Hordeum distichum), devido aos seus grãos melhor desenvolvidos e glumelas (envelopes) mais finas. Outras características que tornam este cereal ideal para o fabrico de cerveja incluem um elevado conteúdo em amido, elevada taxa de formação de enzimas e elevada resistência mecânica no processo, entre outras [1]. Figura 1 – Cevada dística. (Retirado de: http://mynameisbeer.wordpress.com/2010/11/) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 5 O lúpulo é outra matéria-prima fundamental para a produção de cerveja. Caracterizase por ser uma planta trepadeira e também por conter resinas relevantes para as características da cerveja, uma vez que lhe conferem o seu amargor típico. O lúpulo possui ainda um papel na formação de espuma, bem como funções antissépticas, que contribuem para uma maior estabilidade organolética da cerveja. As leveduras são responsáveis pelo processo de fermentação da cerveja, transformando os açúcares do mosto em álcool e dióxido de carbono. Este último é muito importante na formação de espuma e contribui para a estabilização do sabor da cerveja, além de ser um conservante natural [1,3]. A água é o principal constituinte da cerveja, pelo que a qualidade da água utilizada no processo de fabrico da cerveja assume uma importância vital na qualidade do produto final. A água contém sais minerais dissolvidos que podem afetar o carácter, a qualidade e o sabor da cerveja, sendo que podem conferir-lhe gosto salgado ou metálico e podem ainda originar alterações do valor do pH durante o processo do seu fabrico, condicionando assim todos os equilíbrios químicos que ocorrem neste processo [3]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 6 1.2.2. Maltagem A maltagem consiste na transformação de cevada em malte, processo realizado em unidades industriais apropriadas, denominadas de malterias (Figura 2). Na maltagem são relevantes três operações: a molha, a germinação e a secagem. Figura 2 – Exemplo de uma malteria, neste caso, disposta em torre. (Adaptado de: Beer: Tap Into the Art and Science of Brewing por Charles Bamforth, 2ª Edição, Pág. 101) i) Molha A molha prepara o grão para a etapa fundamental da germinação. O grão, inicialmente com valores de humidade da ordem dos 12 a 14%, é posto em contacto com água, durante cerca de dois dias, aumentando o seu teor até cerca de 42% [1]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 7 Esta etapa apresenta outros objetivos como a lavagem do grão, a remoção de resíduos, o arrastamento de grandes quantidades de micro-organismos que se desenvolvem no envelope do grão e também de outras substâncias que lá se encontram e que podem ser prejudiciais para a cerveja [4]. ii) Germinação No final da molha dá-se o início da germinação, que pode ser definida como um processo biológico que vai tornar as paredes celulares do grão bastante mais friáveis e facilita a extração do amido. Na sua estrutura são evidentes duas grandes zonas: o embrião e o endosperma (Figura 3) [1]. Figura 3 – Imagem representativa do grão de cevada e das modificações que ocorrem no endosperma, durante a germinação. (Adaptado de: http://brejadobreda.blogspot.pt/2013/05/maltear-ou-torrar-eis-questao.html) O embrião, fonte de vida, vai ser sede de ordens hormonais que desencadeiam as reações que levam à parcial degradação enzimática do amido armazenado no endosperma, originando açúcares. Estes vão ser a fonte de energia indispensável para o crescimento da pequena raiz (radícula) e do pequeno caule (caulículo) a formar. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 14 1.3.1. E-2-nonenal e Lipoxigenase Ao longo dos anos, um dos aldeídos que tem merecido maior atenção por parte da indústria cervejeira é o E-2-nonenal (Figura 7), devido à sua influência nas características organoléticas da cerveja, como referido anteriormente. Figura 7 – Estrutura química do E-2-nonenal. (Retirado de: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/w321303?lang=en®ion=PT) Uma característica importante deste aldeído é o seu baixo limite de perceção sensorial, já que foi comprovado que uma concentração de E-2-nonenal de 0,1 µg/L é suficiente para tornar percetível o aroma/gosto a papel/cartão na cerveja [3]. Apesar dos numerosos estudos que têm sido desenvolvidos nesta área, a elucidação dos mecanismos que conduzem ao aparecimento do E-2-nonenal no decorrer do envelhecimento da cerveja está longe de ser consensual entre a comunidade científica que se tem dedicado a esta problemática. No entanto, apesar da controvérsia associada, atualmente está estabelecido que a principal origem dos compostos carbonílicos são os lípidos das matérias-primas [3]. Na cerveja e no mosto, os únicos substratos lipídicos de importância são o ácido linoleico (C18:2) e o linolénico (C18:3), que provêm da cevada maltada. Estes ácidos são maioritariamente libertados dos triacilgliceróis pela atividade das lípases presentes na cevada e no malte [6]. A principal enzima implicada na oxidação dos lípidos gordos é a lipoxigenase (LOX), tendo sido estabelecida uma correlação entre a atividade lipoxigenásica do malte e o nonenal da cerveja envelhecida. A medição do “nonenal potencial”, definido como a capacidade de um malte formar nonenal a pH 4 durante 2 horas a 100oC, proposta por Drost et al. em 1990, revelou-se um bom indicador do envelhecimento da cerveja produzida, uma vez que se correlaciona bem com a atividade lipoxigenásica do malte [7]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 15 A oxidação dos ácidos gordos insaturados do malte é igualmente considerada como o mecanismo principal responsável pela formação de E-2-nonenal durante os primeiros estágios da brassagem. Essa oxidação pode ser enzimática ou química (autoxidação) e ocorre no princípio da maltagem e da brassagem, dando origem à formação de hidroperóxidos, compostos que estão presentes em baixa concentração no grão nãomaltado (Figura 8) [7,8,9]. Figura 8 – Vias de formação do E-2-nonenal, a partir de ácidos gordos insaturados. Na reação por via enzimática, intervêm as lipoxigenases e a lipase do malte, que desempenham um importante papel na produção de hidroperóxidos durante a brassagem [10]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 16 A cevada germinada contém duas formas da enzima lipoxigenase, nomeadamente a LOX-1 e a LOX-2 [11]. A LOX-1 está presente na cevada não-maltada e a sua atividade aumenta durante a germinação, tendo um pH ótimo entre 5,9 e 7,8 e uma temperatura de ação de 45oC, permanecendo estável até cerca de 50oC. Por outro lado, a LOX-2 só se desenvolve durante a etapa da germinação, uma vez que é sintetizada durante a maltagem, e é menos termoestável do que a LOX-1 [9]. Devido à sua sensibilidade a altas temperaturas, a maioria da atividade da LOX é perdida durante a secagem, sendo que a atividade restante, presente no malte, se deve essencialmente à LOX-1 e pode ser a principal causa da oxidação dos ácidos gordos durante a brassagem [12,13]. A LOX-1 está na origem de 90% do 9-hidroperoxi-ácido (9-LOOH) e a LOX-2 origina preferencialmente o 13-hidroperoxi-ácido (13-LOOH). Uma vez formados, os hidroperóxidos podem degradar-se por via radicalar ou sob a ação de enzimas como a hidroperóxidoliase (pouco presente no malte) para formarem diversos aldeídos ou outras estruturas. O 9-hidroperoxi-ácido conduz à formação posterior de E-2-nonenal [14] (Figura 9). FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 17 Lípidos Ácido Linoleico 13-LOOH 9-LOOH mono, di, trihidroxi-ácidos E-2-nonenal mono, di, trihidroxi-ácidos compostos carbonílicos compostos carbonílicos Lipase LOX-1 LOX-2 O2 O2 Via enzimática Via não-enzimática Via não-enzimática Figura 9 – Formação do E-2-nonenal por transformação do 9-hidroperóxido do ácido linoleico e por ação da lipoxigenase. Durante a empastagem, o ácido linoleico é transformado em die trihidroxi-ácidos pela LOX-1 e uma enzima adicional, mais estável que esta. Este fator enzimático está relacionado com a peroxidase (POX) que usa os hidroperóxidos dos ácidos gordos como substrato e catalisa as hidroxialquilações sem a presença de oxigénio. Por sua vez, os novos hidroxi-ácidos podem ser degradados não-enzimaticamente em vários compostos carbonílicos. Sabe-se também que o 9-LOOH se transforma em E-2nonenal por ação da enzima 9-hidroperóxido liase (9-HPL) [15,16,17]. Durante a germinação da cevada, surge a hidroperóxido isomerase, catalisando a transformação dos hidroperoxi-ácidos a α-hidroxi-cetonas. As α-hidroxi-cetonas podem ser convertidas não enzimaticamente a mono-, die trihidroxi-ácidos. Apesar da isomerase referida ser encontrada no malte, há indícios de que se encontra fortemente ligada a uma fração insolúvel da cevada e não é libertada na fração solúvel durante a empastagem. Assim, assume-se que esta enzima não está envolvida nas transformações dos hidroperoxi-ácidos durante esta etapa [18]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 18 Finalmente, os ácidos linoleico e linolénico, esterificados em triacilgliceróis, podem também ser oxidados pela lipoxigenase. A presença e concentração