Autenticação de Bacalhau Processado (Gadus spp.) por Análise de Fusão de Alta Resolução de Fragmentos de ADN (HRMA)

Cláudia Patrícia Moreira Tomás Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Dissertação do 2º ciclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre em Controlo de Qualidade na Especialidade de Água e Alimentos Orientador: Doutor Miguel Ângelo Rodrigues Pinto de Faria Coorientadora: Professora Doutora Isabel Maria Pinto Leite Viegas Oliveira Ferreira Julho 2015 ii É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE. iii PUBLICAÇÕES Da realização deste trabalho resultaram as seguintes comunicações: C. Tomás, M. A. Faria, I. M. P. L. V. O. Ferreira; “Authentication of processed gadoid species by barcode sequencing and phylogenetic analysis” XX Encontro Luso-Galego de Química, Porto, Novembro 2014 (comunicação poster). C. Tomás, M. A. Faria, I. M. P. L. V. O. Ferreira; “Authentication of dried salted codfish by fast PCR HRMA” II Food Integrity Conference, Bilbao, Fevereiro 2015 (comunicação poster). C. Tomás, M. A. Faria, I. M. P. L. V. O. Ferreira; “Salted Codfish Authentication By Fast PCR-HRMA” Sessão pública de apresentação dos projetos de investigação científica (IJUP), Porto, Maio 2015 (comunicação poster). iv AGRADECIMENTOS Ao Doutor Miguel Faria, agradeço pela oportunidade que me ofereceu com este trabalho, pelos novos conhecimentos adquiridos, por toda a ajuda, apoio, pela disponibilidade constante, competência, empenho e dinamismo. À Professora Doutora Isabel Ferreira por ter disponibilizado todos os recursos necessários ao longo da realização deste trabalho. A todos os colaboradores que trabalham diariamente no Serviço de Bromatologia. À Rita, pela amizade, pelas conversas, conselhos, desabafos, almoços, lanches… e muito mais. À Bárbara, pela paciência, pelos momentos de descontração, pelas brincadeiras que fizeram o tempo passar mais rápido, pelos concelhos, desabafos, e principalmente pela tua amizade que cresceu neste ano de tese. À Rosa, Joana, Tiago, pelos momentos de descontração e companhia nos almoços e lanches. Aos meus pais, sem os quais todo o meu percurso escolar não teria sido possível, pela paciência e por acreditarem sempre em mim. À minha família e amigos que me acompanharam neste percurso, que me apoiaram, que acreditaram e que me ajudaram a cumprir mais um dos meus objetivos. Muito OBRIGADA a todos!!! v RESUMO O Bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) é um dos peixes mais consumidos na Europa, assumindo uma especial importância em Portugal quer pela quantidade consumida quer pela relevância gastronómica e mesmo cultural. O aumento do consumo mundial desta espécie provocou a diminuição dos stocks marinhos e, como consequência, a escassez e aumento de preços. Neste contexto, a comercialização de diferentes espécies de peixes, apresentando características organoléticas e morfológicas semelhantes, como se fossem Gadus morhua, é uma prática muito tentadora para os comerciantes sem valores morais. Hoje em dia, a autenticidade de alimentos, particularmente de peixe, assume uma importância crucial, devido ao número de casos de adulteração e impacto no consumidor. A autenticação de alimentos assume assim grande importância na comunidade científica como o demonstra o grande desenvolvimento de vários métodos analíticos, físico-químicos e biológicos, rápidos e precisos, que permitem distinguir espécies recorrendo a marcadores específicos como proteínas e ADN. Devido à estabilidade relativa deste último, os métodos de ADN desempenham um papel cada vez maior no controlo da segurança alimentar e na deteção de adulterações em alimentos. Este trabalho consistiu no desenvolvimento de marcadores moleculares para a avaliação da autenticidade (identificação de espécies) de bacalhau em produtos conservados pelo sal e ultracongelados. Recorreu-se para tal à técnica de análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA). Foram adquiridas 33 amostras no mercado comercializadas sob a designação de espécie de G. morhua, G. macrocephalus e G. Chalcogrammus na forma de inteiro, desfiado e demolhado ultracongelado. Procedeu-se, numa primeira fase, à identificação das espécies pela sequenciação da região barcode subunidade 1 do gene citocromo-oxidase (COI). Verificou-se que 93 % das amostras sequenciadas estavam corretamente rotuladas, contudo detetaram-se duas adulterações rotuladas como G. morhua mas identificadas como G. macrocephalus, de menor valor comercial. Na fase seguinte procedeu-se ao desenvolvimento de 7 novos marcadores no gene COI pelo desenho de primers para amplificação de fragmentos com um tamanho aproximado de 100 pb, em zonas onde foram detetados polimorfismos adequados à análise HRMA. Esta metodologia, utilizada com os marcadores desenvolvidos e selecionados, mostrou-se eficiente na discriminação de Gadus morhua das outras espécies, tendo permitido a identificação correta em 97 % das amostras. Este estudo demonstrou que a substituição de espécies pode ser avaliada por HRMA, de uma forma rápida e específica, configurando uma robusta ferramenta de autenticação alimentar. Palavras-chave: Autenticidade, PCR, HRMA, barcoding, Gadus. vi ABSTRACT Atlantic cod (Gadus morhua, L.) is one of the most consumed and exploited white fish with gastronomic relevance in several European countries, particularly in Portugal where it is highly consumed and assumes a notorious gastronomic and cultural importance. As a consequence G. morhua is highly exploited provoking dramatic fish stock depletion. In this framework the commercialization of different fish species, presenting similar organoleptic and morphological characteristics, as if they were G. morhua, is a very attractive practice for unscrupulous traders. Nowadays the authenticity of foods, particularly of fishes, assumes a crucial importance due to increasing cases of food fraud and its impact on consumers. Food authentication is therefore highly focused by researchers who had developed a high number of methodologies for species discrimination throughout the use of specific markers as proteins and DNA, being this last progressively more used in food authentication. The main objective of the present work consisted in the development of molecular markers for the authentication (species identification) of codfish in salted and deep-frozen products using the High Resolution Melting Analysis technique. Thirty three samples were acquired in the markets commercialized under the designation of G. morhua, G. macrocephalus and G. Chalcogrammus, as whole fish, shredded and deep-frozen products. Species were firstly identified by sequencing de barcode region cytochrome-oxidase subunit I (COI) gene. We found that 93 % of the samples were correctly identified in the label however two adulterations were labeled as G. morhua but identified as G. macrocephalus, of less commercial value. In the following step, 7 new HRMA markers were developed by de novo designing primer pairs for the amplification of short fragments (ca. 100 bp) in polymorphic regions of the COI gene. The chosen methodology, as well as the selected newly developed markers, proved to be very efficient in discriminating the species Gadus morhua from others, which permitted the correct identification of the specie in 97% of the samples. The present study demonstrated that the species substitution can be detected by the HRMA methodology in a fast and specific way configuring thus a robust tool for food authentication. Palavras-chave: Authenticity, PCR, HRMA, barcoding, Gadus. vii ÍNDICE GERAL Páginas Publicações iii Agradecimentos iv Resumo v Abstract vi Índice Geral vii Índice de Figuras viii Índice de Tabelas x Lista de Abreviaturas xi 1.Introdução e Objetivos 2 1.1. A Importância do peixe na alimentação 3 1.2. A Importância ecológica do peixe 4 1.3. Espécies de peixes com relevância alimentar e comercial 6 1.3.1. Espécies de peixes mais comercializadas 6 1.4. Identificação e autenticação de espécies 8 1.4.1. Importância do controlo de espécies em produtos alimentares 8 1.4.2. Autenticidade do bacalhau (Gadus spp.) 11 1.4.3. Metodologias para a identificação de espécies de peixes 15 1.4.3.1. Marcadores moleculares clássicos: proteínas e ADN 16 1.4.3.2. Sequenciação de regiões do ADN barcoding 25 1.4.3.3. Análise de fusão de alta resolução (HRMA) 29 2.Materiais e Métodos 2.1. Amostragem 33 2.2. Preparação das amostras e extração de ADN 35 2.3. Quantificação de ADN nos extratos 38 2.4. Amplificação por PCR e eletroforese dos produtos amplificados 39 2.5. Protocolo para purificação dos fragmentos amplificados para sequenciação 40 2.6. Análise das sequências e filogenia 41 2.7. Desenho de novos primers 42 2.8. Otimização das condições de amplificação dos novos primers 43 2.9. Protocolo da amplificação e análise de fusão em PCR em tempo real 43 3.Resultados e Discussão 3.1. Quantificação de ácidos nucleicos, avaliação da pureza e estado de degradação de ADN nos extratos 46 3.2. Análise das sequências e filogenia 50 3.3. Desenho de novos primers para pequenos fragmentos polimórficos 54 3.4. Otimização das condições de amplificação dos novos primers 56 3.5. HRMA do gene COI 59 3.6. Otimização das condições analíticas em HRMA 60 3.7. Desempenho dos novos primers em HRMA 62 3.8. Aplicação dos marcadores desenvolvidos para a distinção HRMA da totalidade das amostras 66 4.Conclusão 73 5.Bibliografia 76 viii ÍNDICE DE FIGURAS Páginas Figura 1 – Gadus morhua. 11 Figura 2 - Produção mundial de captura da espécie Gadus morhua (Adaptado de http://www.fao.org/fishery/species/2218/en). 12 Figura 3 - Produção mundial de captura da espécie Gadus macrocephalus (Adaptado de http://www.fao.og/fishery/species/3011/en). 13 Figura 4 - Produção mundial de captura da espécie Gadus chalcogrammus (Adaptado de http://www.fao.og/fishery/species/3011/en). 13 Figura 5 - Gadus macrocephalus. 14 Figura 6 - Gadus chalcogrammus. 14 Figura 7 - Mapa das zonas de pesca da FAO (adaptado de http://www.fao.org/fishery/area/search/en). 15 Figura 8 - Esquema das diferentes etapas da técnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP) (Adaptado de (Semagn et al. 2006)). 18 Figura 9 - Desenho esquemático de condições de reação para ADN polimórfico amplificado ao acaso (RAPD) (Adaptado de (Semagn et al. 2006)). 20 Figura 10 - Passos em análise AFLP (Adaptado de (Semagn et al. 2006)). 21 Figura 11 - Desenho esquemático de marcadores SSR. Os segmentos a azul indicam fragmentos repetitivos cujo número varia em diferentes indivíduos e as setas pretas os primers para amplificação da zona de repetição (Adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechSTS.shtml). 22 Figura 12 - SNP descoberta por um alinhamento de traços de sequência obtida a partir de sequenciação direta de produtos de PCR genómicas (Adaptado de (Semagn et al. 2006)). 23 Figura 13 - Curva da diferença das espécies que mostram onde as amostras têm sido identificadas a partir da morfologia. Amostra de referência, M. carinatus (baseline vermelho), M. carinatus (vermelho) amostras incluídas M. Halotrachys (azul) (Adaptado de (Fitzcharles 2012)). 31 Figura 14 - Protocolo de extração de ADN pelo Kit NucleoSpin® Food. 36 Figura 15 - Adaptador para leitura de absorvência em pequenos volumes (min. 4 microlitros) num leitor de placas. 38 Figura 16 - Termociclador (C1000) e módulo ótico de PCR em Tempo Real (CFX96). 44 Figura 17 - Gel de agarose das amostras de bacalhau extraídas pelo KIT Nucleospin Food utilizando gel genómico. L: Ladder (Lambda DNA/Hindlll Marker,2). 