Aplicação de um caso prático de doenças profissionais: relevância médico-legal

ANA SALOMÉ BAPTISTA OLIVEIRA LEITE APLICAÇÃO DE UM CASO PRÁTICO DE DOENÇAS PROFISSIONAIS: RELEVÂNCIA MÉDICO-LEGAL Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto Orientador – Professora Doutora Elisabete Cunha Categoria – Professora Adjunta Afiliação – Escola Superior de Enfermagem da Universidade do Porto Á memória dos meus avós . AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Professora Doutora Mónica Cunha, por todo o apoio, orientação e disponibilidade. Pelas críticas e sugestões dadas em todas as fases que levaram à concretização deste trabalho, sempre com o objetivo de enriquecer o mesmo. Não existem palavras para expressar e transmitir todo o meu reconhecimento e gratidão. Um grande e sentido beijinho, e o meu sincero obrigado. À Sra. Professora Doutora Maria José Carneiro de Sousa, pela simpatia, compreensão e partilha dos seus valiosos ensinamentos. Ao Sr. Professor Doutor Pinto da Costa, pela inspiração dada ao longo de todo este percurso. Pela sabedoria, humor e capacidade de transmitir os seus conhecimentos. À Dra. Daniela do Centro de Materiais da Universidade do Porto (CEMUP) pela simpatia e explicações acerca do SEM durante todo processo de investigação. À minha amiga, Filipa Amaro, colega de licenciatura, pós-graduação e mestrado, agradeço todo o apoio, amizade, companheirismo e partilha de saberes durante todo este processo. Aos meus pais, sem eles não seria possível realizar este curso, agradeço por me terem ajudado financeiramente e psicologicamente. Obrigado por toda a confiança, apoio, amor, compreensão, força, vontade de vencer, inspiração e sacrifícios prestados. Sem vocês nunca conseguiria ter chegado até aqui. Obrigado por sempre terem acreditado em mim. São os melhores pais do mundo! Ao meu irmão, Dudu, pelo apoio e amor incondicional desde sempre. Ao meu namorado, Bernardo, pelo apoio inesgotável manifestado ao longo de todos estes anos, nos bons e nos maus momentos. Pela amizade e amor. Por toda a paciência que sempre tiveste comigo, e por todos os incentivos para nunca desistir. Sem ti tudo teria sido muito mais difícil. Um beijo especial à minha avó Manuela, e à memória dos meus avós, Adelaide, Isauro e Eduardo. A todos os familiares e amigos, que se mostraram disponíveis e me apoiaram durante esta etapa atribulada, o meu muito obrigado. Agradeço também a todos os que não foram mencionados particularmente, e que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. O meu obrigado a todos! vii RESUMO Os metais pesados são elementos quimicamente reativos e bio-acumulativos cujo organismo não é capaz de eliminar. Esta característica, aliada à sua potencial toxicidade, distingue-os de outros agentes tóxicos. O excesso de metais pesados que fazem naturalmente parte dos organismos, como o cobre (Cu) ou zinco (Zn), ou o contacto com metais pesados não intrínsecos ao Homem, pode provocar efeitos nocivos, nomeadamente neoplasias. A exposição aos metais pesados é uma contaminação silenciosa, à qual estamos expostos diariamente seja pela ocupação laboral, ingestão de água contaminada ou inalação de vapores tóxicos. Alguns metais continuam a ser utilizados, inclusivamente, em tratamentos médicos de foro oncológico, tratamentos dentários através de amálgamas e ainda em meios de diagnóstico, como no caso da imagiologia. As doenças profissionais são, atualmente, uma problemática cada vez mais presente nos nossos dias. Na Tabela Nacional de Incapacidades (TNI) estão contemplados, como possíveis causadores destas doenças, três metais: o mercúrio (Hg), o chumbo (Pb) e o arsénio (As). O objetivo deste estudo visou determinar qualitativamente e semiquantitativamente a presença de metais pesados em amostras de cabelo de uma população alvo. Para a realização deste estudo utilizou-se o método de Microscopia Eletrónica de Varrimento acoplado à Microanálise de Raios-X (SEM-XRM), que fornece informações sobre a morfologia e analisa qualitativa e semi-quantitativamente uma determinada amostra. Esta metodologia é um versátil instrumento para a observação e análise de características micro-estruturais. Através desta técnica é possível detetar, desde que numa concentração superior a 0,1-0,3% em massa, a presença de metais pesados numa amostra. Pela aplicabilidade desta técnica na identificação de metais em diferentes tipos de amostras, esta metodologia adquire uma forte importância médico-legal. Neste trabalho observou-se a presença de metais pesados e terras raras nas amostras em estudo, o que nos poderá indicar que a exposição crónica desta população a esses mesmos metais potencia processos inflamatórios e desse modo carcinogénese, pelo stress oxidativo causado. viii ix ABSTRACT Heavy metals are chemically reactive and bio-accumulative elements whose body is unable to eliminate. This feature, combined with its potential toxicity, distinguishes them from other toxic agents. The excess of heavy metals that are naturally part of organisms, such as copper (Cu) or zinc (Zn), or contact with heavy metals not intrinsic to Man, can provoke harmful effects including neoplasia. Exposure to heavy metals is a silent infection to which we are daily exposed either by labor occupation, drinking contaminated water or inhalation of toxic fumes. Some metals continue to be used even in oncological medical treatment, dental treatment through amalgam and also in diagnostics, such as in imaging. Occupational diseases are currently an increasingly problematic. In the Tabela Nacional de Incapacidades (TNI) are included, as possible causes of these diseases, three metals: mercury (Hg), lead (Pb) and arsenic (As). This study aimed to determine qualitatively and semi-quantitatively the presence of heavy metals in hair samples from a target population. For this study was used the scanning electron microscopy coupled with X-ray elemental microanalysis (SEMXRM), which provides information on the morphology and analyzes qualitatively and semiquantitatively a given sample. This methodology is a versatile tool for the observation and analysis of micro-structural features. With this technique it is possible to detect, within a mass excess of 0.1-0.3 %, the presence of heavy metals in a sample. By applying this technique to identify types of metals in different samples, a strong medical-legal importance is acquired. In this work was observed the presence of heavy metals and rare earths in samples under study, wich may indicate that chronic exposure of this population to heavy metals favors inflammatory processes and corresponding oxidative stress, promoting carcinogenesis. xvi MEV Microscópio Eletrónico de Varrimento NAG N-acetilβ – D – glucosaminidase NFAT Nuclear factor of activated T-cells NF-κB Fator Nuclear Kappa B OMS Organização Mundial de Saúde p38 MAPK p38 Mitogen-activated Protein Kinases RNS Reactive Nitrogen Species ROS Reactive Oxygen Species SEM-XRM Microscopia Eletrónica de Varrimento acoplada à Microanálise de Raios-X SOD Superóxido Dismutase TCF T Cell Factor TCF4 T Cell Factor 4 TNI Tabela Nacional de Incapacidades U-Cd Concentração de Cádmio na Urina Wnt Wingless-type MMTV Integration site Family 1 INTRODUÇÃO Introdução 2 1. MEDICINA LEGAL 1.1. Breve Introdução Histórica Historicamente, a Medicina Legal pode ser dividia em cinco períodos: Antigo, Romano, Médio, Canónico e Moderno ou Científico [1]. Período Antigo Durante o período Antigo a medicina era considerada uma profissão subalterna e vista mais como uma arte do que uma ciência. Os cadáveres eram considerados sagrados, e por esta razão era proibida a realização de necrópsias. No Egipto, os crimes sexuais eram condenados, caso o indivíduo apresenta-se ereção enquanto virgens nuas ou com roupas transparentes dançavam. Em 1240 a.C., na China, foi criado um valioso documento médico-legal, o tratado Hsi yuan lu, que falava acerca do exame post-mortem, listava antídotos para venenos e continha informações acerca da respiração artificial. Devido ao Cristianismo, neste período, deu-se a emancipação do Direito [1]. Período Romano Anteriormente à reforma de Justiniano, em Roma, Numa Pompílio criou uma lei que determinava a histerotomia quando uma mulher grávida falecia. Nesta época os cadáveres já eram examinados externamente por médicos. Existem relatos na bibliografia que referem que o médico Tito Lívio examinou em praça pública os cadáveres de Tarquínio (assassinado) e de Germânico (suspeito de envenenamento). Com a reforma de Roma, a Medicina e o Direito afirmaram-se. Na Grécia antiga o interesse pela Medicina também aumentou. Entre 460-377 a.C., Hipócrates mencionou algumas noções sobre anatomia e fisiologia e entre 131-210 d.C., Galeno realizou experiências com animais e examinou os seus cadáveres [1]. Neste período realizou-se uma das primeiras autópsias com