Síntese Biomimética e Caracterização de Novos Derivados da Acridina

Síntese Biomimética e Caracterização de Novos Derivados da Acridina Margarida Linhares Mestrado em Química Departamento de Química e Bioquímica 2013 Orientador Ana Cristina Freire, Professora Associada, Faculdade de Ciências Coorientador Susana Luísa Henriques Rebelo, Investigadora do REQUIMTE, Faculdade de Ciências Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________ i Agradecimentos Ao Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, por me ter aceite no Mestrado em Química. À minha orientadora, Professora Doutora Ana Cristina Freire, pela confiança, preocupação, disponibilidade constante e conhecimento transmitido. À minha coorientadora, Doutora Susana Rebelo, pelo conhecimento, paciência, ajuda e preocupação. Ao Professor Doutor Alexandre Magalhães e ao Doutor Krzysztof Biernacki pela colaboração e ajuda nos estudos teóricos computacionais. À Doutora Andreia Peixoto e ao Doutor Carlos Granadeiro, pela disponibilidade e ajuda prestada sempre que solicitada. Aos meus colegas de laboratório, especialmente à Paula Costa, Mariana Rocha, Marta Nunes e Mariana Araújo pela boa disposição e por todos os conselhos. Aos meus amigos, especialmente à Sofia Duarte, Inês Gomes, Maria Cordeiro e Vânia Gomes, pela constante preocupação, ajuda e amizade. Ao João, por todo o apoio, carinho e paciência. Aos meus Pais, irmão e irmãs pela confiança, apoio e constante presença. iii Resumo O mecanismo de oxigenação realizado pelo grupo prostético do citocromo P450 inspirou o uso de metaloporfirinas como catalisadores em reações de oxidação. Com base no facto destas mono-oxigenases mediarem oxidações, mesmo de compostos xenobióticos inertes e apolares, as metaloporfirinas têm sido utilizadas como catalisadores biomiméticos na oxidação de vários compostos orgânicos. Entre estes, os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. O trabalho descrito nesta dissertação teve por base a oxidação da acridina recorrendo a um sistema de catálise biomimética oxidativa. O substrato foi oxidado à temperatura ambiente, utilizando peróxido de hidrogénio como oxidante “verde”, na presença da metaloporfirina cloro[meso-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirinato] manganês(III) ([Mn(TDCPP)Cl]) e do cocatalisador, acetato de amónio. Desta forma, foram obtidos novos compostos funcionalizados nas posições periféricas da acridina, nomeadamente monoepóxidos, diepóxidos, tetraepóxidos e um derivado hidroxilado, com diferentes rendimentos consoante a extensão da reação. Estes compostos foram caracterizados por estudos de espectroscopia de RMN e de espectrometria de massa. Os estudos incluíram também a realização de cálculos teóricos computacionais que permitiram a confirmação das estruturas dos novos derivados da acridina e uma melhor compreensão da reatividade da oxidação. A reação num único passo levou à formação de novas moléculas facilmente funcionalizáveis e poderá estar na origem do desenvolvimento de novas vias de síntese, para a obtenção de compostos importantes para aplicações biológicas e fotoquímicas. Palavras-chave Oxidação, metaloporfirina, catálise biomimética, acridina, peróxido de hidrogénio v Abstract The oxygenation mechanism performed by the prosthetic group of cytochrome P450 has inspired the use of metalloporphyrins as catalysts for oxidation reactions. Based on the fact that this mono-oxygenases mediate oxidations even of inert and apolar xenobiotic substrates, the metalloporphyrins have been used as biomimetic catalysts for the oxidation of innumerable organic substrates. Among these, the polycyclic aromatic hydrocarbons. The work described in this thesis is based on the oxidation of acridine by oxidative biomimetic catalysis. The substrate was oxidised at room temperature, using hydrogen peroxide as a green oxidant, in the presence of the metalloporphyrin chloro[mesotetrakis(2,6-dichlorophenyl)porphyrinate]manganese(III) chloride ([Mn(TDCPP)Cl]) and of the co-catalyst, ammonium acetate. Thus, new compounds functionalized on the peripheral positions of acridine, namely monoepoxides, diepoxides, tetraepoxides, and a hidroxylated derivative, were obtained with different yields depending on the extent of the reaction. These compounds were characterized by NMR spectroscopy and mass spectrometry studies. The studies also included computational theoretical calculations that allowed the confirmation of the structures of the new acridine derivatives and a greater understanding of the reactivity of the oxidation. The one-step reaction led to the formation of new easily functionalizable molecules and might be the source for the development of new synthesis routes, to obtain important compounds for biological and photochemical applications. Keywords Oxidation, metalloporphyrin, biomimetic catalysis, acridine, hydrogen peroxide xii Fig. 4.6 – Estrutura 3D de dois isómeros anti,anti da molécula 1:2,3:4,5:6,7:8tetraepoxiacridina, aa1 e aa2. ..................................................................................... 82 Fig. 4.7 – Estrutura 3D de dois isómeros sin,anti da molécula 1:2,3:4,5:6,7:8tetraepoxiacridina, sa1 e sa2. ..................................................................................... 83 Fig. 4.8 – Estrutura 3D de dois isómeros sin,sin da molécula 1:2,3:4,5:6,7:8tetraepoxiacridina, ss1 e ss2. ..................................................................................... 84 Fig. 4.9 – Estrutura 3D dos dois isómeros óticos do composto 8a. ............................. 86 Fig. 4.10 – Mecanismo da reação de hidroxilação catalisada pela metaloporfirina [Mn(TDCPP)Cl]. .......................................................................................................... 87 Fig. 4.11 – Mapa de potencial eletrostático sobre a superfície de isodensidade de 0,0004 e/ao3 da acridina (1). ........................................................................................ 87 Fig. 4.12 – Valores de carga potencial ESP calculados para a molécula da acridina (1). ................................................................................................................................... 88 Fig. 4.13 – Valores de carga potencial ESP calculados para a molécula da 1:2epoxiacridina (2). ........................................................................................................ 89 Fig. 4.14 – Valores de carga potencial ESP calculados para a molécula da 3:4epoxiacridina (2a). ...................................................................................................... 89 Fig. 4.15 – Mapa de potencial eletrostático sobre uma superfície de isodensidade de 0,0004 e/ao3 anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4). .............................................................. 90 Fig. 4.16 – Valores de carga potencial ESP calculados para a molécula da anti-1:2,3:4diepoxiacridina (4). ..................................................................................................... 90 Fig. 4.17 – Esquema da reação de abertura de epóxido na 1:2,3:4-diepoxiacridina pela 4-etilanilina. ................................................................................................................ 90 xiii Índice de Tabelas Tabela 3.1 – Condições utilizadas na oxidação da acridina (1). ................................. 34 Tabela 3.2 – Conversão do substrato e rendimento dos produtos obtidos nas condições I, II e III. ...................................................................................................... 36 Tabela 3.3 – Desvios químicos de RMN de 13C dos compostos anti-1:2,3:4diepoxiacridina (4) e sin-1:2,3:4-diepoxiacridina (5). ................................................... 59 Tabela 4.1 – Comparação entre os valores de δ de RMN de 1H experimentais e teóricos da acridina (1). .............................................................................................. 76 Tabela 4.2 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da 1:2epoxiacridina (2) com os valores teóricos da mesma molécula e da 3:4-epoxiacridina (2a). ............................................................................................................................ 78 Tabela 4.3 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da 4hidroxiacridina (3) com os valores teóricos da mesma molécula e da 1-hidroxiacridina (3a). ............................................................................................................................ 79 Tabela 4.4 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da anti1:2,3:4-diepoxiacridina (4) com os valores teóricos da mesma molécula e do isómero sin. .............................................................................................................................. 80 Tabela 4.5 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da sin1:2,3:4-diepoxiacridina (5) com os valores teóricos da mesma molécula e do isómero anti. ............................................................................................................................. 81 Tabela 4.6 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8a com os valores teóricos dos isómeros anti,anti, aa1 e aa2. ................................... 82 Tabela 4.7 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8b com os valores teóricos dos isómeros anti,anti, aa1 e aa2. ................................... 82 Tabela 4.8 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8a com os valores teóricos dos isómeros sin,anti, sa1 e sa2. ..................................... 83 Tabela 4.9 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8b com os valores teóricos dos isómeros sin,anti, sa1 e sa2. .................................... 