Polimorfismos genéticos nos recetores FcyRIIA e FcyRIIIA, reativação do citomegalovírus humano e sobrevivência global de doentes submetidos a transplante de células estaminais hematopoiéticas

I Patrícia Isabel Tavares Figueiredo Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do Citomegalovírus Humano e sobrevivência global de doentes submetidos a transplante de células estaminais hematopoiéticas Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Oncologia, Especialização em Oncologia Molecular, submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador – Professor Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva Categoria – Professor Associado com Agregação Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto e Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Instituto Português de Oncologia do Porto Co-orientador – Doutora Ana Luísa Pereira Teixeira Afiliação – Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Instituto Português de Oncologia do Porto II INFORMAÇÃO TÉCNICA TÍTULO: Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do Citomegalovírus Humano e sobrevivência global de doentes submetidos a transplante de células estaminais hematopoiéticas Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Oncologia, Especialização em Oncologia Molecular, submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto AUTOR: Patrícia Isabel Tavares Figueiredo DATA: Setembro de 2014 E-MAIL: [email protected] III IV I AGRADECIMENTOS Ao concluir esta etapa do meu percurso académico, não posso deixar de agradecer a todos os que contribuíram para a realização deste projeto. À Comissão Científica do Mestrado em Oncologia, que me permitiu integrar neste mestrado e, desta forma, adquirir mais conhecimentos na área de oncologia. Ao Professor Doutor Rui Medeiros, meu orientador, agradeço a oportunidade de realizar este projeto, o apoio e a transmissão de conhecimento, bem como o entusiasmo e a disponibilidade que sempre demonstrou durante este período. Obrigada pela compreensão e pelos seus ensinamentos. À Doutora Ana Luísa Teixeira, minha co-orientadora, muito obrigada pela disponibilidade, apoio laboratorial, paciência e atenção prestada durante a realização deste projeto, mas principalmente pela exigência e sentido crítico que me fez crescer. Ao Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do IPO do Porto, obrigada pela disponibilidade, entreajuda e amizade demonstrada ao longo deste ano. À Dra. Mónica Gomes, à Dra. Joana Assis e ao Dr. Augusto Nogueira agradeço a ajuda e apoio técnico prestado durante a execução do projeto. À Isabel, Mara, Francisca e Rita, obrigada pela amizade, companheirismo e entreajuda demonstrada ao longo deste “ano da tese”… Aos “Sacaninhas da presidente”, que tornaram estes dois anos inesquecíveis, agradeço todos os momentos bem passados, desde os jogos do “Glorioso”, aos nossos jantares de mestrado, que contribuíram para fortalecer a nossa amizade e o espírito de entreajuda que foi sempre uma constante. À “Família Residencial”, obrigada a todos os que durante estes seis anos magníficos por aqui passaram. Comigo levo as recordações, aventuras, partilhas, brincadeiras… Graças a vocês posso dizer que hoje sou uma pessoa mais “rica”. A todos os meus amigos, obrigada por estarem sempre comigo. “Podia viver sem a UMJA? Podia, mas não era a mesma coisa!”. A toda a minha família, obrigada por todo o apoio que me deram ao longo destes anos. Em especial aos meus pais, pelo apoio incondicional, pela paciência e pelo esforço que fizeram para que pudesse ser o que sou hoje. Agradeço também à minha avó, a minha conselheira, por todo seu apoio e por sempre acreditar em mim. A todos os que me acompanharam nesta jornada, um Muito Obrigada! II III ABREVIATURAS A ADCC Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity AP1 Activator Protein 1 APCs Células Apresentadoras de Antigénios B Btk Bruton's tyrosine kinase C Ca Cálcio CD Cluster of Differentiation cDNA DNA complementar Ct Cycle Threshold D DAG Diacyl-glycerol DNA Ácido desoxirribonucleico dNTPs Desoxinucleotídeos Trifosfatados E EGFR Epidermal Growth Factor Receptor F Fab Fragment antigen-binding Fc Fragment crystallizable FcγRs Recetores Fcγ G g Glicoproteína G-CSF Granulocyte-colony Stimulating Factor GPI Glycophosphatidylinositol GUSB Beta-glucuronidase GvHDs Doenças do enxerto contra o hospedeiro H HCMV Citomegalovírus Humano HIV Human Immunodeficiency Virus HLA Human leukocyte antigen HR Hazard Ratio HSPGs Heparan Sulfate Proteoglycans HSCT Transplante de células estaminais hematopoiéticas H2O Água IV I IC Intervalo de Confiança IE Immediate-early IFR3 Interferon Regulatory Factor 3 IFN Interferão Ig Imunoglobulina IL Interleucina IP3 Inositol Trisphosphate IRL Internal Repeat Long IRS Internal Repeat Short ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif ITIM Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif J JNK c-Jun N-terminal kinases K kpb Quilo pares de bases KIR Killer Ig-like Receptors M MAPK Mitogen-activated Protein Kinase MHC Major Histocompatibility Complex MIEP Major Immediate-Early Promotor mL Mililitros mRNA RNA mensageiro N NF-κB Nuclear Factor kappa B NK Natural Killer nm Nanómetros O ORF Open Reading Frame P P Probabilidades PAMPs Pathogen-associated Molecular Patterns PCR Polymerase Chain Reaction PDGFR-α Platelet-derived Growth Factor Receptor α PI3K Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase PIP2 Phosphatidylinositol (3,4)-bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate PKC Proteína cinase C PLCγ Fosfolipase C-γ pp Fosfoproteína V R RNA Ácido ribonucleico RT Transcriptase Reversa RT-PCR Reverse-Transcription PCR S SHIP1 Src homology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1 SNPs Single Nucleotide Polymorphisms Syk Spleen Tyrosine Kinase T TLRs Toll-like Receptors TNF Fator de Necrose Tumoral TRL Terminal Repeat Long TRS Terminal Repeat Short U µL Microlitros UL Unique Long US Unique Short X χ2 Qui-Quadrado XII XIII RESUMO XIV Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT XV O cancro constitui uma das principais causas de morte no mundo, sendo que as neoplasias hematológicas são preocupantes, em consequência da sua elevada taxa de incidência e mortalidade em crianças e adolescentes. O transplante de células estaminais hematopoéticas (HSCT) continua a ser indicado no tratamento de alguns tipos de neoplasias hematopoiéticas; porém, está associado a uma significativa morbidade e mortalidade devido principalmente ao aparecimento das doenças do enxerto contra o hospedeiro. A administração de fármacos imunossupressores é fundamental para evitar a rejeição do transplante, sendo acompanhada por um aumento da suscetibilidade a infeções, nomeadamente pelo Citomegalovírus Humano (HCMV). A reativação do HCMV após o transplante ocorre em 60% a 70% dos doentes seropositivos para o HCMV antes do transplante. A existência de exames laboratoriais sensíveis permite a deteção precoce da infeção pelo HCMV no sentido de administrar uma terapia preemptiva que contribui para a redução da morbidade e mortalidade após o transplante. As células envolvidas na latência, replicação e na resposta imune contra HCMV expressam recetores para a região Fc das IgG (FcγRs), cuja afinidade para as diferentes subclasses das IgG pode mudar na presença de variações genéticas funcionais nos genes que codificam os FcγRs. Deste modo, torna-se relevante estudar a influência dos polimorfismos genéticos funcionais FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na reativação do HCMV e na sobrevivência global de indivíduos submetidos a HSCT. Neste sentido, procedeu-se à genotipagem dos polimorfismos referidos por PCR em tempo real em amostras de doentes transplantados (n=180). Adicionalmente, foi realizado um estudo funcional em que se procedeu à quantificação dos níveis de expressão de mRNA de IFN-γ numa população controlo (n=53), de acordo com os polimorfismos estudados. No presente estudo, verificamos que no grupo de indivíduos com infeção ativa pelo HCMV, os portadores da variante FCGR2A 131HH apresentam uma sobrevivência global inferior comparativamente aos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RH/RR (31 vs 46 meses, P=0,024); observamos também que os indivíduos com infeção ativa pelo HCMV e portadores da variante FCGR3A 158VV apresentam uma sobrevivência global inferior