interesse forense, por volta do ano 44 a.C., o médico Antistius autopsiou o corpo de Júlio César para determinar qual das 23 facadas provocou a sua morte [2]. Introdução 3 Período Médio Foi durante este período (1248) que surgiu o livro chinês, Hsi Duam Yu (“A abolição de um erro”) umas das primeiras referências literárias forense. Este livro descreve diferentes marcas e ferimentos que poderiam auxiliar a distinguir entre estrangulamento e afogamento, e ajudar a distinguir se uma morte era acidental ou intencional [2]. Também neste período, foram fundadas as bases da patologia moderna pelos cirurgiões italianos, Fortunato Fidelis e Paolo Zacchia. Na Europa, durante a guerra, vários cirurgiões de exércitos, tal como o francês Ambroise Paré e o espanhol Juan Fragoso, recolheram dados importantes acerca da morte violenta provocada pelos ferimentos sofridos na guerra [3]. Diz-se que a Idade Média foi a “escuridão do pensamento humano”, visto que a proibição da dissecação dos cadáveres impediu o desenvolvimento da Medicina [1]. Período Canónico Durante 1200 a 1600 deu-se o período Canónico. Este período foi dominado pelo Cristianismo, que através da codificação das Decretais dos Pontífices dos Concílios dá normas ao Direito Moderno dos povos civilizados. Em 1537, ocorreu a promulgação do Código Criminal Carolino (de Carlos V), acontecimento que marca este período. Este código é o primeiro documento organizado de Medicina Judiciária e afirma que devem ser realizadas perícias médicas antes dos juízes tomarem decisões [1]. Ambroise Paré escreve o primeiro livro de Medicina Legal, em 1575, intitulado Des rapports et des moyens d'embaumer les corps morts [1]. Período Moderno ou Científico Neste período a investigação dedica-se fundamentalmente a fenómenos naturalísticos, químicos, físicos e psíquicos relacionados com condutas criminosas. Com o desenvolvimento das várias ciências surge uma nova, a criminologia [2]. Em Itália, Fortunato Fidelis publica em 1602 o livro De Relatoribus Libri Quator in Quibus e a Omnia quae in Forensibus ac Publicis Causis Medici Preferre Solent Plenissime Traduntur, que dá inicio a este período [1]. Introdução 4 Paulus Zacchias é considerado por muitos autores o fundador da Medicina Legal, visto que em 1621 publica o livro Quaestiones Medico Legales Opus Jurisperitis Maxime Necessarium Medicis Peritilis, obra que estuda diversos problemas médico-legais [1]. No século XIX devido a vários nomes como o de Orfila, Divergie, Lacassagne, Rollet, Thoinot, Tardieu e Brouardell, na França; Bernt, Hoffman, Schanesteir e Paltauf, em Viena; Telchmeyer, na Alemanha; Hunter e Cooper, na Inglaterra; Barzelloti, Martini, Perrone, Garófolo, Virgílio, Nicéforo, Falconi e Ferri, na Itália; Balk, Gromev, Schmidt e Poelchan, Dragendorff e Pirogoff, na Rússia; a disciplina de Medicina Legal progrediu. Neste século com a construção de novos aparelhos e descobertas de novas técnicas a Medicina Legal ganha autonomia como ciência [1]. 1.2. Conceitos Médico-Legais A Medicina Legal é o conjunto de conhecimentos médico-psico-biológicos aplicados às diversas áreas de atuação do direito (direito civil, direito penal, direito do trabalho, direito administrativo, entre outros), ou seja, está intimamente relacionada com as ciências jurídicas e sociais [4]. Esta pode ser designada de Medicina Judicial ou Medicina Forense. A Medicina Legal surge juntamente com as questões e exigências da Justiça, e dedica-se aos problemas médicos que interessam à saúde dos Homens que se reúnem em sociedade. Esta área tem repercussões a nível legal, cível e politico [3]. Atualmente, a Medicina Legal está inserida no âmbito da medicina social, visto que esta contribui para a promoção da saúde das populações [5]. Esta ciência encontra-se constantemente em expansão, o que leva a necessidade de uma adaptação dos seus métodos às novas tecnologias, às descobertas científicas, e às mudanças sociais e do direito [6]. Compete à Medicina Legal a realização de autópsias médico-legais quando há suspeita de morte violenta, causa ignorada, casos de intoxicação, acidentes de trabalho, acidentes de viação e aviação, e sempre que seja necessária a confirmação de um diagnóstico. É também sua competência estudar e opinar sobre determinada terapêutica, como por exemplo em casos de responsabilidade médica. Para elaborar hipóteses e conclusões durante as suas pesquisas a Medicina Legal utiliza frequentemente outras ciências, como a Química e a Física [4]. Introdução 5 Esta área através da perícia contribui para a prevenção e reabilitação/reintegração/reinserção [6]. A Medicina Legal tem como principal objetivo auxiliar o direito na aplicação da justiça, através da prestação de serviços [6]. 1.3. Medicina Legal como Disciplina Multidisciplinar Existem várias áreas de atuação da Medicina Legal, designadamente, a medicina forense (incluí a tanatologia forense, clínica médico-legal e psiquiatria forense) e outras ciências forenses (incluí a toxicologia forense, genética e biologia forense, anatomiapatológica forense, psicologia forense, criminalística, antropologia forense e odontologia forense, etc.) [6]. Em Portugal o serviço nacional de Medicina Legal organiza-se em torno do Instituto de Medicina Legal. Existem diferentes delegações (Coimbra, Lisboa e Porto) e gabinetes médico-legais, onde é desenvolvida a atividade pericial. Os gabinetes médicolegais apenas realizam atividades periciais no âmbito da Clínica médico-legal e da Tanatologia Forense. No caso das delegações, estas abrangem vários serviços, tais como [6]: O serviço de Tanatologia Forense, ao qual compete a realização de autópsias médico-legais e a realização de outros atos neste domínio, designadamente, identificação de cadáveres e restos humanos, estudo de peças anatómicas e embalsamamento. O serviço de Clínica médico-legal, ao qual compete a realização de perícias e exames em pessoas nos diversos domínios do direito (penal, civil e do trabalho), para a descrição e avaliação dos danos provocados na integridade psico-física. O serviço de Psiquiatria Forense, ao qual compete a realização de perícias e exames psicológicos e psiquiátricos solicitados à delegação. O serviço de Genética e Biologia Forense, ao qual compete a realização de perícias e exames laboratoriais, de hematologia forense e de outros vestígios orgânicos, tais como os exames de criminalística biológica, investigação biológica de filiação, entre outros. O serviço de Anatomia Patológica Forense, ao qual compete a realização de perícias e exames de anatomia patológica forense. Introdução 6 O serviço de Toxicologia Forense, ao qual compete a realização de perícias e exames laboratoriais toxicológicos e químicos, que se desenvolverá mais aprofundadamente de seguida. Introdução 7 2. TOXICOLOGIA A toxicologia (do grego toxikon - veneno das flechas) é a ciência que estuda os xenobióticos e/ou endobióticos, os seus mecanismos de ação e os efeitos tóxicos que estes provocam. Esta ciência tem como principal objetivo a identificação e quantificação dos efeitos adversos associados com a exposição a determinados agentes, que possuem a designação de tóxicos [7]. Um tóxico/veneno é qualquer composto químico com capacidade de produzir efeitos nocivos ou mesmo a morte de um sistema biológico, visto que alteram elementos bioquímicos essenciais para a vida [3]. Os tóxicos são normalmente substâncias químicas de origem orgânica ou inorgânica que podem associar-se a alguns agentes físicos ou a outras condições. O estudo destes compostos e das suas intoxicações permite estabelecer um limite de segurança, para que os meios biológicos possam interagir com os mesmos [7]. Os tóxicos podem ser classificados segundo vários critérios. Em toxicologia Clínica existem 7 grupos de tóxicos. Esses grupos dividem-se em gases, substâncias orgânicas termolábeis, substâncias voláteis, metais ou metalóides, pesticidas, aniões, e outras substâncias mais específicas [7]. A evolução histórica da toxicologia pode ser dividida em várias fases. Inicialmente o Homem descobriu os tóxicos existentes na natureza com a descoberta de animais e plantas tóxicas. A primeira aplicação da toxicologia ocorreu quando os tóxicos foram utilizados como arma de caça. Os Índios e os Egípcios deixaram referências e algumas marcas da utilização de tóxicos e também dos seus antídotos [8]. Na civilização Grega os venenos eram utilizados como arma de execuções em suicídios e homicídios. Um exemplo dessa situação é a famosa morte de Sócrates em 339 a.C., descrita por Platão, que morreu envenenado por um extrato de cicuta [9]. Em Roma, oito anos depois, ocorreu uma intoxicação em massa [3]. Durante a Idade Média existiam diversos envenenadores profissionais que ofereciam os seus serviços aos mais poderosos. Este uso abusivo dos venenos levou a que fosse criada a lei de Lucio Cornelio, que