"Hidrólise Enzimática das Proteínas da Dreche"

Hidrólise Enzimática das Proteínas da Dreche Dissertação do 2ºCiclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre em Controlo de Qualidade na Especialidade de Água e Alimentos Sandra Juliana Vieira Teixeira Trabalho realizado sob a orientação da Professora Doutora Isabel Maria Pinto Leite Viegas Oliveira Ferreira Março de 2011 DE ACORDO COM A LEGISLAÇÃO EM VIGOR, NÃO É PERMITIDA A REPRODUÇÃO DE QUALQUER PARTE DESTA DISSERTAÇÃO. ___________________________________________________________________________________________ Resumo i Resumo A indústria cervejeira produz vários resíduos e subprodutos em grandes quantidades. Os dois principais subprodutos são a dreche e o excedente de levedura, que são potenciais fontes de produtos de valor acrescentado. Contudo, as principais aplicações destes subprodutos resumem-se à alimentação animal. Deste modo, o desenvolvimento de técnicas que permitam a sua valorização é de grande interesse, por razões económicas e ambientais. O trabalho experimental descrito nesta dissertação teve como principal objectivo fornecer uma base científica para a valorização dos subprodutos da indústria cervejeira, produzidos em maior quantidade, em particular, a utilização da fracção proteica da dreche e das peptidases do excedente de levedura da cerveja, para a obtenção de hidrolisados. O concentrado de proteínas da dreche, obtido por extracção alcalina e subsequente precipitação ácida, foi utilizado como substrato para as peptidases da levedura da cerveja presentes nos extractos enzimáticos, obtidos por disrupção mecânica das células de levedura. As condições que afectam a hidrólise enzimática das proteínas da dreche, pelas peptidases da levedura da cerveja foram estudadas, incluindo a concentração de enzima e de substrato, o pH, a temperatura e o tempo. O pH óptimo de hidrólise foi 6 e a temperatura óptima foi 50ºC. A potencial presença de inibidores endógenos das peptidases da levedura da cerveja foi detectada. As peptidases da levedura da cerveja, que possivelmente estão envolvidas na hidrólise das proteínas da dreche são peptidases de serina e metalopeptidases. A hidrólise das proteínas da dreche com peptidases comerciais (Alcalase® e Protamex®) e com as peptidases da levedura da cerveja foi comparada e os hidrolisados obtidos foram separados por RP-HPLC/UV, que revelou a presença de péptidos com tempos de retenção similares, o que aponta para péptidos com peso molecular e polaridade semelhantes. Palavras-Chave: Subprodutos; Dreche; Proteínas; Levedura; Peptidases; Hidrolisados ___________________________________________________________________________________________ Abstract iii Abstract The beer industry produces various residues and by-products in large quantities. The two main by-products of brewing are spent grains and yeast surplus, which are a source of several value-added products. However, the main applications of these products are limited to animal feed. Consequently, the development of techniques that enable their valorisation are of great interest for economic and environmental reasons. The experimental work described in this thesis aimed to provide a scientific basis for the valorisation of major brewing industry by-products, in particular, the use of the protein fraction of spent grains and brewer’s yeast peptidases to obtain hydrolysates. The spent grain protein concentrates, obtained by alkaline extraction and subsequent acid precipitation, was used as the substrate for brewer’s yeast peptidases present in extracts obtained by mechanical disruption of brewer’s yeast cells. Conditions that affect the enzymatic hydrolysis of spent grain proteins by brewer’s yeast peptidases were studied, including substrate and enzyme concentration, pH, temperature and time. The optimum pH of hydrolysis was 6 and the optimal temperature was 50 °C. The potential presence of endogenous inhibitors of brewer’s yeast peptidases was detected. Brewer’s yeast peptidases possibly involved in the hydrolysis of spent grain proteins are serine peptidases and metallopeptidases. Hydrolysis of proteins from spent grains with commercial peptidases (Alcalase® and Protamex®) and brewer’s yeast peptidases was compared. The hydrolysates were separated by RP-HPLC/UV. Results showed the presence of peptides with identical retention times that indicate peptides with similar molecular weight and polarity. Keywords: By-products; Spent Grains; Proteins; Yeast; Peptidases; Hydrolysates _____________________________________________________________________________________________ Índice v Índice Resumo .................................................................................................................................. i Abstract ................................................................................................................................ iii Índice .................................................................................................................................... v Índice de Figuras ................................................................................................................ ix Índice de Tabelas ................................................................................................................ xi Lista de Abreviaturas ....................................................................................................... xiii Introdução............................................................................................................................. 1 Capítulo I - Revisão Bibliográfica ...................................................................................... 5 1. Subprodutos da Indústria Cervejeira ..................................................................... 5 1.1. Formação de subprodutos durante o processo de fabrico de cerveja................... 5 1.2. Dreche ..................................................................................................................... 9 1.2.1. Composição química da dreche ...................................................................... 9 1.2.2. Potenciais aplicações da dreche ................................................................... 10 1.2.3. Proteínas da dreche ...................................................................................... 13 1.2.3.1. Extracção das proteínas da dreche ....................................................... 14 1.3. Excedente de levedura Saccharomyces .............................................................. 16 1.3.1. Composição química do excedente de levedura Saccharomyces ............... 16 1.3.2. Potenciais aplicações do excedente de levedura Saccharomyces .............. 17 1.3.3. Peptidases da levedura da cerveja ............................................................... 18 1.3.3.1. Peptidases – Aspectos gerais ................................................................ 19 1.3.3.2. Peptidases da levedura Saccharomyces cerevisiae ............................. 21 Índice _____________________________________________________________________________________________ vi 1.3.3.3. Extracção de peptidases de leveduras .................................................. 24 1.3.3.4. Inibidores de peptidases ........................................................................ 26 2. Hidrólise enzimática de proteínas ........................................................................ 28 2.1. Factores que afectam a hidrólise enzimática de proteínas .................................. 29 2.1.1. Peptidases ..................................................................................................... 29 2.1.2. Substrato ........................................................................................................ 30 2.1.3. Condições de hidrólise .................................................................................. 30 Capítulo II - Materiais e Métodos ..................................................................................... 33 1. Materiais ................................................................................................................... 33 1.1. Amostras ............................................................................................................... 33 1.2. Reagentes e soluções........................................................................................... 33 1.3. Equipamentos ....................................................................................................... 34 2. Métodos ................................................................................................................... 34 2.1. Extracção das proteínas da dreche e obtenção do CPD ..................................... 34 2.2. Determinação da solubilidade das proteínas presentes no CPD ........................ 36 2.3. Determinação do azoto total - Método de Kjeldahl .............................................. 36 2.4. Método de Bradford .............................................................................................. 36 2.5. Determinação da humidade .................................................................................. 37 2.6. Extracção e concentração das peptidases da levedura da cerveja ..................... 37 2.7. Determinação da actividade proteolítica – Método de hidrólise da caseína ....... 38 2.8. Hidrólise enzimática das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja e pelas peptidases comerciais, Alcalase® e Protamex® ................................... 39 2.9. Efeito da concentração de peptidases da levedura da cerveja e da concentração de substrato na hidrólise das proteínas da dreche ......................................................... 40 2.10. Efeito do pH na hidrólise das proteínas da dreche ........................................... 40 2.11. Efeito da temperatura na hidrólise das proteínas da dreche............................ 41 2.12. Efeito do tempo na hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja .......................................................................................................... 41 2.13. Detecção de potenciais inibidores endógenos das peptidases da levedura da cerveja 41 _____________________________________________________________________________________________ Índice vii 2.14. Efeito de Inibidores sintéticos na actividade das peptidases da levedura da cerveja 42 2.15. Separação dos hidrolisados por RP-HPLC/UV ................................................ 43 Capítulo III - Resultados e Discussão ............................................................................. 45 1. Proteínas da dreche ............................................................................................... 45 1.1. Extracção das proteínas da dreche e obtenção do CPD ..................................... 45 1.2. Determinação da solubilidade das proteínas presentes no CPD ........................ 45 2. Peptidases da levedura da cerveja ....................................................................... 46 2.1. Verificação da actividade proteolítica do extracto enzimático ............................. 46 2.2. Influência do pH na actividade das peptidases da levedura da cerveja .............. 47 3. Hidrólise enzimática das proteínas da dreche com as peptidases da levedura da cerveja............................................................................................................................ 48 3.1. Optimização das condições de hidrólise .............................................................. 48 3.1.1. Efeito da concentração de peptidases e de substrato .................................. 49 3.1.2. Efeito do pH ................................................................................................... 50 3.1.3. Efeito da temperatura .................................................................................... 