de hidroxi-ácidos gordos esterificados em triacilgliceróis ou fosfolípidos na cevada e no malte aumentam durante o armazenamento da cerveja, o que leva a crer que a oxidação lipídica tem origem na ação desta enzima em questão. Estes lípidos oxidados são também percursores de compostos carbonílicos no mosto [19,20,21,22]. A autoxidação de ácidos gordos leva ao aparecimento dos mesmos compostos obtidos pela via enzimática descrita anteriormente. A reação radicalar inclui uma etapa de iniciação (favorecida pela presença de metais, luz, temperatura, …), uma etapa de propagação (etapa limitante, favorecida para ácidos gordos insaturados) e uma etapa de terminação. Os hidroperóxidos formados, muitos instáveis, decompõem-se novamente originando principalmente aldeídos [23]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 19 O mecanismo geral de transformação do ácido linoleico em E-2-nonenal, tanto na maltagem como na empastagem, por ação da lipoxigenase ou por autoxidação, está exemplificado na Figura 10 e foi proposto por Guido et al. em 2004 [24]. Figura 10 – Mecanismo de produção do Nonenal Potencial Residual no malte (“MALT-RNP”) durante a fase de secagem do processo de secagem (“KILNING”) e durante a empastagem (“MASHING”) (Retirado de: Guido, L., Boivin, P., Benismail, N., Gonçalves, C., & Barros, A. (2005). An early development of the nonenal potential in the malting process. European Food Research and Technology , 205.) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 20 Devido à influência da enzima lipoxigenase na formação do E-2-nonenal, os parâmetros adotados durante os processos de maltagem e brassagem têm sido otimizados ao longo do tempo, de forma a reduzir a atividade da LOX no malte e os níveis de E-2-nonenal na cerveja finalizada, diminuindo assim o gosto/aroma a papel/cartão. Apesar deste fator poder ser parcialmente reduzido por processos de otimização, não tem sido possível eliminar da cevada a atividade lipoxigenásica do malte totalmente. Se tal acontecesse, a partir da criação de uma nova variedade de cevada com menor presença desta enzima (LOX-less), por exemplo, os produtores de malte poderiam fabricar uma cerveja muito mais estável a nível organolético. O processo de fabrico seria muito mais fácil de controlar, a nível da maltagem e brassagem, e a cerveja final seria considerada mais fresca e apresentaria um tempo de prateleira mais longo, favorecendo igualmente o consumidor. [25] Alguns investigadores têm corroborado esta hipótese, comprovando que a cerveja produzida com um malte proveniente de uma variedade de cevada LOX-less apresenta menor teor de E-2-nonenal e uma melhor estabilidade da espuma. Em 2001, a Carlsberg e a Heineken colaboraram na criação de uma nova variedade de cevada, em que o gene associado à LOX-1 não existia, sucedida de outra variedade de cevada, em 2010, mas desta vez sem os genes associados tanto à LOX-1 como à LOX-2. [25] Recentemente, de encontro a esta necessidade, foram realizados alguns estudos com uma variedade de cevada denominada de PolarStar, em que a LOX-1 foi completamente retirada do germoplasma do grão. A formação do E-2-nonenal foi um dos alvos desta análise e foi possível concluir que a cerveja produzida com malte de cevada PolarStar continha uma concentração muito menor deste aldeído, na cerveja fresca, em comparação com aquela produzida nas mesma condições mas a partir de um malte controlo (AC Metcalfe). Observou-se também que depois de um envelhecimento forçado e natural das duas cervejas, o teor em E-2-nonenal aumentou drasticamente, no entanto verificou-se um aumento muito mais rápido naquela produzida com o malte controlo. [25] Estes resultados indicam que o uso de uma variedade de cevada LOX-less como a PolarStar mostra-se vantajoso tanto a nível da estabilidade do sabor da cerveja como a nível da estabilidade da espuma da mesma, surgindo como uma possível solução para o problema da produção de aroma/gosto a papel/cartão, aquando do envelhecimento da cerveja, sem alterar as características agradáveis ao consumidor. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 21 Tendo então em conta que a identificação e quantificação do E-2-nonenal ao longo do processo de fabrico da cerveja constitui uma das principais preocupações da indústria cervejeira, é de extremo interesse avaliar a influência de diversos parâmetros do processo de maltagem na qualidade do malte de cevada a utilizar na produção de cerveja, a partir da quantificação do potencial nonenal assim como da atividade da lipoxigenase, entre outros. Para tal, este trabalho teve como objetivo monitorizar o grão de cevada/malte proveniente de diferentes etapas do processo de maltagem, como a germinação e a secagem, assim como o mosto, através da análise de diversos parâmetros físicoquímicos, por espectrofotometria de UV-Vis ou por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). No caso da cevada e do malte, esses parâmetros incluem a determinação da atividade da lipoxigenase, a determinação quantitativa do teor de polifenóis totais, pelo método de Folin-Ciocalteau, e a determinação da atividade antioxidante, pelo método FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). Já no mosto realizaram-se igualmente alguns ensaios como a determinação do poder redutor, pelo método ITT (Indicator TimeTest), e a quantificação do E-2-nonenal, pelo método do Potencial Nonenal, já referido anteriormente. Por fim, surgiu também a necessidade de correlacionar todos estes parâmetros estudados, assim como alguns adicionais, recorrendo a uma análise estatística, mais propriamente uma correlação multivariada, determinando o grau de associação existente entre as diversas variáveis em análise, tanto para aquelas que abrangem o mosto e o seu malte final correspondente como para aquelas cujo conjunto amostral inclui a cevada e malte retirado de diversas fases do processo de maltagem. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 22 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 23 2. Amostragem 2.1. Preparação das Amostras .................................................. 26 2.2. Teor de Humidade das Amostras ....................................... 27 ______________________________________________________ FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 30 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 31 3. Materiais e Métodos 3.1. Determinação do Potencial Nonenal O conceito de Nonenal Potencial (NP, ou Potencial Nonenal, foi proposto por Drost em 1990 e pode ser definido com a capacidade de um mosto poder originar cerveja rica em E-2-nonenal, durante o seu envelhecimento, e sob as condições normais da mesma (pH 4 e baixo conteúdo em O2) ou seja, a medição do “potencial nonenal” expressa-se como a capacidade de um mosto formar E-2-nonenal a pH 4 durante 2 horas a 100ºC. [7] O método utilizado neste trabalho para a quantificação do E-2nonenal no mosto, com base neste conceito, envolveu técnicas como a extração do mesmo, por 2h em banho-maria, destilação por arrastamento de vapor do mosto já arrefecido, extração em fase sólida do destilado recolhido diluído e análise por cromatografia líquida de alta eficiência com deteção espectrofotométrica de UV-Vis. 3.1.1. Equipamento e Reagentes i) Equipamento  Sistema de desgaseificação com N2 (Air Liquide)  Medidor de pH (Metrohm 605)  Banho termostatizado (P Selecta Precisterm S-388)  Sistema de destilação por arrastamento (Kjeltech System 1026 Tecator)  Sistema de extração em fase sólida (NOSHOK) o Bomba (VWR PH 20405-86) o Coluna (Whatman ODS-5)  Sistema de HPLC (Perkin Elmer Flexar LC) o Bomba (Perkin Elmer Series 200) o Detetor (Perkin Elmer Series 200) o Coluna (Phenomenex 3 µm NX-C18 110 Å) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 32 ii) Reagentes  Ácido ortofosfórico (H3PO4), 85 %, p.a. (Merck)  Acetonitrilo (CH3CN), grau do gradiente para HPLC (Merck)  2-Octanol (C8H18O), para síntese (Merck)  E-2-nonenal (C9H16O), 97% (Aldrich)  Cloreto de sódio anidro (NaCl), p.a., ≥99,0% (Sigma Aldrich) 3.1.2. Procedimento Experimental 3.1.2.1. Preparação de Soluções i) Solução de ácido ortofosfórico 5% Transferiram-se 29,41 mL de ácido ortofosfórico 85% para um balão volumétrico de 500,0 mL e ajustou-se o volume final com água ultrapura. ii) Solução stock de E-2-nonenal (1000 mg/L) Transferiram-se 0,030 mL de E-2-nonenal para um balão volumétrico de 25,00 mL e ajustou-se o volume final com acetonitrilo. iii) Solução de trabalho de E-2-nonenal (1 mg/L) Transferiram-se 0,010 mL de solução stock de E-2-nonenal, preparada em ii), para um balão volumétrico de 10,00 mL e ajustou-se o volume final com acetonitrilo. 3.1.2.2. Preparação das Amostras Para a determinação do nonenal potencial no mosto, utilizou-se cerca de 300 mL de mosto frio, o qual se ajustou a pH 4,0 com ácido ortofosfórico 5%. O mosto foi disposto num frasco “Schott” de 500 mL de capacidade, desgaseificado com N2 durante 5 minutos e colocado num banho de 98ºC, durante 2 horas. Após o aquecimento, o mosto foi arrefecido num banho à temperatura ambiente durante cerca de 2 horas e em seguida no frigorífico a 4ºC por uma noite. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 33 No dia seguinte, o mosto foi decantado, recolhendo-se 250 mL de sobrenadante, aos quais foi adicionado 2,9 g de NaCl para promover o fenómeno de salting-out e cerca de 0,100 mL de 2-octanol para contrariar a formação de espuma. De seguida, procedeu-se a uma destilação por arrastamento de vapor, da qual se recolheram 15 mL de destilado. Este foi diluído em água ultrapura num balão volumétrico de 50,00 mL. e submetido a uma extração em fase sólida, através da eluição de 6 mL de acetonitrilo, procedidos pela eluição de 6 mL de água e passagem lenta do destilado diluído, recolhendo-se 1 mL de extrato em acetonitrilo. 3.1.2.3. Curva de Calibração i) Preparação dos Padrões Cada padrão de E-2-nonenal foi preparado por diluição da solução de trabalho de 1 mg/L com acetonitrilo em balões volumétricos, de acordo com a Tabela 1: Tabela 1 – Preparação da curva de calibração de E-2-nonenal. Padrão |Nonenal|padrão / mg/L Volume da solução de trabalho (mL) Volume final (mL) 1 0,010 0,100 10,00 2 0,050 0,500 3 0,100 1,000 4 0,150 1,500 5 0,200 2,000 ii) Análise Analisou-se o extrato concentrado e os padrões por HPLC com deteção espectrofotométrica de UV-Vis, sendo que as condições cromatográficas foram as seguintes: eluente – água:acetonitrilo (45:55), sistema isocrático, volume de injeção – 20 µL, fluxo – 0,800 mL/min, comprimento de onda da deteção – 227 nm. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 34 3.1.3. Determinação do Potencial Nonenal Com os valores obtidos para as absorvâncias dos padrões e as suas concentrações, construiu-se um gráfico do tipo Absorvância = f (concentração). Para cada amostra, o teor em E-2-nonenal é determinado através da seguinte fórmula: | �−  − nonenal| 󰇛mg/L󰇜=Área do pico obtida 󰇛uV.sec󰇜− b m Sendo que m representa o declive e b a ordenada na origem da reta de calibração. No entanto, a concentração obtida a partir da fórmula anteriormente apresentada não representa o teor de E-2-nonenal presente nos 250 mL de mosto iniciais mas sim no extrato de 1 mL. É importante ter em conta as diluições e concentrações que foram realizadas ao longo do procedimento, nomeadamente a concentração de 250 mL de mosto em 15 mL de destilado, a diluição desses 15 mL de destilado numa solução de 50 mL e a concentração desses 50 mL de solução diluída em 1 mL de extrato. Posto isto, tem-se que a concentração de E-2-nonenal em 250 mL de mosto é determinada a partir da seguinte fórmula: | �− − nonenal|L 󰇛µg/L󰇜=|E−−nonenal|L 󰇛mg/L󰇜 5 ×  (2) (3) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 35 3.2. Determinação da Atividade da Lipoxigenase O método aplicado neste trabalho permite determinar a atividade da enzima lipoxigenase de um extrato de malte ou cevada através da análise espectrofotométrica da formação de um dieno conjugado, resultante da ação oxidante da LOX sobre o ácido linoleico que conduz à formação de hidroperóxidos, que podem ser quantificados a 234 nm. 3.2.1. Equipamento e Reagentes i) Equipamento  Espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-3101 PC)  Bomba de circulação de água (FALC FA90)  Balança analítica (Kern ABJ 220-4M)  Sistema de purificação de água (Millipore Direct-Q 3)  Medidor de pH (Metrohm 605)  Agitador rotativo (Yellowline RS10)  Centrífuga (Hermle Z 300K)  Borbulhador de ar (Millipore WP61222050) ii) Reagentes  Acetato de sódio anidro (CH3COOH), p.a., ≥99,0% (Merck)  Cloreto de sódio anidro (NaCl), p.a., ≥99,0% (Sigma Aldrich)  Ácido bórico (H3BO3), ≥99,5% (Sigma Aldrich)  Hidrogenofosfato dissódico dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O), puriss. p.a., ≥99,0% (Sigma Aldrich)  Ácido linoleico (C18H32O2), 99% (Aldrich)  Tween 20 (Polissorbato 20) (C58H114O26 ) (Aldrich) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 36 3.2.2. Procedimento Experimental 3.2.2.1. Preparação de Soluções i) Tampão acetato (0,1 mol/L, pH 5,0, contendo NaCl 0,1 mol/L) Dissolveram-se 8,203 g de CH3COOH e 5,844 g de NaCl em cerca de 900 mL de água ultrapura. Após dissolução completa da mistura, ajustou-se o pH a 5,0 com HCl 6 mol/L. Transferiu-se quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 1,000 L e ajustou-se o volume com água ultrapura. ii) Tampão borato (25 mmol/L, pH 9,0) Dissolveram-se 1,546 g de H3BO3 em cerca de 900 mL de água ultrapura. Após dissolução completa da mistura, ajustou-se o pH a 9,0 com HCl 6 mol/L. Transferiu-se quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 1,000 L e ajustou-se o volume com água ultrapura. iii) Tampão fosfato (0,1 mol/L, pH 6,6) Dissolveram-se 35,814 g de Na2HPO4.12H2O em cerca de 900 mL de água ultrapura. Após dissolução completa da mistura, ajustou-se o pH a 6,6 com HCl 6 mol/L. Transferiu-se quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 1,000 L e ajustou-se o volume com água ultrapura. 3.2.2.2. Preparação do Extrato Enzimático Suspendeu-se 5,000 g de cevada ou malte moído em 50,00 mL de tampão fosfato, arrefecido em gelo, num matraz de 100 mL, e deixou-se agitar num banho de gelo por 30 minutos a 4ºC, usando um agitador rotativo (140 rpm). Centrifugou-se o homogeneizado por 15 minutos a 4ºC num tubo falcon (6000 rpm) e recolheu-se 1,50 mL do sobrenadante, centrifugando-o novamente por 5 minutos a 4ºC num tubo eppendorf (10000 rpm). O sobrenadante resultante foi aquele que foi utilizado para estimar a atividade total da lipoxigenase, sendo necessário diluí-lo 8 vezes no caso da cevada e 4 vezes no caso do malte. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 37 3.2.2.3. Preparação do Substrato Usando apenas material de vidro, dispersou-se 0,250 mL de ácido linoleico por homogeneização em 5,000 mL de tampão borato, contendo 0,250 mL de Tween 20. De forma a facilitar a dispersão, adicionou-se igualmente 0,650 mL de NaOH 1M e 3,850 mL de água ultrapura arrefecida em gelo, perfazendo um volume final de 10,00 mL. A solução final obtida apresentou então uma concentração de 0,079 mol/L em ácido linoleico. Antes de se proceder á análise espectrofotométrica, o substrato foi saturado com ar por 30 segundos. 3.2.2.4. Análise A atividade da lipoxigenase foi determinada espectrofotometricamente adicionando 0,050 mL de extrato enzimática a 0,050 mL de substrato e 2,90 mL de tampão fosfato, numa célula de quartzo a 30ºC. Quando se adicionou o substrato e o extrato enzimático à célula, esta ação foi precedida de uma pipetagem não-volumétrica de 6 vezes dentro da mesma, de forma a promover uma ligeira saturação e homogeneização das misturas. O “auto-zero” foi realizado primeiro com 2,90 mL de tampão fosfato e novamente depois de adicionar os 0,050 mL de substrato. A temperatura do sistema foi mantida a 30ºC durante um período de tempo de análise de 10 minutos e a oxidação do ácido linoleico por parte da LOX foi determinada a partir de medições contínuas de absorvância a 234 nm, tendo em especial consideração os primeiros 3 minutos. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 38 3.2.3. Determinação da Atividade Enzimática A quantidade de hidroperóxidos formados é calculada utilizando a seguinte fórmula: Atividade Enzimática 󰇛nmol/s/g󰇜 = ∆A s ⁄ x V x 9 x f x V’ 󰇛� x � x v x  x m󰇜x  󰇛−H󰇜 ⁄ Sendo que: ∆A/s = Variação da absorvância com o tempo = declive (s-1) V = Volume total da mistura reacional (mL) f = Fator de diluição do extrato enzimático = 4 ou 8 V’ = Volume do tampão de extração (mL) ε234 = Coeficiente de absortividade molar (28000 L.mol-1.cm-1) d = Distância ótica (cm) v = Volume da amostra a analisar (mL) m = Massa de amostra seca (g) H = Teor de humidade da amostra moída (%) (5) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 39 3.3. Determinação Quantitativa do Teor de Polifenóis Totais (Folin-Ciocalteau) A quantificação dos compostos fenólicos totais pela metodologia que emprega o reagente de Folin-Ciocalteau baseia-se na redução dos ácidos fosfotungstíco (H3PW12O40) e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), presentes no reagente de FolinCiocalteau, pelos compostos fenólicos presentes na cevada/malte a óxido de tungsténio (W8O23) e óxido de molibdénio (Mo8O23) em meio alcalino. Estes óxidos formados apresentam coloração azulada, sendo possível a quantificação da absorvância da solução na região do visível (740nm). Através de uma reta de calibração de ácido gálico é possível correlacionar a intensidade da cor com a concentração de fenóis presentes na amostra, sendo o resultado expresso em equivalente de ácido gálico (EAG). No entanto, o reagente de Folin-Ciocalteu não é específico para grupos fenólicos, sofrendo interferências de outras substâncias redutoras presentes na amostra, tais como o ácido ascórbico e açúcares redutores [26]. 