47 Figura 18 - Gel de agarose das amostras de bacalhau extraídas pelo método SDS/Ureia utilizando gel genómico. L: Ladder (Lambda DNA/Hindlll Marker,2). 47 Figura 19 - Árvore filogenética Neighbor-Joining das 30 amostras sequenciadas para o gene COI. 52 Figura 20 - Gel de agarose dos produtos de amplificação em PCR convencional dos primers Gadus_3, Gadus_4 e Gadus_6. 58 ix Figura 21 - Curvas diferenciais resultantes de HRMA de 600 pb do gene COI as amostras 10,15,21 da espécie G.morhua, 2,3,16 da espécie G.macrocephalus e 6,20,23 da espécie G.chacogrammus. 59 Figura 22 - Curvas diferenciais de fusão para três amostras de cada espécie amplificadas nas diluições 1:20 e 1:50 para o per de primers Gadus_7. 61 Figura 23 - Curvas diferenciais de fusão usando o par de primers Gadus_1 e Gadus_6 para 3 amostras de cada espécie. 62 Figura 24 - Curvas diferenciais de fusão usando os pares de primers Gadus_3, Gadus_4 e Gadus_5 para 3 amostras de cada espécie. 63 Figura 25 - Curvas diferenciais de fusão usando o par de primers Gadus_7 em três amostras de cada espécie. 64 Figura 26 - Curvas diferenciais de fusão usando o par de primers Gadus_2 em três amostras de cada espécie. 65 Figura 27 - Curva de fusão não processada dos sinais de amplificação de todas as amostras (Primers Gadus_2). A linha a preto representa um branco de amplificação. 66 Figura 28 - Curvas de fusão normalizadas ao longo do eixo de temperatura. 67 Figura 29 - Curvas diferenciais de fusão dos fragmentos amplificados pelo primer Gadus_2 para as 33 amostras, em duplicado. 68 Introdução e Objetivos 5 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Segundo a FAO, 38% de todo o peixe produzido atualmente no mundo é exportado e, em termos de valor, mais de dois terços das exportações de pescado dos países em desenvolvimento destinam-se aos países mais desenvolvidos. Neste contexto, em que a China assume um papel importante, por se estar a transformar num importante e crescente mercado de consumo de peixes, tem-se registado um aumento dos investimentos em aquacultura, a fim de responder à procura. O mesmo documento prevê que, em 2030, a Ásia venha a representar 70% do consumo mundial de peixe. No sentido contrário, a África vai registar uma diminuição do consumo de peixe per capita, de 1% ao ano, desde 2010 até 2030 (Bank 2013). Introdução e Objetivos 6 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 1.3. ESPÉCIES DE PEIXES COM RELEVÂNCIA ALIMENTAR E COMERCIAL 1.3.1. ESPÉCIES DE PEIXES MAIS COMERCIALIZADAS A base de dados relativos à captura mundial da FAO inclui estatísticas para quase 1600 espécies marinhas, sendo que as 23 espécies e géneros cuja captura ultrapassou uma média anual de meio milhão de toneladas em 2011 e 2012 (Tabela 1) representam apenas cerca de 40 por cento do total de captura. Quase dois terços dessas espécies principais não dependem dos fundos marinhos para viverem, apresentando notórias transformações devidas às alterações ambientais. Em vários casos, elas são amplamente utilizadas como matéria-prima na transformação em farinha e óleo de peixe, caracterizando-se pelo seu baixo valor comercial (FAO 2014). Tabela 1 – Captura Marinha: principais espécies e géneros. Ranking 2012 Nome comum Nome científico 2012 (toneladas) Variação (percentagem 2003– 2012 2011-2012 1 Anchoveta Engraulis ringens 4 692 855 – 24.4 – 43.6 2 Escamudo-do-alasca Theragra chalcogramma 3 271 426 13.3 2.0 3 Atum-bonito Katsuwonus pelamis 2 795 339 28.0 5.7 4 Sardinela Sardinella spp. 2 345 038 14.2 0.0 5 Arenque Clupea harengus 1 849 969 – 5.6 3.9 6 Cavala Scomber japonicus 1 581 314 – 13.4 – 7.8 7 Carapau Decapterus spp. 1 441 759 0.2 4.2 8 Albacora Thunnus albacares 1 352 204 – 9.8 9.1 9 Biqueirão-do-IndoPacífico Engraulis japonicus 1 296 383 – 31.8 – 2.2 10 Chibata Trichiurus lepturus 1 235 373 – 1.1 – 1.8 11 Bacalhau do Atlântico Gadus morhua 1 114 382 31.3 6.0 12 Sardinha Sardina pilchardus 1 019 392 – 3.1 – 1.7 13 Capelim Mallotus villosus 1 006 533 – 12.0 17.9 14 Alabote Dosidicus gigas 950 630 136.4 4.9 15 Serra do pacífico Scomberomorus spp 914 591 30.3 – 0.4 16 Cavala Scomber scombrus 910 697 32.1 – 3.7 17 Espadilha Strangomera bentincki 848 466 179.1 – 4.4 18 Farolito Acetes japonicus 588 761 8.4 7.0 19 Menhadem-escamudo Brevoortia patronus 578 693 10.8 – 7.2 20 Falso-besugo-doirado Nemipterus spp. 576 487 – 9.4 4.6 21 Anchova Engraulis encrasicolus 489 297 – 21.1 – 19.4 22 Carapau-chileno Trachurus murphyi 447 060 – 75.1 – 29.5 23 Sardinha australiana Sardinops caeruleus 364 386 – 42.5 – 43.0 Fonte: Adaptada de FAO, 2014 (Adaptado de State & Fisheries, 2014). Introdução e Objetivos 7 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Em relação aos peixes mais comercializados no mundo, a FAO refere diferentes percentagens de valor total dos produtos comercializados, e estas estão apresentadas na tabela 2. Tabela 2 – Percentagens dos peixes mais comercializados no mundo. Fonte: Adaptada de FAO, 2015 (http://www.fao.org/news/story/pt/item/214518/icode/). Pelos dados apresentados pode atestar-se e importância quer ambiental quer económica do bacalhau como espécie de relevo na alimentação humana. A alteração dos hábitos de consumo e de pesca, à escala global, tem posto em causa a sobrevivência de algumas espécies. A preservação da biodiversidade marinha implica evitar a captura em épocas de defeso, isto é, quando as espécies piscícolas estão em reprodução ou são espécies juvenis. Os produtos do mar apresentam períodos de abundância, que correspondem à maturidade das espécies, sendo durante os mesmos que o consumidor pode adquirir um produto melhor e a preços mais interessantes 7 . 7 Cf. http://www.docapesca.pt/pt/do-mar-ao-prato.html (acedido em junho de 2014). Peixes Percentagem (%) Camarão 15 Salmão e Truta 14 Peixes de fundo (bacalhau, pescada, arinca e escamudo) 10 Atum 9 Cefalópodes (polvos, lulas e chocos) 3 Farinha de peixe 3 Óleo de peixe 1 Introdução e Objetivos 8 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 1.4. IDENTIFICAÇÃO E AUTENTICAÇÃO DE ESPÉCIES 1.4.1. IMPORTÂNCIA DO CONTROLO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS ALIMENTARES É talvez um reflexo da condição humana que a fraude de uma forma ou outra tem acompanhado as transações comerciais ao longo de muitos séculos. Em questões de autenticidade não é só o consumidor final que sofre, também a indústria de alimentos é cada vez mais atingida e isso pode efetivamente significar a ruína para um fabricante de alimentos (Ashurst and Dennis 1996). Normalmente, as questões de autenticidade de alimentos não representam uma ameaça para a saúde pública. No entanto, esta afirmação baseia-se fortemente sobre a moralidade das pessoas envolvidas em atividades ilícitas. Mas podem resultar consequências graves, se alguns fabricantes não tiverem consideração com a saúde humana, no intuito de ganhar dinheiro (Ashurst and Dennis 1996; Scarano and Rao 2014). Esta questão da autenticidade é, portanto, de grande importância para os organismos fiscalizadores que precisam ter conhecimento não apenas como surgem os problemas, mas como eles podem ser monitorados e avaliados (Ashurst and Dennis 1996; Scarano and Rao 2014). A identificação das espécies de peixes constituintes dos produtos alimentares é uma questão primordial para a verificação da veracidade da rotulagem do produto. Uma das formas mais comuns de adulteração de produtos à base de peixe envolve a substituição por outras espécies de menor valor económico, tendo em vista o aumento do lucro económico. A legislação, cada vez mais exigente, indica a necessidade de rotular produtos de peixe com a denominação comercial e científica que é regulada pelo regulamento da União Europeia Nº.1379/2013, a fim de garantir a rastreabilidade em toda a cadeia e, assim, evitar possíveis fraudes (Herrero et al. 2010; Lamendin et al. 2015; Pinto et al. 2013). Foram assim implementadas algumas regulamentações para assegurar a informação completa e correta, garantindo assim a transparência do mercado. Como consequência, estes regulamentos exigem o desenvolvimento de ferramentas analíticas para tornar possível a distinção entre espécies estreitamente relacionadas (Mohanty et al. 2013). A autenticação de espécies de peixes é um desafio particularmente difícil uma vez que se estima que mais de 800 espécies de peixes são internacionalmente comercializadas sob diferentes formas, marcas e preparações. Como os preços são diferentes, dependendo das preferências de produtos de diferentes espécies e de consumo, é importante que os mercados e o ambiente protejam devidamente os consumidores contra práticas dolosas Introdução e Objetivos 9 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) que consistem, nomeadamente, em substituir espécies de valor mais alto por outras espécies semelhantes de menor valor 8 . A nível nacional, a legislação alimentar determina genericamente que o rótulo não deve induzir em erro os consumidores, mas o comércio internacional e o uso de diferentes produtos com termos semelhantes tornam o sistema de rotulagem bastante complicado8. Espécies diferentes podem ter o mesmo nome em países diferentes (ou regiões de um mesmo país). Por outro lado, por vezes, a mesma espécie tem nomes diferentes na mesma língua, em diferentes locais do próprio país. Por exemplo, nos países nórdicos, os enlatados Sprattus sprattus são rotulados como sardiner ou ansjos e os não enlatados são chamados de brisling, no entanto, noutros países, referem-se à sardinha como Sardina pilchardus e à anchova como da espécie Engraulidae. O nome robalo é muito utilizado no comércio internacional, mas refere-se a diferentes espécies de várias famílias, sendo mesmo denominado de peixe-gato, podendo originar informação enganosa8. Por outro lado, as empresas de produção de alimentos, associações comerciais e, até mesmo, países inteiros podem ser protetores de nichos de mercado para determinadas espécies de peixes e produtos. Isto acontece porque exigem um investimento significativo na pesquisa e desenvolvimento, publicidade, promoção e sensibilização dos consumidores para os atributos reclamados do produto específico que tentam proteger para a criação de tais nichos de mercado. Portanto, as empresas de sucesso, ou os países, não aceitam que outros produtos idênticos usem a mesma denominação, a mesma publicidade, e também não aceitam a competição no mercado. Isto pode ser uma fonte de disputas comerciais entre países, de que exemplos recentes mostram que a identificação de espécies de peixe é um problema recorrente no mundo. Embora esses conflitos envolvam geralmente um número limitado de países, têm um impacto direto sobre o comércio internacional de pescado8. Os problemas de autenticidade que são detetados em produtos alimentares com base em peixe podem dividir-se em quatro grandes categorias: relativamente à origem (origem geográfica ou selvagem/aquicultura); por substituição, nomeadamente, de proteínas do peixe, gordura, a fim de intencionalmente enganar o consumidor; no tratamento, mormente se um produto congelado é passado a fresco ou um produto irradiado é vendido como não irradiado; e problemas diversos, que ocorrem, por exemplo, quando usados corantes artificiais que são referidos como naturais, o uso de conservantes não é referido no rótulo ou o nível de água adicionada é subdeclarado (Arvanitoyannis et al. 2005). Na tabela 3 estes são apresentados de uma forma resumida. 