52 3.1.4. Efeito do tempo .............................................................................................. 53 3.2. Detecção de potenciais inibidores endógenos das peptidases da levedura da cerveja .............................................................................................................................. 54 3.3. Efeito de inibidores sintéticos na actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche ............................................................................. 55 4. Hidrólise enzimática das proteínas da dreche com peptidases comerciais e comparação com as peptidases da levedura da cerveja .............................................. 58 5. Separação por RP-HPLC/UV dos péptidos resultantes da hidrólise enzimática das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja e pelas peptidases comerciais ...................................................................................................... 65 Capítulo IV - Conclusão .................................................................................................... 67 Referências ......................................................................................................................... 71 Lista de Abreviaturas ________________________________________________________________________________ xiv TFA Ácido trifluoracético TNBS Ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfónico Tris Tris(hidroximetil)aminometano U Unidades de actividade enzimática UV Ultravioleta UV-Vis Ultravioleta-Visível v Volume Ve Volume de preparação enzimática Vt Volume total _________________________________________________________________________________________ Introdução 1 Introdução A valorização de subprodutos é um conceito inovador no domínio da gestão dos resíduos contribuindo para um desenvolvimento sustentável. A indústria cervejeira produz anualmente vários subprodutos, sendo a dreche e o excedente de levedura os subprodutos produzidos em maior quantidade (Mussatto, 2009). As suas principais aplicações são limitadas à alimentação animal e muitas vezes o aterro é um dos destinos destes subprodutos. No entanto, várias aplicações agro-industriais têm sido estudadas, em particular na alimentação humana e a utilização a nível biotecnológico (Ferreira et al., 2010; Mussatto, 2009; Mussatto et al., 2006). A dreche é um subproduto rico em proteínas, mas a sua reduzida solubilidade constitui uma das principais limitações para a utilização a nível alimentar. A potencial aplicação das proteínas insolúveis da dreche requer a utilização de métodos de extracção dessas proteínas, que pode ser realizada por métodos químicos, físicos e bioquímicos, ou pela combinação de vários métodos (Celus et al., 2007; Treimo et al., 2008). A levedura da cerveja, que é recolhida no final da fermentação como excedente de levedura, contém várias peptidases intracelulares dos principais tipos catalíticos (serina, cisteína, metalo e ácido aspártico), que podem ser isoladas e purificadas (Ferreira et al., 2010). As peptidases têm inúmeras funções fisiológicas importantes e são um dos grupos de enzimas com mais interesse a nível industrial. As peptidases têm inúmeras aplicações na indústria alimentar, de detergentes, têxtil, bem como a nível médico e biotecnológico (Rawlings e Barrett, 2010; Whitaker, 2003). As leveduras são um dos organismos mais importantes nas indústrias de fermentação, por exemplo na indústria cervejeira, e poderiam ser utilizadas como uma boa fonte de peptidases (Roy et al., 2000). Contudo, a maioria dos estudos sobre as peptidases de leveduras estão relacionados com procedimentos de extracção e Introdução _________________________________________________________________________________________ 2 purificação, bem como, conhecer as suas funções fisiológicas a nível celular, mas os estudos sobre possíveis aplicações das peptidases de leveduras são raros. As peptidases de leveduras são essencialmente de natureza intracelular, o que justifica não terem ganho interesse comercial significativo (Kamini et al., 1999). A obtenção de peptidases intracelulares requer a utilização de métodos de extracção eficientes (Shynkaryk et al., 2009). Vários métodos mecânicos e não mecânicos têm sido utilizados para a disrupção celular e obtenção das peptidases intracelulares de leveduras. A hidrólise enzimática de proteínas, pela acção de peptidases para a obtenção de péptidos e aminoácidos é muito importante na indústria alimentar, bem como, a nível biotecnológico devido às suas propriedades funcionais e nutricionais (Kunst, 2003; Pericin et al., 2009). A hidrólise enzimática das proteínas da dreche com peptidases comerciais tem sido referida na literatura (Celus et al., 2007; Treimo et al., 2008). Celus e colaboradores estudam as propriedades tecno-funcionais dos hidrolisados obtidos (Celus et al., 2007). Roy e colaboradores (Roy et al., 2000) estudaram a obtenção de hidrolisados a partir das proteínas do leite com peptidases presentes em extractos enzimáticos de levedura Saccharomyces cerevisiae. Neklyudov e colaboradores (Neklyudov et al., 1996; Neklyudov et al., 1998) utilizaram a levedura da cerveja, em particular a levedura Saccharomyces carlsbergensis como fonte de peptidases para obtenção de hidrolisados a partir de proteínas de sangue animal. Contudo, a hidrólise das proteínas da dreche com peptidases da levedura da cerveja, aparentemente, ainda não foi descrita na literatura. O trabalho experimental descrito nesta dissertação teve como principal objectivo fornecer uma base científica para a valorização dos subprodutos da indústria cervejeira produzidos em maior quantidade, em particular a utilização da fracção proteica da dreche e das peptidases da levedura da cerveja para a obtenção de hidrolisados, como se apresenta esquematizado na Figura 1. O trabalho experimental foi dividido em quatro etapas principais. A primeira etapa correspondeu à extracção das proteínas da dreche e obtenção do concentrado de proteínas da dreche (CPD). Na segunda etapa, o extracto enzimático, que contém as peptidases da levedura da cerveja, foi obtido por disrupção mecânica das células de levedura excedente da cerveja. Na terceira etapa, foi realizada a hidrólise enzimática das proteínas da dreche, com as peptidases da levedura da cerveja. As condições de hidrólise, incluindo a concentração de enzima e substrato, o pH, a temperatura e o tempo, que afectam a hidrólise enzimática foram estudadas. A potencial presença de inibidores endógenos das _________________________________________________________________________________________ Introdução 3 peptidases da levedura da cerveja, em particular das peptidases vacuolares que possam estar presentes nos extractos enzimáticos. Também foi alvo de estudo, o tipo catalítico das peptidases da levedura envolvidas na hidrólise das proteínas da dreche. Na quarta e última etapa, foi realizada a hidrólise das proteínas da dreche com peptidases comerciais (Alcalase® e Protamex®). Os resultados foram comparados com a hidrólise das proteínas da dreche com as peptidases da levedura da cerveja. Posteriormente, os hidrolisados obtidos foram separados por RP-HPLC/UV para avaliar o peso molecular e polaridade dos péptidos obtidos. Figura 1 – Visão esquemática da obtenção de hidrolisados das proteínas da dreche com as peptidases da levedura da cerveja, para a valorização dos dois principais subprodutos da indústria cervejeira, a dreche e o excedente de levedura. Cevada Malte Mosto Dreche Cerveja Excedente de Levedura Concentrado de Proteínas da Dreche (CPD) Peptidases da Levedura da Cerveja Hidrolisados ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 5 Capítulo I - Revisão Bibliográfica 1. SUBPRODUTOS DA INDÚSTRIA CERVEJEIRA A cerveja é a quinta bebida mais consumida no mundo, depois do chá, bebidas gaseificadas, leite e café (Aliyu e Bala, 2011). Em 2008, foram produzidos 1,811×106 hectolitros de cerveja em todo o mundo (Robertson et al., 2010) e em média por ano, são consumidos cerca 23 litros de cerveja por pessoa (Fillaudeau et al., 2006). A indústria cervejeira produz, inevitavelmente, quantidades relativamente grandes de subprodutos, tais como a dreche, o excedente de levedura Saccharomyces e os resíduos de lúpulo (Gupta et al., 2010; Mussatto, 2009). A utilização destes subprodutos ainda é limitada, sendo principalmente comercializados para utilização na alimentação animal. No entanto, estes subprodutos são recursos de elevado potencial para utilização em processos biotecnológicos, uma vez que são ricos em carbono, azoto e sais minerais (Mussatto, 2009). Em termos ambientais, a utilização de subprodutos industriais representa uma solução para os problemas de poluição, portanto o desenvolvimento de novas técnicas para aproveitamento e melhoramento de subprodutos agro-industriais é de grande interesse (Mussatto, 2009; Mussatto et al., 2006). 1.1. FORMAÇÃO DE SUBPRODUTOS DURANTE O PROCESSO DE FABRICO DE CERVEJA No processo de fabrico da cerveja, os principais ingredientes utilizados são o malte, água, levedura e lúpulo (Lopez et al., 2010). Alguns cereais não maltados, tais como o milho, o trigo, o arroz e a aveia, designados de adjuntos, podem ser utilizados no Revisão Bibliográfica ________________________________________________________________________________ 6 fabrico da cerveja, como fontes de hidratos de carbono mais económicas do que o malte (Priest e Stewart, 2006). A primeira fase do processo de produção de cerveja é a maltagem, onde o malte é obtido a partir da cevada (Lopez et al., 2010). A maltagem engloba três etapas, a maceração, a germinação e a secagem. Durante a maceração, os grãos de cevada limpos são colocados em contacto com a água, de forma a promover a sua hidratação, iniciando-se o processo de germinação e a activação dos processos metabólicos. A germinação promove a síntese e activação de enzimas, tais como, amilases, peptidases e β-glucanases. É na etapa de germinação que os grãos de cevada passam a ser designados por malte. A germinação termina com a etapa de secagem do malte, para evitar a contaminação com microrganismos e para produzir componentes do flavour (Mussatto et al., 2006). No final da maltagem inicia-se o processamento da cerveja propriamente dito, cuja fase inicial corresponde ao fabrico do mosto. O malte é moído de forma a obter uma farinha grosseira, que é misturada com água e a temperatura aumenta lentamente de 37ºC para 78ºC para promover a hidrólise enzimática dos constituintes do malte. Durante este processo, o amido do malte é convertido em açúcares fermentáveis, sobretudo maltose e maltotriose, em açúcares não fermentáveis (dextrinas) e as proteínas são degradadas, por peptidases, em polipéptidos e aminoácidos. Esta etapa de conversão enzimática é designada de brassagem, na qual é obtido um líquido doce, conhecido como mosto (Gupta et al., 2010; Lopez et al., 2010; Mussatto, 2009). Após a brassagem, é realizada uma etapa de filtração para separar a parte insolúvel (a fracção sólida conhecida como dreche) do filtrado (mosto). O mosto contém todos os compostos solúveis necessários à fermentação (Lopez et al., 2010; Mussatto, 2009). Após a filtração, o mosto é submetido à ebulição. É nesta etapa que é adicionado o lúpulo. Durante este processo, as substâncias do lúpulo que conferem o sabor amargo e o flavour característicos da cerveja, são transferidas para o mosto (Mussatto, 2009; Priest e Stewart, 2006). A ebulição tem também por objectivo a eliminação de substâncias voláteis indesejáveis, a esterilização do mosto, desnaturação das enzimas e precipitação de proteínas de peso molecular elevado (Priest e Stewart, 2006). No final da ebulição, é necessário realizar a separação do precipitado proteico e dos componentes do lúpulo não solubilizados (resíduos de lúpulo) do mosto quente. A separação pode ser realizada por centrifugação, filtração ou sedimentação. O mosto quente é posteriormente arrefecido e arejado em condições estéreis (Priest e Stewart, 2006). ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 7 Após o arrefecimento do mosto, segue-se a etapa de fermentação. Nesta etapa, a levedura de cultura seleccionada para o tipo de cerveja que se pretende produzir, é adicionada ao mosto arrefecido e saturado em oxigénio. Os açúcares do mosto, pela acção da levedura são convertidos em etanol e dióxido de carbono (Mussatto, 2009; Priest e Stewart, 2006). Durante a fermentação, a massa de células de levedura aumenta cerca de 3 a 6 vezes. No final desta fase, a maioria das células são recolhidas como levedura excedente, no topo ou no fundo do tanque de fermentação (de acordo com a natureza da levedura utilizada) (Mussatto, 2009). No final da fermentação, segue-se a fase de maturação, cujo objectivo é a libertação de compostos voláteis indesejáveis, de forma a melhorar o sabor e o aroma da cerveja. Posteriormente segue-se a estabilização coloidal, a clarificação, operação que confere à cerveja a sua limpidez, eliminando os últimos elementos de turvação ainda em suspensão (Priest e Stewart, 2006). A etapa final do fabrico da cerveja é o enchimento. Antes ou depois do enchimento é necessário realizar a estabilização biológica da cerveja, realizada a frio por filtração esterilizante ou a quente pela pasteurização, cujo objectivo é a remoção de microrganismos presentes (Priest e Stewart, 2006). Na Figura 2 encontra-se uma representação esquemática do processo de produção de cerveja e os pontos onde são produzidos os principais subprodutos da indústria cervejeira, Revisão Bibliográfica ________________________________________________________________________________ 8 Figura 2 – Representação esquemática do processo de produção de cerveja e dos pontos onde são produzidos os três principais subprodutos da indústria cervejeira (retirado de (Mussatto, 2009)). ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 9 1.2. DRECHE A dreche é o subproduto mais abundante resultante do fabrico da cerveja, representando cerca de 85% do total de subprodutos produzidos. Estima-se que por cada 100 litros de cerveja fabricada, sejam produzidos cerca de 20 quilogramas de dreche (Gupta et al., 2010; Mussatto, 2009), e só na Europa são produzidos mais de 3 milhões de toneladas de dreche por ano (Faulds et al., 2009). 1.2.1. Composição química da dreche A dreche, fracção sólida que resulta da filtração do mosto durante o processo de fabrico da cerveja (Ozvural et al., 2009; Stojceska e Ainsworth, 2008), contém cerca de 30% (p/p) do malte original (Robertson et al., 2010). Dependendo do tipo de cerveja produzido, a dreche pode ser constituída apenas pelos resíduos do malte de cevada, ou também podem estar presentes resíduos de outros cereais não maltados eventualmente utilizados durante a brassagem, tais como o milho ou o arroz (Gupta et al., 2010; Mussatto, 2009). A composição química da dreche varia de acordo com a variedade de cevada, com a época de colheita, com as condições da maltagem e brassagem, e com a qualidade e o tipo de adjuntos utilizados (Gupta et al., 2010; Lopez et al., 2010; Mussatto, 2009; Robertson et al., 2010; Santos et al., 2003). De uma forma geral, a dreche é um material lenhinocelulósico, rico em proteínas e fibras (arabinoxilanas, lenhina e celulose), que representam cerca de 20% e 70% da sua composição, respectivamente (Gupta et al., 2010; Lopez et al., 2010). Algumas análises da composição química da dreche encontram-se na Tabela 1. A celulose e a hemicelulose juntas, correspondem a cerca de 50% da composição da dreche, revelando a presença de grandes quantidades de açúcares, tais como a xilose, glucose e a arabinose. A lenhina contém vários componentes polifenólicos, sobretudo ácidos ferúlico, p-coumárico, siringico, vanilico e p-hidroxibenzoico (Mussatto, 2009). Os minerais, tais como, cálcio, cobalto, cobre, ferro, magnésio, fósforo, potássio, selénio, sódio e enxofre fazem parte da composição da dreche. Esta também possui Revisão Bibliográfica ________________________________________________________________________________ 16 1.3. EXCEDENTE DE LEVEDURA SACCHAROMYCES O excedente de levedura é outro dos principais subprodutos resultantes do processo de fabrico da cerveja. As aplicações deste subproduto têm sido investigadas, uma vez que é produzido em grandes quantidades e apresenta valor energético e nutricional (Mussatto, 2009; Paucen et al., 2010). As leveduras são utilizadas na indústria cervejeira durante o processo fermentativo. Estas têm um impacto significativo na qualidade da cerveja, uma vez que do processo de fermentação não resulta apenas etanol e dióxido de carbono, pois outros compostos, tais como, ácidos orgânicos, esteres, aldeídos e cetonas são produzidos, os quais desempenham um papel fundamental no perfil sensorial da cerveja (Pinho et al., 2006). As leveduras utilizadas na indústria cervejeira pertencem ao género Saccharomyces e são convencionalmente divididas em duas classes principais: leveduras de fermentação alta e leveduras de fermentação baixa. As cervejas podem ser também dividias em dois tipos, em função do tipo de levedura utilizada, em Ale e Lager. As cervejas do tipo Ale são produzidas com leveduras de fermentação alta (Saccharomyces cerevisiae) e o processo de produção ocorre a temperaturas de 1625ºC. As cervejas do tipo Lager são produzidas com leveduras de fermentação baixa (Saccharomyces pastorianus ou Saccharomyces carlsbergensis), a temperaturas de 815ºC, sendo conhecidas por leveduras de fermentação baixa por flocularem no fundo do tanque de fermentação (Ferreira et al., 2010). A levedura é geralmente reutilizada cerca de 4 a 6 vezes na etapa de fermentação. Contudo, o excedente de levedura é o segundo subproduto produzido em maior quantidade (Ferreira et al., 2010). Após a fermentação, a maioria da levedura é recolhida como excedente de levedura (Priest e Stewart, 2006). Tipicamente, a quantidade total de excedente de levedura produzida na fermentação Lager é aproximadamente 1,7 kg/m3 – 2,3 kg/m3 do produto final (Ferreira et al., 2010). 1.3.1. Composição química do excedente de levedura Saccharomyces O excedente de levedura Saccharomyces é rico em proteínas e hidratos de carbono. Na Tabela 3 encontra-se a composição química do excedente de levedura. As proteínas presentes neste subproduto contêm inúmeros aminoácidos, tais como, arginina, ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 17 cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e tirosina (Mussatto, 2009). A biomassa de levedura é uma excelente fonte de vitaminas, tais como biotina, niacina, tiamina, vitamina B6, riboflavina entre outras (Mussatto, 2009). O conteúdo total de minerais presentes no excedente de levedura é de cerca de 5-10% do peso seco celular. A fracção mineral inclui vários elementos, sendo o potássio e fósforo os que estão presentes em maior quantidade (Mussatto, 2009). Tabela 3 – Composição química do excedente de levedura Saccharomyces. Componentes (% peso seco) (Priest e Stewart, 2006) (Lamoolphak et al., 2006) Proteínas 45 48 Lípidos nr* 1 Cinzas <8 8 Hidratos de carbono nr 36 *nr – não referido 1.3.2. Potenciais aplicações do excedente de levedura Saccharomyces O excedente de levedura Saccharomyces, segundo subproduto em maior quantidade que resulta do fabrico de cerveja, é geralmente vendido para alimentação animal, após inactivação pelo calor, mas grande parte deste subproduto é considerado como resíduo orgânico industrial (Lamoolphak et al., 2006). Este subproduto apresenta maior quantidade de proteínas, vitaminas e aminoácidos, quando comparado com a dreche (Mussatto, 2009). Devido às suas características nutricionais, o excedente de levedura tem sido actualmente utilizada como suplemento nutricional. Contudo, a sua utilização na alimentação humana é limitada, uma vez que a biomassa de levedura apresenta elevada quantidade ácidos nucleicos, principalmente RNA, que em humanos é metabolizado a ácido úrico, o que pode originar a gota (Ferreira et al., 2010; Mussatto, 2009; Priest e Stewart, 2006). As principais aplicações do excedente de levedura encontram-se na Tabela 4. As células de levedura da cerveja contêm inúmeros compostos de interesse industrial que podem ser extraídos e isolados, tais como, proteínas, vitaminas, Revisão Bibliográfica ________________________________________________________________________________ 18 aminoácidos, DNA, RNA e várias enzimas, em particular peptidases. A produção industrial destas enzimas é um campo a explorar (Ferreira et al., 2010; Mussatto, 2009). Tabela 4 – Principais aplicações do excedente de levedura Saccharomyces (Chae et al., 2001; Ferreira et al., 2010; Mussatto, 2009; Priest e Stewart, 2006). Área de aplicação Descrição Alimentação animal Excelente para utilização na alimentação de ruminantes, suínos e aves (após inactivação) devido ao seu elevado valor nutricional, sendo fonte de proteínas e vitaminas e uma vez que constitui uma excelente fonte de azoto de baixo custo. Também tem sido estudada a sua utilização na alimentação de animais de estimação, por exemplo cães, como fonte de aminoácidos essenciais e na alimentação de peixes de aquacultura. Alimentação humana Tem sido usado como fonte de antioxidantes naturais em alimentos com elevado conteúdo em gorduras animais, bem como no fabrico de pães, bolos e certos produtos cárneos para aumentar a retenção de humidade e prolongar a frescura. Também pode ser utilizado em alimentos para crianças (até 3%) devido às suas propriedades nutricionais e na alimentação vegetariana como fonte de aminoácidos essenciais e vitaminas. Pode ainda ser utilizado como fonte de intensificadores de sabor em diversos alimentos tais como carnes, queijos e sopas. Adsorvente A biomassa de levedura pode ser usada como adsorvente de iões metálicos (chumbo, zinco, cobre e níquel), sendo utilizada na remoção de metais de águas residuais. Biotecnologia O excedente de levedura pode ser usado como substrato para o crescimento de microrganismos e para a produção de enzimas. Algumas fracções do excedente de levedura apresentam actividade antitumoral. 1.3.3. Peptidases da levedura da cerveja A levedura da cerveja, que é recolhida no final da fermentação como excedente de levedura, contém várias peptidases intracelulares que podem ser isoladas e purificadas. As leveduras utilizadas na indústria cervejeira pertencem ao género Saccharomyces. Nesta secção, são abordadas as peptidases da levedura Saccharomyces cerevisiae, uma vez que são as peptidases de leveduras mais estudadas. ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 19 1.3.3.1. Peptidases – Aspectos gerais As peptidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas e estão presentes em todos os organismos vivos, desempenhando diversas funções a nível fisiológico (Rawlings e Barrett, 2010; Whitaker, 2003). A clivagem enzimática de ligações peptídicas em proteínas ou péptidos é designada de hidrólise enzimática, sendo também frequentemente chamada de proteólise (Whitaker, 2003). As peptidases têm inúmeras aplicações a nível industrial, principalmente na indústria alimentar, detergentes, na indústria têxtil, a nível médico e biotecnológico. A nível industrial as peptidases representam cerca de 60% do mercado total de enzimas (Charles et al., 2008; Whitaker, 2003). As peptidases são normalmente classificadas com base em três critérios principais: (1) tipo de reacção catalisada, (2) tipo catalítico e (3) estrutura molecular e homologia (Rawlings e Barrett, 2010). Actualmente, são conhecidos seis tipos catalíticos de peptidases: as peptidases de cisteína, serina, treonina, ácido aspártico, ácido glutâmico e metalopeptidases. O tipo catalítico de uma peptidase diz respeito aos grupos químicos presentes no local activo e que são responsáveis pela catálise da hidrólise de ligações peptídicas. Assim, as peptidases de serina possuem um resíduo aminoácido de serina no local activo, que actua como nucleófilo, nas peptidases de cisteína o nucleófilo é um resíduo aminoácido de cisteína e nas peptidases de treonina o nucleófilo é um resíduo de treonina N-terminal. Nas peptidases de ácido aspártico, ácido glutâmico e metalopeptidases, o ataque nucleófilo é mediado por uma molécula de água, activada por dois resíduos de ácido aspártico, um resíduo de ácido glutâmico e por um ião metálico, respectivamente (Rawlings e Barrett, 2010). Existem dois sistemas principais de classificação das peptidases: o sistema EC do NC-IUBMB e o sistema MEROPS. O sistema EC do NC-IUBMB classifica as peptidases com base no tipo de reacção catalisada, mas também tem em conta o critério adicional, tipo catalítico. De acordo com sistema EC do NC-IUBMB, as peptidases estão incluídas na subclasse 3.4, estando distribuídas por 14 sub-subclasses e podem ser classificadas em dois grandes grupos, dependendo do seu local de acção no substrato: exopeptidases e endopeptidases. As exopepdidases actuam apenas nas regiões terminais das cadeias polipeptídicas, isto é, nos N-terminais e nos C-terminais. As exopeptidases são classificadas com base na reacção catalisada em:  Aminopeptidases (EC 3.4.11) - Hidrólise de um único aminoácido a partir da região N-terminal da cadeia peptídica; Revisão Bibliográfica ________________________________________________________________________________ 20  Dipeptidases (EC 3.4.13) - Hidrólise de dipéptidos em aminoácidos;  Dipeptidil peptidases e tripeptidil pepdidases (EC 3.4.14) - Hidrólise de um dipéptido ou tripéptido a partir da região N-terminal da cadeia peptídica;  Peptidil dipeptidases (EC 3.4.15) - Hidrólise de um dipéptido a partir da região C-terminal da cadeia peptídica;  Carboxipeptidases (EC 3.4.16-18) - Hidrólise de um único aminoácido a partir da região C-terminal;  Omega peptidases (EC 3.4.19) - Remoção de resíduos terminais que são substituídos, ciclizados ou ligados por ligações isopeptídicas. As carboxipeptidases por sua vez podem ser divididas em três grupos, de acordo com o grupo catalítico presente no local activo em: carboxipeptidases de serina (EC 3.4.16), metalocarboxipeptidases (EC 3.4.17) e carboxipeptidases de cisteína (EC 3.4.18) (NC-IUBMB, 2010). As endopeptidases hidrolisam ligações peptídicas no interior das cadeias polipeptídicas e são classificadas de acordo com o mecanismo catalítico em: endopeptidases de serina (EC 3.4.21), endopeptidases de cisteína (EC 3.4.22), endopeptidases de ácido aspártico (EC 3.4.23), metaloendopeptidases (EC 3.4.24) e endopeptidases de treonina (EC 3.4.25). As endopeptidases cujo mecanismo catalítico ainda é desconhecido são incluídas na sub-suclasse EC 3.4.99 (NC-IUBMB, 2010). O sistema de classificação MEROPS tem em conta o mecanismo catalítico, mas também as relações evolutivas, a sequência de aminoácidos e as características estruturais essenciais. Neste novo sistema de classificação, as peptidases que apresentam sequências de aminoácidos estatisticamente semelhantes são agrupadas em famílias. As famílias que tiveram uma origem evolucionária comum e apresentam semelhanças nas estruturas tridimensionais são agrupadas em clãs. Cada família e clã tem um identificador que mostra o tipo catalítico das peptidases do grupo: A (ácido aspártico), C (cisteína), M (metalo), S (serina), T (treonina), G (ácido glutâmico) e U (tipo catalítico desconhecido). Os clãs que incluem famílias de mais do que um tipo catalítico têm como identificador a letra P (Rawlings e Barrett, 2010). As peptidases de ácido glutâmico não são reconhecidas pelo sistema EC, sendo apenas consideradas no sistema MEROPS. A especificidade das peptidases é normalmente difícil de definir, dependendo da natureza dos vários resíduos aminoácidos em torno da ligação peptídica a ser hidrolisada e da conformação das cadeias polipeptídicas do substrato (NC-IUBMB, 2010). Em 1967, Schechter e Berger introduziram um sistema de nomenclatura para descrever a ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 21 interacção das peptidases com os seus substratos, facilitando a descrição da especificidade de uma determinada peptidase (Ng et al., 2009)(Figura 3). Figura 3 – Representação esquemática da interacção peptidase-substrato de acordo com a nomenclatura de Schechter e Berger (1967) (adaptado de (Turk, 2006)). O sistema de nomenclatura de Schechter e Berger considera que os resíduos aminoácidos do substrato proteico ligam-se aos sublocais da enzima no local activo. Cada sublocal interage com apenas um resíduo aminoácido do substrato. Por convenção, os resíduos aminoácidos do substrato são designados por P e os sublocais da protease que interagem com o substrato são designados por S. Os resíduos aminoácidos do lado N-terminal da ligação peptídica a ser quebrada são numerados de Pn, … P4, P3, P2, P1 e os resíduos do lado C-terminal são numerados de P1’, P2’, P3’, P4’, … P’n. Os sublocais da peptidase são numerados de Sn, … S4, S3, S2, S1,S1’, S2’, S3’, S4’, … S’n, para complementar cada local P (Ng et al., 2009). As peptidases não diferem apenas na sua especificidade para o substrato, mas também nos seus mecanismos de catálise. Os seis tipos catalíticos de peptidases utilizam fundamentalmente dois mecanismos de reacção diferentes para hidrólise das ligações peptídicas e estabilização do intermediário tetraédrico. Nas peptidases de serina, cisteína e treonina o nucleófilo do local catalítico é parte de um aminoácido (catálise covalente), enquanto que, nas peptidases de ácido aspártico, ácido glutâmico e metalopeptidases o nucleófilo é uma molécula de água activada (catálise ácido-base) (Turk, 2006). 1.3.3.2. Peptidases da levedura Saccharomyces cerevisiae O sistema proteolítico da levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido bastante estudado e inúmeras peptidases têm sido caracterizadas, uma vez que este organismo N-terminal C-terminal -terminal -terminal Substrato Ligação susceptível de ser cortada Revisão Bibliográfica ________________________________________________________________________________ 22 eucariótico unicelular pode ser facilmente estudado com recurso a diversas técnicas experimentais. Além disso, têm sido encontradas relações evolutivas entre peptidases de leveduras e peptidases de organismos eucarióticos superiores, bem como, tem sido reconhecida a importância da proteólise na regulação do metabolismo celular (JajcaninJozic et al., 2010). As peptidases da levedura estão envolvidas em inúmeros processos biológicos essenciais para a célula, tais como a renovação de proteínas, degradação de proteínas aberrantes, processamento de proteínas, adaptação a condições ambientais com pouca disponibilidade de azoto (Bolumar et al., 2008). As peptidases da levedura Saccharomyces cerevisiae podem ser incluídas em quatro grupos, dependendo do compartimento celular em que se encontram: peptidases dos vacúolos, peptidases citoplasmáticas, peptidases mitocondriais e peptidases envolvidas nas vias de secreção (Jajcanin-Jozic et al., 2010). Na Tabela 5 encontram-se algumas peptidases localizadas nos diferentes compartimentos celulares, bem como o seu tipo catalítico e referências bibliográficas que descrevem as diferentes peptidases. Os vacúolos da levedura Saccharomyces cerevisiae contêm inúmeras peptidases: duas endopeptidases, a peptidase A e a peptidase B; duas carboxipeptidases, a carboxipeptidase C e a carboxipeptidase S; aminopeptidases, tais como a aminopeptidase I e a aminopeptidase Y e dipeptidil aminopeptidases, tais como a dipeptidil aminopeptidase B (Flores et al., 1999; Hutter et al., 2005; Jones, 1991; Jones, 2002; Schlee et al., 2006). As endopeptidases, carboxipeptidases e aminopeptidases são solúveis (Jones, 2002) e a dipeptidil aminopeptidase B encontra-se integrada na membrana vacuolar (Li e Kane, 2009). As peptidases vacuolares constituem o grupo de peptidases mais numeroso e desempenham diversas funções essenciais a nível fisiológico (Bolumar et al., 2008). As peptidases A e B, mas principalmente, a peptidase A catalisa clivagens que resultam na maturação de precursores e activação de zimogénios de peptidases vacuolares (Flores et al., 1999; Hutter et al., 2005; Jones, 1991). As peptidases vacuolares estão também envolvidas na degradação de proteínas, particularmente em condições de stress nutricional (Flores et al., 1999; Jones, 1991; Van Den Hazel et al., 1996; Wolf, 2004). A proteólise vacuolar é essencial para a degradação de proteínas para obtenção de aminoácidos, azoto e carbono em condições de stress nutricional (Wolf, 2004). Na ausência de peptidases vacuolares, as células de levedura não sobreviriam em más condições nutricionais (Yasuhara et al., 1994). ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 23 Tabela 5 – Peptidases da levedura Saccharomyces cerevisiae. Localização celular Peptidases Tipo catalítico Referências Vacúolos Peptidase A Ácido aspártico (Jones, 1991; Parr et al., 2007; Rawlings e Barrett, 2010) Peptidase B Serina (Hutter et al., 2005; Jones, 1991; Rawlings e Barrett, 2010; Van Den Hazel et al., 1996) Carboxipeptidase Y Serina (Jones, 1991; Rawlings e Barrett, 2010; Van Den Hazel et al., 1996) Carboxipeptidase S Metalopeptidase (Jones, 1991; Rawlings e Barrett, 2010; Spormann et al., 1991) Aminopeptidase I Metalopeptidase (Jones, 1991; Rawlings e Barrett, 2010) Aminopeptidase Y Metalopeptidase (Jones, 1991; Rawlings e Barrett, 2010; Yasuhara et al., 1994) Dipeptidil aminopeptidase B Serina (Jones, 1991; Rawlings e Barrett, 2010) Citoplasma Peptidases do Proteossoma Treonina (Rawlings e Barrett, 2010) Dipeptidil peptidase III Metalopeptidase (Jajcanin-Jozic et al., 2010; Rawlings e Barrett, 2010) Peptidase D Metalopeptidase (NC-IUBMB, 2010; Rawlings e Barrett, 2010) Aspartil aminopeptidase Metalopeptidase (Sarry et al., 2007; Yokoyama et al., 2006) Mitocôndria MPP Metalopeptidase (Koppen e Langer, 2007; Rawlings e Barrett, 2010) Pim1 Serina Lap3 Cisteína Oma1 Metalopeptidase Vias de secreção Kex carboxipeptidase Serina (Hauptmann e Lehle, 2008) Yapsin-1 Ácido aspártico (Gagnon-Arsenault et al., 2008; Sievi et al., 2001) Em geral, as peptidases vacuolares são relativamente inespecíficas e são responsáveis pela degradação de vários tipos de proteínas (Hutter et al., 2005; Li e Kane, 2009). O controlo da actividade proteolítica vacuolar é essencial para prevenir a proteólise descontrolada, que pode por em causa as funções essenciais à vida da célula. Portanto, a maioria das peptidases são sintetizadas na forma de precursores inactivos Revisão Bibliográfica ________________________________________________________________________________ 24 (zimogénios) e transportadas até ao vacúolo, onde são posteriormente activadas por clivagem proteolítica (Hutter et al., 2005; Li e Kane, 2009; Rupp e Wolf, 1995; Wolff et al., 1996). As peptidases do proteossoma encontram-se no citoplasma das células de levedura (Flores et al., 1999; Jajcanin-Jozic et al., 2010). O proteossoma é um complexo multicatalítico que contém várias peptidases, sendo responsável pela renovação de proteínas intracelulares, incluindo proteínas marcadas para a degradação por poliubiquitinação (Rawlings e Barrett, 2010). O proteossoma é responsável pela clivagem específica de proteínas e está envolvido na degradação específica de proteínas em condições de stress (Flores et al., 1999; Hilt e Wolf, 1992; Hutter et al., 2005). As peptidases mitocondriais estão presentes em vários subcompartimentos da mitocôndria, tais como a matriz mitocondrial (MPP e Pim1), membrana interna (Oma1) e espaço intermembranar (Lap3) e desempenham várias funções essenciais, em particular, na regulação da biogénese mitocondrial e no controlo de qualidade de proteínas mitocondriais (Koppen e Langer, 2007). Existem inúmeras proteínas e péptidos, essenciais para a regulação da actividade biológica, que são inicialmente secretados como precursores inactivos e que são posteriormente convertidos em formas activas, nas vias de secreção pela acção de peptidases (Henrich et al., 2005). As peptidases envolvidas nas vias de secreção estão localizadas principalmente no complexo de Golgi e na membrana plasmática (Flores et al., 1999). A kex carboxipetidase é uma peptidase que se localiza na membrana do complexo de Golgi e está envolvida na morte celular (Hauptmann e Lehle, 2008). A yapsin-1 é uma peptidase localizada na membrana plasmática, que pode estar envolvida na activação de enzimas periplasmáticas e de proteínas implicadas na construção da parede celular (Gagnon-Arsenault et al., 2008). 