Pesquisa de inibidores de endoproteases da matriz associadas ao desenvolvimento tumoral em sementes de diferentes espécies de leguminosas

Pesquisa de inibidores de endoproteases de matriz associadas ao desenvolvimento tumoral em sementes de diferentes espécies de leguminosas Jennifer dos Santos Oliveira Porto, 2015 ii Pesquisa de inibidores de endoproteases de matriz associadas ao desenvolvimento tumoral em sementes de diferentes espécies de leguminosas Search of matrix endoprotease inhibitors associated to tumor development in the seeds of different legume species Jennifer dos Santos Oliveira Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa Professor Doutor Ricardo Manuel de Seixas Boavida Ferreira, Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa Doutora Ana Isabel Gusmão Lima, Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa Prof. Doutor José Alejandro Ribeiro dos Santos, Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto Dissertação de candidatura ao grau de Mestre em Nutrição Clínica apresentada à Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto 2015 iii Agradecimentos Início os meus agradecimentos ao meu orientador Professor Doutor Ricardo Boavida pelos seus conhecimentos, disponibilidade, interesse e experiência. À minha coorientadora, Doutora Ana Lima, pelos conselhos, pelos ensinamentos e pela simpatia demonstrada. Ao meu coorientador, Prof. Doutor José Alejandro dos Santos, pela ajuda e pela disponibilidade. Não posso deixar de agradecer ao Instituto Superior de Agronomia pela disponibilidade de realizar a minha dissertação nas suas instalações. Agradeço a todos os colegas do laboratório pelo apoio, ajuda e paciência em especial à Eduarda, Phill, Inês, Miguel, Regina, Ana Cristina, Sofia, Margarida, Filipe, Raimundo, António e Maria João. Á Sara um agradecimento especial pelo companheirismo, pela amizade e principalmente pela paciência e ajuda ao longo de todo o trabalho. Tenho que agradecer inevitavelmente à minha irmã, Sabrina, pelos anos de companheirismo, amizade e paciência. Por ter ouvido vezes sem conta as minhas dúvidas e incertezas e por ter estado sempre comigo. Aos meus amigos, principalmente à Margarida, Carla, Catarina, Inês, São, Milhas, Silvestre, Johnny, Fábio, Solange e Sofia pelas palavras de motivação e confiança e principalmente pela amizade. Agradeço ainda à minha família pela preocupação demonstrada e por me ajudarem a manter a confiança. Finalmente, agradeço aos meus paisque sempre primaram pela minha educação. Um muito obrigado, além de me oferecerem a oportunidade de estudar, sempre estiveram presentes e sou muito feliz por isso. iv Resumo As metaloproteinases de matriz (MMP), particularmente as gelatinases, MMP-2 e MMP-9, estão associadas ao desenvolvimento de metástases tumorais que, por sua vez são responsáveis pela maioria das mortes induzidas por cancro do cólon. O consumo de leguminosas tem demostrado inibir a atividade metastática em vários estudos. Pretendeu-se verificar quais os compostos presentes em diferentes espécies de leguminosas (fava, feijão vermelho, grão-debico, lentilha, soja e tremoço) que apresentavam maior inibição das gelatinases e, por consequência, maior redução da capacidade de migração e de multiplicação celular em células do carcinoma do cólon humano. Verificou-se ainda o efeito da cozedura nestas bioatividades. Por último, realizou-se um estudo comparativo da capacidade de inibição da MMP-9 utilizando a mesma massa de semente para tentar inferir qual a espécie com maior potencial antitumoral. O efeito dos compostos proteicos e não proteicos (compostos fenólicos, saponinas e fitato) foi testado na migração e multiplicação de células HT-29, e a sua influência na atividade gelatinolítica foi quantificada. Foi também avaliada a capacidade de inibição da MMP-9 nas frações isoladas utilizando um ensaio fluorimétrico e zimografia reversa. O grão-de-bico, o tremoço e a soja apresentaram maior concentração dos compostos potencialmente bioativos, tendo sido estas as espécies selecionadas para os estudos celulares. Verificou-se que tanto as amostras proteicas como as não proteicas das sementes foram capazes de inibir a migração das células HT29, mas, nas concentrações utilizadas houve uma maior capacidade de inibição v da migração celular por parte dos compostos não proteicos. Na multiplicação celular, somente os compostos não proteicos reduziram o crescimento e a viabilidade celular, sugerindo que os mecanismos de ação entre as duas frações poderão ser diferentes. Todos os compostos estudados inibiram a atividade gelatinolítica no meio das células HT-29 sobretudo por inibição específica da MMP-9 e não da MMP-2. Utilizando a mesma massa de semente, verificou-se que os compostos não proteicos aparentam ter uma maior atividade inibidora da atividade gelatinolítica do que as suas proteínas. Tanto as proteínas como os compostos não proteicos das sementes estudadas parecem ter um efeito inibitório da capacidade tumoral, exibindo possivelmente efeitos sinergísticos nesta bioatividade. O tremoço parece ser, dentro das espécies estudadas, a melhor leguminosa na inibição da MMP-9. Este trabalho, apesar de não ser conclusivo, evidencia a importância de se estudarem novas espécies de leguminosas e abre portas para a realização de estudos com novos compostos com potencial anticancerígeno elevado. Palavras-Chave Ácido fítico, atividade gelatinolítica, células HT-29, compostos fenólicos, cozedura, inibidores de proteases, leguminosas, metaloproteinases de matriz, metástases, migração, MMP-9, multiplicação celular, saponinas e sementes vi Abstract Matrix metalloproteinases (MMPs), mainly gelatinases MMP-2 and MMP-9 are involved in the development of metastases, which are responsible for most deaths due to colon cancer. In several studies, legume consumption has been shown to be associated with metastatic activity inhibition. The aim of this study was to verify which compounds present in different species of legumes (beans, red beans, grain-peas, lentils, soy and lupine) have high inhibition of gelatinases and, thus high reduction of the capacity of migration and cell proliferation in human colon carcinoma cells. It was also verified the effect of cooking on these bioactivities. Finally, we performed a comparative study concerning the ability to inhibit MMP-9 using the same seed mass, in order to infer the species with the greatest antitumor activity potential. The effect of protein and non-protein compounds (phenolics, saponins and phytate) was tested in the migration and proliferation of HT-29 cells and their effects on gelatinase activity was quantified. The capacity to inhibit MMP-9 in the isolated fractions was evaluated using a fluorimetric assay and reverse zymography. Grain-peas, lupine and soy demonstrated to have higher concentration of potentially bioactive compounds and therefore, these species were selected for cellular studies. This study showed that both protein and non-protein samples of seeds were able to inhibit the migration of HT-29 cells. However, the concentrations used in this study showed that non-protein compounds were capable of a greater inhibition of cell migration capacity. In cellular multiplication, vii only the non-protein compounds were able to reduce cell growth and viability, suggesting that the mechanism of action between the two fractions might be different. All of the compounds studied inhibited the gelatinolytic activity on the HT-29 cells, mainly by specific inhibition of MMP-9, but not MMP-2. In addition, this study showed that using the same seed mass, non-protein compounds appear to have higher inhibitory activity of gelatinase activity than their proteins. In this study, both proteins and non-protein compounds in the seeds appear to have an inhibitory effect on the tumor capacity, possibly showing synergistic effects in this bioactivity. From the species studied, the lupine seems to be the best legume in the inhibition of MMP-9. Although not conclusive, this work highlights the importance of studying new species of legumes and contributes to increase the interest in studies with new compounds with high anticancer potential. Keywords Cell proliferation, cooking, gelatinase activity, HT-29 cells, legumes, matrix metalloproteinases, metastasis, migration, MMP-9, phenolic compounds, phytic acid, protease inhibitors, saponins and seeds viii Índice Agradecimentos ...................................................................................................... iii Resumo .................................................................................................................. iv Abstract .................................................................................................................. vi Lista de Abreviaturas .............................................................................................. xi Lista de Figuras .................................................................................................... xiii Lista de Tabelas .................................................................................................... xv 1. Introdução ........................................................................................................... 1 1.1. Metaloproteinases de matriz ........................................................................ 3 1.2. As leguminosas e o cancro .......................................................................... 5 1.2.1. Mecanismos possíveis de atividade antitumoral.................................... 8 1.3. Principais compostos não proteicos das sementes das leguminosas .......... 8 1.3.1. Saponinas.............................................................................................. 8 1.3.2. Ácido fítico ............................................................................................. 9 1.3.3. Compostos fenólicos ........................................................................... 10 1.4. Principais compostos bioativos proteicos das sementes de leguminosas . 11 1.4.1. Proteínas e inibidores de proteases .................................................... 11 1.5. Efeito da cozedura nos compostos bioativos ............................................. 13 2. Objetivos ........................................................................................................... 15 3. Materiais e Métodos ......................................................................................... 16 3.1. Reagentes .............................................................................................. 16 3.2. Materiais biológicos ................................................................................ 