quando comparados com os indivíduos portadores das variantes FCGR3A 158VF/FF (14 vs 45 meses, P=0,019). Cumulativamente, foi observado um efeito sinérgico dos dois polimorfismos, sendo que os indivíduos portadores das variantes genéticas FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV apresentam uma sobrevivência global inferior comparativamente aos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF (15 vs 46 meses, P=0,013), apresentando também um risco de morte aumentado (HR=6,35, P=0,004). Quando considerado o status da infeção pelo HCMV, verificamos que os indivíduos com infeção ativa pelo HCMV portadores dos variantes Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT XVI FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV apresentam uma sobrevivência global inferior comparativamente aos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF (P<0,0001). Os resultados sugerem que os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131HH ou FCGR3A 158VV apresentam um risco aumentado para a reativação do HCMV (RR=3,29, P<0,0001). Adicionalmente, no estudo funcional, verificamos que os indivíduos portadores da variante FCGR3A 158V apresentam uma expressão de mRNA de IFN-γ aumentada (2-ΔΔCt = 1,57, P=0,048). Os resultados sugerem que uma maior ativação do recetor FcγRIIA por parte dos indivíduos portadores da variante FCGR2A 131HH poderá levar a uma maior ativação das cascatas de sinalização PI3K e NF-κB induzida pelo HCMV, promovendo a diferenciação dos monócitos em macrófagos fundamental para a replicação do HCMV. O efeito do IFN-γ produzido em maior quantidade pelos indivíduos portadores do alelo FCGR3A 158V poderá estimular a diferenciação dos monócitos em macrófagos, potenciando também a disseminação viral. A caracterização genética individual dos polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F poderá ser uma estratégia útil na definição de um subgrupo com maior risco para a ocorrência de reativação do HCMV. Assim, os indivíduos seropositivos para o HCMV e que, cumulativamente, sejam portadores das variantes FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV, deveriam ser alvo de uma maior monitorização da infeção pelo HCMV e, consequentemente, poderão beneficiar de uma terapia preemptiva mais precoce com o objetivo de prevenir o desenvolvimento de doenças associadas à infeção pelo HCMV que influenciam a sobrevivência global dos doentes submetidos a HSCT. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT XVII ABSTRACT Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT XVIII Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT XIX Cancer is a leading cause of death worldwide, and the hematologic malignancies are worrying, as a consequence of their high rate of incidence and mortality in children and adolescents. The hematopoietic stem cells transplantation (HSCT) continues to be indicated for the treatment of hematopoietic neoplasms; however, it exhibits a significant morbidity and mortality associated to graft versus host diseases. The administration of immunosuppressive drugs is essential to prevent the transplant rejection, and is accompanied by an increased susceptibility to infections, such as Human Cytomegalovirus (HCMV). The HCMV reactivation after transplantation occurs in 60% to 70% of patients seropositive for HCMV prior to transplantation. The existence of sensitive laboratory tests allows the early detection of HCMV infection in order to deliver a preemptive therapy, which contributes to the reduction of morbidity and mortality after transplantation. The cells involved in latency, replication and immune response against HCMV express receptors for the Fc region of IgG (FcγRs), whose affinity for the different subclasses of IgG can change in the presence of functional genetic variations in genes encoding these receptors. Thus, it becomes important to study the influence of functional genetic polymorphisms FCGR2A R131H and FCGR3A V158F in the Fc receptors and its impact in HCMV reactivation and overall survival of patients undergoing HSCT. In this way, we proceeded to genotyping of these polymorphisms by real-time PCR. Additionally, we performed a functional study to quantify the IFN-γ mRNA expression levels in a control population, according to the described polymorphisms. In the present study, we observed that within the group of individuals with active HCMV infection, the FCGR2A 131HH variant carriers have a lower overall survival compared to individuals FCGR2A 131RR/RH variants carriers (31 vs 46 months, P=0.024); we also verified that the individuals FCGR3A 158VV variant carriers have a lower overall survival comparatively to individuals FCGR3A 158VF/FF variants carriers (14 vs 45 months, P=0.019). Cumulatively, we observed a synergic effect of polymorphisms, whose individuals FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV variants carriers have a lower overall survival compared to individuals FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF variants carriers (15 vs 46 months, P=0.013), also presenting an higher risk of death (HR = 6.35, P = 0.004). When considering the status of HCMV infection, we found that individuals with active HCMV infection, and FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV variants carriers, have a lower overall survival compared to individuals FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF variants carriers (P<0.0001). The results suggest that individuals carrying the variant FCGR2A 131HH or FCGR3A 158VV have an increased risk for HCMV reactivation (RR=3.29, P<0.0001). Additionally, in the functional study, we Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT XX found that individuals with FCGR3A 158V variant exhibit an increased IFN-γ mRNA expression levels (2-ΔΔCt=1.57, P=0.048). The results suggest that an increased activation of the FcγRIIA by individuals FCGR2A 131HH variant carriers, can lead to greater activation of PI3K and NF-κB signaling pathways induced by HCMV, promoting the monocytes-to-macrophages differentiation, essential for HCMV replication. The effect of IFN-γ produced in greater amounts by individuals FCGR3A 158V allele carriers, can stimulate the differentiation of monocytes into macrophages and, consequently, enhancing the viral spread. The individual genetic characterization of polymorphisms FCGR2A R131H and FCGR3A V158F could be a useful strategy in subgroup definition of individuals with higher risk for HCMV reactivation. Thus, the seropositive individuals for HCMV and that, cumulatively, are carriers of variants FCGR2A 131HH or FCGR3A 158VV, should be subject to greater HCMV infection monitoring and may benefit of an early preemptive therapy, with the goal of preventing the development of HCMV infection-associated diseases, that influencing the overall survival of patients undergoing HSCT. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT XXI CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 4 A infeção pelo Citomegalovírus Humano (HCMV) permanece como uma das principais causas de morbidade e mortalidade após o HSCT alogénico devido ao extenso período de imunossupressão, pelo que o estado da infeção pelo HCMV dos recetores do transplante tem uma forte influência no prognóstico destes indivíduos [17]. A existência de técnicas laboratoriais fiáveis e sensíveis para a deteção precoce da infeção pelo HCMV permite a administração de uma terapia preemptiva que contribui para a redução da morbidade e mortalidade após o HSCT [18]. Este tipo de terapia não tem como objetivo prevenir a infeção, mas sim para prevenir a doença causada pelo HCMV [19]. Existem duas principais formas de infeção pelo HCMV, sendo elas: infeção primária, que ocorre quando o vírus infeta o hospedeiro sem infeção a priori, e infeção recorrente, quando ocorre reativação do vírus em indivíduos seropositivos ou reinfeção em indivíduos previamente infetados com uma estirpe diferente da que causou a infeção original [20]. A reativação do HCMV após o HSCT alogénico ocorre em 60 a 70% dos doentes que são seropositivos e a infeção primária desenvolve-se em 20 a 30% dos recipientes seronegativos antes do transplante [21]. 