84 Tabela 4.10 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8a com os valores teóricos dos isómeros sin,sin, ss1 e ss2....................... 85 xiv Tabela 4.11 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8b com os valores teóricos dos isómeros sin,sin, ss1 e ss2. ..................... 85 xv Abreviaturas AcOEt Acetato de etilo ADN Ácido desoxirribonucleico APT Experiência dos protões diretamente ligados ARN Ácido ribonucleico COSY Espectroscopia de correlação homonuclear d Dupleto dd Duplo dupleto ddd Duplo dupleto de dupletos dt Duplo tripleto DFT Teoria do funcional da densidade DMF N,N-Dimetilformamida EI Espectrometria de massa com ionização por impacto eletrónico EM Espectrometria de massa Eq. Equivalentes molares ESP Carga de potencial eletrostático H2TDCPP meso-Tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirina HMBC Espectroscopia de correlação heteronuclear de múltiplas ligações HSQC Espectroscopia de correlação heteronuclear de quantum-simples IUPAC União Internacional de Química Pura e Aplicada J Constante de acoplamento (em Hz) m Multipleto m/z Relação massa/carga M+• Ião molecular MetOH Metanol [Mn(TDCPP)Cl] Cloro[meso-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirinato]manganês(III) NOESY Espectroscopia de correlação do efeito Overhauser nuclear ppm Partes por milhão RMN Espectroscopia de ressonância magnética nuclear s Singuleto t Tripleto TLC Cromatografia de camada fina UV/Visível Espectrofotometria de ultravioleta-visível xvi λ Comprimento de onda (em nm) Capítulo I Introdução FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 3 Capítulo I - Introdução A sociedade, filha de uma industrialização galopante, é cada vez mais exigente, impondo eficiência e qualidade ao mais baixo custo. Por outro lado, devido ao efeito secundário nefasto dessa mesma industrialização, a sociedade exige agora que haja também uma consciência ecológica, a par desta produção industrial intensa. A Indústria Química, como uma das maiores a nível mundial, tem agora a necessidade de tornar os seus processos cada vez mais sustentáveis. O objetivo prende-se em obter produtos com pouco ou nenhum impacto na Natureza e, ao mesmo tempo, de forma rentável. A introdução da catálise nos processos químicos foi um passo essencial para a possibilidade de atingir este objetivo, uma vez que a utilização de catalisadores permite novas vias com menores energias de ativação levando a processos eficientes, seletivos e realizados em condições mais suaves, nomeadamente com menor gasto energético[1]. Atualmente, cerca de 85% a 90% dos processos químicos industriais requerem a utilização de um catalisador[2]. Apesar disto, a sociedade ainda está muito longe de ter uma indústria química completamente baseada em processos “verdes”, em que a produção seja tão rentável como seria sem a preocupação ambiental, facto que impulsiona o constante aumento da investigação na área da Química Sustentável. 1.1 Ecossustentabilidade de reações de oxidação A oxidação é uma das reações mais importantes em síntese orgânica, tendo um papel essencial em muitos processos industriais. No entanto, torna-se cada vez mais premente a diminuição do impacto ambiental dos processos químicos utilizados nestas transformações, nomeadamente, a substituição de oxidantes utilizados em condições estequiométricas, como os dicromatos ou permanganatos, que levam à produção de quantidades exponenciais de resíduos indesejáveis, corrosivos e tóxicos. Os oxidantes mais usados nos sistemas biológicos são o oxigénio molecular ou o peróxido de hidrogénio. Estes seriam também os oxidantes ideais para aplicação na indústria química devido à sua acessibilidade e baixo custo; por outro lado, a sua utilização não leva à produção de resíduos indesejáveis para o ambiente. No entanto, estes oxidantes requerem uma ativação de forma a possibilitar que os processos sejam eficientes e seletivos[3]. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 4 A grande necessidade de desenvolver processos catalíticos “verdes” capazes de acelerar este tipo de reações de uma forma seletiva e em condições ambientalmente compatíveis levou a considerar os sistemas biológicos como fonte de inspiração e, consequentemente, à biomimetização de processos metabólicos[4]. 1.2 Catálise biomimética oxidativa In vivo, as reações de oxidação ocorrem essencialmente pela ação catalítica de metaloenzimas, que promovem a ativação de oxidantes considerados verdes, como o oxigénio molecular e o peróxido de hidrogénio. Estas reações ocorrem em condições suaves e eco compatíveis e os processos podem ser muito seletivos e, por vezes, inéditos para a atual indústria química. Desta forma, os centros prostéticos destas enzimas têm sido usados como modelo para a síntese de complexos metálicos com propriedades catalíticas semelhantes[5, 6]. Entre as enzimas envolvidas na ativação do oxigénio ou do peróxido de hidrogénio, encontram-se as hemoproteínas, nomeadamente o citocromo P450, a peroxidase ou a catalase[7]. O grupo heme b é uma metaloporfirina, a protoporfirina IX complexada com ferro(II) (figura 1.1). No caso das enzimas referidas, o grupo prostético é um grupo análogo ao heme b em que o ferro se encontra no estado de oxidação (+3) e as diferenças no modo de ação entre as três classes de enzimas são atribuídas aos resíduos de aminoácido que coordenam axialmente o ião metálico ou que se encontram na proximidade do centro ativo[7]. Consequentemente, as metaloporfirinas foram introduzidas na catálise oxidativa, e alguns derivados específicos têm mostrado ser excelentes modelos do citocromo P450 na oxidação seletiva de vários compostos orgânicos, tais como terpenos, esteróides, alcenos, alcanos e hidrocarbonetos aromáticos[8-17]. Nos estudos foi também evidenciado o papel relevante dos grupos substituintes do núcleo porfirínico, assim como do centro metálico e das condições da reação para a obtenção de processos eficientes[18]. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 5 Fig. 1.1 – Estrutura da metaloporfirina heme b[19]. 1.3 Citocromo P450 O citocromo P450 é uma superfamília de metaloenzimas com um papel essencial no metabolismo dos seres vivos, atuando em várias funções biológicas[20]. Destas, destacam-se as oxidações de compostos xenobióticos pela ativação do oxigénio molecular, para a obtenção de produtos hidrofílicos e de mais fácil excreção[21]. No ser humano, o citocromo P450 está presente em quase todos os órgãos, essencialmente nos rins, no fígado, no intestino e nos pulmões[20]. A designação “citocromo” refere-se a “pigmento celular” enquanto o número 450 refere-se à banda intensa no espectro de Visível, de máxima absorção a 450 nm, observável quando a enzima se encontra na sua forma reduzida complexada com monóxido de carbono, que corresponde à banda Soret do grupo [(heme)-Fe(II)-CO][22]. A reação de oxigenação catalisada por esta hemoproteína está representada na equação 1.1. Neste processo, o NADH ou NADPH fornecem os equivalentes redutores necessários, sendo regenerados in vivo num processo distinto. Enquanto esta reação ocorre de forma régio e estereoseletiva sob condições fisiológicas de pressão e temperatura, a mesma reação não catalisada apenas ocorreria a elevadas temperaturas, sendo que não beneficiaria da mesma seletividade[20, 23, 24]. Equação 1.1 – Mono-oxigenação de substratos orgânicos pelo oxigénio molecular promovida pelo citocromo P450. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 12 Vários estudos provaram que a utilização de acetato de amónio como cocatalisador e agente tamponizante é imprescindível, uma vez que a ausência do mesmo provoca a inativação do complexo catalisador[49]. Este controla a catálise ácida e básica que contribui para a clivagem heterolítica na formação da espécie ativante, o oxo-complexo de manganês(V). A metaloporfirina cloro[meso-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirinato]manganês(III) [Mn(TDCPP)Cl] (figura 1.7) tem mostrado bons resultados na epoxidação de compostos aromáticos, mesmo em relação a outras metaloporfirinas de manganês, em que o ciclo porfirínico apresenta diferentes substituições nas posições meso e βpirrólicas[50]. Fig. 1.7 – Estrutura da metaloporfirina [Mn(TDCPP)Cl]. Desta forma, a [Mn(TDCPP)Cl] foi a metaloporfirina utilizada nas reações de oxidação concretizadas neste trabalho, juntamente com o cocatalisador acetato de amónio e o agente oxidante peróxido de hidrogénio. 1.5 Acridina A acridina é um composto aromático policíclico constituído por três anéis condensados e por um heteroátomo de azoto (figura 1.8). A cor amarela deste composto é devida ao sistema aromático deslocalizado nos três anéis. A sua descoberta foi reportada em 1870 por Graebe e Cairo, que identificaram o composto numa fração de antraceno (o seu análogo homocíclico). O seu nome vem do latim acris, que significa forte ou pungente, devido ao seu cheiro acre e à irritação que provoca na pele e em membranas mucosas[51]. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 13 Fig. 1.8 – Estrutura da acridina. Apesar das variações no sistema de numeração sugeridas por diferentes autores em diferentes épocas (figura 1.9 – a, b e c), o sistema atualmente aceite para esta molécula e adotado neste trabalho está representado na figura 1.9 – d. Esta numeração foi sugerida por Graebe, que se baseou em sistemas semelhantes usados para o antraceno[51]. Este sistema é também o sistema IUPAC. Fig. 1.9 – Representação de diferentes sistemas de numeração da acridina. A acridina, como análogo heterocíclico de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, possui uma elevada atividade carcinogénica, uma vez que no organismo se formam metabolitos epoxidados ou ionizados, produtos secundários obtidos na oxidação pelas enzimas metabolizadoras. Estes compostos reagem facilmente com a cadeia de ADN, com o ARN ou com proteínas, podendo resultar na formação de tumores[52]. 