através do envenenamento castigava os crimes com morte [9]. Introdução 8 A cicuta, o acónito, o ópio, a beladona, o arsénio e os corrosivos eram os venenos mais utilizados na altura [8]. Até ao séc. IX acreditava-se que um corpo negro, azul, pontilhado ou com odor desagradável indicava que a sua morte seria causada por envenenamento. Outro dos mitos passava por queimar os corações humanos e, caso estes não ardessem, indiciava a presença de veneno. Também nessa altura acreditava-se que um cadáver não sofreria decomposição quando a causa de morte de um indivíduo fosse envenenamento [8]. No séc. XIV, Paracelsus citou a célebre frase “Todas as substâncias são venenos, não existe uma que não seja veneno. Somente a dose certa diferencia um veneno de um remédio”. No séc. XVIII, o físico alemão Hermann Boerhoave foi o primeiro a desenvolver um método químico que determinasse a presença de um tóxico [8]. Durante este mesmo século, o veneno deixou de ser usado como arma apenas pelos mais nobres, e passou a ser utilizado por todas as classes sociais [9]. Mathieu Orfila, o “pai da toxicologia”, em 1814, publicou a primeira abordagem ao estudo da natureza química e fisiológica dos tóxicos, o Tratado dos Venenos [8]. Em 1828, fez a disciplina académica com o lançamento da sua obra Traité dês poisons tires mineral, vegetal et animal ou toxicologie general sous les rapports de la patologie et la Médecine Légale [9]. Foi durante a Segunda Guerra Mundial que se tornaram mais conhecidos os mecanismos de toxicidade das substâncias. Após a Segunda Guerra Mundial surge a Toxicologia Moderna. 2.1. Toxicologia Moderna A Toxicologia Moderna difere da toxicologia tradicional por expandir de uma forma significativa o seu campo de ação e a sua zona de interesses. Nesta área, é muito importante o conhecimento da fisiopatologia, visto que permitirá realizar um melhor diagnóstico e um tratamento adequado [3]. A Toxicologia Moderna é constituída por quatro áreas principais: clínica, forense, reguladora e de investigação. Consoante a área de atividade podem ser subdivididas em Ecotoxicologia, Toxicologia Alimentar, Toxicologia Clínica, Toxicologia Experimental, Introdução 9 Toxicologia Forense, Toxicologia Industrial, Toxicologia dos Medicamentos, Toxicologia Ocupacional e Toxicologia Regulamentadora [7]. 2.2. Toxicologia Forense Uma das áreas da Medicina Legal é a Toxicologia Forense. Esta área está inserida no âmbito da toxicologia analítica. O principal objetivo da Toxicologia Forense é a deteção e quantificação de substâncias tóxicas [7]. Atualmente a população está em constante perigo pois tem á sua disposição vários venenos e toxinas. É por isso, importante reconhecer, identificar e quantificar o risco relativo da exposição humana a agentes tóxicos. Assim, a Toxicologia Forense utiliza conhecimentos de todas as áreas da Toxicologia Moderna [7]. Esta área da Medicina Legal dedica-se ao estudo de casos de dependência de sustâncias de abuso, alimentos contaminados por substâncias tóxicas, doping, gases letais (designadamente o monóxido de carbono), venenos, entre outras questões importantes relacionadas com a área [4]. As intoxicações podem ser criminais, legais (pena de morte), acidentais (alimentares, mordedura de animais, medicamentosas) ou voluntárias (toxicodependência) [7]. Segundo a velocidade de desencadeamento de ações ou efeitos dos tóxicos, as intoxicações podem ser agudas, sub-agudas e crónicas [7]. Introdução 16 Alguns estudos afirmam que um indivíduo que se encontre exposto a baixas concentrações de cádmio pode vir a desenvolver doenças ósseas, tais como osteoporose e fraturas [13]. Por estas razões, devem ser tomadas medidas para reduzir a exposição das populações a este metal, de forma a minimizar os riscos dos efeitos adversos para a saúde [13]. 5.3. Stress Oxidativo do Cádmio O cádmio, por si só, é incapaz de formar radicais livres de forma direta, contudo, segundo Jomova et al., este pode formar indiretamente ROS (reactive oxygen species) e RNS (reactive nitrogen species), envolvendo os radicais superóxido, hidroxilo e o óxido nítrico [17]. Como já foi referido, o cádmio pode produzir de maneira indireta a formação de radicais livres, isto ocorre porque este metal substitui o ferro e o cobre por várias proteínas de membrana e citoplasmáticas (por exemplo, a ferritina e a apoferritina), aumentando assim a quantidade de cobre e iões de ferro que participam no stress oxidativo através de reações de Fenton [17, 19]. O aumento da toxicidade induzida pelo cádmio pode ser explicado pelo deslocamento do cobre e ferro. O cobre, deslocado do seu local de ligação é capaz de catalisar a repartição de peróxido de hidrogénio através da reação de Fenton [17]. Este metal é capaz de induzir stress oxidativo, uma vez que inibe enzimas antioxidantes, como por exemplo, catalase, glutationa-peroxidase (GPx), glutationaredutase (GSR) e superóxido dismutase (SOD), através da interação com os grupos tiol [19]. O cádmio pode ativar também proteínas cinases C que provocam a fosforilação de vários fatores de transição, que por sua vez levam à ativação da expressão do gene alvo [17]. Apesar dos mecanismos tóxicos do cádmio não se encontrarem bem esclarecidos, sabe-se que este atua intracelularmente e provoca lesões através da formação de radicais livres. Estas lesões afetam principalmente os pulmões, rins, ossos, coração, sistema nervoso central e órgãos reprodutores [17]. Introdução 17 Alguns marcadores de stress oxidativo em tecido cardíaco de ratos expostos ao cádmio demostraram um aumento significativo de lipoperóxidos e, em simultâneo, uma diminuição da atividade das enzimas SOD e GPx. A nível da atividade da catalase não foram observadas alterações. Observou-se também uma diminuição dos níveis de glucose e um aumento de lípidos no tecido cardíaco. As atividades da alanina aminotransferase (ALT) e do aspartato aminotransferase (AST) diminuíram, isto reflete-se numa diminuição da degradação da proteína metabólica e um aumento da atividade do lactato desidrogenase (LDH). A exposição ao cádmio altera as vias metabólicas referidas anteriormente. Em particular, a formação de Cd2+ induzida através de ROS provoca alterações nas vias metabólicas do coração [17]. O testículo é um bom marcador de exposição ao cádmio, visto que este metal provoca lesões e necrose testicular. Têm sido realizados alguns estudos em modelos de ratos para avaliar a toxicidade testicular induzida por este metal. Nestes estudos foi possível observar um aumento de malondialdeído (MDA) e GPx, tal como uma diminuição da atividade da enzima SOD nos grupos expostos. Verificou-se também um aumento do número de células com quebras na cadeia simples de DNA e lesões celulares [17]. 5.4. Carcinogénese do Cádmio O cádmio foi designado carcinogéneo humano (grupo I) pela Agência Internacional de Pesquisa de cancro e pelo Programa Nacional de Toxicologia [15, 20]. Vários estudos epidemiológicos têm relacionado a exposição ao cádmio com o desenvolvimento de cancro do pulmão, próstata, rins e pâncreas. De facto, em indivíduos fumadores a probabilidade de virem a desenvolver cancro, quando expostos a este metal, aumenta [17]. Atualmente, estudos revelam que o efeito mutagénico direto do cádmio é fraco, no entanto é suficiente para induzir tumores se combinado com outros efeitos prócancerígenos deste metal, tais como; formação de ROS, interferência com enzimas antioxidantes, inibição de enzimas de reparo de DNA, desregulação da proliferação celular, interferência com os mecanismos pró e anti-apoptóticos e rutura da adesão celular [21]. Sabe-se ainda, que o cádmio (Cd2+) pode causar cancro renal através da interrupção do complexo E-caderina/β-catenina. Outro fator que contribui para o seu efeito carcinogénico é a desregulação da adesão da E-caderina e alterações ao nível da sinalização Wnt (wingless-type MMTV integration site family) / β-catenina [21]. Introdução 18 A Wnt é uma cascata de sinalização canónica que é segregada para ativar processos de sinalização de controlo da proliferação celular. Em situações normais, controla o comportamento celular ao promover a ligação ao DNA de proteínas ativadoras da transcrição pertencentes às famílias TCF (T cell factor) e Lef-1 (lymphoid enhancer factor-1). As proteínas Wnt induzem a estabilização da βcatenina citosólica que se liga ao TCF/Lef-1 no núcleo, ativando a expressão de genes alvo específicos. A proteína βcatenina tem duas funções, primeiro como uma molécula de sinalização da via Wnt, e segundo como uma proteína estrutural em junções aderentes. As caderinas são glicoproteínas dependentes do Ca2+ responsáveis pela adesão de algumas células do nosso organismo. A rutura da adesão da E-caderina em tecidos normais, provoca paragem do crescimento e morte celular [21]. Um acontecimento precoce relacionado com a nefrotoxicidade de