Estudo do Envolvimento da Bioactivação Metabólica no Efeito Hiponatrémico da 3,4 - Metilenodioximetanfetamina (Ecstasy)

Daniel Gomes Esteves da Silva ESTUDO DO ENVOLVIMENTO DA BIOACTIVAÇÃO METABÓLICA NO EFEITO HIPONATRÉMICO DA 3,4-METILENODIOXIMETANFETAMINA (“ECSTASY”) Mestrado em Controlo de Qualidade Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto 2008 Os estudos apresentados nesta dissertação foram realizados no Laboratório associado REQUIMTE/Serviço de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Estes estudos contaram com o apoio financeiro da Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) e do Fundo Europeu para o Desenvolvimento Regional (FEDER) (POCI/SAL-FCT/57187/2004). Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto para obtenção do grau de Mestre em Controlo de Qualidade na especialidade de Medicamentos e Plantas Medicinais. Orientador: Professora Doutora Helena Maria Ferreira da Costa Ferreira Carmo Alguns dos resultados apresentados nesta dissertação constam nas seguintes comunicações Daniel Gomes, Helena Carmo, Félix Carvalho, Fernando Remião, Maria de Lourdes Bastos, Paula Branco, Luísa Ferreira, Paula Guedes de Pinho. Gas-ChromatographyMass Spectrometry Method for Simultaneous Measurement of MDMA (Ecstasy) and its Metabolites HMA, MDA and HMMA in Plasma and Urine. XXXVIII Reunião Anual da Sociedade Portuguesa de Farmacologia; XXV Reunião de Farmacologia Clínica e VII Reunião de Toxicologia, Coimbra, 5 a 7 de Dezembro de 2007. Helena Carmo, Daniel Gomes, Félix Carvalho, Fernando Remião, Maria de Lourdes Bastos, Paula Branco, Luísa Ferreira, Paula Guedes de Pinho. Optimized GC-MS/MS quantification of MDMA (ecstasy) and its metabolites HMA, MDA, and HMMA in different matrices for toxicological applications. AOAC Europe Section International Workshop and the II Encontro Nacional de Bromatologia, Hidrologia e Toxicologia, Lisboa, Abril 2008. Agradecimentos À Professora Doutora Helena Maria Ferreira da Costa Ferreira Carmo, minha orientadora, são dirigidos os meus primeiros agradecimentos pelo entusiasmo, confiança, amizade e enorme saber científico com que sempre me orientou. À Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, Professor Doutor Félix Dias Carvalho ao Professor Doutor Fernando Remião e à Engenheira Maria Elisa Soares, pelo incondicional apoio científico, pelo estímulo, pela amizade e pelo salutar ambiente humano proporcionado no Laboratório de Toxicologia. À Professora Doutora Eduarda Fernandes que contribuiu através da execução da técnica de purificação da MDMA a partir de formulações apreendidas pela Policia Judiciária. À Doutora Paula Guedes pelo apoio na técnica de GS-MS e pelos ensinamentos sobre a validação de métodos quantitativos. À Dra. Helena Pontes e Dra. Vera Costa pelo apoio na execução do trabalho experimental, pela troca de ideias, pelo apoio, pela amizade e pelo salutar ambiente humano proporcionado no Laboratório de Toxicologia. À Dra. Renata Silva tenho também a agradecer a contribuição directa para a formatação e edição desta dissertação. À Técnica Júlia Caramez agradeço a disponibilidade sempre demonstrada no Laboratório de Toxicologia. À Dra. Maria José Coelho, proprietária da Farmácia Central de Ovar, pela flexibilidade que permitiu a minha disponibilidade de tempo para a execução deste trabalho. A todos os meus amigos que sempre me acompanharam, agradeço o apoio e o constante incentivo. Aos meus pais, ao meu irmão e à Sofia que sempre me acompanharam durante estes anos de estudo, agradeço o apoio, a amizade e o amor que tornaram possível este trabalho. A eles dedico esta dissertação. Índice Geral ____________________________________________________________ II 2.4.2.2.Excitotoxicidade – Envolvimento do glutamato e/ou do monóxido de azoto (NO) na neurotoxicidade da MDMA ............................................... 40 2.4.2.3.Envolvimento da Hipertermia nos Mecanismos de Neurotoxicidade ................................................................................................ 42 2.4.2.4.Alteração da Função Mitocondrial potencia a Neurotoxicidade.. 43 2.4.3.Efeitos Neuropsiquiátricos da MDMA ............................................... 44 2.4.3.1.Efeitos Agudos .................................................................................. 44 2.4.3.1.1.Síndrome serotonérgica ............................................................. 44 2.4.3.2.Efeitos Crónicos ................................................................................ 45 2.4.3.2.1.Efeitos Crónicos Cognitivos e na Memória ............................. 46 2.4.3.2.2.Efeitos Crónicos Psiquiátricos .................................................. 47 2.4.4.Explicação mecanística para as alterações de memória, cognitivas e psiquiátricas. ......................................................................................................... 48 2.5.Toxicidade Não Neuronal ............................................................................ 49 2.5.1.Toxicidade Hepática ............................................................................. 49 2.5.1.1.Catecolaminas ................................................................................... 50 2.5.1.2.MDMA e metabolitos ....................................................................... 52 2.5.1.3.Hipertermia ....................................................................................... 53 2.5.1.4.Apoptose ............................................................................................ 54 2.5.2.Sistema Cardiovascular ....................................................................... 55 2.5.3.Sistema Imunitário ............................................................................... 56 2.5.4.Rim ......................................................................................................... 58 2.5.5.Músculo ................................................................................................. 61 2.6.Conclusões ..................................................................................................... 62 3.CAPÍTULO III - Hiponatrémia e MDMA ......................................................... 67 3.1.Hiponatrémia ................................................................................................ 67 3.1.1.Arginina-Vasopressina ......................................................................... 67 3.1.2.Importância da Vasopressina (AVP) na Hiponatrémia .................... 67 3.1.3.Classificação da Hiponatrémia ............................................................ 68 3.1.3.1.Hiponatrémia Hipovolémica ............................................................ 69 3.1.3.2.Hiponatrémia Euvolémica ............................................................... 69 3.1.3.3.Hiponatrémia Hipervolémica .......................................................... 70 3.2.Hiponatrémia desencadeada pela MDMA ................................................. 71 3.3.Conclusões ..................................................................................................... 75 ____________________________________________________________ Índice Geral III 4.CAPÍTULO IV - Validação do método de Cromatografia Gasosa com Detecção por Espectrometria de Massa (GC-MS/MS) para a quantificação simultânea da MDMA e dos seus metabolitos MDA, HMA e HMMA em plasma e urina ............................................................................................................................... 78 4.1.Introdução ..................................................................................................... 78 4.2.Materiais e Métodos ..................................................................................... 79 4.2.1.Materiais utilizados .............................................................................. 79 4.2.2.Matriz para análise ............................................................................... 79 4.2.3.Soluções Padrão ................................................................................... 80 4.2.4.Reacção de Hidrólise Enzimática ........................................................ 80 4.2.4.1.Técnica para hidrólise da urina ...................................................... 80 4.2.4.2.Técnica para hidrólise do plasma.................................................... 81 4.2.5.Isolamento dos Compostos de Interesse - Extracção em Fase Sólida (SPE) ................................................................................................................ 81 4.2.5.1.Técnica para a Extracção em Fase Sólida ...................................... 81 4.2.6.Derivatização por perfluoroacilação ................................................... 82 4.2.6.1.Técnica para a derivatização ........................................................... 82 4.2.7.Cromatografia Gasosa com detecção por Espectrometria de Massa (GC-MS/MS) ......................................................................................................... 83 4.3.Validação do Método .................................................................................... 88 4.3.1.Calibração ............................................................................................. 88 4.3.1.1.Técnica para a preparação das amostras para as curvas de calibração .......................................................................................................... 89 4.3.1.1.1.Urina .............................................................................................. 89 4.3.1.1.2.Plasma ............................................................................................ 89 4.3.2.Precisão .................................................................................................. 89 4.3.3.Exactidão ............................................................................................... 90 4.3.4.Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) ............. 90 4.3.5.Avaliação do Rendimento do Procedimento de Extracção ............... 91 4.4.Resultados e Discussão ................................................................................. 92 4.4.1.Curvas de Calibração e Linearidade .................................................. 92 4.4.2.Precisão .................................................................................................. 93 4.4.3.Exactidão ............................................................................................... 95 4.4.4.Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) ............. 96 Índice Geral ____________________________________________________________ IV 4.4.5.Rendimento do Procedimento de Extracção ...................................... 97 4.5.Conclusão ...................................................................................................... 97 5.CAPÍTULO V - Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA ........... 101 5.1.Introdução ................................................................................................... 101 5.2.Materiais e Métodos ................................................................................... 101 5.2.1.Materiais utilizados ............................................................................ 101 5.2.2.Animais ................................................................................................ 102 5.2.2.1.Protocolo experimental para animais sacrificados uma hora após a administração de MDMA ........................................................................... 102 5.2.2.2.Protocolo experimental para animais sacrificados 24h após a administração da MDMA .............................................................................. 103 5.2.2.3.Administração da MDMA ............................................................. 104 5.2.2.4.Técnica de colheita de sangue ........................................................ 105 5.2.3.Quantificação da AVP ........................................................................ 105 5.2.3.1.Princípio do método ....................................................................... 