1.5.1 Aplicações da acridina Ao longo dos anos, foram desenvolvidos inúmeros derivados da acridina, apresentando várias aplicações em estudos de atividade biológica, em conceção de fármacos, na indústria de corantes ou na fotoquímica, nomeadamente como sensores fluorescentes[53-55]. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 14 1.5.1.1 Aplicações biológicas Inicialmente pensava-se que a acridina apenas teria atividade carcinogénica. No entanto, em meados dos anos 60, este composto chamou a atenção devido à atividade dos seus derivados na prevenção do crescimento de células tumorais, mostrando ser possível a utilização destas moléculas em terapias anticancerígenas. Isto estimulou a síntese de novos compostos derivados da acridina, em busca de fármacos anticancerígenos[56-60]. Os derivados da acridina apresentam uma estrutura base planar e ligam-se fortemente, mas reversivelmente, ao ADN[61]. O modo de ligação envolve a intercalação da molécula entre pares de bases azotadas (figura 1.10), que vai interferir com a função do ADN, ao bloquear a síntese contínua de ARN e ADN, impedindo a síntese de proteínas. Essencialmente, estas ligações baseiam-se em forças de van der Waals, suplementadas por ligações iónicas devido aos iões fosfato do ADN[62]. Fig. 1.10 – Esquema da intercalação de moléculas derivadas da acridina no ADN[63]. O entendimento do modo de ação destes derivados e a existência de diferentes alvos biológicos incentivaram a crescente investigação na síntese de novos derivados acridínicos. Na figura 1.11 estão representados alguns derivados da acridina com alvos biológicos distintos[64]. Par de bases azotadas Dupla hélice do ADN FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 15 Fig. 1.11 – Derivados da acridina: a) com atividade anticancerígena; b) com propriedades de ligação ao ADN; c) com propriedades inibidoras da topoisomerase[64]. Para além da atividade anticancerígena, vários derivados da acridina apresentam também características antibacterianas[65], como a proflavina ou a acriflavina[66] (figura 1.12 d), e também antimaláricas, como a quinacrina[67] (figura 1.12 e). Fig. 1.12 – Estrutura da acriflavina (d) e da quinacrina (e)[66, 67]. <<<< a) b) c) d) e) FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 16 1.5.1.2 Aplicações fotoquímicas Os derivados da acridina são extensivamente utilizados em sondas luminescentes, essencialmente quimiluminescentes e fluorescentes[68-72]. A quimiluminescência resume-se a uma reação química que emite luz. Para este feito, é necessário que a energia libertada pela reação provoque a transição de um eletrão do seu estado fundamental para um estado excitado, ocorrendo essencialmente quando há electrões π envolvidos[73]. Os derivados da acridina têm mostrado ser bons sensores quimiluminescentes, evidenciando excelente seletividade essencialmente na quantificação de ácidos nucleicos[74]. Por outro lado, as sondas fluorescentes baseiam-se na variação da intensidade e/ou comprimento de onda da radiação luminescente emitida pela molécula usada como sonda. Esta característica é empregada na quantificação analítica de vários tipos de elementos e moléculas químicas, como iões ou moléculas orgânicas. O objetivo é encontrar sensores químicos que mostrem boa seletividade, sensibilidade e curto tempo de atuação[75]. Os derivados da acridina têm vindo a mostrar ser bons sensores na quantificação de várias espécies químicas, como iões de magnésio ou cobre, ou molécula orgânicas como a cafeína[75-77]. 1.5.2 Síntese de derivados da acridina Apesar do elevado número de derivados da acridina existentes, poucos destes são obtidos pela substituição direta na molécula de acridina, já que apenas a posição 9 da molécula mostra uma reatividade adequada para a sua fácil funcionalização[51]. Essencialmente, estes derivados são obtidos a partir de reações de adição e ciclização de compostos de menor massa molecular. Estas reações apresentam vários aspectos negativos como a necessidade de vários passos de reação ou a utilização de elevadas temperaturas. Alguns exemplos estão representados na figura 1.13, em que se observa a variedade de compostos de partida como aminas aromáticas, fenóis, aldeídos ou benzenos halogenados[51]. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 17 Fig. 1.13 – Exemplos de sínteses de derivados da acridina[51]. Compreendendo a necessidade de desenvolvimento de novas vias de síntese, mais económicas e mais ecológicas, para obtenção de compostos derivados da acridina (novos ou já existentes) aplicou-se o sistema de catálise biomimética oxidativa baseado na [Mn(TDCPP)Cl], descrito na secção 1.4.2, na oxidação da acridina obtendo-se novos compostos que podem ter aplicação direta ou ser posteriormente funcionalizados. Desta forma, foram sintetizados essencialmente epóxidos ou derivados hidroxilados nas posições periféricas, que podem sofrer reações de abertura de anel de epóxido com vários nucleófilos ou podem ainda ser oxidados ou rearranjados[78, 79]. Estes estudos poderão incentivar a utilização da acridina como substrato na obtenção de novos compostos acridínicos com substituintes nas suas posições periféricas. Estes compostos poderão ainda ser aplicados no estudo do mecanismo de interação dos metabolitos derivados de compostos aromáticos policíclicos com a cadeia de ADN. Capítulo II Execução Experimental FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 21 Capítulo II – Execução Experimental Neste capítulo são apresentados os procedimentos seguidos na síntese da metaloporfirina e na oxidação da acridina. Também se encontram aqui descritos os reagentes e solventes utilizados, a instrumentação usada na caracterização dos produtos e o software utilizado para realização dos cálculos teóricos. 2.1 Reagentes e solventes Todos os reagentes e solventes utilizados durante a execução experimental deste trabalho foram utilizados sem purificação adicional. Na síntese da porfirina utilizou-se pirrol 98% adquirido à Aldrich e 2,6diclorobenzaldeído ≥98% adquirido à Fluka. Os solventes utilizados foram ácido acético glacial p.a., nitrobenzeno para síntese e éter de petróleo p.a., adquiridos à Merck e ainda metanol p.a. adquirido à Panreac e diclorometano p.a. adquirido à Sigma-Aldrich. Na reação de complexação da porfirina, usou-se o cloreto de manganês(II) tetra-hidratado p.a. e a piridina p.a., ambos adquiridos à Merck. O solvente utilizado foi N,N-dimetilformamida (DMF) p.a., adquirido à Merck, e clorofórmio p.a. adquirido à Carlo Erba. Usou-se a acridina 97% e peróxido de hidrogénio (solução aquosa) 30% m/m, adquiridos à Sigma-Aldrich. Foi também utilizado peróxido de hidrogénio na forma de aducto de ureia 98%, da Aldrich. O acetato de amónio, p.a. foi adquirido à Merck e o solvente utilizado foi o acetonitrilo p.a., adquirido à Fisher Scientific. Na reação de abertura do epóxido, foi utilizada a 4-etilanilina 98%, da Aldrich e o acetonitrilo descrito anteriormente como solvente. No controle das reações por cromatografia de camada fina (TLC) foram usadas folhas plásticas revestidas por sílica gel 60 F254 da Merck. Para a separação dos produtos por TLC preparativa foram utilizadas placas de vidro revestidas por uma camada de sílica gel 60 GF254 da Merck. Como eluentes foram usados o clorofórmio e metanol, já referidos, e ainda acetato de etilo p.a. adquirido à Merck. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 28 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7) RMN de 1H δ (ppm): 4,10 (1H, dt, 3J= 4,0 Hz, 3J= 2,4 Hz, 4J= 2,4 Hz, H-3); 4,47 (1H, d, 3J= 4,0 Hz, H-4); 4,75 (2H, m, H-1, H-2); 7,57 (1H, ddd, 3J= 8,0 Hz, 3J= 6,8 Hz, 4J= 1,2 Hz, H-7); 7,76 (1H, ddd, 3J= 8,4 Hz, 3J= 6,8 Hz, 4J= 1,6 Hz, H-6); 7,79 (1H, d, 3J= 8,0 Hz, H-8); 8,10 (1H, d, 3J= 8,4 Hz, H-5); 8,14 (1H, s, H-9) RMN de 13C δ (ppm): 55,1 (C-4); 57,7 (C-3); 67,0 (C2); 72,6 (C-1); 127,6 (C-7); 128,0 (C-8); 128,4 (C-8a); 128,5 (C-9a); 128,9 (C-5); 130,6 (C-6); 139,6 (C-9); 147,7 (C-10a); 152,5 (C-5a). EM (EI) m/z (abundância relativa %): 229 (M+•, 5); 212 (25); 200 (66); 182 (33); 156 (26). anti,anti-1:2,3:4,5:6,7:8-tetraepoxiacridina (8a) RMN de 1H δ (ppm): 3,71 (2H, dd, 3J= 4,0 Hz, 4J= 0,4 Hz, H-1, H-8); 3,89 (2H, d, 3J= 4,0 Hz, H-4, H-5); 4,04 (2H, m, H-2, H-7); 4,07 (2H, m, H-3, H-6); 7,76 (1H, s, H-9). EM (EI) m/z (abundância relativa %): 243 (M+•, 19); 214 (48); 186 (28); 158 (17); 130 (12). anti,anti-1:2,3:4,5:6,7:8-tetraepoxiacridina (8b) RMN de 1H δ (ppm): 3,72 (2H, dd, 3J= 3,6 Hz, 4J= 0,4 Hz, H-1, H-8); 3,90 (2H, d, 3J= 4,0 Hz, H-4, H-5); 4,04 (2H, m, H-2, H-7); 4,07 (2H, m, H-3, H-6); 7,75 (1H, s, H-9). EM (EI) m/z (abundância relativa %): 243 (M+•, 19); 214 (48); 186 (28); 158 (17); 130 (12). FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 29 2.4.4 Reação da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina com a 4-etilanilina em micro-ondas Uma mistura de anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) (0,15 mmol) e 4-etilanilina (0,15 mmol) em acetonitrilo (6 mL) foi colocada num vaso de 10mL, que posteriormente foi selado e colocado na cavidade de um reator de micro-ondas. A reação foi irradiada a 80 ºC, durante 10 minutos (1 minuto de rampa de aquecimento até à temperatura desejada) usando 150 W de potência máxima. Após a reação, o solvente foi evaporado e a mistura reacional foi dissolvida em clorofórmio deuterado para caracterização por RMN. 1-(4’-etilfenilamino)-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (9) RMN de 1H δ (ppm): 1,18 (3H, t, 3J= 7,6 Hz, -CH3); 