16 3.3 Determinação do peso seco ................................................................... 16 ix 3.4 Tratamento térmico ................................................................................. 17 3.4.1. Hidratação........................................................................................ 17 3.4.2. Cozedura ......................................................................................... 17 3.5. Extrações e quantificações dos compostos proteicos ............................. 17 3.5.1. Extração das proteínas solúveis ...................................................... 17 3.5.2. Quantificação do teor proteico ......................................................... 18 3.6. Extrações e quantificações dos compostos não proteicos ...................... 19 3.6.1. Extração do ácido fítico .................................................................... 19 3.6.2. Quantificação do ácido fítico ................................................................ 19 3.6.3. Extração das saponinas ................................................................... 20 3.6.4. Quantificação das saponinas ........................................................... 20 3.6.5. Extração dos compostos fenólicos ................................................... 21 3.6.6. Quantificação dos compostos fenólicos ........................................... 21 3.7. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ............................... 22 3.7.1. Coloração do SDS-PAGE ................................................................ 23 3.8. Zimografia reversa .................................................................................. 23 3.9. Ensaios Celulares .................................................................................. 25 3.9.1. Manutenção das células HT-29 ....................................................... 25 3.9.2. Ensaios de migração ....................................................................... 25 3.9.3. Ensaios de multiplicação................................................................. 25 3.9.4. Ensaios da atividade enzimática do meio extracelular ..................... 26 3.9.5. Zimografia ............................................................................................ 27 3.10. Ensaios da atividade da MMP-9 ............................................................ 27 3.11. Análise estatística ..................................................................................... 27 4. Resultados e Discussão .................................................................................... 28 1 1. Introdução O cancro coloretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais frequente nos homens, depois do cancro dos pulmões e da próstata, e o segundo mais frequente nas mulheres depois do cancro da mama (1). Neste tipo de cancro, apenas 5% dos casos é de origem hereditária (2). A incidência do CCR começa normalmente a manifestar-se nas idades compreendidas entre os 45 e os 50 anos, mas aumenta progressivamente com a idade, e os homens têm um maior risco do que as mulheres (3). Na Europa, surgem cerca de 250 000 novos casos por ano de cancro do cólon, em que aproximadamente 9% são malignos (2), sendo considerado o segundo tipo de cancro em que a mortalidade é maior (4). A prevalência deste tipo de tumor é maior nas zonas urbanizadas e industrializadas (2). Entre 2004 e 2010, na população americana, a sobrevivência após 5 anos do diagnóstico de cancro do cólon variou consoante o estádio em que o mesmo foi primariamente detetado; em indivíduos em que o tumor se encontrava numa fase inicial e não se tinha ainda espalhado para outras partes do corpo, a sobrevivência foi de 92%. Quando havia já metástases, a sobrevivência baixou drasticamente para os 11% (5). É sabido que uma alimentação adequada poderia prevenir entre a 70 a 80% de todos os casos de CCR (6). Para além da dieta, a obesidade e a inflamação são fatores de risco para o este tipo de cancro (7). O consumo de carnes vermelhas, carnes processadas, bebidas alcoólicas (mais de 30 g diários de etanol), aumento da gordura corporal e gordura abdominal são fatores que levam ao desenvolvimento deste cancro. Outros alimentos que podem levar ao 2 desenvolvimento do CCR, mas com evidência limitada, são alimentos com altos teores em ferro, gordura saturada e açúcar (8). Os fatores de risco, não dietéticos, para o cancro do cólon incluem: fumar, uso crónico de anti-inflamatórios não esteróides, aspirina e condições como doenças coloretais, pré-disposição genética e síndrome metabólica (9). A maior parte das mortes por cancro do cólon ocorre devido às metástases noutros tecidos, normalmente no fígado (10). Cerca de 25 a 30% dos doentes com CCR apresentavam metastização no momento do diagnóstico, passando a terapia a ter como principal objetivo prolongar o tempo de vida, mantendo a qualidade desta (2). A metastização é um processo pelo qual o tumor se difunde de um órgão primário para órgãos ou tecidos secundários (11). Para que isto ocorra é necessário que as células cancerígenas passem diversas barreiras fisiológicas(12), sendo que apenas algumas, menos de 0,1%, têm a capacidade de superar todos os obstáculos e sobreviver para formar novas colónias (13). No entanto, como já mencionado, uma percentagem relevante dos indivíduos com cancro apresenta metastização. As metástases definem o tumor maligno e são a principal causa de morte no cancro (13). Há várias décadas que a literatura tem associado as metaloproteinases de matriz (MMP) com este fenótipo maligno (14, 15). As MMPs estão implicadas em determinados pontos críticos no processo de metastização como no destacamento, na passagem das células cancerígenas para os vasos sanguíneos ou linfáticos (intravasamento) e ainda no processo inverso, ou seja, a passagem destas células para fora dos vasos sanguíneos ou linfáticos (extravasamento), conforme figura 1 (13). 3 Figura 1. Processo de metastização. Adaptado de Wirk e colaboradores (16). 1.1. Metaloproteinases de matriz As MMPs são endoproteases dependentes de zinco com capacidade de degradação dos componentes da matriz extracelular (17). As MMPs estão normalmente presentes em indivíduos saudáveis e têm um papel importante na degradação fisiológica da matriz extracelular, por exemplo, na formação de tecidos, sua reparação e angiogénese (18). Em humanos, são conhecidas 23 proteases da família das metaloproteinases (19), que podem ser divididas em 3 subgrupos, identificados consoante a sua “preferência” de substratos: (i) colagenases, que degradam colagénio fibrilar; (ii) estromelisinas, que preferem proteoglicanos e glicoproteínas como substratos; (iii) e as gelatinases, que são particularmente ativas na degradação de colagénio não fibrilar desnaturado, colagénio tipo IV e sobretudo colagénio tipo V, a gelatina (12, 13). As MMPs são secretadas sob a forma de zimogénios e são ativadas no meio extracelular (13). Estas estão ligadas ao desenvolvimento das metástases do 4 cancro, a inflamação crónica e a danos nos tecidos, como distúrbios neurológicos(19). Estas desordens ocorrem porque as MMPs regulam diferentes processos celulares, nomeadamente, a apoptose, angiogénese, invasão e metástases (figura 2) (20). As MMPs regulam a apoptose através da degradação da matriz proteica, que pode resultar numa ação apoptótica ou anti-apoptótica nas células endoteliais e epiteliais (21). Figura 2. Ação das MMPs. Adaptado de Szarvas e colaboradores (22) Estudos mostram que das MMPs, as gelatinases são as mais importantes para a formação de metástases (23, 24). Dentro das gelatinases fazem parte a 5 MMP-2 e a MMP-9, sendo que a massa molecular da pro-MMP2 de 72 kDa, MMP-2 ativa de 64 kDa, pro-MMP9 de 92 kDa e MMP-9 ativa de 83 kDa (19). Vários estudos têm verificado esta relação entre as MMP-2 (gelatinase A) e a MMP-9 (gelatinase B) e a formação de metástases (25-28), em que com a inibição das gelatinases, em particular da MMP-9, é possível impedir de uma forma eficaz a formação de metástases e a invasão celular (29, 30). Devido à aparente eficácia da inibição destas enzimas na prevenção de metástases, tem havido um desenvolvimento na criação de inibidores de MMPs sintéticos. No entanto, os resultados não têm sido muito animadores, uma vez que esta inibição leva ao desenvolvimento de efeitos secundários graves, devido à inibição não seletiva das MMPs (31). Por esta razão, a investigação mais recente têm-se direcionado para inibidores de MMPs naturais, principalmente derivados de plantas, que apresentam um menor risco de aparecimento de efeitos secundários e de toxicidade (32, 33). A utilização de alimentos com atividade anticancerígena e antimetastática, abriu portas para a nutracêutica em que os alimentos ou os seus componentes proporcionam benefícios para a prevenção e/ou tratamento tumoral(34). 1.2. As leguminosas e o cancro As sementes de leguminosas são definidas pela Food and Agriculture Organization (FAO) como alimentos em que a semente é diretamente consumida(35). As sementes de leguminosas fazem parte da família Fabaceae, que contem 18 000 espécies identificadas (36). Calcula-se que as leguminosas são 6 consumidas há 10 000 anos e encontram-se entre os alimentos mais utilizados em todo o mundo (37). As propriedades nutricionais das leguminosas têm sido estudadas e apontadas como benéficas para a saúde. As leguminosas são ricas em proteínas, hidratos de carbono de baixo índice glicémico, fibra insolúvel, maioritariamente, e fibra solúvel, e também outros compostos como minerais (38, 39). Outros componentes presentes nas leguminosas, importantes para a saúde, são as gorduras mono e poli-insaturadas (40), os compostos fenólicos e os esteróis (41). Em termos de aminoácidos, as leguminosas são ricas em lisina e pobres em metionina, triptofano e cisteína. São também ricas em aminoácidos não proteicos, alguns dos quais exibem forte toxicidade (41, 42). No geral, as leguminosas correspondem a 2% da energia total ingerida pelo homem e fornecem 3,5% da proteína total consumida diariamente (8). As leguminosas fazem parte de várias dietas consideradas saudáveis, nomeadamente a dieta Mediterrânea (43), à qual está associada uma diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cardíacas, hipertensão (44), diabetes mellitus tipo 2 (45), cancro (46), e doenças de Parkinson (47) e Alzheimer (48). Numa dieta cujo objetivo é diminuir a hipertensão, Dietary Approaches to Stop Hypertension (DASH), é recomendado o consumo de leguminosas quatro a cinco vezes por semana (49). Vários autores têm relacionado o consumo de leguminosas com a diminuição da incidência de