3.3.1. Equipamento e Reagentes iii) Equipamento  Espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-3101 PC)  Balança analítica (Mettler AE50)  Sistema de purificação de água (Millipore Direct-Q 3)  Agitador rotativo (Yellowline RS10)  Centrífuga (Hermle Z 300K)  Banho de ultrassons (Cole Palmer 8891) iv) Reagentes  Ácido gálico (C6H2(OH)3COOH), puriss, ≥98,0% (Fluka)  Carbonato de sódio anidro (Na2CO3), p.a. (Merck)  Reagente de Folin-Ciocalteau (Sigma Aldrich)  Metanol (CH3OH), p.a. (Merck) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 46 3.4.3. Determinação da Atividade Antioxidante Com os valores obtidos para as absorvâncias dos padrões e as suas concentrações, construiu-se um gráfico do tipo Absorvância = f (concentração).Para cada amostra, a atividade antioxidante é determinada através da seguinte fórmula: FRAP 󰇛mgET/gs󰇜 =(󰇡Abs 󰇛9 󰇜− b 󰇢/ ms) ×f Sendo que: Abs (593 nm) = absorvância medida a 593 nm b =ordenada na origem obtida para a reta de calibração m = declive obtido para a reta de calibração ms = massa da amostra seca f = fator de diluição (6) FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 47 3.5. Determinação do Poder Redutor (ITT) A definição de poder redutor é dada pela capacidade de uma certa substância em doar eletrões ou hidrogénio a outra substância. Num contexto mais alargado, pode até ser dito que o poder redutor representa uma propriedade que se refere à ação de um composto capaz de limitar, retardar ou prevenir o processo de oxidação. O método ITT (Indicator-Time-Test) tem como princípio a redução do 2,6-diclorofenolindofenol (DCI) a um composto sem cor, pelos compostos redutores presentes no mosto. O valor medido representa a percentagem de indicador descolorizado durante um período de tempo exato, que é especificamente definido para agentes redutores rápidos, intermédios e lentos. 3.5.1. Equipamento e Reagentes i) Equipamento  Espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-3101 PC)  Balança analítica (Mettler AE50)  Sistema de purificação de água (Millipore Direct-Q 3)  Medidor de pH (Metrohm 605) ii) Reagentes  2,6-Diclorofenolindofenol (DCI) (C12H7NCl2O2), ≥97,0% (Sigma Aldrich)  Acetato de sódio (CH3COONa), p.a. (Merck)  Metanol (CH3OH), p.a. (Merck) 3.5.2. Procedimento Experimental 3.5.2.1. Preparação de Soluções i) Tampão acetato (0,1 mol/L, pH 4,3) Pesaram-se 8,20 g de acetato de sódio e adicionou-se cerca de 900 mL de água ultrapura. Após dissolução completa da mistura, ajustou-se o pH a 4,3 com HCl 6 mol/L. Transferiu-se quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 1,000 L e ajustou-se o volume com água ultrapura. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 48 ii) Solução stock de DCI (1,45 g/L) Pesaram-se 0,0073 g de DCI e transferiu-se quantitativamente para um balão volumétrico de 5,000 mL, ajustando-se o volume com água ultrapura iii) Solução de trabalho de DCI (72,5 mg/L) Dispôs-se 1,000 mL da solução stock de DCI, preparada em ii), num balão volumétrico de 20,00 mL, ajustando-se o volume final com o tampão acetato (0,1M, pH 4,3), preparado em i). 3.5.2.2. Curva de Calibração i) Preparação dos Padrões Cada padrão de DCI foi preparado por diluição da solução stock de trabalho de DCI com tampão acetato (0,1M, pH 4,3) em células de poliestireno, homogeneizando o seu conteúdo por inversão da mesma, usando parafilme. Mediu-se a absorvância a 520 nm contra uma célula de poliestireno com 3,000 mL de tampão acetato para efeitos de branco. Tabela 4 – Preparação da curva de calibração de DCI Padrão |DCI|final (mg/L) Volume da solução de trabalho de DCI (mL) Volume do tampão acetato (mL) Volume final (mL) 1 72,5 3,000 0,000 3,000 2 36,3 1,500 1,500 3 24,2 1,000 2,000 4 18,1 0,750 2,250 5 12,1 0,500 2,500 ii) Análise Numa célula de poliestireno, adicionaram-se 1,500 mL de mosto e 1,500 mL de solução de trabalho de DCI, homogeneizando o seu conteúdo por inversão da mesma, usando parafilme. Mediu-se a absorvância a 520 nm exatamente 30 segundos, 5 minutos e 60 minutos depois da agitação por inversão, contra um branco de tampão acetato. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 49 3.5.3. Determinação do Poder Redutor Com os valores obtidos para as absorvâncias dos padrões e as suas concentrações, construiu-se um gráfico do tipo Absorvância = f (concentração). Para a determinação dos agentes redutores, a absorvância foi convertida em concentração de DCI, usando uma reta de calibração e estes valores relacionam-se com a concentração dos agentes redutores da seguinte forma: Agentes Redutores Rápidos: Ireferência – I30’’ Agentes Redutores Intermédios: I30’’ – I5’ Agentes Redutores Lentos: I5’ – I60’ Sendo que: Ireferência = absorvância medida para o padrão com a mesma quantidade de solução de trabalho de DCI que as amostras (Padrão 2); I30’’ = absorvância medida 30 segundos depois da agitação da célula por inversão; I5’ = absorvância medida 5 minutos depois da agitação da célula por inversão; I60’ = absorvância medida 60 minutos depois da agitação da célula por inversão. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 50 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 51 4. Resultados e Discussão 4.1. Humidade das Amostras .................................................... 53 4.2. Determinação do Potencial Nonenal .................................. 55 4.3. Determinação da Atividade da Lipoxigenase ...................... 61 4.4. Determinação Quantitativa do Teor de Polifenóis Totais (Folin-Ciocalteau) ....................................................................... 73 4.5. Determinação da Atividade Antioxidante (FRAP) ............... 79 4.6. Determinação do Poder Redutor (ITT) ............................... 85 4.7. Análise Estatística (Correlação Multivariada) ..................... 91 ______________________________________________________ FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 52 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 53 4. Resultados e Discussão 4.1. Humidade das Amostras Na Tabela 5 estão representados os teores de humidade obtidos para as diferentes amostras de cada fabrico. Tabela 5 – Resultados obtidos relativamente ao teor de humidade das amostras analisadas De um modo geral, como seria de esperar, as amostras que apresentam maior teor de humidade são aquelas referentes ao “break point” e as que apresentam menor teor de humidade são aquelas referentes ao malte final. Relativamente ao fabrico 006, o teor de humidade referente ao “break point” deveria ser mais elevado, no entanto a amostra não foi recolhida exatamente na altura da ocorrência desta etapa mas sim cerca de uma hora depois, daí a discrepância de valores face aos outros fabricos. É de notar também que, nesse mesmo fabrico, a amostra de malte final apresenta um teor de humidade demasiado elevado comparado com a dos restantes fabricos, uma vez que aquando do ensacamento do malte na Instalação Piloto de Maltagem da Unicer, houve uma mistura do mesmo com o malte verde, proveniente da etapa da germinação. Por esta razão, os resultados referentes a esta amostra não irão ser tomados em consideração, daqui para a frente. Humidade (%) Cevada Germinação (Início) Germinação (Fim) Secagem (“Break Point”) Secagem (Golpe de Fogo - Início) Secagem (Golpe de Fogo - Fim) Malte 002 - - 7,60 - 6,86 6,14 5,32 003 13,10 10,54 9,31 18,76 7,92 6,45 7,30 004 11,27 8,94 5,89 16,76 5,33 4,02 4,61 005 14,70 7,93 7,40 21,44 6,26 5,87 5,75 006 14,30 9,54 9,45 9,98 6,14 5,82 13,35 007 15,02 6,27 9,41 17,73 6,08 5,37 5,61 008 14,05 13,52 10,65 14,31 6,55 5,50 5,62 009 13,40 10,37 7,39 20,19 6,54 5,30 4,97 010 12,90 9,74 7,62 18,20 5,77 4,64 4,53 Fabrico Amostra FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 54 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 55 4.2. Determinação do Potencial Nonenal Na Tabela 6 estão representados os resultados obtidos relativamente ao potencial nonenal no mosto Congresso, para cada fabrico, assim como os respetivos desvios padrão associados. Os ensaios foram realizados em duplicado ou triplicado para a maioria dos fabricos, à exceção do fabrico 002. Tabela 6 – Resultados obtidos relativamente à concentração de E-2-nonenal nos mostos analisados Na Figura 13 estão representados graficamente os valores apresentados na Tabela anterior. As barras contornadas a preto representam os fabricos que sofreram alterações na temperatura de golpe de fogo, de 85ºC para 75ºC, (003, 007, 008, 009) e a barra contornada a amarelo representa o fabrico que sofreu uma diminuição do teor de humidade no final da etapa de germinação (010). No caso do fabrico 006, o malte utilizado para produzir o mosto não foi aquele correspondente à etapa final da maltagem, como para os outros fabricos, mas sim aquele retirado na altura do fim da etapa de secagem, ou seja, antes da desradiculação. Fabrico |E-2-nonenal| (µg/L) σ Número de ensaios 002 0,304 - 1 003 0,416 0,05 3 004 0,360 0,05 2 005 0,651 0,1 3 006 0,489 0,1 3 007 0,227 0,04 2 008 0,471 0,02 2 009 0,457 0,05 3 010 0,250 0,002 2 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 62 Apresenta-se também a Figura 15, na qual se podem comparar as atividades enzimáticas entre as amostras Secagem (Golpe de Fogo – Fim) e Malte, de acordo com a temperatura de golpe de fogo aplicada. Para o desenho deste gráfico apenas se considerou a temperatura como parâmetro aferidor, e portanto somente se compararam fabricos da mesma variedade de cevada, neste caso, Tipple. Os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 85ºC estão representados em tons de azul (005, 006 e 010) e os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 75ºC estão representados em tons de vermelho (007, 008 e 009). FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 63 Figura 14 – Representação gráfica da atividade enzimática da lipoxigenase obtida para as amostras analisadas. 