2,54 (2H, q, 3J= 7,6 Hz, -CH2-); 3,31 (1H, s largo, NH); 4,00 (1H, m, H-3); 4,33 (1H, d, 3J= 4,0 Hz, H-4); 4,72 (1H, m, H-2); 4,81 (1H, m, H-1); 6,64 (2H, m, H-3’, H5’); 7,00 (2H, m, H-2’, H-6’); 7,41 (1H, ddd, 3J= 8,0 Hz, 3J= 6,8 Hz, 4J= 1,2 Hz, H-7); 7,50 (1H, d, 3J= 8,0 Hz, H-8); 7,63 (1H, ddd, 3J= 8,4 Hz, 3J= 6,8 Hz, 4J= 1,6 Hz, H-6); 7,82 (1H, s, H-9); 7,95 (1H, d, 3J= 8,4 Hz, H-5). RMN de 13C δ (ppm): 16,0 (-CH3); 28,0 (-CH2-); 54,4 (C-4); 57,8 (C-1); 58,1 (C-3); 66,1 (C-2); 114,6 (C-2’, C-6’); 127,0 (C-7); 127,9 (C-9a); 127,9 (C-8); 128,2 (C8a); 128,4 (C-5); 128,9 (C-3’, C-5’); 129,9 (C-6); 134,5 (C-4’); 138,4 (C-9); 144,0 (C-1’); 147,1 (C-10a); 152,7 (C-4a). Capítulo III Novos Derivados da Acridina FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 33 Capítulo III – Novos Derivados da Acridina Neste trabalho, a acridina foi oxidada em condições biomiméticas para a obtenção de novos derivados, que poderão ser precursores de compostos com potenciais características biológicas ou fotoquímicas. Nas diversas reações realizadas à temperatura ambiente, o peróxido de hidrogénio foi utilizado como oxidante “verde”, o acetonitrilo como solvente, a metaloporfirina cloro[meso-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirinato]manganês(III) [Mn(TDCPP)Cl] como catalisador e o acetato de amónio como cocatalisador. Nestas condições foram obtidos diversos produtos como ilustrado na figura 3.1. Fig. 3.1 – Reação de oxidação da acridina (1) e produtos obtidos. A oxidação da acridina (1) foi realizada em três condições reacionais diferentes e os produtos foram isolados após separação por cromatografia em camada fina. Neste capítulo descrevem-se os resultados obtidos, assim como todo o processo de identificação e caracterização das novas moléculas isoladas. É ainda descrita a reação de um diepóxido de acridina com 4-etilanilina como reação modelo para posteriores funcionalizações. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 34 3.1 Oxidação da acridina (1) As oxidações da acridina (1) realizaram-se da forma descrita na parte experimental, utilizando as condições I, II e III, apresentadas na tabela 3.1, em que se variou o tempo de reação, a quantidade de oxidante utilizado e a razão substrato/catalisador. Dependendo destas condições obtiveram-se diferentes rendimentos para os produtos isolados. Para os tempos de reação mais longos obtiveram-se novos produtos resultantes da reatividade dos produtos formados inicialmente. Tabela 3.1 – Condições utilizadas na oxidação da acridina (1). Condições de reação I II III Tempo (horas) 1 3 15,5 H2O2 adicionado (eq.)* 2 6 31 Razão substrato/catalisador 300 300 100 *Equivalentes molares relativamente ao substrato Para isolar estes produtos foi necessário recorrer a várias separações sucessivas, em que se alterou o eluente para um melhor isolamento dos compostos. Estas separações, para as reações realizadas nas condições I (1h00) e II (3h00) estão esquematizadas nas figuras 3.2 e 3.3, respetivamente. Nestes esquemas estão indicados os eluentes utilizados bem como os produtos isolados. Na figura 3.2 está representada a separação da mistura reaccional obtida pela oxidação da acridina (1) durante a condição I. Foi possível isolar os seguintes compostos: 1:2-epoxiacridina (2), 4-hidroxiacridina (3), anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) e sin-1:2,3:4-diepoxiacridina (5). Fig. 3.2 – Apresentação da separação cromatográfica da mistura reacional da oxidação da acridina (1) na condição I. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 35 A separação da mistura final obtida pela reação na condição II está representada na figura 3.3. Após a primeira separação, as frações (A) e (B) foram novamente separadas, utilizando um eluente com menor concentração em metanol (1% em clorofórmio). No final foi possível isolar os seguintes compostos: anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4), sin-1:2,3:4-diepoxiacridina (5), 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6) e a 1-amónio3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7). Fig. 3.3 – Apresentação das separações cromatográficas da mistura reacional da oxidação da acridina (1) na condição II. A oxidação da acridina utilizando a condição III levou à formação de 6 produtos. Após uma primeira separação, com o eluente CHCl3/MetOH 5%, foram recolhidas três frações (C-E) que foram posteriormente separadas, sendo isolados os compostos 6 e 7. À semelhança do que se encontra representado na figura 3.3 usou-se o eluente CHCl3/MetOH 1%, para separar as frações (C) e (D) e obter os compostos isolados 1, 4 e 5. A fração (E) foi fracionada usando como eluente CHCl3/AcOEt 25%, tendo-se isolado os compostos 8a e 8b. Na tabela 3.2 estão indicadas as conversões do substrato e os rendimentos isolados dos produtos obtidos nas três condições de reação utilizadas. A percentagem de conversão foi de 71% ao fim de 1h de reação (condição I) e aumentou para 94% ao fim de 3h de reação (condição II). Ao fim de 15,5 h (condição III) observou-se 100% de conversão. A lenta progressão do consumo do substrato nas últimas horas de reação, observada através do controlo das reações por TLC, pode ser explicada pela formação de novos produtos a partir dos compostos iniciais. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 36 Tabela 3.2 – Conversão do substrato e rendimento dos produtos obtidos nas condições I, II e III. Condições de reação I II III Conversãoa 71% 94 % 100 % Rendimento dos produtosb (2) 8 % -- -- (3) 5 % -- -- (4) 20 % 25 % 26 % (5) 5 % 6 % 6 % (6) -- 2 % 4 % (7) -- 3 % 6 % (8a) -- -- 8% (8b) 3% aA percentagem de conversão é baseada no substrato consumido; bRendimentos isolados. Na condição I obtiveram-se dois produtos mono-oxigenados que não foram isolados nas reações realizadas para maiores tempos de reação: a 1:2-epoxiacridina (2) com um rendimento isolado de 8% e a 4-hidroxiacridina (3), com um rendimento de 5%. A espécie ativa no ciclo catalítico da [Mn(TDCPP)Cl] é consensualmente considerada a espécie oxo [Mn(V)=O][49] que promove a epoxidação da acridina através de um ataque eletrófilo. Deste modo, a formação do composto 2 é acompanhada pela perda de aromaticidade da molécula, originando também uma ligação de carácter duplo. Esta ligação poderá mais facilmente sofrer um novo ataque eletrófilo da espécie ativa [Mn(V)=O], formando-se um segundo anel de epóxido na molécula. Pode-se portanto explicar que o mono-epóxido não seja encontrado entre os produtos das reações com tempos de reação superiores, onde a quantidade de substrato na mistura reacional é sucessivamente menor. No caso da 4-hidroxiacridina (3), esta molécula poderá resultar de um rearranjo do mono-epóxido na posição 3:4 dando origem a uma molécula aromática com um grupo hidroxilo na posição 4 ou de uma hidroxilação direta do anel aromático pela espécie ativa. Este tema foi também tratado no capítulo IV. Os outros dois compostos obtidos na condição I foram os diepóxidos de acridina, sendo o mais abundante o isómero anti (composto 4), que foi obtido com rendimento de 20%, enquanto o isómero sin (composto 5), foi obtido com rendimento de 5%. FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 37 Usando a condição II foi possível obter maiores rendimentos para os compostos 4 e 5 relativamente aos obtidos na reação realizada na condição I, nomeadamente estes foram obtidos com rendimentos de 25% e 6%, respetivamente. O baixo rendimento obtido para o isómero sin em relação ao seu isómero anti pode justificar-se pelo impedimento estereoquímico que existe na introdução do segundo anel de epóxido, sendo preferível a aproximação à espécie ativa do catalisador pela face oposta à do primeiro epóxido. Na condição II foram ainda isoladas pequenas quantidades de produtos resultantes da abertura do anel de epóxido, nomeadamente os compostos 6 e 7. Ambos os produtos resultam do ataque nucleófilo na posição 1, formando-se um anel com três funcionalidades: o epóxido, um grupo hidroxilo e um novo grupo funcional. O composto 6 foi obtido com rendimento de 2% e resulta da abertura do anel de epóxido pelo ião acetato, proveniente do cocatalisador usado, e o composto 7 foi obtido com um rendimento de 3%, resultante da abertura do anel pelo amoníaco, também proveniente do cocatalisador. Quando a reação foi realizada na condição III (15,5 h), não se observou um aumento significativo no rendimento dos diepóxidos 4 e 5, no entanto, observou-se um pequeno aumento no rendimento dos produtos resultantes da abertura do anel e foram obtidos os tetraepóxidos 8a e 8b, com rendimentos de 8% e 3%, respetivamente. O composto anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) foi o composto obtido com maior rendimento em todas as reações. 