Caracterização Química e Bioatividade de Coleostephus Myconis: Incorporação em Formulações Dermocosméticas de Baixa Toxicidade

Sílvia Maria Fernandes Bessada Caracterização química e bioatividade de Coleostephus myconis (L.) Rchb.f.: incorporação em formulações dermocosméticas de baixa toxicidade Dissertação do 2º Ciclo de Estudos conducente ao grau de Mestre em Controlo de Qualidade Orientação Professora Doutora Maria Beatriz Prior Pinto Oliveira Doutor João Carlos Martins Barreira PORTO Outubro, 2015 “Deixe que as suas escolhas reflitam as suas esperanças, e não os seus medos.” Nelson Mandela, 1918-2013 i Agradecimentos No percurso da elaboração do presente trabalho, tive oportunidade de contactar e aprender com diversos profissionais. A todos que, de alguma forma, estiveram relacionados, manifesto a minha gratidão. À minha orientadora, Professora Doutora Maria Beatriz Oliveira, pela sua incansável dedicação, conhecimentos, incentivo e interesse pelo aluno como alguém que fará mudanças positivas no futuro. De facto, a Universidade é formação e informação e muito se deve a pessoas assim. Ao meu orientador, Doutor João Barreira, pela sua rigorosa orientação, apoio e compreensão. Os seus conhecimentos científicos e a sua capacidade pedagógica fazem de uma simples conversa em ensinamentos que perduram no tempo, um exemplo de perfecionismo e dedicação. Ao REQUIMTE, Laboratório de Bromatologia da Faculdade de Farmácia e a todos os seus elementos, em particular à Joana Santos, Anabela Costa, Filipa Pimentel e Antónia Nunes pelo apoio e partilha de informação. Ao grupo BioChemCore do Centro de Investigação de Montanha da Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Bragança e a todos os seus elementos pela simpatia e boa disposição, e pelo precioso apoio em diversos ensaios realizados durante este trabalho. Em particular à Professora Doutora Isabel C. F. R. Ferreira pelo acolhimento e estadia em Bragança. Ao Professor João Paulo Teixeira do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge pela oportunidade que me foi concedida para o estudo e avaliação da toxicidade celular. A todos os elementos do Departamento de Saúde Ambiental, pelo acolhimento, formação e ensinamentos, em particular à Doutora Carla Costa e à Maria João. À Maria, ao Tomás e ao Joni, por tudo. ii Resumo A investigação e desenvolvimento otimizado de novos produtos devem assentar em princípios de sustentabilidade ambiental, com recurso a fontes de origem natural, de fácil acesso e reduzido custo de produção. Neste contexto, a obtenção de produtos seguros para a saúde do consumidor deve ser transversal às indústrias alimentar, farmacêutica e cosmética. Alguns destes produtos são especificamente orientados para a melhoria das defesas antioxidantes. Na realidade, o estado de stress oxidativo está na base do desenvolvimento de diversas fisiopatologias humanas. Também o envelhecimento, que é determinado pela prevalência da degeneração em relação à regeneração dos tecidos, está associado ao stress oxidativo. Desta forma, a suplementação diária com antioxidantes exógenos (pela alimentação e aplicação de produtos dermatológicos) é benéfica para a diminuição do stress oxidativo, quer pela compensação da ineficácia dos sistemas de defesa endógenos, quer pelo aumento da resposta antioxidante global. A espécie Coleostephus myconis (L.) Rchb.f. é considerada uma erva daninha e persistente, com presença constante nos terrenos de cultivo abandonados (uma preocupante realidade do setor agrícola em Portugal). Predominante na flora portuguesa, o C. myconis pertence à família Asteraceae, que é reconhecida pelo seu valor medicinal mundial e elevado poder antioxidante, tal como descrito em diferentes trabalhos de investigação. No entanto, o C. myconis surge como uma espécie ainda subaproveitada, tornando-se imperativo desenvolver estudos de caracterização que possam elucidar as suas propriedades nutricionais, composição química e bioatividade e considerar a sua aplicação em produtos e formulações, como resposta ao crescente interesse em recursos de origem vegetal, valorização da flora silvestre e desenvolvimento sustentável. Neste trabalho, a avaliação da atividade antioxidante de diferentes extratos (aquoso, alcoólico, hidroalcoólico) das diferentes partes botânicas que constituem o C. myconis (caules e folhas, botões florais, flor em antese, flor senescente) e o estudo da citotoxicidade constituíram a base científica de validação da sua potencial aplicação em produtos derivados, nomeadamente formulações dermocosméticas para aplicação tópica. As diferentes partes botânicas foram ainda caracterizadas em relação aos macronutrientes, aminoácidos, compostos fenólicos e compostos lipofílicos (ácidos gordos e tocoferóis), considerando a sua possível utilização alternativa no desenvolvimento de alimentos funcionais e/ou suplementos alimentares. Os extratos hidroalcoólicos (1:1 v/v) das flores senescentes demonstraram os índices de atividade antioxidante mais elevados nos quatro ensaios (bloqueio de radicais DPPH: 0,25 mg/mL extrato; poder redutor: 0,13 mg/mL extrato; inibição da descoloração do β-caroteno: 0,41 mg/mL extrato; inibição da formação de TBARS: 0,08 mg/mL extrato). iii A incorporação destes extratos em géis hidrossolúveis e posterior determinação da atividade antioxidante, pelos mesmos ensaios, não revelou perdas de atividade significativas. Atendendo à caracterização do perfil em compostos fenólicos por HPLC/DAD-MS de extratos de flores senescentes e caule e folhas de C. myconis, os ácidos fenólicos foram os compostos predominantes (em especial, o ácido 3,5-O-dicafeoilquínico), tendo a miricetina-O-metilhexósido sido detetada como o principal flavonoide. A citotoxicidade dos extratos hidroalcoólicos das partes verdes e flor em senescência foi avaliada na linha celular tumoral humana (HepG2) considerando períodos de exposição de 24 h e 48 h, sem e com recuperação celular, não se tendo verificado recuperação da viabilidade celular após exposição aos extratos das flores senescentes. Na análise nutricional, os hidratos de carbono são o composto maioritário (87,6 g/100 g ms no caule e folhas; 81,1 g/100 g ms nas flores senescentes), enquanto a gordura total é o minoritário. A treonina é o aminoácido predominante nas duas partes botânicas estudadas (15 mg/g na flor; 6,2 mg/g no caule e folhas). Entre os ácidos gordos, o ácido linoleico (C18:2n6c) (43%) nas flores senescentes e o ácido linolénico (C18:3n3) (51%) nos caules e folhas foram os compostos predominantes, sendo a relação ácidos gordos insaturados/ácidos gordos saturados de 2,13 nas flores e 4,66 nos caules e folhas. Atendendo ao perfil em vitamina E, foram encontradas 4 das 8 isoformas possíveis, sendo o α-tocoferol (110 μg/g de óleo) e o δ-tocoferol (215 μg/g de óleo), as mais abundantes, (ambas nos nos caules e folhas). Em geral, os resultados para a atividade antioxidante e citotoxicidade dos extratos e dos géis hidrossolúveis, bem como a sua a caracterização nutricional e química demonstram que o C. myconis possui um excelente potencial como fonte de compostos bioativos promotores da saúde, pela diminuição do stress oxidativo e prevenção do envelhecimento. iv Abstract Research and optimized development of new products should be driven by environmental sustainability principles, using sources of natural origin, easy access and low production cost. In this context, obtaining safe products to consumer health must be a common purpose in the food, pharmaceutical and cosmetic industries. Some of these products are specifically designed to improve the antioxidant defenses. In fact, the oxidative stress status is the underlying mechanism of several human pathophysiologic conditions. Inclusively the aging process, characterized by the prevalence of degeneration over regeneration of tissues, is associated to oxidative stress. Thus, the daily supplementation with exogenous antioxidants (through food and application of dermatological products) contributes to reduce the oxidative stress, either by balancing the ineffectiveness of endogenous defense systems, or by increasing the total antioxidant response. The species Coleostephus myconis (L.) Rchb.f. is considered as being a harmful and persistent weed, with constant presence in abandoned farmland (a concerning reality in the Portuguese agricultural sector). Prevailing in the Portuguese flora, C. myconis belongs to the Asteraceae family, which is recognized for its global medicinal value and high antioxidant power, as described in different research works. However, C. myconis is still underutilized, demanding characterization studies to clarify its nutritional properties, chemical composition and bioactivity, and further application in products and formulations, as a response to the increasing interest in plant resources, valorization of sylvan flora and sustainable development. Herein, the evaluation of the antioxidant activity of different extracts (aqueous, alcoholic, hydroalcoholic) of different botanical parts of C. myconis (stems and leaves, buds, flower in anthesis, senescent flower) and the study of cytotoxicity were the scientific validation of their potential application in derived products, including dermocosmetic formulations for topical application. The different botanical parts were further characterized with respect to macronutrients, amino acids, phenolic compounds and lipophilic compounds (fatty acids and tocopherols), considering its alternative use in developing functional foods and/or dietary supplements. The hydroalcoholic extracts (1:1 v/v) of senescent flowers showed the highest antioxidant activity in the four tests (DPPH scavenging: 0.25 mg/mL extract; reducing power: 0.13 mg/mL extract; β-carotene discoloration inhibition: 0.41 mg/mL extract; TBARS formation inhibition: 0.08 mg/mL extract). The incorporation of these extracts in water soluble gels and subsequent determination of antioxidant activity, through the same tests, showed