iões de cádmio (Cd2+) é a alteração das propriedades das junções apertadas e junções aderentes. Isto ocorre, muito provavelmente, devido ao deslocamento de Ca2+ que interrompe a interação homofílica da E-caderina. Estes acontecimentos provocam a perda de integridade da adesão célula-célula, a diminuição da resistência transepitelial e um aumento da permeabilidade celular [21]. Assim, a rutura da adesão célula-célula induzida pelo cádmio pode desempenhar um papel muito importante na formação de um tumor [17]. Segundo Chakraborty et al., o Cd2+ ativa a via de sinalização Wnt em células renais e induz a transcrição de genes alvo que são mediados pela via Wnt. Os efeitos do Cd2+ dependem da densidade celular e do seu estado de proliferação. A indução da via Wnt pelo Cd2+ ocorre, não só através da translocação da β-catenina para o núcleo, mas também através do aumento da expressão do fator de transcrição TCF4 (T Cell Factor 4) [21]. Em suma, o Cd2+ pode facilitar a carcinogénese em células renais, através da indução da via de sinalização Wnt que, por sua vez, promove a proliferação e sobrevivência das células pré-neoplásicas [21]. Introdução 19 6. MERCÚRIO 6.1. Origem e exposição de Mercúrio O mercúrio (Hg) é um metal pesado com número atómico 80 e massa atómica 200,59. À temperatura ambiente é líquido e inodoro, contudo pode evaporar e libertar vapores tóxicos a temperaturas mais elevadas. Este metal existe em baixas concentrações na crosta terrestre [20]. O mercúrio pode ser encontrado em diversas formas, tais como, metálico (Hg0), orgânico (metilmercúrio, etilmercúrio ou fenilmercúrio) e inorgânico, e em diferentes estados de oxidação (0, +1,+2) [22]. Nos tempos mais primórdios, o mercúrio era utilizado pelos Romanos na forma de pomada para aliviar as dores dentárias em crianças. Na Grécia antiga este era utilizado como cosmético para clarear a pele. Mais tarde, a sua principal utilidade era como remédio para o tratamento da sífilis. Os compostos de mercúrio também podem ser utilizados como diuréticos [13]. Atualmente, o mercúrio é utilizado na extração do ouro, amálgamas dentárias, termómetros, barómetros e instrumentos para medir a pressão arterial [20]. A sua vasta aplicação a nível industrial faz com que aumente o risco de exposição ocupacional e acidental [23, 24]. O ser humano encontra-se exposto às duas formas orgânicas do mercúrio, nomeadamente, ao metilmercúrio (CH3Hg+), e etilmercúrio (CH3CH2Hg+), através do consumo de peixe contaminado, amálgamas dentárias e certas vacinas [23, 25]. Em termos de exposição ocupacional os médicos dentistas são o grupo exposto a maiores concentrações de mercúrio [13]. A exposição ocupacional a este metal ocorre principalmente através da via inalatória. Após a inalação cerca de 70 – 80 % do vapor de mercúrio é retido e absorvido. Apenas uma parte deste metal vai para o trato gastrointestinal e menos de 10 % é absorvido [20]. Em termos de exposição não ocupacional, a população em geral encontra-se exposta a este metal através da alimentação. A exposição ao mercúrio não apresenta riscos significativos para a população, com a exceção de certos grupos que consome uma elevada quantidade de peixe [13]. Os níveis de exposição não ocupacional são geralmente mais baixos que os níveis de exposição ocupacional [20]. Introdução 20 A natureza também liberta grandes quantidades de mercúrio através da atividade vulcânica, fogos florestais e fontes termais [25]. O mercúrio é uma substância tóxica ambiental que está correlacionada com a toxicidade no cérebro [15]. Este metal apresenta um elevado risco para o feto, por esta razão as mulheres grávidas devem evitar uma grande ingestão de certos peixes como o tubarão, peixe-espada e o atum, pois estes contêm elevadas concentrações de mercúrio [13]. Os compostos inorgânicos do mercúrio podem ser pesquisados na urina. No caso do metilmercúrio (orgânico) o sangue é a amostra ideal. Para pesquisa de uma exposição a longo prazo, o cabelo é a amostra preferencial, no entanto é necessário ter em conta possíveis contaminações externas [13]. 6.2. Efeitos na saúde do Homem Em baixas concentrações, o mercúrio pode induzir stress oxidativo e citotoxicidade celular. Mercúrio Inorgânico A maior fonte de exposição ao mercúrio inorgânico são as amálgamas dentárias[1]. Uma exposição aguda ao mercúrio pode provocar lesões graves a nível dos pulmões. No caso de uma intoxicação crónica podem surgir alguns sintomas neuro psicológicos, tais como tremores, agitação, ansiedade, alterações da personalidade, distúrbios do sono e depressão. Estes sintomas são reversíveis após cessação da exposição [13]. O mercúrio metálico é um alergénio que pode causar eczema de contato, e líquen oral (proveniente das amálgamas dentárias). Para além disso pode provocar, também, lesões a nível dos rins [13] Após uma exposição intensa a vapores de mercúrio metálico podem ocorrer lesões pulmonares. No caso de ingestão de mercúrio pode ocorrer necrose gastrointestinal e nos túbulos renais [20]. Introdução 21 O mercúrio inorgânico tem menos capacidade que o metilmercúrio para atravessar a barreira placentária, no entanto acumula-se no líquido amniótico em concentrações mais elevadas [23]. Mercúrio Orgânico Como já foi referido anteriormente a população em geral encontra-se exposta às duas formas orgânicas do mercúrio, o metilmercúrio e o etilmercúrio. Através da ação de microrganismos (bactérias metanogénicas) o mercúrio inorgânico pode ser convertido em metilmercúrio e dimetilmercúrio. O metilmercúrio é muito estável e acumula-se na cadeia alimentar aquática através de um fenómeno denominado de bioamplificação. Este fenómeno significa que à medida que os níveis tróficos aumentam a concentração do metal também aumenta [23]. A única fonte de exposição ao metilmercúrio, nos humanos, é o consumo de peixe contaminado [23, 25]. O metilmercúrio é absorvido quase na sua totalidade no trato gastrointestinal e é distribuído pela maior parte dos tecidos. Os compostos de metilmercúrio são excretados na bílis e intestino. O restante é biotransformado em compostos inorgânicos e excretado através das fezes. Estes compostos podem passar para o feto através do leite materno, pois também são excretados por esta via [20]. Nos seres humanos os compostos de metilmercúrio têm um intervalo biológico de aproximadamente 2 meses [20]. O metilmercúrio é lipossolúvel e penetra rapidamente o sistema nervoso. O indivíduo inicialmente começa por sentir parestesias e dormência nas mãos e nos pés, de seguida os sintomas desenvolvem para dificuldades de coordenação e auditivas. Em doses elevadas pode levar à morte cerca de 2 a 4 semanas após o inicio da exposição [13]. O sistema nervoso é o principal alvo do metilmercúrio. Para além disso, os compostos orgânicos podem, também, afetar o sistema imunitário e os rins [1]. Alguns estudos referem que o metilmercúrio pode estar relacionado com algumas doenças cardiovasculares [23]. O sangue e o cabelo são amostras utilizadas para realizar a monitorização da exposição a compostos de metilmercúrio [20]. O etilmercúrio é quimicamente semelhante ao metilmercúrio, e ambos têm efeitos tóxicos para o cérebro. No entanto, existem diferenças entre eles, a metabolização do Introdução 22 etilmercúrio em mercúrio orgânico é mais rápida, e o etilmercúrio é menos potente que o metilmercúrio [25]. Este composto não provoca lesões a nível dos rins e tem um curto tempo de semi-vida no organismo [25]. 6.3. Carcinogénese do Mercúrio O mercúrio e os seus compostos são classificados de cancerígenos humanos, capazes de afetar a saúde humana através da exposição ambiental e ocupacional. Contudo, a capacidade deste metal em provocar carcinogénese e produzir efeitos genotóxicos não se encontra totalmente esclarecida na literatura. Alguns estudos revelam que em testes genotóxicos foram detetadas mutações tanto ao nível cromossómico como ao nível génico. Estas mutações são responsáveis pelo aparecimento de tumores e doenças hereditárias. Estudos laboratoriais efetuados em plantas e animais constataram que o mercúrio tem capacidade de inibir a formação do fuso mitótico, levando a uma distribuição anormal dos cromossomas e consequente poliploidia. Esta é a ação mais comum a nível genético dos compostos de mercúrio, devido à forte afinidade do mercúrio para os grupos sulfidrílo presentes nas proteínas do fuso. Outros estudos revelam que o mercúrio tem também capacidade para produzir radicais livres, via peroxidação lipídica, em organismos vivos. Existem diversas evidências acerca do efeito deste metal a nível do DNA [25]. Sabe-se, também, que a toxicidade do mercúrio pode produzir um aumento dos níveis de glutationa, sugerindo que esta atue como uma defesa celular importante contra a toxicidade deste metal. Outras substâncias antioxidantes, como por exemplo, o ácido ascórbico, têm também