1.3. Citomegalovírus Humano O HCMV pertence à família Herpesviridae, que está dividida em três subfamílias: alphaherpesviruses (Vírus Herpes Simplex 1 e 2 e Vírus da Varicela-zoster), betaherpesviruses (Citomegalovírus e Herpesvírus 6 e 7) e gammaherpesviruses (Vírus Epstein-Barr e Herpesvírus 8) [22]. A principal característica dos herpesvírus humanos é a capacidade de estabelecer uma infeção latente, em que o vírus persiste dentro de células específicas do hospedeiro, e consegue defender-se do reconhecimento imunológico [23]. Durante este período de latência, o HCMV permanece em células mielóides indiferenciadas, como os monócitos, e nos percursores das células dendríticas [24]. A transmissão do HCMV pode ocorrer através da saliva, contacto sexual, aleitamento materno, transfusão sanguínea ou transplante de células estaminais hematopoiéticas/órgãos sólidos [25]. As principais manifestações clínicas da doença causada pelo HCMV em recetores do transplante são pneumonia e doenças gastrointestinais; por outro lado, retinites e doenças do sistema nervoso central são ocasionalmente observadas [26]. Para além destes, sintomas como febre, neutropenia, linfadenopatia, hepatite, trombocitopenia e meningoencefalite também podem ser observados [22]. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 5 No que diz respeito à sua estrutura, o HCMV apresenta uma cápside viral icosaédrica que contém o material genómico e é delimitada por uma camada de proteínas denominada tegumento e uma bicamada lipídica externa (envelope) enriquecida com glicoproteínas que constituem os principais alvos para o desenvolvimento de uma resposta imune (Figura 3A) [27]. É um vírus de DNA de cadeia dupla cujo genoma tem aproximadamente 230 kpb e é constituído por cerca de 200 Open Reading Frames (ORFs) que codificam proteínas envolvidas na síntese de ácidos nucleicos (DNA polimerase viral), genes reguladores e proteínas estruturais (cápside e proteínas do virião) e outros genes com impacto na interação vírus-hospedeiro, contribuindo assim para o êxito do parasitismo no hospedeiro humano [23]. O seu genoma está dividido em duas unique regions designadas UL e US, flanqueadas por dois conjuntos de inverted repeats: TRL/IRL e IRS/TRS (Figura 3B) [28]. A cápside viral contém cinco principais proteínas – codificadas pelos genes UL46, UL48.5, UL80, UL85 e UL86 – que interagem especificamente com proteínas do tegumento para iniciar a formação do tegumento e originar viriões infeciosos maduros. Para além desta função, estão ainda envolvidas na síntese de DNA viral e na replicação do vírus [29, 30]. TRL UL IRL IRS US TRS A) B) Figura 3 - A) Representação esquemática do HCMV. B) Organização esquemática do genoma do HCMV. As abreviaturas das regiões individuais do genoma indicam: terminal repeat long (TRL), unique long (UL), internal repeat long (IRL), internal repeat short (IRS), unique short (US) e terminal repeat short (TRS). Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 6 As proteínas do tegumento compreendem cerca de metade do total de proteínas que compõem os viriões infeciosos, sendo que a fosfoproteína (pp) 65, a pp71, pp150 e a pp28 as mais importantes com base na função que desempenham no ciclo de replicação do HCMV [31]. A pp65, codificada pelo gene UL83, é a proteína mais abundante do tegumento e está envolvida na modulação/evasão à resposta imune das células do hospedeiro durante a infeção pelo HCMV e apresenta atividade cinase, mediando a fosforilação das proteínas virais immediate-early (IE) [32]. A pp71, codificada pelo gene UL82, é uma proteína necessária para uma eficiente replicação viral, uma vez que leva à ativação da expressão de genes virais IE através da indução da degradação da Daxx, uma proteína envolvida na repressão da transcrição [33]. A pp150 e a pp28, codificadas pelos genes UL32 e UL99 respetivamente, são proteínas altamente imunogénicas. A pp150 é importante na reorganização do assembly compartment no citoplasma durante a montagem do virião [32]. A pp28 apresenta uma função importante no envolvimento citoplasmático das proteínas do tegumento e da cápside durante o processo de montagem do virião [34]. A cápside viral e o tegumento são envolvidos pelo envelope, bicamada lipídica que contém glicoproteínas (g) na sua superfície, sendo que as principais são: gB (UL55), gH (UL75), gM (UL100), gN (UL73), gL (UL74) e gO (UL115) [31]. Estas glicoproteínas estão envolvidas no processo de entrada do HCMV nas células, nomeadamente na ligação inicial à célula, seguida da fusão com a membrana e internalização do vírus na célula, e bem como na ativação da resposta imune inata [35]. 1.4. Mecanismos de entrada do Citomegalovírus Humano nas células A infeção é iniciada quando uma partícula viral contacta uma célula, através da interação das glicoproteínas de superfície do virião com moléculas dos recetores de superfície das células [23]. O HCMV pode infetar vários tipos de células, como monócitos/macrófagos, células endoteliais, células epiteliais, fibroblastos, células dendríticas, células do estroma, neutrófilos, neurónios e hepatócitos [36, 37]. Inicialmente, através das glicoproteínas gB e gM/gN que se encontram no envelope viral, o HCMV interage com Heparan Sulfate Proteoglycans (HSPGs) presentes na superfície das células e funcionam como “correntes” na ligação do vírus à membrana celular (Figura 4A) [35, 38]. Na fase de acoplamento, a gB pode interatuar com recetores expressos na superfície das células, como é o caso do Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) e do Platelet-derived Growth Factor Receptor α (PDGFR-α), desencadeando a ativação de vias de sinalização, como a via do PI3K-Akt, a fosfolipase Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 7 C-γ (PLCγ), a mobilização intracelular de cálcio, entre outras (Figura 4B) [39, 40]. O facto de o HCMV poder entrar numa grande diversidade de células sugere a existência de vários recetores e mecanismos envolvidos no processo de entrada [35, 41]. Posteriormente, a gB e o complexo gH/gL/gO estão envolvidos na fusão do vírus com a membrana. A interação entre a gB e as integrinas celulares conduz à internalização do vírus [35]. Assim, as integrinas α2β1, α6β1 e αVβ3 funcionam como co-recetores na fase de fusão do processo de entrada do HCMV (Figura 4C) [42-44]. A entrada do HCMV é também acompanhada pela ativação da imunidade inata através da ativação dos Toll-like Receptors (TLRs) que detetam pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) [45]. O HCMV interage com o TLR2 através das glicoproteínas gB e gH do envelope, levando à ativação do NF-κB e à produção de citocinas pro-inflamatórias (Figura 4D) [46, 47]. Apesar do TLR2 não estar diretamente envolvido no processo de entrada do HCMV, este recetor parece estar coordenado com a entrada viral e a ativação da imunidade inata [35]. Figura 4 – Representação esquemática do processo de entrada do HCMV. A) Ligação inicial do HCMV aos HSPGs. B) Acoplamento do HCMV à membrana, através da interação com recetores de superfície. C) Fusão do HCMV com a membrana, com a ajuda das integrinas. D) Ativação da imunidade inata através da interação do TLR2 com as glicoproteínas presentes no envelope viral. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 8 Também têm sido abordados outros mecanismos de entrada do HCMV nas células. Por exemplo, o HCMV pode entrar em células epiteliais e endoteliais por endocitose, um processo de fusão que requer acidificação através dos endossomas e, muito provavelmente, necessita do complexo gH/gL/UL128-131 para a entrada nestas células [48-50]. Para além deste mecanismo, o HCMV pode ser internalizado em células dendríticas por macropinocitose, um processo importante na captura do antigénio, dependente de actina e colesterol, mas independente do pH [51]. Após a fusão do vírus com a membrana plasmática dá-se a deposição dos componentes do virião no citoplasma e o DNA viral migra para o núcleo, onde se inicia a replicação [23]. 