no significant activity losses. v Considering the characterization of the phenolic compounds profile by HPLC/DAD-MS in the senescent flower and in stems and leaves extracts, phenolic acids were the predominant compounds (in particular, 3,5-O-dicaffeoylquinic acid), while myricetin-O-methyl-hexoside was detected as the main flavonoid. The cytotoxicity of hydroalcoholic extracts of green parts and senescent flower was evaluated in a human tumor cell line (HepG2) considering exposure periods of 24 h and 48 h, with or without cell recovery. In the case of the assays with the senescent flower, the cell viability was not recovered after exposure. Regarding the nutritional analysis, the carbohydrates were the major compound (87.6 g/100 g DM in stems and leaves; 81.1 g/100 g DM in senescent flowers), while total fat was the minor compound. Threonine stood out as the predominant amino acid in the two botanical parts (15 mg/g in flowers; 6.2 mg/g on stems and leaves). Among the fatty acids, linoleic acid (C18: 2n6c) (43%) in senescent flowers and linolenic acid (C18:3n3) (51%) in stems and leaves were the predominant compounds, with unsaturated fatty acid/acids saturated fatty ratios of 2.13 in flowers and 4.66 in stems and leaves. Considering the vitamin E profile, four of the eight possible isoforms were found, with α-tocopherol (110 mg/g oil) and δ-tocopherol (215 mg/g of oil), as the most abundant (both in stems and leaves). Overall, the results for the antioxidant activity and cytotoxicity of extracts of soluble gels, as well as their nutritional and chemical characterization showed that C. myconis has an excellent potential as a novel source of health-promoting bioactive compounds, by reducing oxidative stress and anti-aging process. vi Publicações e comunicações [1] Bessada, S.M.F.; Barreira, João C.M.*; Oliveira, M. Beatriz P.P. 2015. Asteraceae species with most prominent bioactivity and their potential applications: a review. Industrial Crops and Products, 76, 604-615. [2] Bessada, S.M.F.; Barreira, João C.M.; Oliveira, M. Beatriz P.P. 2014. Antioxidant potential of Asteraceae species with botanical relevance in Portugal. 7º IJUP, 7th Meeting of Young Researchers of University of Porto, 12-14 de fevereiro, Universidade do Porto. [3] Bessada, S.M.F.; Barreira, João C.M.; Oliveira, M. Beatriz P.P. 2014. Application of the ruderal plant Coleostephus myconis as a new food source: evaluation of macronutrient composition. XX Encontro Luso-Galego de Química, Porto, 26-28 de novembro, Universidade do Porto. [4] Bessada, S.M.F.; Barreira, João C.M.; Ferreira, Isabel C.F.R.; Oliveira, M. Beatriz P.P. 2015. Antioxidant activity of polar extracts from different botanical parts of Coleostephus myconis. 8º IJUP, 8th Meeting of Young Researchers of University of Porto, 13-15 de maio, Universidade do Porto. vii Índice Agradecimentos ..................................................................................................................... i Resumo .................................................................................................................................. ii Abstract ................................................................................................................................. iv Publicações e comunicações ................................................................................................ vi Índice de figuras .................................................................................................................... ix Índice de tabelas ................................................................................................................... x Abreviaturas .......................................................................................................................... xi 1. Considerações iniciais ................................................................................................... 1 1.1. Stress oxidativo...................................................................................................... 1 1.2. Defesas antioxidantes ............................................................................................ 3 1.3. Avaliação das propriedades antioxidantes ............................................................. 5 1.3.1. Ensaio da capacidade de captação de radicais DPPH ................................... 6 1.3.2. Ensaio do poder redutor ................................................................................. 7 1.3.3. Ensaio da inibição da descoloração do β-caroteno ........................................ 7 1.3.4. Ensaio das substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) .................. 8 1.4. Envelhecimento como consequência do stress oxidativo ....................................... 8 1.5. Compostos bioativos das plantas ..........................................................................10 1.6. Potencial antioxidante de espécies da família Asteraceae ....................................12 1.7. Objetivos ...............................................................................................................21 1.7.1. Objetivos gerais ............................................................................................21 1.7.2. Objetivos específicos ....................................................................................21 2. Material e métodos ...................................................................................................... 22 2.1. Padrões e reagentes .............................................................................................22 2.2. Recolha e preparação das amostras .....................................................................22 2.3. Avaliação da atividade antioxidante ......................................................................23 2.3.1. Preparação dos diferentes extratos ...............................................................24 2.3.2. Atividade captadora de radicais DPPH ..........................................................24 2.3.3. Poder redutor ................................................................................................25 2.3.4. Inibição da descoloração do β-caroteno ........................................................25 2.3.5. Inibição da peroxidação lipídica na presença de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) ..................................................................................................26 2.4. Citotoxicidade .......................................................................................................26 2.4.1. Cultura celular e tratamentos ........................................................................27 2 Figura 1. Efeitos das espécies reativas nas principais moléculas. Adaptado de Carocho & Ferreira, 2013. Os radicais livres podem causar danos irreversíveis no ADN a nível químico ou estrutural. As modificações mais comuns incluem mutações resultantes da inserção ou deleção de bases, modificação de sequências de bases, erros de leitura, quebra de cadeias, ligações cruzadas ADN-proteína e rearranjos cromossómicos. O radical hidroxilo (HO⦁), produzido a partir da reação de Fenton, reage com todos os componentes da molécula de ADN (Carocho & Ferreira, 2013; Dizdaroglu et al., 2002; Valko et al., 2004). A ação dos radicais livres nas proteínas pode ocorrer pela modificação oxidativa de aminoácidos específicos, clivagem peptídica e formação de ligações cruzadas com produtos resultantes da peroxidação lipídica (Lobo et al., 2010). A peroxidação lipídica inicia-se nos ácidos gordos polinsaturados (AGPI) da membrana celular levando a reações radicalares em cadeia. O HO⦁ inicia as reações retirando um átomo de hidrogénio do carbono metilado da cadeia de ácidos gordos, produzindo um radical lipídico. Após a subsequente adição de oxigénio, forma o radical peroxilo (ROO•), que possui uma elevada reatividade e ataca outros ácidos gordos, formando hidroperóxidos e novos radicais, propagando-se assim a peroxidação lipídica (Lobo et al., 2010). A morte celular resulta da carbonilação proteica, peroxidação lipídica e fragmentação do ADN, causadas por espécies reativas indutoras de stress oxidativo. A produção excessiva de ROS tem vindo a ser relacionada com estímulos oncogénicos, por alteração das vias de sinalização e da regulação do estado redox, sugerindo que este estado celular desempenha um papel importante em sinais de transdução, diferenciação, proliferação celular e apoptose (Figura 2) (Ajiboye et al., 2013). Alvo dos radicais livres ADN e RNA Proteínas Lípidos Mutações. Quebra das cadeias. Rearranjos cromossomais. Ligações cruzadas ADN-proteínas. Modificação oxidativa de aminoácidos. Clivagem peptídica. Formação de ligações cruzadas com produtos da peroxidação lipídica. Peroxidação lipídica. Formação de ligações cruzadas com outras macromoléculas. 3 Figura 2. Resposta celular à produção de ROS. Adaptado de Wojcik et al., 2013. As ROS são as principais responsáveis pelo stress oxidativo e doenças associadas. No entanto, alguns estudos recentes e a identificação de novas espécies radicalares derivadas de azoto (como o óxido nítrico - NO⦁) e de enxofre têm vindo a alterar o conceito das espécies reativas exercerem sempre uma ação prejudicial (López-Alarcón & Denicola, 2013). 1.2. Defesas antioxidantes Para contrariar o efeito nocivo das espécies reativas, o organismo possui mecanismos biológicos de proteção (Figura 3). Estes agentes de defesa estão divididos em (i) antioxidantes endógenos, como hormonas, enzimas (superóxido dismutase - SOD, catalase e glutationa peroxidase - GPx), e (ii) antioxidantes exógenos (antioxidantes fornecidos pela dieta), como α-tocoferol, ácido ascórbico, carotenoides e compostos fenólicos, dotados da capacidade de anular ou remover os radicais livre do ambiente celular, de forma a proteger o organismo (Flora, 2009; Lü et al., 2010; Rahman, 2007). 