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 Cevada Germinação (Início) Germinação (Fim) Secagem ("Break Point") Secagem (Golpe de Fogo - Início) Secagem (Golpe de Fogo - Fim) Malte Atividade Enzimática (nmol/s/g) 002 003 004 005 006 007 008 009 010 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 64 Figura 15 – Representação gráfica da atividade enzimática da lipoxigenase obtida para os fabricos relativos à cevada de variedade Tipple, tendo em conta a temperatura de golpe de fogo. Os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 85ºC estão representados em tons de azul e os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 75ºC estão representados em tons de vermelho. 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 180.00 200.00 Secagem (Golpe de Fogo - Início) Secagem (Golpe de Fogo - Fim) Malte Actividade Enzimática (nmol/s/g) 005 006 007 008 009 010 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 65 Da análise de dados efetuada, é possível verificar que, de uma forma geral, a atividade enzimática da LOX é máxima nas amostras correspondentes à Cevada e vai sofrendo um decréscimo gradual ao longo do processo de maltagem. Apesar de a LOX-1 estar já presente na cevada não-maltada, regista-se uma diminuição acentuada da atividade da enzima LOX entre a cevada e o início da germinação, devido aos elevados teores de humidade praticados durante a etapa da molha. No entanto, verifica-se um aumento desta atividade na maioria dos fabricos em estudo, entre o início e o fim da germinação, uma vez que a LOX-1 tende a aumentar a sua atividade durante a germinação e a LOX-2 só se desenvolve durante esta etapa [12,13]. Já para a etapa pré “break point”, é de notar um aumento da atividade enzimática para os fabricos 006 e 008. Relativamente ao fabrico 006, a amostra não foi recolhida exatamente na altura da ocorrência deste fenómeno mas sim cerca de uma hora depois, como já foi mencionado anteriormente, o que afetou os teores de humidade desta amostra. Para além disso, o “break point” deste fabrico foi atingido significativamente mais cedo do que nos restantes fabricos, a cinco horas do início da etapa de secagem, enquanto que os restantes levaram entre sete e nove horas. No caso do fabrico 008, o “break point” também foi atingido relativamente cedo, cerca de seis horas depois do início da secagem, e a uma temperatura de 50ºC, temperatura essa a que a LOX-1 ainda permanece estável, o que também pode explicar o aumento mencionado, já que quanto menor a temperatura, maior a humidade e menor a destruição enzimática. Devido à sua sensibilidade a altas temperaturas, a maioria da atividade da LOX é perdida durante a secagem, sendo que a atividade restante, presente no malte, se deve essencialmente à LOX-1, já que a LOX-2 é menos termoestável [9]. Na Figura 15, é possível constatar exatamente isso, já que em todos os fabricos se verifica uma diminuição da atividade enzimática entre o início e o fim do golpe de fogo, apesar de mais acentuada nuns do que noutros. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 66 Quanto ao efeito da temperatura de golpe de fogo aplicada, no caso da cevada de variedade Tipple, não é possível constatar com clareza que a atividade enzimática é maior para os fabricos em que a temperatura aplicada foi de 75ºC, como seria de esperar, uma vez que no caso do fabrico 005, em que a temperatura de golpe de fogo é de 85ºC, esta é muito maior do que naqueles em que a temperatura de golpe de fogo foi menor (007, 008 e 009). No entanto, para o fabrico 006 (e 010) já se constata o contrário, a atividade enzimática do malte no fim do golpe de fogo é menor do que aquela correspondente ao malte do fabrico 007,em que a temperatura de golpe de fogo foi de 75ºC, apesar de ser ligeiramente maior do que aquela correspondente aos fabricos 008 e 009. Contudo, a diferença entre atividades não é tão acentuada como aquela registada entre o fabrico 005 e 007/008/009. No caso do fabrico 010, apesar de ter sofrido modificações no teor de humidade durante a etapa de germinação, o malte apresenta menor atividade enzimática do que aquela pertencente ao fabrico 005 mas praticamente igual à do fabrico 006, embora a temperatura de golpe de fogo seja igual para os três fabricos em causa. A única diferença de comportamento deste fabrico em relação aos restantes é que a atividade enzimática se mantêm praticamente constante durante a etapa de germinação, enquanto que os outros registam um aumento. Tal deve-se ao facto de que, como já mencionado anteriormente, a atividade enzimática é promovida sob condições de humidade elevada (acima de 40 %) e baixas temperaturas, o que não se verifica neste fabrico, já que o teor de humidade aplicado durante a etapa de germinação foi de 39%, ao contrário dos restantes (42% - 45%). Para os fabricos produzidos com a variedade de cevada Quench verifica-se um comportamento semelhante ao daqueles produzidos com a variedade de cevada Tipple, até ao início do golpe de fogo. No entanto, é importante salientar que, o efeito da temperatura já se faz sentir de forma diferente, uma vez que, o fabrico 003, cuja temperatura de golpe de fogo foi de 75ºC, é aquele em que a atividade enzimática é maior, face aos fabricos 002 e 004, cuja temperatura de golpe de fogo foi de 85ºC, correspondendo às expectativas esperadas. Contudo, como só foram produzidos três fabricos, seria necessário efetuar mais alguns ensaios com esta variedade de cevada, de forma a constatar se esta tendência se manteria. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 67 Face aos resultados apresentados anteriormente, relativamente à concentração de E2-nonenal no mosto, e àqueles obtidos para a atividade da lipoxigenase na cevada/ malte, surgiu a necessidade de tentar estudar a relação entre estes dois parâmetros. Para isso, representaram-se graficamente as duas variáveis na Figura 16. No caso da atividade enzimática, apenas se consideraram os valores obtidos para o malte final de cada fabrico e, no caso do fabrico 006, para o malte obtido no fim da secagem. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 68 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 69 Figura 16 – Representação gráfica da relação entre a atividade enzimática da lipoxigenase e a concentração de E-2-nonenal. 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 002 003 004 005 006 007 008 009 010 |E-2-nonenal| (µg/L) AEnzimática (nmol/s/g) Fabrico AEnzimática |E-2-nonenal| FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 70 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 71 A partir da relação estabelecida graficamente, é possível constatar que, no caso dos fabricos produzidos a partir de cevada de variedade Quench (002 a 004), esta segue uma tendência linear, ou seja, quando se regista um aumento da atividade enzimática da lipoxigenase no malte, entre fabricos, regista-se também um aumento do teor em E-2-nonenal do mosto fabricado com esse mesmo malte. E quando se regista a diminuição da primeira, regista-se também a diminuição do segundo. Do fabrico 005 ao 006, a relação entre as duas variáveis ainda segue o mesmo comportamento verificado para a variedade Quench, já que se observa uma diminuição tanto da atividade enzimática como da concentração de E-2-nonenal. Todavia, para os restantes fabricos provenientes da cevada de variedade Tipple (007 a 010), já não se verifica uma tendência tão notória. Do 006 ao 007, constata-se uma tendência inversa, uma vez que a atividade enzimática aumenta mas a concentração de E-2-nonenal diminui e, a mesma tendência se observa do 007 ao 008, registando-se uma diminuição da primeira variável e um aumento da segunda. No entanto, do 008 ao 009, é possível observar que tanto a atividade enzimática como o teor em E-2-nonenal diminuem, embora pouco, retomando a relação linear entre estes dois parâmetros. Por fim, do fabrico 009 ao 010, regista-se um aumento ligeiro da atividade enzimática mas uma diminuição acentuada da concentração de E-2-nonenal, levantando-se de novo a hipótese de uma relação tendencialmente inversa. A partir destas conclusões é difícil estabelecer, com certeza, a relação pretendida entre as duas propriedades em estudo. No entanto, de uma forma geral, verifica-se que a analogia entre as duas segue uma tendência maioritariamente linear, o que corrobora a hipótese da influência da enzima lipoxigenase sobre a oxidação dos ácidos gordos e a posterior formação do aldeído E-2-nonenal. No entanto, a melhor maneira de poder afirmar com veracidade esta suposição, seria realizando mais alguns ensaios semelhantes, para novos fabricos, tanto com cevada de variedade Quench como Tipple. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 78 É de notar também uma diminuição do teor de polifenóis totais entre o fim da germinação e o break-point, devido à inibição da esterase do ácido ferúlico que, devido à sua sensibilidade ao aumento da temperatura aplicado na secagem, impede a libertação deste composto que é o principal responsável pelo conteúdo polifenólico do malte. Quanto ao efeito da temperatura de golpe de fogo, verifica-se que no fabrico 006, em que a temperatura de golpe de fogo foi de 85ºC, o aumento do teor de polifenóis totais é mais acentuado no que nos fabricos 008 e 009, em que a temperatura de golpe de fogo é menor. De resto, tanto os fabricos 005 e 010 como o fabrico 008 sofrem um aumento do teor polifenólico, mas menos acentuado do que no 006, e o fabrico 009 permanece praticamente constante entre as duas fases do golpe de fogo. Em relação ao fabrico 007, regista-se uma diminuição do parâmetro em estudo, entre o início e o fim do golpe de fogo, o que não vai de encontro com a hipótese formulada, no entanto, como a diminuição é pouco significativa, pode ser apenas considerada como uma questão de influência do desvio padrão ou de erros cometidos aquando da realização da análise. No caso dos fabricos produzidos a partir da cevada de variedade Quench, é possível constatar que no fabrico 003, cuja temperatura de golpe de fogo associada é de 75ºC, o teor de polifenóis totais é menor face ao fabrico 004, mas maior face ao fabrico 002, ambos submetidos a uma temperatura de golpe de fogo de 85ºC. No entanto tanto o fabrico 003 como o fabrico 004 registam um aumento acentuado da atividade enzimática durante a secagem, enquanto que o fabrico 002 apresenta uma ligeira diminuição da mesma. Desta forma, e devido às conclusões dúbias que estes resultados sugerem, a melhor abordagem seria efetuar mais alguns ensaios com esta variedade de cevada, de forma a constatar se esta tendência se manteria. Todavia é curioso denotar que, de um modo geral e excluindo os fabricos 002 e 006, o conteúdo polifenólico, no fim da etapa de secagem, associado aos fabricos produzidos com cevada de variedade Quench são muito superiores em comparação com os de variedade Tipple. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 79 4.5. Determinação da Atividade Antioxidante (FRAP) Na Tabela 9 está representada a atividade antioxidante obtida para as diferentes amostras de cada fabrico, e os respetivos desvios padrão associados. Os ensaios foram realizados em triplicado para todas as amostras. Tabela 9 – Resultados obtidos relativamente à atividade antioxidante das amostras analisadas (n=3) Fabrico Cevada Germinação (Início) Germinação (Fim) Secagem (“Break Point”) Secagem (Golpe de Fogo - Início) Secagem (Golpe de Fogo - Fim) Malte 002 FRAP (mgET/gms) - - 365,27 - 368,80 339,55 365,45 σ - - 1,5 - 2,9 3,0 3,2 003 FRAP (mgET/gms) 458,51 420,45 507,47 331,98 596,69 525,16 555,72 σ 5,2 26 19 32 12 9,0 23 004 FRAP (mgET/gms) 320,20 260,13 353,90 203,53 457,56 340,71 408,85 σ 18 12 10 22 5,3 15 1,6 005 FRAP (mgET/gms) 437,99 456,97 502,93 312,91 477,51 534,84 473,02 σ 26 12 5,9 8,2 12 20 2,4 006 FRAP (mgET/gms) 614,59 509,26 605,97 646,85 605,55 669,14 512,80 σ 14 7,3 12 11 11 17 20 007 FRAP (mgET/gms) 570,96 447,11 474,49 386,36 486,37 510,22 505,75 σ 3,3 6,6 10 14 17 8,6 11 008 FRAP (mgET/gms) 508,93 398,83 498,11 290,67 444,19 426,93 452,16 σ 2,4 5,8 4,1 6,3 20 5,8 10 009 FRAP (mgET/gms) 602,68 478,51 588,78 503,89 556,16 563,82 543,91 σ 38 23 4,2 23 29 6,8 17 010 FRAP (mgET/gms) 273,22 275,31 300,36 168,81 341,86 366,10 337,65 σ 18 9,9 6,1 2,5 15 5,2 11 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 80 Na Figura 19 estão representados graficamente os valores apresentados na Tabela anterior. As barras contornadas a preto representam as amostras pertencentes aos fabricos que sofreram alterações na temperatura de golpe de fogo, de 85ºC para 75ºC, (003, 007, 008, 009) e as barras contornadas a amarelo representam as amostras pertencentes ao fabrico que sofreu uma diminuição do teor de humidade na etapa de germinação (010). Apresenta-se também a Figura 20, na qual se podem comparar as atividades antioxidantes entre as amostras Secagem (Golpe de Fogo - Fim) e Malte, de acordo com a temperatura de golpe de fogo aplicada. Para o desenho deste gráfico apenas se considerou a temperatura como parâmetro aferidor, e portanto somente se compararam fabricos da mesma variedade de cevada, neste caso, Tipple. Os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 85ºC estão representados em tons de azul (005, 006 e 010) e os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 75ºC estão representados em tons de vermelho (007, 008 e 009). FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 81 Figura 19 – Representação gráfica da atividade antioxidante (método FRAP) obtida para as amostras analisadas. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Cevada Germinação (Início) Germinação (Fim) Secagem ("Break Point") Secagem (Golpe de Fogo - Início) Secagem (Golpe de Fogo - Fim) Malte FRAP (mgET / gms) 002 003 004 005 006 007 008 009 010 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 82 Figura 20 – Representação gráfica da atividade antioxidante obtida para os fabricos relativos à cevada de variedade Tipple, tendo em conta a temperatura do golpe de fogo. Os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 85ºC estão representados em tons de azul e os fabricos com temperatura de golpe de fogo de 75ºC estão representados em tons de vermelho. 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 Secagem (Golpe de Fogo - Início) Secagem (Golpe de Fogo - Fim) Malte FRAP (mgET / gms) 005 006 007 008 009 010 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 83 Da análise de dados efetuada, é possível verificar que, de uma forma geral, a atividade antioxidante da cevada/malte mantém-se praticamente constante ao longo do processo de maltagem, podendo aumentar ligeiramente na fase de secagem. No caso dos polifenóis, regista-se um aumento acentuado da presença destes compostos no fim da germinação, para a maioria dos fabricos, no entanto na atividade antioxidante este aumento não se reflete da mesma forma, sendo apenas significativo num ou dois fabricos, permanecendo praticamente constante nos restantes. Esta constatação pode levar a crer que os compostos fenólicos libertados durante esta etapa apresentam atividade antioxidante reduzida ou são inibidos por outros constituintes presentes nos extratos [27]. É de notar também que se observa uma diminuição acentuada da atividade antioxidante durante a fase do “break point”, para a maioria dos fabricos, devido à inibição da esterase do ácido ferúlico, como já foi explicado anteriormente. Quanto ao efeito da temperatura de golpe de fogo, verifica-se que nos fabricos cuja temperatura de golpe de fogo foi de 85ºC, o aumento da atividade antioxidante é mais acentuado do que nos fabricos em que a temperatura de golpe de fogo é menor, excetuando no fabrico 010, em que ocorreram alterações no teor de humidade aquando da etapa da germinação. Como se pode observar no gráfico da Figura 20, a atividade antioxidante do fabrico 010 é bastante inferior aos restantes, o que se poderá dever a uma menor formação de produtos de reação de Maillard durante a secagem do malte verde, que apresenta menor teor de humidade. Para os fabricos em que a temperatura de golpe de fogo aplicada foi de 75ºC, constata-se que a atividade antioxidante sofreu um aumento muito pouco significativo, apesar de no caso do fabrico 009, esta ser maior do que no fabrico 005, em que a temperatura de golpe de fogo é maior. Estas conclusões vão de encontro ao que já foi referido anteriormente, relativamente ao teor de polifenóis totais das amostras em estudo, e à presença de compostos antioxidantes provenientes da reação de Maillard, nomeadamente as melanoidinas, que são consideradas os compostos que mais contribuem para a atividade antioxidante do malte [28]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 84 No caso dos fabricos produzidos a partir da cevada de variedade Quench, é possível constatar exatamente o contrário, já que o fabrico 003, cuja temperatura de golpe de fogo associada é de 75ºC,é aquele em que a atividade antioxidante é mais elevada, face aos fabricos 002 e 004, cuja temperatura de golpe de fogo é maior. Contudo, como só foram produzidos três fabricos, seria necessário efetuar mais ensaios com esta variedade de cevada, de forma a constatar se esta tendência se manteria. Os estudos polifenólico e antioxidante mostram-se importantes na medida em que contribuem para a correta seleção da variedade de cevada a utilizar no fabrico da cerveja, tendo em conta a eficiência antioxidante e a composição fenólica. A escolha da variedade deve então ter em conta dois parâmetros: o poder antioxidante da cevada e o seu aumento durante a maltagem. Além disso, como já foi referido, outros compostos que não os polifenóis podem participar