1.3.3.3. Extracção de peptidases de leveduras A disrupção das células de leveduras é uma etapa importante para a extracção de bioprodutos de interesse industrial, em particular de peptidases, que estão presentes no interior das células (Shynkaryk et al., 2009), uma vez que as células de levedura apresentam paredes celulares, o que constitui uma barreira natural à libertação de macromoléculas para o meio de cultura (Ricci-Silva et al., 2000). ________________________________________________________________________________ Revisão Bibliográfica 25 Os métodos de ruptura celular podem ser classificados de uma forma geral em mecânicos e não mecânicos (Figura 4) (Balasundaram et al., 2009). Os métodos mecânicos frequentemente utilizados na ruptura de células de leveduras, para obtenção de enzimas intracelulares incluem técnicas como, Bead mill (Ricci-Silva et al., 2000; Vangaver e Huyghebaert, 1991), ultrassons (Balasundaram e Pandit, 2001; Okungbowa et al., 2007), agitação em vortex utilizando esferas de vidro (Bolumar et al., 2005; Bolumar et al., 2008; Kato et al., 2006; Okungbowa et al., 2007; Tanimizu e Hayashi, 1996; Yokoyama et al., 2006) e homogeneização por alta pressão (Balasundaram e Harrison, 2006; Balasundaram e Pandit, 2001; Meussdoerffer et al., 1980). Os métodos não mecânicos incluem físicos (temperatura), métodos químicos (com utilização de solventes e detergentes) e enzimáticos (autólise) (Apar e Ozbek, 2008; Geciova et al., 2002). Os diferentes métodos químicos (solventes, temperatura e autólise) são muitas vezes combinados para melhorar a eficiência (Breddam e Beenfeldt, 1991; Yokoi et al., 1996). Autólise é o termo que descreve a ruptura dos constituintes celulares por acção de enzimas endógenas. Este processo ocorre naturalmente nas leveduras, quando completam o seu ciclo de crescimento e entram em fase de morte, ou em condições de stress nutricional. No entanto, este processo pode ser induzido pela exposição das células a solventes orgânicos e a temperaturas altas. O controlo da temperatura é essencial para impedir a desnaturação das enzimas (Hernawan e Fleet, 1995). Figura 4 – Métodos de ruptura celular utilizados na obtenção das peptidases intracelulares de leveduras. Métodos de Ruptura Celular Mecânicos • Ultrassons • Bead mill • Vortex • Homogeneização por alta pressão Não-mecânicos Físicos • Temperatura Químicos • Solventes • Detergentes Enzimáticos • Autólise _________________________________________________________________________________Materiais e Métodos 33 Capítulo II - Materiais e Métodos 1. MATERIAIS 1.1. Amostras Os dois subprodutos resultantes do fabrico da cerveja, dreche e excedente de levedura utilizados neste trabalho, foram fornecidos pela indústria cervejeira UNICER, sediada em Leça do Balio, Portugal. As amostras (dreche e levedura) foram congeladas a -20ºC, imediatamente após a sua recepção. A descongelação foi feita no próprio dia da sua utilização, no frigorífico a 4ºC. 1.2. Reagentes e soluções Os reagentes, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, ácido cítrico, caseína, ácido tricloroacético, glicina, fosfato de sódio monobásico monohidratado, fosfato de sódio dibásico dihidratado, BSA e inibidores sintéticos das peptidases (EDTA, Bestatina, E-64, PMSF e Pepstatina A) foram adquiridos à Sigma. O sulfato de amónio, L-tirosina, Tris, ácido clorídrico, acetonitrilo e ácido trifluoracético foram adquiridos à Merck. O reagente de Bradford foi adquirido à Bio-Rad e as esferas de vidro de 5 mm de diâmetro (Lenz) foram adquiridas à VWR. As membranas de ultrafiltração Amicon® Ultra - 15 de MWCO 10 kDa foram adquiridas à Milipore. As peptidases comerciais utilizadas no trabalho foram a Alcalase® e a Protamex®. A Alcalase® (Calbiochem®) foi adquirida pela Merck. A Alcalase® é uma endopeptidase de serina (EC 3.4.21.62), produzida por Bacillus licheniformis, com Materiais e Métodos _________________________________________________________________________________ 34 actividade óptima a pH 6-10 e a temperaturas entre 50 e 70ºC (Santos et al., 2009a). A actividade enzimática desta preparação é de 3,03 U/ml. A Protamex® é produzida pela Novozymes e foi adquirida pela Sigma. Protamex® é uma mistura de Alcalase® e Neutrase® (Treimo et al., 2008). A Neutrase® é uma metalopeptidase (EC 3.4.24.28) produzida por espécies de Bacillus. A actividade óptima da Protamex® é a pH 5,5-7,5 e a temperatura de 35-60ºC (Liaset et al., 2002). A sua actividade enzimática é de 1,5 U/g. 1.3. Equipamentos Foi utilizada uma balança de humidade (SCALTEC SMO 01, Scaltec Intruments), um eléctrodo de pH (pH-Meter Basic 20+, Crison Instruments), uma centrífuga refrigerada (5810R, eppendorf®), um espectrofotómetro (UV-16A, UV-Vis, Shimadzu Corporation), um banho (1083GFL, Labolan) e um vortex mixer (ZX3, Velp Scientifica). O equipamento de HPLC utilizado era da marca Gilson (Gilson Medical Electronics) e estava equipado com uma bomba do tipo 302, uma bomba do tipo 305, um injector Rheodyne 7125, com um loop de 20 µL e com um detector UV Gilson 118. A coluna utilizada, foi uma coluna de fase reversa Chrompack P 300 RP com um revestimento de polistireno-divinilbenzeno (8 µm, 300 Å, 150 х 4.6 I.D.). O equipamento foi controlado por um software Gilson 712. 2. MÉTODOS 2.1. Extracção das proteínas da dreche e obtenção do CPD O método utilizado para a extracção das proteínas da dreche foi uma adaptação do método descrito por Celus e colaboradores (Celus et al., 2007). O procedimento de extracção das proteínas da dreche e obtenção do CPD está ilustrado na Figura 5. O CPD foi preparado por extracção alcalina da dreche húmida com KOH 0,1 M (43% (p/v)), durante 60 minutos, a 60ºC e com agitação. Em seguida, foi realizada uma centrifugação a 15000хg, durante 15 minutos a 4ºC. As proteínas presentes no sobrenadante foram precipitadas por acidificação a pH 4, com ácido cítrico 2 M. _________________________________________________________________________________Materiais e Métodos 35 Posteriormente foi realizada uma centrifugação a 15000хg, durante 15 minutos a 4ºC. O precipitado rico em proteínas foi recolhido e liofilizado, sendo designado de concentrado de proteínas da dreche (CPD). A quantidade de azoto total presente no precipitado foi determinada pelo método de Kjeldahl e o teor de humidade também foi determinado. Figura 5 – Procedimento para extracção das proteínas da dreche e obtenção do CPD. Dreche Húmida Extracção Alcalina KOH 0,1 M 1h, 60ºC Proteínas SolúveisResíduo Precipitação ácida Ácido cítrico 2 M pH 4 Concentrado de proteínas da dreche (CPD) Sobrenadante Centrifugação Centrifugação Materiais e Métodos _________________________________________________________________________________ 36 2.2. Determinação da solubilidade das proteínas presentes no CPD A solubilidade das proteínas presentes no CPD foi determinada de acordo com o método descrito por Celus e colaboradores (Celus et al., 2007), com algumas modificações. Na avaliação da solubilidade das proteínas do CPD em função do pH, 0,6 g de CPD foram dispersas em 20 ml de soluções tampão de concentração 100 mM (tampão acetato de sódio para pH 5, tampão fosfato de sódio para pH 6 e 7, tampão TrisHCl para pH 8 e tampão glicina-NaOH para pH 9 e 10). O pH das diferentes suspensões foi ajustado, se necessário, e em seguida as suspensões foram agitadas durante 60 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi realizada uma centrifugação a 15000хg, durante 15 minutos a 4ºC. A quantidade de proteína presente no sobrenadante foi determinada pelo método de Bradford. A solubilidade foi expressa como a percentagem (%) de proteína no sobrenadante relativa à quantidade de proteína presente no CPD, sendo calculada da seguinte forma: 100 CPD de amostra na presente Proteína tesobrenadan no presente Proteína (%) deSolubilida  2.3. Determinação do azoto total - Método de Kjeldahl O teor total em azoto presente nas amostras sólidas foi determinado pelo método de Kjeldahl de acordo com o método oficial da AOAC 945.39. O conteúdo em proteína foi determinado pelo teor em azoto, utilizando o factor de conversão de 6.25 (Treimo et al., 2008). As determinações foram realizadas em duplicado. 2.4. Método de Bradford A quantificação da proteína solúvel foi realizada pelo método descrito por Bradford (Bradford, 1976). A BSA (1mg/ml) foi utilizada como padrão. As determinações foram realizadas em triplicado. _________________________________________________________________________________Materiais e Métodos 37 2.5. Determinação da humidade A humidade das amostras de dreche e do CPD foi determinada com auxílio de uma balança de humidade, a uma temperatura de 100ºC. As análises foram feitas em duplicado. 2.6. Extracção e concentração das peptidases da levedura da cerveja Efectuou-se a pesagem de 15 – 17 g de suspensão de células de levedura para um tubo de Falcon e em seguida foi realizada uma centrifugação a 5000хg, durante 5 minutos, para remover restos de cerveja. O pellet de células foi pesado e lavado duas vezes em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7 na proporção de 1:1 (células:tampão, p/v) por centrifugação a 5000хg durante 5 minutos. O método para extracção das peptidases foi realizado com base no procedimento descrito por Kato e colaboradores (Kato et al., 2006), com algumas modificações. O pellet de células lavado foi novamente pesado, ressuspendido em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7 e foram adicionadas esferas de vidro à suspensão celular, na proporção de 1:1:1 (células:tampão:esferas, p/v/p). A disrupção celular foi realizada por agitação no vortex 10 vezes (1 minuto cada) com intervalos de 1 minuto no gelo. Após a remoção das esferas de vidro, foi realizada uma centrifugação a 15000хg durante 40 minutos. O sobrenadante obtido após a centrifugação foi diluído em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7, na proporção (1:2). Em seguida, foi adicionado sulfato de amónio de forma a obter 90% (p/v) de saturação e a mistura foi mantida sobre agitação suave durante 2 horas. O precipitado foi recolhido por centrifugação a 10000хg, durante 30 min, a 4ºC, e em seguida foi redissolvido em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7. Em seguida, a fracção enzimática presente foi dessalinizada e concentrada por ultrafiltração, utilizando membranas Amicon® (MWCO = 10 kDa). O extracto enzimático concentrado foi guardado a -20ºC até à sua utilização. Todas as operações foram realizadas a 4ºC. A actividade proteolítica foi determinada pelo método de hidrólise da caseína. Materiais e Métodos _________________________________________________________________________________ 38 2.7. Determinação da actividade proteolítica – Método de hidrólise da caseína O método de hidrólise da caseína foi utilizado para a determinação da actividade proteolítica do extracto enzimático obtido, bem como, para a verificação da influência do pH na actividade das peptidases da levedura da cerveja. O método de hidrólise da caseína foi também utilizado para determinação da actividade proteolítica das preparações enzimáticas comerciais Alcalase® e Protamex®, uma vez que é difícil saber a quantidade de peptidases presentes nas preparações comerciais, pois não são preparações totalmente puras. A solução de caseína foi preparada segundo o método descrito por Whitaker (Whitaker, 2003). A solução stock de caseína foi preparada por suspensão de 5 g de caseína em 100 ml de água