4 Os antioxidantes presentes no organismo que inibem ou retardam os efeitos oxidativos, interrompendo a reação radicalar em cadeia, podem classificar-se em dois grandes grupos segundo o mecanismo de defesa: antioxidantes enzimáticos e antioxidantes não enzimáticos (Carocho & Ferreira, 2013; Flora, 2009). Figura 3. Antioxidantes naturais separados por classes: antioxidantes exógenos (a verde); antioxidantes endógenos (a castanho). Adaptado de Carocho & Ferreira, 2013. Nos últimos anos, tem vindo a ser sugerido que a suplementação diária com antioxidantes exógenos pode ser benéfica para a diminuição do estado de stress oxidativo, quer pela compensação da ineficácia dos sistemas de defesa endógenos, quer pelo aumento da resposta antioxidante total (Berger et al., 2012; Bouayed & Bohn, 2010). Desta forma, os antioxidantes podem bloquear as complexas vias de danos oxidativos em vários níveis de ação (Figura 4), uma vez que desempenham funções importantes na homeostasia redox das células, função celular e prevenção de doenças. Uma dieta rica em compostos antioxidantes, naturalmente presentes nas plantas, poderá assim ser favorável à saúde humana (Bagh et al., 2011). 5 Figura 4. Defesas in vivo contra o stress oxidativo. Os antioxidantes desempenham vários níveis de atividade. Adaptado de Bessada et al., 2015. 1.3. Avaliação das propriedades antioxidantes A capacidade antioxidante reflete a ação cumulativa de todos os antioxidantes presentes num extrato ou amostra biológica. Esta capacidade pode ser considerada como um bom indicador de alterações do estado de stress oxidativo in vivo (Ghiselli et al., 2000). Os ensaios de capacidade antioxidante in vitro são importantes para verificar se há ou não correlação entre antioxidantes fortes e os níveis de stress oxidativo (Huang et al., 2005). Os métodos disponíveis têm diferentes vantagens e desvantagens em termos de simplicidade de instrumentação, mecanismos, método de quantificação e relevância biológica (Niki, 2010), pelo que a melhor solução é utilizar vários métodos em simultâneo. Alguns destes procedimentos utilizam antioxidantes sintéticos ou radicais livres, outros são específicos para a peroxidação lipídica e necessitam de células animais ou vegetais; alguns têm um objetivo mais amplo, outros exigem manipulação e reagentes mínimos e são rápidos a produzir resultados (Carocho & Ferreira, 2013). 2a linha 3a linha 4a linha Antioxidantes Sinalização Expressão genética Adaptação Radicais livres ROS/RNS/RSS Desequilíbrio redox Stress oxidativo Oxidação de moléculas Dano oxidativo Doenças Envelhecimento Indução de enzimas de defesa 1a linha Reparação de novo Bloqueio de radicais Quelação de metais 6 1.3.1. Ensaio da capacidade de captação de radicais DPPH O ensaio de redução do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) tem sido amplamente utilizado como método químico de avaliação do potencial antioxidante de produtos naturais, particularmente em extratos de plantas medicinais (Braca et al., 2001). O radical livre DPPH apresenta cor violeta com um máximo de absorvância a 517 nm, que em presença de um antioxidante sofre redução, mudando a sua cor para amarelo e diminuindo a absorvância no comprimento de onda referido (Figura 5) (Amarowicz et al., 2004; López et al., 2007). Este método de medição da capacidade de doar protões à amostra é utilizado com frequência devido à sua simplicidade e velocidade de análise (Antolovich et al., 2002). Figura 5. Redução do radical DPPH. Além do mais, a análise de um grande número de amostras pode ser feita em microplacas. Porém, apresenta algumas limitações: o DPPH só pode ser dissolvido em meios orgânicos (especialmente em álcoois), o que é uma limitação importante ao interpretar a ação dos antioxidantes hidrofílicos. Deve atender-se ao facto deste método ser afetado pela luz, oxigénio e tipo de solvente; acima de um certo teor de água no solvente, há diminuição da capacidade antioxidante (Karadag et al., 2009). A concentração de antioxidante que causa uma diminuição de 50% da quantidade inicial de DPPH é denominada EC50 (concentração correspondente a 50% da eficácia total), seguindo-se a mesma designação para os métodos apresentados de seguida. 7 1.3.2. Ensaio do poder redutor Este ensaio em meio ácido baseia-se na capacidade de redução do Fe(III), que apresenta uma coloração amarela, a Fe(II), que apresenta uma tonalidade entre o verde e o azul (Karadag et al., 2009). Os valores são calculados através da medição do aumento da absorvância. No que diz respeito às suas limitações, qualquer composto (mesmo sem propriedades antioxidantes) com um potencial redox inferior ao do par redox Fe(III)/Fe(II) pode, em teoria, reduzir o Fe(III) a Fe(II), influenciando os resultados. Por outro lado, nem todos os antioxidantes reduzem Fe(III). Outro aspeto a considerar é a produção simultânea de Fe(II), que é um conhecido próoxidante e pode resultar na formação de radicais adicionais no meio reacional (e.g., o radical hidroxilo a partir de H2O2). Finalmente, os compostos que absorvem no comprimento de onda de medição podem interferir, sobrestimando os resultados (Magalhães et al., 2008). 1.3.3. Ensaio da inibição da descoloração do β-caroteno Este ensaio é muito utilizado na medição da atividade antioxidante de compostos bioativos, uma vez que o β-caroteno é extremamente suscetível à oxidação do radical linoleato (Bougatef et al., 2008). O β-caroteno sofre descoloração rápida na ausência de um antioxidante. Durante a oxidação, um átomo de hidrogénio é removido do ácido linoleico, dando posteriormente origem ao radical livre pentadienilo que, em seguida, ataca as moléculas altamente insaturadas do β-caroteno para readquirir o átomo de hidrogénio. Como as moléculas de β-caroteno perdem a sua conjugação, os carotenoides perdem a cor laranja característica, num processo que pode ser monitorizado por espetrofotometria. A presença de um antioxidante pode impedir a destruição do β-caroteno ao neutralizar o radical livre linoleato, e quaisquer outros radicais livres formados no interior do sistema, utilizando o seu potencial redox (Amarowicz et al., 2004). Assim, para inibir a descoloração do β-caroteno basta adicionar uma amostra contendo antioxidantes ou extratos vegetais pois estes podem ceder átomos de hidrogénio aos radicais, prevenindo assim a descoloração: β-caroteno-H (laranja) + ROO• → β-caroteno• (descolorado) + ROOH β-caroteno-H (laranja) + ROO• + AH → β-caroteno-H (laranja) + ROOH + A• Em que AH é um antioxidante dador de hidrogénio; A• é um antioxidante oxidado; ROOH é o radical hidroperóxido. 8 1.3.4. Ensaio das substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) Os lípidos livres ou na forma de ésteres de AGPI e colesterol são vulneráveis ao ataque de radicais livres. Muitos estudos têm demonstrado que a peroxidação lipídica induz perturbações e alterações nas membranas biológicas, formando compostos potencialmente tóxicos (Niki et al., 2010). A peroxidação lipídica envolve radicais livres que atacam sistemas biológicos e pode ser impedida por defesas enzimáticas ou não enzimáticas. Este método baseia-se na medição de malondialdeído (MDA) formado por clivagem de ácidos gordos insaturados após oxidação de um substrato lipídico (Bougatef et al., 2008). Numa fase inicial, um ião de um metal de transição ou um radical livre oxida o substrato; só então, e após adição de ácido tiobarbitúrico (TBA) se verifica a extensão da oxidação que pode ser medida por espetrofotometria (Figura 6). Verifica-se, normalmente, uma diminuição da absorvância, quando um antioxidante é adicionado; por esta razão, os resultados são expressos em percentagem de inibição da oxidação (Antolovich et al., 2002). Figura 6. Reação de MDA e TBA na formação de TBARS. 1.4. Envelhecimento como consequência do stress oxidativo A taxa de envelhecimento da pele, ou do organismo em geral, é determinada pela prevalência da degeneração em relação à regeneração dos tecidos. A ação dos radicais livres e o estado de stress oxidativo de um determinado tecido estão relacionados com o aumento da degeneração desse tecido e o processo de envelhecimento em geral. As consequências do envelhecimento humano são predominantemente visíveis na pele, pelo aumento do aparecimento de rugas e flacidez (Kammeyer & Lutein, 2015). 9 A pele é uma importante barreira de proteção entre o exterior e o interior do corpo humano e um órgão muito sujeito a stress oxidativo. O envelhecimento da pele é induzido por fatores intrínsecos e extrínsecos, ambos levando à diminuição da sua integridade estrutural e perda das funções fisiológicas (Barreira et al., 2013; Kammeyer & Lutein, 2015). As ROS desempenham um papel importante no envelhecimento da pele, uma vez que 1,5-5% do oxigénio consumido é convertido em ROS por processos intrínsecos (Poljsak et al., 2012). Fatores extrínsecos como a exposição a radiação UV, poluição ambiental e fumo de tabaco, aceleram também a produção de ROS nas células (Barreira et al., 2013; Masaki, 2010). A degeneração da pele pela radiação UV é um processo cumulativo e depende da frequência, duração e intensidade da exposição celular e da proteção natural da pele, conferida pela pigmentação (Ortonne, 2002). O(s) tipo(s) de ROS produzido(s) depende(m) ainda do comprimento de onda da radiação UV. A radiação UVB é um potencial ativador da produção do radical anião superóxido (O2 ⦁-) enquanto a radiação UVA leva à produção de singleto de oxigénio (1O2) através de reações fotossensibilizadoras com cromóforos internos (Barreira et al., 2013; Masaki, 2010). O 1O2 é oxidado a esqualeno, colesterol e resíduos acil-insaturados nos componentes lipídicos, produzindo hidroperóxidos. A oxidação de proteínas e lípidos altera as funções da pele; no caso da aplicação tópica de esqualeno oxidado (mono-hidroperóxido de esqualeno), a função protetora da pele é alterada, como resposta aguda, podendo também verificar-se o aparecimento de rugas, como resposta crónica (Barreira et al., 2013; Masaki, 2010). As espécies radicalares têm ainda uma importante ação sobre a melanogénese, embora a sua ação sobre os melanócitos não esteja completamente esclarecida (Masaki., 2010). A aplicação tópica de formulações cosméticas, nas quais são incluídos compostos com propriedades eliminadoras de radicais livres, tais como ácido ascórbico, tocoferóis, carotenoides e compostos fenólicos, protege os tecidos dérmicos melhorando a resistência ao stress oxidativo e prevenindo o envelhecimento da pele. Assim, tem vindo a verificar-se uma crescente procura de plantas e dos seus extratos, no desenvolvimento e formulação de novos produtos dermatológicos e cosméticos e potencial tratamento de problemas de pele (Barreira et al., 2013; Masaki., 2010). 