uma função protetora contra este tóxico [19]. Sabe-se também que o selénio (Se), afeta a distribuição do mercúrio reduzindo a sua toxicidade. O selénio possui algumas selenoproteínas que tem funções enzimáticas importantes, e o selénio plasmático juntamente com o mercúrio inorgânico forma um complexo insolúvel que se liga à selenoproteína-P. Esta ligação pensa-se que possa prevenir a absorção/captação do mercúrio pelos rins. A selenoproteína-P aparenta atuar como defesa antioxidante, transporte do selénio, e protetor como quelante natural de metais pesados [26]. Introdução 23 7. CHUMBO 7.1. Origem e exposição do Chumbo O chumbo (Pb) é um metal pesado com número atómico 82. Este possui invulgares propriedades físicas e químicas (baixo ponto de fusão, ductilidade e facilidade de formar ligas) que, aliado à sua fácil extração o torna num dos metais mais usados pelo Homem [17, 27]. As suas primeiras aplicações foram em materiais de construção, pigmentos para vidros de cerâmica, condutas de água, recipientes para cozinhar e armazenar alimentos, tintas e como adoçante na produção de vinho [13]. O chumbo é um metal tóxico para os seres humanos e animais, e pode acumularse no ambiente (água, solo, poeiras, entre outras) durante um longo período de tempo [17]. Durante os últimos 5 milénios devido ao extenso processamento de minérios de chumbo, foram libertados para o ambiente cerca de 300 milhões de toneladas deste metal [28]. Mais de 50% das emissões de chumbo são provenientes da gasolina. No entanto, nas últimas décadas, nos países desenvolvidos as emissões de chumbo diminuíram significativamente, devido à introdução da gasolina sem chumbo. Consequentemente, os níveis de chumbo de sangue diminuíram na população em geral [13]. As emissões de chumbo para o ambiente estão relacionadas com os transportes rodoviários, o que faz com que este metal se encontre distribuído uniformemente pelo espaço. A população em geral encontra-se exposta a este metal através da alimentação e de poeiras que se encontram no ambiente [13]. Aproximadamente 50% do chumbo inorgânico inalado pode ser absorvido pelos pulmões [13]. No caso das crianças, estas são particularmente sensíveis à exposição a este metal, devido á sua elevada absorção gastrointestinal (40-50%), e pelo facto de possuírem uma barreira hemato-encefálica permeável [13]. Nos adultos a absorção gastrointestinal deste metal é de cerca de 3-10% e o chumbo inorgânico é incapaz de penetrar a barreira hemato-encefálica [17]. Na absorção intestinal, o chumbo compete com o ião cálcio (Ca2+), por esta razão uma deficiência de ferro na alimentação aumenta a absorção de chumbo pelo trato gastrointestinal. O chumbo no organismo liga-se às proteínas dos eritrócitos (90%) e é distribuído pelos tecidos moles e ossos. Os ossos são o principal reservatório deste metal no organismo. A sua eliminação é lenta e ocorre Introdução 24 principalmente através da via urinária [29]. O tempo de semi-vida do chumbo no sangue é cerca de 1 mês e no esqueleto cerca de 20-30 anos [13]. 7.2. Efeitos na saúde do Homem O chumbo é uma substância tóxica que pode provocar doenças a nível do sistema neurológico, hematológico, gastrointestinal, reprodutor, circulatório e imunológico [30]. O quadro clínico de um indivíduo intoxicado com chumbo pode ser dividido em duas categorias, consoante a duração da exposição. Pode ser uma intoxicação aguda que se manifesta com aminoacidúria, glicosúria, hiperfosfatemia, anemia hemolítica (o chumbo diminui o tempo de vida dos eritrócitos e perturba a síntese da hemoglobina), gota e encefalopatia; ou intoxicação crónica que se manifesta com nefrite túbulo intersticial e diminuição da função renal. As intoxicações crónicas por chumbo denominam-se saturnismo [31]. Normalmente, as intoxicações por chumbo podem ser diagnosticadas através de níveis elevados deste metal no sangue. Níveis sanguíneos iguais ou superiores a 10g/dL são considerados tóxicos e podem originar distúrbios neurológicos, deficiências cognitivas, hipertensão, entre outros [17]. O chumbo induz a produção de radicais livres que inativam, em células endoteliais, os mediadores vasodilatadores, tais como o óxido nítrico (NO). Este efeito pode explicar o aparecimento de hipertensão em intoxicações por chumbo [32]. Os sintomas de intoxicações por chumbo são dores de cabeça, tonturas, irritabilidade, perda de memória, dores abdominais, sabor metálico na boca, e vários sintomas relacionados com o sistema nervoso. A encefalopatia provocada por este metal é caracterizada por falta de sono e inquietação. Em casos mais graves de encefalopatia, o indivíduo pode desenvolver psicose aguda e confusão. No caso de crianças expostas ao chumbo, estas podem sofrer distúrbios no comportamento e aprendizagem, e apresentarem dificuldades de concentração. Existem evidências que alguns fatores genéticos e ambientais podem contribuir para o aumento dos efeitos do chumbo no desenvolvimento neurológico das crianças, aumentando assim a sua neurotoxicidade [13]. Sabe-se que a exposição aguda a este metal pode causar nefrotoxicidade, nomeadamente a nível dos túbulos proximais renais. Alguns estudos em ratos, observaram para além de nefrotoxicidade, glicosúria, aminoaciduria, hematúria, stress Introdução 25 oxidativo e perda de microvilosidades. O chumbo liga-se a proteínas de baixo peso molecular numa proporção inferior a 1%. Por esta razão, é filtrado livremente no glomérulo e é reabsorvido nas células tubulares proximais através de endocitose. Uma vez dentro das células, o chumbo provoca lesões mitocondriais, desacopla a cadeia respiratória, esgota as reservas de antioxidantes, stress oxidativo e apoptose. Alguns estudos demonstraram que o chumbo aumenta os processos pró-inflamatórios através do fator nuclear kappa B (NFκB), que por sua vez dentro do rim ativa o sistema renina angiotensina, que assim ativa os macrófagos, gerando-se um processo inflamatório intersticial no rim [31]. Sabe-se que trabalhadores que se encontrem expostos a este metal têm uma frequência mais elevada de infertilidade, abortos, natimortos, abortos espontâneos e diminuição do líbido [30]. 7.3. Stress Oxidativo do Chumbo Semelhantemente a outros metais o chumbo provoca lesões celulares, uma vez que induz stress oxidativo às células. A exposição a este metal provoca alterações nos marcadores de stress oxidativo, nomeadamente, catalase, SOD, GPx e GSR [19]. O efeito patogénico deste metal é muito variado, visto que este interrompe a atividade de enzimas, inibe competitivamente a absorção de alguns minerais importantes, liga-se às proteínas com grupos sulfidrilo (interrompe a síntese de proteínas estruturais), altera a homeostase do cálcio e reduz os níveis de reservas antioxidantes sulfidrilo disponíveis no organismo [30]. Os radicais livres induzidos pelo chumbo podem causar lesões através de dois mecanismos diferentes que se encontram relacionados. O primeiro mecanismo diz respeito à formação direta de ROS (oxigénio singleto, peróxido de hidrogénio, radical superóxido e radical hidroxilo). O segundo mecanismo baseia-se na redução direta das reservas antioxidantes. Em todos os sistemas biológicos, quando a produção de ROS aumenta, as reservas antioxidantes esgotam-se [17, 30]. A maioria das intoxicações por chumbo interferem com o metabolismo da glutationa, nomeadamente provocam alterações a nível da glutationa reduzida [17]. Para além de atuar como um antioxidante para eliminar radicais livres, a glutationa é um substrato importante que tem um papel crucial no metabolismo de determinados xenobióticos e toxinas através da conjugação da glutationa no fígado [19]. Introdução 32 9. TERRAS RARAS 9.1. Origem e exposição de Terras Raras As terras raras ou lantanídeos (Ln) são metais que fazem parte do grupo II da tabela periódica. Estes têm números atómicos sucessivos do 57 ao 71, sendo: lantânio (La), cério (Ce), praseodímio (Pr), neodímio (Nd), promécio (Pm), samário (Sm), európio (Eu), gadolínio (Gd), térbio (Tb), disprósio (Dy), hólmio (Ho), érbio (Er), túlio (Tm), itérbio (Yb) e lutécio (Lu). As propriedades físico-químicas destes elementos são muito semelhantes, devido à sua configuração eletrónica. O ítrio (Y) e o escândio (Sc) também são considerados terras raras pois possuem características físico-químicas muito semelhantes. As terras raras podem ser divididas em elementos leves e pesados. Os elementos leves (La ao Eu) têm uma massa atómica menor, por outro lado os elementos pesados (Gd ao Lu) têm uma massa atómica maior. As terras raras são então constituídas por 17 elementos semelhantes entre si na química elementar. A designação “terras raras” provém do aspeto terroso dos óxidos destes elementos e não da raridade da sua existência [40]. Vários estudos geológicos têm mostrado que estes elementos existem abundantemente na crosta terreste, por exemplo, o