na atividade antioxidante no malte, incluindo outros produtos provenientes da reação de Maillard e de caramelização [27]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 85 4.6. Determinação do Poder Redutor (ITT) Na Tabela 10 está representado o teor de agentes redutores intermédios e lentos presentes no mosto, obtidos para os diferentes mostos de cada fabrico, assim como os respetivos desvios padrão associados. Os ensaios foram realizados em triplicado para todas as amostras. Os mostos analisados não apresentaram indícios da existência de agentes redutores rápidos, por isso os seus teores não estão indicados na Tabela 10. Tabela 10 – Resultados obtidos relativamente ao teor de agentes redutores intermédios e lentos presentes no mosto (n=3) Na Figura 21 e 22 estão representados graficamente os valores apresentados na Tabela anterior. As barras contornadas a preto representam os fabricos que sofreram alterações na temperatura de golpe de fogo, de 85ºC para 75ºC, (003, 007, 008, 009) e a barra contornada a amarelo representa o fabrico que sofreu uma diminuição do teor de humidade na etapa de germinação (010). No caso do fabrico 006, o malte utilizado para produzir o mosto não foi aquele correspondente à etapa final da maltagem, como para os outros fabricos, mas sim aquele retirado na altura do fim da etapa de secagem, ou seja, antes da desradiculação. Fabrico Agentes Redutores Intermédios (%) σ Agentes Redutores Lentos (%) σ 002 0,328 0,2 2,21 0,3 003 1,50 0,07 8,74 0,6 004 0,508 0,1 8,25 0,8 005 0,337 0,01 12,2 0,8 006 0,940 0,1 9,86 0,6 007 0,570 0,1 6,78 0,4 008 1,10 0,09 7,92 0,2 009 2,29 0,00 12,9 0,1 010 1,23 0,04 8,86 0,04 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 86 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 87 Figura 21 – Representação gráfica do teor em agentes redutores intermédios presentes no mosto. 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 Agentes Redutores Intermédios (%) 002 003 004 005 006 007 008 009 010 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 94 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 95 Tabela 11 – Resultados obtidos relativamente ao coeficiente de correlação de Pearson (r) entre as variáveis referentes ao mosto e ao malte final correspondente. Atividade da LOX Potencial Nonenal Teor de Humidade Teor de Polifenóis Totais Atividade Antioxidante Agentes Redutores Intermédios Agentes Redutores Lentos Poder Antiradicalar (Mosto) Poder Antiradicalar (Malte) Atividade da βglucanase Teor em βglucanos Teor em Azoto Aminado Livre Friabilidade Modificação Poder Diastásico Atividade da LOX r 1 Sig. Potencial Nonenal r 0,542 1 Sig. 0,132 Teor de Humidade r 0,504 0,315 1 Sig. 0,167 0,409 Teor de Polifenóis Totais r -0,345 -0,114 0,149 1 Sig. 0,364 0,771 0,701 Atividade Antioxidante r 0,035 0,441 0,559 0,658 1 Sig. 0,928 0,235 0,117 0,054 Agentes Redutores Intermédios r -0,386 0,061 0,080 0,422 0,338 1 Sig. 0,305 0,876 0,838 0,257 0,373 Agentes Redutores Lentos r 0,185 0,634 0,011 0,202 0,462 0,523 1 Sig. 0,634 0,067 0,977 0,602 0,211 0,149 Poder Antiradicalar (Mosto) r 0,196 0,117 -0,152 0,159 -0,164 -0,510 -0,126 1 Sig. 0,642 0,782 0,719 0,707 0,698 0,197 0,766 Poder Antiradicalar (Malte) r 0,428 -0,147 -0,506 -0,121 -0,367 -0,164 0,309 0,258 1 Sig. 0,338 0,754 0,247 0,795 0,417 0,725 0,500 0,577 Atividade da βglucanase r 0,169 0,235 0,814** 0,518 0,703* 0,084 0,017 0,230 -0,493 1 Sig. 0,663 0,542 0,008 0,153 0,035 0,831 0,965 0,584 0,261 Teor em βglucanos r -0,400 -0,322 -0,685 -0,592 -0,728* -0,246 -0,477 -0,436 -0,301 -0,759* 1 Sig. 0,326 0,437 0,061 0,122 0,041 0,557 0,232 0,328 0,562 0,029 Teor em Azoto Aminado Livre r 0,357 0,362 0,195 0,149 0,556 -0,122 0,585 -0,131 0,256 0,152 -0,480 1 Sig. 0,346 0,339 0,614 0,701 0,120 0,755 0,098 0,758 0,580 0,697 0,228 Friabilidade r 0,525 -0,174 0,518 0,026 -0,186 -0,233 -0,379 0,220 0,191 0,323 -0,385 -0,196 1 Sig. 0,147 0,655 0,153 0,948 0,632 0,546 0,314 0,600 0,681 0,397 0,346 0,613 Modificação r 0,330 -0,212 0,153 -0,633 -0,513 -0,185 -0,225 -0,398 0,023 -0,313 0,213 -0,012 0,477 1 Sig. 0,386 0,584 0,694 0,067 0,158 0,634 0,561 0,329 0,962 0,412 0,613 0,975 0,194 Poder Diastásico r 0,268 0,363 0,550 0,239 0,620 0,251 0,326 -0,609 -0,437 0,285 -0,535 0,522 0,164 0,234 1 Sig. 0,486 0,337 0,125 0,535 0,075 0,515 0,392 0,109 0,326 0,458 0,172 0,149 0,674 0,544 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 96 Tabela 12 – Resultados obtidos relativamente ao coeficiente de correlação de Spearman (ρ) entre as variáveis referentes ao mosto e ao malte final correspondente Atividade da LOX Potencial Nonenal Teor de Humidade Teor de Polifenóis Totais Atividade Antioxidante Agentes Redutores Intermédios Agentes Redutores Lentos Poder Antiradicalar (Mosto) Poder Antiradicalar (Malte) Atividade da βglucanase Teor em βglucanos Teor em Azoto Aminado Livre Friabilidade Modificação Poder Diastásico Atividade da LOX ρ 1 Sig. Potencial Nonenal ρ 0,167 1 Sig. 0,668 Teor de Humidade ρ 0,467 0,567 1 Sig. 0,205 0,112 Teor de Polifenóis Totais ρ -0,117 0,000 0,217 1 Sig. 0,765 1,000 0,576 Atividade Antioxidante ρ 0,067 0,467 0,733* 0,633 1 Sig. 0,865 0,205 0,025 0,067 Agentes Redutores Intermédios ρ -0,583 0,033 0,017 0,483 0,383 1 Sig. 0,099 0,932 0,966 0,187 0,308 Agentes Redutores Lentos ρ -0,183 0,600 0,083 0,217 0,417 0,467 1 Sig. 0,637 0,088 0,831 0,576 0,265 0,205 Poder Antiradicalar (Mosto) ρ 0,286 0,190 0,048 0,333 -0,119 -0,429 0,095 1 Sig. 0,493 0,651 0,911 0,420 0,779 0,289 0,823 Poder Antiradicalar (Malte) ρ 0,143 -0,179 -0,571 -0,250 -0,536 -0,143 0,357 0,143 1 Sig. 0,760 0,702 0,180 0,589 0,215 0,760 0,432 0,760 Atividade da βglucanase ρ 0,267 0,317 0,867** 0,267 0,550 0,000 -0,167 0,262 -0,643 1 Sig. 0,488 0,406 0,002 0,488 0,125 1,000 0,668 0,531 0,119 Teor em βglucanos ρ -0,500 -0,357 -0,643 -0,595 -0,690 -0,214 -0,500 -0,643 -0,371 -0,524 1 Sig. 0,207 0,385 0,086 0,120 0,058 0,610 0,207 0,119 0,468 0,183 Teor em Azoto Aminado Livre ρ 0,335 0,301 0,335 0,201 0,544 -0,184 0,335 0,036 -0,090 0,192 -0,503 1 Sig. 0,379 0,431 0,379 0,604 0,130 0,635 0,379 0,933 0,848 0,620 0,204 Friabilidade ρ 0,688* -0,339 0,078 -0,009 -0,313 -0,305 -0,566 0,203 0,296 0,078 -0,195 -0,280 1 Sig. 0,041 0,371 0,841 0,982 0,412 0,425 0,112 0,630 0,520 0,841 0,643 0,466 Modificação ρ 0,429 -0,244 0,269 -0,244 -0,042 -0,101 -0,496 -0,467 -0,143 0,286 -0,024 0,211 0,492 1 Sig. 0,250 0,527 0,484 0,527 0,915 0,796 0,175 0,243 0,760 0,456 0,955 0,586 0,179 Poder Diastásico ρ 0,083 0,083 0,367 0,367 0,600 0,500 0,083 -0,738* -0,429 0,117 -0,238 0,293 0,087 0,487 1 Sig. 0,831 0,831 0,332 0,332 0,088 0,170 0,831 0,037 0,337 0,765 0,570 0,444 0,824 0,183 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 97 Tabela 13 – Resultados obtidos relativamente ao coeficiente de correlação de Pearson (r) entre as variáveis referentes às amostras de cevada/malte Atividade da LOX Teor de Humidade Teor de Polifenóis Totais Atividade Antioxidante Poder Anti-radicalar Atividade da β-Glucanase Poder Diastasico Atividade da LOX r 1 Sig. Teor de Humidade r 0,297* 1 Sig. 0,023 Teor de Polifenóis Totais r -0,207 -0,318* 1 Sig. 0,115 0,014 Atividade Antioxidante r 0,001 -0,247 0,362** 1 Sig. 0,995 0,060 0,005 Poder Anti-radicalar r 0,146 -0,175 0,130 -0,009 1 Sig. 0,302 0,214 0,357 0,949 Atividade da β-Glucanase r -0,189 -0,123 0,483** 0,170 -0,174 1 Sig. 0,152 0,353 0,000 0,199 0,217 Poder Diastásico r -0,274* -0,114 0,435** 0,245 -0,118 0,656** 1 Sig. 0,038 0,396 0,001 0,063 0,405 0,000 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 98 Tabela 14 – Resultados obtidos relativamente ao coeficiente de correlação de Spearman (ρ) entre as variáveis referentes às amostras de cevada/malte Atividade da LOX Teor de Humidade Teor de Polifenóis Totais Atividade Antioxidante Poder Anti-radicalar Atividade da β-Glucanase Poder Diastasico Atividade da LOX ρ 1 Sig. Teor de Humidade ρ 0,403** 1 Sig. 0,002 Teor de Polifenóis Totais ρ -0,175 -0,290* 1 Sig. 0,186 0,026 Atividade Antioxidante ρ 0,020 -0,125 0,392** 1 Sig. 0,883 0,345 0,002 Poder Anti-radicalar ρ 0,113 -0,294* 0,167 -0,098 1 Sig. 0,424 0,034 0,237 0,490 Atividade da β-Glucanase ρ -0,196 -0,128 0,436** 0,125 -0,151 1 Sig. 0,138 0,333 0,001 0,346 0,284 Poder Diastásico ρ -0,078 0,018 0,472** 0,257 -0,147 0,653** 1 Sig. 0,560 0,895 0,000 0,052 0,297 0,000 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 99 Analisando os resultados obtidos para as amostras de mosto e malte final correspondente, apresentados na Tabela 11, referentes à correlação de Pearson, destacam-se quatro correlações estatisticamente significativas, sendo elas entre a atividade enzimática da β-glucanase e o teor de humidade (0,814), entre a atividade da β-glucanase e a atividade antioxidante (0,703), entre o teor em β-glucanos e a atividade antioxidante (-0,728) e entre o teor de β-glucanos e a atividade da βglucanase (-0,759). Estas correlações verificam-se, uma vez que o papel da β-glucanase consiste na degradação dos β-glucanos insolúveis das paredes celulares do grão da cevada, originando posteriormente unidades