10 1.5. Compostos bioativos das plantas As plantas produzem várias moléculas com ação antioxidante: compostos fenólicos, compostos azotados, vitaminas, terpenoides entre outros (Chetan et al., 2012; Phillipson, 2007). Os compostos bioativos são produzidos pela planta como metabolitos secundários, podendo ser identificados e caracterizados a partir de extratos de raízes, caule, casca, folhas, flores, frutos e sementes (Azmir, 2013; Krishnaiah et al., 2011). Entre os metabolitos secundários existem algumas substâncias que possuem efeitos benéficos nos sistemas biológicos. Alguns autores classificam os compostos bioativos obtidos a partir de plantas segundo o tipo de extração (Guha, 2009): i) compostos hidrofílicos ou polares (ex. compostos fenólicos); ii) compostos lipofílicos ou apolares (ex. carotenoides, terpenoides, vitamina E). Entre estes, os compostos bioativos mais estudados são os compostos fenólicos e os carotenoides (Ferreira, 2007). As plantas produzem milhares de compostos fenólicos, sendo comuns em alguns produtos de origem natural como o vinho ou o chá (Benfeito, 2013). Diversos estudos têm comprovado o elevado potencial antioxidante das plantas, sendo os compostos fenólicos os principais contribuintes, possuindo também outras atividades biológicas importantes como anti-inflamatória, anti-tumoral, antiviral, antimicrobiana e propriedades antialérgicas (Deshpande, 2013; Krishnaiah et al., 2011; Kumar, 2013). Os compostos fenólicos previnem ou reduzem os danos causados pelo stress oxidativo pela combinação de vários mecanismos como a eliminação de radicais livres, doação de átomos de hidrogénio, captura de 1O2, quelatação de iões metálicos, como substrato do anião O2 ⦁- e do HO⦁, e/ou aumentando a capacidade de defesas (e.g., estimulando a síntese de antioxidantes endógenos) (Nićiforović et al., 2010). Relativamente aos mecanismos, pode ocorrer transferência de i) átomos de H: LOO• + ArOH → LOOH + ArO• O radical ArO• deve ser estável para reagir lentamente com o substrato LH, mas rapidamente com o radical peroxilo lipídico (LOO•), interrompendo as reações em cadeia (Wright et al., 2001). ou ii) eletrões (ambas exemplificadas para o processo de peroxidação lipídica): LOO• + ArOH → LOO- + ArOH+ ArOH+ + H2O ↔ ArO• + H3O+ LOO- + H3O+ ↔ LOOH + H2O A equação global deste processo é idêntica à do anterior (Wright et al., 2001). 11 Na verdade, o potencial antioxidante de uma planta está relacionado com o seu teor em compostos fenólicos; estes podem ser classificados como: (1) flavonoides (e.g., flavonóis, flavonas, flavanóis, flavanonas, isoflavonoides e antocianidinas) e (2) compostos nãoflavonoides (ácidos fenólicos entre outros) (Ferreira & Abreu, 2007; Leopoldini, 2011). Os flavonoides são compostos fenólicos de distribuição ubíqua nas plantas. Caracterizam-se quimicamente por possuírem um núcleo flavano de dois anéis benzeno (A e B) ligados por um anel pirano que contém oxigénio (C) (Figura 7) (Lepoldini, 2011). Figura 7. Estrutura molecular geral dos flavonoides. Em função das substituições no anel C, como metilação, metoxilação, alquilação, oxidação, Ce O-glicosilação e hidroxilação, os flavonoides podem formar mais de 9000 compostos com atividade antioxidante, antibacteriana, antivírica e antitumoral (Putignani, 2013). A sua atividade antioxidante é conferida pela possibilidade de formação de quelatos com metais de transição, capacidade de eliminar HO⦁, ROO⦁ e O2 ⦁-, inibição de oxidases responsáveis pela produção de O2 ⦁-, ativação de enzimas antioxidantes, ou inibição da produção de NO⦁. Esta atividade depende da estrutura química, em particular do número e posição das funções fenólicas e a presença ou ausência de ligações duplas. Aos flavonoides são ainda atribuídas propriedades anti-inflamatórias e funções similares às de hormonas como o estrogénio (Benfeito, 2013; Ravishankar, 2013). Os ácidos fenólicos dividem-se em dois principais grupos: (i) os ácidos benzóicos que contêm 7 átomos de carbono (C6-C1) e (ii) os ácidos cinâmicos compostos por 9 átomos de carbono (C6-C3). Aparecem predominantemente sob a forma de ácido hidroxibenzóico e ácido hidroxicinâmico, na forma livre ou conjugada. Os ácidos fenólicos contêm pelo menos um anel benzeno ligado a uma ou mais funções fenólicas (Figura 8). Esta estrutura química parece estar diretamente relacionada com a sua atividade antioxidante (Leopoldini, 2011). 18 Figura 10. Distribuição geográfica da espécie C. myconis em Portugal Continental. Adaptado de http://www.flora-on.pt. Apesar de ter a capacidade de crescer em locais geralmente secos e sobre qualquer substrato, quando em terrenos cultivados e recentemente abandonados verifica-se um crescimento em grande extensão, podendo ocupar parte ou a totalidade do terreno. Até ao momento, não se verificou qualquer necessidade de intensificar a produção pelo uso de fertilizantes de origem química, uso de pesticidas ou inseticidas, tendo sido constatado ao longo deste tempo de estudo, um crescimento predominante em zonas agrícolas, margens de caminhos e bermas de estradas e autoestradas, onde não se faz uso de qualquer tratamento fitofarmacêutico de uso na agricultura convencional. O C. myconis apresenta uma floração sazonal, principalmente entre fevereiro e agosto. As suas flores são tipicamente amarelas, apresentando diferentes estados de maturação (no mesmo elemento podem encontrar-se flores jovens ou imaturas, adultas e envelhecidas) (Figura 11). 19 Figura 11. Diferentes estados de floração de C. myconis. Apesar da sua relevância geográfica, as pesquisas efetuadas em bases de dados científicas não resultaram em referências bibliográficas significativas desta espécie. O C. myconis é apenas referenciado em alguns estudos de elevada especificidade, como é o caso de um trabalho (Marshall et al., 1987) onde se constatou que a inoculação de caules e folhas desta espécie com o fungo Botrytis cinerea induzia a biossíntese de uma molécula com propriedades fungicidas. Mezache et al. (2009) fazem referência aos flavonoides encontrados no Chrysanthemum myconis, sinónimo de C. myconis, e da sua atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Considerada uma erva daninha e persistente pela comunidade agrícola, esta é uma planta com presença constante nos terrenos de cultivo abandonados, uma das nefastas consequências do setor agrícola em Portugal. A sua permanente floração entre os meses de fevereiro e agosto fazem do C. myconis uma espécie de utilidade com potenciais aplicações, podendo vir a ser considerado como um valioso recurso da flora portuguesa, até então subaproveitado. Neste contexto, é imperativo desenvolver estudos de caracterização desta espécie que possam elucidar as suas propriedades nutricionais, composição química e bioatividade. Posteriormente, deve considerar-se a sua aplicação em produtos de diferente tipologia, como resposta ao crescente interesse em recursos de origem vegetal, assim como pela importância de contribuir para o desenvolvimento sustentável de um país que prima pela riqueza da sua flora. 20 Entre as possíveis aplicações, é de realçar a incorporação de extratos naturais em formulações com interesse dermocosmético. Na verdade, apesar de o potencial antioxidante de extratos com princípios ativos vegetais ou de compostos puros isolados ter vindo a ser avaliado com alguma frequência, existem ainda poucos estudos sobre as propriedades antioxidantes de formulações finais. Neste setor particular, os géis têm-se tornado cada vez mais populares devido à sua facilidade de aplicação, melhor absorção percutânea (quando comparados com outras preparações semi-sólidas) e resistência ao stress fisiológico causado pela flexibilidade da pele e movimentos mucociliares (já que adotam a forma da área onde são aplicados) (Haneefa et al., 2010). Os géis podem ser preparados com diversos polímeros, e.g., carbopol 940, hidroxietilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose. De acordo com testes de estabilidade, tais como stress térmico, avaliação de pH, viscosidade e armazenamento a diferentes temperaturas, o carbopol 940 parece ser o polímero gelificante mais estável (Queiroz et al., 2009). 21 1.7. Objetivos 1.7.1. Objetivos gerais Como objetivo principal destaca-se a avaliação da atividade antioxidante de diferentes extratos (aquoso, hidroalcoólico, alcoólico) das diferentes partes anatómicas que constituem o C. myconis (partes verdes, botões florais, flor em antese e flor senescente) e estudo da citotoxicidade, com vista a determinar a sua potencial aplicação em produtos derivados. Como segundo objetivo geral, pode ser destacada a caracterização química e nutricional, atendendo particularmente à composição em macronutrientes, aminoácidos, compostos lipofílicos (ácidos gordos, tocoferóis) e compostos fenólicos de amostras de flores (em três estados de maturação) e partes verdes (caules e folhas) de C. myconis. A informação obtida, que poderá viabilizar a utilização desta planta na indústria alimentar ou farmacêutica, constitui a base científica para o desenvolvimento de formulações dermocosméticas (por incorporação dos extratos mais ativos desta planta) de baixa toxicidade para aplicação tópica. 