destilada e foram adicionados 0,5 ml de uma solução de NaOH 5 M e em seguida, foi aquecida a 90ºC durante 15 minutos, com agitação. Após arrefecimento, a solução de caseína foi armazenada no frigorífico durante cerca de uma semana. Imediatamente antes da sua utilização, foi preparada uma solução de caseína de concentração 1% (p/v) a partir da solução stock, no tampão adequado de concentração 100 mM (tampão acetato de sódio para pH 5, tampão fosfato de sódio para pH 6 e 7, tampão Tris-HCl para pH 8 e tampão glicina-NaOH para pH 9 e 10). O ensaio de hidrólise da caseína foi realizado por modificação dos métodos descritos por Treimo e colaboradores (Treimo et al., 2008) e por Whitaker (Whitaker, 2003). Para o ensaio de determinação da actividade proteolítica, 1 ml de substrato e tampão (800 µl nos tubos para o extracto enzimático e 980 µl nos tubos para as peptidases comerciais) foram adicionados em cada tubo de ensaio e incubados durante 5 minutos à temperatura de 37ºC. A reacção foi iniciada após a adição de 200 µl de extracto enzimático. No caso das preparações comerciais, foram adicionados 20 µl de uma preparação com 0,006 U. O volume de extracto enzimático adicionado foi maior, uma vez que a preparação das peptidases da levedura da cerveja não é tão concentrada como as preparações comerciais. Após 30 minutos de incubação a 37ºC, foram adicionados 3 ml de uma solução de ácido tricloroacético (TCA) gelado [100 mM TCA, 1,9% (v/v) ácido acético e 220 mM de acetato de sódio]. Os tubos foram mantidos em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente, para completar a precipitação dos produtos insolúveis em TCA (substrato não digerido e polipéptidos de peso molecular elevado). Em seguida, o precipitado foi removido por centrifugação a 10000хg, durante 10 minutos. A quantidade de péptidos solúveis em TCA foi medida espectrofotometricamente a 280 nm. Os ensaios foram realizados em duplicado e os _________________________________________________________________________________Materiais e Métodos 39 brancos foram preparados pela adição de 3 ml da solução de TCA antes da adição das enzimas. Também foram realizados controlos, com a adição de enzimas e sem adição de substrato, assim como, controlos em que foi adicionado substrato e sem adição de enzima. A actividade proteolítica foi expressa em termos de variação de absorvência ou foi convertida em unidades de actividade (U) pela seguinte fórmula: FD T Ve Vt eequivalent tirosina-L de mol U      onde, µmol de L-tirosina equivalente é calculado a partir da recta padrão de L-tirosina (µmol de L-tirosina = 1,340 Abs 280 nm – 0,00415); Vt = Volume total do ensaio (ml); Ve = Volume de preparação enzimática (ml); T = Tempo de ensaio (min); e FD = Factor de diluição. Uma unidade foi definida como a quantidade de enzima necessária para libertar o equivalente a 1 µmol de L-tirosina por minuto nas condições do ensaio. A quantidade de tirosina foi determinada a partir de uma recta padrão de L-tirosina, utilizando uma solução de L-tirosina 1,1 mM. 2.8. Hidrólise enzimática das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja e pelas peptidases comerciais, Alcalase® e Protamex® Para obtenção dos hidrolisados das proteínas da dreche, a amostra de CPD foi solubilizada em tampão Tris-HCl, a pH 8 [3% (p/v)], durante 60 minutos, à temperatura ambiente, para solubilizar todas as proteínas presentes no CPD. Após a solubilização, foi realizada uma centrifugação (15000хg durante 15 minutos a 4ºC). O sobrenadante foi recolhido e foi determinada a concentração de proteína pelo método de Bradford. Em seguida, o sobrenadante foi diluído de forma a ter uma solução de CPD, com uma concentração de proteína de 2 mg/ml, a qual foi utilizada como substrato para as peptidases. A hidrólise das proteínas da dreche foi realizada pelo mesmo procedimento descrito para a hidrólise da caseína (em 2.7). O método utilizado para a determinação da Materiais e Métodos _________________________________________________________________________________ 40 hidrólise das proteínas da dreche é baseado na determinação dos péptidos e aminoácidos solúveis em TCA, que resultaram da hidrólise das proteínas da dreche e foram quantificados a 280 nm. Nota: a actividade para a caseína não corresponde necessariamente à actividade para as proteínas da dreche, nas condições de hidrólise utilizadas neste estudo. 2.9. Efeito da concentração de peptidases da levedura da cerveja e da concentração de substrato na hidrólise das proteínas da dreche Para verificar o efeito da concentração de peptidases da levedura da cerveja, na hidrólise das proteínas da dreche, foram utilizados dois volumes diferentes de extracto enzimático, 200 µl e 500 µl, e uma concentração de substrato de 5 mg/ml. Para verificar o efeito da concentração de substrato (proteínas da dreche) na hidrólise das proteínas da dreche, foram utilizadas duas concentrações diferentes de substrato, 2 mg/ml e 5 mg/ml, e um volume de extracto enzimático de 200 µl. A hidrólise foi realizada a pH 8 e a 37ºC, utilizando o procedimento descrito em 2.8. A actividade foi expressa em termos de variação de absorvência a 280 nm. 2.10. Efeito do pH na hidrólise das proteínas da dreche Para determinar o efeito do pH, bem como, o pH óptimo de hidrólise, a hidrólise das proteínas da dreche foi realizada a 37ºC e a diferentes valores de pH (5-10), utilizando as seguintes soluções tampão na concentração de 100 mM: tampão acetato de sódio (pH 5), fosfato de sódio (pH 6-7), Tris-HCl (pH 8) e glicina-NaOH (pH 9-10). A hidrólise enzimática foi realizada segundo o procedimento descrito em 2.8. A actividade máxima verificada foi considerada 100% e as actividades relativas foram calculadas. _________________________________________________________________________________Materiais e Métodos 41 2.11. Efeito da temperatura na hidrólise das proteínas da dreche O efeito da temperatura na hidrólise das proteínas da dreche foi avaliado a diferentes temperaturas, 25, 37, 45, 50, 60 e 70ºC, ao pH óptimo determinado. A hidrólise enzimática foi realizada segundo o procedimento descrito em 2.8. Os resultados foram expressos em percentagem da actividade máxima verificada (considerada como 100%). 2.12. Efeito do tempo na hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja As peptidases da levedura da cerveja foram incubadas com as proteínas da dreche, nas condições de pH e temperatura óptimos, em diferentes períodos de incubação 0, 10, 20, 30, 40 e 60 minutos. Após o período de incubação, foi determinada a actividade sobre as proteínas da dreche pelo procedimento descrito em 2.8. A actividade foi expressa em unidades de actividade (U). 2.13. Detecção de potenciais inibidores endógenos das peptidases da levedura da cerveja A detecção de potenciais inibidores endógenos das peptidases da levedura da cerveja, que hidrolisam as proteínas da dreche, foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Bolumar e colaboradores (Bolumar et al., 2005; Bolumar et al., 2006), com algumas modificações. O extracto enzimático foi dividido em duas aliquotas. Uma aliquota foi diluída a metade, em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7 e a outra foi diluída a metade, em tampão acetato de sódio 100 mM pH 5. Ambas foram incubadas durante 20 horas a 25ºC. Os extractos enzimáticos após 0 horas de incubação e 20 horas de incubação a 25ºC, foram utilizados para hidrolisar as proteínas da dreche, nas condições de pH e temperatura óptimos, pelo procedimento descrito em 2.8. Um aumento da absorvência a 280 nm, e consequentemente, o aumento da hidrólise das proteínas da dreche, reflecte a destruição dos inibidores endógenos, devido à incubação prolongada a 25ºC e/ou a pH ácido. A actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as Resultados e Discussão _____________________________________________________________________________ 48 A pH 5 verificou-se uma redução de cerca de 34% da actividade das peptidases e a pH 10 verificou-se uma redução de cerca de 56% da actividade, em relação à actividade máxima verificada. Figura 8 – Influência do pH na actividade das peptidases da levedura da cerveja, na hidrólise da caseína 1% a 37ºC. 3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DAS PROTEÍNAS DA DRECHE COM AS PEPTIDASES DA LEVEDURA DA CERVEJA 3.1. Optimização das condições de hidrólise As condições de hidrólise, tais como, o pH, a temperatura, a concentração de enzima, a concentração de substrato e o tempo são muito importantes na obtenção de hidrolisados (Santos et al., 2009a). Neste trabalho experimental, foram testadas diferentes concentrações de substrato e enzima, assim como, a influência do pH, da temperatura e do tempo na hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja. 0 20 40 60 80 100 120 4 5 6 7 8 9 10 11 Actividade Relativa (%) pH _____________________________________________________________________________ Resultados e Discussão 49 3.1.1. Efeito da concentração de peptidases e de substrato As proteínas do CPD, solubilizadas a pH 8, foram utilizadas como substrato para as peptidases da levedura da cerveja, na concentração de 5 mg/ml. Utilizaram-se dois volumes diferentes (200 e 500 µl) de extracto de peptidases da levedura da cerveja. A hidrólise enzimática das proteínas da dreche foi realizada a pH 8 e a 37ºC, durante 30 min. Os resultados encontram-se na Figura 9. Verificou-se que aumentando a concentração de extracto enzimático, a absorvência a 280 nm também aumenta, o que significa um aumento da hidrólise das proteínas da dreche. Figura 9 – Hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja, a pH 8 e a 37ºC, na presença de diferentes volumes de extracto enzimático e com uma concentração de substrato de 5 mg/ml. O efeito da concentração de substrato na hidrólise das proteínas da dreche, pelas peptidases da levedura da cerveja, foi avaliado e os resultados encontram-se na Figura 10. Foram utilizadas duas concentrações de substrato, 2 e 5 mg/ml e 200 µl de extracto enzimático. A hidrólise enzimática foi realizada a 37ºC e a pH 8. Após a análise dos resultados foi possível verificar, que a hidrólise das proteínas da dreche é maior na presença de concentrações de substrato mais elevadas (5 mg/ml). 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 200 500 Abs 280 nm Volume de extracto enzimático (µl) Resultados e Discussão _____________________________________________________________________________ 50 Figura 10 – Efeito da concentração de substrato na hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja, a pH 8 e a 37ºC. Os resultados obtidos permitiram concluir, que foi possível verificar maior hidrólise das proteínas da dreche, utilizando a concentração de 5 mg/ml de substrato e 500 µl de extracto enzimático. Contudo, nestas condições, a absorvência a 280 nm é bastante elevada (>1). Assim, para os restantes ensaios foi utilizada uma concentração de substrato de 2 mg/ml e um volume de extracto enzimático de 200 µl. 3.1.2. Efeito do pH O efeito do pH na hidrólise das proteínas da dreche, pelas peptidases da levedura da cerveja foi determinado num intervalo de pH de 5-10 e à temperatura de 37ºC. Não foram realizados ensaios a valores de pH inferiores a 5, uma vez que na literatura foi referido que peptidases com actividade óptima na zona de pH baixos (pH 3-5), por exemplo, a pepsina e a actinidina, apresentam baixa actividade sobre as proteínas da dreche (Celus et al., 2007; Treimo et al., 2008). 