cancro, bem como com a redução do risco de doenças cardiovasculares, diabetes e hipertensão (50). Em estudos realizados com ratos expostos a um agente cancerígeno, verificou-se que o grupo que consumia feijões pretos e brancos apresentava 7 menos adenomas e adenocarcinomas no intestino delgado e cólon comparativamente com os que tinham outro tipo de alimentação (51, 52). Noutro estudo ecológico, foi confirmado que a diminuição do risco de cancro do cólon está associada ao elevado consumo de feijões (53). No Nurses’ Health Study, as mulheres que consumiam quatro ou mais porções de leguminosas por semana tinham uma incidência mais baixa de adenomas no cólon e reto em comparação com as que tinham um consumo mais baixo (54). No Netherlands Cohort Study, o consumo de leguminosas foi associado a um menor risco de cancro da próstata (55). Num estudo na China, foi verificado que a parte da população que apresentava um menor risco de desenvolvimento de cancro gástrico consumia mais feijões, vegetais crus, fruta, tomate e produtos de soja, do que os que tinham um elevado risco de desenvolver este tipo de cancro (56). As mulheres chinesas que consumiam mais de 11,3 g de soja diariamente durante a adolescência, em comparação com as que consumiam menos de 2,7 g, apresentavam uma diminuição de 43% do risco de desenvolver cancro da mama durante a prémenopausa (57). Os estudos que demostram que as leguminosas podem ter um efeito anticancerígeno e antimetastático têm, contudo, negligenciado as espécies de leguminosas consumidas na dieta Mediterrânea, como o tremoço e o grão-debico. Torna-se portanto, importante verificar se estas apresentam os mesmos efeitos que as outras espécies já estudadas. 8 1.2.1. Mecanismos possíveis de atividade antitumoral Apesar destes estudos mostrarem um potencial anticancerígeno das leguminosas, ainda não se sabe qual o mecanismo pelo qual estas podem ser protetoras do desenvolvimento tumoral. Estudos vários têm atribuído este efeito anticancerígeno a algumas substâncias específicas presentes nas leguminosas(58, 59), como parece ser o caso dos compostos fenólicos, das saponinas e do ácido fítico, devido aos seus potenciais antioxidante (60). Para além destas substâncias, os inibidores de proteases são também considerados substâncias bioativas com atividade anticancerígena (59). No entanto, não há estudos que indiquem qual destes compostos (compostos não proteicos e proteicos), apresenta um efeito mais pronunciado na prevenção do cancro. 1.3. Principais compostos não proteicos das sementes das leguminosas 1.3.1. Saponinas As saponinas ou saponosídeos são glicosídeos de metabolismo secundário vegetal, caracterizados pela formação de espuma, tendo propriedades de detergentes e surfactantes. São compostos formados por uma parte hidrofílica e uma parte lipofílica (58). São um grupo diversificado que se encontra nas leguminosas e em outras plantas. Estes glicosídeos são esteróides ou, mais geralmente, terpenos policíclicos com diferentes dimensões e complexidade (58). Nas leguminosas, as saponinas foram descritas no tremoço (61), lentilhas (62), grãode-bico (63), soja, ervilhas e vários tipos de feijão (64). Na soja, espécie onde são mais estudadas, já foram isolados 10 tipos diferentes de saponinas (65). 9 Durante algum tempo, as saponinas foram consideradas indesejáveis devido à sua toxicidade e atividade hemolítica; no entanto, apresentam uma enorme diversidade de estruturas e só algumas são potencialmente tóxicas (66). A literatura sugere que as saponinas das leguminosas podem ter uma atividade anticancerígena(67-70) e anti-inflamatória (71). Vários estudos demostram que as saponinas podem diminuir o desenvolvimento de cancro, tanto in vitro como in vivo (72-74). 1.3.2. Ácido fítico O ácido fítico ou, nas condições fisiológicas, fitato, encontra-se presente nas sementes das espécies de leguminosas (75), sendo denominado 1,2,3,4,5,6hexafosfato de mioinositol (76). O ácido fítico é considerado um antinutriente, devido à sua capacidade de diminuir a absorção de outros nutrientes (77). Uma dieta rica em fitato pode causar um balanço negativo dos minerais (Cu2+, Zn2+, Fe3+ e Ca2+), formando complexos insolúveis com estes e diminuindo, assim, a sua biodisponibilidade (78). Para além dos minerais, o ácido fítico parece ter um efeito negativo nas enzimas digestivas, incluindo lipase, α-amilase, pepsina e tripsina (78). Apesar das desvantagens que o fitato apresenta, este tem também efeitos benéficos como a diminuição da biodisponibilidade de substâncias tóxicas, como os metais pesados (cádmio e chumbo) presentes na dieta (79), e também tem a capacidade de diminuir o colesterol e os triglicéridos (58). O ácido fítico presente na soja provoca uma melhoria das doenças cardíacas, através do controlo da hipercolesterolemia e aterosclerose (58). Diversos estudos têm demonstrado que o 16 3. Materiais e Métodos 3.1. Reagentes Todos os reagentes utilizados neste trabalho apresentavam um grau de pureza pró-análise, e eram provenientes da Sigma (St Louis, EUA), Bio.Rad (Richmond, EUA), Merck S. A. (Darmstadt, Alemanha),VWR Chemical (Radnor, EUA), Millipore (Canadá),da RPE ACS (Milão, Itália), da Chem-lda NV (Bélgica) e da PanReac AppliChem (Barcelona, Espanha). Todas as soluções foram preparadas com água desionizada, obtida num sistema Mili-Q plus, da “Milipore” (Bedford, EUA). 3.2. Materiais biológicos Os materiais biológicos utilizados para a realização do presente trabalho foram sementes quiescentes de tremoço branco (Lupinus albus L.), grão-de-bico (Cicer arietinum L.), fava (Vicia faba L.), feijão vermelho (Phaseolus vulgaris L.), lentilha (Lens culinaris M.) e soja (Glycine max L.). Foi utilizada, durante este estudo, uma linha celular humana de um adenocarcinoma do cólon, HT-29 (ECACC 85061109), obtida de uma mulher Caucasiana de 44 anos de idade. 3.3 Determinação do peso seco As sementes de leguminosas foram devidamente pesadas e colocadas a secar, numa estufa a 50 °C, e mantidas, nestas condições, até se verificar estabilização do peso. 17 3.4 Tratamento térmico 3.4.1. Hidratação As sementes de leguminosas foram hidratadas durante 24 h à temperatura ambiente, com água desionizada (Mili-Q, Millipore Corporation) numa proporção de 1:3 (m/v). 3.4.2. Cozedura A cozedura das sementes de leguminosas foi feita em água desionizada, numa razão de 1:20 (m/v), num recipiente metálico sobre uma placa quente até apresentarem uma textura macia (97). 3.5. Extrações e quantificações dos compostos proteicos 3.5.1. Extração das proteínas solúveis As sementes de leguminosas (cruas e cozidas) foram trituradas num robot de cozinha Bimby® TM 31 até se obter um pó fino e homogéneo. a) Deslipidação A farinha das leguminosas foi imersa em n-hexano, numa porção de 1:34 (m/v), num período de 4 h, com agitação a 4 °C. Seguidamente, a amostra foi decantada e seca numa estufa a 50 °C, durante aproximadamente 30 min. 18 b) Extração das proteínas solúveis das sementes de leguminosas cruas e cozidas À farinha deslipidada foi adicionado, numa proporção de 1:5 (m/v), tampão Tris HCl 100 mM a pH 7,5. Esta solução foi mantida sob agitação overnight a 4 °C. As amostras foram centrifugadas posteriormente, numa centrífuga Beckman J2-21M/E, a 12000 g durante 1 h a 4 °C, tendo sido recolhido o sobrenadante e posteriormente conservado a -20 °C. c) Eliminação dos compostos fenólicos da fração proteica Às amostras preparadas anteriormente foi adicionada polivinilpolipirrolidona (PVPP), numa porção de 1:4 (m/m). A amostra resultante foi centrifugada a 12000 g, numa centrífuga Beckman J2-21M/E, durante 30 min, recolhendo-se o sobrenadante, que foi seguidamente conservado a -20 °C para posterior análise. 3.5.2. Quantificação do teor proteico O doseamento da proteína foi realizado através do método de Bradford (102), de acordo com o método descrito pela Bio-Rad (103), no qual se utilizaram microplacas com poços de 250 μL. Para a realização da quantificação proteica foi traçada uma reta padrão em que foi utilizada como padrão uma solução composta por albumina de soro de bovino (BSA), com diferentes concentrações. As amostras foram diluídas até perfazer um volume final de 20 μL, tendo sido realizados testes em triplicado. Foram, posteriormente, adicionados 200 μL de reagente de Bradford, “Dye Reagent Concentrate” e incubado no escuro à temperatura ambiente durante 10 19 min. Passado este tempo, foi lida a absorvância a 595 nm, num espetrofotómetro Syenery HT, Bio-TEK. 3.6. Extrações e quantificações dos compostos não proteicos 3.6.1. Extração do ácido fítico A extração do ácido fítico das sementes de leguminosas foi realizada de acordo com o método descrito por Gao e colaboradores (104). As sementes das leguminosas foram previamente trituradas, num robot de cozinha Bimby® TM 31, até à obtenção de um pó fino e homogéneo. Adicionou-se à amostra, numa porção de 1:20 (m/v), 2,4% (v/v) HCl, sendo depois colocada sob agitação a 220 rpm durante 16 h. As amostras foram posteriormente centrifugadas a 1000 g, numa centrífuga Beckman CoulterTM AllegraTM 25R, durante 20 min a 10 °C. Foi recolhido o sobrenadante e desprezado o precipitado. 3.6.2. Quantificação do ácido fítico Às extrações realizadas no ponto anterior adicionou-se 1 g de NaCl e colocou-se sob agitação a 350 rpm durante 20 min, de forma a dissolver o sal adicionado. Após a agitação, a amostra foi centrifugada a 1000 g, numa centrífuga Beckman CoulterTM AllegraTM 25R, a 10 °C durante 20 min, sendo rejeitado o precipitado. Foram utilizadas diferentes concentrações de fitato na preparação da reta de calibração. Na porção de 3:1 (v/v), foi adicionado à amostra o reagente modificado de Wade (0,03% (m/v) FeCl3·6H2O + 0,3% (m/v) ácido sulfossalicílico), 20 homogeneizado num vortex e posteriormente centrifugado a 1000 g, numa centrífuga Himac CT15RE, durante 10 min a 10 °C. A absorvância da reação colorimétrica foi lida a 500 nm, num espectrofotómetro Syenery HT, Bio-TEK. 3.6.3. Extração das saponinas As saponinas foram extraídas das leguminas segundo o método descrito por Makkar e Becker (105). Às amostras, moídas num robot de cozinha Bimby ® TM 31, foi adicionado 80% (v/v) metanol, numa porção de 1:20 (m/v), com agitação durante a noite. O conteúdo foi centrifugado a 3500 g, numa centrífuga Beckman CoulterTM AllegraTM 25R, durante 10 min e foi recolhido o sobrenadante. O precipitado foi lavado três vezes com 80% (v/v) metanol, numa porção de 1:10 (m/v), tendo sido centrifugado a 3 500 g, numa centrífuga Beckman CoulterTM AllegraTM 25R, durante 10 min, e foi recolhido o sobrenadante. 