1.7.2. Objetivos específicos Os extratos de C. myconis serão obtidos com solventes de baixa toxicidade e custo reduzido (aquosos, hidroalcoólicos, alcoólicos) e posteriormente avaliados quanto ao potencial antioxidante (efeito captador de radicais livres, poder redutor e inibição da peroxidação lipídica). Os mesmos ensaios serão repetidos nas formulações dermocosméticas preparadas por incorporação de extratos selecionados. A potencial citotoxicidade dos extratos a incorporar nos géis hidrossolúveis será estudada na linha celular tumoral HepG2, de forma a avaliar a viabilidade das formulações a desenvolver. Os diferentes componentes botânicos serão caracterizados em relação à sua composição fenólica através de técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espetrometria de massa, de forma a identificar as moléculas com maior relevância na bioatividade determinada. De uma forma mais abrangente, pode também dizer-se que este trabalho poderá contribuir para a valorização da flora silvestre com aplicações medicinais, constituindo um novo recurso natural de valor competitivo. 22 2. Material e métodos O presente trabalho foi realizado de forma faseada em diferentes instituições: REQUIMTE (Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto), Centro de Investigação de Montanha do Instituto Politécnico de Bragança e Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, dadas as necessidades específicas para a realização de cada um dos ensaios, cuja descrição será feita ao longo deste capítulo. 2.1. Padrões e reagentes Os padrões ácido gálico, catequina, imidazolidinil ureia, trietanolamina, 1,2-propanodiol e ácido poliacrílico (carbopol 940) foram adquiridos à Sigma (St. Louis, MO, EUA), o DPPH foi comprado à Alfa Aesar (Ward Hill, MA, EUA), o tocol (2-metil-2-(4,8,12-trimetiltridecil)- croman-6-ol) foi adquirido na Matreya Inc. (Pennsylvania, EUA), a norleucina e a mistura de padrões de metil ésteres de ácidos gordos (FAME) Supelco37 foram comprados à Supelco (Bellefonte, PA, USA), enquanto a mistura de L-aminoácidos LAA21 foi obtida na Sigma (St. Louis, MO, EUA). Para as análises cromatográficas, o acetonitrilo (grau de pureza HPLC) foi obtido da Merck KgaA (Darmstadt, Alemanha). O ácido fórmico e o ácido trifluoroacético foram adquiridos à Prolabo (VWR International, França). Os padrões de compostos fenólicos foram fornecidos pela Extrasynthese (Genay, França). Os reagentes brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT), o vermelho neutro e o Triton X-100 foram adquiridos na Sigma-Aldrich. A linha celular HepG2 foi obtida na European Collection of Cell Cultures. Todos os restantes compostos químicos e solventes eram de grau analítico, tendo sido comprados a fornecedores especializados. A água foi tratada através de um sistema de purificação Milli-Q (TGI Pure Water Systems, EUA). 2.2. Recolha e preparação das amostras As plantas de C. myconis foram colhidas na zona Noroeste de Portugal (Riba de Mouro, Minho) em junho de 2014 e divididas em 4 tipos de amostra: i) caules e folhas; ii) botões florais; iii) flores em antese (totalmente abertas e funcionais); iv) flores em fase de deiscência (Tabela 2). Testemunhos do material usado foram depositados no herbário local. Após a colheita, as amostras foram congeladas e liofilizadas durante 48 horas a -78 °C e à pressão de 0,015 mbar (Telstar Cryodos-80, Terrassa, Barcelona). 23 Tabela 2. Amostras de C. myconis e análises efetuadas. Planta Amostra Análises Partes verdes, constituídos por caules e folhas. Atividade antioxidante Citotoxicidade em HepG2 Compostos fenólicos Análise nutricional Aminoácidos Ácidos gordos Tocoferóis Incorporação em gel Botões florais Atividade antioxidante Compostos fenólicos Flor em antese Atividade antioxidante Compostos fenólicos Flor senescente Atividade antioxidante Citotoxicidade em HepG2 Compostos fenólicos Análise nutricional Aminoácidos Ácidos gordos Tocoferóis Incorporação em gel 2.3. Avaliação da atividade antioxidante Após a preparação dos três diferentes tipos de extratos, de polaridade crescente, como será descrito no ponto seguinte, foi avaliada a atividade antioxidante em todos os extratos, das quatro partes anatómicas que constituem o C. myconis, através de quatro ensaios distintos (atividade captadora de radicais DPPH, poder redutor, inibição da peroxidação lipídica na presença de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e inibição da descoloração do β-caroteno). 24 2.3.1. Preparação dos diferentes extratos De cada componente botânico, foram extraídos aproximadamente 0,5 g, à temperatura ambiente, por agitação magnética a 150 rpm, com 50 mL de etanol (extratos alcoólicos), 50 mL de água desionizada (extratos aquosos) e 50 mL de etanol:água 1:1 (v/v) (extratos hidroalcoólicos), durante 60 minutos. Posteriormente, os diferentes extratos foram filtrados através de filtros de papel Whatman nº 4. Os resíduos obtidos foram re-extraídos sob as mesmas condições. Os extratos foram evaporados a 40 °C (evaporador rotativo Buchi R-210) sob pressão reduzida, para remover os solventes extratores e determinar a massa de extrato. Posteriormente foi preparada uma solução mãe com a concentração de 10 mg/mL de cada um dos diferentes extratos (aquoso, hidroalcoólico e alcoólico) para cada uma das amostras. A partir da solução mãe foram efetuadas diluições num intervalo de 0,078125-5 mg/mL. 2.3.2. Atividade captadora de radicais DPPH Esta metodologia foi executada num Leitor de Microplacas ELX800 (Bio-Tek Instruments, Inc.). Amostras (30 µL) de cada uma das diferentes concentrações dos diferentes extratos e de controlos negativos (branco) dos diferentes solventes (água, água/etanol 1:1 e etanol) foram colocadas em triplicado nos poços juntamente com a solução de DPPH (270 µL, 6×10-5 mol/L). A mistura com a solução de DPPH foi deixada ao abrigo da luz durante 60 minutos. A redução do radical DPPH foi avaliada pela absorvância a 515 nm. A atividade captadora de radicais livres (RSA) foi calculada em função da percentagem de descoloração do DPPH usando a equação: % RSA = [(ADPPH - AS)/ADPPH] × 100, onde AS é a absorvância da solução na presença de extrato numa determinada concentração e ADPPH é a absorvância da solução de DPPH. A EC50 foi calculada por interpolação a partir do gráfico de percentagem de RSA em função da concentração da amostra. O Trolox foi utilizado como controlo positivo. 25 2.3.3. Poder redutor Para este método foi utilizado o leitor de microplacas referido em 2.3.2. A 0,5 mL das diferentes concentrações de extratos foi adicionado tampão fosfato de sódio (200 mmol.L-1, pH 6,6, 0,5 mL) e ferricianeto de potássio (1%, w/v, 0,5 mL). A mistura foi incubada a 50 °C durante 20 min. Adicionou-se posteriormente ácido tricloroacético (10%, w/v, 0,5 mL). Na microplaca colocaram-se 0,8 mL da mistura reacional, água desionizada (0,8 mL) e cloreto de ferro (III) (0,1%, w/v 0,16 mL) e avaliada a absorvância a 690 nm. A EC50 (correspondente a 0,5 de absorvância) é calculada por interpolação a partir do gráfico de absorvância a 690 nm em função da concentração da amostra. O Trolox foi utilizado como controlo positivo. 2.3.4. Inibição da descoloração do β-caroteno Preparou-se, por dissolução, uma solução de β-caroteno (2 mg) em clorofórmio (10 mL). Pipetaram-se 2 mL desta solução de β-caroteno para um balão de fundo redondo e evaporouse o clorofórmio a 40 °C sob vácuo. Aos 0,4 mg de β-caroteno resultantes, adicionou-se ácido linoleico (40 mg), emulsionante Tween 80 (400 mg) e água destilada (100 mL), agitando vigorosamente até emulsionar. Transferiram-se 4,8 mL desta emulsão para tubos de ensaio contendo 0,2 mL de cada uma das diferentes concentrações dos extratos. Os tubos foram agitados (vortex) e medida a absorvância a 470 nm (tempo zero). Posteriormente foram incubados com agitação (50 °C, 2 h), sendo a absorvância novamente determinada a 470 nm (espetrofotómetro AnalytikJena 200-2004). A inibição da descoloração do β-caroteno foi calculada utilizando a seguinte equação: (conteúdo do βcaroteno após 2 h de ensaio/conteúdo β-caroteno inicial) × 100. A EC50 foi calculada por interpolação a partir do gráfico de percentagem da inibição da descoloração do β-caroteno em função da concentração da amostra. O Trolox foi utilizado como controlo positivo. 26 2.3.5. Inibição da peroxidação lipídica na presença de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) Foi utilizado tecido cerebral de porco (Sus scrofa) como fonte lipídica. O tecido foi dissecado e homogeneizado com tampão tris-HCl (20 mM, pH 7,4) numa proporção 1:2 (w/v), em banho de gelo. A mistura foi agitada e centrifugada a 3000g durante 10 min. A 0,2 mL de cada concentração dos diferentes extratos adicionou-se 0,1 mL de ácido ascórbico (0,1 mM), sulfato de ferro (0,1 mL) e 0,1 mL de sobrenadante do homogeneizado cerebral. A mistura foi incubada durante 1 h a 37 °C. A reação terminou pela adição de ácido tricloroacético (28%, w/v, 0,5 mL), seguido de ácido tiobarbitúrico (TBA, 2%, w/v, 0,38 mL), esta mistura foi depois aquecida a 80 °C durante 20 min. Decorrido este período, centrifugou-se (3000 rpm, 5 min) para remover a proteína precipitada. A intensidade da cor do complexo malondialdeído-ácido tiobarbitúrico (MDA-TBA) no sobrenadante foi medida a 532 nm. A percentagem de inibição da peroxidação lipídica foi calculada utilizando a fórmula: [(A - B)/A] × 100%, onde A e B correspondem à absorvância do controlo e da solução com o extrato, respetivamente. A EC50 foi calculada por interpolação a partir do gráfico da percentagem de inibição da formação de TBARS em função da concentração da amostra. O Trolox foi utilizado como controlo positivo. 