105 5.2.3.2.Técnica de extracção ...................................................................... 106 5.2.3.3.Técnica para a quantificação ......................................................... 106 5.2.3.4.Cálculos ........................................................................................... 108 5.2.4.Quantificação da MDMA e dos metabolitos MDA, HMA e HMMA ... .............................................................................................................. 109 5.2.5.Análise estatística ................................................................................ 109 5.3.Resultados ................................................................................................... 110 5.3.1.Efeitos da MDMA sobre os níveis plasmáticos de AVP em fêmeas 1h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0,9% .......................... 110 5.3.2.Efeitos da MDMA sobre os níveis plasmáticos de AVP em machos 1h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0,9% .......................... 111 5.3.3.Efeitos da MDMA sobre os níveis plasmáticos de AVP em fêmeas 24h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0,9% ................... 113 5.3.4.Efeitos da MDMA na concentração urinária de AVP em fêmeas 24h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0.9% .......................... 114 5.3.5.Efeitos da MDMA na excreção de urina em fêmeas 24h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0,9% ...................................... 116 ____________________________________________________________ Índice Geral V 5.3.6.Efeitos da MDMA na razão entre o volume de água ingerida e o volume de urina excretada em fêmeas 24h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0,9% ................................................................................... 117 5.3.7.Estudo das correlações entre concentrações de AVP e as concentrações de MDMA, MDA, HMA e HMMA .......................................... 119 5.3.7.1.Correlações entre as concentrações plasmáticas de AVP e as concentrações plasmáticas de MDMA, MDA, HMA e HMMA quantificadas 1h após a administração da MDMA (20 mg/kg) em fêmeas. ...................... 119 5.3.7.2.Correlações entre as concentrações urinárias de AVP e as concentrações urinárias de MDMA, MDA, HMA e HMMA para as fêmeas sacrificadas 24h após a administração da MDMA (20 mg/kg). .................. 120 5.4.Discussão ..................................................................................................... 121 5.4.1.Efeito da MDMA na concentração plasmática da AVP (1h após a administração) .................................................................................................... 121 5.4.2.Efeito da MDMA na concentração plasmática da AVP (24h após a administração) .................................................................................................... 122 5.4.3.Efeito da MDMA na excreção de urina (24h após a administração) ... .............................................................................................................. 123 5.4.4.Correlações entre as concentrações de AVP e as concentrações de MDMA, MDA, HMA e HMMA em fêmeas ..................................................... 123 6.CAPÍTULO VI – Conclusões Gerais ................................................................ 129 7.CAPÍTULO VII – Bibliografia .......................................................................... 133 Índice Geral ____________________________________________________________ VI ________________________________________________________ Índice de Figuras VII ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 - Estruturas dos neurotransmissores dopamina, noradrenalina e serotonina, e estruturas de três compostos relacionados: mescalina, MDA e MDMA. ....................... 14 Figura 2 - Estrutura geral das feniletilaminas e das fenilisopropilaminas pertencentes ao grupo das arilalquilaminas. ............................................................................................. 15 Figura 3 - Exemplo de um alucinogénio: 2,5-dimetoxi-4-metilanfetamina (DOM) e de um entactogénio: 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA). ...................................... 15 Figura 4 - Metabolismo da MDMA. Representação das vias metabólicas. .................. 27 Figura 5 – Aductos com a glutationa. ............................................................................ 29 Figura 6 - Vias metabólicas responsáveis pela formação de metabolitos neurotóxicos.37 Figura 7 - Envolvimento da dopamina na neurotoxicidade mediada pela MDMA. Adaptado de Sprague et al. (1998). ................................................................................ 39 Figura 8 – Metabolitos resultantes da conjugação com glutationa. ............................... 53 Figura 9 - Mecanismo responsável pela Imunossupressão mediada pela MDMA. Adaptado de Connor (2004). .......................................................................................... 58 Figura 10 - Metabolitos resultantes da conjugação com a glutationa. ......................... 59 Figura 11 - Via de destoxificação do conjugado com a glutationa: 5-(glutation-S-il)αMeDA. ............................................................................................................................ 60 Figura 12 – Reacção genérica de derivatização com o reagente anidrido trifluoroacético em meio de acetato de etilo, obtendo-se derivados O-TFA e N-TFA. ........................... 82 Figura 13 - Espectro de massa do derivado N-TFA da MDMA. .................................. 85 Figura 14 - Espectro de massa do derivado N-TFA da MDA. ...................................... 86 Figura 15 - Espectro de massa do derivado N-TFA e O-TFA da HMMA. ................... 86 Figura 16 - Espectro de massa do derivado N-TFA e O-TFA da HMA. ...................... 87 Figura 17 - Espectro de massa do derivado N-TFA e O-TFA da 4-hidroxi-3metoxibenzilamina. ........................................................................................................ 87 Figura 18 – Cromatograma de uma amostra de plasma obtido em modo ''Selected Ion'' com os seguintes iões: m/z=135, m/z=162 para a MDMA e MDA; m/z=140, m/z=260 para a HMA; m/z=154, m/z=260 para a HMMA; m/z=232 para o PI. Os tempos de retenção foram: PI (7,0 min); HMA (7,5 min); MDA (7,8 min); HMMA (8,2min) e MDMA (8,7 min). .......................................................................................................... 88 Índice de Figuras ________________________________________________________ VIII Figura 19 - Sistema circulatório venoso do rato. A punção para recolha de amostra foi realizada na veia cava inferior. ..................................................................................... 104 Figura 20 - Curva de calibração para a quantificação da AVP. .................................. 108 Figura 21 - Efeito da MDMA sobre concentação plasmática de AVP em fêmeas Wistar sacrificadas 1h após a administração. Os valores são apresentados sob a forma de média±erro padrão (**P≤0,01 vs controlo). ................................................................. 111 Figura 22 - Efeito da MDMA sobre concentação plasmática de AVP em machos Wistar sacrificados 1h após a administração. Os valores são apresentados sob a forma de média±erro padrão (*P≤0,05 vs controlo). ................................................................... 112 Figura 23 - Efeito da MDMA sobre concentação plasmática de AVP em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração. Os valores são apresentados sob a forma de média±erro padrão. ....................................................................................................... 114 Figura 24 - Efeito da MDMA sobre a concentração urinária de AVP em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração. Os valores são apresentados sob a forma de média±erro padrão (*P≤0,05 vs controlo). ................................................................... 115 Figura 25 - Efeito da MDMA sobre a excreção de urina em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração. Os valores são apresentados sob a forma de média±erro padrão (**P≤0,01 vs controlo). ..................................................................................... 117 Figura 26 - Efeito da MDMA sobre a excreção de urina em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração. Os valores são apresentados como a razão entre o volume de água ingerido e o volume de urina excretada, sob a forma de média±erro padrão (***P≤0,001 vs controlo). ............................................................................................ 118 ________________________________________________________ Índice de Tabelas IX ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 - Isoenzimas do citocromo P450 envolvidas no metabolismo da MDMA e MDA (Maurer et al. 2000). ............................................................................................. 31 Tabela 2 - Etiologias da hiponatrémia com origem na perda de sódio (adaptado de Verbalis, 2007). .............................................................................................................. 69 Tabela 3 - Etiologias da hiponatrémia com origem na diluição (adaptado de Verbalis, 2007). .............................................................................................................................. 70 Tabela 4 - Resumo de Casos Clínicos de intoxicação com MDMA em que ocorreu hiponatrémia. .................................................................................................................. 74 Tabela 5 - Estrutura dos analitos e do padrão interno derivatizados, com proposta do padrão de fragmentação (Pizarro et al. 2002). ................................................................ 84 Tabela 6 - Iões seleccionados para a quantificação dos analitos por GC-MS/MS. ....... 85 Tabela 7 - Estudo da linearidade. Curvas de Calibração e coeficientes de correlação obtidos. ........................................................................................................................... 92 Tabela 8 - Precisão intra-dia do método de GC-MS/MS e do método de extracção para as duas matrizes. ............................................................................................................. 93 Tabela 9 - Precisão inter-dia do método GC-MS/MS para as duas matrizes. ............... 94 Tabela 10 - Exactidão do método GC-MS/MS para as duas matrizes. ......................... 95 Tabela 11 – Limites de quantificação para todos os analitos, nas duas matrizes, em modo “Full-Scan” e em modo “μSIS”. ........................................................................... 96 Tabela 12 - Rendimento do procedimento de extracção por SPE. ................................ 97 Tabela 13 - Resumo do procedimento experimental para a quantificação da AVP. ... 107 Tabela 14 - Concentração plasmática de AVP em fêmeas Wistar sacrificadas 1h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. .................................................................... 110 Tabela 15 - Concentração plasmática de AVP em machos Wistar sacrificados 1h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. .................................................................... 112 Tabela 16 - Concentração plasmática de AVP em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. ................................................................. 113 Tabela 17 – Concentração urinária de AVP em fêmeas Wistar sacrificadas 1h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. .................................................................... 115 Tabela 18 – Volume de urina excretada em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. .................................................................... 116 Índice de Tabelas ________________________________________________________ X Tabela 19 – Razão entre o volume de água ingerida e o volume de urina excretada em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. ...... 