3.6.4. Quantificação das saponinas A determinação da quantidade de saponinas foi efetuada através de um método espectrofotométrico descrito por Hiai e colaboradores (106). Foram utilizadas diferentes concentrações de saponinas da soja para a preparação da reta padrão. À extração, feita previamente, foi adicionada numa proporção de 1:4 (v/v) uma solução com 80% (v/v) metanol, de 1:5 (v/v) uma solução com 8% (v/v) de vanilina, em etanol, e de 1:50 (v/v) de 72% (m/v) de ácido sulfúrico, tendo sido deixada em agitação num banho-maria a 0 °C. Posteriormente, a mistura foi aquecida num banho com água a 60 °C, durante 10 min, e colocada de novo em 21 água fria, até arrefecer. A absorvância foi lida a 544 nm, num espectrofotómetro Syenery HT, Bio-TEK. 3.6.5. Extração dos compostos fenólicos Os compostos fenólicos foram extraídos conforme o método descrito por Xu e Chang (107). Às leguminosas ‘sem cor’ (soja, tremoço branco e grão-de-bico), previamente trituradas num robot de cozinha Bimby® TM 31, juntou-se, numa porção de 1:10 (m/v), uma solução com 50% (v/v) de acetona. Nas leguminosas ‘com cor’ (feijão vermelho, lentilha e fava) adicionou-se, numa porção de 1:10 (m/v), uma solução com 70% (v/v) de acetona e 0,5% (v/v) de ácido acético. Ambas as amostras foram colocadas a agitar a 300 rpm, num agitador Agitorb 200 ICP, durante 3 h à temperatura ambiente. A mistura foi posteriormente agitada durante 12 h no escuro e de seguida centrifugada a 867 g, numa centrífuga Beckman CoulterTM AllegraTM 25R, durante 10 min, sendo recolhido o sobrenadante. O processo repetiu-se duas vezes. 3.6.6. Quantificação dos compostos fenólicos Os compostos fenólicos foram quantificados com o método de FolinCiocalteu utilizando diferentes concentrações de ácido gálico para a preparação da reta de calibração(108). A 10 µL do extrato dos compostos fenólicos foram adicionados 80 µL de uma solução de 7% (m/v) de carbonato de sódio e 100 µL do reagente de Folin-Ciocalteau e posteriormente passados pelo vortex e incubados durante 8 min à temperatura ambiente. A absorvância foi lida a 765 nm num espectrofotómetro Syenery HT, Bio-TEK. 22 3.7. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Foi utilizada a técnica de eletroforese desnaturante em gel vertical de poliacrilamida em dodecilo sulfato de sódio (SDS-PAGE, “sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”) (109), em sistema descontínuo, constituído por um gel concentrador e um gel separador. Os polipéptidos foram separados em géis de 17,5% (m/v) acrilamida com a seguinte composição (110): - Gel de concentração: 5% (m/v) acrilamida, 0,13% (m/v) bisacrilamida (N,N’-metileno-bisacrilamida), 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1% (m/v) dodecilo sulfato de sódio (SDS), 0,1% (m/v) persulfato de amoníaco (PSA) e 0,05% (v/v) tetrametiletilenodiamina (TEMED). - Gel de separador: 17,5% (m/v) acrilamida, 10% (m/v) glicerol, 0,1% (m/v) bisacrilamida, 375 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,01% (m/v) SDS, 0,03% (m/v) PSA e 0,03% (v/v) TEMED. As amostras a analisar foram ressuspendidas no tampão de tratamento de amostra (80 mM Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM 2-mercaptoetanol, 2% (m/v) SDS, 15% (v/v) glicerol e 0,006% (m/v) m-cresol purpúreo). De seguida as amostras foram agitadas e fervidas durante 5 min. Posteriormente foram centrifugadas a 10000 g, durante 5 mint numa centrífuga 5415 D, Eppendorf. O tampão de eletroforese era constituído por uma solução 25 mM de Trizma base, e 192 mM de glicina a pH 8,8 e 0,1% (m/v) SDS, sendo que a corrida decorreu em sistema vertical (Mini-PROTEAN Tetra Cell, BioRad, EUA), a corrente constante de 20 mA e tensão não inferior a 200 V, com uma fonte de alimentação modelo EPS 500/400 (GE Healthcare, EUA). 23 3.7.1. Coloração do SDS-PAGE O gel foi fixado durante 20 min numa solução de 10% (m/v) ácido tricloroacético (TCA), sob agitação. Seguidamente foi lavado com água bidestilada para remover o excesso de ácido e colocado a corar numa solução corante, contendo 0,25% (m/v) Azul Brilhante de Coomassie R-250 (CBB-R-250), contendo 25% (v/v) 2-propanol e 10% (v/v) ácido acético. Para a descoloração, o gel foi colocado numa solução contendo 25% (v/v) 2propanol e 10% (v/v) ácido acético, sempre com agitação, à temperatura ambiente, até se observarem nitidamente as bandas correspondentes aos polipéptidos. 3.8. Zimografia reversa A zimografia reversa é uma técnica eletroforética que torna possível a avaliação dos inibidores proteicos com atividade inibitória sobre a MMP-9. Isto é possível porque o substrato gelatina e a MMP-9 são adicionadas ao gel. Os inibidores proteicos presentes nas amostras são separados eletroforeticamente no gel de poliacrilamida com a gelatina e a gelatinase, que vai digerindo a proteína do gel. As amostras foram tratadas com tampão de amostra (60 mM Tris-HCl a pH 6,8; 2% (m/v) SDS; 10% (v/v) glicerol). a) Separação proteica em SDS-PAGE em condições não-redutoras O gel de zimografia foi constituído por um gel de separação e um gel de concentração, com a seguinte composição: 24 - Gel de separação: 12,5 % (m/v) acrilamida, 1% (m/v) bisacrilamida, 750 mM Tris-HCl pH 8,8, 2,5% (m/v) gelatina, 0,028 % (m/v) PSA, 0,14% (v/v) TEMED e 10 µmol de MMP-9 - Gel de concentração: 5% (m/v) acrilamida, 1% (m/v) bisacrilamida, 125 mM Tris-HCl pH 6,8; 0,03% (m/v) PSA e 0,24% (v/v) TEMED. A eletroforese foi efetuada num sistema vertical e com a adição do tampão de glicina, já descrito. b) Lavagem Com o objetivo de remover o SDS e consequentemente renaturar as enzimas foram realizadas três lavagens com duração de 30 min cada, com agitação, após a separação eletroforética, com 2,5% (v/v) Triton X-100. c) Incubação Incubou-se o gel com tampão de zimografia (50 mM Tris-HCl a pH 7,4, 5 mM Cacl2, 1 µM ZnCl2 e 0,01% (m/v) azida de sódio) overnight até 2 dias a 37 °C. d) Coloração e descoloração do gel A coloração da zimografia obtida foi efetuada com 30% (v/v) etanol, 10% (v/v) ácido acético e 5% (m/v) azul de Coomassie G-250 coloidal (Coomassie G) O Coomassie G contém 34% (v/v) metanol, 17% (m/v) sulfato de amoníaco, 2% (v/v) ácido fosfórico e 1,1% (m/v) Coomassie G. A descoloração foi feita com 30 % (v/v) etanol e 10 % (v/v) ácido acético. 25 3.9. Ensaios Celulares 3.9.1. Manutenção das células HT-29 As células cresceram em monocamada com o meio RPMI (meio Roswel Park Memorial Institute) suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal (SBF), 200 mM de glutamina, 2x104 Ul.mL-1 de penicilina e com 20 mg.mL-1 de estreptomicina em frascos de 75 cm2 e foram mantidas a 37 °C e 5% (v/v) de CO2. A viabilidade celular foi rotineiramente verificada por observação diária num microscópio invertido. 3.9.2. Ensaios de migração As células HT-29 cresceram em placas com 24 poços (5x105 células/poço) durante 24 h, ou até 80% de confluência. Efetuou-se um risco na monocamada de células com uma ponta de uma pipeta de 100 µL; após o corte lavaram-se os poços com tampão fosfato salino (PBS) para retirar as células soltas e colocou-se 100 µg.mL-1 de proteínas e 10 mg.mL-1 dos compostos não proteicos em tampão com o meio RPMI. As células foram mantidas até 48 h, sendo monitorizado a invasão celular do corte efetuado pela pipeta ao longo do tempo. A área invadida após 48 h foi calculada para cada amostra e comparados com a área inicial às 0 h. 3.9.3. Ensaios de multiplicação As células HT-29 cresceram nas condições já descritas, em placas com 96 poços (2x104 células/poço), em que foi adicionado 100 µg.mL-1 de cada fração 32 Figura 4. Teor de saponinas em diferentes espécies de sementes de leguminosas. Quantificação pelo método descrito por Hiai e colaboradores (106). Os resultados estão expressos em mg de saponinas .g-1 PS de sementes. As barras representam a média de pelo menos três réplicas diferentes ± desvio padrão. No presente trabalho, verificou-se que a soja contém aproximadamente 0,4% (m/m) de saponinas e o feijão 0,2% (m/m), o que está de acordo com a literatura publicada, em que a soja apresentava 0,5 a 0,6% (m/m) e o feijão 0,2% a 1,6% (m/m) (120). O conteúdo em saponinas pode variar consoante as culturas, variedade, localização, irrigação, tipo de solo, clima e crescimento (59). Após a cozedura verificou-se uma perda significativa (p ≤0,05) das saponinas em todas as leguminas com exceção da lentilha. Neste trabalho houve uma diminuição entre 7 e 90,7%, sendo que a que teve uma menor perda foi a lentilha e a maior o grão-de-bico. Outros estudos estão de encontro com os resultados obtidos neste trabalho. Chang e colaboradores (121) verificaram que a concentração de saponinas, em diferentes leguminosas (ervilha, grão-de-bico e lentilha), variava aproximadamente entre 7 a 17 mg.g-1. Após cozedura, estes mesmos autores, concluíram que a havia uma perda de 5,2 e 42,9 % das saponinas 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Lentilha Fava Feijão Grão Soja Tremoço mg de saponinas.g-1 PS de semente Não Cozido Cozido 33 Existem, no entanto, estudos contraditórios quanto à perda de saponinas após a cozedura. No entanto, estas comparações só poderão ser realizadas quando os autores utilizam o mesmo volume de água, tempo e temperatura na cozedura. Fenwick and Oakenfull (122) verificaram que a cozedura tem pouco efeito no conteúdo em saponinas da fava, enquanto que Jood e colaboradores (123) observaram uma redução significativa nas saponinas após cozedura do grãode-bico e numa variedade de feijão. Tabela 2. Teor em saponinas nas diferentes sementes de leguminosas, cruas e cozidas, e percentagem de perda devida à cozedura. Os resultados encontram-se expressos em mg de saponinas.g-1 PS de semente e representam a média (n=3) ± desvio padrão e a percentagem de perda devida à cozedura. NC: não cozido; C: cozido; a p≤0,05 NC vs.C. Lentilha Fava Feijão Grão Soja Tremoço Saponinas NC (mg.g-1 PS) 0,7 ± 0,06 1,2 ± 0,04 1,7 ± 0,54 3,7 ± 0,29 3,6 ± 0,24 0,7 ± 0,02 C (mg.g-1 PS) 0,7 ± 0,07 0,6 ± 0,01 1,2 ± 0,25 0,3 ± 0,12 1,6 ± 0,24 0,4 ± 0,13 % De perda 7,0 51,2a 29,5a 90,7a 57,6a 41,5a 4.1.3. Compostos fenólicos Os compostos fenólicos têm sido, devido à sua capacidade antioxidante, muito estudados como potenciais agentes anticancerígenos (83). A quantidade destes compostos nas sementes das leguminosas varia consoante a espécie, como se pode constatar na figura 5 e tabela 3. Assim, as leguminosas com maior quantidade destes compostos poderão exibir uma maior atividade anticancerígena. 