2.4. Citotoxicidade Os extratos hidroalcoólicos do caule e folhas e da flor senescente foram avaliados quanto à sua citotoxicidade, tendo sido preparadas sucessivas diluições (no próprio meio de cultura celular) correspondentes às concentrações EC25, EC37,5, EC50, EC62,5 e EC75 determinadas a partir dos ensaios de atividade antioxidante. Os ensaios foram efetuados na linha celular tumoral humana, HepG2 (carcinoma hepatocelular), por períodos de exposição de 24 h e 48 h. Os ensaios de viabilidade celular utilizados foram o MTT e a incorporação de vermelho neutro (NRU), quer imediatamente após a exposição da linha celular ao extrato por períodos de 24 h e 48 h, quer após permitir um tempo de recuperação de 24 h, após renovação do meio de cultura (24 h com recuperação; 48 h com recuperação). Todos os ensaios foram efetuados em triplicado. O Triton X-100 a 1% foi utilizado como controlo positivo. 27 2.4.1. Cultura celular e tratamentos A linha celular humana de carcinoma hepatocelular (HepG2) é uma linha contínua obtida a partir de um rapaz Caucasiano de 15 anos de idade do sexo masculino, que apresentava um carcinoma hepatocelular bem diferenciado. Esta linha celular foi cultivada no meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) com L-glutamina (1%), solução de antibióticos e antimicóticos (1%), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado. Após as células atingirem 80% de confluência nos frascos-T, foram transferidas para novos frascos com meio de cultura fresco. Nesse processo, o meio de cultura foi removido e a camada de células foi lavada com PBS (solução salina tamponizada com fosfato). Após este procedimento, a monocamada confluente de células foi tripsinizada (tripsina a 0,25%/EDTA a 0,02% em PBS sem Ca2+ ou Mg2+) e incubada a 37 °C durante cerca de 1 min. Após separação celular, a tripsina foi inativada com meio de cultura e a suspensão foi transferida para um tubo de fundo cónico e centrifugada durante 5 min a 365g. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento ressuspenso em meio de cultura celular. A suspensão foi transferida para novos frascos-T, e novo meio completo foi adicionado (proporção de subcultura de 1:3). As células foram incubadas numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 e 37 °C. Todos estes procedimentos foram realizados numa câmara de fluxo laminar para garantir condições estéreis. Todos os materiais foram manipulados utilizando procedimentos adequados, a fim de evitar a contaminação externa. Os extratos secos de ambas as componentes botânicas foram diretamente dissolvidos em meio de cultura numa concentração adequada à posterior preparação das diferentes concentrações ensaiadas. Para a avaliação da citotoxicidade, as células foram semeadas a uma concentração de 2.5x104 células por poço em placas de 96 poços, deixando-se aderir durante 24 h a 37 °C. Para cada ensaio e cada extrato, 100 μL de diferentes suspensões foram avaliadas em meio completo. O meio completo foi utilizado como controlo negativo e o Triton X-100 (1%) em meio completo foi utilizado como controlo positivo. 2.4.2. Ensaio do MTT Após o período de incubação, preparou-se uma solução de MTT (500 µg/mL) a partir de uma solução stock (5 mg/mL, preparada em meio incompleto), usando meio incompleto para fazer a diluição. Após o tempo de exposição, os tratamentos e controlos foram retirados dos poços da placa e foram acrescentados 100 µL da solução de MTT (500 µg/mL) a cada poço. 34 2.9. Caracterização da composição em vitamina E A determinação do teor de vitamina E fez-se a partir da mesma fração lipídica que foi utilizada na metodologia anterior (2.8.). Para a identificação e quantificação dos compostos individuais prepararam-se soluções-padrão em n-hexano (25; 18,75; 12,5; 6,25; 2,5; e 1,25 mg/ml) contendo os seguintes vitâmeros: α, β, γ e δ–tocoferol e α, β, γ e δ-tocotrienol. Cada uma destas soluções continha 20 μL de tocol, padrão interno (PI, 1 mg/mL). Cerca de 20 mg da gordura extraída (com adição prévia de tocol, 1 mg/mL) foram dissolvidos em 1 mL de n-hexano. Agitou-se a mistura em vortex e centrifugou-se (Heraeus Sepatech Biofuge Pico, Haraeus Instrumments, Germany) a 13000 rpm, durante 3 minutos. O sobrenadante foi transferido para vials âmbar de injeção e conservado a -20 °C até análise cromatográfica (HPLC/FD) (Alves et al., 2009). A análise cromatográfica foi realizada num sistema HPLC da Jasco (Japão) equipado com um injetor automático (AS-950), uma bomba (PU-980) e um detetor de díodos (MD-910) acoplado a um FD (FP-920). A separação cromatográfica foi efetuada numa coluna de fase normal Supelcosil LC-SI (3 μm; 75 mm × 3,0 mm; Supelco, Bellefonte, EUA), à temperatura ambiente (21 °C). Utilizou-se como eluente uma mistura de n-hexano e 1,4-dioxano (98:2), a um fluxo de 0,7 mL/minuto (Alves et al., 2009). Os compostos foram identificados com base nos seus espetros UV/Vis e tempo de retenção dos respetivos padrões. A quantificação foi efetuada pelo método do padrão interno, usando os cromatogramas obtidos com o detetor de fluorescência (λexcitação = 290 nm; λemissão = 330 nm). Os dados foram analisados no Software Borwin-PDA Controller (JMBS, França). Todas as análises foram efetuadas em duplicado e os resultados expressos em µg/g de gordura. 2.10. Preparação do gel hidrossolúvel Foi preparada uma base semi-sólida por adição de 0,5 g de Carbopol 940 a 20 mL de água desionizada. A mistura foi deixada em repouso durante 1 h, após a qual se adicionou 1 mL de trietanolamina e um volume de extrato equivalente à EC50 média determinada a partir dos valores obtidos em cada um dos ensaios de atividade antioxidante efetuados com os extratos. 35 De seguida, adicionou-se ácido cítrico (0,45 g), EDTA dissódico (0,005 g), imidazolidinilureia (0,1 g) e propilenoglicol (7,5 g). O produto final foi ajustado a 50 g, por adição de água desionizada, e submetido a ensaios de avaliação da atividade antioxidante, por forma a verificar a manutenção da atividade medida nos extratos isolados. Nas mesmas condições, foi preparada uma formulação base, sem incorporação de extrato, como controlo negativo. A atividade antioxidante do gel hidrossolúvel foi avaliada pelas técnicas anteriormente descritas em 2.3.2, 2.3.3, 2.3.4 e 2.3.5. 2.11. Análise estatística Para cada extrato foram consideradas três amostras, sendo cada amostra analisada em duplicado (análises cromatográficas) ou triplicado (ensaios de bioatividade). Os resultados são expressos como média±desvio-padrão. As diferenças estatísticas representadas com letras foram verificadas através de análise de variância (ANOVA) a um fator, seguida do teste de Tukey (para distribuições homoscedásticas) ou de Tamhane’s T2 (distribuições heteroscedásticas) acoplados ao método de Welch. A normalidade entre grupos de amostras e a homogeneidade das variâncias e das matrizes de variância-covariância foram verificadas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov com correção de Lilliefors, o teste de Levene e o teste MBox, respetivamente. Todos os testes estatísticos foram feitos considerando um α = 0,05, utilizando o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS), v. 22.0. 36 3. Resultados e discussão 3.1. Avaliação da atividade antioxidante Apesar da ausência de estudos com a espécie C. myconis, outras plantas da família Asteraceae têm vindo a ser referenciadas pela sua atividade antioxidante (Tabela 1). Considerando a sua relação filogenética com estas espécies, e também a elevada disponibilidade botânica no Noroeste português, foram avaliados diferentes extratos de C. myconis de forma verificar a sua atividade antioxidante e potencial inclusão em formulações tópicas para aplicações dermocosméticas. Para comparar o potencial antioxidante das diferentes partes botânicas de C. myconis extraídas com solventes de baixa toxicidade (água, etanol e água:etanol 1:1), realizaram-se quatro ensaios in vitro: atividade captadora de radicais DPPH, poder redutor, inibição da descoloração do β-caroteno e inibição da formação de TBARS. Os resultados obtidos nestes ensaios estão apresentados na Tabela 3. Apesar de se verificar alguma relação entre a atividade antioxidante de cada parte botânica e o solvente de extração utilizado, é possível inferir algumas conclusões gerais. Os extratos obtidos a partir das partes verdes, por exemplo, demonstraram menores índices de atividade em todos os ensaios (exceto para a inibição da formação de TBARS observada nos extratos etanólicos), independentemente do solvente utilizado. Por outro lado, os botões florais e as flores em deiscência demonstraram os índices de atividade mais elevados, tendo os melhores valores globais sido registados para os extratos hidroalcoólicos obtidos a partir das flores em deiscência (bloqueio de radicais DPPH: 0,25 mg/mL de extrato; poder redutor: 0,13 mg/mL de extrato; inibição da descoloração do βcaroteno: 0,41 mg/mL de extrato; inibição da formação de TBARS: 0,08 mg/mL de extrato, neste caso com valores similares aos dos restantes estados florais). Os valores determinados estão dentro da gama expectável para este tipo de matriz, embora não possam ser comparados diretamente com outros resultados obtidos para esta espécie, já que não existem trabalhos publicados na atividade antioxidante de C. myconis. Os solventes testados nesta fase do trabalho foram selecionados pela sua baixa toxicidade, o que torna os extratos adequados para a incorporação em produtos de dermocosmética ou aplicações relacionadas com a Indústria Alimentar. 37 Tabela 3. Atividade antioxidante (EC50 em mg/mL) dos extratos preparados a partir de diferentes partes botânicas de C. myconis. Efeito captador de DPPH1 Poder redutor1 Inibição da descoloração do β-caroteno1 Inibição da formação de TBARS1 etanol caules e folhas 3,9±0,1 a 0,78±0,01 a 1,4±0,1 a 0,09±0,01 b botão floral 0,41±0,02 c 0,15±0,01 d 0,62±0,01 c 0,11±0,01 a flor em antese 0,52±0,01 b 0,24±0,01 b 0,85±0,03 b 0,08±0,01 c flor senescente 0,46±0,01 bc 0,18±0,01 c 0,48±0,01 d 0,08±0,01 c Homoscedasticidade2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 ANOVA a 1 fator3 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 água caules e folhas 2,1±0,1 a 0,72±0,01 a 1,5±0,1 a 0,20±0,01 a botão floral 0,39±0,05 c 0,20±0,01 d 0,50±0,01 c 0,08±0,01 c flor em antese 1,2±0,1 b 0,54±0,01 b 0,89±0,02 b 0,19±0,01 a flor senescente 0,47±0,01 c 0,35±0,01 c 0,47±0,01 d 0,11±0,01 b Homoscedasticidade2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 ANOVA a 1 fator3 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 hidroalcoólico caules e folhas 0,51±0,04 a 0,30±0,01 a 1,4±0,1 a 0,09±0,01 a botão floral 0,34±0,01 b 0,21±0,01 b 0,49±0,01 c 0,08±0,01 b flor em antese 0,33±0,01 b 0,18±0,01 c 0,72±0,01 b 0,08±0,01 b flor senescente 0,25±0,01 c 0,13±0,01 d 0,41±0,01 d 0,08±0,01 b Homoscedasticidade2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 ANOVA a 1 fator3 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 1Letras diferentes em cada coluna e tipo de extrato indicam valores médios com diferenças significativas (p<0,001). Estas diferenças foram classificadas pelo teste de Tamhane T2, já que não se verificou homoscedasticidade. 