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 2 5 Abs 280 nm [Proteínas dreche] (mg/ml) _____________________________________________________________________________ Resultados e Discussão 51 Os resultados obtidos no estudo do efeito do pH, na hidrólise das proteínas da dreche encontram-se na Figura 11. Após a análise dos resultados foi possível concluir, que as peptidases da levedura da cerveja actuaram sobre as proteínas da dreche num intervalo de pH 5-9. Na zona de pH 6-7, as peptidases da levedura da cerveja apresentaram maior actividade sobre as proteínas da dreche, sendo pH 6, o pH óptimo para a hidrólise. A levedura Saccharomyces cerevisiae possui inúmeras peptidases, que são activas na zona de pH 6-7, tais como a aspartil aminopepidase, peptidase B, carboxipeptidase y, kex carboxipeptidase, aminopeptidase I, carboxipeptidase S, entre outras peptidases (Brenda, 2011). Figura 11 – Influência do pH na hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja. A actividade foi expressa em termos de percentagem relativa. A pH 5 e a pH 9, a actividade das peptidases da levedura sobre as proteínas da dreche foi de apenas cerca de 32% e 18%, respectivamente, em relação à actividade máxima verificada. A pH 10, as peptidases da levedura da cerveja praticamente não hidrolisaram as proteínas da dreche (apenas cerca de 1% de actividade foi observada). Os resultados obtidos para determinação do pH óptimo de actividade das peptidases da levedura da cerveja, pelo método de hidrólise da caseína, mostraram a actividade óptima das peptidases da levedura da cerveja na zona de pH 7-8. Contudo, os 0 20 40 60 80 100 120 4 5 6 7 8 9 10 11 Actividade relativa (%) pH Resultados e Discussão _____________________________________________________________________________ 52 resultados obtidos para a hidrólise das proteínas da dreche revelaram que o pH óptimo de hidrólise foi 6. A pH 8 verificou-se uma redução significativa na actividade das peptidases da levedura da cerveja, sobre as proteínas da dreche. Estas diferenças estão provavelmente relacionadas com o tipo de substrato utilizado. Segundo North (North, 1982), quando são utilizados substratos diferentes para avaliar a influência do pH na hidrólise de proteínas, são observadas diferenças significativas no pH óptimo de hidrólise, pela mesma enzima. Por exemplo, quando se utiliza a caseína como substrato, normalmente o pH óptimo é maior do que quando se utiliza a hemoglobina como substrato. Assim, o pH óptimo pode ser uma característica do substrato, assim como, das peptidases (North, 1982). 3.1.3. Efeito da temperatura Os resultados do efeito da temperatura na actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche, encontram-se na Figura 12. A actividade das peptidases da levedura da cerveja foi máxima a temperaturas de 50-60ºC. A 37ºC verificou-se cerca de 47% da actividade máxima e a 25ºC apenas cerca de 13%. Para temperaturas superiores a 60ºC, a actividade foi drasticamente reduzida, verificando-se apenas cerca de 6% de actividade relativa após a incubação a 70ºC. Figura 12 – Influência da temperatura na hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja. A actividade foi expressa em termos de percentagem relativa. 0 20 40 60 80 100 120 20 30 40 50 60 70 80 Actividade relativa (%) Temperatura (oC) _____________________________________________________________________________ Resultados e Discussão 53 3.1.4. Efeito do tempo A actividade das peptidases da levedura da cerveja, utilizando as proteínas da dreche como substrato, foi avaliada ao longo do tempo (até 60 minutos de incubação), nas condições de pH e temperatura óptimas, isto é, à temperatura de 50ºC e a pH 6. Após a análise da Figura 13, verificou-se que a actividade das peptidases aumentou com o tempo, até um período de incubação de 40 minutos. Ao fim de 30 minutos, a actividade foi aproximadamente o dobro da actividade ao fim de 10 minutos. No entanto, a partir de 40 minutos, a actividade das peptidases não aumentou, talvez devido à pouca disponibilidade de substrato. Estes resultados permitiram concluir, que ao fim de uma hora de incubação a 50ºC e a pH6, as peptidases da levedura da cerveja hidrolisaram as proteínas da dreche, sem perda de actividade. Figura 13 – Efeito do tempo na hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja, nas condições de pH e temperatura óptimos. A actividade foi expressa em unidades de actividade (U). 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 010 20 30 40 50 60 70 Actividade (U) Tempo (min) Resultados e Discussão _____________________________________________________________________________ 54 3.2. Detecção de potenciais inibidores endógenos das peptidases da levedura da cerveja As peptidases vacuolares da levedura Saccharomyces cerevisiae, em particular, a peptidase B e carboxipeptidase Y, têm inibidores endógenos localizados no citoplasma. Após a disrupção das células da levedura, formam-se complexos entre os inibidores e as peptidases vacuolares (Bolumar et al., 2005; Lenney, 1975; Tanimizu e Hayashi, 1996). A presença de inibidores endógenos das peptidases vacuolares, também foi detectada em outras leveduras que não pertencem ao género Saccharomyces, tais como, Debaryomyces hansenii e Kluyveromyces lactis (Bolumar et al., 2006; Flores et al., 1999). As peptidases vacuolares, normalmente, apresentam actividade óptima a pH 6 (Sorensen et al., 1994). Uma vez que as peptidases da levedura da cerveja apresentaram maior actividade sobre as proteínas da dreche a pH 6, foi avaliada a potencial presença desses inibidores, que podem inibir as peptidases vacuolares, e consequentemente, podem reduzir a actividade destas peptidases. Para inactivar os inibidores endógenos das peptidases vacuolares, têm sido utilizadas diferentes estratégias, tais como, longos períodos de incubação a 25ºC e/ou a pH 5 (Bolumar et al., 2005). Hayashi e colaboradores (Hayashi et al., 1968) descreveram a activação das peptidases vacuolares (peptidase B e carboxipeptidase y) da levedura Saccharomyces cerevisiae, após a incubação a pH 5. A possível destruição ou inactivação de inibidores endógenos, promoveu a dissociação do complexo enzimainibidor, resultando na activação das peptidases vacuolares (Hayashi et al., 1968). A actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche foi avaliada a 50ºC e a pH 6, após a incubação do extracto enzimático, durante 20 horas a 25ºC, a pH 5 e 7. Os resultados obtidos (Tabela 8) indicaram, que após 20 horas de incubação a pH 7 e a 25ºC, a actividade das peptidases da levedura da cerveja diminui cerca de 31%, em relação à actividade verificada em 0 horas de incubação, o que significou, que longos períodos de incubação a pH 7 e a 25ºC reduziram a hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja. Após a incubação a 25ºC e a pH 5 durante 20 horas, verificou-se que a actividade das peptidases duplicou, em relação a actividade verificada em 0 horas de incubação, a pH 5 e 25ºC. Estes resultados permitiram concluir, que a actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche aumentou após longos períodos de incubação a pH ácido. _____________________________________________________________________________ Resultados e Discussão 55 Tabela 8 – Hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja em diferentes concentrações para detectar a potenciais inibidores endógenos. A actividade foi expressa em percentagem da actividade mais alta verificada, que foi considerada 100%. Tempo (horas) Extracto enzimático pH=7 Extracto enzimático pH=5 0 89,7 41,6 20 58,4 100,0 O aumento da actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche, após 20 horas de incubação a pH 5, indicou a potencial presença de inibidores das peptidases vacuolares. Assim, peptidases vacuolares, como a peptidase B e a carboxipeptidase y, podem estar envolvidas na hidrólise das proteínas da dreche. Contudo, para confirmar que as peptidases vacuolares hidrolisam as proteínas da dreche, seria necessário isolar e purificar cada uma destas peptidases, e na presença de inibidores sintéticos específicos, verificar se realmente essas peptidases vacuolares hidrolisam as proteínas da dreche. 3.3. Efeito de inibidores sintéticos na actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche O efeito de inibidores sintéticos, na actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche foi avaliado, com o objectivo de verificar qual o tipo catalítico das peptidases que são responsáveis pela hidrólise das proteínas da dreche, nas condições óptimas de temperatura e pH, isto é, à temperatura de 50ºC e a pH 6. Para tal, foram utilizados inibidores dos quatro principais tipos catalíticos de peptidases (peptidases de serina, cisteína, ácido aspártico e metalopeptidases). Os resultados encontram-se na Tabela 9. Resultados e Discussão _____________________________________________________________________________ 56 Tabela 9 – Efeito de inibidores sintéticos na actividade das peptidases da levedura da cerveja sobre as proteínas da dreche. Inibidores Tipo catalítico Concentração (mM) Actividade relativa (%) Pepstatina A Ácido Aspártico 0,01 105 0,05 103 E-64 Cisteína 0,01 107 0,05 91 PMSF Serina 1 95 2 69 EDTA Metalo 10 71 20 50 Bestatina Metalo (aminopeptidases) 0,01 102 0,05 93 Após análise dos resultados, verificou-se que nenhum dos inibidores reduziu mais de 50% a actividade das peptidases da levedura sobre as proteínas da dreche. A pepstatina A, nas concentrações de 0,01 mM e 0,05 mM, não apresentou efeito inibitório na actividade peptidases da levedura da cerveja. O EDTA, na concentração de 20 mM, reduziu a actividade das peptidases em cerca de 50% e o PMSF na concentração de 2 mM reduziu a actividade em cerca de 31% a actividade das peptidases da levedura sobre as proteínas da dreche. Estes resultados sugerem, que poderão ser peptidases de serina e metalopeptidases, as principais responsáveis pela hidrólise das proteínas da dreche, nas condições de pH e temperatura óptimos. As metalopeptidases e as peptidases de serina são geralmente activas a pH 7-9 (Wilhite et al., 2000). Contudo, as leveduras do género Saccharomyces, em particular a Saccharomyces cerevisiae, contêm várias peptidases activas a pH 6-7, incluindo peptidases de serina, como a peptidase B, carboxipeptidase Y e Kex carboxipeptidase, bem como, metalopeptidases, como a aspartil metalopeptidase, peptidase D e a carboxipeptidase S (Brenda, 2011). Em particular, as peptidases de serina, como é o caso da carboxipeptidase y e a kex carboxipeptidase, são activas a pH ácido, apresentando pH óptimo de actuação na zona pH 4,5-6 (NC-IUBMB, 2010; Rawlings e Barrett, 2010). A fraca inibição causada pelos inibidores E-64 e Bestatina, nas concentrações mais elevadas, poderá significar que não serão peptidases de cisteína e aminopeptidases _____________________________________________________________________________ Resultados e Discussão 57 (do tipo catalítico metalopeptidases), as responsáveis pela hidrólise da maioria das proteínas da dreche, nas condições do ensaio. Contudo, Yokoyama e colaboradores, referem que a aspartil aminopeptidase, presente no citoplasma das leveduras, ao contrário da maioria das aminopeptidases, não é inibida por Bestatina, mas apenas por EDTA (Yokoyama et al., 2006). Os resultados da utilização de inibidores sintéticos, para a classificação das peptidases da levedura da cerveja, devem ser analisados com bastante cuidado, uma vez que, não é garantido o efeito dos inibidores na actividade das peptidases, sobretudo quando não se utiliza um substrato natural (como a caseína) e quando não se utilizam preparações enzimáticas puras (Osman, 2003; Storey e Wagner, 1986). A utilização de preparações enzimáticas pouco purificadas, e a utilização de extractos que contêm vários tipos de peptidases, pode conduzir a resultados erróneos, pois os componentes do extracto podem influenciar a ligação enzima-inibidor. Por outro lado, o local activo das peptidases pode não estar realmente acessível à ligação do inibidor (Storey e Wagner, 1986). Assim, seria necessário purificar o extracto de peptidases da levedura da cerveja para obter várias fracções com actividade proteolítica sobre as proteínas da dreche, de forma a confirmar o tipo catalítico da(s) peptidase(s) da levedura da cerveja, que é(são) responsável(is) pela hidrólise das proteínas da dreche. Algumas complicações na determinação do tipo catalítico podem surgir, devido ao facto de alguns inibidores utilizados na determinação do