34 Figura 5. Teor em compostos fenólicos nas diferentes espécies de sementes de leguminosas. Os compostos foram quantificados pelo método de Folin-Ciocalteau (108). Os resultados estão expressos em mg de equivalentes de ácido gálico g-1 PS de semente. As barras representam a média de pelo menos três réplicas diferentes ± desvio padrão. Os níveis de polifenóis nas plantas são largamente influenciados por fatores genéticos e por condições ambientais. Outros fatores como a germinação, maturação, variedade, processamento e armazenamento podem também influenciar o conteúdo em compostos fenólicos (58). Neste trabalho, o tremoço foi o que apresentou uma maior concentração de compostos fenólicos, com 3,12 mg de equivalentes de ácido gálico.g-1 PS de semente, seguido da soja, com 1,74 mg.g-1 PS. Chang e colaboradores (60), ao estudarem a concentração de compostos fenólicos em diversas espécies (ervilha verde e amarela, grão-de-bico, lentilha, várias variedades de feijão e soja) verificaram que estas continham entre 1,13 e 14,3 mg.g-1 PS, sendo que a espécie que apresentou mais foi a lentilha e a que apresentou menos foi a ervilha. Com o processo de cozedura verificou-se uma perda significativa (p ≤0,05) no teor destes compostos entre 58,9 e 91,9%, sendo que os que apresentaram 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Lentilha Fava Feijão Grão Soja Tremoço mg de ácido gálico.g-1 PS de semente Não Cozido Cozido 35 uma maior perda foram o feijão e a lentilha. Esta redução dos fenóis após a cozedura foi confirmada por outros estudos (121, 124), em que verificaram uma perda de 30 a 79% do total destes compostos. A soja e a fava foram os que apresentaram uma menor perda de compostos fenólicos, 60,9 e 58,9% respetivamente. Uma possível explicação, como já verificado na soja, poderá ser o facto de ocorrer libertação de compostos fenólicos estruturais, como a lenhina, por despolimerização térmica durante a cozedura (125). Neste trabalho, parte destes compostos passaram para a água de cozedura (dados não apresentados), sendo a água de cozedura e imbibição a maior responsável pela perda dos compostos fenólicos em comparação com a temperatura (126). Devido ao elevado potencial bioativo destes compostos, estes resultados apontam para a importância de se consumir a água utilizada nestes processos (imbibição e cozedura). Tabela 3. Teor em compostos fenólicos nas diferentes sementes de leguminosas, cruas e cozidas, e percentagem de perda devida à cozedura. Os resultados encontram-se expressos em mg de ácido gálico.g-1 PS de semente e representam a média (n=3) ± desvio padrão e a percentagem de perda devida à cozedura. NC: não cozido; C: cozido; a p≤0,05 NC vs.C. Lentilha Fava Feijão Grão Soja Tremoço Compostos fenólicos NC (mg.g-1 PS) 1,6 ± 0,1 0,9 ± 0,56 1,7 ± 0,15 0,8 ± 0,08 1,7 ± 0,16 3,1 ± 0,44 C ´ (mg.g-1 PS) 0,4 ± 0,08 0,4 ± 0,04 0,1 ± 0,01 0,2 ± 0,002 0,7 ± 0,06 0,8 ± 0,02 % De perda 73,0a 58,9a 91,9a 68,0a 60,9a 72,4a 4.1.4. Proteínas solúveis O interesse pelas proteínas das leguminosas tem vindo a aumentar nas últimas décadas, principalmente devido aos seus benefícios a nível das doenças 36 cardiovasculares. Uma vez que a FDA aprovou a alegação nutricional da lunasina como tendo propriedades na diminuição do colesterol sérico e na redução do risco de doenças coronárias (127). Atualmente, as proteínas têm sido estudadas como potenciais agentes anticancerígenos. Deste modo, foi importante identificar as leguminosas com maior teor em proteínas pois, deste modo, poderão apresentar maior capacidade anticancerígena (36). A concentração em proteínas solúveis nas sementes de leguminosas encontra-se ilustrada na figura 6 e tabela 4. Figura 6. Teor de proteínas solúveis das diferentes espécies de leguminosas. Quantificação pelo método de Bradford (103). Os resultados estão expressos em mg de proteínas soluveis.g-1PS de semente. As barras representam a média de pelo menos três réplicas diferentes ± desvio padrão. Sabe-se que a concentração das proteínas solúveis e totais é dependente da espécie, variedade, maturidade e das condições de crescimento (92). Quando não cozidas, a soja e o tremoço apresentaram maior quantidade de proteína solúvel, 297,4 e 190,4 mg.g-1 PS, respetivamente, e as sementes de leguminosas que apresentaram menores quantidades foram a lentilha e o feijão, 0 50 100 150 200 250 300 350 Lentilha Fava Feijão Grão Soja Tremoço mg de proteínas solúveis.g-1 PS de semente Não Cozido Cozidos 37 79,0 e 72,0 mg.g-1, respetivamente. Após o processo de cozedura, a concentração de proteína variou, sendo que as que demonstraram ter um maior teor foram a lentilha e o tremoço com uma concentração de 17,7 e 16,6 mg.g-1, respetivamente. Por outro lado, as leguminosas que apresentaram com menor teor foram o feijão, 4,4 mg.g-1 PS, seguido da fava, com 13,9 mg.g-1 PS. Os resultados mostram que após a cozedura, houve uma diminuição significativa das proteínas solúveis, principalmente na soja, com uma perda de 94,7 %, seguida do feijão com 93,9 %. Scarafoni e colaboradores (128) observaram uma redução de mais de 99 % nas proteínas solúveis do tremoço, após o tratamento térmico. Tabela 4. Teor em proteínas solúveis nas diferentes sementes de leguminosas, cruas e cozidas, e percentagem de perda devida à cozedura. Os resultados encontram-se expressos em mg de proteínas solúveis.g-1 PS de semente e representam a média (n=3) ± desvio padrão e a percentagem de perda devida à cozedura. NC: não cozido; C: cozido; a p≤0,05 NC vs.C. Lentilha Fava Feijão Grão Soja Tremoço Proteínas solúveis NC (mg.g-1 PS) 79,0 ± 5,63 114,5 ± 3,7 72,0 ± 4,02 138,2 ± 1,73 297,4 ± 8,65 190,4 ± 7,42 C (mg.g-1 PS) 17,7 ± 0,23 13,9 ± 6,42 4,4 ± 1,56 16,0 ± 6,52 15,7 ± 4,82 16,6 ± 3,2 % De perda 77,6a 87,8a 93,9a 88,4a 94,7a 91,3a Com o objetivo de avaliar a diferença no teor e perfil polipeptídico foi efetuado um SDS-PAGE às diferentes espécies de leguminosas (figura 7). Como seria de esperar, as diferentes espécies apresentam uma grande variabilidade no seu perfil polipeptídico. Após a cozedura foi possível verificar a diminuição tanto quantitativa como qualitativa do teor proteico, sendo observável o desaparecimento de algumas bandas polipeptídicas. Como foi confirmado na 38 tabela 4, a soja e o feijão foram os que apresentaram uma maior perda de proteína com a cozedura, algo facilmente observado no respetivo perfil polipeptídico. Figura 7. Imagem representativa do perfil polipeptídico das frações proteicas das leguminosas obtidas por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida (17,5% m/v acrilamida), suplementado com 10% (v/v) glicerol. NC: Não cozida; C: Cozida. De forma a permitir uma análise e comparação qualitativa e quantitativa do teor proteico, as frações NC e C foram ressuspendidas e carregadas com o mesmo volume no gel. No que refere ao nível nutricional, com a cozedura das leguminosas verifica-se uma perda dos compostos, principalmente das saponinas e compostos fenólicos. Quanto às proteínas, foram apenas analisadas as proteínas solúveis e não as totais, no entanto, no que diz respeito à proteína ingerida, a temperatura 39 apenas desnatura as proteínas, o que as torna mais digestíveis por ficarem mais suscetíveis à ação de proteases (129). Em termos dos compostos bioativos, o grão-de-bico, a soja, o tremoço e o feijão foram os que apresentaram maior concentração destes. Podendo, de uma forma especulativa, afirmar que poderão ser estas as leguminosas que terão um maior potencial anticancerígeno. 4.2. Zimografias reversa Diversos estudos apontam para o facto de que a inibição da atividade das MMPs parece ser uma promissora terapia anti-cancro (130). Dentro das MMPs, a MMP-2, MMP-7 e MMP-9 são as mais estudadas, no entanto, as gelatinases são as mais importantes para os processos de migração celular, angiogénese e formação de metástases (131). Através da zimografia reversa, figura 8, foi possível analisar quais as frações proteicas que apresentaram capacidade de inibição ou resistência à MMP-9. A maioria das leguminosas, na sua forma não cozida, apresentou frações inibitórias. Com uma massa molecular de aproximadamente 100 kDa, 80 kDa e 25 kDa. O tremoço parece ter apenas uma fração que foi inibidora ou resistente à MMP-9, sendo esta de aproximadamente 25 kDa. 40 Figura 8. Imagem representativa de uma zimografia reversa realizada por SDS-PAGE (12,5 % m/v acrilamida) com gelatina e 1µmol.mL-1 de MMP-9. NC: Leguminosa sem cozer; C: Leguminosa cozida. De forma a permitir uma análise e comparação qualitativa e quantitativa do teor proteico, as frações NC e C foram ressuspendidas e carregadas com o mesmo volume em gel. Após a cozedura foi possível verificar que a maioria das bandas desaparecem em quase todas as espécies, mas que existem polipéptidos com aproximadamente 25 kDa, que são resistentes ao tratamento térmico e que continuam a ter capacidade de inibição e/ou de resistência à MMP-9. Esta fração proteica foi apenas visível em três espécies: grão-de-bico, soja e tremoço. Assim, através da zimografia reversa foi possível verificar a existência de um polipéptido com aproximadamente 25 kDa, que poderá ser o referido e já 41 descrito, sendo este resistente à temperatura e que mantêm a sua inibição e/ou resistência à MMP-9. Na soja estão estudados vários inibidores de proteases como por exemplo um BBI e um KI com 8 kDa e 22 kDa, respetivamente (132). No grão-de-bico já foram também descritos inibidores de proteases, neste caso de tripsina, com massa molecular por volta dos 20 kDa (133). Quanto ao tremoço, a informação sobre inibidores de proteases encontra-se ainda muito limitada. Até agora, somente um inibidor de proteases foi descrito, sendo este um inibidor de tripsina com cerca de 21 kDa (128). Este inibidor poderá ser o que se encontra visível na zimografia reversa, mas apenas um estudo mais profundo, como por exemplo com outros tipos de eletroforeses poderiam permitir a sua identificação. 4.3. Ensaios celulares nas células CCR, HT-29 A análise do potencial antitumoral das diferentes espécies foi subsequentemente efetuada em células do cancro cólon, HT-20. Foram escolhidas três leguminosas: grão-de-bico, soja e tremoço. Esta escolha recaiu no facto de estas apresentarem uma fração proteica resistente ou inibidora da MMP9 quando cozidas. Para além disso, estas três leguminosas são, de uma maneira geral, as que apresentam maior quantidade dos compostos potencialmente bioativos. Para os ensaios celulares foram estudadas dois tipos de frações, uma contendo os compostos proteicos, solúveis em tampão, e uma segunda contendo compostos não proteicos (compostos fenólicos, saponinas e ácido fítico), solúveis em acetona, das três leguminosas selecionadas na sua forma crua e cozida. Foi utilizada uma concentração de 100 µg.mL-1 de compostos proteicos, uma vez que 48 capacidade de prevenir ou suprimir processos cancerígenos em diferentes linhas celulares, bem como em ensaios com animais, este péptido tem vindo a ser investigado pela FDA deste 1992, e atualmente está a ser avaliado em ensaios clínicos em humanos como um agente anticancerígeno(138). Neste trabalho, como já mencionado, as proteínas solúveis da soja não apresentaram efeito na inibição da migração celular. No entanto, uma possível justificação para esta diferença é o facto de estes estudos terem utilizado somente BBIs e não a proteína total solúvel. Fereidunian e colaboradores (131) purificaram 12 mg de BBI.g-1 de semente de soja, o que corresponde a aproximadamente 9% da proteína solúvel da soja. Extrapolando, neste trabalho teriam sido adicionados 9 µg.mL-1 deste BBI, o que em comparação com o adicionado nos outros estudos foi uma quantidade muito inferior. Assim, pode-se inferir que neste trabalho foi utilizado uma concentração demasiado baixa para exercer efeito. 