118 Tabela 20Correlação entre as concentrações plasmáticas de AVP e as concentrações plasmáticas da MDMA, MDA, HMA e HMMA para as fêmeas Wistar sacrificadas 1h após a administração da MDMA (20 mg/kg). .............................................................. 119 Tabela 21 - Correlação entre as concentrações urinárias de AVP e as concentrações urinárias da MDMA, MDA, HMA e HMMA para as fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração da MDMA (20 mg/kg). .............................................................. 120 ____________________________________________________________ Abreviaturas XI ABREVIATURAS 5-HIAA – ácido 5-hidroxiindolacético 5-HT – 5-hidroxitriptamina ou serotonina ADP – adenosina difosfato AMPA – 2-amino-3-(3-hidroxi-5-etilisoxazol-4-il)propionato ATP – adenosina trifosfato AUC – área sob a curva num gráfico de concentração plasmática em função do tempo AVP ou ADH – Arginina Vasopressina ou Hormona Antidiurética Bcl-xL – proteína reguladora da apoptose com acção anti-apoptótica CK – creatinina fosfocínase COMT – catecol-O-metil transferase CSWS – Síndrome da perda de sal cerebral ou “Cerebral salt wasting syndrome” CYP – isoenzima do citocromo P450 DA – dopamina DHHA – ácido 3,4-dihidroxihipúrico DHPA – dihidroxifenilacetona DNA – ácido desoxirribonucleico DO – densidade óptica DOB – 2-(4-bromo-2,5-dimetoxifenil)-1-aminoetano DOM – 2,5-dimetoxi-4-metilanfetamina DOPAC – ácido dihidroxifenilacético EIA – imunoensaio enzimático ESPAD – “European School Survey Project on Alcohol and other Drugs” GABA – ácido γ-aminobutírico GC-MS/MS – Cromatografia gasosa com espectrometria de massa GOT – transaminase glutamica-oxaloacética GPX – glutationa peroxidase GR – glutationa redutase GSH – glutationa reduzida GSSG – glutationa oxidada GST – glutationa-S-transferase HBSC – “Health Behaviour in School aged Children” HHA ou α-MeDA – 3,4-dihidroxianfetamina ou α-metildopamina Capítulo I - Introdução ___________________________________________________ 4 recreativos com mais experiência facilmente identificam as reacções adversas desta droga (Green et al. 2003). Este trabalho enquadra-se no estudo sobre os efeitos neuroendócrinos da MDMA e dos seus metabolitos. Pretende-se contribuir para a melhor compreensão da hiponatrémia como efeito tóxico desencadeado pela MDMA. O efeito hiponatrémico está relacionado com a alteração da secreção da hormona antidiurética (ADH, AVP ou arginina-vasopressina) o que justifica o estudo da influência da MDMA na secreção dessa hormona. 1.2. Objectivos do Trabalho O objectivo deste trabalho consistiu no estudo do efeito da MDMA na secreção da AVP e o envolvimento dos seus metabolitos 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), 4hidroxi-3-metoxiamfetamina (HMA) e 4-hidroxi-3-metoximetamfetamina (HMMA) neste efeito. Com este objectivo dois trabalhos foram executados. O primeiro consistiu na validação de um método de GC-MS/MS para a quantificação simultânea da MDMA e dos metabolitos em questão em plasma e urina. O segundo trabalho consistiu nos ensaios in vivo executados em ratos Wistar machos e fêmeas. Em resumo os objectivos dos trabalhos foram: 1º Trabalho: Validar um método de GC-MS/MS para a quantificação simultânea da MDMA, MDA, HMA e HMMA. 2º Trabalho: Demonstrar, in vivo, o aumento da libertação de AVP com a administração de MDMA. Estudar a correlação entre o perfil metabólico e a expressão do efeito hiponatrémico. Averiguar possíveis diferenças de género na expressão do efeito. ___________________________________________________ Capítulo I - Introdução 5 1.3. Estrutura da Dissertação Esta dissertação está dividida em 6 capítulos: − CAPÍTULO I: Introdução − CAPÍTULO II: MDMA “Ecstasy” – Revisão Geral Neste capítulo faz-se uma revisão sobre a história da MDMA, desde a sua descoberta até à utilização recreativa como droga de abuso. São também referidas as características químicas, as relações estrutura-actividade, a farmacocinética, bem como os mecanismos de acção farmacológicos e os efeitos tóxicos. No que diz respeito às manifestações de toxicidade da MDMA são abordadas a neurotoxicidade e a toxicidade não neuronal, referindo os principais alvos de toxicidade. − CAPÍTULO III: MDMA e Hiponatrémia Neste capítulo, no âmbito da toxicidade neuroendócrina, é abordado em particular o efeito de hiponatrémia desencadeado pela MDMA. São referidos o envolvimento e a importância da arginina-vasopressina, bem como a importância de outros efeitos típicos da MDMA que contribuem para o desencadear do efeito hiponatrémico. − CAPÍTULO IV: Validação do Método GC-MS/MS para a Quantificação da MDMA, MDA, HMA e HMMA. Neste capítulo faz-se a descrição da validação de um novo método para a quantificação da MDMA, MDA, HMA e HMMA em plasma e urina. − CAPÍTULO V: Estudos in vivo da Influência da MDMA na Secreção da AVP Neste capítulo descrevem-se os estudos in vivo realizados em ratos injectados intraperitonialmente com MDMA na dose de 20 mg/kg e sacrificados 1 hora e 24 horas após a administração. Foram depois quantificados a AVP e os metabolitos no plasma de todos os animais e nas urinas dos animais sacrificados 24h depois da administração. Neste capítulo descrevem-se os protocolos experimentais utilizados nos estudos in vivo assim como os resultados obtidos e a respectiva discussão. Capítulo I - Introdução ___________________________________________________ 6 − CAPÍTULO VI: Conclusões Gerais Neste capítulo são apresentadas as conclusões resultantes da execução dos trabalhos experimentais. − CAPÍTULO VII: Referências Bibliográficas ___________________________________________________ Capítulo I - Introdução 7 Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 8 Capítulo II 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) Revisão Geral ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 9 Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 10 2. CAPÍTULO II - 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) - Revisão Geral 2.1. Introdução A 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) foi originalmente sintetizada em 1912 pela indústria química Merck. Por essa altura o composto não foi sujeito a testes farmacológicos já que foi desenvolvido apenas como um precursor da síntese de substâncias hemostáticas (Freudenmann et al. 2006). Em consequência do interesse por substâncias semelhantes à adrenalina surgem, em 1927, os primeiros estudos farmacológicos realizados pela Merck e em 1952 são realizados, testes toxicológicos. Só a partir de 1960 começam a surgir publicações regulares sobre a MDMA (Freudenmann et al. 2006) e em 1970 ocorre a primeira identificação de MDMA em comprimidos apreendidos nas ruas de Chicago (Freudenmann et al. 2006). Os primeiros estudos em humanos foram realizados em 1978 por Shulgin & Nichols com o objectivo de caracterizar a actividade simpaticomimética da MDMA (Shulgin & Nichols 1978). Durante as décadas de 70 e 80 ocorreu a disseminação da MDMA como droga de abuso e, em 1984, surge na Califórnia a designação de ‘‘ecstasy’’ (Freudenmann et al. 2006). A generalização do uso fez com que, em 1985, esta substância fosse classificada nos EUA como “Schedule I controled substance”, ou seja, a MDMA passa a ser colocada no grupo das substâncias de abuso não seguras e sem utilidade terapêutica (Freudenmann et al. 2006). No entanto, antes desta classificação restritiva surgiram algumas tentativas de utilização terapêutica da MDMA, nomeadamente como coadjuvante terapêutico dada a sua capacidade para aumentar a introspecção e induzir sentimentos de confiança e empatia entre pacientes e terapeutas (Green et al. 2003). As características específicas da MDMA, no que respeita aos efeitos sobre as emoções e empatia, levaram a que Nichols sugerisse a inclusão deste composto numa nova classe de compostos. Os seus efeitos são distintos dos compostos representativos dos alucinogénios como a dietilamida do ácido lisérgico (LSD) e a mescalina. Assim foi sugerida a nova classe dos entactogénios que incluiu a metilenodioxianfetamina (MDA) ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 11 e a MDMA, e que corresponde às substâncias praticamente sem acção alucinogénia, mas com capacidade de actuar sobre as emoções e empatia. Estes efeitos são únicos e traduzem-se em excitação, estado de alerta, auto-confiança, diminuição da sensação de fadiga, boa disposição, euforia e sentimento de proximidade e de ligação emocional com as outras pessoas (de la Torre et al. 2004a; Nichols 1986). 2.1.1. Padrão de utilização A utilização da MDMA remonta a meados dos anos 70 como consequência da descoberta dos seus efeitos psico-activos pelo bioquímico americano Shulgin (Shulgin & Nichols 1978). As primeiras utilizações da MDMA ocorreram em sessões de psicoterapia, já que os efeitos sobre a comunicabilidade dos pacientes foram considerados positivos ao facilitar as relações entre o terapeuta e o doente (Greer & Tolbert 1986). Ao mesmo tempo que surgiu a utilização terapêutica, ocorreu também o inicio da utilização recreativa (Parrott 2001). A utilização terapêutica foi gradualmente abandonada durante os anos 70 e a MDMA foi abolida e classificada como ilegal em diversos países nomeadamente, no Reino Unido em 1977, e nos EUA em 1985 (Karlsen et al. 2007). Apesar das restrições, a popularidade da MDMA como droga de abuso cresceu. Em meados dos anos 80 esta era a droga mais utilizada nas festas de dança conhecidas como ‘‘raves’’. A subcultura rave e as respectivas festas com multidões em espaços pequenos e com música electrónica impulsionaram a rápida expansão da utilização recreativa da MDMA. O baixo preço e os efeitos entactogénios, associados à falsa ideia de inocuidade contribuíram também para a disseminação desta droga (Cole & Sumnall 2003; Parrott 2001). De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde, estima-se que em 2004 existiram 8,5 milhões de utilizadores de ‘‘ecstasy’’ (Organização Mundial de Saúde, 2004). Nos EUA o Instituto Nacional para o Abuso de Drogas (The National Institute of Drug Abuse, 2004) relatou em 2004 que os utilizadores mais frequentes da ‘‘ecstasy’’ são os jovens e que existem 11 milhões de pessoas a partir dos 12 anos de idade que utilizaram ‘‘ecstasy’’ pelo menos uma vez durante a sua vida. Em inquéritos, realizados por este instituto, que questionaram a utilização de ‘‘ecstasy’’ foi possível estimar que em 2004 existiram cerca de 450 mil utilizadores nos 30 dias anteriores ao questionário Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 12 (National Institue of Drug Abuse. Monitoring the Future: National Results on Adolescent Drug Use, 2005). Embora exista ainda uma elevada prevalência da ‘‘ecstasy’’ como droga de abuso verificou-se, nos Estados Unidos, que entre 2001 e 2005, ocorreu uma redução global da utilização da ‘‘ecstasy’’ (United States National Institue of Drug Abuse, 2005). No caso da realidade europeia, acompanhada pelo Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência, verifica-se que, em 2007, a Europa continua a ser o principal centro de Produção de ‘‘ecstasy’’. No relatório anual de 2007 do Observatório constatase que, das drogas leves, a ‘‘ecstasy’’ continua a ser, a seguir à cannabis, a segunda droga mais prevalente e estima-se que, em média, cerca de 3% dos adultos europeus tenha utilizado ‘‘ecstasy’’ pelo menos uma vez na vida. Na Europa, à semelhança do que acontece nos EUA, o consumo da ‘‘ecstasy’’ é predominantemente juvenil. Nas faixas etárias entre os 15-34 anos as taxas de consumo variam nos vários países da comunidade entre 0,5-14,6%. As taxas de prevalência mais elevadas correspondem a áreas urbanas. É também importante referir que de 1995 a 2005 as taxas de prevalência em jovens com idades compreendidas entre os 15 e 16 anos aumentaram. Finalmente, o relatório anual de 2007 do Observatório indica que, em geral, a prevalência da ‘‘ecstasy’’ pode estar a estabilizar ou até a diminuir, sendo este fenómeno detectável em países como o Reino Unido e a Espanha onde a incidência de ‘‘ecstasy’’ é habitualmente elevada (Relatório Anual 2007 do Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência, 2007). A realidade portuguesa mostra que a prevalência de uso da ‘‘ecstasy’’ em 2001 foi de 0,9% na população dos 15 aos 34 anos e foi semelhante à prevalência da cocaína e da heroína (Instituto da Droga e da Toxicodependência, 2001). No estudo ESPAD (European School Survey Project on Alcohol and Other Drugs) verificou-se que na população escolar portuguesa do 3º Ciclo do Ensino Básico, as prevalências de utilização em 1999 e 2003 foram respectivamente de 2,3% e 4% mostrando uma tendência crescente. Esta tendência inverteu-se entre 2002 e 2006 tal como demonstrou o estudo HBSC/OMS – (Health Behaviour in School-aged Children 2006). Este trabalho mostrou que, em 2002, 2,2% dos alunos sujeitos ao inquérito utilizaram ‘‘ecstasy’’ pelo menos uma vez na vida, tendo havido em 2006 uma redução desta prevalência para 1,6%. (Relatório Anual de 2006 do Instituto da Droga e da Toxicodependência, 2006). ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 13 2.1.2. Características físico-químicas da 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) A MDMA (CAS 42542-10-9) é uma feniletiletilamina incluída no grupo das fenilisopropilaminas (Figura 1). As várias designações reflectem a sua estrutura e também as suas acções biológicas. Assim, esta molécula pode ser conhecida por: ‘‘ecstasy’’; Speed; Adam; Meth; MDMA; 3,4-metlenodioximetanfetamina; N-metil3,4-metilenodioxianfetamina, N-metil-1-1(3,4-metilenodioxifenil)-2-aminopropano; 3,4-methylenodioxi-N-α-dimetil-β-feniletilamina, ou α-dimetil-1,3-benzodioxol-5etanamina. Sendo a sua fórmula molecular C11H15NO2, o seu peso molecular é de 193,25 unidades de massa atómica. Esta molécula apresenta um centro quiral podendo existir dois enantiómeros: o S-(+)-MDMA e R-(-)-MDMA, que podem ser encontrados em separado ou em mistura racémica. No uso ilícito recorre-se à toma da mistura racémica. (de la Torre et al. 2004b) Relativamente às características físico-químicas, esta substância, quando está sob a forma de base, apresenta-se como um óleo com ponto de ebulição entre 100 e 110 ºC, insolúvel em água e solúvel em solventes orgânicos. Na forma de sal, apresenta-se no estado sólido (cristais) ou como óleo de cor branca sendo solúvel em água e de gosto amargo (Shulgin 1986). O espectro do UV da MDMA apresenta um máximo de absorvência a 286 nm, típico do grupo metilenodioxifenilo. (Shulgin 1986) Estão descritas na literatura seis vias de síntese da MDMA (Shulgin 1986). Para a produção ilícita da MDMA existem três vias mais utilizadas: a via de Leukart-Wallach, a via da aminação redutiva e a via baseada no uso do bromopropano (Pifl et al. 2005). A utilização destas vias sintéticas leva à formação não só de MDMA mas também de subprodutos tais como a 1,3-bis(3,4-metilenodioxifenil)-2-propanamina e a N-formil1,3-bis(3,4-metilenodioxifenil)-prop-2-il-amina, ambos com capacidade de libertar serotonina para a fenda sináptica (Pifl et al. 2005). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 20 2.2.3. MDMA e Sistema Adrenérgico Estudos in vitro demonstraram que a MDMA ao actuar em tecido cerebral do hipocampo e do estriado, desencadeia a libertação de noradrenalina (NA) sendo esta libertação bloqueada pela desipramina (bloqueador da recaptação neuronal da noradrenalina) (Fitzgerald & Reid 1990). Tal como já se referiu, nos humanos, a MDMA tem maior afinidade para o transportador pré-sináptico da noradrenalina do que para o transportador da serotonina e da dopamina. (Han & Gu 2006). No entanto, in vivo, a importância da libertação de noradrenalina directamente pela acção da MDMA sobre os transportadores présinápticos permanece pouco esclarecida podendo os efeitos sobre o sistema adrenérgico resultar de uma mediação indirecta por mecanismos serotonérgicos (Green et al. 2003). Os efeitos cardiovasculares da MDMA detectados em humanos são contrariados essencialmente pela administração de citalopram, sugerindo que a libertação de NA (responsável por esses efeitos) resulta essencialmente da activação do sistema serotonérgico e não da interacção directa da MDMA e/ou dos seus metabolitos com o sistema de recaptação da noradrenalina. (Liechti & Vollenweider 2000). 2.2.4. Resposta Neuroendócrina A MDMA faz elevar os níveis de corticosterona e de prolactina. O aumento da corticosterona é dependente da dose. Pelo contrário, o aumento da prolactina não depende da dose. A utilização dos inibidores da recaptação da serotonina como: a quetanserina, mianserina ou fluoxetina atenuam a elevação de corticosterona causada pela MDMA, indicando que este mecanismo é dependente do sistema serotonérgico. Os níveis de prolactina não são afectados pelos inibidores da recaptação da serotonina (Nash et al. 1988). Burns e colaboradores verificaram também o aumento da secreção de aldosterona e renina após a administração de MDMA a ratos e sugeriram que este aumento se deveu à acção do sistema serotonérgico (Burns et al. 1996). Estudos in vitro usando tecido hipotalâmico de rato demonstraram que a MDMA leva ao aumento de oxitocina e vasopressina (AVP), sendo a resposta dependente da ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 21 dose (Forsling et al. 2001; Forsling et al. 2002). O aumento da vasopressina induzido pela MDMA foi relacionado com a ocorrência de hiponatrémia acompanhada com edema cerebral, sendo esta uma resposta potencialmente fatal. Este mecanismo de toxicidade será abordado com mais pormenor no CAPÍTULO III - Hiponatrémia e MDMA (Forsling et al. 2001; Forsling et al. 2002; Maxwell et al. 1994; Parr et al. 1997). 2.2.5. Resposta Imune A administração de MDMA a ratos desencadeia um aumento dependente da dose de corticosterona (Nash et al. 1988) que é detectável 30 minutos após a administração (Connor et al. 1998). Apesar de este aumento já não ser detectável 6 horas após a administração (Connor et al. 1998), a contagem total de linfócitos aos 30 minutos e às 6 horas revelou uma redução em 50% do número total inicial. Além disso, verificou-se também a supressão da proliferação linfocitária induzida pela concavalina A (Connor et al. 1998). Estas observações sugerem que os utilizadores da MDMA podem estar sujeitos a imunossupressão. Os estudos de Connor e colaboradores demonstraram que estas alterações funcionais desencadeadas pela MDMA só ocorrem com o aumento de corticosterona plasmática, logo é um efeito relacionado com a sua acção glucocorticoide (Connor 2004; Connor et al. 1998). 2.2.6. Efeito no Sistema Termorregulador A alteração da temperatura corporal é um dos efeitos mais conhecidos da MDMA. A administração da MDMA a ratos colocados à temperatura ambiente (20-22 ºC) produz uma resposta hipertérmica traduzida por aumentos de 1 a 2 ºC da temperatura corporal. O pico desta resposta é detectado entre os 40 e os 60 minutos após a administração (Green et al. 2003). A variação da temperatura corporal induzida pela MDMA depende da temperatura ambiente. Estudos de Malberg e Seiden em ratos Holtzman revelaram, após a administração de MDMA, respostas hipotérmicas para temperaturas ambientes de 20-22 Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 22 ºC e respostas hipertérmicas para os animais mantidos a 28-30 ºC (Malberg & Seiden 1998). Outro estudo, em ratos, mostrou resposta hipertérmica para temperatura ambiente de 22 ºC e resposta hipotérmica para 17 ºC, mostrando que existe grande sensibilidade a pequenas variações da temperatura ambiente (Dafters & Lynch 1998). As diferentes respostas dos animais à MDMA, em função da temperatura ambiente, estão relacionadas com os efeitos da MDMA nos mecanismos termorreguladores. Gordon e colaboradores executaram um estudo em ratos com o objectivo de determinar a actividade metabólica, quantificar a perda de água por evaporação e determinar a temperatura rectal em ratos mantidos a diferentes temperaturas ambiente. Os ratos mantidos a 10 ºC apresentaram respostas hipotérmicas sem alterações na actividade metabólica. Por outro lado, os ratos mantidos a 20 e 30 ºC apresentaram respostas hipertérmicas com grandes perdas de água por evaporação e com aumento da actividade metabólica (Gordon et al. 1991). Um estudo mais recente sobre os mecanismos termorreguladores, detectou que a temperatura da cauda não varia após a administração de uma dose de MDMA (Mechan et al. 2002). Como a vasodilatação dos vasos sanguíneos da cauda é um mecanismo de perda de calor, este estudo sugere que a MDMA interfere com este mecanismo de termorregulação (Mechan et al. 2002). Esta descoberta está de acordo com a ausência de reposta hipertérmica nos animais mantidos a temperaturas baixas. Provavelmente, quando os ratos são mantidos a temperaturas baixas a perda dos mecanismos de termorregulação assume menor relevância na dissipação de calor, e a hipertermia não ocorre (Green et al. 2003). 2.2.6.1. Farmacologia e patofisiologia da resposta hipertérmica A origem molecular da hipertermia é difusa, podendo estar relacionada com a acção da MDMA a nível do sistema nervoso central e a nível periférico. Na comunidade científica é consensual a ideia de que a estimulação do sistema serotonérgico desencadeia resposta hipertérmica. A utilização de L-triptofano com inibidores da monoaminaoxigenase (MAO) corresponde a um exemplo de uma associação pró-serotonérgica capaz de aumentar a temperatura corporal (GrahameSmith 1971). Outro exemplo é a hipertermia provocada pela droga de abuso pcloroamfetamina (PCA) devido à sua capacidade de libertar serotonina (Colado et al. ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 23 1993). Assim, considerou-se que a hipertermia provocada pela MDMA teria origem na activação de receptores serotonérgicos (Shankaran & Gudelsky 1999). No entanto, apesar de a MDMA ter como alvo o sistema serotonérgico, verificou-se que a hipertermia resulta da capacidade desta molécula libertar dopamina. A utilização dos antagonistas metisergida e ritanserina selectivos para os receptores 5-HT2A e 5HT2C respectivamente, não bloquearam a resposta hipertérmica da MDMA (Mechan et al. 2002). A dissociação entre a resposta hipertérmica e a estimulação serotonérgica foi também confirmada pela utilização do inibidor da recaptação da serotonina, a fluoxetina. Esta molécula, capaz de inibir quase totalmente o aumento intracelular de serotonina, não teve qualquer efeito na resposta hipertérmica dos animais em estudo (Malberg et al. 1996). A confirmação do envolvimento da dopamina na reposta hipertérmica surgiu quando a utilização do antagonista selectivo para os receptores da dopamina D1, SCH 23390, produziu uma resposta inibitória da hipertermia, tendo sido essa inibição dependente da dose (Mechan et al. 2002). Além do envolvimento da dopamina é também conhecida a necessidade da activação do sistema nervoso simpático para desencadear a resposta hipertérmica. A administração de antagonistas para os receptores adrenérgicos α1 e para os receptores adrenérgicos β3 atenuou a resposta hipertérmica quando usados separadamente. A coadministrarão dos dois tipos de antagonistas resultou no desaparecimento da resposta hipertérmica (Sprague et al. 2003). Este fenómeno pode estar relacionado com a inibição da vasoconstrição cutânea desencadeada pela MDMA (Pedersen & Blessing 2001). O aumento da temperatura do organismo é acompanhado com aumentos significativos da temperatura do músculo esquelético, fenómeno que é revertido também pelo bloqueio dos receptores β3 (Sprague et al. 2003). As capacidades inibitórias dos antagonistas dos receptores β3 sobre a hipertermia muscular induzida pela MDMA sugere o envolvimento das proteínas de desacoplamento na termogénese induzida pela MDMA a nível do músculo (Rusyniak et al. 2005). De facto, ratos deficientes em proteína de desacoplamento 3 (UCP-3) não são sensíveis aos efeitos hipertérmicos da MDMA, sendo resistentes aos efeitos letais da hipertermia (Mills et al. 2003). Rusyniak e colaboradores mostraram que a MDMA desencadeia o desacoplamento da fosforilação oxidativa in vivo, mas o mecanismo permanece desconhecido. Estes estudos mostram que o desacoplamento ocorre através de Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 24 mecanismos indirectos logo independentes de efeitos directos da MDMA e dos seus metabolitos, resultando em reduções de ATP e fosfocreatina com a consequente hipertermia e rabdomiólise. O eixo hipotálamo-pituitária-tiróide parece contribuir também para o fenómeno da hipertermia. A administração de MDMA a ratos sem hipotálamo ou sem tiróide não desencadeou resposta hipertérmica ocorrendo até uma resposta paradoxal de hipotermia (Sprague et al. 2003). Nesse estudo, a hipertermia foi fortemente associada à tiroxina (hormona T4) já que nos animais tiroidectomizados a administração de tiroxina reactivou a hipertermia induzida pela MDMA (Sprague et al. 2003). Foi então proposto um mecanismo em que o sistema nervoso simpático e o eixo hipotálamo-pituitáriatiróide são activados pela MDMA e que através dos agonistas β, agonistas α, e tiroxina desencadeiam hipertermia pela activação das proteínas de desacoplamento (Sprague et al. 2003). 