cobalto é menos comum que o cério, o ítrio é mais abundante que o chumbo e o lutécio é tão comum como a prata e o mercúrio. As terras raras estão presentes em vários minerais, tais como fluoretos, halogenetos, óxidos, carbonatos, fosfatos e silicatos, com especial incidência em granitos, pegmatitos e rochas metamórficas. Sabe-se que existem cerca de 250 tipos de minerais que possuem terras raras na sua constituição [41]. A utilização das terras raras a nível mundial tem aumentado, devido às suas propriedades espectroscópicas e magnéticas, sendo estas utilizadas nas mais diversas áreas, tais como, indústria, agricultura e medicina. Por exemplo, o ítrio é utilizado em supercondutores e na tecnologia laser; o cério em conversores catalíticos de carros; o lantânio em lentes de câmaras e telescópios (os compostos que contenham lantânio são também utilizados em iluminação de estúdios e na projeção em cinemas); o neodímio em alto-falantes e em discos rígidos; o praseodímio para criar motores de aviões; o gadolínio em raios – X, sistemas de digitalização de imagens de ressonância magnética e em televisões; o ítrio, térbio e európio são utilizados Introdução 33 na indústria de televisores, em ecrãs de computadores e em outros dipositivos; e o európio no controlo de reatores nucleares [41]. Em diversos países, as terras raras estão também a ser utilizadas na agricultura como fertilizantes, diretamente no solo, na parte aérea das plantas, nas sementes e como solução aquosa com elementos misturados ou individualmente. Por estas razões estes elementos são um potencial perigo para a saúde ambiental e ocupacional [41]. Na medicina, a sua principal aplicação são as sondas espectroscópicas no estudo de biomoléculas e como diagnóstico não invasivo (este serve de agente contraste em imagens de ressonância magnética). Estes elementos são extremamente importantes na área da imunologia, visto que são utilizados para a realização do diagnóstico clínico, entre outras, nomeadamente, como marcadores luminescentes com importância para a investigação de enzimas, anticorpos e células. Devido ao aumento de aplicações das terras raras, o risco destes elementos incorporarem-se nos seres vivos aumentou consideravelmente. A produção de terras raras têm consequências negativas para os organismos aquáticos, terrestres e para o ser humano, o que pode colocar em risco a saúde pública. Por exemplo, a refinação de uma tonelada de óxido de terras raras pode produzir cerca de 1,4 toneladas de resíduos radioativos. As principais vias de exposição a terras raras são: inalação de poeiras no local de trabalho, ingestão de géneros alimentícios e contacto com produtos industriais ou agentes medicinais (por via oral, venosa, ou através de feridas de queimaduras) que contenham estes elementos. A principal via de exposição acidental para os humanos, é a inalação de partículas transportadas através do ar que contenham lantanídeos.[42]. A principal via de incorporação destes compostos em trabalhadores expostos é também a via inalatória, através da inalação de aerossóis que contenham estes elementos. Uma vez que os lantanídeos afetam os processos metabólicos do ser humano é importante que sejam seguidos parâmetros de segurança no local de trabalho. Uma ventilação inadequada no local de trabalho, falta de higiene por parte dos trabalhadores, bem como a ausência ou uso inadequado de proteções individuais, tais como máscaras, aumentam a probabilidade de exposição, e o risco do aparecimento de doenças pulmonares [41]. Introdução 34 9.2. Efeitos na saúde do Homem Segundo o sistema de classificação de Hodge-Sterner, as terras raras são consideradas substâncias de baixa toxicidade. A sua toxicidade depende da forma química e da via de exposição. Devido à acumulação de partículas de terras raras, a exposição crónica é mais grave que a exposição aguda [42]. Alguns estudos em ratos mostraram que a ingestão oral de terras raras, não causa efeitos genotóxicos, carcinogénicos e teratogénicos. Por outro lado, quando se trata de aplicação intravenosa, os resultados foram contrários. No entanto são necessários estudos mais aprofundados acerca do seu mecanismo de patogenicidade, visto que não se sabe ao certo as células alvo específicas envolvidas durante estes processos. Por esta razão, alguns dos seus efeitos, tal como a indução de neoplasias, podem ou não ser provocadas exclusivamente pelas terras raras, e tal facto, deve ser tido em consideração [42]. Muitos estudos sugerem que as terras raras têm capacidade para acumularem-se no aparelho respiratório. A exposição ocupacional a poeiras de terras raras são consideradas citotóxicas para o tecido pulmonar, e portanto estão intimamente relacionadas com o aparecimento de enfisema, pneumonia, bronquite e fibrose pulmonar progressiva ou pneumoconiose. O potencial poder patogénico dos lantanídeos inalados depende do tipo e fórmula química dos materiais, dose e duração da exposição. A pneumoconiose provocada por terras raras é uma doença pulmonar de longo prazo que pode surgir devido à exposição do Homem, por exemplo, ao fumo de lâmpadas de arco de carbono. As partículas granulares finas de poeiras que contenham elementos de terras raras (principalmente cério), vão-se acumular no aparelho respiratório, provocando doenças intersticiais, enfisema e obstruções graves, levando a uma diminuição da capacidade de difusão do monóxido de carbono. A deposição destas partículas nos pulmões podem ser detetadas por um longo período de tempo, por exemplo através de raios-X, que normalmente apresentam algumas mudanças visíveis. No entanto, os indivíduos que têm esta patologia não apresentam sintomas. No primeiro caso descrito na literatura acerca de pneumoconiose provocada pela exposição a terras raras, o diagnóstico foi realizado através da lavagem broncoalveolar que continha níveis anormais de La, Ce, Nd, Sm, Tb, Yb e Lu [41, 42]. No caso do fígado, este órgão retém uma considerável quantidade de terras raras que provocam efeitos hepatotóxicos. Alguns estudos demonstraram que após a injeção de terras raras a atividade de enzimas específicas do fígado, nomeadamente, ALT e AST aumentaram, e voltaram à normalidade ao fim de 6-10 dias. Também ocorreu necrose Introdução 35 hepática após a injeção subcutânea e intravenosa. No entanto, a lesão hepática mais evidente após injeção intravenosa é o fígado gordo (acumulação de gordura nas células do fígado). Antes de induzir o fígado gordo, as terras raras aumentam as concentrações plasmáticas dos ácidos gordos livres e diminuem os níveis de colesterol e fosfolípidos. Estes mecanismos ainda não se encontram totalmente compreendidos, mas segundo as propriedades bioquímicas dos lantanídeos, presume-se que estes aumentam a retenção hepática de triglicéridos do plasma, e diminuem a oxidação dos lípidos através das mitocôndrias hepáticas, bem como reduzem a síntese hepática e a secreção de lipoproteínas [42]. Sabe-se que no fígado, o gadolínio inibe seletivamente a secreção através das células de Kupffer, e diminui a atividade do citocromo P450 nos hepatócitos, protegendo assim as células hepáticas dos produtos tóxicos resultantes da biotransformação dos xenobióticos. O ião praseodímio (Pr3+) é semelhante ao gadolínio pois também protege os tecidos do fígado [41]. Os lantanídeos também provocam efeitos a nível da estrutura óssea, estes podem associar-se tanto à parte orgânica como à parte inorgânica do osso [42]. A longo prazo, um consumo de doses baixas de terras raras pode levar, a que estas substâncias se acumulem na estrutura óssea, provocando alterações a nível do tecido ósseo, aumento da taxa de micronúcleos, bem como genotoxicidade das células da medula óssea [41]. Swanson e Truesdale (1971) descobriram que lentes humanas com cataratas contêm uma concentração mais elevada de lantânio em comparação com lentes saudáveis. Por conseguinte, pensa-se que os lantanídeos desempenham um papel importante no desenvolvimento da doença de cataratas [42]. Os lantanídeos exercem diversas ações sobre a maior parte das células nervosas. Contudo, estes elementos são incapazes de penetrar o sistema nervoso central, visto que não atravessam a barreira hematoencefálica [42]. Sabe-se que os iões lantanídeos, em específico, La3+ e Gd3+, bloqueiam diferentes canais de cálcio de células humanas e animais. Os iões Dy3+ e La3+ bloqueiam as transportadoras de Ca2+ ATPase e Mg2+ ATPase, enquanto Eu3+ e Tb3+ inibem a calcineurina [41]. Em baixas concentrações os iões lantanídeos podem inibir a produção de radicais livres de oxigénio [41]. Também podem ser encontrados níveis anormais de terras raras nas unhas, o que sugere a absorção das mesmas através do pulmão [41]. Introdução 36 O cabelo pode ser utilizado como biomarcador para detetar a presença de terras raras no organismo humano. Alguns estudos revelam que indivíduos que se encontram mais próximos de áreas de mineração de terras raras, contêm uma maior concentração das mesmas no cabelo, em comparação com indivíduos que se encontram em áreas mais distantes [41]. 