1.5. Ciclo de replicação, latência e reativação do Citomegalovírus Humano A replicação do HCMV ocorre em vários tipos de células diferenciadas do hospedeiro e o ciclo de replicação do HCMV envolve uma fase nuclear e outra citoplasmática (Figura 5) [52]. Durante a fase lítica da infeção ocorre no núcleo da célula hospedeira a síntese de DNA viral, seguida pela expressão de genes virais consistente com o ciclo de vida do HCMV: os genes IE codificam proteínas que desempenham uma função crucial na expressão de genes virais consequentes e uma replicação viral eficiente; os genes early (E) codificam enzimas necessárias para a replicação do DNA viral e para a fosforilação de proteínas e, após a replicação do DNA viral, ocorre a transcrição dos genes late (L) que codificam proteínas estruturais, incluindo glicoproteínas virais e proteínas da nucleocápside [53, 54]. Os genes IE podem ser silenciados após a infeção, resultando numa infeção latente caracterizada pela minimização da expressão de genes virais e da formação de novos viriões [24]. A expressão de genes virais L é seguida pela montagem da cápside, encapsidação do DNA e tegumentação inicial. Após a sua formação, a nucleocápside é transportada para o citoplasma através do nuclear complex egress, que facilita o envolvimento inicial da nucleocápside na membrana nuclear interna, seguido de um novo envolvimento na membrana nuclear externa [52]. No citoplasma, dentro do assembly compartment, os viriões em desenvolvimento adquirem a maioria das proteínas do tegumento e do envelope, um processo suportado pelo retículo endoplasmático e por endossomas. Posteriormente, os viriões são transportados para a superfície celular para serem libertados [55]. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 9 Figura 5 – Ciclo de replicação do HCMV. A latência é definida pela persistência do genoma viral sem a produção de viriões infeciosos, uma vez que os genes IE são silenciados após a infeção. Contudo, pode ocorrer a reativação viral sob determinados estímulos, como é o caso da imunossupressão [24]. Existem evidências de que células mielóides indiferenciadas, tais como os monócitos e células dendríticas progenitoras, transportam o vírus latente e que a diferenciação destas células pode regular a expressão de genes virais IE importantes para a reativação do HCMV [56]. Assim, a diferenciação dos monócitos em macrófagos leva a que se estabeleça uma infeção persistente, pois ao contrário dos monócitos, os macrófagos são células permissivas para a replicação viral [57]. Também a diferenciação das células progenitoras CD34+ em células dendríticas maduras leva à reativação da expressão de genes virais, mas também à produção de viriões infeciosos [58]. A reativação do vírus latente em células mieloides progenitoras ocorre em simultâneo com a diferenciação celular e parece estar correlacionada com modificações póstraducionais das histonas associadas ao major immediate-early promoter (MIEP), levando à remodelação da cromatina [59, 60]. Mais ainda, existem evidências de que a reativação do HCMV poderá estar correlacionada com a expressão de citocinas pro-inflamatórias (TNF-α, IFN-γ, entre outras), mas também com a ativação de fatores de transcrição, como o NF-κB e o activator protein 1 (AP1), que se ligam ao MIEP de modo a ativar a expressão de genes IE [60, 61]. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 10 Assim, torna-se importante perceber a interação entre o HCMV e as células do hospedeiro, principalmente a nível da persistência do vírus nestas células e da função destas na resposta imune contra o HCMV [62]. 1.6. Citomegalovírus Humano e resposta imune A infeção pelo HCMV induz tanto uma resposta imune inata como uma resposta adaptativa humoral e mediada por células, que levam à resolução da infeção primária aguda. Durante o período de latência, a resposta imune de longo prazo à infeção pelo HCMV exige uma resposta sustentada das células T de memória e a produção de IgG, de modo a prevenir o aparecimento de doença clínica após a reativação do vírus [63]. Apesar da reconstituição da resposta das células T de memória específicas para o HCMV ser relevante, a recuperação da função das células Natural Killer (NK) é também importante na proteção contra o HCMV em doentes submetidos ao HSCT [64]. A imunidade inata desempenha uma função crucial no controlo precoce da infeção pelo HCMV, sendo inicialmente mediada pela ativação do TLR2, que reconhece as glicoproteínas gB e gH presentes no envelope viral [47, 65]. Como consequência são ativadas vias de sinalização que levam à sobre-expressão do NF-κB e do interferon regulatory factor 3 (IFR3), levando à produção de citocinas inflamatórias como a interleucina 12 (IL-12), interferão do tipo I (IFN-α/β) e TNF [22, 66]. Mais ainda, a resposta mediada pelo TLR2 contra o HCMV é aumentada na presença do CD14 [46]. Em última análise, a secreção de citocinas inflamatórias conduz ao recrutamento de células da imunidade inata (células NK) e à ativação de APCs que induzem a imunidade adaptativa [22]. As células NK são uma importante primeira linha de defesa contra patogénios virais como o HCMV [67]. Estas células participam na clearance viral através da lise de células infetadas (ADCC, do inglês Antibody Dependente Cell-mediated Cytotoxicity) e da libertação de citocinas inflamatórias (IFN-γ e TNF-α) que vão regular a função de outras células do sistema imune [68]. As células NK compreendem 5 a 15% de todos os linfócitos circulantes e são geralmente divididas com base na expressão relativa dos marcadores CD56 e CD16 em duas principais subpopulações que apresentam funções distintas: CD56bright CD16+/- e CD56dim CD16+ [69, 70]. O subconjunto CD56bright CD16+/- medeia uma função efetora citolítica, através da libertação de potentes citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias (principalmente de IFN-γ), mas apresenta pouca citotoxicidade [70]. Esta subpopulação expressa altos níveis do recetor CD94/NKG2A, mas baixo níveis de moléculas Killer Ig-like Receptors (KIR) [71]. As células CD56bright Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 11 CD16+/- libertam IFN-γ apenas dezasseis horas após a estimulação [72]. Já o subconjunto CD56dim CD16+ abrange cerca de 90% de todas as células NK do sangue periférico e medeia uma resposta de citotoxicidade celular direta contra as células infetadas com o vírus, induzida pela libertação de perforina e granzima. [70]. Esta subpopulação é caracterizada por uma alta expressão de moléculas KIR [71]. As células CD56dim CD16+ podem também produzir altas quantidades de IFN-γ entre duas a quatro horas após a sua ativação, induzida pela combinação de citocinas como a IL-2, IL-12 e IL-15 [72]. Após o HSCT ocorre uma expansão da subpopulação CD56bright CD16+/- produtora de citocinas que persiste até pelo menos um ano, diminuindo gradualmente no período póstransplante [73]. Estudos recentes sugerem que as CD56dim CD16+ derivam das células CD56bright CD16+/- e a maturação completa da subpopulação CD56dim CD16+ envolve a perda progressiva do recetor CD94/NKG2A e a aquisição de moléculas KIR [71, 74]. Assim, a ativação das células NK é altamente controlada pelo balanço entre os recetores ativadores e inibidores [71]. Os principais recetores inibidores são os KIR e os CD94/NKG2A, e os principais recetores ativadores são os Natural Cytotoxicity Receptors (NKp30, NKp44 e o NKp46), CD94/NKG2C, CD94/NKG2D e o CD117 (c-kit) [71, 75-78]. Este balanço é modulado pela ação de citocinas que controlam as funções efetoras das células NK [79]. O IFN-γ é uma citocina pró-inflamatória produzida principalmente pelas células NK, pelas células T CD4+ (Th1) e pelas células T CD8+ [80]. Contudo, outras células do sistema imune, como as células NKT, as APCs e até as células B, também podem produzir IFN-γ [81]. A sua produção é controlada por citocinas libertadas pelas APCs, sendo estimulada pelas IL-12 e IL-18 e regulada negativamente por citocinas como a IL-4 [81]. As suas principais funções incluem a diferenciação das células Th1, induz o class switching para a classe IgG, a ativação de macrófagos, um aumento da expressão de moléculas MHC classe II e um aumento da capacidade de apresentação de antigénios [82]. O HCMV é um potente imunogénio que desencadeia uma forte resposta imune [83]. A resposta imune humoral contra o HCMV é caracterizada pela produção de células B de memória e de plasmócitos [22]. Estas células produzem anticorpos neutralizantes contra glicoproteínas do envelope viral (por exemplo, gB e gH), proteínas estruturais do tegumento (por exemplo, a pp65 e a pp150), produtos de genes do locus UL128-131A, que está envolvido no processo de entrada do vírus nas células hospedeiras, bem como proteínas não estruturais (IE1 e UL123) [63, 84]. Os anticorpos IgM são produzidos após a infeção primária pelo HCMV, mas também podem surgir durante a reativação