8 Cf. http://www.fao.org/fishery/topic/14807/en (acedido em janeiro de 2014). Introdução e Objetivos 10 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Tabela 3 – Problemas de autenticidade que são encontrados nos produtos alimentares com base em peixe. Origem - Quanto a origem geográfica não é corretamente assinalada - Quando consta que o produto é selvagem, sendo na realidade proveniente de aquicultura Substituição - Por outras proteínas de peixe ou por outra gordura - Outras substituições, a fim de intencionalmente enganar o consumidor Tratamento - Congelado a ser passado a fresco - Produto irradiado vendido como não irradiado Diversos problemas - Uso de corantes artificiais e serem identificados como naturais; ou de conservantes não referidos nos rótulos - Nível de água adicionada que é subdeclarado Fonte: Baseada em informação de Arvanitoyannis, 2005. Verifica-se assim que para aumentarem o seu lucro, os fabricantes podem ser tentados a rotular incorretamente os respetivos produtos alimentares, substituindo espécies por outras de menor qualidade ou menor valor comercial e/ou adicionando ingredientes de menor qualidade nos mesmos (Druml and Cichna-Markl 2014; Herrero et al. 2010; Pinto et al. 2013). Daí a importância do controlo de espécies e alimentar, por forma a garantir que os consumidores não sejam defraudados nas suas escolhas alimentares (Galal-Khallaf et al. 2014). Nos últimos anos, foram desenvolvidos vários métodos analíticos para a identificação de espécies e controlo da autenticidade de alimentos. Métodos analíticos específicos e sensíveis são necessários para verificar a conformidade dos alimentos com a respetiva declaração, a fim de proteger os consumidores de práticas fraudulentas. Estes métodos desempenham, pois, um papel importante, indo desde os métodos físicos, alicerçados na microscopia, aos métodos baseados no ADN, passando pelas técnicas que recorrem à análise de proteínas (Druml and Cichna-Markl 2014; Galal-Khallaf et al. 2014; Scarano and Rao 2014). Introdução e Objetivos 11 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 1.4.2. AUTENTICIDADE DO BACALHAU (Gadus spp.) O futuro do bacalhau em Portugal esteve em discussão num encontro onde reuniu produtores, importadores e exportadores de bacalhau, representantes da distribuição (retalho) e de outras empresas norueguesas ligadas à pesca e ao processamento de bacalhau. Durante o evento foram analisados dados concretos sobre a situação atual dos recursos, quotas, dados estatísticos sobre o consumo de bacalhau em Portugal durante o ano de 2013 e as respetivas previsões do consumo para os dois anos seguintes. Da análise disponível, concluiu-se que em Portugal no ano 2013 o bacalhau vendido através de retalho foi de 58 000 toneladas, o que resultou num aumento total de 11,4%. Devido ao crescimento da procura de bacalhau seco salgado, este teve um aumento de 14,7%, enquanto que a diminuição da procura do demolhado / ultracongelado, verificou-se um decréscimo de 9%. Apesar das elevadas quotas de pesca de bacalhau do ano 2013, segundo as previsões científicas, estas irão normalizar no decorrer dos próximos anos 9 . O Bacalhau do Atlântico (Gadus morhua, figura1) é um dos peixes mais consumidos em vários países europeus, assumindo uma especial importância em Portugal, quer pela quantidade consumida quer pela importância gastronómica e mesmo cultural. Como o consumo mundial aumentou, houve então a diminuição nas capturas, e como consequência, provocou uma escassez desta espécie, como se pode observar na figura 2. As razões por esta escassez ou diminuição da captura deve-se ao aumento do consumo em todo o mundo desta espécie e aos seus altos níveis de exploração. Como existiu uma queda de volume das existências do bacalhau do Atlântico, a União Internacional para a Conservação da Natureza (IUCN) e a Convenção para a Proteção do Ambiente Marinho do Nordeste Atlântico (OSPAR) incluiu esta espécie na lista vermelha como uma espécie vulnerável com estatuto de ameaçada (http://www.greenpeace.org/portugal/pt/O-que-fazemos/Campanha-Dos-OceanosMercados-em-Portugal/lista-vermelha/). Esta situação trouxe a procura e captura de espécies alternativas, aumentando o seu número no mercado para assim atender à demanda dos consumidores. Neste contexto, a comercialização de diferentes espécies de peixes, apresentando características organoléticas e morfológicas semelhantes, como se fossem Gadus morhua, é uma prática muito tentadora para os comerciantes sem 9 Cf.http://www.mardanoruega.com/Articles/Portugal/Saiba-mais/Artigos/O-Futuro-do-Bacalhau-volta-a-sertema-de-discuss%C3%A3o-em-Portugal (acedido em junho de 2015). Figura 1 – Gadus morhua. Introdução e Objetivos 12 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) escrúpulos. Além disso, o aumento dos produtos transformados e a existência de um mercado global, pode levar a substituições de espécies liberalmente ou acidentalmente. Alguns exemplos de substitutos para o bacalhau do atlântico são o bacalhau do Pacífico (Gadus macrocephalus), bacalhau da Gronelândia (Gadus ogac), maruca (Molva molva), juliana (Pollachius pollachius), escamudo (Pollachius virens), arinca (Melanogrammus aeglefinus), paloco do Alasca (Theragra chalcogramma ou Gadus chalcogrammus), verdinho (Micromesistius poutassou), pescada (Merluccius spp), e badejo (Merlangius merlangius) (Herrero et al. 2010; Lago and Vieites 2012; Pinto et al. 2013). Figura 2 - Produção mundial de captura da espécie Gadus morhua (Adaptado de http://www.fao.org/fishery/species/2218/en). O bacalhau da espécie Gadus morhua é pescado na zona da FAO 27 (figura 7) e tem origem no Atlântico Nordeste. É dos peixes mais nobres pescados na Noruega e na Islândia. Este Bacalhau poderá também aparecer identificado como Bacalhau do Atlântico. É comercializado fresco, refrigerado ou congelado, inteiro ou como filetes, secos e salgados, secos e sem sal, em salmoura ou fumados. Outros produtos obtidos a partir do bacalhau são caras de bacalhau salgadas, línguas de bacalhau em salmoura, óleo de fígado, entre outros 10 . Em Portugal as espécies de gadoides mais comercializados e simultaneamente os mais prováveis substitutos para o bacalhau do Atlântico (G. morhua) são o bacalhau do Pacífico (G. macrocephalus) e o paloco do Alasca (Theragra chalcogramma ou G. chalcogrammus). 10 Cf.http://correiogourmand.com.br/info_03_dicionarios_gastronomicos_alimentos_carnes_pescados_peixe_b acalhau_06_os_tipos.htm (acedido em Fevereiro de 2015). Introdução e Objetivos 13 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Por isto, houve então um aumento nas capturas destas espécies, como se pode observar nas figuras 3 e 4. Figura 3 - Produção mundial de captura da espécie Gadus macrocephalus (Adaptado de http://www.fao.og/fishery/species/3011/en). Figura 4 - Produção mundial de captura da espécie Gadus chalcogrammus (http://www.fao.org/fishery/species/3017/en). Introdução e Objetivos 14 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) O bacalhau da espécie Gadus macrocephalus (Bacalhau do Pacífico, figura 5) ordem dos Gadiformes, família Gadidae e gênero Pollachius, pode ser encontrado com alguma frequência tanto em Portugal como no Brasil. É um peixe de menor qualidade, mas é mais branco que o Bacalhau do Atlântico e não apresenta uma textura, nem sabor a que as pessoas estão habituadas. Houve uns anos em que o consumo do Bacalhau do Pacífico foi elevado, pois o seu preço era baixo comparativamente com o do Atlântico 11 . O Theragra chalcogramma (figura 6), ordem dos Gadiformes, família Gadidae, gênero Theragra mais conhecido como paloco, é um parente bastante mais económico do Bacalhau, sendo que o mesmo é pescado tanto na zona do Alasca como nas zonas da Rússia e China. Atualmente é classificado no género Gadus, espécie G. chalcogrammus. É um peixe de tamanho pequeno, e aparece normalmente no formato de migas, como substituto às migas de bacalhau. Em Portugal e no Brasil é fácil de encontrar, a maioria importado da China, com uma variabilidade enorme em termos de qualidade. Em Portugal, os desfiados de paloco aparecem com frequência mal identificados em termos de rotulagem, pois é muito vendido como paloco do Alaska, pescado na zona FAO 67 (figura 7), mas são importados da China e pescados em maioria na zona FAO 61 (figura 7). Gastronomicamente o paloco é mais macio, magro, de sabor suave, de cor branca e é considerado um peixe de alta qualidade. É muito usado na culinária coreana, japonesa e russa 12 . Como referido, estas duas espécies apresentam características morfológicas semelhantes ao bacalhau do Atlântico (mais escasso e de maior valor gastronómico) pelo que são aquelas que mais frequentemente são usadas na substituição fraudulenta nobre G. morhua. Desta forma, o desenvolvimento de metodologias para a autenticação de bacalhaus, com um maior foco na substituição da espécie G. morhua, deve focar estas referidas espécies. 11 Cf.http://correiogourmand.com.br/info_03_dicionarios_gastronomicos_alimentos_carnes_pescados_peixe_b acalhau_06_os_tipos.htm (acedido em Fevereiro de 2015). 12 Cf.http://correiogourmand.com.br/info_03_dicionarios_gastronomicos_alimentos_carnes_pescados_peixe_b acalhau_06_os_tipos.htm (acedido em Fevereiro de 2015). Figura 5 – Gadus macrocephalus. Figura 6 – Gadus chalcogrammus. Introdução e Objetivos 21 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Figura 10 - Passos em análise AFLP (Adaptado de (Semagn et al. 2006)). Com estes marcadores, não é necessário o conhecimento prévio de dados de sequência de ADN para a construção dos primers utilizados, mas a criação de grande número de polimorfismos por reação salienta-se como uma vantagem. O alto custo, as várias etapas e reagentes necessários à obtenção dos marcadores são algumas das desvantagens (Faleiro 2007). Embora a análise de AFLP tem sido extensivamente utilizada para a pesquisa genética envolvendo plantas, fungos e bactérias, tem sido testada para um uso limitado na pesquisa de animais. Os marcadores AFLP foram desenvolvidos por algumas espécies aquáticas, incluindo o peixe-gato, ostras, truta e atum. Estes ainda não foram muito explorados na Introdução e Objetivos 22 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) investigação de fraudes de peixe porque são relativamente demorados e não são adaptados para aplicações de larga escala. Para superar esses contratempos, os pesquisadores utilizaram a análise com AFLP em truta arco-íris para desenvolver um marcador específico da espécie. Os primers foram desenhados para amplificarem um segmento desse marcador, que permitiu assim, a diferenciação da truta arco-íris e do salmão do Atlântico. Sendo assim, permitiu a confiabilidade e a facilidade do método para aplicações em deteção de fraude comercial (Rasmussen and Morrissey 2008). SSRs (Simple Sequence Repeats), STR (Short tandem repeats) ou marcadores microssatélite (figura 11) são sequências de 1 a 6 nucleotídeos que se repetem no genoma de eucariotas. Estes marcadores SSRs baseiam-se no uso de primers que através da reação de PCR amplificam estas regiões e após separação dos fragmentos amplificados as variações de tamanho são detetadas. Estes marcadores têm vantagens em relação aos RFLPs como serem baseados em PCR, de menor custo e menos trabalhosos. Microssatélites são um sub grupo dos marcadores VNTRs (Variable Number Tandem Repeats) que incluem também os marcadores do tipo minissatélite cujo bloco repetitivo contém mais que 6 nucleótidos (Dantas and Nodari). Os microssatélites são marcadores relativamente curtos característica que permite que amostras e quantidades mínimas de ADN, ou com alto grau de