9.3 Carcinogénese das Terras Raras Alguns estudos têm demonstrado que os lantanídeos podem promover a proliferação celular e induzir apoptose, dependendo das espécies de Ln, concentração e tipos celulares. Os iões destes elementos podem bloquear diferentes canais de cálcio em células humanas, visto que podem substituir ou serem antagonistas do Ca2+ durante reações nucleares, devido à semelhança dos seus raios iónicos. Nos eritrócitos humanos, os catiões de Ln podem ligar-se à membrana, aumentando assim, a permeabilidade celular, que dependendo do composto de Ln vão provocar alterações morfológicas. Introdução 37 10. CABELO COMO AMOSTRA BIOLÓGICA DE ESTUDO Tendo sido o cabelo a amostra biológica utilizada no presente trabalho experimental decidiu-se apresentar breves conceitos importantes acerca da mesma. O cabelo é uma amostra biológica utilizada para a deteção de diversas substâncias químicas há mais um de século atrás [43]. Em 1858, Hoppe publicou os resultados da primeira análise de cabelo, relativas à deteção de arsénio em cadáveres exumados (onze anos após a sua sepultura). Foi durante as décadas de 60 a 70 que o cabelo começou a ser utilizado para avaliar a exposição a metais pesados tóxicos, nomeadamente, arsénio, chumbo e mercúrio. Em algumas figuras históricas, também foram efetuadas análises de cabelo, tais como Ludwing van Beethoven, William Butler Yeats e Napoleão Bonaparte. Durante a colheita de amostras de cabelo, a área de recolha deve ser preferencialmente no meio da cabeça ou na nuca. E esta deve ser realizada de modo a não causar danos estéticos ao indivíduo. Esta matriz tem a vantagem de ser de fácil colheita, transporte e preservação, pois as amostras de cabelo são estáveis por um elevado período de tempo. Para além disso, ao utilizar o cabelo como matriz, é possível obter uma segunda amostra similar e correspondente à amostra colhida inicialmente, caso seja necessário realizar uma análise posterior. No entanto, a maior vantagem do cabelo em relação às restantes matrizes biológicas, é o facto de ter um longo período de deteção dos metabolitos a estudar (meses a anos) [43]. Para além disso, o cabelo permite visualizar o historial de exposição a uma determinada substância, visto que este cresce a uma velocidade razoavelmente constante (0,3-0,4 mm/dia e 0,9 – 1,2 cm/mês) [44]. Quantitativamente o cabelo não é uma via importante de excreção de substâncias químicas, no entanto este pode conter concentrações muito mais elevadas de alguns elementos, em comparação com outros tecidos e fluidos acessíveis. Esta matriz é um indicador da acumulação de certos elementos químicos no tecido celular [45]. Usualmente o cabelo é a amostra utilizada em Toxicologia Forense na determinação de envenenamento, deteção de drogas de abuso, consumo crónico de drogas e violações. Outra aplicação da análise de cabelo é em estudos arqueológicos, pois permite visualizar o estilo de vida dos nossos antepassados. Contudo, esta amostra tem sido alvo de discussões entre a comunidade científica, visto que alguns mecanismos não se encontram bem definidos e esclarecidos, Introdução 38 nomeadamente, os mecanismos de incorporação e deposição de drogas e a variabilidade dos resultados e procedimentos laboratoriais. Apesar disso, vários investigadores têm proposto o cabelo como matriz biológica alternativa para a deteção de substâncias químicas. A discrepância entre os valores das janelas de deteção entre o cabelo, urina e sangue, cerca de 2-4 dias, permite-nos verificar que para obtermos informações de exposição a curto prazo, a urina e o sangue são as amostras preferenciais, pelo contrário, para exposições a longo prazo a amostra ideal é o cabelo. Introdução 39 11. STRESS OXIDATIVO E CARCINOGÉNESE DOS METAIS PESADOS Alguns metais pesados como o cádmio, mercúrio, chumbo, arsénio, crómio, níquel e cobalto são classificados como cancerígenos humanos. Contudo, os mecanismos que envolvem a formação de tumores associados a estes metais não se encontram bem esclarecidos [19]. Sabe-se que a exposição crónica a metais pesados aumenta a incidência de cancro em indivíduos expostos. Com a exceção do crómio, a maior parte dos metais são pouco ou nada mutagénicos, no entanto, são a forma mais resistente de poluentes ambientais devido à sua capacidade de se acumularem no ambiente [15]. Quando um indivíduo encontra-se exposto a metais pesados, devido à sua toxicidade, vão-se desenvolver processos de inflamação, que com a continuidade de exposição vão acabar por originar uma inflamação crónica. Esta por sua vez, induz a produção de stress oxidativo que está relacionado com o desenvolvimento tumoral. Estes processos serão desenvolvidos de seguida mais pormenorizadamente. O processo de inflamação é um mecanismo de defesa essencial no nosso organismo, sendo que este processo consiste na resposta fisiológica protetora que ocorre nos tecidos vascularizados na sequência de uma lesão tecidular. Os principais objetivos deste processo são eliminar a causa inicial da lesão celular, remover células necróticas e tecidos, e iniciar o processo de reparação. Além disso, os processos de inflamação são capazes de destruir micróbios, mas também podem causar lesões em tecidos normais. As células inflamatórias sanguíneas que participam no processo inflamatório são os neutrófilos, eosinófilos, monócitos, linfócitos e plaquetas. No entanto também participam neste processo células inflamatórias nos tecidos, nomeadamente, macrófagos, fibroblastos e mastócitos. Quando a inflamação é de duração prolongada (semanas a anos), surge a inflamação crónica, caracterizada por diversas reações, nomeadamente, infiltração de células mononucleares (macrófagos, linfócitos e células plasmáticas), destruição tecidular por células inflamatórias e reparação com angiogénese e fibrose [46]. A inflamação crónica pode surgir através de infeções persistentes por micróbios difíceis de erradicar, doenças inflamatórias imuno-moduladas (doenças de hipersensibilidade), exposição prolongada a agentes potencialmente tóxicos, e no caso de alguns cancros, no qual reações inflamatórias promovem o desenvolvimento do tumor [46]. Introdução 40 Este tipo de inflamação envolve interações complexas entre várias populações de células e os seus mediadores, nomeadamente, macrófagos, linfócitos, eosinófilos, mastócitos e neutrófilos [46]. Os macrófagos são as células dominantes na inflamação crónica. Em todos os tecidos, os macrófagos atuam como filtros para partículas em suspensão, micróbios e diversas células. Os macrófagos teciduais podem ser ativados por diversos estímulos para realizarem várias tarefas. As principais vias de ativação dos macrófagos são a ativação de macrófagos clássica e a alternativa [46]. A ativação dos macrófagos pela via clássica é induzida pelos produtos microbianos (endotoxinas), através de sinais provenientes das células T. Os macrófagos que são ativados por esta via produzem enzimas lisossomais, NO e ROS, que aumentam a sua capacidade para matar organismos ingeridos, e segregam ainda, citocinas que estimulam a inflamação. Estes macrófagos são importantes na defesa do hospedeiro contra os micróbios ingeridos e em diversas reações inflamatórias [46]. Em relação a ativação dos macrófagos pela via alternativa, o seu papel principal é reparar os tecidos danificados, uma vez que estes macrófagos segregam fatores de crescimento que promovem a angiogénese, ativam fibroblastos, e estimulam a síntese de colagénio. Pensa-se que, para responder aos estímulos nocivos, inicialmente, os macrófagos são ativados pela via clássica, com o objetivo de destruir o agente agressor. De seguida é então ativada a via alternativa que inicia a reparação dos tecidos, no entanto, esta sequência não se encontra bem documentada para a maioria das inflamações [46]. Os linfócitos são mobilizados sempre que existem infeções, e são os principais condutores da inflamação em diversas doenças autoimunes e crónicas. A ativação dos linfócitos T e B faz parte da resposta imune adaptativa, em infeções e doenças imunológicas [46]. Os linfócitos e os macrófagos interagem de forma bidirecional, e esta interação tem um papel importante na propagação da inflamação crónica. Os macrófagos exibem antigénios para células T, expressam moléculas de membrana, e produzem citocinas que estimulam a resposta das células T. Os linfócitos T ativados, que por sua vez, produzem citocinas, ativam os macrófagos. Esta ativação promove a apresentação de antigénios e aumenta a segregação de citocinas. É este ciclo que sustenta a inflamação crónica [46]. Introdução 41 Os eosinófilos são característicos de locais de inflamação, relacionados