ou reinfeção [85]. A medição da avidez das IgG pode ser usada para diferenciar entre uma Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 12 infeção primária e uma reativação do HCMV. Assim, a combinação da medição dos níveis de IgM e da avidez das IgG proporciona um marcador de diagnóstico de uma infeção primária pelo HCMV [85, 86]. Uma baixa avidez das IgG e altos níveis de IgM estão associados a infeções primárias, e uma alta avidez das IgG indica que os altos níveis de IgM derivam da reativação da infeção pelo HCMV [85, 86]. Os recetores Fcγ (FcγRs) reconhecem a região Fc das IgG como ligando e a sua ligação desencadeia diversos mecanismos efetores, como a ADCC, fagocitose, endocitose de complexos imunes, produção de citocinas, produção de anticorpos e facilita a apresentação de antigénios pelas APCs [87]. A resposta imune mediada por células é o principal mecanismo pelo qual a replicação do HCMV é controlada, uma vez que a resposta imune induzida pela infeção primária não erradica o vírus. Assim, as células T CD8+ e CD4+ específicas para o HCMV são importantes para o controlo e restrição da replicação viral no hospedeiro com infeção persistente [83]. De acordo com Li e seus colaboradores, os indivíduos que não possuem células T CD8+ e CD4+ específicas para o HCMV apresentam um risco aumentado de desenvolver doença [88]. Após a resolução da resposta aguda ocorre uma redução da resposta efetora e um aumento da memória imunológica [22]. A imunovigilância da infeção latente/reativação do vírus depende dos linfócitos T CD8+ citotóxicos [22]. A principal função destas células passa pela lise de células alvo infetadas pelo vírus e é mediada pela ativação específica de células dendríticas, responsáveis pela apresentação de antigénios associados às moléculas MHC classe I de modo a induzir uma resposta das células T CD8+ citotóxicas [89]. As células T CD8+ expressam uma variedade de moléculas efetoras, como a granzima A, B, K e perforina, envolvidas na indução da lise das células alvo [22]. A resposta imune específica para o HCMV em portadores saudáveis do vírus é dependente de uma resposta forte das células T contra um amplo repertório de antigénios, como a pp65, o IE1, a pp50, a pp28, a gB, a gH e as proteínas US [90, 91]. As células T CD4+ são classicamente definidas como células T helper e reconhecem antigénios apresentados por APCs como as células dendríticas e macrófagos. A ativação das células T CD4+ leva à produção de citocinas inflamatórias que promovem uma resposta inflamatória, à expansão de células efetoras como as células T citotóxicas e auxiliam as células B a produzir anticorpos com alta afinidade para o vírus [22, 89]. A resposta das células T CD4+ específicas para o HCMV depende de uma variedade de antigénios, tais como a pp65, o IE1, a gB e a gH [63]. Assim, uma resposta funcional das células T CD8+ e a resposta imune através de anticorpos são insuficientes para o controlo da replicação viral, pelo que o desenvolvimento das células T CD4+ de memória é necessário para a recuperação da Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 13 infeção causada pelo HCMV [92]. Estudos realizados em indivíduos submetidos a HSCT sugerem que uma resposta visível das células T CD8+ e CD4+ específicas para o HCMV está correlacionada com a proteção e recuperação da doença causada pelo HCMV [83]. 1.7. Recetores Fcγ Os recetores para as imunoglobulinas (recetores Fc) desempenham uma função importante na resposta imune, ligando a imunidade humoral e a imunidade celular [93]. Existem recetores Fc específicos com a capacidade de reconhecer e ligarem-se às cinco classes de imunoglobulinas. Estes recetores são expressos em diferentes células e apresentam diferentes atividades biológicas [94]. Além da resposta contínua das células T específicas, a imunidade a longo prazo contra o HCMV também requer a produção de anticorpos neutralizantes (IgG) [95]. As IgG constituem cerca de 75% das imunoglobulinas circulantes, sendo a classe de imunoglobulinas mais abundante no soro [96]. Estes anticorpos ligam-se aos respetivos antigénios através das suas duas regiões Fab e são reconhecidos por recetores específicos que se ligam ao domínio Fc das IgG; por isso, são chamados de recetores Fcγ (FcγRs) [97]. Após a ligação das IgG, os FcγRs desencadeiam várias funções efetoras relacionadas com a imunidade inata e a adaptativa, dependendo da classe dos FcγRs e também do tipo de células em que estão expressos [98]. Eles podem exibir funções efetoras como: a fagocitose, a ADCC, a endocitose de complexos imunes, a produção de citocinas, a regulação da ativação de células B (produção de anticorpos) e facilitam a apresentação de antigénios [87]. Os FcγRs são codificados por oito genes diferentes, localizados no braço longo do cromossoma 1 (1q21-23), e estão divididos em três classes: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) e FcγRIII (CD16) [99]. Os FcγRs apresentam diferentes características, nomeadamente a nível da sua estrutura molecular, distribuição celular, afinidade para IgG e motivos de sinalização, que estão resumidas na Tabela 1 [98]. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 20 Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 21 CAPÍTULO 2 OBJETIVOS Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 22 2. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 23 2.1. Objetivo Geral Avaliar a influência dos polimorfismos genéticos FCGR2A R131H (rs1801274) e FCGR3A V158F (rs396991) no risco de reativação do HCMV e na sobrevivência global de doentes submetidos a HSCT. 2.2. Objetivos Específicos  Avaliar a frequência dos polimorfismos genéticos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F em doentes submetidos a HSCT.  Avaliar a associação dos polimorfismos estudados e a sobrevivência global de indivíduos submetidos a HSCT.  Avaliar a associação dos polimorfismos estudados e o risco de morte em indivíduos submetidos a HSCT.  Avaliar a associação dos polimorfismos estudados e o risco de reativação do HCMV em indivíduos submetidos a HSCT.  Análise da expressão de mRNA de IFN-γ numa população controlo, de acordo com os polimorfismos genéticos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 24 Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 25 3. CAPÍTULO 3 MATERIAL E MÉTODOS Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 26 Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 27 3.1. Análise dos polimorfismos genéticos FCGR2A R131H (rs1801274) e FCGR3A V158F (rs396991) 3.1.1. População O estudo de variações genéticas em genes dos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA envolvidas na resposta imune contra o HCMV foi efetuado com base numa coorte retrospetiva histórica, em que foram selecionados doentes submetidos a HSCT no Serviço de Transplantação de Medula Óssea do Instituto Português de Oncologia do Porto FG entre Janeiro de 2008 e Setembro de 2012. Os dados demográficos, clinicopatológicos, evolução da doença, assim como os dados da serologia e de monitorização da infeção pelo HCMV foram obtidos pela consulta dos processos clínicos de cada doente. A caracterização da população em estudo está resumida na Tabela 3. A cada participante do estudo foi colhida uma amostra de sangue (8 mL) por venopunção da região antecubital. Todos os indivíduos incluídos, de acordo com os procedimentos éticos, assinaram o consentimento informado para utilização das amostras biológicas, de acordo com a declaração de Helsínquia. Tabela 3 - Características da população em estudo. Características Nº de Doentes (N Total = 180) % Idade (Anos) Média 35 (16 – 54) - Género Feminino 73 0,41 Masculino 107 0,59 Patologia Leucemias Agudas 96 0,53 Doenças Linfoproliferativas Crónicas 38 0,22 Doenças Mieloproliferativas Crónicas 16 0,09 Síndromes Mielodisplásicos /Mieloproliferativos 17 0,09 Anemia Aplástica 13 0,07 Infeção pelo HCMV Positivo 102 0,57 Negativo 78 0,43 Reativação do HCMV Reativação 94 0,52 Não-Reativação 86 0,48 Tipagem HLA Idêntico 127 0,71 Não idêntico 23 0,13 Desconhecido 30 0,16 Regime de condicionamento Mieloablativo 117 0,65 Intensidade Reduzida 63 0,35 Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 28 3.1.2. Extração de DNA genómico Após a colheita das amostras procedeu-se à extração de DNA genómico a partir das células nucleadas do sangue periférico pelo método de extração por colunas de centrigugação com recurso ao kit de extração FavorPrep™ Genomic DNA Mini Kit (Favorgen®), consoante as especificações do fornecedor. A concentração e pureza do DNA obtido foi determinada através da medição da absorvância a 260 e 280 nm usando um espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 (Thermo Scientific®). 