2A homoscedasticidade entre as partes botânicas foi calculada através do teste de Levene. 3Como p<0,001, o valor médio do parâmetro avaliado difere dos outros em pelo menos uma das partes botânicas, logo a comparação múltipla pode ser realizada. 38 3.2. Citotoxicidade A avaliação da citotoxicidade foi feita no caule e folhas e na flor senescente, selecionados devido à maior disponibilidade em biomassa e atividade antioxidante superior, respetivamente (tal como descrito na secção anterior). A citotoxicidade foi avaliada pela realização de dois ensaios de viabilidade celular (MTT e NRU) após exposição das células aos extratos hidroalcoólicos (em diferentes concentrações) das duas partes botânicas selecionadas. A linha celular HepG2 foi utilizada por ser um modelo de excelência em ensaios de citotoxicidade (Yi et al., 2006). Os estudos de viabilidade celular foram efetuados após a exposição das células durante 24h e 48h, sem e com recuperação celular, por um período de 24h. Os resultados obtidos para o extrato correspondente à EC25 foram genericamente idênticos aos do controlo negativo (meio completo), tendo-se verificado sempre uma viabilidade próxima de 100,0%. Assim, a comparação entre concentrações será feita considerando a concentração mínima imediatamente superior à anterior (EC37,5) e a concentração máxima ensaiada (EC75). No ensaio MTT, e após exposição durante 24 e 48 h com as cinco concentrações (EC25, EC37,5, EC50, EC62,5 e EC75) de extrato de caule e folhas de C. myconis, a viabilidade celular variou entre 91,7% para a EC37,5 e 47,1% para a EC75, após uma exposição de 24 h (Figura 12A), e entre 90,0% para a EC37,5 e 56,2% para a EC75, após uma exposição de 48 h (Figura 12B). Comparativamente, as células expostas ao controlo positivo (Triton X-100), demonstraram uma viabilidade de 19,3% (após 24 h) e 21,2% (após 48 h). No ensaio NRU efetuado mantendo as mesmas condições (24 e 48 h de exposição sem recuperação), a viabilidade celular para a EC37,5 foi de 95,3%, após 24 h, e 85,0% após 48 h (Figura 12C). No caso do extrato correspondente à EC75, verificou-se uma viabilidade de 52,5%, após 24 h, e de 57,5%, após 48 h, tendo os controlos positivos registado valores de 39,5% e 35,2%, para as exposições de 24 e 48 h, respetivamente. Em relação aos ensaios efetuados com extratos de flores senescentes (EC25, EC37,5, EC50, EC62,5 e EC75), os resultados obtidos para o ensaio MTT demonstraram uma viabilidade celular entre 90,6%, para a EC37,5 e 73,2%, para a EC75 (Figura 12A), após 24 h de exposição. Nos ensaios com 48 h de exposição (Figura 12B), a viabilidade celular atingiu valores de 99,9% (EC37,5) e 63,8% (EC75); os valores obtidos para o controlo positivo foram 16,9% (24 h) e 24,3% (48 h). No ensaio NRU, os valores viabilidade foram de 99,9% (EC37,5), 91,5% (EC75) e 46,9% (Triton X-100), após 24 h de exposição e 90,6% (EC37,5), 72,1% (EC75) e 27,3% (Triton X-100), após 48 h de exposição. 39 (A) (B) (C) (D) Figura 12. Citotoxicidade dos extratos de flores senescentes e caules e folhas em condições selecionadas. 0 20 40 60 80 100 120 EC25 EC37,5 EC50 EC62,5 EC75 CP Viabilidade celular (%) Concentração de extrato (mg/mL) MTT - 24 h (sem recuperação) Caules e folhas Flores senescentes 0 20 40 60 80 100 120 EC25 EC37,5 EC50 EC62,5 EC75 CP Viabilidade celular (%) Concentração de extrato (mg/mL) NRU - caules e folhas (sem recuperação) 24 h 48 h 0 20 40 60 80 100 120 EC25 EC37,5 EC50 EC62,5 EC75 CP Viabilidade celular (%) Concentração de extrato (mg/mL) MTT - 48 h (sem recuperação) Caules e folhas Flores senescentes 0 20 40 60 80 100 120 EC25 EC37,5 EC50 EC62,5 EC75 CP Viabilidade celular (%) Concentração de extrato (mg/mL) MTT - flores senescentes (com recuperação) 24 h 48 h 40 Considerando os resultados obtidos sem recuperação, verificou-se em ambos os ensaios de viabilidade celular (MTT e NRU) uma diminuição da percentagem de células viáveis dependente da concentração do extrato e do tempo de exposição. Em relação aos resultados obtidos após repetição das condições experimentais anteriores, mas permitindo agora um período de recuperação de 24 h, as células em contacto com o extrato correspondente à concentração EC37,5 dos caules e folhas de C. myconis apresentaram valores de viabilidade celular (MTT) de 100,0% para ambos os períodos de exposição; já as células expostas aos extratos com concentração equivalente à EC75, apresentaram percentagens de viabilidade de 89,4 e 82,0, para as 24 h e 48 h, respetivamente. Os valores do controlo positivo também subiram ligeiramente (40,2% para 24 h de exposição e 30,1% para 48 h de exposição). No caso do ensaio NRU, ambas as concentrações demonstraram viabilidades próximas de 100,0% para ambos os tempos de exposição, enquanto as células expostas ao Triton X-100 apresentaram em ambos os tempos uma viabilidade de cerca de 40%. Nos ensaios efetuados com extratos de flores senescentes, apenas se verificou alguma recuperação de viabilidade no caso do ensaio NRU, para o qual as células ensaiadas com o extrato a EC37,5 demonstraram uma viabilidade próxima de 100,0% para ambos os tempos de exposição, enquanto nas células ensaiadas com extrato a EC75 se observaram viabilidades de 73,7% e 95,2%, para as 24 h e 48 h (o que leva a admitir que as células terão sido danificadas pela manipulação experimental, dado que a menor viabilidade deveria corresponder ao maior tempo de exposição). Os resultados para o controlo positivo foram 74,0% e 51,9%, para as 24 h e 48 h, respetivamente. No caso do ensaio MTT (Figura 12D), os valores de viabilidade para a recuperação após 24 h de exposição foram 80,6% (EC37,5), 35,1% (EC75) e 23,2% (controlo positivo); após 48 h de exposição, os valores obtidos foram 61,1% (EC37,5), 46,6% (EC75) e 30,1% (controlo positivo), o que indica que não houve recuperação da viabilidade celular após exposição aos extratos de flores senescentes, possivelmente por danos causados na atividade mitocondrial das células. 41 3.3. Análise nutricional A caracterização química e a avaliação do perfil nutricional de uma planta silvestre, subaproveitada, com elevada abundância e de fácil acesso, constituem um requisito fundamental na perspetiva da sua potencial utilização em diferentes aplicações. As flores senescentes e os caules e folhas apresentaram elevados teores de humidade (Tabela 4), tendo-se registados valores de 75,1% e 80,2%, respetivamente. Apesar de não existirem estudos científicos (até à data) que incluam esta espécie, os teores em humidade são concordantes com os obtidos em plantas da família Asteraceae (García-Herrera et al., 2014). Considerando os resultados em base de massa seca (ms), os hidratos de carbono são o composto maioritário por larga margem (87,6 g/100 g ms no caule e folhas; 81,1 g/100 g ms nas flores senescentes). A flor senescente (8,3 g/100 g ms) apresentou um teor em proteína superior ao do caule e folhas (4,4 g/100 g ms), enquanto os teores em cinzas apresentaram valores bastante próximos, apesar de ligeiramente superiores nas flores (6,5 g/100 g ms no caule e folhas; 7,0 g/100 g ms nas flores senescentes). Ambas as componentes botânicas registaram valores baixos de gordura total (1,4 g/100 g de massa seca no caule e folhas; 3,6 g/100 g de massa seca nas flores senescentes). Considerando os valores obtidos para todos os macronutrientes, os perfis são concordantes com os publicados para outras espécies da mesma família (García-Herrera et al., 2014). Do ponto de vista de teor energético, as amostras revelaram valores muito semelhantes, apesar de ligeiramente superiores no caso da flor senescente (381 kcal/100 g de massa seca no caule e folhas; 390 kcal/100 g de massa seca nas flores senescentes). Tabela 4. Caracterização nutricional e valor energético das amostras de caule e folhas e flores senescentes. Componente Caule e folhas Flor senescente Valor de p (teste t de student) Água (g/100 g mf) 80,2±0,2 75,1±0,1 <0,001 Gordura (g/100 g ms) 1,4±0,1 3,6±0,1 <0,001 Proteína (g/100 g ms) 4,4±0,3 8,3±0,2 <0,001 Cinzas (g/100 g ms) 6,5±0,1 7,0±0,1 <0,001 Hidratos de carbono (g/100 g ms) 87,6±0,3 81,1±0,1 <0,001 Energia (kcal/100 g ms) 381±1 390±1 <0,001 42 3.4. Caracterização do perfil em aminoácidos por HPLC/FD Do ponto de vista nutricional, a caracterização do perfil em aminoácidos de uma determinada matriz assume especial interesse, já que estas moléculas são as unidades estruturais das proteínas. Os aminoácidos essenciais, ou seja aqueles que o organismo necessita de obter de forma exógena, têm uma importância acrescida, já que participam em vias metabólicas fundamentais, para além do seu papel na síntese e turnover proteicos. Os aminoácidos, e alguns dos produtos do seu metabolismo, são ainda precursores da biossíntese de importantes compostos biológicos e fisiológicos (Wu, 2009). O perfil em aminoácidos das amostras de flor senescente e caules e folhas de C. myconis está representado na Tabela 5. A treonina é o aminoácido predominante nas duas componentes botânicas (15 mg/g na flor; 6,2 mg/g no caule e folhas). Nas flores, os aminoácidos acídicos (carregados negativamente a pH fisiológico) aspartato e glutamato (que não foi possível separar) aparecem como segundo componente (8,9 mg/g), enquanto a lisina (7,5 mg/g) foi a terceira forma mais abundante. Nos caules e folhas, a lisina e a leucina (ambos numa concentração de 4,0 mg/g), destacaram-se como os aminoácidos mais abundantes, depois da treonina. A treonina (Figura 13A), para além de ser um aminoácido proteinogénico essencial, tem a particularidade de ser o único, para além da serina (não detetada nesta espécia), que apresenta um grupo álcool na cadeia lateral (a tirosina não é considerada um álcool, mas sim um fenol, já que o grupo OH da cadeia lateral está diretamente ligado a um anel aromático, conferindo-lhe diferentes propriedades oxidativas e ácido-base). Para além do seu importante papel na síntese proteica, em particular da proteína mucina necessária para a integridade e função intestinal, tem funções imunológicas e é também um precursor da glicina, podendo ser utilizado como um pró-fármaco para elevar os níveis de glicina no cérebro (Stryer et al., 2002; Wu, 2009). (A) (B) Figura 13. Estrutura química da treonina (A) e lisina (B). 