tipo catalítico das peptidases, não serem absolutamente específicos apenas para um único tipo catalítico de peptidases (Storey e Wagner, 1986). Assim, o PMSF é um inibidor irreversível das peptidases de serina. No entanto, pode também inibir algumas peptidases de cisteína. O EDTA é um inibidor reversível das metalopeptidases, mas pode também inibir outras peptidases dependentes de iões metálicos, tais como, algumas peptidases de cisteína que são dependentes de iões cálcio (Beynon e Bond, 2001; Storey e Wagner, 1986). Também é de salientar, que algumas aminopeptidases do tipo catalítico metalo, como é o caso da aspartil aminopeptidase presente em leveduras, não são inibidas por Bestatina, um inibidor da maioria das aminopeptidases do tipo catalítico metalo (Yokoyama et al., 2006). Resultados e Discussão _____________________________________________________________________________ 64 Celus e colaboradores (Celus et al., 2007) referiram que os hidrolisados das proteínas da dreche obtidos após elevada hidrólise com a Alcalase® apresentam menor capacidade de emulsificação e formação de espuma, ao passo os hidrolisados obtidos com a Flavourzyme® apresentam boas propriedades tecno-funcionais independentemente do grau de hidrólise. Estes dados permitem concluir, que nem sempre os hidrolisados obtidos com peptidases que hidrolisam em maior extensão as proteínas da dreche, podem apresentar boas propriedades funcionais. Assim, seria interessantes estudar as propriedades funcionais dos hidrolisados obtidos com as peptidases da levedura da cerveja. A utilização das peptidases da levedura da cerveja para obter hidrolisados pode ser vantajosa, uma vez que o seu pH óptimo de actuação é mais baixo do que as peptidases comerciais utilizadas e porque as peptidases da levedura da cerveja são mais facilmente inactivadas a temperaturas altas (70ºC) do que as peptidases Alcalase® e Protamex®, o que segundo Candido e Sgarbieri (Candido e Sgarbieri, 2003) favorece a inactivação das peptidases no final do processo de hidrólise. Seria interessante comparar a actividade da peptidases da levedura da cerveja com as peptidases comerciais, utilizando outras técnicas de determinação da actividade proteolítica, tais como a técnica pH stat ou técnicas que se baseiam na quantificação dos grupos amina libertados durante a hidrólise de ligações peptídicas do substrato, com a utilização de reagentes como o TNBS ou a ninidrina. Estas técnicas apresentam a vantagem de serem mais informativas, relativamente às técnicas de quantificação dos resíduos aminoácidos, pois permitem determinar o número de ligações peptídicas que foram clivadas no substrato. A técnica utilizada neste estudo, para quantificação da actividade proteolítica tem a vantagem de ser barata e de fácil execução, no entanto, está dependente do conteúdo em aminoácidos aromáticos do substrato (Bhaskar et al., 2002; Rutherfurd, 2010). _____________________________________________________________________________ Resultados e Discussão 65 5. SEPARAÇÃO POR RP-HPLC/UV DOS PÉPTIDOS RESULTANTES DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DAS PROTEÍNAS DA DRECHE PELAS PEPTIDASES DA LEVEDURA DA CERVEJA E PELAS PEPTIDASES COMERCIAIS A separação dos hidrolisados, obtidos após hidrólise enzimática das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja e pelas peptidases comerciais, Alcalase® e Protamex®, foi realizada por cromatografia de fase reversa, com detecção UV. Na Figura 17 encontram-se os perfis cromatográficos obtidos após hidrólise enzimática com as peptidases da levedura da cerveja, Protamex® e Alcalase®. Os três tipos de hidrolisados apresentaram péptidos com peso molecular e polaridade semelhante, como se pode verificar nos cromatogramas da Figura 17. As fracções com menor tempo de retenção correspondem a péptidos com peso molecular menor e as fracções com maior tempo de retenção correspondem a péptidos com maior peso molecular e maior afinidade para a coluna cromatográfica. A separação cromatográfica por RP-HPLC é principalmente baseada nas diferenças de hidrofobicidade, mas o tamanho dos péptidos também influencia os tempos de retenção. Existe uma relação entre o peso molecular dos péptidos e o tempo de retenção na cromatografia de fase reversa. Em geral, as amostras com péptidos maiores são eluídas mais tarde do que as amostras com péptidos mais pequenos, o que significa que o tempo de retenção é maior para péptidos de maior tamanho (van der Ven et al., 2001). O tempo de retenção dos péptidos mais pequenos (com menos de 15 resíduos) apenas depende da composição em aminoácidos. No caso dos péptidos maiores, o tempo de retenção é também influenciado pelo peso molecular dos péptidos e pela conformação (Celus et al., 2007; van der Ven et al., 2001). A análise dos cromatogramas da Figura 17 também permitiu verificar, que a Alcalase® foi a peptidase que apresentou maior actividade sobre as proteínas da dreche, uma vez que foi detectada maior quantidade de péptidos, o que confirma os resultados obtidos anteriormente. A monitorização da absorvência foi realizada a 215 nm, que corresponde à absorvência das ligações peptídicas, o que implica que o nível de péptidos pequenos é subestimado (Celus et al., 2007; van der Ven et al., 2001). Resultados e Discussão _____________________________________________________________________________ 66 Figura 17 – Perfis cromatográficos dos hidrolisados obtidos após hidrólise enzimática das proteínas da dreche com as peptidases da levedura da cerveja, Protamex® e Alcalase®. A hidrólise enzimática foi realizada nas condições de pH e temperatura óptimos para cada tipo de peptidase. A absorvência (215 nm) foi expressa em unidades arbitrárias (UA). Abs 215 nm (UA) Abs 215 nm (UA) Abs 215 nm (UA) Tempo (min) Tempo (min) Tempo (min) Alcalase® Protamex® Peptidases LC _________________________________________________________________________________________ Conclusão 67 Capítulo IV - Conclusão O fabrico de cerveja envolve, inevitavelmente, a produção de vários resíduos e subprodutos, sendo a dreche e o excedente de levedura, os dois subprodutos produzidos em maior quantidade. No entanto, estes subprodutos podem ser reciclados e reutilizados, uma vez que apresentam valor nutricional, podendo ser utilizados na alimentação animal e humana. Além disso, têm elevado potencial biotecnológico e são fonte de vários produtos de valor acrescentado, incluindo as proteínas. O trabalho experimental descrito nesta dissertação teve como principal objectivo fornecer uma base científica para a valorização de dois dos principais subprodutos da indústria cervejeira, a dreche e o excedente de levedura, em particular, a valorização da fracção proteica da dreche e das peptidases da levedura da cerveja para a obtenção de hidrolisados. A dreche é um subproduto rico em proteínas que são maioritariamente insolúveis. A potencial aplicação das proteínas insolúveis da dreche requer a utilização de métodos de obtenção dessas proteínas. A extracção das proteínas da dreche pode ser realizada por métodos químicos, físicos e bioquímicos, ou pela combinação de vários métodos. Neste trabalho experimental, as proteínas da dreche foram obtidas por extracção alcalina seguida de precipitação ácida. O concentrado de proteínas obtido continha cerca de 60% de proteínas, solúveis a pH alcalino. O excedente de levedura da cerveja pode ser utilizado como fonte de várias peptidases intracelulares, que podem ser isoladas e purificadas. As peptidases têm inúmeras funções a nível fisiológico e aplicações a nível industrial. Contudo, os estudos sobre a aplicação industrial das peptidases de leveduras do género Saccharomyces, em particular da levedura da cerveja são raros. A obtenção das peptidases intracelulares da levedura da cerveja requer a utilização de métodos mecânicos e/ou não mecânicos. Neste trabalho experimental, as peptidases da levedura da cerveja foram extraídas por agitação em vortex com esferas de vidro. As peptidases extraídas apresentaram Conclusão _________________________________________________________________________________________ 68 actividade na zona de pH 5-10, com actividade óptima na zona de pH neutro-alcalino (pH 7-8). O concentrado de proteínas da dreche, após solubilização a pH 8, foi utilizado como substrato na obtenção de hidrolisados, utilizando as peptidases da levedura da cerveja. Os resultados obtidos permitiram verificar que as peptidases da levedura da cerveja hidrolisam as proteínas da dreche. As condições para obtenção dos hidrolisados das proteínas da dreche com as peptidases da levedura da cerveja foram estudadas. Os resultados obtidos demonstraram que o aumento da concentração de peptidases da levedura da cerveja e o aumento da concentração de proteínas da dreche resultaram num aumento da hidrólise. De uma forma geral, a hidrólise enzimática aumentou com o aumento do tempo da reacção (até 40 min). O pH e temperatura óptimos para a hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja foram de 6 e 50ºC, respectivamente. A potencial presença de inibidores endógenos das peptidases vacuolares nos extractos enzimáticos foi detectada, devido a um aumento da hidrólise das proteínas da dreche após longos períodos de incubação dos extractos enzimáticos a pH ácido. Estes resultados também indicaram a possibilidade de as peptidases vacuolares, tais como a peptidases B e a carboxipeptidase Y, estarem envolvidas na hidrólise das proteínas da dreche. Os resultados da utilização de inibidores sintéticos demonstraram, que possivelmente são peptidases de serina e metalopeptidases as principais responsáveis pela hidrólise das proteínas da dreche. A hidrólise enzimática do concentrado de proteínas da dreche com peptidases comerciais Alcalase® e Protamex® foi também estudada neste trabalho. O pH óptimo de hidrólise das proteínas da dreche pela Alcalase® foi 9 e pela Protamex® foi 8. A temperatura óptima para a Alcalase® e a Protamex® foi 60ºC. A hidrólise das proteínas da dreche com as peptidases comerciais e com as peptidases da levedura da cerveja foi comparada. Nas condições óptimas de pH e temperatura, a Alcalase® foi a enzima que apresentou maior actividade sobre as proteínas da dreche. Estes resultados foram comprovados pela análise dos hidrolisados por RP-HPLC/UV. A separação dos hidrolisados por RP-HPLC/UV também permitiu verificar que os hidrolisados obtidos com as peptidases comerciais e com as peptidases da levedura da cerveja apresentaram tempos de retenção semelhantes. O trabalho realizado constitui uma base para vários estudos adicionais, tais como, a optimização do processo de extracção e purificação das peptidases da levedura da cerveja, de forma a aumentar o rendimento da hidrólise das proteínas da dreche; a caracterização dos hidrolisados obtidos a partir da hidrólise das proteínas da dreche _________________________________________________________________________________________ Conclusão 69 pelas peptidases da levedura da cerveja, em particular, a determinação do peso molecular dos péptidos obtidos e a determinação da composição em aminoácidos, bem como, a identificação dos péptidos e aminoácidos produzidos; o estudo das propriedades funcionais, nutricionais e bioactivas dos péptidos e aminoácidos resultantes da hidrólise das proteínas da dreche pelas peptidases da levedura da cerveja; o estudo de potenciais aplicações das peptidases da levedura da cerveja a nível industrial, nomeadamente na indústria alimentar, a nível médico e biotecnológico; e a aplicação das peptidases intracelulares da levedura da cerveja para obtenção de hidrolisados, a partir de outros subprodutos industriais, tais como, os subprodutos resultantes da indústria de processamento de pescado, bem como de outros substratos de natureza proteica. ________________________________________________________________________________________ Referências 71 Referências ALIYU, S. e BALA, M. 2011. 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