3.1.3. Genotipagem dos polimorfismos genéticos FCGR2A R131H (rs1801274) e FCGR3A V158F (rs396991) por PCR em tempo real Após a extração de DNA genómico da população em estudo foram analisadas as variantes genéticas dos genes FCGR2A R131H e FCGR3A V158F por discriminação alélica, com recurso a PCR em tempo real através da tecnologia TaqMan® (Applied Biosystems®), utilizando-se o sistema 7300 real-time PCR-System (Applied Biosystems®). Para o FCGR2A R131H, recorreu-se ao assay C___9077561_20 (Applied Biosystems®) onde as sondas marcadas com fluorocromos eram específicas para cada alelo, sendo que o VIC corresponde ao alelo T (TTACCTTTTAGGGTCTTTAAGAGGGTAAACCTAGGGTGGAAGAGGTAGGGT) e o FAM ao alelo C (TTACCTTTTAGGGTCTTTAAGAGGGCAAACCTAGGGTGGAAGAGGTAGGGT). Relativamente ao FCGR3A V158F, utilizou-se o assay C__25815666_10 (Applied Biosystems®), sendo as sondas marcadas com fluorocromos específicos para cada alelo, onde o VIC corresponde ao alelo G (AGACTTCTGTGTAAAAATGAGGGTTGTTCGGGGGACGTCTTCATCCTCGGC) e o FAM ao alelo T (AGACTTCTGTGTAAAAATGAGGGTTTTTCGGGGGACGTCTTCATCCTCGGC). A reação de amplificação para os dois polimorfismos em estudo incluiu 1x TaqMan® Genotyping Master Mix, 1x TaqMan® SNP Genotyping Assay e de água bidestilada, perfazendo um total de 6 µL por caso, aos quais foi adicionado 1 µL de DNA. As condições da amplificação foram as seguintes: pré-incubação a 95ºC durante 10 minutos, e em seguida, 45 ciclos de desnaturação a 92ºC durante 15 segundos e emparelhamento dos primers e extensão a 60ºC durante 30 segundos. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 29 A amplificação foi detetada e analisada com o auxílio do aparelho Real-Time 7300 ABI, através do software 7300 System Sequence Detection (versão 1.2.3 Applied Biosystems®), obtendo-se um gráfico semelhante ao da Figura 8. Como controlo de qualidade da genotipagem, este procedimento foi repetido em 10% das amostras e foram usados controlos negativos para confirmar a ausência de contaminação. Figura 8 – Discriminação alélica das variantes genéticas de um polimorfismo, através do PCR em tempo real. 3.2. Quantificação da expressão de mRNA de IFN-γ 3.2.1. População A quantificação da expressão de mRNA de IFN-γ e também o estudo de variações genéticas nos genes FCGR2A R131H e FCGR3A V158F foram realizados numa população controlo recrutada aleatoriamente a partir da população da região norte de Portugal. Todos os indivíduos incluídos assinaram o consentimento informado para poderem participar no estudo, e os respetivos dados socio-demográficos foram recolhidos através de um formulário previamente aceite pela comissão de ética do IPO do Porto. Os Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 36 Tabela 5 – Frequência das variantes genéticas relativas aos polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na população em estudo, de acordo com a infeção pelo HCMV. Polimorfismos HCMV- * HCMV+ * n % n % FCGR2A R131H (rs1801274) RR/RH 58 0,85 64 0,81 HH 10 0,15 15 0,19 FCGR3A V158F (rs396991) VV 5 0,08 7 0,09 VF/FF 60 0,92 72 0,91 * HCMV+, com infeção ativa pelo HCMV; HCMV-, sem infeção ativa pelo HCMV. 4.2. Influência do polimorfismo genético FCGR2A R131H na sobrevivência global de indivíduos submetidos a HSCT Através da análise das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier representadas na Figura 10 podemos verificar que o polimorfismo genético FCGR2A R131H não tem influência na sobrevivência global dos indivíduos submetidos a HSCT (Figura 10A, Log Rank test, P=0,211). Também não observamos uma diferença estatisticamente significativa na sobrevivência global entre os indivíduos portadores da variante homozigótica FCGR2A 131HH e os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH (Figura 10B, Log Rank test, P=0,081). Figura 10 – Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e respetivo Log Rank test para o polimorfismo FCGR2A R131H. Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) Log Rank Test, P=0,081 B Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) A Log Rank Test, P=0,211 RR RH HH RR/RH HH Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 37 Após estratificação de acordo com o status da infeção pelo HCMV, os indivíduos com infeção ativa pelo HCMV e portadores da variante FCGR2A 131HH, apresentam uma sobrevivência global inferior quando comparada com os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH (Figura 11A, Log Rank test, P=0,024). Contudo, não observamos diferenças estatisticamente significativas na sobrevivência global dos indivíduos sem infeção ativa pelo HCMV, de acordo com o polimorfismo estudado (Figura 11B, Log Rank test, P=0,927). 4.3. Influência do polimorfismo genético FCGR3A V158F na sobrevivência global de indivíduos submetidos a HSCT De acordo com as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier representadas na Figura 12, não se verificou qualquer associação estatisticamente significativa entre as variantes do polimorfismo FCGR3A V158F e a sobrevivência global dos indivíduos submetidos a HSCT (Figura 12A, Log Rank test, P=0,302). Mais ainda, não se observou uma diferença estatisticamente significativa na sobrevivência global entre os indivíduos homozigóticos para a variante FCGR3A 158VV e os indivíduos portadores das variantes FCGR3A 158VF/FF (Figura 12B, Log Rank test, P=0,081). Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) A Log Rank test, P=0,024 Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) B Log Rank test, P=0,927 RR/RH HH RR/RH HH Com infeção ativa pelo HCMV Sem infeção ativa pelo HCMV Figura 11 – Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e respetivo Log Rank test para o polimorfismo no gene FCGR2A R131H, estratificado por: A) infeção ativa; B) sem infeção ativa. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 38 Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) Log Rank test, P=0,302 A Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) Log Rank test, P=0,081 B No entanto, após estratificação de acordo com o status da infeção pelo HCMV, verificamos que os indivíduos com infeção ativa pelo HCMV, portadores da variante FCGR3A 158VV, apresentam uma sobrevivência global inferior quando comparados com os indivíduos portadores da variante FCGR3A 158VF/FF (Figura 13A, Log Rank test, P=0,019). Contudo, não observamos diferenças estatisticamente significativas na sobrevivência global dos indivíduos HCMV negativo, segundo o polimorfismo estudado (Figura 13B, Log Rank test, P=0,970). Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) A Log Rank test, P=0,019 Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) B Log Rank test, P=0,970 VV VF/FF VV VF/FF Com infeção ativa pelo HCMV Sem infeção ativa pelo HCMV Figura 12 – Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e respetivo Log Rank test para o polimorfismo FCGR3A V158F. Figura 13 – Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e respetivo Log Rank test para o polimorfismo no gene FCGR3A V158F, estratificado por: A) infeção ativa; B) sem infeção ativa. VV VF/FF FF VF VV Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 39 4.4. Influência sinérgica dos polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na sobrevivência global de indivíduos submetidos a HSCT Através da análise das curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier representadas na Figura 14, podemos verificar que os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV apresentam uma sobrevivência global inferior comparativamente à dos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF (Log Rank test, P=0,013). Após estratificação de acordo com o status da infeção pelo HCMV, verificamos que entre os indivíduos com infeção ativa pelo HCMV, os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV apresentam uma sobrevivência global inferior quando comparados com os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF (Figura 15A, Log Rank test, P<0,001). Porém, não observamos diferenças estatisticamente significativas na sobrevivência global dos indivíduos HCMV negativo, de acordo com a combinação dos polimorfismos estudados (Figura 15B, Log Rank test, P=0,471). Figura 14 – Curva de sobrevivência de Kaplan-Meier e respetivo Log Rank test para a combinação dos polimorfismos genéticos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F. Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) Log Rank Test, P=0,013 FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 40 Adicionalmente, a análise multivariada por Regressão de Cox demonstrou que os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV apresentam um risco de morte de aproximadamente 6 vezes superior do que os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF (Tabela 6, P=0,004). Tabela 6 – Análise de Regressão de Cox multivariada da combinação dos polimorfismos genéticos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F, ajustada para a idade e género. Variáveis HR IC 95% P FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV 6,35 1,78 – 22,60 0,004 Género 1,70 0,81 – 3,55 0,161 Idade 1,02 1,00 – 1,04 0,120 HR, Hazard Ratio; IC 95%, intervalo de confiança a 95% Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) A Log Rank test, P<0,0001 Sobrevivência Cumulativa (%) Sobrevivência global (Meses) B Log Rank test, P=0,471 FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF Com infeção ativa pelo HCMV Sem infeção ativa pelo HCMV Figura 15 – Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e respetivo Log Rank test para a combinação dos polimorfismos genéticos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F, estratificado por: A) infeção ativa; B) sem infeção ativa. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 41 4.5. Influência dos polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F no risco de reativação do HCMV em indivíduos submetidos a HSCT Através da análise multivariada por Regressão de Cox, podemos verificar que os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131HH e FCGR3A 158VV apresentam um risco aumentado para a ocorrência de reativação do HCMV (Tabela 7). Deste modo, os indivíduos portadores da variante FCGR2A 131HH apresentam um risco aumentado de aproximadamente 3 vezes de ocorrer a reativação do HCMV quando comparados aos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH (P<0,0001). No que diz respeito ao polimorfismo FCGR3A V158F, verificamos que os indivíduos portadores da variante FCGR3A 158VV apresentam um risco de reativação do HCMV de aproximadamente 2 vezes superior, comparativamente com os indivíduos portadores das variantes FCGR3A 158VF/FF (P=0,017). Além disto, observamos também que os indivíduos portadores da variante FCGR2A 131HH ou da variante FCGR3A 158VV apresentam um risco aumentado de aproximadamente 3 vezes de ocorrer a reativação do HCMV, comparativamente aos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF (P<0,0001). Tabela 7 – Análise de Regressão de Cox multivariada dos polimorfismos genéticos FCGR2A 131HH ou FCGR3A 158VV, ajustada para a idade, género, regime de condicionamento e patologia. MODELO Variáveis HR IC 95% P Modelo 1 FCGR2A 131HH 3,34 1,89 – 5,89 <0,0001 Género 1,00 0,65 – 1,55 0,989 Idade 1,01 1,00 – 1,02 0,159 Regime de Condicionamento 1,21 0,72 – 2,02 0,467 Patologia 0,94 0,79 – 5,89 0,447 Modelo 2 FCGR3A 158VV 2,29 1,16 – 4,52 0,017 Género 0,99 0,64 – 1,52 0,959 Idade 1,01 1,00 – 1,02 0,126 Regime de Condicionamento 1,19 0,71 – 2,02 0,509 Patologia 0,916 0,77 – 1,09 0,312 Modelo 3 FCGR2A 131HH ou FCGR3A 158VV 3,29 1,98 – 5,48 <0,0001 Género 0,98 0,64 – 1,50 0,917 Idade 1,01 0,99 – 1,02 0,268 Regime de Condicionamento 1,20 0,72 – 2,01 0,482 Patologia 0,94 0,79 – 1,11 0,438 HR, Hazard Ratio; IC 95%, intervalo de confiança a 95% Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 42 4.6. Análise da expressão de mRNA de IFN-γ para os polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na população controlo O efeito funcional das variantes analisadas foi caracterizado, procedendo-se à quantificação relativa de mRNA de IFN-γ numa população saudável. Na Tabela 8 estão representadas as frequências das variantes genéticas relativas aos genes FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na população controlo. A análise do equilíbrio de HardyWeinberg no grupo controlo permitiu observar que as frequências genotípicas observadas eram similares às esperadas para os polimorfismos em estudo (FCGR2A R131H, P=0,680; FCGR3A V158F, P=0,912). Verificamos que a frequência das variantes FCGR2A 131RR, 131RH e 131HH foram de 0,26, 0,48 e 0,26, respetivamente. Para o polimorfismo genético FCGR3A V158F, observou-se uma frequência de 0,09 da variante homozigótica 158VV, 0,42 da variante 158VF e 0,49 da variante 158FF. Tabela 8 – Frequências das variantes genéticas relativas aos genes FCGR2A R131H e FCGR3A V158F para a população controlo. Polimorfismos População Controlo n % FCGR2A R131H (rs1801274) RR 14 0,26 RH 25 0,48 HH 14 0,26 FCGR3A V158F (rs396991) VV 5 0,09 VF 22 0,42 FF 26 0,49 Após caracterização genotípica da população, observamos uma diferença estatisticamente significativa nos níveis de expressão IFN-γ no que diz respeito ao polimorfismo FCGR3A V158F, sendo que os indivíduos portadores das variantes FCGR3A 158VV/VF apresentam maior expressão de IFN-γ do que os indivíduos FCGR3A 158FF (Figura 16A, 2-ΔΔCt = 1,57, T test, P=0,048). Relativamente ao polimorfismo FCGR2A R131H, não encontramos uma diferença estatisticamente significativa nos níveis de expressão IFN-γ entre os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH e os indivíduos FCGR2A 131HH (Figura 16B,T test, P=0,588). Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 43 Figura 16 – Fold-change dos níveis de mRNA de IFN-γ de acordo com os polimorfismos: A) FCGR3A V158F e B) FCGR2A R131H. A B 0 0,5 1 1,5 2 2,5 FF VV/VF Fold-change dos níveis de IFN-γ FCGR3A V158F 0 0,5 1 1,5 2 2,5 RR/RH HH Fold-change dos níveis de IFN-γ FCGR2A R131H * Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 44 Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 45 5. CAPÍTULO 5 DISCUSSÃO Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 52 período pós-transplante [73]. Posteriormente, esta subpopulação dá origem à subpopulação de células NK CD56dim CD16+, que apesar de apresentarem uma função maioritariamente citotóxica, também são capazes de produzir grandes quantidades de IFN-γ [72]. Esta produção de IFN-γ parece estar associada a um estado de inflamação crónica que não é benéfico para o recetor do transplante, e é ainda pior para os indivíduos portadores da variante FCGR3A 158V. Uma possível explicação para este efeito poderá estar relacionada com a reativação do vírus. De acordo com os resultados obtidos, os indivíduos portadores da variante FCGR3A 158VV têm um risco aumentado de aproximadamente 2 vezes de ocorrer a reativação do vírus, comparativamente aos indivíduos FCGR3A 158VF/FF. Assim, a reativação do HCMV poderá ser mediada por este estado de inflamação crónica. Existem evidências de que o IFN-γ é necessário para a diferenciação dos monócitos em macrófagos, estabelecendo-se uma infeção ativa, pois ao contrário dos monócitos, os macrófagos são células permissivas para a replicação do HCMV [131, 132]. Cumulativamente, um estudo realizado em doentes submetidos a transplante renal, mostrou que a infeção latente ou ativa pelo HCMV induz uma ativação imune sistémica caracterizada pela produção de citocinas do tipo 1, como o IFN-γ, que pode até ter um papel na rejeição do alotransplante [132, 133]. Em suma, no presente estudo verificamos que os indivíduos portadores da variante FCGR3A 158VV com infeção ativa pelo HCMV apresentam pior sobrevivência global, quando comparados com os indivíduos portadores das variantes FCGR3A 158VF/FF. Este resultado poderá estar relacionado com a ocorrência de uma maior produção de IFN-γ pelas células NK dos indivíduos portadores do alelo FCGR3A 158V. Deste modo, o IFN-γ poderá estimular a diferenciação dos monócitos em macrófagos nos indivíduos portadores da variante FCGR3A 158VV com infeção ativa pelo HCMV, potenciando a infeção pelo HCMV que se poderá traduzir numa menor sobrevivência global destes indivíduos. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 53 5.3. Influência sinérgica dos polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na sobrevivência global e no risco de morte de indivíduos submetidos a HSCT Segundo os resultados obtidos do presente estudo, podemos observar um efeito sinérgico dos polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na sobrevivência global dos doentes submetidos a HSCT. Verificamos que os indivíduos portadores das variantes genéticas de alta afinidade FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV apresentam uma sobrevivência global inferior comparativamente aos indivíduos portadores das variantes de baixa afinidade FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF (15 meses versus 46 meses, respetivamente, P=0,013), apresentando também um risco de morte aumentado de aproximadamente 6 vezes. De acordo com o previamente mencionado, o aumento da expressão/produção de IFN-γ pelas células NK dos indivíduos portadores das variantes de alta afinidade, poderá estar a influenciar a sobrevivência global dos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV. Segundo um estudo realizado por Frausto-Del-Río e seus colaboradores, a fagocitose mediada pelos FcγRs em macrófagos diminui após o tratamento com IFN-γ [134]. O IFN-γ induz a ativação da Rac-1 e um aumento dos níveis basais de F-actina, por um mecanismo que envolve a via de sinalização PI3K, alterações que afetam o rearranjo do citoesqueleto e que resultam na diminuição da fagocitose pelos macrófagos [134]. Deste modo, os indivíduos portadores das variantes de alta afinidade FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV poderão produzir uma maior quantidade de IFN-γ, o que poderá modular a fagocitose mediada pelo FcγRIIA em macrófagos e, consequentemente, diminuir a resposta imune destes indivíduos contra algum tipo de microrganismo durante o período pós-transplante. Este facto poderá levar a que estes indivíduos apresentem uma sobrevivência global inferior, comparativamente aos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF. De acordo com os resultados obtidos quando considerado o status da infeção pelo HCMV, verificamos que os indivíduos com infeção ativa pelo HCMV, portadores dos variantes de alta afinidade FCGR2A 131HH / FCGR3A 158VV, apresentam uma sobrevivência global inferior comparativamente aos indivíduos portadores das variantes de baixa afinidade FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF. Cumulativamente, observamos que os indivíduos portadores da variante FCGR2A 131HH ou FCGR3A 158VV têm um risco superior de aproximadamente 3 vezes de reativação do HCMV quando comparados com os indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131RR/RH / FCGR3A 158VF/FF. Deste modo, uma maior ativação do recetor FcγRIIA por parte dos indivíduos portadores da variante FCGR2A 131HH poderá levar a uma maior ativação Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 54 das cascatas de sinalização PI3K e NF-κB induzida pelo HCMV, promovendo a diferenciação dos monócitos em macrófagos, fundamental para a replicação do HCMV. Adicionalmente, o efeito do IFN-γ produzido em maior quantidade pelos indivíduos portadores do alelo FCGR3A 158V, poderá estimular a diferenciação dos monócitos em macrófagos nos indivíduos com infeção ativa pelo HCMV, portadores da variante FCGR3A 158VV, potenciando a replicação do HCMV. Assim, o efeito cumulativo das duas variantes de alta afinidade FCGR2A 131HH e FCGR3A 158VV parece estar associado ao facto destes indivíduos apresentarem uma menor sobrevivência global quando comparados com os indivíduos portadores das variantes de baixa afinidade FCGR2A 131RR/RH e FCGR3A 158VF/FF. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 55 CAPÍTULO 6 CONCLUSÃO E PERSPETIVAS FUTURAS Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 56 Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 57 Atualmente, o HSCT alogénico é uma opção de tratamento para diversos tipos de neoplasias hematológicas. Porém, a toxicidade associada ao regime de condicionamento, a terapia de imunossupressão administrada após o enxerto e o aparecimento de GvHDs podem aumentar o risco de morbidade a longo prazo, e até levar ao aumento da suscetibilidade a infeções, como é o caso da infeção pelo HCMV. Estes fatores podem resultar no aumento da mortalidade e na redução da qualidade de vida após o transplante que pode melhorar com a administração de uma terapia preemptiva. A reativação do HCMV após o HSCT alogénico ocorre em 60 a 70% dos doentes que são seropositivos, sendo por isso importante estudar mecanismos moleculares que desencadeiem a reativação viral. Deste modo, a identificação de alterações genéticas com impacto na reativação do HCMV e, consequentemente, na sobrevivência global dos doentes submetidos a HSCT alogénico, poderá ser uma estratégia para a definição de biomarcadores moleculares como fator de prognóstico e com impacto no tratamento e follow up destes doentes. As células do sistema imune envolvidas na latência, replicação e resposta contra o HCMV expressam os FcγRs, que têm a capacidade de interagir com as IgG. A afinidade dos recetores para as diferentes subclasses de IgG pode ser alterada na presença de variações genéticas nos genes que codificam os FcγRs, nomeadamente os polimorfismos genéticos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F, o que pode resultar numa maior ativação das vias de sinalização desencadeadas por estes recetores. Em consequência de uma híper-ativação de vias de sinalização chave, como as cascatas de sinalização PI3K e NFκB, que potenciam a disseminação e a replicação do HCMV, os indivíduos portadores das variantes de alta afinidade FCGR2A 131HH e FCGR3A 158VV apresentam uma menor sobrevivência global. Os resultados do presente estudo suportam também um efeito sinérgico de polimorfismos funcionais FCGR2A R131H e FCGR3A V158F na sobrevivência global dos doentes submetidos a HSCT. Verificou-se também que os indivíduos portadores das variantes de alta afinidade FCGR2A 131HH ou FCGR3A 158VV apresentam um risco de reativação do HCMV aproximadamente 3 vezes superior. Com base nos resultados obtidos, a caracterização genética individual dos polimorfismos FCGR2A R131H e FCGR3A V158F poderá ser uma estratégia útil na prática clínica, na definição de um subgrupo com maior risco para a ocorrência de reativação do HCMV. Assim, os indivíduos seropositivos para o HCMV e que, cumulativamente, sejam portadores das variantes de alta afinidade, deveriam ser alvo de uma maior e precisa monitorização da infeção pelo HCMV e, consequentemente, poderão beneficiar de uma terapia preemptiva mais precoce com o objetivo de prevenir o desenvolvimento de doenças associadas à infeção pelo HCMV, que influenciam a sobrevivência global dos doentes submetidos a HSCT (Figura 17). Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 58 Futuramente, será necessário replicar este estudo numa população maior para validar os resultados obtidos. Poderia ser feita a quantificação dos níveis de expressão de mRNA do TNF-α por PCR em tempo real, de acordo com os polimorfismos descritos, uma vez que esta citocina é produzida por macrófagos, e está também implicada na reativação do HCMV. Adicionalmente, seria necessário quantificar os níveis de fosforilação do PI3K e do NF-κB por Western blot, para confirmar se ocorre uma híperativação destas vias de sinalização nos indivíduos portadores das variantes FCGR2A 131HH e FCGR3A 158VV. Figura 17 – Definição de um subgrupo com maior risco para a ocorrência de reativação do HCMV, com a finalidade de aumentar a sobrevivência dos doentes submetidos a HSCT. Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 59 CAPÍTULO 7 REFERÊNCIAS Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 60 Polimorfismos genéticos nos recetores FcγRIIA e FcγRIIIA, reativação do HCMV e sobrevivência global em doentes submetidos a HSCT 61 1. Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, Rosso S, Coebergh JW, Comber H, Forman D and Bray F (2013) Cancer incidence and mortality patterns in Europe: estimates for 40 countries in 2012. Eur J Cancer. 49(6): p. 1374-403. 2. N Howlader AN, M Krapcho, J Garshell, D Miller, SF Altekruse, CL Kosary, M Yu, J Ruhl, Z Tatalovich, A Mariotto, DR Lewis, HS Chen, EJ Feuer, KA Cronin (2014) SEER Cancer Statistics Review, 1975-2011, National Cancer Institute. . http://seer.cancer.gov/csr/1975_2011/. 3. Cooper G, The Cell: A Molecular Approach. Chapter 15. 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