de glucose. Este processo de degradação dos βglucanos é possível em condições de teor de humidade muito elevado e é favorecido e melhorado quando o grão é sujeito a um maior período de germinação, etapa em que a enzima em causa é ativada [31]. Daí que a associação da atividade desta enzima com a humidade seja positiva e a associação com o teor de β-glucanos seja negativa. Quanto à correlação com a atividade antioxidante, esta está relacionada com a libertação dos açúcares redutores como a glucose, durante a fase da germinação, que apresentam ligações com compostos fenólicos com propriedades antioxidante e que são utilizados posteriormente na reação de Maillard, originando compostos igualmente antioxidantes, como as melanoidinas, justificando assim o seu aumento com o aumento da atividade da β-glucanase e a consequente diminuição do teor de βglucanos. Examinando agora os resultados obtidos para as amostras de mosto e malte final correspondente, apresentados na Tabela 12, referentes à correlação de Spearman, destacam-se também quatro correlações estatisticamente significativas, sendo que uma delas é igual a uma das determinadas anteriormente pela correlação de Pearson (atividade enzimática da β-glucanase e teor de humidade (0,876)) e as restantes correlações são entre a atividade antioxidante e o teor de humidade (0,733), entre a friabilidade do grão e a atividade da LOX (0,688) e entre o poder diastásico e o poder anti-radicalar do mosto (-0,738). FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 100 Como já foi explicado anteriormente, o teor de humidade do malte está diretamente relacionado com as atividades das enzimas hidrolíticas implicadas no processo de maltagem, mais propriamente na germinação, enzimas essas que, como a βglucanase, a α-amilase e a β-amilase, hidrolisam compostos que originam açúcares redutores, utilizados posteriormente para gerar compostos com atividade antioxidante. Desta forma, a sua associação varia positivamente. Quanto à relação entre a friabilidade e à atividade da LOX, é importante ressalvar que a friabilidade é considerada um parâmetro importante na qualidade do malte uma vez que uma reduzida modificação física origina problemas na moagem, no rendimento da brassagem, na libertação do extrato e na filtração do mosto e indica a capacidade do malte se desintegrar quando sujeito ao processo de moagem, ou seja uma maior friabilidade significa uma maior percentagem de grãos modificados. A fração não modificada dos grãos é mais dificilmente degradada do que a fração modificada, uma vez que as suas propriedades físicas dificultam a ação enzimática, já que as regiões amorfas são mais acessíveis às enzimas do que as regiões cristalinas [31]. Daí que a associação entre estas duas variáveis seja positiva, já que quanto maior o número de grãos modificados, mais facilmente a LOX pode exercer a sua função. Já no caso da associação entre o poder diastásico e o poder anti-radicalar do mosto, esta mostra-se negativa. O poder anti-radicalar, determinado a partir do método do DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil), está relacionado com a atividade antioxidante dos constituintes da cevada/malte que por sua vez está intimamente relacionada com a capacidade que estes constituintes possuem para prevenir reações de oxidação, inibindo desta forma a formação de radicais; já o poder diastásico é um parâmetro que expressa a quantidade de enzimas produzidas e ativadas durante a maltagem, que irão atuar na conversão do amido durante a brassagem, nomeadamente, a α-amilase e β-amilase, ou seja, a partir deste método é possível estimar a quantidade de açúcares redutores formados, resultantes da hidrólise do amido provocada por estas enzimas. Estes açúcares redutores estão na origem de compostos fenólicos com elevado peso molecular que exibem uma elevada capacidade anti-radicalar (antioxidante) e uma tendência crescente de formar complexos insolúveis com proteínas durante a brassagem [32]. Para além disso, a solubilidade dos polifenóis diminui com o aumento do peso molecular e os polifenóis polimerizados apresentam maior atividade antioxidante que os seus monómeros correspondentes [32]. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 101 A polimerização oxidativa dos polifenóis e a propensão crescente de estas maiores espécies polimerizadas formarem complexos com proteínas, resulta na formação de espécies insolúveis. Espécies estas que são perdidas por precipitação e filtração, o que pode conduzir a uma diminuição da capacidade antioxidante do mosto [32]. Desta forma se justifica a associação negativa entre o poder diastásico e poder anti-radicalar do mosto. Relativamente à Tabela 13 e aos resultados obtidos para as amostras de cevada/malte, referentes à correlação de Pearson, é possível observar a existência de seis correlações estatisticamente significativas, sendo elas entre o teor de humidade e a atividade da LOX (0,297), entre o teor de polifenóis totais e o teor de humidade (- 0,318), entre a atividade antioxidante e o teor de polifenóis totais (0,362), entre a atividade da β-glucanase e teor de polifenóis totais (0,483), entre o poder diastásico e teor de polifenóis totais (0,435) e entre o poder diastásico e a atividade da β-glucanase (0,656). Quanto à relação entre a atividade enzimática da LOX e o teor de humidade, esta já foi explicada anteriormente com mais detalhe, no entanto já seria de esperar que a associação entre as duas variáveis fosse positiva, uma vez que a atividade desta enzima é altamente favorecida por elevados teores de humidade, desde que a temperatura não seja muito elevada. Da mesma forma, seria de esperar que o teor de polifenóis totais e o teor de humidade apresentassem uma associação negativa, já que um elevado teor de humidade revela uma menor intensidade de secagem do malte e menor formação de compostos corados e aromáticos, provenientes da reação de Maillard, e que influenciam os resultados obtidos pelo método de Folin-Ciocalteau aplicado, já que este não deteta apenas compostos fenólicos, sendo igualmente afetado por outros compostos com características redutoras. Também a relação entre o teor de polifenóis totais e a atividade antioxidante foi explicada anteriormente, e portanto a associação positiva entre as duas variáveis já seria espectável, uma vez que os polifenóis participam diretamente na atividade antioxidante do malte, embora não sejam os únicos compostos a fazê-lo. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 102 Tanto a atividade enzimática da β-glucanase e o poder diastásico (relacionado com a atividade das enzimas α-amilase e β-amilase) se associam positivamente com o teor de polifenóis totais devido ao facto de estas três enzimas estarem na origem dos açúcares redutores, que, para além de estarem ligados aos polifenóis detetados na fase da germinação, resultam também na produção, através da reação de Maillard, de compostos com propriedades redutoras que interferem na deteção dos mesmos pelo método de Folin-Ciocalteau. Da mesma forma, estas duas primeiras variáveis relacionam-se positivamente uma vez que as três enzimas hidrolíticas implicadas são ativadas ou produzidas na mesma fase do processo de maltagem, a germinação, sendo muito sensíveis a temperaturas elevadas, aplicadas na secagem, e a condições de pH que não sejam as ideais, apresentando portanto um comportamento semelhante ao longo do processo de maltagem Já na Tabela 14, a partir dos resultados obtidos para as amostras de cevada/malte, verificam-se sete correlações estatisticamente significativas, relativamente à correlação de Spearman, sendo que seis delas são as mesmas que aquelas identificadas anteriormente na Tabela 13 (teor de humidade e atividade da LOX (0,403); teor de polifenóis totais e teor de humidade (-0,290); atividade antioxidante e teor de polifenóis totais (0,392); atividade da β-glucanase e teor de polifenóis totais (0,436); poder diastásico e teor de polifenóis totais (0,473); poder diastásico e a atividade da β-glucanase (0,653)) e a restante é entre o poder anti-radicalar do malte e o teor de humidade (-0,294). Tendo em conta que o poder anti-radicalar está relacionado com a atividade antioxidante dos constituintes da cevada/malte, é natural que esta variável apresente uma associação negativa com o teor de humidade, já que, como referenciado previamente, elevados teores de humidade influenciam negativamente a formação de compostos aromáticos [31], na etapa do golpe de fogo, provenientes da reação de Maillard, como as melanoidinas, compostos esses que contribuem fortemente para a atividade antioxidante do malte final. FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 103 5. Conclusão ______________________________________________________ FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 110 FCUP Monitorização de parâmetros físico-químicos do grão de cevada/malte ao longo do processo de maltagem 111 6. Referências Bibliográficas [1] Cruz, J. M. (2006). Produção de Cerveja. In J. A. 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