3.1.1 Ataque nucleófilo na diepoxiacridina A reação do anti-diepóxido (4) com 4-etilanilina (figura 3.4) foi realizada como reação modelo para a abertura dos epóxidos isolados e obtenção de novos derivados funcionais. A reação foi realizada em micro-ondas, usando acetonitrilo como solvente e aquecimento a 80ºC durante 10 min. O composto 4 foi completamente e seletivamente convertido no composto 9, sendo este o único produto observado nesta reação. Fig. 3.4 – Esquema da reação de abertura do epóxido da diepoxiacridina (4). FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 44 O estudo do espectro de HMBC da 1:2-epoxiacridina (2) apresentado nas figuras 3.11 e 3.12 permitiu: Confirmar que o epóxido se encontra na posição 1:2, já que existe uma correlação 3JCH entre o protão H-9 e o carbono C-1, identificada na figura 3.11; A atribuição de todos os sinais correspondentes aos carbonos quaternários (figura 3.12): O carbono C-9a a δ 125,9 ppm, que correlaciona com o protão H-4; O carbono C-8a a δ 127,2 ppm, que correlaciona com o protão H-5; O carbono C-10a a δ 148,3 ppm, que correlaciona com os protões H-9, H-8 e H-6; E o carbono C-4a a δ 151,3 ppm, que correlaciona com os protões H-9, H-1 e H-3. A partir destas atribuições foi também possível atribuir inequivocamente os carbonos do anel aromático, partindo do acoplamento do H-8 com C-9 complementado pelas respetivas conectividades no espectro de COSY. O espectro de massa da 1:2-epoxiacridina (2) obtido com ionização por impacto eletrónico (Figura 3.13) confirma a estrutura obtida com os estudos anteriores. Neste espectro está identificado o pico do ião molecular (M+•) com m/z = 195, assim como os picos correspondentes às perdas sucessivas dos fragmentos CO e C2H3. Fig. 3.13 – Espectro de massa da 1:2-epoxiacridina (2). M+• M+•-CO M+•-C3H3O FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 45 3.2.2 Caracterização da 4-hidroxiacridina (3) O espectro de RMN de 1H da 4-hidroxiacridina (3) (figura 3.14) mostra 8 sinais na zona aromática do espectro, e consequentemente, neste caso, a funcionalização não levou a uma perda de aromaticidade mas a uma perda de simetria relativamente ao substrato. O espectro está de acordo com a introdução de um grupo hidroxilo, no entanto o protão correspondente não é visível devido à sua labilidade. A partir deste espectro foi possível tirar as seguintes conclusões: O singuleto a δ 8,77 ppm corresponde ao protão H-9; Os sinais dos protões H-5, H-6, H-7 e H-8 têm uma forma semelhante aos sinais dos protões equivalentes no espectro de RMN de 1H da acridina e da 1:2epoxiacridina (2), mas são observados a desvios químicos semelhantes aos da acridina (1); Os três sinais restantes são atribuídos aos protões do anel funcionalizado, observados a menores frequências de acordo com o efeito dador de eletrões do grupo hidroxilo. São observados três duplos dupletos a δ 7,53 ppm, δ 7,46 ppm e δ 7,20 ppm, sendo que o protão a δ 7.46 acopla com 2 protões adjacentes, enquanto os outros dois protões acoplam com um protão adjacente e um protão ao longo de quatro ligações. Fig. 3.14 – Espectro de RMN de 1H da 4-hidroxiacridina (3). H-9 H-6 H-8 H-5 H-7 H-3 H-1 H-2 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 46 Fig. 3.15 – Espectro de NOESY da 4-hidroxiacridina (3). Fig. 3.16 – Espectro de COSY da 4-hidroxiacridina (3). O espectro bidimensional NOESY, apresentado na figura 3.16, mostra uma correlação espacial entre o sinal correspondente ao protão H-9, a δ 8.77 ppm, e os sinais a 8,03 e a 7,56 ppm que consequentemente podem ser atribuídos aos protões H-8 e H-1, respetivamente. No espectro bidimensional COSY (figura 3.16) foi possível observar as seguintes correlações 1H-1H que permitiram a atribuição dos outros protões na molécula: H-6 H-6 H-8 H-5 H-7 H-1 H-2 H-2 H-3 H-9 H-8 H-1 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 47 O H-1, a δ 7,53 ppm, correlaciona com o H-2, a δ 7,46 ppm, que por sua vez correlaciona com o H-3, a δ 7,20 ppm; O H-8, a δ 8,03 ppm correlaciona com o H-7 (a δ 7,56 ppm) e este correlaciona também com H-6, a δ 7,79 ppm. O H-6, por sua vez, correlaciona também com o H-5 (a δ 8,22 ppm). Estes resultados confirmam a presença do grupo hidroxilo na posição 4. O espectro de RMN de 13C da 4-hidroxiacridina (3) encontra-se na figura 3.17, assim como a experiência APT. A partir do estudo destes dois espectros foi possível observar: Treze sinais de carbonos diferentes na zona aromática, correspondentes a todos os carbonos da molécula; A presença de 5 carbonos quaternários (distinguidos pela experiência APT. O sinal observado a maior frequência, a δ 151,9 ppm, é atribuído ao carbono C-4, adjacente ao grupo hidroxilo; Oito sinais de carbonos correspondentes aos oito –CH aromáticos da 4hidroxiacridina (3) foram também atribuídos por análise dos espectros de HSQC e HMBC. Fig. 3.17 – Espectro de RMN de 13C da 4-hidroxiacridina (3), juntamente com a experiência APT. C-3 C-1 APT 13C C-7 C-2 C-8 C-5 C-6 C-9 C-9a C-8a C-4a C-10a C-4 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 48 Recorrendo ao espectro bidimensional HSQC, apresentado na figura 3.18, foi possível obter a correlação de acoplamento heteronuclear através de uma ligação 1H13C (1JCH). Fig. 3.18 – Espectro de HSQC da 4-hidroxiacridina (3). O estudo do espectro bidimensional de correlação heteronuclear a múltiplas ligações HMBC apresentado na figura 3.19 permitiu: A confirmação de que o grupo hidroxilo se encontra na posição 4, uma vez que há uma correlação 3JCH entre o protão H-2 e o carbono C-4; A identificação de todos os sinais correspondentes aos carbonos quaternários: O carbono C-9a a δ 126,8 ppm, que correlaciona com o protão H-2; O carbono C-8a a δ 127,5 ppm, que correlaciona com o protão H-5; O carbono C-4a a δ 140,4 ppm, que correlaciona com o protão H-9 e com o protão H-3; E o carbono C-10a a δ 147,1 ppm, que correlaciona com o protão H-9 e H-8. 3 2 8 6 7 5 9 1 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 49 Fig. 3.19 – Espectro de HMBC da 4-hidroxiacridina (3). O espectro de massa da 4-hidroxiacridina (3) é muito semelhante ao da 1:2epoxiacridina (2), como se pode ver na figura 3.20. Estes dois compostos puderam ser distinguidos pelos estudos de RMN. Neste espectro está identificado o pico do ião molecular (M+•) com m/z = 195 e dos dois principais fragmentos a m/z = 167 e a m/z = 139/140. Fig. 3.20 – Espectro de massa da 4-hidroxiacridina (3). M+• M+•-CO M+•-C3H3O C-9a H-2 H-5 H-8 C-8a C-10a C-4a H-9 H-3 C-4 C-1 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 50 3.2.3 Caracterização da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) O espectro de RMN de 1H da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) (figura 3.21) apresenta semelhanças com o espectro do mono-epóxido 2, mas os sinais correspondentes aos protões olefínicos deste último são agora observados na região das ligações C-O. Este espectro está de acordo com a introdução de um segundo anel de epóxido na ligação dupla do composto 2. Os desvios químicos observados para os sinais dos 9 protões da molécula, são coerentes com a menor aromaticidade deste composto relativamente aos compostos descritos anteriormente. Nomeadamente, a partir deste espectro foi possível observar: O singuleto correspondente a H-9 é agora observado a δ 8,20 ppm com um Δδ de 0,57 ppm relativamente à acridina (1) e um Δδ de 0,16 ppm relativamente ao monoepóxido 2; Os sinais dos outros quatro protões na zona aromática, H-5-8, apresentam um padrão de multiplicidade semelhante aos dos compostos anteriores, mas a menores frequências; Na zona alifática do espectro observam-se os restantes quatro sinais correspondentes aos protões H-1-4, adjacentes aos dois anéis de epóxido; Os dois sinais a menores frequências são dupletos com posteriores desdobramentos de pequena intensidade devido a acoplamentos a quatro ligações, estes sinais podem ser facilmente atribuídos aos protões H-1 e H-4; Entre 4,11 e 4,16 ppm encontram-se dois multipletos atribuídos aos protões H2 e H-3 de acordo com a maior complexidade dos acoplamentos esperados para estes protões. H-9 H-5 H-8 H-6 H-7 H-4 H-3 H-1 H-2 Fig. 3.21 – Espectro de RMN de 1H da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4). FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 51 Fig. 3.22 – Espectro de COSY da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4). As atribuições feitas puderam ser confirmadas através do espectro de COSY (figura 3.22) onde se observam as seguintes correlações 1H-1H: O multipleto a δ 4,11-4,13 ppm correlaciona com o duplo dupleto a δ 3,95 ppm e com o multipleto a δ 4,15-4,17 ppm, que por sua vez correlaciona com o dupleto a δ 4,10 ppm; O sinal a δ 7,76 ppm correlaciona com o sinal a δ 8,10 ppm e o sinal a δ 7,59 ppm, que por sua vez correlaciona com o sinal a δ 7,82 ppm. Atendendo aos assinalamentos obtidos para os compostos anteriores seria esperável que os sinais mais afastados do átomo de azoto fossem observados a menores frequências devido ao efeito indutor desprotetor deste heteroátomo. Deste modo, e de acordo com o indicado na figura 3.21, seria esperável que H-5 fosse o sinal observado a δ 8,10 ppm e H-1 o sinal a δ 3,95 ppm. No espectro de NOESY a correlação entre o protão H-9 e o protão H-1 (a δ 3,95 ppm) podia ser considerada devido à observação de um pequeno sinal, mas não de forma segura, consequentemente, estas atribuições foram apenas inequivocamente confirmadas com os espectros de HSQC e HMBC, como se encontra descrito a seguir. H-5 H-3 H-4 H-2 H-8 H-1 H-2 H-6 H-3 H-7 H-6 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 52 Permanecia ainda a dúvida sobre a estereoquímica do composto, nomeadamente se a adição dos dois anéis de epóxido ocorrera em faces opostas ou na mesma face, levando respetivamente a configurações anti ou sin. A identificação de uma configuração anti no composto 4 foi baseada na comparação dos desvios químicos no espectro de RMN de 1H com o outro diepóxido obtido, o composto 5 (secção 3.2.4), e com os dados descritos para compostos análogos na literatura[13,16], em que os desvios químicos dos protões H-1 e H-4 do isómero sin são observados a maiores frequências do que os do isómero anti. Por outro lado, os rendimentos relativos dos dois compostos também estão de acordo com o maior rendimento esperado para o isómero anti relativamente ao isómero sin, devido ao menor impedimento estereoquímico da introdução do segundo epóxido pela face oposta ao primeiro. Esta atribuição foi confirmada por cálculos teóricos de RMN de 1H descritos no capítulo IV. O espectro de RMN de 13C da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) encontra-se na figura 3.23, assim como a experiência APT. A partir destes dois