4.3.2. Multiplicação celular A tumerogénese ocorre devido a uma multiplicação celular descontrolada e excessiva (131). A identificação de um inibidor da multiplicação celular pode resultar na inibição do crescimento tumoral e no desenvolvimento de metástases. Neste trabalho, foi-se avaliar o efeito que os diferentes compostos estudados tinham na viabilidade e proliferação celular (figura 11). De um modo geral, os resultados demonstraram que a maior parte dos compostos não apresentaram citotoxicidade para as células, uma vez que a viabilidade celular foi mantida. Na forma crua, apenas os compostos não proteicos 49 do grão-de-bico apresentaram significativamente (p ≤0,05) menor multiplicação celular em relação ao controlo, enquanto que com a cozedura, apenas os compostos não proteicos da soja induziram uma inibição da proliferação celular, sendo esta inibição de 38% e 28%, respetivamente (tabela 6). Figura 31. Multiplicação celular das células HT-29 após 24 h tratadas com 10 mg.mL-1 de compostos não proteicos ou 100 µg.mL-1 de proteínas solúveis. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p ≤0,05vs. controlo. NP: Compostos não proteicos das leguminosas cruas; NPC: Compostos não proteicos das leguminosas cozidas; P: Proteína solúvel das leguminosas cruas; PC: Proteína solúvel das leguminosas cozidas. Tabela 6. Inibição da multiplicação celular em relação ao controlo nas células HT-29, tratadas com 10 mg.mL-1 de compostos não proteicos ou 100 µg.mL-1 das proteínas solúveis. Os valores são apresentados com média ± desvio padrão. NC: Não Cozido; C: Cozido; a p≤0,05 vs. controlo. Inibição da multiplicação celular (%) Grão Soja Tremoço C. Proteicos NC 14 ± 5,7 11 ± 13,2 11 ± 7,7 C 12 ± 10,9 15 ± 9,9 17 ± 4,9 C. Não Proteicos NC 38 ± 15,8a 7 ± 10,8 0 ± 13,9 C 15 ± 5,7 28 ± 6,9a 15 ± 13,0 0 20 40 60 80 100 120 Grão Soja Tremoço Controlo % em relação ao controlo NP NP C P P C * * 50 Os compostos não proteicos do grão-de-bico cru apresentaram, com significado estatístico (p <0,05), maior capacidade de inibição da multiplicação celular comparativamente com os mesmos compostos da soja e do tremoço. Ao comparar o efeito da cozedura no potencial da inibição da multiplicação celular das leguminosas, verificou-se que não existem diferenças significativas (p <0,05) na sua influência na multiplicação celular. Assim, neste trabalho foi possível observar que nenhuma inibiu significativamente a multiplicação celular, nem induziu citotoxicidade. No entanto, estudos sobre o potencial das proteínas das leguminosas, principalmente os BBIs, indicam que estas têm um poder inibitório na multiplicação celular. Fereidunian e colaboradores (131) verificaram que 200 µg.mL-1 de BBI da soja diminuiu a multiplicação celular em mais de 50% e numa concentração de 400 µg.mL-1 a redução foi superior a 80% nas células HT-29. BBIs extraídos do grão-de-bico apresentaram uma inibição da multiplicação celular nas células do cancro da mama e os BBIs do feijão, soja, grão-de-bico diminuíram a multiplicação nas células cancerígenas da próstata comparativamente com o controlo (132). No presente trabalho a fração proteica das diferentes espécies de leguminosas (100 µg.mL-1) não apresentou uma diminuição significativa da multiplicação celular como em outros estudos, no entanto, como já mencionado, foi adicionado a proteína total solúvel e não apenas as proteínas que apresentaram atividade anti-tumoral, os BBIs. Quanto à fração não proteica, como já mencionado, verificou-se uma diminuição da multiplicação celular com o grão-de-bico e a soja. Estes resultados vão de encontro com outros estudos já publicados. Giron e colaboradores (139) verificaram que os compostos extraídos com acetona do grão-de-bico são um 51 potente inibidor na multiplicação nas células Caco-2. Para além disso, observaram que esta extração tinha um melhor poder inibitório da multiplicação celular em relação às proteínas. Esta inibição da viabilidade das células foi independe da dose (132). No entanto, na literatura, os estudos são contraditórios quanto ao efeito destes compostos na multiplicação celular. Isto poderá deve-se ao facto dos estudos isolarem compostos específicos de diversas leguminosas, testarem quantidades diferentes e utilizarem diferentes linhas celulares. Bawadi e colaboradores (86) observaram que 0,24 a 24 µM de taninos isolados do feijão preto não tiveram efeito na multiplicação celular. Outros estudos também mostraram que os compostos fenólicos das leguminosas reduziram a multiplicação celular nas HT-1080 (140) e nas células do adenocarcinoma do cancro do colo do útero (141). Num estudo, a suplementação com compostos presentes na soja como as saponinas, proteínas e gordura (1% da dieta) e isoflavonas (1,705 g/kg), adicionadas à dieta dos ratos, apresentou uma diminuição de 21% na multiplicação celular do cancro da próstata (142). Jenab e colaboradores (143) verificaram que ao suplementar com 1% de ácido fítico durante 100 dias, houve inibição no desenvolvimento neoplásico do cancro do cólon nos ratos tratados com azoximetano. O facto de as espécies estudadas induzirem maior efeito na migração celular, e não na multiplicação celular poderá estar associado ao seu mecanismo de ação. Um dos fatores mais associado à redução da taxa de migração celular é a atividade das MMP-e e MMP-9. Assim, neste trabalho analisou-se a atividade gelatinolítica do meio das células HT-29 após exposição aos diferentes extratos. 52 4.3.3. Atividade gelatinolítica do meio extracelular do ensaio da invasão celular Em condições normais, as células segregam MMP-2 e MMP-9 ativas para o meio extracelular, que ao degradarem o meio circundante conseguem prosseguir com a migração celular (30, 32). Ao haver inibição das gelatinases verifica-se uma diminuição da degradação da membrana extracelular, neste caso da gelatina e, consequentemente da formação de metástases. Assim, neste ensaio o objetivo foi verificar se houve diminuição da degradação da gelatina o que indica se houve ou não inibição das MMP-2 e MMP-9. É importante salientar que no meio extracelular existem ambas as enzimas, MMP-2 e MMP-9, portanto neste ensaio foi avaliada a atividade gelatinolítica total. Os resultados podem ser observados na figura 12. Verificou-se que houve diminuição significativa (p ≤0,05) da atividade gelatinolítica em todos os compostos extraídos das diferentes leguminosas. As proteínas da soja (cozida) foram as que apresentaram maior capacidade de inibição da atividade gelatinolítica, com uma inibição de 88%, conforme representado na tabela 7. 53 Figura 12. Atividade gelatinolítica do meio extracelular das células HT-29 do ensaio da invasão celular quantificada pelo método da DQ-gelatin. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p ≤0,05 vs. controlo. NP: Compostos não proteicos das leguminosas cruas; NPC: Compostos não proteicos das leguminosas cozidas; P: Proteína solúvel das leguminosas cruas; PC: Proteína solúvel das leguminosas cozidas. Tabela 7. Inibição da atividade gelatinolítica do meio das células HT-29 em relação ao controlo, tratadas com 10 mg.mL-1 de compostos não proteicos ou 100 µg.mL-1 das proteínas solúveis. Os valores são apresentados com média ± desvio padrão. NC: Não Cozido; C: Cozido; a p≤0,05 vs. controlo. Inibição da atividade gelatinolítica com o meio extracelular (%) Grão Soja Tremoço C. Proteicos NC 86 ± 0,9a 85 ± 3,3a 87 ± 0,9a C 87 ± 0,4a 88 ± 0,3a 78 ± 12,3a C. Não Proteicos NC 27 ± 0,9a 76 ± 22,3a 26 ± 3,6a C 30 ± 1,2a 28 ± 1,1a 32 ± 0,5a Como é observável, as proteínas solúveis apresentaram maior capacidade de inibição da atividade gelatinolítica em relação aos compostos não proteicos. Esta diferença foi significativa (p ≤0,05) no grão-de-bico, na soja cozida e no tremoço, em que os compostos não proteicos demonstraram ter uma inibição significativamente menor em relação às proteínas solúveis. 0 20 40 60 80 100 120 Grão Soja Tremoço Controlo Atividade gelatinolítica (% em relação ao controlo) NP NP C P P C * * * * * * * * * * * * 54 Quanto à diferença induzida pela fervura, verificou-se que a soja crua apresentou significativamente (p ≤0,05) melhor inibição da atividade gelatinolítica em relação à cozida e as proteínas do tremoço cru inibiram mais a atividade gelatinolítica em comparação com as cozidas. Neste ensaio, ainda foi possível observar que dentro os compostos não proteicos da soja foram mais eficientes na inibição da atividade do que os mesmos compostos das outras leguminosas. Quanto às proteínas solúveis, o tremoço apresentou menor inibição em relação ao grão-de-bico e à soja, particularmente na sua forma cozida. È interessante comparar os resultados da migração celular com os da atividade gelatinolítica. Visto que na migração e multiplicação celular os compostos não proteicos induziram uma maior inibição em comparação com as proteínas, na atividade gelatinolítica ocorreu o inverso. Estes resultados sugerem que as proteínas das leguminosas são mais eficientes na inibição das MMPs que os compostos não proteicos. No entanto, devido ao tempo limitado para a realização do presente trabalho, não foi possível a realização de um maior número de ensaios celulares. Por outro lado, facto de que os compostos não proteicos não inibiram tanto as MMPs, mas reduziram a multiplicação e a invasão, revela que poderão estar associados a outro mecanismo antitumoral que não a inibição das gelatinas, como por exemplo na diminuição das espécies reativas de oxigénio (144), e não apenas pela inibição das gelatinases. Uma vez que a atividade proteolítica avaliada neste ensaio se deve ao conjunto da MMP-2 e da MMP-9, resta saber ainda se a inibição observada se deve à inibição das duas gelatinases, ou apenas a uma especificamente. Nos casos de inibição específica, esperava-se que a gelatinase não inibida ainda 55 manifestasse capacidade de proteólise, pelo que foi necessária a realização de uma zimografia de gelatina para que fosse possível determinar como funcionava essa inibição. 