degradação, possam ser tipadas (Dantas and Nodari). Figura 11 – Desenho esquemático de marcadores SSR. Os segmentos a azul indicam fragmentos repetitivos cujo número varia em diferentes indivíduos e as setas pretas os primers para amplificação da zona de repetição (Adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechSTS.shtml) Introdução e Objetivos 23 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Os ensaios com SSRs são mais robustos do que com RAPDs e mais versáteis do que com AFLPs. Foram feitos estudos para a análise genética de duas espécies de carpa, Cyprinus carpio L. e Ctenopharyngodon idella, sendo utilizados os marcadores SSRs em conjunto com os AFLPs, pois a carpa é um peixe importante para a aquacultura. Os marcadores SSRs ou microssatélites têm sido considerados como um dos marcadores moleculares eficientes que fornecem informação genética devido à sua codominância, alta taxa de mutação e apresentam alto polimorfismo. O desenvolvimento de marcadores microssatélites exigia um dispendioso esforço técnico, com procedimentos caros e demorados. Entretanto com os avanços da tecnologia, apareceram métodos mais eficientes e de baixo custo para desenvolver marcadores moleculares para espécies que não possuam dados disponíveis (Liu et al. 2011; Tavares et al. 2014). Em relação aos marcadores SNPs (figura 12), estes são utilizados para identificar mutações em apenas um único nucleotídeo constituindo fontes abundantes de variação genética. O polimorfismo de sequência nucleotídica (SNP) é relevante para estudos filogenéticos de evolução dentro da espécie, no mapeamento genético e na diferenciação de alelos do mesmo gene. Em comparação com outros marcadores, tem como vantagem a possibilidade de deteção de grande quantidade de polimorfismos entre alelos de determinado gene; como desvantagens, salienta-se a necessidade de conhecimento prévio da sequência do gene de interesse e o custo da técnica envolvida nas etapas inerentes à sequenciação dos diferentes fragmentos do ADN de interesse. A elevada variabilidade dos marcadores SNP permitem, por exemplo, distinguir indivíduos originários de diferentes populações tendo grande importância no controlo ecológico destas (Faleiro 2007; Scarano and Rao 2014). Figura 12 - SNP descoberta por um alinhamento de traços de sequência obtida a partir de sequenciação direta de produtos de PCR genómicas (Adaptado de (Semagn et al. 2006)). Introdução e Objetivos 24 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) A tabela 4 sintetiza as vantagens e desvantagens dos vários tipos de marcadores moleculares referidos anteriormente. Tabela 4 – Vantagens e desvantagens dos diversos marcadores moleculares usados para a identificação de peixes Marcadores Vantagens Desvantagens Isoenzimas - Baixo custo - Baixo número dos sistemas enzimáticos - Fácil e rápido RAPD - Necessidade de quantidades mínimas de ADN - Baixa reprodutibilidade - Fácil e rápido - Generalização das análises - Sensível - Trabalha-se com qualquer espécie SPAR - Amplificação via PCR utilizando um único primer - Conhecimento prévio da sequência RFLP - Alta reprodutibilidade - Demorado e caro - Necessidade de sondas específicas - Necessidade de grandes quantidades de ADN AFLP - Não é necessário o conhecimento prévio da sequência - Custo elevado - Criação de grande número de polimorfismos - Utilização de várias etapas SNP - Possibilidade da deteção de grande número de polimorfismos - Conhecimento prévio da sequência - Custo elevado Fonte: Baseada em informação de Faleiro, n.d.. Os marcadores mencionados utilizam geralmente as informações contidas no genoma nuclear. Contudo, o polimorfismo encontrado no ADN mitocondrial, bem como as suas características genéticas (herança materna, genoma haploide, ausência de recombinação, sensibilidade aos efeitos da origem genética e alta taxa evolutiva) fizeram deste genoma uma excelente fonte de informações genéticas para estudos taxonómicos e populacionais (Hilsdorf 2010). Embora o ADN nuclear (nDNA) e o ADN mitocondrial (mtDNA) possam ambos servir na identificação de espécies, a análise do ADN mitocondrial oferece inúmeras vantagens relativamente à identificação de ADN nuclear (Cawthorn et al. 2011). Assim, o genoma mitocondrial têm sido recentemente alvo de desenvolvimento de marcadores moleculares não só pelas vantagens apresentadas mas também pelo facto de existir num elevado número de cópias em cada célula correspondente ao elevado número de mitocôndrias presentes. Este facto permite uma maior sensibilidade nas metodologias, nomeadamente nas utilizadas na autenticação de alimentos processados, pois o maior Introdução e Objetivos 25 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) número de cópias das regiões alvo está diretamente relacionado com a quantidade de fragmentos amplificados obtidos após a reação de PCR (Hilsdorf 2010). Todos os marcadores anteriormente referidos utilizam a eletroforese em gel para finalização da identificação de espécies, o que comporta alguns inconvenientes, como a mão-de-obra intensiva, a grande quantidade de tempo despendido, a sua baixa sensibilidade para a deteção de quantidades residuais de ADN e uma grande probabilidade de contaminação cruzada (Bréchon et al. 2013). Surgiram assim novas estratégias para a autenticação de espécies em alimentos tentando contornar os inconvenientes anteriormente referidos. A sequenciação de fragmentos amplificados altamente polimórficos e a utilização da técnica de análise de fusão (HRMA – High Resolution Melting Analysis) na discriminação destes fragmentos são duas metodologias atualmente em desenvolvimentos e que serão descritas seguidamente pela sua importância na autenticação de alimentos por métodos moleculares recentemente desenvolvidos. 1.4.3.2. SEQUENCIAÇÃO DE REGIÕES DO ADN BARCODING Apesar do considerável número de marcadores moleculares que têm sido usados para a discriminação de espécies de peixes, a sequenciação de regiões específicas e altamente variáveis entre espécies assume cada vez maior importância como técnica de referência de alta precisão. A comunidade científica tem desenvolvido esforços no sentido de uniformizar as regiões genómicas usadas para a identificação de espécies. Estes resultaram na definição de algumas zonas no genoma contendo simultaneamente zonas altamente polimórficas e zonas razoavelmente conservadas (num grande leque taxonómico) que permitem a utilização de primers universais ou pelo menos dedicados a grandes grupos taxonómicos. A estas regiões chamaram-se ADN barcodes a sua utilização tem-se generalizado em todas as áreas da ciência que necessitem de discriminar espécies (Ederal et al. 2013; Galimberti et al. 2013). ADN barcoding é assim um método usado, entre outras aplicações, com a finalidade de identificar e discriminar espécies (Galal-Khallaf et al. 2014; Kalivas et al. 2014). Trata-se de um sistema recente, criado para proporcionar rápidas e precisas identificações de espécies, através da sequenciação de segmentos relativamente curtos de genes (Ederal et al. 2013; Hebert and Gregory 2005; Kim et al. 2010), ou seja, é um sistema de base molecular que permite aos cientistas identificar espécies, através da comparação de sequências no ADN da amostra, obtidas por sequenciação laboratorial, com as sequências Introdução e Objetivos 26 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) de referência presentes em bases de dados. O seu sucesso depende da variabilidade molecular entre espécies e da disponibilidade de repositórios de sequências de referência (sequências de ADN de espécies conhecidas) de alta qualidade (Galimberti et al. 2013). O ADN barcoding veio também acelerar o ritmo da descoberta de novas espécies, permitindo que os taxonomistas as classifiquem rapidamente e que evidenciem diferentes características que possam representar novas espécies (Hebert and Gregory 2005; Scarano and Rao 2014). Devido à elevada variação entre espécies e a baixa variação intra-espécies, o gene mtDNA mais comum e mais utilizado nas pesquisas de identificação de espécies tem sido o cyt b. Recentemente, foi desenvolvido e introduzido como uma ferramenta taxonómica para identificação de animais um sistema de identificação baseado na região do citocromo c oxidase subunidade I (COI). Portanto, este sistema de identificação baseado na região COI tem sido utilizado com sucesso como uma ferramenta confiável e universal para a identificação de espécies. O gene COI tem duas vantagens importantes, em primeiro lugar os primers universais utilizados para este gene são muito robustos, permitindo assim a recuperação final de mais de 50 representantes de filos animais e em segundo lugar, o COI parece ter uma maior amplitude de sinal filogenético do que qualquer outro gene mitocondrial. Com isto, alguns autores, referiram que uma sequência de um gene único seria suficiente para diferenciar todos, ou pelo menos, a grande maioria de espécies animais utilizando o gene mitocondrial do ADN citocromo-oxidase da subunidade I (COI) como um sistema global para a identificação de animais. A sequência é comparada a um código de barras (DNA barcoding), com espécies que estão a ser delineadas por uma sequência particular ou por um conjunto apertado de sequências muito semelhantes (GalalKhallaf et al. 2014). A sua utilidade como técnica de autenticação de alimentos, particularmente de peixes, é evidente e apresenta inúmeras vantagens pois pode ser utilizada para identificar espécies, com alta precisão, em peixe inteiro, filetes, barbatanas, peixe juvenil, ovos ou fragmentos de tecidos (Hanner et al. 2011). Daí que tenha evoluído recentemente como um instrumento molecular rápido e confiável na identificação de espécies (Geiger et al. 2014). Vários genes têm sido estudados como possíveis região barcoding para os grandes grupos taxonómicos das plantas, fungos, animais, etc., tendo a comunidade científica chegado a acordo na definição de um gene ou grupos de genes como regiões barcoding para cada um desses grupos. Introdução e Objetivos 27 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) No caso dos animais vários estudos têm confirmado que, aproximadamente, 650 pb da região 5’ da citocromo C oxidase subunidade I (COI) (Galal-Khallaf et al. 2014) pode ser usado como um código de barras de ADN para identificar a maioria das espécies de animais, ou seja, é como um sistema universal de identificação adequado para estas espécies (Cawthorn et al. 2011; Holmes et al. 2009; Keskın and Atar 2013; Kim et al. 2010; Lakra et al. 2011; Rasmussen Hellberg et al. 2010; Ribeiro et al. 2012; Wong and Hanner 2008). O citocromo C oxidase I (COI) tem duas vantagens importantes: em primeiro lugar, os primers universais para este gene são muito robustos, permitindo no final a recuperação da maioria, se não de todos, dos filos animais; em segundo lugar, o gene COI tem uma maior gama de sinal filogenético do que qualquer outro gene mitocondrial (Hebert et al. 2003). Vários autores demonstraram que o gene COI é o apropriado para discriminar a diversidade de espécies em todo o filo animal, tendo vindo a ser utilizado para peixes marinhos e de água doce (Lakra et al. 2011). A utilização deste gene irá também fornecer uma solução confiável, de custo eficaz e acessível para o problema atual de identificação de espécies (Hebert et al. 2003). Esta região do gene citocromo c oxidase subunidade 1 (cox1 ou COI) tem tido utilidade para a identificação de espécies de animais e para a descoberta de novas espécies. Vários estudos destacaram o poder de resolução