2.3. Toxicocinética da MDMA 2.3.1. Absorção e Distribuição A MDMA é uma amina que pode existir como base livre ou como sal de vários ácidos. Os utilizadores recreativos desta substância recorrem normalmente a sais que são solúveis em água e que podem ser administrados por via oral, inalatória ou intravenosa. A via de administração mais comum é a via oral, através da ingestão de comprimidos em dose única (Kalant 2001). Vários estudos mostram que as dosagens mais comuns variam entre os 80 e os 150 mg de MDMA e que os utilizadores mais experientes podem repetir a administração mais do que uma vez ao longo de cada utilização. Na utilização recreativa, o início dos efeitos estimulantes, psicológicos e eufóricos ocorre entre os 20 e os 60 minutos, com um efeito máximo observado entre os 60 e os 90 minutos após a ingestão (Green et al. 2003). Os efeitos da MDMA duram cerca de 6 horas (Hegadoren et al. 1999). A MDMA é extensivamente metabolizada no fígado. No entanto, é importante considerar que o metabolismo também ocorre noutros órgãos. O metabolismo cerebral da MDMA, apesar de não contribuir decisivamente para a depuração global da ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 25 substância, parece ter importância na neurotoxicidade e nas diferentes respostas de cada utilizador à substância (de la Torre et al. 2004a). A concentração plasmática máxima é atingida 2 horas após a administração (tmax=2h). O tempo de semi-vida para uma dose de 100 mg é de 8-9 horas e o volume de distribuição é de cerca de 4L/kg (de la Torre et al. 2004a). O efeito de primeira passagem é considerável, já que o metabolito plasmático mais comum (HHMA ou 3,4dihidroximetanfetamina) tem um tmax pouco maior do que 2h (de la Torre et al. 2004b). A ligação às proteínas plasmáticas é baixa, e é da ordem dos 20% (de la Torre et al. 2004a). A administração de diferentes doses leva a variações não proporcionais das concentrações plasmáticas, o que sugere que a MDMA tem uma cinética não linear. A ‘‘clearance’’ renal é constante mas a ‘‘clearance’’ não renal diminui com o aumento da dose (de la Torre et al. 2000). Este fenómeno parece estar relacionado com a capacidade da MDMA inibir o citocromo P450, levando à redução do metabolismo hepático, o que justifica a cinética não linear (de la Torre et al. 2000). Num estudo clínico, foram administradas a nove indivíduos duas doses de 100 mg de MDMA separadas por 24 horas. Verificou-se que, na segunda administração, as concentrações plasmáticas eram de tal forma elevadas que não podiam ser explicadas apenas pela acumulação da droga, indicando a ocorrência do fenómeno de inibição metabólica com duração superior a 24 horas (Farré et al. 2004) A falta de proporcionalidade e a cinética não linear da MDMA, resultante da inibição do metabolismo realizado pelo citocromo P450 CYP2D6, faz com que a administração de doses repetidas se torne uma atitude perigosa pois, na segunda administração, os níveis plasmáticos da MDMA podem ser imprevisivelmente elevados (Farré et al. 2004). A disposição da MDMA parece ser estéreo-selectiva já que a administração do racemato leva a perfis plasmáticos distintos para os dois enantiómeros. Assim, verificou-se que a concentração plasmática máxima obtida para o enantiómero R-(-)- MDMA é significativamente maior do que a concentração plasmática máxima do S-(+)- MDMA. Além disso, o enantiómero farmacologicamente mais activo [S-(+)-MDMA] é mais rapidamente eliminado (Fallon et al. 1999; Pizarro et al. 2004). Uma possível explicação, está no facto de o metabolismo da MDMA ser também estéreo-selectivo já que a isoenzima CYP2D6 tem maior afinidade para o (S)-(+)-MDMA, resultando em tempos de semi-vida mais curtos para este enantiómero (de la Torre et al. 2004b). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 26 2.3.2. Metabolismo da MDMA O metabolismo da MDMA foi extensamente estudado e encontra-se descrito e caracterizado em várias revisões (Figura 4) (de la Torre et al. 2004b; Green et al. 2003). As reacções que ocorrem são em, grande parte, responsáveis pelas manifestações de toxicidade aguda e crónica características da substância, já que ocorre um fenómeno de bioactivação metabólica (Morton 2005). A MDMA é metabolizada por duas vias metabólicas principais: 1. O-desmetilenação, seguida da metilação mediada pela catecol-Ometiltransferase e/ou por conjugação com ácido glucurónico ou sulfato (vias metabólicas II e IV representadas na Figura 4). 2. N-desalquilação, desaminação e oxidação para formar as fenilcetonas posteriormente oxidadas a derivados do ácido benzóico, que finalmente originam ácidos hipúricos pela conjugação com glicina. (vias metabólicas I, III e V, representadas na Figura 4) (de la Torre et al. 2004b). ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 27 Figura 4 - Metabolismo da MDMA. Representação das vias metabólicas. Via I: N-desmetilação; Via II: desmetilenação; Via III: desaminação oxidativa; Via IV: O-metilação; Via V: conjugação com a glicina. Legenda de Abreviaturas: MDMA, 3,4-metilenodioximetanfetamina; MDA, 3,4 metilenodioxianfetamina; HHMA ou N-Me-α-MeDA, dihidroxiabfetamina ou N-metil-αmetildopamina; α-MeDA, α-metildopamina; HMMA, hidroximetoximetanfetamina; HMA, hidroximetoxianfetamina; PIPAC, peperonilacetona; MDHA, ácido 3,4-metilenodioxihipúrico; DHPA, 3,4-diidroxifenilacetona; DHHA, ácido 3,4-diidroxihipúrico; HMPA, 4-hidroxi-3-metoxifenilacetona; HMHA, ácido 4-hidroxi-3-metoxihipúrico (Carmo 2007). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 28 A N-desmetilação da MDMA mediada pelo citocromo P450 origina 3,4metilenodioxianfetamina (MDA). Ambas, MDMA e MDA, sofrem reacção de desmetilenação mediada pelo Citocromo P450 para originar os dois catecóis respectivos, a 3,4-dihidroximetanfetamina (HHMA ou N-Me-α-MeDA) e a 3,4dihidroxianfetamina (HHA) também designada por α-metildopamina (α-MeDA). Por sua vez, estes catecóis são metilados pela catecol-O-metiltransferase dando origem à 4hidroxi-3-metoximetanfetamina (HMMA) e à 4-hidroxi-3-metoxiamfetamina (HMA), respectivamente. Os quatro metabolitos, HHMA, HHA, HMMA e HMA são conjugados com sulfato ou ácido glucurónico e podem ser encontrados principalmente no plasma e na urina (Green et al. 2003). A sucessiva degradação da cadeia lateral da MDMA, HHMA e HMMA através das reacções de N-desmetilação e desaminação oxidativa originam os respectivos deaminoxometabolitos: piperonilacetona (PIPAC); 3,4-dihidroxifenilacetona (DHPA); 4-hidroxi-3-metoxifenilacetona (HMPA). Finalmente, a conjugação das cetonas com glicina vai originar os seguintes ácidos hipúricos: ácido 3,4-metilenodioxihipúrico (MDHA), ácido 3,4-dihidroxihipúrico (DHHA) e ácido 4-hidroxi-3-metoxihipúrico (HMHA). A auto-oxidação dos catecóis resulta na formação de radicais livres, ROS e RNS que têm sido implicados na acção neurotóxica da MDMA (Cadeta & Brannocka 1998). A sua elevada reactividade permite a oxidação sucessiva originando as respectivas quinonas que, por sua vez, sofrem oxidação intramolecular originando os aminocromos. Estes também oxidam para dar origem aos respectivos 5,6-hidroxindóis que finalmente polimerizam para formar pigmentos semelhantes a melaninas (Bolton et al. 2000). Deste processo resultam grandes quantidades de ROS e RNS que, tal como as quinonas, reagem com grupos nucleófilos nomeadamente: grupos sulfidrilo das proteínas e da glutationa, lípidos e DNA (Bolton et al. 2000; Cadeta & Brannocka 1998). Os metabolitos catecólicos podem também conjugar-se com moléculas de glutationa num processo acompanhado pela formação de ROS e RNS (Hiramatsu et al. 1990). Neste processo, formam-se os metabolitos: 5-(glutation-S-il)-α-MeDA, 2-(glutation-Sil)- α-MeDA e a 2,5-bis(glutation-S-il)α-MeDA (Hiramatsu et al. 1990). A formação destes aductos tem potencial tóxico, sendo esta biotransformação uma via de toxificação para as células do rim (Carvalho et al. 2002b), do fígado (Carvalho et al. 2001b; Carvalho et al. 2004a; Carvalho et al. 2004b), do coração (Carvalho et al. 2004c) e do ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 29 sistema nervoso central (Bai et al. 1999; Capela et al. 2007; Capela et al. 2006; Easton et al. 2003). 5-(glutation-S-il)-α-MeDA 2,5-bis(glutation-S-il)α-MeDA 2-(glutation-S-il)- α-MeDA Figura 5 – Aductos com a glutationa. Finalmente, foi identificada em ratos uma terceira via metabólica que consiste na hidroxilação aromática com formação de triidroxianfetaminas (triidroxianfetamina e triidroximetanfetamina) (Lim & Foltz 1991). Estes metabolitos triidroxilados foram mais tarde identificados como neurotóxicos (Zhao et al. 1992). 2.3.3. Excreção A principal via de excreção das anfetaminas em geral é a via urinária, logo o pH urinário é um factor que condiciona a excreção renal. Como estes compostos são bases fracas, a excreção renal aumenta com a acidificação da urina e diminui com a alcalinização. Assim, o tempo de semi-vida destas substâncias varia em função do pH urinário havendo até utilizadores que recorrem ao bicarbonato com o objectivo de prolongar os efeitos da droga (de la Torre et al. 2004a). Os derivados anfetamínicos que possuem o substituinte metilenodioxilo no anel aromático sofrem metabolização extensa, pelo que a quantidade excretada na urina sem biotransformação é relativamente pequena (de la Torre et al. 2004a). A MDMA é um exemplo deste fenómeno. Embora se consigam detectar moléculas intactas na urina, a percentagem de MDMA não biotransformada e excretada é de 15% do total administrado. Assim, cerca de 80% da MDMA administrada é excretada sob a forma de metabolitos (de la Torre et al. 2004a). A clearance renal da MDMA é constante e independente da dose administrada, por contraposição à clearance não renal que depende da dose (de la Torre et al. 2004a). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 36 sequestradores de radicais livres conduzia à redução desses efeitos (Colado & Green 1995; Gudelsky 1996). A génese do stress oxidativo está no metabolismo da MDMA. Este é responsável pela formação de metabolitos neurotóxicos com estruturas semelhantes a quinonas que são capazes de gerar espécies reactivas de oxigénio e de azoto através de reacções de oxidação-redução (Figura 6) (Bolton et al. 2000). O metabolismo da MDMA mediado pelas enzimas do citocromo P450 é o responsável pela formação de catecóis como a 3,4-dihidroximetanfetamina (HHMA ou N-Me-α-MeDA) e a 3,4-dihidroxianfetamina (HHA ou α-MeDA). A formação das quinonas, N-Me-α-MeDA-o-quinona e α-MeDA-o-quinona, a partir dos catecóis levam a quatro vias de toxicidade possíveis (Figura 6). 1) A partir das ortoquinonas pode ocorrer oxidação intramolecular com formação de aminocromos. As oxidações subsequentes formam os 5,6diidroxindois que polimerizam originando estruturas semelhantes a melaninas (Bolton et al. 2000). 2) As ortoquinonas podem originar semi-quinonas com formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e de azoto (NOS) (Capela et al. 2006). 3) As ortoquinonas podem reagir directamente com os constituintes celulares levando à alteração e destruição dos neurónios (Capela et al. 2006). 4) As ortoquinonas, devido à sua capacidade reactiva, reagem com a glutationa (GSH) originando os aductos correspondentes que podem, por sua vez, ser metabolizados aos derivados de N-acetilcisteína (NAC). ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 37 Figura 6 - Vias metabólicas responsáveis pela formação de metabolitos neurotóxicos. As primeiras reacções são mediadas pelo citocromo P450: a MDMA sofre N-desmetilação para dar origem à MDA. MDA e MDMA sofrem ambas desmetilenação para formar os respectivos catecóis a partir dos quais se inicia todo um processo de stress oxidativo. Além de ROS e RNS surgem as ortoquinonas que podem seguir quatro vias: 1) Oxidação intramolecular seguida de oxidação e autoxidação para formar polímeros do tipo da melanina. 2) Formação de semiquinonas e espécies reactivas de oxigénio (ROS) e espécies reactivas de azoto (NOS). 3) Conjugação com glutationa levando à depleção das defesas anti-oxidantes. 4) Reacção directa com constituintes celulares [adaptado de Capela et al. (2006)]. Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 38 Em resumo, estas reacções são capazes de gerar catecóis, quinonas, semiquinonas e hidroquinonas que podem ceder electrões ao oxigénio originando superóxidos, peróxido de hidrogénio e outras espécies que, por sua vez, levam à depleção das defesas antioxidantes, peroxidação lipídica, inibição da TPH, alteração das proteínas em geral, alteração do DNA e, finalmente, à degeneração dos terminais serotonérgicos. Todos estes danos podem ser acompanhados com produção secundária de radical hidroxilo que traz ainda mais danos, num ciclo destrutivo de oxidação-redução (Colado & Green 1995). Estudos in vitro demonstraram que os metabolitos resultantes da conjugação com glutationa são neurotoxinas fortes com maior toxicidade do que os catecóis que lhes deram origem. Além disso, verificou-se também que a incubação das células em hipertermia potenciava a neurotoxicidade da MDMA (Capela et al. 2007; Capela et al. 2006). A formação dos aductos com glutationa, foi demonstrada em microssomas de fígado humano. Ao mesmo tempo, a administração intracerebral do conjugado 5-(glutation-Sil)-α-MeDA a ratos desencadeou sintomas de intoxicação pela MDMA mostrando que tem actividade no sistema nervoso central (Easton et al. 2003). A administração intracerebral destes conjugados desencadeou também depleção de serotonina (Bai et al. 1999). Por fim, é importante referir a formação dos metabolitos triidroxilados em ratos que demonstraram ter acção neurotóxica quando administrados directamente no estriado (Lim & Foltz 1991; Zhao et al. 1992). 2.4.2. Acumulação de Dopamina – ROS, RNS e Stress Oxidativo Tal como foi referido, para os primatas não humanos e para o rato, a MDMA é neurotóxica para o sistema serotonérgico e praticamente não apresenta efeitos deletérios no sistema dopaminérgico. No ratinho ocorre o contrário, já que há maior resistência do sistema serotonérgico ao efeito neurotóxico, enquanto o sistema dopaminérgico é mais sensível (Lyles & Cadet 2003). A libertação de serotonina mediada pela MDMA leva à activação dos receptores 5HT2A/2C pós-sinápticos dos interneurónios gabaérgicos. Isto reduz a neurotransmissão gabaérgica e consequentemente aumenta a síntese e libertação de dopamina pelos neurónios dopaminérgicos (Gudelsky & Nash 1996). Existem assim dois mecanismos ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 39 de libertação de dopamina: directamente pela MDMA (Schmidt et al. 1987) e através da regulação serotonérgica mediada pelos interneurónios gabaérgicos (Gudelsky & Nash 1996). Além disso, a inibição preferencial da MAOA também contribui para o aumento da dopamina extracelular (Leonardi & Azmitia 1994). Pensa-se que, devido à quantidade excessiva de dopamina extracelular existente, esta pode ser transportada para o interior dos terminais serotonérgicos através do transportador da serotonina (SERT) (Lyles & Cadet 2003). Tal pressuposto está de acordo com a descoberta de que a dopamina pode ser transportada pelo SERT (Faraj et al. 1994). Uma vez no interior do terminal serotonérgico, a autoxidação da dopamina exerce por si só acção neurotóxica (Graham 1978). Além disso, no interior do terminal, a dopamina pode ser metabolizada pela MAOB formando peróxido de hidrogénio que, por sua vez, pode desencadear peroxidação lipídica e stress oxidativo (Sprague et al. 1998). Este mecanismo pode potenciar a destruição dos terminais serotonérgicos e contribuir para a toxicidade a longo prazo (Figura 7) (Lyles & Cadet 2003). Figura 7 - Envolvimento da dopamina na neurotoxicidade mediada pela MDMA. Adaptado de Sprague et al. (1998). MDMA Libertação Depleção de Serotonina (5-HT) Libertação e Síntese de Dopamina (DA) 5-HT2A/2C ↓GABA Transporte de DA para o terminal Serotonérgico Desaminação pela MAOB Formação de peróxido de hidrogénio e radicais livres Degeneração Selectiva dos terminas serotonérgicos Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 40 2.4.2.1. Serotonina – activação de receptores 5-HT2A A libertação de serotonina (5-HT) para a fenda sináptica permite activar os receptores 5-HT2A que parecem estar envolvidos em mecanismos de neurotoxicidade. Uma vez activados, estes receptores causam alterações na homeostase do cálcio através da translocação da proteína cínase C do citosol para a membrana plasmática e respectiva activação (Kramer et al. 1998). Esta teoria é suportada pelo facto da nimodipina, um bloqueador dos canais de cálcio, reduzir a toxicidade neuronal mediada pela MDMA (Farfel et al. 1992). Foi colocada também a hipótese de que a serotonina, ou um dos seus metabolitos, fossem responsáveis pela neurotoxicidade da MDMA, já que a inibição da recaptação da serotonina pela fluoxetina ou citalopram antagonizava os indicadores de toxicidade nomeadamente, a depleção da serotonina induzida pela MDMA (Schmidt 1987) e a inibição da actividade da triptofanohidroxilase (Schmidt & Taylor 1987). Supunha-se então, que o transportador da serotonina (SERT) fosse capaz de captar o metabolito tóxico da serotonina colocando-o no interior do terminal nervoso onde este poderia desencadear um processo de stress oxidativo com destruição selectiva do terminal serotonérgico. Esta hipótese é no entanto controversa porque não foram encontrados os metabolitos da serotonina capazes de desencadear toxicidade (Sprague et al. 1998). Além disso, outro estudo (Sprague et al. 1994) em que se instituiu um regime com triptofano ou 5-hidroxitriptofano que aumenta a quantidade de serotonina endógena (Gudelsky & Nash 1996) e consequentemente os seus hipotéticos metabolitos tóxicos, demonstrou que os níveis aumentados de serotonina não traduzem agravamento da neurotoxicidade, colocando mais uma vez em dúvida a teoria do envolvimento de produtos de oxidação da serotonina no mecanismo de neurotoxicidade da MDMA (Sprague et al. 1998). 2.4.2.2. Excitotoxicidade – Envolvimento do glutamato e/ou do monóxido de azoto (NO) na neurotoxicidade da MDMA O glutamato é o neurotransmissor excitatório mais abundante do sistema nervoso central. A libertação excessiva de glutamato está associada a morte neuronal num processo designado de excitotoxicidade. A quantidade excessiva de glutamato na fenda ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 41 sináptica leva à activação dos receptores ionotrópicos [2-amino-3-(3-hidroxi-5methilisoxazol-4-il)proprionato ou AMPA] e metabotrópicos (N-metil-D-aspartato ou NMDA) do glutamato que fazem aumentar o cálcio intracelular. Este aumento, por sua vez, activa cínases, lípases, proteases, endonucleases e outras vias metabólicas que provocam degeneração neuronal directa ou através da formação de ROS, de RNS e da ocorrência de stress oxidativo. (Arundine & Tymianski 2003; Sattler & Tymianski 2000). A questão do envolvimento da excitotoxicidade no mecanismo de neurodegeneração provocado pela MDMA é ainda controversa (Quinton & Yamamoto 2006; Sprague et al. 1998). Um estudo realizado em ratos utilizando o MK-801, um inibidor do receptor do glutamato NMDA, demonstrou protecção contra a depleção dos níveis de serotonina, 7 dias depois da administração da MDMA (Farfel et al. 1992). Por outro lado, outro estudo revelou não haver efeito do bloqueador MK-801 sobre a inibição da triptofanohidroxilase (TPH) provocada pela MDMA (Johnson et al. 1989). O envolvimento do glutamato na neurotoxicidade da MDMA levou a especular se este não seria responsável pelo aumento do monóxido de azoto (NO) intracelular, sendo este o mediador último da toxicidade. Esta suposição baseia-se na capacidade que o glutamato tem de activar o receptor NMDA que, por sua vez, sinaliza a activação da NO-sintetase e desencadeia a produção de NO que finalmente seria responsável pela toxicidade (Sattler & Tymianski 2000). Tendo por base esta hipótese, foi realizado um estudo onde se testaram três inibidores da sintetase do óxido nítrico: metilester da N(G)-nitro-L-arginina (L-NAME), N(G)-monometil-L-arginina e N(G)-nitro-L-arginina. Destes três inibidores, apenas o LNAME consegue proteger contra os efeitos neurotóxicos da MDMA (depleção de serotonina e dopamina). Como este inibidor é o único que induz hipotermia, os autores concluíram que o efeito protector deveria estar relacionado com o abaixamento da temperatura e não com a inibição da produção de NO. Deste modo concluíram que o NO não teria um papel importante na neurotoxicidade mediada pela MDMA (Taraska & Finnegan 1997). Por outro lado, num estudo in vitro em cultura de células serotonérgicas humanas, verificou-se que a incubação simultânea de MDMA e de dador de NO (nitroprussiato de sódio) resulta no aumento de morte celular em relação aos controlos. Esse mesmo Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 42 estudo demonstrou o efeito protector do inibidor da NO-sintetase (L-NAME), na ausência do efeito hipotérmico verificado in vivo (Simantov & Tauber 1997). Mais uma vez se verifica que o envolvimento do glutamato e/ou do NO na neurotoxicidade mediada pela MDMA é uma questão que permanece em aberto. Finalmente, é importante salientar que para outras anfetaminas, como a metanfetamina, existem evidências mais claras sobre o envolvimento do glutamato e da excitotoxicidade nos mecanismos de neurodegeneração (Quinton & Yamamoto 2006). 2.4.2.3. Envolvimento da Hipertermia nos Mecanismos de Neurotoxicidade A MDMA causa hipertermia em ratos e essa alteração da temperatura depende da temperatura ambiente. Assim, a administração de MDMA em ratos mantidos a 30 ºC desencadeia uma resposta hipertérmica, enquanto que ratos mantidos a 10 ºC têm uma resposta hipotérmica (Gordon et al. 1991). Estas observações levam a crer que a MDMA causa alterações nos mecanismos termorreguladores. Os efeitos hipertérmicos também ocorrem nos humanos e são potencialmente fatais (Dar & McBrien 1996). A utilização do antagonista dos receptores da serotonina, quetanserina, protege contra a neurotoxicidade e bloqueia a hipertermia induzida por uma dose baixa (10 mg/kg) de MDMA administrada a ratos. Se a dose for aumentada este bloqueio deixa de ser eficaz e a temperatura corporal aumenta (Schmidt et al. 1990). Verificou-se também que os efeitos protectores da quetanserina são contrariados aumentando a temperatura ambiente (Malberg et al. 1996). Estes dois estudos mostram que a protecção contra a neurotoxicidade mediada pela quetanserina se deve à hipotermia por ela provocada. Existem também substâncias capazes de fornecer protecção contra a neurotoxicidade sem alterar a resposta hipertérmica da MDMA. Um bom exemplo é a fluoxetina que apesar de proteger contra os efeitos neurotóxicos da MDMA não contraria a hipertermia (Malberg et al. 1996). Estes estudos permitem concluir que a redução da temperatura corporal é um mecanismo de protecção contra a neurotoxicidade induzida pela MDMA, ao mesmo tempo que se verifica que, para além da hipertermia, existem outros mecanismos para os efeitos neurotóxicos. ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 43 Esta conclusão está de acordo com o conhecimento geral de que a redução da temperatura protege contra danos cerebrais com as mais variadas origens. Deste modo, será de considerar que, possivelmente, todas as substâncias capazes de baixar a temperatura corporal tenham efeito protector contra a neurodegeneração (Sprague et al. 1998). Pode-se desta forma dizer que a hipertermia, além de ser um sintoma grave de intoxicação aguda por MDMA, é também um factor que potencia fortemente a neurotoxicidade (Kiyatkin 2005). 