4.3.4. Zimografia A zimografia da gelatina mostra, em gel eletroforético, a atividade específica das duas gelatinases, MMP-2 e MMP-9, assim também como a das pro-enzimas. Os resultados das zimografias do meio extracelular das HT-29 expostas durante 48 h os extratos estudos neste trabalho encontram-se na figura 13. Na zimografia, foi possível verificar qual das gelatinases foi inibida pelos diferentes compostos. De um modo geral, foi facilmente observável que as leguminosas estudadas tiveram, quase todas, capacidade de inibição da proMMP9 (92 kDa) e MMP-9 ativa (83 kDa), mas não da pro-MMP2 e MMP-2.Esta inibição da MMP-9 ativa poderá ter sido feita tanto através de uma inibição direta da sua atividade (enzima já ativa) como também da sua própria produção, uma vez que há diminuição da pro MMP-9. É sabido que este tipo de inibidores pode ter uma ação em diferentes níveis moleculares: (i) inibição da transcrição, (ii) inibição da pós-transcrição, (iii) inibição da tradução, (iv) degradação póstradução e (v) inibição da secreção ou atividade (131). 56 Figura 13. Imagem representativa de uma zimografia realizada com o meio extracelular do ensaio da invasão celular nas células HT-29 em SDS-PAGE (12,5% v/v acrilamida) com gelatina. As células foram tratadas com 10 mg.mL-1 de compostos não proteicos ou 100 µg.mL-1 de proteínas solúveis. NP: Compostos não proteicos; P: Proteínas solúveis; NPC: Compostos não proteicos cozidos; PC: Proteínas solúveis cozidas. As zimografias corroboram com os ensaios fluorimétricos, uma vez que os compostos estudados apresentaram inibição da MMP-9. Estes resultados reforçam a hipótese de que os compostos não proteicos inibem a migração celular através da inibição da MMP-9 e/ou por outro mecanismo. Ao comparar estes resultados com a migração celular e os da atividade gelatinolítica do meio extracelular das células HT-29 verificou-se que as proteínas das leguminosas poderão inibir a migração celular através da inibição da MMP-9 e não da MMP-2. 57 Os estudos são contraditórios quanto à capacidade de inibição da MMP-2 e MMP-9 por parte dos diferentes compostos presentes nas leguminosas. Um estudo verificou que os BBIs da soja têm capacidade de inibição da atividade ou da secreção da MMP-2 e MMP-9, numa concentração de 200 e 400 µg.mL-1 (131). Os taninos isolados do feijão preto estimularam a secreção da MMP-2 e MMP-9, sendo posto em causa, pelos autores, os efeitos anticancerígenos deste composto fenólico (86). Outro composto fenólico, fisetina, extraído de uma leguminosa mostrou ter capacidade de inibição da MMP-9, onde 15 µM inibiu cerca de 50% desta enzima, e não apresentou inibição da MMP-2 (140). Quanto ao ácido fítico, na concentração de 2,5 mM, apresentou um efeito na expressão no RNAm de algumas MMPS e nos seus inibidores e sub-regula a MMP-1, MMP-2, MMP-3 e MMP-9 (145). Kang e colaboradores (134) verificaram que as saponinas da soja crua apresentavam maior capacidade de inibição da MMP-9 do que da MMP-2. Estes autores concluíram ainda que a inibição da MMP-2 ocorria porque as saponinas da soja estimulam a secreção do TIMP-2 nas células HT-1080, sendo este um inibidor específico das MMP-2. Num outro estudo, um extrato solúvel em água do tremoço demostrou diminuir a atividade da pro-MMP2, pro-MMP9 em fibroblastos com inflamação (146). Como não foi encontrados trabalhos com extratos proteicos inibidores das MMPs, este trabalho mostra claramente a necessidade de mais estudos sobre o potencial antimetastático das frações proteicas das leguminosas. Se os compostos não proteicos forem responsáveis pela inibição do stresse oxidativo e os proteicos pela inibição da atividade das MMPs, é possível que ambos os 64 6. Referências Bibliográficas 1. Tarraga Lopez PJ, Albero JS, Rodriguez-Montes JA. Primary and secondary prevention of colorectal cancer. Clinical medicine insights Gastroenterology. 2014; 7:33-46. 2. Labianca R, Beretta GD, Kildani B, Milesi L, Merlin F, Mosconi S, et al. Colon cancer. Critical reviews in oncology/hematology. 2010; 74(2):106-33. 3. Society AC. Cancer Facts & Figures, 2013. American Cancer Society. 2013 4. Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, Rosso S, Coebergh JW, Comber H, et al. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: estimates for 40 countries in 2012. European journal of cancer (Oxford, England : 1990). 2013; 49(6):1374-403. 5. SEER NCIs. What are the survival rates for colerectal cancer by stage? : American Cancer Society; 2004-2010. Disponível em: http://www.cancer.org/cancer/colonandrectumcancer/detailedguide/colorectalcancer-survival-rates#. 6. Glade MJ. Food, nutrition, and the prevention of cancer: a global perspective. American Institute for Cancer Research/World Cancer Research Fund, American Institute for Cancer Research, 1997. Nutrition (Burbank, Los Angeles County, Calif). 1999; 15(6):523-6. 7. Bruce WR, Giacca A, Medline A. Possible mechanisms relating diet and risk of colon cancer. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 2000; 9(12):1271-9. 65 8. Food, Nutrition, Physical Activity, and the prevention of cancer: a global perspective American Institute for Cancer Research. 2007 9. Stewart BW KP, editors. World cancer repor. Lyon: IARC Press. 2003 10. Welch JP, Donaldson GA. The clinical correlation of an autopsy study of recurrent colorectal cancer. Annals of surgery. 1979; 189(4):496-502. 11. Deryugina EI, Quigley JP. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis. Cancer metastasis reviews. 2006; 25(1):9-34. 12. Chambers AF, Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 1997; 89(17):1260-70. 13. Stamenkovic I. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. Seminars in cancer biology. 2000; 10(6):415-33. 14. Liotta LA, Thorgeirsson UP, Garbisa S. Role of collagenases in tumor cell invasion. Cancer metastasis reviews. 1982; 1(4):277-88. 15. Pauli BU, Schwartz DE, Thonar EJ, Kuettner KE. Tumor invasion and host extracellular matrix. Cancer metastasis reviews. 1983; 2(2):129-52. 16. Wirtz D, Konstantopoulos K, Searson PC. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 2011; 11(7):512-22. 17. Nagase H, Woessner JF, Jr. Matrix metalloproteinases. The Journal of biological chemistry. 1999; 274(31):21491-4. 18. Shapiro SD. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Current opinion in cell biology. 1998; 10(5):602-8. 19. Klein T, Bischoff R. Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases. Amino acids. 2011; 41(2):271-90. 66 20. Verma S, Kesh K, Ganguly N, Jana S, Swarnakar S. Matrix metalloproteinases and gastrointestinal cancers: Impacts of dietary antioxidants. World journal of biological chemistry. 2014; 5(3):355-76. 21. Herren B, Levkau B, Raines EW, Ross R. Cleavage of beta-catenin and plakoglobin and shedding of VE-cadherin during endothelial apoptosis: evidence for a role for caspases and metalloproteinases. Molecular biology of the cell. 1998; 9(6):1589-601. 22. Szarvas T, vom Dorp F, Ergun S, Rubben H. Matrix metalloproteinases and their clinical relevance in urinary bladder cancer. Nature reviews Urology. 2011; 8(5):241-54. 23. Nikkola J, Vihinen P, Vuoristo MS, Kellokumpu-Lehtinen P, Kahari VM, Pyrhonen S. High serum levels of matrix metalloproteinase-9 and matrix metalloproteinase-1 are associated with rapid progression in patients with metastatic melanoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2005; 11(14):5158-66. 24. Bjorklund M, Koivunen E. Gelatinase-mediated migration and invasion of cancer cells. Biochimica et biophysica acta. 2005; 1755(1):37-69. 25. Itoh T, Tanioka M, Yoshida H, Yoshioka T, Nishimoto H, Itohara S. Reduced angiogenesis and tumor progression in gelatinase A-deficient mice. Cancer research. 1998; 58(5):1048-51. 26. Bernhard EJ, Gruber SB, Muschel RJ. Direct evidence linking expression of matrix metalloproteinase 9 (92-kDa gelatinase/collagenase) to the metastatic phenotype in transformed rat embryo cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994; 91(10):4293-7. 67 27. Hua J, Muschel RJ. Inhibition of matrix metalloproteinase 9 expression by a ribozyme blocks metastasis in a rat sarcoma model system. Cancer research. 1996; 56(22):5279-84. 28. Parsons SL, Watson SA, Collins HM, Griffin NR, Clarke PA, Steele RJ. Gelatinase (MMP-2 and -9) expression in gastrointestinal malignancy. British journal of cancer. 1998; 78(11):1495-502. 29. Zheng H, Takahashi H, Murai Y, Cui Z, Nomoto K, Niwa H, et al. Expressions of MMP-2, MMP-9 and VEGF are closely linked to growth, invasion, metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma. Anticancer research. 2006; 26(5a):3579-83. 30. Yang B, Tang F, Zhang B, Zhao Y, Feng J, Rao Z. Matrix metalloproteinase-9 overexpression is closely related to poor prognosis in patients with colon cancer. World journal of surgical oncology. 2014; 12:24. 31. Zucker S, Vacirca J. Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer. Cancer metastasis reviews. 2004; 23(1-2):101-17. 32. Herszenyi L, Hritz I, Lakatos G, Varga MZ, Tulassay Z. The behavior of matrix metalloproteinases and their inhibitors in colorectal cancer. International journal of molecular sciences. 2012; 13(10):13240-63. 33. Sarkar FH, Li Y, Wang Z, Kong D. The role of nutraceuticals in the regulation of Wnt and Hedgehog signaling in cancer. Cancer metastasis reviews. 2010; 29(3):383-94. 34. de Mejia EG, Dia VP. The role of nutraceutical proteins and peptides in apoptosis, angiogenesis, and metastasis of cancer cells. Cancer metastasis reviews. 2010; 29(3):511-28. 68 35. (1994) FaAO. Definition and classification of commodities: pulses and derived products. 1994 36. Duranti M. Grain legume proteins and nutraceutical properties. Fitoterapia. 2006; 77(2):67-82. 37. Leterme P, Carmenza Munoz L. Factors influencing pulse consumption in Latin America. The British journal of nutrition. 2002; 88 Suppl 3:S251-5. 38. Tharanathan RN, Mahadevamma S. Grain legumes—a boon to human nutrition. Trends in Food Science & Technology. 2003; 14(12):507-18. 39. Tosh SM, Yada S. Dietary fibres in pulse seeds and fractions: Characterization, functional attributes, and applications. Food Research International. 2010; 43(2):450-60. 40. Lovejoy J. Fat: The Good, the Bad, and the Ugly. In: Wilson T, Bray GA, Temple NJ, Struble MB, editores. Nutrition Guide for Physicians. Humana Press; 2010. p. 1-11. 41. Iqbal A, Khalil IA, Ateeq N, Sayyar Khan M. Nutritional quality of important food legumes. Food chemistry. 2006; 97(2):331-35. 42. Boye J, Zare F, Pletch A. Pulse proteins: Processing, characterization, functional properties and applications in food and feed. Food Research International. 2010; 43(2):414-31. 