espectros foi possível observar: Treze sinais de carbonos diferentes, correspondentes a todos os carbonos da molécula; A presença de 4 sinais correspondentes aos carbonos quaternários (C-4a, C10a, C-8a e C-9a), que apenas são visíveis no espectro de RMN de 13C, mas que são fáceis de identificar comparando com a experiência APT; Cinco sinais de carbonos correspondentes aos cinco –CH aromáticos; Quatro sinais na zona alifática, correspondentes aos quatro carbonos C-1-4 (adjacentes aos epóxidos). Fig. 3.23 – Espectro de RMN de 13C da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4), juntamente com a experiência APT. C-2 C-1 APT 13C C-9a C-8a C-10a C-4a C-9 C-4 C-3 C-7 C-5 C-8 C-6 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 53 O estudo do espectro bidimensional HSQC, apresentado na figura 3.24, permitiu a identificação dos carbonos e hidrogénios com correlação 1JCH. Fig. 3.24 – Espectro de HSQC da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4). A partir do estudo do espectro de correlação heteronuclear a 3-4 ligações, HMBC, apresentado na figura 3.25 foi possível tirar as seguintes conclusões: Este espectro mostra uma correlação 3JCH entre o protão H-9 e os carbonos C1 e C-8 e ainda uma correlação 3JCH entre o protão H-1 e o carbono C-9, consequentemente, o sinal a δ 52,4 ppm corresponde ao C-1, e o sinal a δ 127,6 ppm corresponde ao C-8, corroborando a atribuição dos protões e dos carbonos apresentada; Foi possível identificar dois dos sinais correspondentes aos carbonos quaternários: O carbono C-10a a δ 147,9 ppm, que correlaciona com o protão H-9; E o carbono C-4a a δ 152,1 ppm, que correlaciona com H-1 e H-9. Os sinais dos carbonos C-9a e C-8a foram atribuídos usando como comparação os espectros do isómero sin deste composto: O carbono C-9a a δ 124,7 ppm; E o carbono C-8a a δ 127,5 ppm. 5 2 3 4 6 7 8 9 1 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 60 O espectro de massa da sin-1:2,3:4-diepoxiacridina (5) está apresentado na figura 3.32, onde se pode observar um padrão de fragmentação muito semelhante à do isómero anti (4). Fig. 3.32 – Espectro de massa da sin-1:2,3:4-diepoxiacridina (5). 3.2.5 Caracterização da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6) O espectro de RMN de 1H da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6) está apresentado na figura 3.33, mostrando doze sinais correspondentes a 12 dos 13 protões da molécula. O sinal do protão correspondente ao grupo hidroxilo não é visível devido à sua labilidade. A partir deste espectro foi possível tirar as seguintes conclusões: O singuleto correspondente ao protão H-9 é observado a δ 8,19 ppm, semelhante ao do composto 4 (isómero anti); O efeito desprotetor provocado pelo grupo carboxilo no protão H-1 leva a um deslocamento do sinal para desvios maiores em relação aos protões H-2-4, sendo possível observá-lo a δ 6,10 ppm; O sinal do protão H-2 (a δ 4,65 ppm) mostra um maior desvio quando comparado com o equivalente nos compostos 4 e 5, já que a abertura do epóxido levou à formação do grupo hidroxilo na posição 2, com maior efeito indutor desprotetor que o grupo epóxido devido à proximidade do grupo carboxilo. M+• M+•-CHO M+•-C2HO2 M+•-C4H2O2 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 61 Fig. 3.33 – Espectro de RMN de 1H da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6). Fig. 3.34 – Espectro de COSY da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6). H-9 H-5 H-8 H-6 H-7 H-4 H-3 H-1 H-2 -CH3 H-5 H-3 H-4 H-8 H-1 H-2 H-6 H-2 H-7 H-6 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 62 O estudo do espectro bidimensional COSY, apresentado na figura 3.34, revelou os seguintes acoplamentos 1H-1H: O sinal a δ 3,99 ppm, correspondente ao protão H-3, acopla com três protões: H-1, H-2 e H-4; O protão H-1 (δ 6,10 ppm) acopla com o H-2 (δ 4,65 ppm); Na zona aromática o protão H-7 (δ 7,54 ppm) acopla com o H-8 (δ 7,72 ppm) e/ou com o H-6 (δ 7,72 ppm), que por sua vez acopla com o H-5 (δ 8,06 ppm). O espectro bidimensional NOESY desta molécula, apresentado na figura 3.35, confirma a abertura do epóxido na posição 1, uma vez que existe uma correlação entre o protão H-9 (δ 8,18 ppm) e o sinal a δ 6,10 ppm, evidenciando que este será relativo ao protão H-1. Fig. 3.35 – Expansão do espectro de NOESY da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6). A figura 3.36 mostra o espectro de RMN de 13C da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2hidroxiacridina (6) (contaminado com o composto 4), bem como a experiência APT. A partir destes dois espectros foi possível observar: A presença de quinze sinais correspondentes aos carbonos da molécula; Cinco carbonos quaternários (distinguidos dos restantes pela experiência APT): o sinal a δ 170,8 ppm corresponde ao carbono do grupo acetoxi e os restantes quatro correspondem aos carbonos C-4a, C-10a, C-8a e C-9a; O sinal a δ 21,4 ppm corresponde ao –CH3 do grupo acetoxi; Tal como no espectro de 1H, os sinais correspondentes aos carbonos C-1 e C2 apresentam um maior desvio em relação aos carbonos C-3 e C-4 devido à proximidade dos grupos carboxilo e hidroxilo. H-9 H-1 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 63 Fig. 36 – Espectro de RMN de 13C da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6), juntamente com a experiência APT. Fig. 3.37 – Espectro de HSQC da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6). C-3 C-1 APT 13C C-7 C-2 C-8 C-5 C-6 C-9 C-9a C-8a C-4a C-10a C-4 -CH3 -C=O 5 2 3 4 6 7 8 9 1 -CH3 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 64 A partir do estudo do espectro bidimensional HSQC, apresentado na figura 3.37, foi possível obter a correlação de acoplamento heteronuclear através de uma ligação 1H13C (1JCH). O estudo do espectro bidimensional HMBC, apresentado na figura 3.38, permitiu: A confirmação de que o sinal a δ 72,3 ppm corresponde ao C-1, corroborando a atribuição dos protões e dos carbonos com os desvios, uma vez que este espectro mostra uma correlação 3JCH entre o H-9 e o C-1; A identificação de todos os sinais correspondentes aos carbonos quaternários: O carbono C-9a a δ 125,0 ppm, que correlaciona com o protão H-4; O carbono C-8a a δ 127,9 ppm, que correlaciona com o protão H-5; O carbono C-10a a δ 148,0 ppm, que correlaciona com o protão H-8 e com o protão H-9; E o carbono C-4a a δ 152,4 ppm, que correlaciona com o protão H-9. Fig. 3.38 – Espectro de HMBC da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6). C-9a H-4 H-5 H-8 C-8a C-10a C-4a H-9 C-1 -C=O -CH3 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 65 O espectro de massa da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6) está apresentado na figura 3.39. Neste espectro está identificado o pico do ião molecular (M+•) com m/z = 271, de baixa intensidade devido à sua fácil fragmentação perdendo o fragmento CH3COOH ou o fragmento CH3CO. Estão também identificadas as outras sucessivas perdas mais importantes, correspondentes aos fragmentos de CHO e C2H4, que corroboram a sua estrutura. Fig. 3.39 – Espectro de massa da 1-acetoxi-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (6). 3.2.6 Caracterização da 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7) O espectro de RMN de 1H do composto 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7) está apresentado na figura 3.40, mostrando nove sinais correspondentes a nove protões da molécula. O protão do grupo hidroxilo não é observável devido à sua labilidade, enquanto os protões do grupo amónio são observáveis num sinal muito largo e de baixa intensidade (a δ ~ 3 ppm), também devido à sua labilidade. A partir deste espectro foi possível tirar as seguintes conclusões: O singuleto a δ 8,14 ppm corresponde ao protão H-9; Os restantes sinais da zona aromática correspondem aos protões H-5, H-6, H7 e H-8, à semelhança dos compostos anteriores; Na zona alifática do espectro encontram-se os restantes sinais correspondentes aos protões H-1-4. Os sinais dos protões H-1 e H-2 encontram-se sobrepostos a δ 4,75 ppm, tendo um desvio maior em relação aos sinais que correspondem aos protões H-3 e H-4. M+• M+•-C2H3O M+•-C2H4O2 M+•-C3H5O3 M+•-C4H5O4 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 66 Fig. 3.40 – Espectro de RMN de 1H da 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7). Fig. 3.41 – Espectro de COSY da 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7). H-9 H-5 H-8 H-6 H-7 H-4 H-3 H-1 H-2 H-5 H-3 H-4 H-8 H-1 H-2 H-6 H-3 H-7 H-6 N-H FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 67 O estudo do espectro bidimensional COSY (figura 3.41) permitiu observar as seguintes correlações 1H-1H: O sinal do protão H-3, a δ 4,10 ppm acopla com H-2 e H-4. Como os sinais H1 e H-2 se encontram sobrepostos não se exclui o acoplamento de H-3 com H-1, mas este seria de menor intensidade; O H-6, a δ 7,76 ppm, correlaciona com o H-5 (δ 8,10 ppm) e com o H-7 (δ 7,57 ppm), que por sua vez correlaciona com o H-8, a δ 7,79 ppm. O espectro de RMN de 13C do composto 7 encontra-se na figura 3.42, assim como a experiência APT. Nestes espectros são observáveis doze sinais de carbonos, correspondentes a doze dos treze carbonos da molécula. A partir destes dois espectros foi possível observar: Cinco sinais de carbonos correspondentes aos cinco –CH aromáticos e ainda três carbonos quaternários (C-4a, C-8a e C-9a), distinguidos pela experiência APT, sendo que o C-10a não foi detectado; Tendo por comparação o composto 6, uma vez que ambos resultam da abertura do anel de epóxido nas posições 1:2, é mais uma vez notório o maior desvio dos sinais dos carbonos C-1 e C-2, em relação aos carbonos C-3 e C-4. Fig. 3.42 – Espectro de RMN de 13C da 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7), juntamente com a experiência APT. C-3 C-1 APT 13C C-7 C-2 C-8 C-5 C-6 C-9 C-9a C-8a C-4a C-4 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 68 A partir do estudo do espectro bidimensional HSQC, foi possível relacionar diretamente os protões com os carbonos da molécula, como representado na figura 3.43. Fig. 3.43 – Espectro de HSQC da 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7). O estudo do espectro bidimensional HMBC apresentado na figura 3.44 permitiu: A confirmação de que o sinal a δ 72,6 ppm corresponde ao C-1, corroborando a identificação dos protões e dos carbonos com os desvios, uma vez que este espectro mostra uma correlação 3JCH entre o H-9 e o C-1; A identificação de todos os sinais correspondentes aos carbonos quaternários: O carbono C-9a a δ 125,0 ppm, que correlaciona com o protão H-4; O carbono C-8a a δ 127,9 ppm, que correlaciona com o protão H-5; O carbono C-10a a δ 148,0 ppm, que apesar de não aparecer nos estudos de RMN de 13C e na experiência de APT, é possível identificá-lo no espectro HMBC por ter uma correlação 3JCH com o protão H-8 e com o protão H-9; E o carbono C-4a a δ 152,4 ppm, que correlaciona com o protão H-1 e H-9. 