desta abordagem em vários grupos de animais, como aves, peixes, búzios, aranhas e répteis. Além de outros marcadores mitocondriais, o Citocromo b também sido usado, quer pela sua utilidade na filogenia ou para complementar o COI em código de barras de ADN, pois tem sido sugerido como um marcador para determinar espécies fronteiras. Em anfíbios e genes de moluscos, tem sido proposto como marcador de ADN barcoding, complementando o COI (Sarri et al. 2014). Nos últimos anos, o ADN barcoding foi obtido para mais de 6000 espécies de peixes (Lakra et al. 2011). Hoje em dia, estão bem estabelecidos os critérios de um marcador para a sua aplicabilidade universal: um marcador genético precisa de ser suficientemente variável para discriminar diferentes espécies, ser menos variável dentro das espécies, ter locais suficientemente conservados para permitir uma amplificação confiável, trazer informação filogenética suficiente, produzir resultados reprodutíveis em condições de laboratório variáveis e possibilitar o alinhamento de sequências entre espécies de diferentes taxa (Sarri et al. 2014). Esta estratégia tem sido particularmente aplicada para a construção de base de dados de sequências barcoding para espécies de peixes. Várias base de dados dedicadas a peixes têm sido publicadas sendo a mais importante a FISH-BIO (www.fishbol.org), para além das bases de dados generalistas como o GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) Introdução e Objetivos 28 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) onde também estão depositadas sequências de regiões barcoding e a base de dados BOLDSYSTEMS (http://www.boldsystems.org/) de milhares de espécies, continuamente atualizadas e acessíveis ao público (http://www.barcodinglife.org) (Sarri et al. 2014) 13 . Futuramente, o ADN barcoding vai ser muito importante e muito utilizado, pois a necessidade contínua de identificação de animais, mais precisa e segura, para fins taxonómicos, filogenéticos, forenses e de conservação, juntamente com os avanços da tecnologia e os baixos custos de sequenciamento de ADN têm contribuído para valorizar em muito o uso de sequências curtas de ADN. Um problema importante na identificação de espécies continua a residir na escolha de quais os genes a utilizar, devido ao ritmo acelerado de mudanças de sequência que resulta regularmente em divergências acentuadas, mesmo entre espécies estreitamente relacionadas. No entanto, o facto de diferentes partes do genoma mitocondrial evoluírem a taxas diferentes faz com que a decisão sobre o gene adequado sirva para avaliar a delimitação de espécies muito cruciais (Sarri et al. 2014). A par dos taxonomistas, o ADN barcoding pode ser potencialmente útil para cientistas de outras áreas, nomeadamente ecologia, ciência forense, biotecnologia, indústrias de alimentos, alimentação animal e controlo da qualidade dos alimentos. Além disso, a identificação de espécies animais em alimentos está tornar-se numa questão muito importante para a avaliação da composição dos alimentos e a prestação de informação ao consumidor. No entanto, em algumas amostras, a qualidade do ADN pode ser gravemente atingida, evitando a amplificação de fragmentos por PCR de comprimento superior a 250 pb. Assim, o ADN barcoding convencional poderá ser problemático (Sarri et al. 2014). Desta forma um marcador genético deve ser curto o suficiente para permitir a amplificação, precisando também de amostras processadas, de abordagens não-invasivas (peles, penas, fezes, saliva, etc) e de ADN a partir de amostras de arquivo. Ademais, as sequências curtas podem permitir a identificação maciça inter e intraespecífica exata de mutações pontuais por meio da técnica de SSCP, evitando a sequenciação do ADN repetitivo das amostras analisadas. Para superar estes problemas, foi desenvolvido um conjunto universal de primers, através da amplificação de um fragmento de 130 pb do gene COI na região do código de barras. A bioinformática foi usada para projetar primers universais, especificamente dentro do gene de rRNA, de acordo com os critérios acima referidos, a fim de criar um marcador de "mini-barcode". Os primers desenhados foram 13 Cf.http://www.kapabiosystems.com/public/pdfs/kapa-express-extract kits/KAPA_Express_Extract_Fish_DNA_Barcoding_Note.pdf (acedido em dezembro de 2013). Introdução e Objetivos 29 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) testados com uma bateria de procedimentos experimentais, a fim de verificar se eles preenchiam os critérios atribuídos (Sarri et al. 2014). As análises moleculares baseadas em ADN barcoding vão ser uma das ferramentas mais poderosas na avaliação da identidade de espécies e no controlo alimentar (Ederal et al. 2013; Maralit et al. 2013). 1.4.3.3. ANÁLISE DE FUSÃO DE ALTA RESOLUÇÃO (HRMA) A análise de fusão de alta resolução (HRM) é um novo método de análise, pósPCR, utilizado para a identificação de variações genéticas nas sequências de ácidos nucleicos. É um método simples, rápido e pouco dispendioso. Esta análise começa com a amplificação por PCR da região de interesse na presença de um fluoróforo. Este fluoróforo tem uma alta fluorescência quando as cadeias de ADN estão ligadas e baixa fluorescência quando as cadeias de ADN se fundem (separam) 14 (Druml and Cichna-Markl 2014; Erali and Wittwer 2010). Os dados de fluorescência gerada durante a fusão de ADN podem ser analisados com base na temperatura de fusão (Tm), ou sobre a forma da curva de fusão. As diferenças encontradas podem permitir a discriminação de diversos genótipos. O uso de pequenos fragmentos amplificados para genotipagem simplifica o desenho do ensaio uma vez que os primers são escolhidos para serem o mais próximos o quanto possível do polimorfismo alvo. À medida que o tamanho dos fragmentos amplificados é diminuída, as diferenças da temperatura de fusão entre os genótipos são aumentados, permitindo assim uma melhor diferenciação (Erali et al. 2009). Esta técnica é, pelas razões apontadas, muito interessante para a autenticação de produtos alimentares processados em que o ADN se encontra degradado e apenas pequenos fragmentos podem ser amplificados. Alguns autores sugeriram a utilização da PCR com posterior análise de fusão de alta resolução (HRMA) dos fragmentos amplificados como processo final de discriminação de espécie em substituição do gel de eletroforese. As metodologias envolvendo grande parte dos marcadores anteriormente referidos podem ser potencialmente adaptadas para a técnica HRMA uma vez que qualquer variação na sequência pode assim ser detetada e mesmo, nalguns casos, substituir a sequenciação individual de ADN de cada amostra, processo demorado e pouco prático para estudos envolvendo um grande número de indivíduos (Fitzcharles 2012). Esta técnica tem vantagens em relação a outros métodos de PCR. É uma técnica de tubo único e fechado, de alto rendimento, que pode detetar 14 Cf.www.appliedbiosystems.com (acedido em Abril de 2015). Introdução e Objetivos 30 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) diferenças em sequências de ADN em apenas um nucleótido, em determinadas condições e temperatura 15 (Bréchon et al. 2013). Este método também foi estudado para produtos de pesca transformados, em casos de ADN degradado, mas revelou um baixo nível para uma falsa identidade. Esta degradação do ADN deve-se ao facto de os produtos terem sido danificados durante a recolha ou quando foram processadas industrialmente. Cada vez mais, tem sido utilizado técnicas com marcadores moleculares para permitir a identificação inequívoca das espécies. Por exemplo, usando a identificação genética, constatou-se que a maioria das amostras que se pensava ser de bacalhau (Gadus morhua), eram realmente de badejo (Merlangius merlangius)(Bréchon et al. 2013). Este método também foi aplicado para identificar outras espécies marinhas, como as anchovas e o arenque, por isso demonstrou um grande potencial de adequação de HRM na identificação destas espécies. (Bréchon et al. 2013). A reação de análise melting de alta resolução tem a capacidade de discriminar espécies geneticamente semelhantes, em que a identificação morfológica pode ser problemática devido a características de sobreposição (Fitzcharles 2012). Anteriormente, a análise de HRM foi usada com sucesso em espécies de plantas ou genotipagem, utilizando microssatélites ou marcadores de código de barras (Kalivas et al. 2014). Os marcadores de espécies de genótipo de ADN são muito úteis para a identificação de plantas, produção e programas de preservação. O ensaio HRM desenvolvido neste estudo é um método rápido e simples para a identificação e a discriminação da identificação das sete espécies Sideritis que estão em crescimento na Grécia. Este ensaio é simples em comparação com outros métodos de genotipagem em que não requerem a sequenciação de ADN ou processamento pós-PCR. Por conseguinte, este método oferece uma nova alternativa para a deteção rápida destas espécies. Neste estudo, os autores utilizaram com sucesso o HRM juntamente com o PCR em tempo real para a deteção, quantificação e identificação rápida das Sideritis. Este método usa apenas as curvas de fusão, o que vai provocar uma redução do risco de contaminação e uma maior rapidez em comparação com outros métodos (Kalivas et al. 2014). Na figura 13 é apresentado um exemplo da distinção de duas espécies de peixes do mesmo género, Macrourus carinatus e M. Halotrachys, pela análise de melting de um fragmento de 299 bp do gene COI (Fitzcharles 2012). 15 Cf.www.appliedbiosystems.com (acedido em Abril de 2015). Materiais e Métodos 37 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) O protocolo de extração SDS/Ureia baseou-se na metodologia descrita por Aranishi (Aranish 2005) que utiliza para digestão das amostras uma solução tamponada constituída por 10 mM Tris-HCl pH=8.0, 20 mM EDTA pH=8.0, 2% SDS e 6 M ureia. Adicionou-se 600 µL de tampão de extração e 2,5 µL de proteinase K a 10 mg/ml a 200 mg de amostra homogeneizada e misturou-se bem em vortex. Seguidamente a mistura foi sujeita a uma digestão a 55 °C durante 60 minutos. No final da digestão os tubos forma arrefecidos e adicionou-se 600 µL de uma solução contendo clorofórmio e álcool isoamílico (24:1). A mistura foi agitada durante 5 minutos e centrifugada a 10000g durante 5 minutos. A fase superior resultante foi transferida para um novo tubo ao qual se adicionou novamente 600 µL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Após centrifugação a 10000g durante 5 minutos transferiu-se cuidadosamente a fase superior para um novo tubo ao qual se adicionou 350 µL de isopropanol a – 20 °C. Após breve agitação as amostras foram guardadas a – 20 °C durante pelo menos 30 minutos para precipitação dos ácidos nucleicos. Seguidamente o ADN foi precipitado por centrifugação refrigerada a 18000g durante 15 minutos. O sobrenadante foi rejeitado por decantação e o precipitado redissolvido em 300 µL de tampão TE. Adicionou-se seguidamente 5 µL de RNAse a 10 mg/ml e incubou-se a 37 °C durante 30 minutos. Após este período foram adicionados 150 µL de NaCl 5M e 900 µL de etanol a – 20 °C e incubou-se a mistura a – 20 °C durante pelo menos 30 minutos. Seguidamente o ADN foi precipitado por centrifugação refrigerada a 18000g durante 15 minutos e o sobrenadante rejeitado por decantação. O precipitado obtido foi lavado duas vezes com etanol a 76%, a 4 °C, seco em corrente de ar, redissolvido em 60 µL de água ultrapura e armazenado a 4 °C até ao momento da análise. Materiais e Métodos 38 