43 O facto de a lisina (Figura 13B) ter sido também detetada em quantidades apreciáveis aumenta as potenciais aplicações da C. myconis, já que este aminoácido é o primeiro aminoácido limitante para o crescimento, é um constituinte do colagénio e um importante transportador de ácidos gordos, para além de a restrição no seu consumo poder dimnuir a taxa de síntese proteica (Fürst, 2009; Suárez-Belloch et al., 2015). Tabela 5. Perfil de aminoácidos das amostras de caule e folhas e flores senescentes. Aminoácido Quantificação (mg/g massa seca) Valor de p (teste t de student) Caule e folhas Flor senescente Histidina 0,45±0,05 2,2±0,1 <0,001 Arginina 2,2±0,2 3,3±0,1 <0,001 Aspartato + glutamato 3,1±0,1 8,9±0,3 <0,001 Treonina 6,2±0,5 15±1 <0,001 Glicina 2,6±0,1 4,7±0,1 <0,001 Alanina 2,7±0,4 4,0±0,2 <0,001 Prolina 2,25±0,04 4,2±0,2 <0,001 Valina + metionina 1,91±0,03 2,7±0,1 <0,001 Fenilalanina 2,75±0,03 3,5±0,2 <0,001 Isoleucina 2,15±0,04 3,6±0,1 <0,001 Leucina 4,0±0,1 6,2±0,2 <0,001 Lisina 4,0±0,1 7,5±0,2 <0,001 Tirosina 1,05±0,04 2,5±0,2 <0,001 50 3.8. Caracterização dos géis hidrossolúveis Considerando os resultados obtidos nos ensaios de atividade antioxidante e citotoxicidade, mas também a biomassa disponível, os geis hidrossolúveis foram preparados com incorporação de extrato hidroalcoólico de flores em deiscência e de caules e folhas, respetivamente. Tendo em atenção os valores de EC50 obtidos na atividade antioxidante, o gel foi preparado com uma concentração de 0,25 mg/mL de formulação final (para as flores senescentes) e 0,50 mg/mL de formulação final (para os caules e folhas). Entre diferentes concentrações de carbopol 940 (o agente de gelificação), verificou-se que a preparação com 1% deste polímero era a que permitia obter a consistência pretendida. Na tentativa de responder a uma exigência atual do mercado, a imidazolidinilureia foi utilizada como componente antimicrobiano, em substituição dos típicos parabenos, que têm vindo a ser progressivamente rejeitados pelos consumidores. A trietanolamina e o ácido cítrico foram utilizados como agentes de controlo do pH, enquanto o EDTA foi incluído como quelante de qualquer agente metálico do meio (evitando a ativação de enzimas). Não foram verificadas alterações significativas nos valores (5,5 a 6,5) de pH durante medições (medidor de pH digital de Hanna Instruments) periódicas ao longo de 180 dias. A determinação do pH tem relevância para avaliar a estabilidade de formulações farmacêuticas, uma vez que podem ocorrer alterações nos valores de pH devido às impurezas, a decomposição por hidrólise, ou erros de procedimento (Queiroz et al., 2009). A cor dos geis apresentava um tom verde pálido (mais evidente nos extratos de caules e folhas), que também se manteve constante ao longo do tempo de observação. As formulações preparadas apresentaram uma textura não gordurosa, com boa dinâmica de absorção cutânea em ambos os casos. Para fins de comparação, foi também preparada uma formulação de controlo, com todos os componentes exceto os extratos de C. myconis. Os géis hidrossolúveis foram depois submetidos aos mesmos ensaios de atividade antioxidante aplicados aos extratos. Como se pode verificar na Figura 14, a atividade antioxidante em cada ensaio é muito similar àquela que seria expectável para o correspondente extrato na concentração em que foi utilizado na formulação, podendo assim concluir-se que a sua incorporação no extrato não causou perdas de atividade significativas. 51 Figura 14. Atividade antioxidante das flores senescentes e dos caules e folhas de C. myconis em extratos hidroalcoólicos e comparação com o valor obtido para o respetivo gel hidrossolúvel. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 Absorvância (690 nm) Concentração (mg/mL) Poder redutor flor senescente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor senescente) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 Atividade (%) Concentração (mg/mL) Captação de radicais DPPH flor deiscente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor deiscente) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 Absorvância (690 nm) Concentração (mg/mL) Poder redutor flor senescente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor senescente) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 Atividade (%) Concentração (mg/mL) Inibição da descoloração do β-caroteno flor deiscente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor deiscente) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 Atividade (%) Concentração (mg/mL) Inibição da descoloração do β-caroteno flor deiscente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor deiscente) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 Absorvância (690 nm) Concentração (mg/mL) Poder redutor flor senescente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor senescente) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 Atividade (%) Concentração (mg/mL) Inibição da formação do TBARS flor deiscente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor deiscente) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 Atividade (%) Concentração (mg/mL) Inibição da descoloração do β-caroteno flor deiscente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor deiscente) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 Absorvância (690 nm) Concentração (mg/mL) Poder redutor flor senescente caules e folhas gel (caule e folhas) gel (flor senescente) 52 4. Conclusões e perspetivas Os resultados obtidos com o presente trabalho de caracterização química, nutricional e bioativa de uma planta relevante da flora portuguesa, até então subvalorizada quanto ao seu potencial interesse na utilização em produtos derivados, alimentares e cosméticos, evidenciam a valorização do C. myconis como recurso natural, num contexto de sustentabilidade ambiental. Atendendo ao perfil em macronutrientes, aminoácidos, compostos lipofílicos (ácidos gordos, tocoferóis) e compostos fenólicos, o C. myconis pode também ser considerado como uma planta com elevado interesse para incorporação em alimentos funcionais ou suplementos alimentares. O elevado teor em hidratos de carbono, incluindo fibra, o teor proteico, em particular aminoácidos limitantes na síntese proteica e crescimento (treonina e lisina), predominância de ácidos gordos insaturados em relação aos saturados, o conteúdo em tocoferóis e compostos fenólicos (relacionados com a elevada atividade antioxidante verificada), justificam a incorporação de C. myconis nestes produtos alimentares. Considerando o principal objetivo, o desenvolvimento de formulações cosméticas para aplicação tópica pela incorporação de extratos naturais é um dos atuais desafios da indústria cosmética. Os géis hidrossolúveis preparados com extratos de C. myconis obtidos com solventes de baixa toxicidade e sem parabenos como agentes conservantes, constituíram uma primeira tentativa de desenvolvimento de cosméticos seguros, com a consistência adequada, textura não gordurosa, boa dinâmica de absorção cutânea, respondendo às exigências de mercado. Este produto preliminar deverá ser desenvolvido para formulações cosméticas com textura, consistência, poder hidratante e emoliente mais próximo daquele exigido pelo consumidor na prevenção do envelhecimento cutâneo. A avaliação in vitro da atividade antioxidante destas formulações e in vivo da biometria cutânea, quando utilizadas regularmente, será também um importante complemento da utilização de extratos de C. myconis como novos agentes bioativos pela indústria cosmética. De realçar a importância da utilização de plantas como recurso natural para o desenvolvimento sustentável de um país que prima pela riqueza da sua flora, assim como o desenvolvimento social e económico de regiões e localidades onde se tem vindo a verificar uma diminuição constante nas explorações agrícolas e um aumento no abandono populacional. Assim, a exploração da produção de C. myconis, sem grandes exigências de cultivo e com vista à sua utilização pelos diversos setores económicos, poderá constituir um valioso recurso alternativo. 53 5. Bibliografia Abajo, C., Boffill, M. Á., Campo, J., Méndez, M. A., González, Y., Mitjans, M., Vinardell, M. P. 2004. In vitro study of the antioxidant and immunomodulatory activity of aqueous infusion of Bidens pilosa. Journal of Ethnopharmacology, 93, 319-323. Abdel-Wahhab, M. A., Abdel-Azim, S. H., El-Nekeety, A. A. 2008. Inula crithmoïdes extract protects against ochratoxin A-induced oxidative stress, clastogenic and mutagenic alterations in male rats. Toxicon, 52, 566-573. Abeysiri, G. R. P. I., Dharmadasa, R. M., Abeysinghe, D. C., Samarasinghe, K. 2013. Screening of phytochemical, physico-chemical and bioactivity of different parts of Acmella oleraceae Murr. (Asteraceae), a natural remedy for toothache. Industrial Crops and Products, 50, 852-856. Ajiboye, T. O., Komolafe, Y. 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