5 2 3 4 6 7 8 9 1 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 69 Fig. 3.44 – Espectro de HMBC da 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7). O espectro de massa do composto 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7) está apresentado na figura 3.45. Neste espectro está identificado o pico do ião molecular (M+•) com m/z = 229. Estão também identificados outros três picos correspondentes a duas perdas sucessivas de fragmentos, de CNH3 e OH2, que corroboram a sua estrutura. Fig. 3.45 – Espectro de massa da 1-amónio-3:4-epoxi-2-hidroxiacridina (7). M+• M+•-CNH3 M+•-CNH5O H-4 H-5 H-8 C-8a C-10a C-4a H-9 C-1 C-9a FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 76 | |       ∑| | Depois calculou-se o desvio absoluto médio  através da fórmula:  ∑|| | | |       | O valor de  obtido para os desvios químicos do RMN de 1H da acridina foi o valor de referência usado nos estudos posteriores para retirar conclusões confiáveis a partir da comparação entre os valores experimentais e os valores teóricos. A molécula de acridina (1) na conformação de menor energia é apresentada na figura 4.1. Na tabela 4.1 estão apresentados os valores de desvio químico dos protões nos espetros de RMN de 1H obtidos experimentalmente e os valores obtidos teoricamente, assim como o erro médio absoluto | |      e o desvio médio , que neste caso apresentou um valor de 0,03. Fig. 4.1 – Estrutura da acridina (1) na conformação de menor energia. Tabela 4.1 – Comparação entre os valores de δ de RMN de 1H experimentais e teóricos da acridina (1). δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. H δ exp (ppm) δ teórico (ppm) |Δδ| 1 8,00 8,28 0,28 2 7,54 7,78 0,24 3 7,79 8,04 0,25 4 8,25 8,45 0,20 5 8,25 8,45 0,20 6 7,79 8,04 0,25 7 7,54 7,78 0,24 8 8,00 8,28 0,28 9 8,77 8,95 0,18 | |       0,23(6)  0,03 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 77 4.1.2 Confirmação da estrutura da 1:2-epoxiacridina (2) A mono-epoxiacridina pode encontrar-se em várias formas isoméricas, nomeadamente os dois isómeros posicionais, 1:2-epoxiacridina (2) e 3:4-epoxiacridina (2a) (figura 4.2). Fig. 4.2 – Estrutura 3D das moléculas 1:2-epoxiacridina (2) e 3:4-epoxiacridina (2a). Cada um destes isómeros poderá encontrar-se em duas formas enantioméricas, em que o epóxido se encontra na face superior ou inferior do anel. Após a obtenção da conformação de menor energia para os quatro compostos, verificou-se que o anel funcionalizado se encontra praticamente no mesmo plano dos anéis aromáticos em todos os compostos que também possuem a mesma energia mínima (figura 4.3). Fig. 4.3 – Representação 3D dos dois enantiómeros da 1:2-epoxiacridina (2). Desta forma, seria esperado que os dois enantiómeros do mesmo isómero posicional não introduzissem uma variação significativa no espectro de RMN de 1H teórico. Posteriormente obtiveram-se os desvios químicos de RMN de 1H teóricos para as moléculas 2 e 2a, que se encontram apresentados na tabela 4.2 em comparação com os valores obtidos experimentalmente para a 1:2-epoxiacridina (2). Para se poderem comparar os valores, a numeração do anel funcionalizado da 3:4-epoxiacridina (2a) encontra-se invertida. (2) (2a) 1 2 3 4 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 78 Comparando os valores obtidos experimentalmente com os teóricos, chegou-se ao valor de desvio médio  de 0,04 para o caso da molécula 2 e de 0,07 no caso da molécula 2a. Estes valores confirmam a estrutura obtida pelos estudos de RMN, resta no entanto explicar a obtenção apenas deste monoepóxido, provavelmente na forma de dois enantiómeros, e a não obtenção do seu isómero posicional 2a. Este ponto será retomado na seção 4.2.1, através de estudos de potencial eletrostático. Tabela 4.2 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da 1:2-epoxiacridina (2) com os valores teóricos da mesma molécula e da 3:4-epoxiacridina (2a). aPara comparação direta dos valores dos protões H-1-4 do composto 2a com os mesmos do composto 2, foi necessário inverter a sua numeração: δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. 4.1.3 Confirmação da estrutura da 4-hidroxiacridina (3) Dos quatro isómeros possíveis para a mono-hidroxiacridina apenas os isómeros 4hidroxiacridina (3) e 1-hidroxiacridina (3a) foram estudados (figura 4.4). Atendendo aos resultados obtidos nos estudos de RMN, o grupo hidroxilo apenas poderia estar nas posições 1 ou 4. Os desvios químicos de RMN de 1H teóricos obtidos para os compostos 3 e 3a encontram-se na tabela 4.3 e os mesmos foram comparados com os desvios químicos obtidos experimentalmente para a 4-hidroxiacridina (3). Comparando os valores, obteve-se um valor de  de 0,06 para a molécula 3 e de 0,10 para a molécula 3a. Estes resultados confirmam os estudos de RMN, indicando que foi obtida a molécula 4-hidroxiacridina (3). Tal como no caso do monoepóxido, resta explicar a razão pela qual apenas este isómero foi obtido. Esta questão será abordada na secção 4.2.1. H δ 2 exp (ppm) δ 2 teórico (ppm) |Δ|2 δ 2a teórico (ppm)a |Δ|2a 1 4,62 4,48 0,14 7,07 0,06 2 4,15 3,99 0,16 6,75 0,10 3 6,85 7,06 0,21 4,04 0,11 4 7,01 7,25 0,24 4,58 0,04 5 8,09 8,26 0,17 8,32 0,23 6 7,74 7,95 0,21 7,95 0,21 7 7,56 7,77 0,21 7,78 0,22 8 7,85 8,08 0,23 8,08 0,23 9 8,36 8,48 0,12 8,14 0,22 | |       0,18(8) 0,15(8)  0,04 0,07 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 79 Fig. 4.4 – Estrutura 3D das moléculas 4-hidroxiacridina (3) e 1-hidroxiacridina (3a). Tabela 4.3 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da 4-hidroxiacridina (3) com os valores teóricos da mesma molécula e da 1-hidroxiacridina (3a). aPara comparação direta dos valores dos protões H-1-4 do composto 3a com os mesmos do composto 3, foi necessário inverter a sua numeração; δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. 4.1.4 Atribuição das configurações anti e sin aos diastereoisómeros da diepoxiacridina Para o estudo da estereoisomeria da molécula 1:2,3:4-diepoxiacridina realizaram-se estudos teóricos para os diastereoisómeros anti e sin (figura 4.5). Também nestes derivados as conformações de menor energia obtidas mostram que o anel funcionalizado com os dois grupos epóxido se encontra no mesmo plano dos anéis aromáticos, enquanto os anéis de epóxido estão acima ou abaixo deste plano. Os valores dos desvios químicos teóricos obtidos foram comparados com os desvios químicos de RMN de 1H experimentais do composto 4 e do composto 5, e os resultados encontram-se resumidos nas tabelas 4.4 e 4.5, respetivamente. H δ 3 exp (ppm) δ 3 teórico (ppm) |Δ|3 δ 3a teórico (ppm)a |Δ|3a 1 7,53 7,71 0,18 6,84 0,36 2 7,46 7,55 0,09 7,79 0,33 3 7,20 7,09 0,11 7,88 0,35 5 8,22 8,48 0,26 8,37 0,15 6 7,79 7,99 0,20 8,02 0,23 7 7,56 7,78 0,22 7,75 0,19 8 8,03 8,23 0,20 8,30 0,27 9 8,77 8,83 0,06 9,37 0,60 | |       0,16(5) 0,31(0)  0,06 0,10 (3) (3a) 1 4 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 80 Os valores de  obtidos pela comparação dos desvios químicos experimentais do composto 4 com os desvios teóricos dos dois isómeros foram de 0,04 no caso do diastereoisómero anti e de 0,10 no caso do sin, indicando que o composto 4 se trata da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina. Na comparação dos desvios químicos experimentais do composto 5 com os desvios teóricos dos dois isómeros, obtiveram-se valores de  de 0,13 no caso do anti e de 0,03 no caso do sin, indicando que o composto 5 se trata da sin-1:2,3:4-diepoxiacridina. Fig. 4.5 – Estrutura 3D das moléculas anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) e sin-1:2,3:4-diepoxiacridina (5). Tabela 4.4 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da anti-1:2,3:4-diepoxiacridina (4) com os valores teóricos da mesma molécula e do isómero sin. δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. H δ 4 exp (ppm) δ anti teórico (ppm) |Δ|anti δ sin teórico (ppm) |Δ|sin 1 3,95 3,68 0,27 4,00 0,05 2 4,12 3,91 0,21 3,70 0,42 3 4,16 3,95 0,21 3,76 0,4 4 4,10 3,83 0,27 4,07 0,03 5 8,10 8,26 0,16 8,34 0,24 6 7,76 7,95 0,19 8,01 0,25 7 7,59 7,79 0,20 7,84 0,25 8 7,82 8,02 0,20 8,11 0,29 9 8,20 8,26 0,06 8,53 0,33 | |       0,19(7) 0,25(1)  0,04 0,10 (4) anti (5) sin FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 81 Tabela 4.5 - Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais da sin-1:2,3:4-diepoxiacridina (5) com os valores teóricos da mesma molécula e do isómero anti. δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. 