com infeções parasitárias, e em reações imunológicas mediadas por IgE (imunoglobulina E), normalmente associadas a alergias [46]. Os mastócitos encontram-se amplamente distribuídos pelo tecido conjuntivo e atuam como resposta a inflamações crónicas e agudas [46]. No caso dos neutrófilos, embora a sua presença seja um bom indicador de inflamação aguda, estes também podem atuar na inflamação crónica [46]. A exposição a metais pesados está relacionada com a formação de radicais livres nos seres vivos [17, 47]. O stress oxidativo é a acumulação de radicais livres, tais como ROS e RNS que provocam um desequilíbrio celular que pode originar carcinogénese [38]. O stress oxidativo resultante da exposição aos metais pesados pode originar um desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a capacidade do sistema para desintoxicar intermediários reativos. Isto pode resultar em lesões no DNA, peroxidação lipídica, modificação de proteínas e desencadear várias doenças, tal como o cancro [19]. A estimulação oncogénica está relacionada com a desregulação de vias de proteção e com a deficiência de reparação de DNA [19]. O potencial cancerígeno de cada metal pesado vai depender do seu estado de oxidação, solubilidade e forma complexa [19]. Os iões dos metais tóxicos possuem propriedades semelhantes (como por exemplo, carga e tamanho) aos iões essenciais. Por estas razões, os iões dos metais competem com os locais de ligação biológicos dos iões essenciais, isto vai provocar uma perturbação na estrutura e na função biomolecular, assim como uma perturbação da homeostasia do metal [19]. O mecanismo de ação da carcinogénese induzida pelos metais pode-se resumir em (1) indução de stress oxidativo e lesões nos componentes celulares, em específico no DNA, (2) interferência nos sistemas de reparação de DNA, provocando uma instabilidade genómica, (3) interrupção do crescimento e proliferação celular através de vias de sinalização, e desregulação de oncogenes ou genes supressores de tumores [19]. Como já foi referido anteriormente, o fenómeno de stress oxidativo pode explicar a genotoxicidade e a mutagenicidade induzida pelos metais. Estes metais induzem a produção de ROS (por exemplo, radicais superóxido), e RNS (por exemplo, óxido nítrico) Materiais e Métodos 48 49 RESULTADOS Resultados 50 Fig.1.1. Imagem de Microscopia Eletrónica de Varrimento, acoplada á Microanálise por Raios-X, onde é visível uma imagem de eletrões secundários ampliada 5000x cuja imagem refere-se a uma amostra de cabelo. Fig.1.2. Imagem de Microscopia Eletrónica de Varrimento, acoplada á Microanálise por Raios-X, na versão de eletrões retrodifundidos onde os pontos brilhantes são característicos da presença de um metal pesado. Fig.1.3. Espetro de Microanálise de Raios-X, que evidência a análise de Z1, onde é possível identificar a presença de Titânio (Ti), Silício (Si) e Alumínio (Al). Resultados 51 Fig.2.1. Imagem de Microscopia Eletrónica de Varrimento, acoplada á Microanálise por Raios-X, onde é visível uma imagem de eletrões secundários ampliada 20000x cuja imagem refere-se a uma amostra de cabelo. Fig.2.2. Imagem de Microscopia Eletrónica de Varrimento, acoplada á Microanálise por Raios-X, na versão de eletrões retrodifundidos onde os pontos brilhantes são característicos da presença de um metal pesado. Fig.2.3. Espetro de Microanálise de Raios-X, que evidência a análise de Z3, onde é possível identificar a presença do metal pesado Crómio (Cr) e Ferro (Fe). Resultados 52 Fig.3.1. Imagem de Microscopia Eletrónica de Varrimento, acoplada á Microanálise por Raios-X, onde é visível uma imagem de eletrões secundários ampliada 10000x cuja imagem refere-se a uma amostra de cabelo. Fig.3.2. Imagem de Microscopia Eletrónica de Varrimento, acoplada á Microanálise por Raios-X, na versão de eletrões retrodifundidos onde os pontos brilhantes são característicos da presença de terras raras. Fig.3.3. Espetro de Microanálise de Raios-X, que evidência a análise de Z1, onde é possível identificar a presença de Terras Raras, nomeadamente, Cério (Ce) e Lantânio (La). 53 DISCUSSÃO Discussão 54 DISCUSSÃO Os metais pesados são contaminantes ambientais com propriedades tóxicas para os seres vivos. O Homem encontra-se exposto a estes compostos há mais de 5000 anos, e atualmente devido ao aumento progressivo da poluição ambiental e ocupacional esta situação tende a piorar. A exposição ocupacional e ambiental aos metais é responsável pelo aparecimento de algumas doenças em vários sistemas, nomeadamente, pulmonar, imunológico, neurológico, renal, endócrino, cardiovascular e reprodutor. O Homem atualmente encontra-se exposto a uma poluição silenciosa, colocando em risco a própria Saúde Pública. O objetivo deste trabalho foi estudar a possível relação entre a exposição crónica de metais pesados e terras raras em indivíduos que pela sua atividade profissional estiveram em contato com estes materiais, com o possível aparecimento de carcinogénese (processos clínicos dos mesmos). Para a concretização deste objetivo foi utilizada a técnica de Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM) acoplada à Microanálise de Raios-X (XRM) (SEM-XRM). Com esta técnica, foi possível qualificar e semi-quantificar os metais e terras raras presentes na amostra em estudo, neste caso o cabelo. A Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM) acoplada à Microanálise de Raios-X (XRM) (SEM-XRM) permitiu identificar numa concentração superior a 0,1-0,3% em massa. Uma vez que os metais pesados e terras raras possuem um elevado número atómico, foi possível identificar “ in situ” a presença destes compostos em imagens fornecidas pelo microscópio eletrónico. Com esta técnica (SEM-XRM) é possível observarmos nas imagens de eletrões retrodifundidos os metais pesados e terras raras, pois estes aparecem representados pelas áreas brancas. A identificação do composto é realizada pela microanálise de raiosX que fornece um espectro com a respetiva identificação. No estudo deste grupo, os resultados indicam a presença de metais pesados e terras raras nas amostras analisadas. Estes resultados indicam exposição crónica deste grupo de risco a metais pesados e terras raras o que poderá potenciar processos inflamatórios (já descritos na bibliografia) e desse modo, desenvolver mecanismos de carcinogénese, pelos mecanismos também já largamente estudados e postulados. Discussão 55 Assim, os nossos resultados completam os resultados publicados em 2011 por Koedrith et al.. Estes autores classificam alguns metais pesados (por exemplo, arsénio, cádmio, chumbo, mercúrio, etc.), como cancerígenos que afetam a saúde do Homem através da exposição ambiental e ocupacional aos mesmo. Estudaram também de que forma o stress oxidativo resultante da exposição a metais pesados pode originar um desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a capacidade de um sistema para desintoxicar intermediários reativos. Deste desequilíbrio podem resultar diversas lesões, nomeadamente, o cancro. Os resultados de um outro estudo, publicado em 2006 por Valko et al., demonstraram que o stress oxidativo induz desequilíbrio celular. Esse desequilíbrio encontra-se presente em diversas células cancerígenas em comparação com células normais, onde não se observa desequilíbrio celular. Este desequilíbrio pode estar relacionado com a estimulação oncogénica. Foi já estudado por Jomova et al., em 2011, que o fato dos metais induzirem a formação de radicais livres e outras espécies reativas é um fator comum para determinar a toxicidade e carcinogénese induzida por estas substâncias. Os resultados apresentados neste trabalho vão de encontro ao já descrito na bibliografia internacional, mostrando pela aplicação desta técnica inovadora que um processo inflamatório crónico origina um estado de stress oxidativo celular e consequente, carcinogénese. Os nossos resultados vieram assim confirmar o já anteriormente descrito, contribuindo com informação original acerca da possível oncogénese/carcinogénese induzida pelos metais pesados, num grupo específico de grande relevância para a população portuguesa. Discussão 56 57 CONCLUSÃO Bibliografia 64 29. Zhang A, Hu H, Sánchez BN, Ettinger AS, Park SK, Cantonwine D, et al. (2012) Association between Prenatal Lead Exposure and Blood Pressure in Children. Environmental Health Perspectives. 120(3):445-450. 30. Patrick L. (2006) Lead Toxicity Part II: The Role of Free Radical Damage and the Use of Antioxidants in the Pathology and Treatment of Lead Toxicity. Alternative Medicine Review. 11(2):114-27. 31. Reyes JL, Molina-Jijón E, Rodríguez-Muñoz R, Bautista-García P, Debray-García Y, Namorado M. (2013) Tight Junction Proteins and Oxidative Stress in Heavy MetalsInduced Nephrotoxicity. BioMed Research International. 32. Vaziri ND. 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