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 2.3. QUANTIFICAÇÃO DE ADN NOS EXTRATOS Após a extração do ADN, procedeu-se à quantificação de ADN nas amostras por espetrofotometria UV, seguiu-se o seguinte protocolo: Colocou-se 3 µL de água ultrapura em todos os poços e fez-se a leitura do branco; lavou-se a placa com etanol a 96% e colocou-se 3 µL de cada amostra, em duplicado em cada uma das 8 posições do adaptador para leitura de pequenos volumes (figura 15); fez-se a leitura da absorvência a 260, 280 e 230 nm. Figura 15 – Adaptador para leitura de absorvência em pequenos volumes (min. 4 microlitros) num leitor de placas. O estado de fragmentação dos ácidos nucleicos extraídos foi verificado através de separação em gel de agarose a 0,8% em tampão SGTB. Materiais e Métodos 39 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 2.4. AMPLIFICAÇÃO POR PCR E ELETROFORESE DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS A amplificação dos fragmentos para sequenciação e a otimização dos primers desenhados de novo foram efetuadas num termociclador Bio-Rad MJ-mini. Toda a preparação das reações de PCR foi efetuada numa estação para preparação de PCR equipada com luz UV. A amplificação do gene barcode COI foi efetuado utilizando os primers universais Fish F2 – 5’TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3’ e Fish R2 – 5’CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA3’ (Ivanova et al. 2007), de acordo com as seguintes condições. As condições de PCR foram as seguintes: 95°C durante 15 minutos, 35 ciclos de 30 segundos as 95°C, 30 segundos a 54°C e 1 minuto a 72°C, e, finalmente, 7minutos a 72°C. A reação de PCR foi realizada num termociclador (MJ Mini, Bio-Rad Laboratories) e foi preparada com a seguinte composição final, em 20 µL de reação: 10 ng de tampão de PCR, 1 U de Taq polimerase (FIREPol® DNA polymerase, Solis BioDyne), 2 mM de MgCl2, 0,5 mM de cada primer e 2,5 mM ddNTP mix. Para verificação da eficiência de amplificação separaram-se os produtos amplificados em gel de agarose a 1,5% em tampão SGTB e adicionado de 3 µL do fluoróforo GelRed 10000X. A separação foi efetuada em tina de gel submerso em tampão SGTB. Foram carregados em cada poço uma mistura de 3-5 microlitros de produto amplificado e 3 microlitros de corante de carregamento (40 % sucrose, 0,25% azul bromofenol). A separação efetuou-se a 120 volt durante cerca de 30 minutos. Materiais e Métodos 40 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 2.5. PROTOCOLO PARA PURIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS PARA SEQUENCIAÇÃO Após amplificação e verificação da sua efetividade procedeu-se à purificação das amostras para sequenciação utilizando um o Kit JETQUICK (Genomed, Alemanha). O protocolo seguido foi o seguinte: a cada tubo de PCR contendo os produtos amplificados adicionouse 200 µL de solução de H1 (contém cloridrato de guanidina e isopropanol) e homogeneizou-se bem em vortex. De seguida, colocou-se a coluna spin JETQUICK num microtubo de 2mL e carregou-se com a mistura do passo anterior. Centrifugou-se a 12000 x g durante 1 minuto e no fim rejeitou-se o filtrado. Lavou-se a coluna com 500 µL de solução H2 (contém etanol, NaCl, EDTA e Tris-HCl) e centrifugou-se a 12000 x g durante 1 minuto e no fim rejeitou-se o filtrado. Centrifugou-se novamente a velocidade máxima durante 1 minuto e rejeitou-se o filtrado com o microtubos de 2mL. Para a eluição do ADN, colocou-se a coluna de spin num novo microtubo de 1,5 mL e adicionou-se 50 µL de água estéril diretamente para o centro da matriz de sílica da coluna spin JETQUICK e centrifugou-se a 12000 x g durante 2 minutos. Retirou-se a coluna e guardou-se os microtubos com o ADN purificado e enviou-se para sequenciação juntamente com os respetivos primers forward ou reverse. Materiais e Métodos 41 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 2.6. ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS E FILOGENIA Os fragmentos amplificados, após purificação, foram enviados para sequenciação numa empresa especializada. As sequências foram recebidas no formato ab1, verificadas quanto à sua qualidade (apenas leituras de bases com índice de qualidade PHRED scores > 20 foram consideradas). As zonas iniciais e finais da sequência foram também eliminadas recorrendo ao mesmo critério do índice de qualidade (cerca de 50 bps no inicio e final da sequência). Todas as sequências forma analisadas com o auxílio do software MEGA6 (Tamura et al. 2013). Este é uma ferramenta integrada para a leitura de ficheiros ab1, realização do alinhamento das sequências, deduzir árvores filogenéticas, etc. Após o tratamento referido as sequências foram alinhadas recorrendo ao algoritmo CLUSTALL que integra o software MEGA. Feito o alinhamento das sequências, procedeuse então à identificação das espécies através da pesquisa em bases de dados de sequências gerais (GenBank) ou específicas para animais (Barcode of life Data System (BOLD)) (http://www.boldsystems.org), recorrendo ao algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool. Através destas ferramentas encontram-se regiões de semelhança entre as sequências obtidas e as mais similares encontradas nas bases de dados, permitindo a identificação da espécie, podendo assim ser feita a comparação com a espécie indicada no rótulo. A reconstrução filogenética foi realizada utilizando o software MEGA 6.0. Os dendrogramas foram obtidos pela análise das sequências através do algoritmo Neighbor-Joining com os parâmetros pré-formatados no software. Materiais e Métodos 42 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 2.7. DESENHO DE NOVOS PRIMERS As reações de amplificação do gene da subunidade 1 do gene citocromo-oxidase foram realizadas utilizando os primers universais para peixes FishF2/FishR2, conforme referido. Todavia o tamanho de fragmento gerado não é adequado para reações de análise de fusão (HRMA) conforme os objetivos do trabalho, pelo que novos primers, focando regiões polimórficas, foram desenhados. Estes primers foram desenhados da seguinte forma: em primeiro lugar recolheram-se da base de dados BOLDSYSTEMS (constituída apenas por sequências com atributos suficientes para barcoding) sequências representativas das três espécies em estudo (Gadus morhua, Gadus macrocephalus e Gadus chacogrammus) referidas na tabela 7. Tabela 7 – Sequências utilizadas para o desenho de novos primers. Às sequências referidas juntaram-se as já obtidas correspondentes às amostras em estudo para comparação e controlo. Procedeu-se ao alinhamento, seguido da identificação das regiões polimórficas capazes de distinguir as três espécies em estudo. Novos primers foram então desenhados, recorrendo à ferramenta Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi) disponível online. Tendo em conta que os primers seriam posteriormente utilizados em análise HRMA o tamanho dos fragmentos amplificados foi mantido abaixo dos 100 pb sempre que possível. As características dos primers foram verificadas com o auxílio da ferramenta online gratuita OligoCalc, ou seja, a temperatura de melting (Tm) de cada primer, possível auto compatibilidade e possibilidade de formação de primers-dimers. Gadus morhua Gadus macrocephalus Gadus chalcogrammus DSFIB456-13 GBGC1354-06 RFE243-05 GBGC1822-06 RFE234-05 TZFPB500-0638 GBGCA542-10 RFE360-05 TZFPB502-06 GLF052-14 DSFIB165-12 TZFPB781-06 GTENK033-11 DSFIB166-12 ABFJ129-06 SCAFB104-07 DSFIB173-12P DSFAL631-09 SCAFB113-07 SCAFB565-07 FMV536-11 SCAFB214-07 TZFP161-04 DSFAL647-09 SCAFB378-07 UCFMS018-14 RFE239-05 SCAFB549-07 SDP113001-13 SCAFB734-07 TZFP074-04 SCFAC259-06 TZFPB171-05 Materiais e Métodos 43 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) A especificidade dos primers foi verificada utilizando a ferramenta PrimerBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi). 2.8. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS NOVOS PRIMERS A otimização das condições de amplificação dos primers de novo desenhados para a obtenção de pequenos fragmentos em regiões polimórficas foi realizada utilizando PCR convencional, em reações de 20 µL com a seguinte composição: Solução tampão, MgCl2, ddNTP mix, Primers Foward e Reverse e taq polimerase (FIREPol® DNA polymerase, Solis BioDyne). Após amplificação esta foi verificada em gel de agarose a 1,5% quanto ao tamanho dos fragmentos esperado, especificidade e intensidade das bandas amplificadas. 2.9. PROTOCOLO DA AMPLIFICAÇÃO E ANÁLISE DE FUSÃO EM PCR EM TEMPO REAL As reações de PCR em tempo real foram igualmente preparadas numa estação para preparação de PCR equipada com luz UV, em tiras de microtubos brancos com tampas adequadas à leitura de fluorescência (Optical Flat 8-Cap Strips, Bio-Rad, EUA). O volume de reação foi de 10 µL, contendo os seguintes componentes: 8 µL de Supermix SsoFast EvaGreen (Bio-Rad, EUA) e 2 µL de amostra. As condições de amplificação e análise de fusão de alta resolução (HRMA), otimizadas para uma reação o mais rápida e eficiente possível, foram as indicadas na tabela 8. As reações forma realizadas no equipamento BioRad C1000 com módulo ótico CFX96 (Bio-Rad, EUA), figura 16. Foi utilizado o programa Precision Melt Analysis (Bio-Rad, USA) para o processamento dos dados de curvas de fusão. Tabela 8 – Condições de tempos e temperaturas de amplificação em PCR em tempo real e em análise HRM. Primer Desnaturação inicial Desnaturação Hibridação Nº ciclos Desnaturação Renaturação Curva de melting Gadus_1 56°C Gadus_2 54°C Gadus_3 55°C Gadus_4 55°C Gadus_5 54°C Gadus_6 54°C Gadus_7 58°C Análise HRM Amplificação 98°C/2 minutos 98°C/5 segundos 35 98°C/1 minutos 60°C/1 minuto 65°C a 95°C incremento de 0,5°C estabilização de 5 segundos Materiais e Métodos 44 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) A temperatura de hibridação dos primers utilizada resultou do processo de otimização das condições de amplificação dos mesmos Figura 16 – Termociclador (C1000) e módulo ótico de PCR em Tempo Real (CFX96). 