43. Willett WC, Sacks F, Trichopoulou A, Drescher G, Ferro-Luzzi A, Helsing E, et al. Mediterranean diet pyramid: a cultural model for healthy eating. The American journal of clinical nutrition. 1995; 61(6 Suppl):1402s-06s. 44. Fung TT, Rexrode KM, Mantzoros CS, Manson JE, Willett WC, Hu FB. Mediterranean diet and incidence of and mortality from coronary heart disease and stroke in women. Circulation. 2009; 119(8):1093-100. 69 45. Esposito K, Maiorino MI, Ceriello A, Giugliano D. Prevention and control of type 2 diabetes by Mediterranean diet: a systematic review. Diabetes research and clinical practice. 2010; 89(2):97-102. 46. Schwingshackl L, Hoffmann G. Adherence to Mediterranean diet and risk of cancer: a systematic review and meta-analysis of observational studies. International journal of cancer Journal international du cancer. 2014; 135(8):188497. 47. Alcalay RN, Gu Y, Mejia-Santana H, Cote L, Marder KS, Scarmeas N. The association between Mediterranean diet adherence and Parkinson's disease. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 2012; 27(6):771-4. 48. Scarmeas N, Stern Y, Mayeux R, Manly JJ, Schupf N, Luchsinger JA. Mediterranean diet and mild cognitive impairment. Archives of neurology. 2009; 66(2):216-25. 49. Mudryj AN, Yu N, Aukema HM. Nutritional and health benefits of pulses. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 2014; 39(11):1197-204. 50. Craig WJ, Mangels AR. Position of the American Dietetic Association: vegetarian diets. Journal of the American Dietetic Association. 2009; 109(7):126682. 51. Hughes JS, Ganthavorn C, Wilson-Sanders S. Dry beans inhibit azoxymethane-induced colon carcinogenesis in F344 rats. The Journal of nutrition. 1997; 127(12):2328-33. 52. Hangen L, Bennink MR. Consumption of black beans and navy beans (Phaseolus vulgaris) reduced azoxymethane-induced colon cancer in rats. Nutrition and cancer. 2002; 44(1):60-5. 70 53. Correa P. Epidemiological correlations between diet and cancer frequency. Cancer research. 1981; 41(9 Pt 2):3685-90. 54. Michels KB, Giovannucci E, Chan AT, Singhania R, Fuchs CS, Willett WC. Fruit and vegetable consumption and colorectal adenomas in the Nurses' Health Study. Cancer research. 2006; 66(7):3942-53. 55. Schuurman AG, Goldbohm RA, Dorant E, van den Brandt PA. Vegetable and fruit consumption and prostate cancer risk: a cohort study in The Netherlands. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 1998; 7(8):673-80. 56. Takezaki T, Gao CM, Ding JH, Liu TK, Li MS, Tajima K. Comparative study of lifestyles of residents in high and low risk areas for gastric cancer in Jiangsu Province, China; with special reference to allium vegetables. Journal of epidemiology / Japan Epidemiological Association. 1999; 9(5):297-305. 57. Lee SA, Shu XO, Li H, Yang G, Cai H, Wen W, et al. Adolescent and adult soy food intake and breast cancer risk: results from the Shanghai Women's Health Study. The American journal of clinical nutrition. 2009; 89(6):1920-6. 58. Champ MM. Non-nutrient bioactive substances of pulses. The British journal of nutrition. 2002; 88 Suppl 3:S307-19. 59. Campos-Vega R, Loarca-Piña G, Oomah BD. Minor components of pulses and their potential impact on human health. Food Research International. 2010; 43(2):461-82. 60. Xu B, Chang SK. Comparative study on antiproliferation properties and cellular antioxidant activities of commonly consumed food legumes against nine human cancer cell lines. Food chemistry. 2012; 134(3):1287-96. 71 61. Woldemichael GM, Montenegro G, Timmermann BN. Triterpenoidal lupin saponins from the Chilean legume Lupinus oreophilus Phil. Phytochemistry. 2003; 63(8):853-7. 62. Morcos SR, Gabrial GN, El-Hafez MA. Nutritive studies on some raw and prepared leguminous seeds commonly used in the Arab Republic of Syria. Zeitschrift fur Ernahrungswissenschaft. 1976; 15(4):378-86. 63. Kerem Z, German-Shashoua H, Yarden O. Microwave-assisted extraction of bioactive saponins from chickpea (Cicer arietinum L). Journal of the Science of Food and Agriculture. 2005; 85(3):406-12. 64. Shi J, Arunasalam K, Yeung D, Kakuda Y, Mittal G, Jiang Y. Saponins from edible legumes: chemistry, processing, and health benefits. Journal of medicinal food. 2004; 7(1):67-78. 65. Shibuya M, Hoshino M, Katsube Y, Hayashi H, Kushiro T, Ebizuka Y. Identification of beta-amyrin and sophoradiol 24-hydroxylase by expressed sequence tag mining and functional expression assay. The FEBS journal. 2006; 273(5):948-59. 66. Rochfort S, Panozzo J. Phytochemicals for health, the role of pulses. Journal of agricultural and food chemistry. 2007; 55(20):7981-94. 67. MacDonald RS, Guo J, Copeland J, Browning JD, Jr., Sleper D, Rottinghaus GE, et al. Environmental influences on isoflavones and saponins in soybeans and their role in colon cancer. The Journal of nutrition. 2005; 135(5):1239-42. 68. Gurfinkel DM, Rao AV. Soyasaponins: the relationship between chemical structure and colon anticarcinogenic activity. Nutrition and cancer. 2003; 47(1):2433. 72 69. Xiao JX, Huang GQ, Zhang SH. Soyasaponins inhibit the proliferation of Hela cells by inducing apoptosis. Experimental and toxicologic pathology : official journal of the Gesellschaft fur Toxikologische Pathologie. 2007; 59(1):35-42. 70. Tsai CY, Chen YH, Chien YW, Huang WH, Lin SH. Effect of soy saponin on the growth of human colon cancer cells. World journal of gastroenterology : WJG. 2010; 16(27):3371-6. 71. Kang JH, Sung MK, Kawada T, Yoo H, Kim YK, Kim JS, et al. Soybean saponins suppress the release of proinflammatory mediators by LPS-stimulated peritoneal macrophages. Cancer letters. 2005; 230(2):219-27. 72. Sung MK, Kendall CWC, Rao AV. Effect of soybean saponins and gypsophila saponin on morphology of colon carcinoma cells in culture. Food and Chemical Toxicology. 1995; 33(5):357-66. 73. Kim HY, Yu R, Kim JS, Kim YK, Sung MK. Antiproliferative crude soy saponin extract modulates the expression of IkappaBalpha, protein kinase C, and cyclooxygenase-2 in human colon cancer cells. Cancer letters. 2004; 210(1):1-6. 74. Koratkar R, Rao AV. Effect of soya bean saponins on azoxymethaneinduced preneoplastic lesions in the colon of mice. Nutrition and cancer. 1997; 27(2):206-9. 75. Shamsuddin AM, Vucenik I, Cole KE. IP6: a novel anti-cancer agent. Life sciences. 1997; 61(4):343-54. 76. Muzquiz M, Varela A, Burbano C, Cuadrado C, Guillamón E, Pedrosa M. Bioactive compounds in legumes: pronutritive and antinutritive actions. Implications for nutrition and health. Phytochem Rev. 2012; 11(2-3):227-44. 77. Connie MW, Srimathi K. Phytate and Mineral Bioavailability. In: Food Phytates. CRC Press; 2001. 73 78. Urbano G, López-Jurado M, Aranda P, Vidal-Valverde C, Tenorio E, Porres J. The role of phytic acid in legumes: antinutrient or beneficial function? J Physiol Biochem. 2000; 56(3):283-94. 79. Rimbach G, Pallauf J. Cadmium accumulation, zinc status, and mineral bioavailability of growing rats fed diets high in zinc with increasing amounts of phytic acid. Biological trace element research. 1997; 57(1):59-70. 80. Steer TE, Gibson GR. The microbiology of phytic acid metabolism by gut bacteria and relevance for bowel cancer. International Journal of Food Science & Technology. 2002; 37(7):783-90. 81. Vucenik I, Shamsuddin AM. Cancer inhibition by inositol hexaphosphate (IP6) and inositol: from laboratory to clinic. The Journal of nutrition. 2003; 133(11 Suppl 1):3778s-84s. 82. Xu BJ, Yuan SH, Chang SK. Comparative analyses of phenolic composition, antioxidant capacity, and color of cool season legumes and other selected food legumes. Journal of food science. 2007; 72(2):S167-77. 83. Azevedo L, Gomes JC, Stringheta PC, Gontijo AM, Padovani CR, Ribeiro LR, et al. Black bean (Phaseolus vulgaris L.) as a protective agent against DNA damage in mice. Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association. 2003; 41(12):1671-6. 84. Cardador-Martinez A, Loarca-Pina G, Oomah BD. Antioxidant activity in common beans (Phaseolus vulgaris L.). Journal of agricultural and food chemistry. 2002; 50(24):6975-80. 85. Cai Y, Luo Q, Sun M, Corke H. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. Life sciences. 2004; 74(17):2157-84. 80 136. Kennedy AR, Wan XS. Effects of the Bowman-Birk inhibitor on growth, invasion, and clonogenic survival of human prostate epithelial cells and prostate cancer cells. The Prostate. 2002; 50(2):125-33. 137. Kennedy AR. The evidence for soybean products as cancer preventive agents. The Journal of nutrition. 1995; 125(3 Suppl):733s-43s. 138. Losso JN. The biochemical and functional food properties of the bowmanbirk inhibitor. Critical reviews in food science and nutrition. 2008; 48(1):94-118. 139. Giron-Calle J, Vioque J, del Mar Yust M, Pedroche J, Alaiz M, Millan F. Effect of chickpea aqueous extracts, organic extracts, and protein concentrates on cell proliferation. Journal of medicinal food. 2004; 7(2):122-9. 140. Park JH, Jang YJ, Choi YJ, Jang JW, Kim JH, Rho YK, et al. Fisetin inhibits matrix metalloproteinases and reduces tumor cell invasiveness and endothelial cell tube formation. Nutrition and cancer. 2013; 65(8):1192-9. 141. Aparicio-Fernandez X, Garcia-Gasca T, Yousef GG, Lila MA, Gonzalez de Mejia E, Loarca-Pina G. Chemopreventive activity of polyphenolics from black Jamapa bean (Phaseolus vulgaris L.) on HeLa and HaCaT cells. Journal of agricultural and food chemistry. 2006; 54(6):2116-22. 142. Zhou JR, Gugger ET, Tanaka T, Guo Y, Blackburn GL, Clinton SK. Soybean phytochemicals inhibit the growth of transplantable human prostate carcinoma and tumor angiogenesis in mice. The Journal of nutrition. 1999; 129(9):1628-35. 143. Jenab M, Thompson LU. Phytic acid in wheat bran affects colon morphology, cell differentiation and apoptosis. Carcinogenesis. 2000; 21(8):154752. 81 144. Lee KW, Lee HJ. The roles of polyphenols in cancer chemoprevention. BioFactors. 2006; 26(2):105-21. 145. Kapral M, Wawszczyk J, Hollek A, Dymitruk D, Weglarz L. Inhibitory effect of inositol hexaphosphate on metalloproteinases transcription in colon cancer cells stimulated with phorbol-12-myristate 13-acetate. Acta poloniae pharmaceutica. 2012; 69(6):1307-12. 146. Gaultier F, Foucault-Bertaud A, Lamy E, Ejeil AL, Dridi SM, Piccardi N, et al. Effects of a vegetable extract from Lupinus albus (LU105) on the production of matrix metalloproteinases (MMP1, MMP2, MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP1, TIMP2) by human gingival fibroblasts in culture. Clinical oral investigations. 2003; 7(4):198-205. 147. Kruger A, Kates RE, Edwards DR. Avoiding spam in the proteolytic internet: future strategies for anti-metastatic MMP inhibition. Biochimica et biophysica acta. 2010; 1803(1):95-102.