4.1.5 Atribuição da estereoquímica dos tetraepóxidos O estudo mais complexo foi o da atribuição estereoquímica aos compostos 8a e 8b, que são dois estereoisómeros da 1:2,3:4,5:6,7:8-tetraepoxiacridina. Esta molécula apresenta 6 diastereoisómeros possíveis, no entanto, neste trabalho apenas dois destes foram obtidos, como descrito no capítulo III. Dois isómeros anti,anti desta molécula, aa1 e aa2, estão apresentados na figura 4.6. Nas tabelas 4.6 e 4.7 estão apresentados os valores de desvios químicos teóricos calculados para estes dois isómeros em comparação com os desvios químicos experimentais dos compostos 8a e 8b, respetivamente. Comparando os valores de desvio químico obtidos experimentalmente para o composto 8a com os valores obtidos teoricamente para os isómeros aa1 e aa2 (tabela 4.6), obteve-se o valor de  de 0,05 para as duas moléculas. No caso do composto 8b (tabela 4.7), obteve-se um valor de  de 0,06 para a comparação com os desvios químicos teóricos do isómero aa1 e de 0,05 para a comparação com os do isómero aa2. H δ 5 exp (ppm) δ anti teórico (ppm) |Δ|anti δ sin teórico (ppm) |Δ|sin 1 4,21 3,68 0,53 4,00 0,21 2 4,01 3,91 0,10 3,70 0,31 3 4,03 3,95 0,08 3,76 0,27 4 4,29 3,83 0,46 4,07 0,22 5 8,15 8,26 0,11 8,34 0,19 6 7,79 7,95 0,16 8,01 0,22 7 7,62 7,79 0,17 7,84 0,22 8 7,87 8,02 0,15 8,11 0,24 9 8,41 8,26 0,15 8,53 0,12 | |       0,21(2) 0,22(2)  0,13 0,03 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 82 Fig. 4.6 – Estrutura 3D de dois isómeros anti,anti da molécula 1:2,3:4,5:6,7:8-tetraepoxiacridina, aa1 e aa2. Tabela 4.6 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8a com os valores teóricos dos isómeros anti,anti, aa1 e aa2. δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. Tabela 4.7 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8b com os valores teóricos dos isómeros anti,anti, aa1 e aa2. H δ 8a exp (ppm) δ aa1 teórico (ppm) |Δ|aa1 δ aa2 teórico (ppm) |Δ|aa2 1 3,71 3,44 0,27 3,45 0,26 2 4,04 3,83 0,21 3,84 0,20 3 4,07 3,87 0,20 3,88 0,19 4 3,89 3,62 0,27 3,64 0,25 5 3,89 3,61 0,28 3,64 0,25 6 4,07 3,87 0,20 3,88 0,19 7 4,04 3,83 0,21 3,84 0,20 8 3,71 3,44 0,27 3,45 0,26 9 7,76 7,76 0 7,74 0,02 | |       0,21(2) 0,20(2)  0,05 0,05 H δ 8b exp (ppm) δ aa1 teórico (ppm) |Δ|aa1 δ aa2 teórico (ppm) |Δ|aa2 1 3,72 3,44 0,28 3,45 0,27 2 4,04 3,83 0,21 3,84 0,20 3 4,07 3,87 0,20 3,88 0,19 4 3,90 3,62 0,28 3,64 0,26 5 3,90 3,61 0,29 3,64 0,26 6 4,07 3,87 0,20 3,88 0,19 7 4,04 3,83 0,21 3,84 0,20 8 3,72 3,44 0,28 3,45 0,27 9 7,75 7,76 0,01 7,74 0,01 | |       0,21(8) 0,20(6)  0,06 0,05 aa1 aa2 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 83 A figura 4.7 apresenta outros dois isómeros do composto 1:2,3:4,5:6,7:8tetraepoxiacridina, os diastereoisómeros sin,anti, identificados por sa1 e sa2. Comparando os valores de desvio químico obtidos experimentalmente para o composto 8a (tabela 4.8) e para o composto 8b (tabela 4.9) com os valores obtidos teoricamente para os isómeros sa1 e sa2, obteve-se o valor de  de 0,08 para todas as comparações. Fig. 4.7 – Estrutura 3D de dois isómeros sin,anti da molécula 1:2,3:4,5:6,7:8-tetraepoxiacridina, sa1 e sa2. Tabela 4.8 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8a com os valores teóricos dos isómeros sin,anti, sa1 e sa2. δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. H δ 8a exp (ppm) δ sa1 teórico (ppm) |Δ|sa1 δ sa2 teórico (ppm) |Δ|sa2 1 3,71 3,83 0,12 3,81 0,10 2 4,04 3,66 0,38 3,66 0,38 3 4,07 3,71 0,36 3,72 0,35 4 3,89 3,92 0,03 3,95 0,06 5 3,89 3,67 0,22 3,71 0,18 6 4,07 3,90 0,17 3,91 0,16 7 4,04 3,87 0,17 3,86 0,18 8 3,71 3,52 0,19 3,49 0,22 9 7,76 8,00 0,24 8,00 0,24 | |       0,20(9) 0,20(8)  0,08 0,08 sa1 sa2 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 84 Tabela 4.9 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8b com os valores teóricos dos isómeros sin,anti, sa1 e sa2. δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. A figura 4.8 apresenta os restantes dois isómeros da 1:2,3:4,5:6,7:8tetraepoxiacridina, isómeros sin,sin, que estão identificadas por ss1 e ss2. Comparando os valores dos desvios químicos de RMN de 1H obtidos experimentalmente para o composto 8a com os valores obtidos teoricamente para os isómeros ss1 e ss2 (tabela 4.10), obteve-se um valor de  de 0,11 para a comparação com os valores da molécula ss1 e de 0,12 para a comparação com os valores da molécula ss2. Para o composto 8b (tabela 4.11), o valor de  obtido na comparação com os desvios do isómero ss1 foi de 0,12 enquanto para os desvios do isómero ss2 foi de 0,13. Fig. 4.8 – Estrutura 3D de dois isómeros sin,sin da molécula 1:2,3:4,5:6,7:8-tetraepoxiacridina, ss1 e ss2. H δ 8b exp (ppm) δ sa1 teórico (ppm) |Δ|sa1 δ sa2 teórico (ppm) |Δ|sa2 1 3,72 3,83 0,11 3,81 0,09 2 4,04 3,66 0,38 3,66 0,38 3 4,07 3,71 0,36 3,72 0,35 4 3,90 3,92 0,02 3,95 0,05 5 3,90 3,67 0,23 3,71 0,19 6 4,07 3,90 0,17 3,91 0,16 7 4,04 3,87 0,17 3,86 0,18 8 3,72 3,52 0,20 3,49 0,23 9 7,75 8,00 0,25 8,00 0,25 | |       0,21(0) 0,20(9)  0,08 0,08 ss1 ss2 FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 85 Tabela 4.10 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8a com os valores teóricos dos isómeros sin,sin, ss1 e ss2. δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. Tabela 4.11 – Comparação dos valores de δ de RMN de 1H experimentais do composto 8b com os valores teóricos dos isómeros sin,sin, ss1 e ss2. δ exp: valores de δ obtidos experimentalmente. A análise de todos os resultados e desvios absolutos médios calculados indicou que os compostos 8a e 8b se tratam dos dois isómeros anti,anti (aa1 e aa2), não podendo ser estruturas anti,sin ou sin,sin. No entanto, estes estudos não permitiram distinguir entre os dois isómeros aa1 e aa2 e esta distinção foi apenas baseada nos resultados experimentais como indicado no capítulo III, nomeadamente os compostos foram distinguidos por comparação dos desvios químicos dos protões H-1 e H-8 ou H-4 e H-5 nos espectros de RMN de 1H, H δ 8a exp (ppm) δ ss1 teórico (ppm) |Δ|ss1 δ ss2 teórico (ppm) |Δ|ss2 1 3,71 3,88 0,17 3,88 0,17 2 4,04 3,69 0,35 3,68 0,36 3 4,07 3,74 0,33 3,73 0,34 4 3,89 4,01 0,12 3,99 0,10 5 3,89 4,01 0,12 3,99 0,10 6 4,07 3,74 0,33 3,73 0,34 7 4,04 3,69 0,35 3,68 0,36 8 3,71 3,88 0,17 3,88 0,17 9 7,76 8,26 0,50 8,24 0,48 | |       0,27(1) 0,26(9)  0,11 0,12 H δ 8b exp (ppm) δ ss1 teórico (ppm) |Δ|ss1 δ ss2 teórico (ppm) |Δ|ss2 1 3,72 3,88 0,16 3,88 0,16 2 4,04 3,69 0,35 3,68 0,36 3 4,07 3,74 0,33 3,73 0,34 4 3,90 4,01 0,11 3,99 0,09 5 3,90 4,01 0,11 3,99 0,09 6 4,07 3,74 0,33 3,73 0,34 7 4,04 3,69 0,35 3,68 0,36 8 3,72 3,88 0,16 3,88 0,16 9 7,75 8,26 0,51 8,24 0,49 | |       0,26(8) 0,26(6)  0,12 0,13 Considerações Finais FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 95 Considerações Finais No trabalho descrito, o composto heteroaromático policíclico acridina foi oxidado eficientemente e em condições suaves, a partir da aplicação de um sistema de catálise biomimética oxidativa baseado na catálise com uma metaloporfirina de Mn(III). Num único passo reacional e utilizando peróxido de hidrogénio como oxidante “verde” foram obtidos vários novos produtos funcionalizados nas posições periféricas da acridina, nomeadamente o 1:2-monoepóxido, anti e sin 1:2,3:4-diepóxidos, e anti,anti-1:2,3:4,5:6,7:8-tetraepóxidos e ainda um composto hidroxilado. Aumentando o tempo de reação, a quantidade de peróxido de hidrogénio adicionado e diminuindo a razão substrato-catalisador foi possível obter maiores rendimentos isolados dos tetraepóxidos, assim como produtos resultantes da abertura de um dos anéis de epóxido do composto diepoxidado por ataque nucleófilo pelo ião acetato ou pela amónia provenientes do cocatalisador. A funcionalização do diepóxido com nucleófilos ocorre de forma seletiva e com 100% de conversão como foi verificado pela reação deste com a 4-etilanilina em refluxo de acetonitrilo, após 10 minutos de aquecimento em micro-ondas. Esta facilidade de abertura de epóxido mostra que estes novos compostos são fáceis de funcionalizar, podendo então obter-se diversos compostos novos ou já existentes. Atendendo ao reduzido número de reações descritas para a funcionalização direta da acridina, nomeadamente para as reações de oxidação, é evidente que estes novos derivados são compostos de grande interesse para aplicações biológicas e fotoquímicas, na medida em que tornam possível a obtenção de um variado leque de compostos derivados da acridina (novos ou já existentes) a partir de novas vias de síntese, essencialmente mais ecológicas. É importante referir também que a formação do diepóxido é diastereoseletiva para o isómero anti, tendo-se observado uma razão anti : sin = 4. Foram realizados estudos teóricos computacionais que mostraram, entre outras particularidades, o facto dos compostos epóxidos obtidos apresentarem uma estrutura plana. Esta característica é a característica fundamental na utilização de derivados da acridina na prevenção do desenvolvimento de tumores, pois permite a intercalação das moléculas na cadeia de ADN, entre pares de bazes azotadas. Desta forma, estes novos compostos podem impulsionar novas vias de síntese para a obtenção destes compostos FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 96 anticancerígenos, ou mesmo a obtenção de novos derivados de maior seletividade biológica. Por outro lado, os epóxidos derivados dos compostos aromáticos policíclicos são conhecidos por serem metabolitos cancerígenos, sintetizados no organismo pela ação das enzimas. Assim sendo, os epóxidos obtidos neste trabalho poderão ser utilizados em estudos de reações mutagénicas, em que estes compostos se ligam a bases azotadas da cadeia de ADN. Referências Bibliográficas FCUP Síntese biomimética e caracterização de novos derivados da acridina 99 Referências Bibliográficas [1] M. M. Pereira, J. 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