3. Resultados e Discussão Resultados e Discussão 46 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 3.1. QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS, AVALIAÇÃO DA PUREZA E ESTADO DE DEGRADAÇÃO DE ADN NOS EXTRATOS A quantificação das amostras foi, como referido, executada num leitor de placas por espetrofotometria. O ADN e ARN absorvem radiação no comprimento de onda de 260 nm e as proteínas a 280 nm. A razão 260/280 é utilizada assim para avaliar a pureza do ADN ou ARN da amostra, ou seja a totalidade dos ácidos nucleicos presentes num extrato. Considera-se que os extratos contendo ADN são puros quando a razão das absorvências 260/280 é superior a aproximadamente 1,8. As amostras cujos valores da relação entre os comprimentos de onda são inferiores a 1,8 muito provavelmente apresentam elevados níveis de proteínas co extraídas com o ADN, compostos fenólicos ou outros contaminantes. A razão 260/280 das diferentes amostras de bacalhau extraídas pelo KIT Nucleospin Food e pelo método SDS/Ureia, assim como as respetivas concentrações de ácidos nucleicos são apresentadas na tabela 9. Para este trabalho preliminar de seleção do método de extração mais adequado optou-se por utilizar apenas as amostras de 1-16, representativas da totalidade de amostragem. Tabela 9 – Razão de absorvência a 260/280 e quantificação de ácidos nucleicos das amostras extraídas pelo kit Nucleospin Food e método SDS/Ureia. Amostra Tipo de Amostra 260/280 Conc. (ng/µL) 260/280 Conc. (ng/µL) 1 Inteiro Graúdo 1,209 3,691 2,000 852,4 2 Bacalhau Desfiado Salgado Seco 2,03 61,34 1,978 282,6 3 Bacalhau Desfiado Salgado Seco 2,039 110,1 2,008 1207 4 Bacalhau Desfiado Salgado Seco 1,848 40,36 2,027 1179 5 Migas de Paloco Salgado Seco 1,898 45,18 2,016 629,3 6 Paloco Desfiado Salgado Seco 1,752 42,36 2,000 445,3 7 Migas de Paloco Salgado Seco 1,935 88,23 2,028 1046 8 Bacalhau Desfiado Salgado Seco 1,392 8,943 2,028 839,5 9 Paloco Desfiado Salgado Seco 1,903 27,82 2,019 1199 10 Inteiro Graúdo 1,950 77,23 2,011 1157 11 Bacalhau Desfiado Salgado Seco 1,959 95,31 1,977 1093 12 Paloco Desfiado Demolhado Ultracongelado 1,219 1,628 1,561 219,6 13 Bacalhau Demolhado Ultracongelado 1,718 8,563 1,289 110,7 14 Bacalhau Desfiado Ultracongelado 1,679 6,941 1,361 84,51 15 Migas de Bacalhau Salgado Seco 1,936 105,0 1,975 475,7 16 Bacalhau Desfiado Salgado Seco 1,934 56,74 2,006 134,9 Média 1,775 48,71 1,893 685 Nucleospin Food SDS/Ureia Resultados e Discussão 53 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) A identificação de espécies recorrendo à construção de árvores filogenéticas permite, para além da identificação pelo posição relativa no dendrograma, verificar de uma forma gráfica o nível de variação genética intraespecífica. Verificou-se assim que a diversidade intraespecífica ocorre para todas as espécies todavia a um nível bastante inferior à diversidade interespecífica, como é conveniente para um correto agrupamento e separação das espécies por barcoding. Pode ainda verificar-se que a espécie que apresenta maior diversidade é o G. morhua apesar do menor número de amostras analisados (Pinto et al. 2013). O gene COI afigura-se assim apropriado para a discriminação destas três espécies. Todavia a metodologia de sequenciação não se mostrou efetiva para a totalidade das amostras, provavelmente devido a uma degradação excessiva de ADN nas amostras em questão. A metodologia de sequenciação é, adicionalmente, bastante morosa (cerca de 72 horas quando a sequenciação é requisitada externamente como acontece na maioria dos laboratórios), pelo que o desenvolvimento de uma metodologia mais rápida, focando zonas genómicas de menor tamanho, é de grande importância na autenticação deste tipo de produtos. A metodologia HRMA permite ultrapassar as limitações referidas pelo que foi a escolhida para o desenvolvimento do trabalho subsequente tendo por base a diversidade genética do gene COI entretanto bem caracterizada. Resultados e Discussão 54 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 3.3. DESENHO DE NOVOS PRIMERS PARA PEQUENOS FRAGMENTOS POLIMÓRFICOS Por forma a implementar uma metodologia de HRMA foram reunidas cerca de 33 (12 G. morhua, 9 G. macrocephalus e 12 G. chalcogrammus) sequências do gene COI, correspondentes às três espécies em questão, validadas pela base de dados BOLD systems. Após inserção das amostras em estudo sequenciadas alinharam-se as sequências e identificaram-se as regiões onde existiam polimorfismos entre as espécies. Foram identificadas 7 regiões contendo o necessário polimorfismo e simultaneamente flanqueadas por zonas conservadas e com o tamanho suficiente para o desenho de primers de amplificação. A tabela 12 sumariza as regiões polimórficas identificadas e respetivas mutações encontradas para cada espécie. Tabela 12 – Regiões polimórficas dos sete primers desenhados. Na tabela 13 apresentam-se os primers selecionados, o seu tamanho, Tm (determinado com a ferramenta online OligoCalc (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/ oligocalc.html), e tamanho do fragmento amplificado. Aos primers foi atribuída a designação Gadus, seguida da indicação F (forward) ou R (reverse) e ao número do local amplificado. Gadus macrocephalus G C A G A/GCT/CC C C A C T/CA/CG C A/GT/CG C C A C T T C G T/CA C C C C C G T A T Gadus morhua G/AT T G A C/TTC/TA A A T T A G C G T G/CCT/CA C T/CT T G T G C/TAC/TAC/TG/CT A T Gadus chalcogrammus G T T A A C T C C A A/GT C A/CG/AC/TG T G C/TTA/GC/TCT/CTG/AT A C A C A C G C T C Gadus F7/R7 Gadus F1/R1 Gadus F2/R2 Gadus F3/R3 Gadus F4/R4 Gadus F5/R5 Gadus F6/R6 Resultados e Discussão 55 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Tabela 13 – Primers selecionados, respetiva sequência, tamanho, temperatura de fusão e tamanho do fragmento amplificado. Todos os primers forma sujeitos ao teste de especificidade recorrendo e uma simulação informática de amplificação usando a ferramenta PrimerBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi). Todos os pares de primers resultaram altamente específicos para o género Gadus incidindo nas espécies em questão devido à abundância de sequências no GenBank relativas a estas. Pela análise da tabela verifica-se que foi possível a obtenção de primers para as 7 regiões identificadas. Estes primers permitem a amplificação de fragmentos com de 71 a 121 pares de bases, com um tamanho médio de 90 pb, o que obedece aos critérios de tamanho de fragmento apropriado para análise de fusão de alta resolução. Nome do primer Tamanho (pb) Tm oligo calc (50 mM salt) Tamanho do Fragmento Gadus_F1 21 61 Gadus_R1 20 58 Gadus_F2 20 56 Gadus_R2 22 56 Gadus_F3 22 56 Gadus_R3 21 61 Gadus_F4 21 61 Gadus_R4 18 56 Gadus_F5 18 56 Gadus_R5 20 54 Gadus_F6 20 54 Gadus_R6 GCTGTAATTAGTACTGCTCAAACAAA 26 62 Gadus_F7 23 61 Gadus_R7 20 63 Sequência (5' - 3') GCGCACGCTTTCGTAATAAT TGTTATTTATTCGAGGGAAAGC GCTTTCCCTCGAATAAATAACA AGCTTCTACACCAGAGGATGC TCATCAATTCTTGGGGCAAT GCAATTTCACAGTACCAAACACC AGCTGCTAAGACGGGGAGAG TCGAGCAGAGCTAAGTCAACC GTGCGCTGTAACGATCACAT AGCATCCTCTGGTGTAGAAGC CCAGCATGAGCGAGGTTT GCTGGGGCATCTGTTGAT ATTGCCCCAAGAATTGATGA 110 90 73 121 84 81 71 Resultados e Discussão 56 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 3.4. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS NOVOS PRIMERS Os novos primers foram testados em PCR convencional previamente à sua utilização em HRMA. Para tal realizou-se a amplificação usando as condições normais no que diz respeito ao perfil de temperaturas e concentração de reagentes e observou-se o comportamento de amplificação de cada par de primers em extratos de 12 amostras (4 de cada espécie) representativas do tipo de amostras existentes. As temperaturas de hibridação (Th) testadas foram baseadas nas Tm obtidas através do software OligoCal subtraindo a estas últimas cerca de 5 oC. Sempre que possível, quando existia apenas uma pequena variação na Th determinada, foram constituídos grupos de pares de primers que poderiam ser usados em amplificações simultâneas à mesma temperatura, por uma questão de otimização de tempo. Relativamente à quantidade de ADN a utilizar em cada amplificação, tendo em consideração os resultados de quantificação de ácidos nucleicos nas amostras e o seu perfil em gel de agarose, não nos foi possível controlar a quantidade de ADN utilizada em cada amplificação. Pelo perfil dos extratos em gel de agarose verificou-se que em grande parte das amostras o ARN está presente em maior quantidade que o ADN pelo que o resultado de quantificação por UV não reflete a quantidade real de ADN mas sim a soma da quantidade de ADN mais ARN. Optou-se, assim, por introduzir nas amostras uma diluição significativa para minorar os efeitos da matriz (essencialmente devidos a inibidores de amplificação) que foi otimizada em 1:20 em água ultrapura para PCR. Na tabela 14 mostra-se a temperatura de hibridação otimizada para cada par de primers desenvolvido e perfil de amplificação. Resultados e Discussão 57 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Tabela 14 – Temperatura de hibridação otimizada para cada par de primers desenvolvido e perfil de amplificação Na figura 20 apresenta-se, a título de exemplo, o gel de agarose dos produtos de amplificação dos pares de primers Gadus_3, Gadus_4 e Gadus_6. Verifica-se que todas as amostras, das três espécies, foram amplificadas com um sinal de intenso e relativamente uniforme. O tamanho de amplificação observado, recorrendo ao padrão de pesos moleculares e à comparação entre os diferentes primers corresponde ao esperado conforme indicado na tabela 13. Nome do primer Th otimizada Gadus_F1 Gadus_R1 Gadus_F2 Gadus_R2 Gadus_F3 Gadus_R3 Gadus_F4 Gadus_R4 Gadus_F5 Gadus_R5 Gadus_F6 Gadus_R6 GCTGTAATTAGTACTGCTCAAACAAA Gadus_F7 Gadus_R7 54 58 56 54 55 55 54 Sequência (5' - 3') GCGCACGCTTTCGTAATAAT TGTTATTTATTCGAGGGAAAGC GCTTTCCCTCGAATAAATAACA AGCTTCTACACCAGAGGATGC TCATCAATTCTTGGGGCAAT GCAATTTCACAGTACCAAACACC AGCTGCTAAGACGGGGAGAG TCGAGCAGAGCTAAGTCAACC GTGCGCTGTAACGATCACAT AGCATCCTCTGGTGTAGAAGC CCAGCATGAGCGAGGTTT GCTGGGGCATCTGTTGAT ATTGCCCCAAGAATTGATGA Resultados e Discussão 58 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Figura 20 – Gel de agarose dos produtos de amplificação em PCR convencional dos primers Gadus_3, Gadus_4 e Gadus_6. O produto amplificado resultou também muito específico para a maioria dos pares de primers verificando-se a presença de uma banda única. Todavia, durante o processo de otimização, e após várias tentativas por alteração da temperatura de hibridação, os pares de primers dos quais resultaram bandas mais intensas, específicas e com um sinal de amplificação uniforme foram o Gadus_1, Gadus_2, Gadus_5, Gadus_5 e Gadus_7. Para os restantes o sinal de amplificação não foi uniforme para todas as Th testadas ocorrendo simultaneamente, embora a um nível bastante baixo, a amplificação de fragmentos inespecíficos (Figura 23, Gadus_4 amostra 10 e Gadus_6 amostra 3), situação que pode influenciar negativamente a performance do método de HRMA. Verificada a especificidade e otimizadas as condições de amplificação, sendo a mais relevante a temperatura de hibridação, procedeu-se à verificação dos primers na distinção das espécies em modo HRMA. 100 bp 50 bp 100 bp 50 bp Resultados e Discussão 59 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 3.5. HRMA DO GENE COI A metodologia HRMA, conforme referido, pressupõe a amplificação de pequenos fragmentos (ca. 100 pb) para que as diferenças existentes nas sequências amplificadas sejam evidentes no perfil das curvas de fusão. Todavia alguns autores referem a eficiência da utilização de fragmentos de maior tamanho (ca. 200-600 pb) na distinção de variedades e espécies de plantas (Faria et al. 2013; Ganopoulos et al. 2012). Tendo em conta este último facto realizou-se uma amplificação e respetiva análise de melting utilizando os primers FishF2 e FishR2 nas condições já referidas para avaliar a possibilidade de utilização deste fragmento e comparação da sua eficiência com os primers de novo desenvolvidos. Neste ensaio foram utilizadas as amostras 10,15 e 21 da espécie G.morhua, 2, 3 e 16 da G.macrocephalus e por fim, 6,20 e 23 da G.chalcogrammus. Na figura 21 mostra-se o resultado da análise de fusão executada. Figura 21 – Curvas diferenciais resultantes de HRMA de 600 pb do gene COI as amostras 10,15,21 da espécie G.morhua, 2,3,16 da espécie G.macrocephalus e 6,20,23 da espécie G.chacogrammus. Tal como se pode verificar na figura anterior a utilização de um fragmento de cerca de 600 pb, em modo HRMA, na distinção das três espécies em estudo mostrou-se bastante ineficiente reiterando assim a necessidade do desenvolvimento de primers que permitam a amplificação de pequenas regiões polimórficas. Resultados e Discussão 60 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 3.6. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES ANALÍTICAS EM HRMA Após otimização das Th dos primers para amplificação de pequenos fragmentos em PCR convencional procedeu-se à otimização das condições em modo HRMA no que respeita às diluições a utilizar e perfil de temperaturas de amplificação. Relativamente aos tempos e temperaturas utilizadas durante a análise de fusão foram utilizadas condições padrão para a obtenção do máximo de resolução possível (análise de fusão de 65 a 95 °C com captação de fluorescência a cada 0,5 °C). No que respeita ao perfil de temperaturas usado, este foi otimizado para uma maior rapidez na amplificação tendo, para tal, sido eliminado o passo de extensão a 72 °C a diminuídos os tempo de desnaturação e hibridação conforma recomendações bibliográficas para PCR rápido de pequenos fragmentos. Após várias experiências chegou-se à conclusão que o perfil otimizado seria o seguinte: 98 °C durante 2 minutos + 35 ciclos de 98 °C durante 5 segundos e Ta durante 5 segundos, seguido por análise de fusão 60-95 °C em 0,5 °C incremento). Este perfil de temperaturas permite a conclusão de uma amplificação e análise de fusão em menos de 1 hora. Por forma a determinar a influência da diluição na resolução HRMA, para além da diluição já estabelecida de 1:20 foi também testada uma diluição a 1:50 utilizando três amostras de cada espécie e o primer Gadus_7, que apresentava uma boa resolução específica. Na figura 22 pode verificar-se que a diluição 1:20 mostrou-se ser a mais eficiente na distinção das espécies provavelmente devido à grande diminuição da quantidade de ADN na diluição 1:50 o que afeta a qualidade da amplificação e introduz um fator de variação na análise. Por uma questão de harmonização na apresentação dos resultados em todas as curvas de fusão será utilizada a seguinte correspondência cor-espécie: azul referente ao Gadus chalcogrammus (CH), a cor vermelha corresponde ao Gadus macrocephalus (MC) e por fim a cor verde ao Gadus morhua (MO). Resultados e Discussão 61 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Figura 22 - Curvas diferenciais de fusão para três amostras de cada espécie amplificadas nas diluições 1:20 e 1:50 para o per de primers Gadus_7. Através da análise dos gráficos das diferentes diluições da figura 22 observou-se que os melhores resultados foram os da diluição 1:20, pois há uma diferença significativa na separação das 3 espécies (Gadus morhua, Gadus macrocephalus e Gadus chalcogrammus). No restante trabalho optou-se por fazer diluições de 1:20 de todas as amostras. MC MO CH MC CH MO Resultados e Discussão 62 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) 3.7. DESEMPENHO DOS NOVOS PRIMERS EM HRMA Após otimização e uniformização das condições analíticas em modo HRMA os 7 pares de primers desenvolvidos (Gadus_1 a Gadus_7) foram testados em 9 amostras (10,15,21 da espécie G. morhua, 2,3,16 da espécie G. macrocephalus e 6, 20,23 da espécie G. chalcogrammus), três representantes de cada uma das três espécies estudadas, anteriormente sequenciadas, cuja identidade foi verificada. Para uma melhor visualização gráfica as curvas de fusão das amostras pertencentes a uma mesma espécie são apresentadas da mesma cor, conforme referido anteriormente. Na figura 23 são apresentadas as curvas diferenciais de fusão obtidas pela amplificação das amostras com os pares de primers Gadus_1 e Gadus_6. Figura 23 – Curvas diferenciais de fusão usando o par de primers Gadus_1 e Gadus_6 para 3 amostras de cada espécie. Resultados e Discussão 69 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Relativamente às outras duas espécies, G. morhua e G. chalcogrammus, verifica-se que o programa foi capaz da sua discriminação, evidenciada pela diferença de cores, apesar de algumas curvas de aproximarem ao nível da inflexão. São todavia distinguíveis pois o ponto de inflexão da curva, que corresponde ao Tm do fragmento, se encontra aproximadamente aos 72 °C para G. chalcogrammus e 73 °C para G. morhua. Esta proximidade é perfeitamente justificável pois corresponde à maior proximidade em termos filogenéticos verificada no dendrograma da figura 19 onde o grupo das espécies de G. morhua apresenta uma raiz comum com o grupo das espécies de G. chalcogrammus. O marcador selecionado amplificado pelos primers Gadus_2 mostrou-se assim eficiente na separação das amostras nas três espécies correspondentes e demonstrou ser um bom marcador para a autenticação de amostras de bacalhau processado. A metodologia em estudo mostrou-se assim eficiente para a discriminação de amostras de bacalhau nas três espécies mais comercializadas. A técnica pode ser executada em menos de 1 hora, após processo extrativo, e para um número de amostras considerável. O custo de execução é também bastante reduzido quando comparado com o processo de sequenciação do gene COI. Após esta análise comparou-se os resultados obtidos com as informações descritas nos rótulos. Essa comparação encontra-se esquematicamente na tabela 15. Resultados e Discussão 70 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Tabela 15 – Resultados obtidos das curvas de fusão de todas as amostras de bacalhau salgado inteiro, desfiado e demolhado/ultracongelado. *Não integrada nos clusters devido a apresentar um perfil de fusão diferente de todas as outras amostras. Avaliando os resultados das 33 amostras, é possível observar que duas amostras (#11 e #29) estavam adulteradas. Pois, estas amostras tinham descrito no rótulo, serem da espécie Gadus morhua, mas na verdade pertencem à espécie Gadus macrocephalus. Em relação à amostra #4, esta foi eliminada da análise, pois apresentava um perfil com características diferentes de todas as outras amostras, não permitindo a identificação da espécie a partir deste método. # Tipo de Processamento Espécie descrita no rótulo Cluster 1 Inteiro Gadus morhua Gadus morhua 2 Desfiado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 3 Desfiado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 4 Desfiado Gadus morhua * 5 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 6 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 7 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 8 Desfiado Gadus morhua Gadus morhua 9 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 10 Inteiro Gadus morhua Gadus morhua 11 Desfiado Gadus morhua Gadus macrocephalus 12 Demolhado e Ultracongelado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 13 Demolhado e Ultracongelado Gadus morhua Gadus morhua 14 Demolhado e Ultracongelado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 15 Desfiado Gadus morhua Gadus morhua 16 Desfiado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 17 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 18 Desfiado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 19 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 20 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 21 Desfiado Gadus morhua Gadus morhua 22 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 23 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 24 Demolhado e Ultracongelado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 25 Demolhado e Ultracongelado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 26 Demolhado e Ultracongelado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 27 Demolhado e Ultracongelado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 28 Desfiado Theragra chalcogramma Gadus chalcogrammus 29 Desfiado Gadus morhua Gadus macrocephalus 30 Desfiado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 31 Desfiado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 32 Demolhado e Ultracongelado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus 33 Demolhado e Ultracongelado Gadus macrocephalus Gadus macrocephalus Resultados e Discussão 71 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) As duas amostras identificadas como mal rotuladas por HRMA, 11 e 29, foram igualmente classificadas como G. macrocephalus pela sequenciação do gene COI, previamente realizada, o que atesta a eficiência do método HRMA. A análise de fusão de fragmentos amplificados pelos primers Gadus_2 mostrou-se assim bastante eficiente tendo permitido classificação correta de 97% das amostras. 4. Conclusões Conclusões 73 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) O Bacalhau, Gadus morhua, consumido maioritariamente na Europa e assumindo uma especial importância em Portugal, é considerado o mais valioso peixe do género Gadus pela sua importância gastronómica e mesmo cultural. O aumento do consumo desta espécie em todo o mundo, levou a uma diminuição nas capturas, e como consequência, provocou uma escassez da mesma. Assim, a prática de adulterações nesta espécie, através da comercialização de diferentes espécies de peixes, apresentando características organoléticas e morfológicas semelhantes, como se fossem Gadus morhua, é uma prática comum, o que permite um maior ganho económico para os comerciantes. Além disso, o aumento dos produtos transformados e a existência de um mercado global, pode levar a substituições de espécies liberalmente ou acidentalmente. Daí a importância do controlo de espécies e alimentar, por forma a garantir que os consumidores não sejam defraudados nas suas escolhas alimentares. Nos últimos anos, foram desenvolvidos vários métodos analíticos para a identificação de espécies e controlo da autenticidade de alimentos. Os métodos analíticos desempenham, um papel importante, indo desde os métodos físicos, alicerçados na microscopia, aos métodos baseados no ADN. Estes últimos têm revelado uma alternativa promissora aos métodos convencionais. Sendo assim, este trabalho levou ao desenvolvimento de marcadores moleculares para a avaliação da autenticidade em amostras de bacalhau, através da utilização da técnica de PCR em tempo real. Foram utilizadas diferentes amostras de bacalhau inteiro, desfiado e demolhado ultracongelado de três espécies distintas do género Gadus. Inicialmente na realização deste trabalho em análise por PCR convencional e sequenciação dos fragmentos amplificados utilizaram-se os primers FishF2 / FishR2, que mostraram ser eficazes na identificação e discriminação das espécies Gadus morhua, Gadus macrocephalus e Gadus chalcogrammus. Verificou-se que 93 % das amostras sequenciadas estavam corretamente rotuladas, contudo detetaram-se duas adulterações rotuladas como G. morhua mas identificadas como G. macrocephalus, de menor valor comercial. Como o método de PCR convencional e subsequente sequenciação é demorado e dispendioso, houve a necessidade de desenvolver um método mais robusto, nomeadamente através da redução do tempo de análise. Foram assim desenvolvidos 7 novos marcadores no gene COI pelo desenho de primers para amplificação de fragmentos com um tamanho aproximado de 100 pb, em zonas onde foram detetados polimorfismos adequados à análise HRMA. Conclusões 74 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Os marcadores foram testados em amostras reais tendo um deles revelado alta eficiência na discriminação das três espécies em questão. A metodologia HRMA, utilizada com os marcadores desenvolvidos e selecionados, mostrou-se eficiente na discriminação de Gadus morhua das outras espécies, tendo permitido a identificação correta em 97 % das amostras. Este estudo demonstrou que a substituição de espécies pode ser avaliada por HRMA, de uma forma rápida e específica, contribuindo assim para a definição da técnica de HRMA com uma robusta ferramenta de autenticação de alimentos. 5. Bibliografia Bibliografia 76 Autenticação de bacalhau processado (Gadus spp.) por análise de fusão de alta resolução de fragmentos de ADN (HRMA) Alves da Silva S, Frenher K, Pazza R. Use of mitochondrial gene sequencing for species identification in salmon filets. 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