2.4.2.4. Alteração da Função Mitocondrial potencia a Neurotoxicidade A neurotoxicidade da MDMA (e das anfetaminas em geral) parece estar também relacionada com alterações funcionais das mitocôndrias. Esta possibilidade foi levantada já que a inibição da cadeia transportadora de electrões pelo malonato, agrava a neurotoxicidade da MDMA (Nixdorf et al. 2001). Ao mesmo tempo, a utilização de substratos para o metabolismo energético, como a nicotinamida e a ubiquinona (ou coenzima Q10), permitiu a redução da toxicidade da MDMA com menor depleção dos níveis de serotonina no hipocampo e no estriado (Darvesh & Gudelsky 2005). Estes fenómenos podem estar relacionados com a inibição da cadeia transportadora de electrões de forma rápida e transitória após a administração de MDMA (Burrows et al. 2000), sendo que essa inibição ocorre ao nível dos complexos I e II da cadeia transportadora de electrões (Quinton & Yamamoto 2006). A origem das alterações da função mitocondrial induzidas pela MDMA ainda não está esclarecida mas pode estar relacionada com os mecanismos que envolvem stress oxidativo, excitotoxicidade e proteínas de desacoplamento, como anteriormente se referiu. Assim, o aumento do gasto energético induzido pela MDMA (Darvesh & Gudelsky 2005) associado à alteração da função mitocondrial pode potenciar a neurotoxicidade (Quinton & Yamamoto 2006). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 44 2.4.3. Efeitos Neuropsiquiátricos da MDMA Do que até aqui se expôs, a MDMA é uma substância que interage de forma complexa com o sistema nervoso central. Vários sistemas neurotransmissores podem ser influenciados. Os sistemas serotonérgico e dopaminérgico são os mais afectados. No entanto, também ocorrem alterações na libertação de noradrenalina. Esta interacção difusa desencadeia respostas neurológicas e neuroendócrinas que caracterizam os efeitos descritos pelos utilizadores de ‘‘ecstasy’’. 2.4.3.1. Efeitos Agudos Os efeitos agudos descritos pelos utilizadores de MDMA são euforia, alterações na percepção da luz e do som, redução da atitude defensiva (afecto negativo), abertura emocional, empatia e redução das inibições (Morton 2005). A generalidade dos efeitos psicológicos foi relacionada com a libertação de serotonina, enquanto que os efeitos estimulantes e eufóricos foram relacionados com a libertação de dopamina (Liechti & Vollenweider 2001). Apesar de não haver o fenómeno de ressaca, existe um período depois da toma em que humor piora, aparecem sintomas de depressão e tristeza, irritabilidade, insociabilização, dificuldades de concentração, problemas de memória, dificuldade em dormir e dores musculares. Apesar de ser reversível, este fenómeno persiste durante alguns dias (cerca de 4 dias) e é conhecido como “midweek blues”. É provável que estas alterações estejam relacionadas com a depleção monoaminérgica (Parrott 2002). 2.4.3.1.1. Síndrome serotonérgica A síndrome serotonérgica corresponde a um conjunto de sintomas agudos que resultam do excesso de serotonina na fenda sináptica. Os sintomas descritos incluem hiperactividade comportamental, confusão mental, agitação, hiperreflexia, hiperpirexia, taquicardia, clonus, mioclonus, oscilações oculares e tremuras (Gillman 1998). Esta síndrome surge normalmente como reacção adversa, principalmente quando se combinam inadvertidamente diferentes substâncias pró-serotonérgicas. Por exemplo, a ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 45 associação de inibidores da monoaminaoxidase (MAOIs) com inibidores da recaptação da serotonina (SSRIs) pode desencadear a síndrome (Gillman 1998). Quando ocorre uma manifestação pouco grave, com apenas três sintomas, não é geralmente necessário apoio médico, a redução da temperatura corporal é suficiente para controlar os sintomas. No entanto, a evolução para manifestações mais graves com quatro ou mais sintomas, pode ocorrer rapidamente e colocar o doente em risco de vida. Neste caso, a intervenção médica é urgente e a terapêutica passa por antagonizar os efeitos da serotonina com bloqueadores dos receptores 5-HT2/5HT1A: ciproheptadina ou cloropromazina (Gillman 1998; Gillman 1999). A utilização de MDMA nas doses recreativas está sempre acompanhada de síndrome serotonérgica em grau variável. Normalmente, os sintomas são moderados e incluem hiperactividade, confusão mental, hipertermia e trismus (bruxismo). Estas reacções são bem conhecidas dos utilizadores habituais e não são consideradas graves (Parrott 2002). Por vezes, podem ocorrer sintomas de hiperactividade serotonérgica mais intensos que chegam a colocar o utilizador em perigo de vida (Green et al. 2003). Vários factores podem influenciar a intensificação da resposta pró-serotonérgica. A dose administrada e a sensibilidade variável de cada utilizador são cruciais. Interacções com outras substâncias pró-serotonérgicas como inibidores da monoaminaoxidase (MAOIs), inibidores do transportador de recaptação da serotonina (SSRIs), cocaína, entre outras, podem aumentar os níveis de serotonina na sinapse. Finalmente, as condições ambientais: temperaturas elevadas, música repetitiva em volume elevado, dança prolongada e locais sobrelotados, contribuem para o aumento do risco da síndrome serotonérgica (Parrott 2002). 2.4.3.2. Efeitos Crónicos Os efeitos crónicos mediados pela MDMA devem ser também considerados em função do padrão de utilização. Os efeitos crónicos são descritos até por utilizadores recentes que recorreram à MDMA entre 1 e 9 vezes. No entanto, estes efeitos são mais frequentes nos utilizadores recorrentes (Parrott et al. 2002). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 52 Estes mecanismos de toxicidade estão de acordo com um estudo in vitro onde ocorreu indução de morte celular de hepatócitos de rato induzida por vários compostos de natureza quinónica (Nakagawa & Moldeus 1992). Além disso, a morte celular foi precedida pela diminuição dos níveis intracelulares de GSH, grupos SH proteicos e de ATP (Nakagawa & Moldeus 1992). 2.5.1.2. MDMA e metabolitos Além da provável toxicidade resultante da oxidação das catecolaminas também se deve considerar a biotransformação da MDMA como potencial via de toxicidade. Isto porque, tal como já foi referido, a principal via de metabolização corresponde à desmetilenação com formação de dois metabolitos catecólicos nomeadamente: o HHA (α-MeDA) e HHMA (N-Me-αMeDA). Estes dois catecóis podem, à semelhança do que se descreveu para as catecolaminas endógenas, sofrer reacções de oxidação com formação de aminocromos e conjugados com glutationa e cisteína. A reactividade das quinonas, semi-quinonas aminocromos e tioéteres formados pode desencadear a formação de ROS e RNS induzindo stress oxidativo, depleção das defesas antioxidantes e lesão celular (Bindoli et al. 1992; Carvalho et al. 2004a; Carvalho et al. 2004b). Estudos recentes comprovam o envolvimento do metabolismo da MDMA nos mecanismos de stress oxidativo e de toxicidade (Carvalho et al. 2004b). Em preparações de hepatócitos isolados, a adição de MDMA levou à depleção de glutationa (GSH) sem que ocorresse alterações na viabilidade celular, nos níveis de ATP, e nas actividades da glutationa reductase (GR), glutationa peroxidase (GPX) e glutationa S-transferase (GST). Mas, por outro lado, a adição do metabolito HHMA (N-Me-α-MeDA) aos hepatócitos levou à depleção de GSH, à redução da viabilidade celular e à redução da actividade das enzimas anti-oxidantes. A redução da viabilidade celular e a depleção de GSH foram revertidas através de antioxidantes, indicando o possível envolvimento do stress oxidativo. Este estudo demonstra que o metabolismo contribui para a toxicidade hepática da MDMA (Carvalho et al. 2004b). Estudos realizados pelo mesmo grupo mostraram que a incubação do metabolito MDA com os hepatócitos, tal como para a MDMA, apenas desencadeou depleção de GSH sem interferir com a viabilidade celular e com as actividades das enzimas GR, GPX e GST. Pelo contrário, a adição do metabolito HHA (α-MeDA) provocou depleção ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 53 da GSH, redução da viabilidade celular e redução da actividade da GR, GPX e GST (Carvalho et al. 2004a). Para todas as moléculas testadas, a depleção de GSH não foi acompanhada pelo aumento do nível de GSSG (glutationa oxidada), já que a glutationa foi conjugada com os metabolitos. Neste estudo, foram identificados dois conjugados: 2-(glutation-S-il)- αMeDA e 5-(glutation-S-il)-α-MeDA. Este fenómeno leva à ruptura da homeostase da glutationa traduzindo-se em menor capacidade antioxidante, o que resulta em alterações proteicas iniciando uma cascata de eventos que leva à lesão hepatocelular (Carvalho et al. 2004a). 5-(glutation-S-il)-α-MeDA 2-(glutation-S-il)- α-MeDA Figura 8 – Metabolitos resultantes da conjugação com glutationa. 2.5.1.3. Hipertermia A hipertermia também parece contribuir para a toxicidade hepática da MDMA. Os danos hepatocelulares, causados in vivo pela MDMA, são semelhantes aos observados in vitro em condições de hipertermia (Santos-Marques et al. 2006). Estudos in vitro demonstraram que a incubação de hepatócitos de rato a 41 ºC leva à diminuição significativa de GSH intracelular, aumento de GSSG, peroxidação lipídica e morte celular (Carvalho et al. 1997). Resultados semelhantes foram obtidos em estudos in vitro com hepatócitos de ratinho (Carvalho et al. 2001b). Estudos in vivo realizados em ratinhos mostraram que a toxicidade hepática induzida pela MDMA é agravada com o aumento da temperatura ambiente (Carvalho et al. 2002a). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 54 2.5.1.4. Apoptose Tal como já foi referido, a MDMA tem capacidade para induzir morte celular programada em hepatócitos. A acção pro-apoptótica foi demonstrada em hepatócitos isolados de rato e em células hepáticas mantidas em cultura celular (linha CFSC-2G) (Montiel-Duarte et al. 2004; Montiel-Duarte et al. 2002). A apoptose foi, nesse estudo, acompanhada com redução da proteína anti-apoptótica Bcl-xL, libertação de citocromo c da mitocôndria e activação da caspase 3. Nas células em cultura celular ocorreu proteólise da poli(ADP-ribose)-polimerase (PARP), uma enzima envolvida na morte celular programada e na reparação do ADN (Montiel-Duarte et al. 2002). O envolvimento do stress oxidativo para desencadear a apoptose foi estudado na linha celular CFSC-2G. A exposição das células à MDMA desencadeou a acumulação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e a redução dos níveis de glutationa (GSH) (Montiel-Duarte et al. 2004). Estes efeitos foram contrariados pela utilização de antioxidantes. No entanto, a apoptose induzida pela MDMA manteve-se. Assim, os autores concluíram que o stress oxidativo não está envolvido na apoptose desencadeada pela MDMA (Montiel-Duarte et al. 2004). Além disso, verificou-se até que a indução de stress oxidativo leva à activação do factor de transcrição NF-κB que bloqueia parcialmente a acção apoptótica da MDMA (Montiel-Duarte et al. 2004). Este grupo estudou também o impacto do metabolismo da MDMA sobre a sua capacidade apoptótica. Assim, utilizando quinidina para inibir a CYP2D6 que, como já foi referido, é crucial para o metabolismo oxidativo da MDMA (Maurer et al. 2000), observou-se a diminuição do efeito apoptótico da MDMA. Desta forma, este grupo concluiu que a acção apoptótica da MDMA depende do metabolismo e possivelmente da formação de conjugados com a glutationa e com a cisteína (Montiel-Duarte et al. 2004). ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 55 2.5.2. Sistema Cardiovascular A toxicidade cardiovascular mediada pela MDMA foi desde cedo detectada em diversas situações clínicas de utilizadores de ‘ecstasy’ (Milroy et al. 1996). Estes acontecimentos desencadearam o interesse em estudar os efeitos cardiovasculares desta molécula. As primeiras investigações observaram, no rato, efeitos estimulantes sobre o coração nomeadamente, taquicardia e arritmia (Gordon et al. 1991). Além disso, a MDMA facilita a vasoconstrição (Fitzgerald & Reid 1994). A hipertensão é outro sintoma que se pode detectar em ratos, sendo um efeito dependente da dose. A administração de MDMA a ratos desencadeia redução da frequência cardíaca, mesmo para doses abaixo de 1 mg/kg por via intravenosa. A bradicardia possivelmente resulta como resposta reflexa (mediada pelos barorreceptores) à hipertensão (O'Cain et al. 2000). A subida da pressão arterial também foi detectada em utilizadores de MDMA (Vollenweider et al. 1998). O perfil da resposta cardiovascular tende a variar ao longo dos vários episódios de administração. Os estudos realizados em ratos mostraram que a administração repetida aumenta os efeitos cardiovasculares e agrava a cardiotoxicidade após cada administração (Badon et al. 2002). Esta descoberta pode ser um indicador da perigosidade para o sistema cardiovascular dos utilizadores de ‘ecstasy’ com um padrão de utilização frequente desta droga. Finalmente, estudos recentes em cardiomiócitos isolados de rato revelaram que, além da cardiotoxicidade mediada pelas alterações monoaminérgicas, ocorre também toxicidade directa. Os principais metabolitos da MDMA (MDA, HHMA e HHA) levam a alterações morfológicas dos cardiomiócitos, alterações na homeostase da glutationa, formação de conjugados da HHMA e HHA com glutationa, aumento dos níveis de cálcio extracelular, depleção de ATP e redução da actividade de enzimas antioxidantes. Estas manifestações de toxicidade não se verificaram para a MDMA, o que mostra que, in vitro, a cardiotoxicidade só acontece depois de o metabolismo ocorrer (Carvalho et al. 2004c). À semelhança do que foi descrito anteriormente para o fígado, também no coração ocorre toxicidade resultante do metabolismo das catecolaminas (Carvalho et al. 2001a; Carvalho et al. 2004c; Chavdarian et al. 1978). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 56 2.5.3. Sistema Imunitário À semelhança de outras drogas de abuso, a MDMA é uma substância imunossupressora, podendo por isso aumentar a susceptibilidade a doenças infecciosas. Num estudo de revisão (Connor 2004) foram sumariados os efeitos imunossupressores a seguir enumerados. 1. Redução da fagocitose pelos neutrófilos. 2. Supressão da produção de citocinas pro-inflamatórias. 3. Supressão da produção de factor de necrose tumoral α (TNF-α). 4. Supressão da produção de interleucina 1β (IL-1β). 5. Aumento da citocina imunossupressora interleucina 10 (IL-10) e promoção do fenótipo imunossupressivo. 6. Redução do número de linfócitos circulantes, com redução expressiva das células T CD4+. 7. Alteração da funcionalidade das células T com diminuição da mitose estimulada. A maior parte destes efeitos não resulta da acção directa da MDMA sobre as células imunes, mas sim indirectamente através da libertação descontrolada de imunomoduladores nomeadamente, glucocorticoides e catecolaminas, que podem desencadear respostas imunossupressoras (Connor 2004). Apesar disso, existem evidências de que as células do sistema imunitário produzem transportadores da serotonina e da dopamina e que sofrem a acção directa da MDMA. (Gordon & Barnes 2003; Mossner & Lesch 1998) Os estudos realizados por House e colaboradores concluíram que, in vitro, os efeitos directos da MDMA são moderados e variáveis, dependendo da dose e do parâmetro em estudo (House et al. 1995). Num sentido oposto, os estudos in vivo e in vitro com zymosan (um tipo de parede celular da Saccaromyces cerevisiae altamente imunogénica) detectaram efeitos supressores directos da MDMA na resposta imune nomeadamente no que respeita à fagocitose realizada pelos neutrófilos. Neste caso, parece ocorrer uma acção directa da MDMA sobre o neutrófilo (Connor et al. 2004). Os efeitos indirectos da MDMA devem-se essencialmente às alterações na libertação de neurotransmissores a nível do sistema nervoso central. A incidência destas modificações ocorre principalmente sobre a serotonina e a dopamina (Green et al. 2003) e produzem consequentemente a activação de vias de imunomodulação periféricas ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 57 nomeadamente, a nível do eixo hipotálamo-pituitária-supra-renal e a nível do sistema nervoso simpático (Green et al. 2003; Nash et al. 1988). A relação entre a libertação de serotonina e os efeitos imunossupressores foi inicialmente estabelecida através de estudos comparativos entre a fenfluramina e a MDMA. A fenfluramina é uma substância capaz de induzir a libertação selectiva de serotonina. Além disso, exerce efeitos imunossupressores semelhantes aos verificados para a MDMA. Através deste estudo deduziu-se que os efeitos imunossupressores dependem da activação serotonérgica (Connor & Kelly 2002; Connor et al. 2000). Um estudo recente em humanos mostra que o tratamento com um inibidor da recaptação da serotonina (paroxetina), que impede a entrada de MDMA para o terminal pré-sináptico e previne a libertação de serotonina, consegue bloquear os efeitos imunossupressores da MDMA (Pacifici et al. 2004). A libertação de dopamina pela MDMA também pode conduzir a efeitos imunossupressores já que outras drogas com potente acção sobre a libertação dopaminérgica, como a anfetamina ou a metanfetamina, têm efeitos imunossupressores em roedores (Connor 2004). Tal como já se referiu, a consequência última da libertação destes neurotransmissores a nível central é a activação do eixo hipotálamo-pituitária-suprarenal e do sistema nervoso simpático (Green et al. 2003; Nash et al. 1988). Estes produzem glucocorticoides e catecolaminas com potencial de desencadear respostas imunossupressoras (Bateman et al. 1989; Elenkov et al. 2000). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 58 Cérebro MDMA: liberta serotonina e dopamina (Mediadores centrais da imunossupressão) Activação das vias imunomoduladoras periféricas. Periferia Estimula a libertação de: • Glucocorticoides • Catecolaminas • Outros mediadores? Mediadores periféricos da imunossupressão. Actuam nos receptores das células imunes. Figura 9 - Mecanismo responsável pela Imunossupressão mediada pela MDMA. Adaptado de Connor (2004). 2.5.4. Rim Existem na literatura várias descrições de falência renal após a utilização recreativa de MDMA (Bingham et al. 1998; Fahal et al. 1992; Henry et al. 1992; Walubo & Seger 1999). Podem ser nomeados vários fenómenos induzidos pela MDMA que possivelmente estão envolvidos na falência renal. A coagulação intravascular disseminada, a vasoconstrição, a rabdomiólise, a hipotensão e a hipertermia são alguns exemplos de possíveis causas que contribuem para estas ocorrências, e que estão geralmente presentes nos casos clínicos descritos (Fahal et al. 1992; Henry & Hill 1998; Walubo & Seger 1999). A coagulação intravascular disseminada e a rabdomiólise estão envolvidas na isquemia renal, na falência renal e na necrose tubular aguda devido à obstrução da Imunossupressão ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 59 microvasculatura pelos agregados plaquetários e precipitação de mioglobina (Cunningham 1997). Além dos factores descritos existe a possibilidade da MDMA ou dos seus metabolitos exercerem toxicidade renal. Estudos in vitro realizados em culturas primárias de células tubulares proximais humanas e de rato mostraram que a MDMA e a MDA não são directamente tóxicos, mas que os metabolitos HHA (α-MeDA), 5- (glutation-S-il)α-MeDA e 2,5-bis(glutation-S-il)α-MeDA são nefrotóxicos potentes (Carvalho et al. 2002b). Paradoxalmente, a citotoxicidade mais intensa foi detectada para os conjugados com a glutationa. A conjugação da glutationa com grupos electrófilos resulta normalmente na destoxificação e eliminação sob a forma de ácidos mercaptúricos. Neste caso, essa conjugação intensificou a toxicidade dos metabolitos da MDMA sobre as células renais (Carvalho et al. 2002b). 5-(glutation-S-il)-α-MeDA 2,5-bis(glutation-S-il)α-MeDA Figura 10 - Metabolitos resultantes da conjugação com a glutationa. A redução da viabilidade celular deve-se à acção pro-oxidante destes metabolitos. Tal como já foi descrito, os catecóis iniciam o ciclo redox com a formação de espécies reactivas de oxigénio. Em primeiro lugar forma-se o anião superóxido (O2.-), seguido do peróxido de hidrogénio (H2O2) e por fim forma-se o radical hidroxilo (OH.). O anião superóxido sofre dismutação espontânea ou mediada pela superóxido dismutase formando peróxido de hidrogénio. Além disso, o anião superóxido também reage com o monóxido de azoto para formar peroxinitrito (ONNO-) que é um citotóxico potente. Após a redução do Fe3+ a Fe2+ pelo radical superóxido, o Fe2+ reage com o peróxido de hidrogénio para dar origem ao radical hidroxilo que reage com macromoléculas essenciais ao funcionamento celular (Carvalho et al. 2002b). O metabolito HHA (αMeDA) pode sofrer polimerização oxidativa originando produtos diméricos e poliméricos. A presença de pigmentos semelhantes a melanina nas culturas tratadas com α-MeDA confirma esse processo (Carvalho et al. 2002b). Capítulo II – MDMA - Revisão Geral________________________________________ 60 Em geral, a nefrotoxicidade dos metabolitos conjugados com glutationa pode ser aumentada devido à elevada actividade renal da γ-glutamil transpeptidase (γ-GT). Esta enzima, localizada na membrana das células epiteliais dos túbulos proximais, leva à formação de dipéptidos cisteinilglicina. Os dipéptidos são substratos das dipeptidases que também estão presentes em grande quantidade na membrana das células epiteliais dos túbulos proximais. O conjugado de cisteína resultante é transportado para o interior da célula através dos transportadores de aminoácidos. Aí a hidroquinona pode ser oxidada a quinona entrando em ciclo redox (Bolton et al. 2000). No caso específico do metabolito 5-(glutation-S-il)α-MeDA este mecanismo parece funcionar no sentido da destoxificação (Figura 11). Após a hidrólise mediada pela γ-GT e a subsequente clivagem mediada pela dipeptidase ocorre a ciclização do conjugado de cisteína. Nesta reacção, o grupo amino cisteinil condensa com o grupo carbonilo da quinona originando um composto do tipo benzotiazolilo. Esta reacção elimina a função quinona responsável pela reactividade molecular, prevenindo assim a entrada em ciclo redox (Carvalho et al. 2002b). Figura 11 - Via de destoxificação do conjugado com a glutationa: 5-(glutation-S-il)α-MeDA. A hidrólise mediada pela γ-GT e a subsequente clivagem mediada pela dipeptidase formam um conjugado com cisteína. O grupo amino cisteinil condensa com o grupo carbonilo da quinona originando um composto do tipo benzotiazolil que é mais estável e menos tóxico (retirado de Carvalho et al. 2002b). ________________________________________ Capítulo II – MDMA - Revisão Geral 61 2.5.5. Músculo Um dos efeitos mais conhecidos da MDMA é a rabdomiólise caracterizada por dores musculares, fraqueza muscular e urina acastanhada (Cunningham 1997). Potencialmente fatal, a incidência da rabdomiólise nos utilizadores de ‘‘ecstasy’’ é elevada (Henry et al. 1992). A rabdomiólise consiste na destruição do músculo esquelético com a libertação de enzimas musculares como a creatinina fosfocínase (CK) e a transaminase glutâmicaoxaloacética (GOT), libertação de ADP (adenosina difosfato), de mioglobina, potássio, fósforo, cálcio, creatinina e outros constituintes celulares (Lane & Phillips 2003). Existem três factores que contribuem para a rabdomiólise induzida pela MDMA: a hiperpirexia, o consumo aumentado de energia devido ao exercício físico intenso e as lesões acidentais (Cunningham 1997). No seu conjunto, estes factores vão contribuir para os fenómenos de falência renal e coagulopatia. A libertação de creatinina cínase e creatinina conjuntamente com a libertação de noradrenalina e vasopressina mediada pela MDMA podem, de forma sinérgica, desencadear agregação plaquetária (Bushfield et al. 1987; Filep & Rosenkranz 1987). Além disso, a libertação de um activador do plasminogénio muscular pode provocar aumento da fibrinólise que conduz a um estado de coagulação intravascular disseminada, que por sua vez contribui para o desenvolvimento da toxicidade renal (Terada et al. 1988). A mioglobulinúria contribui para a falência renal aguda. Esta resulta dos elevados níveis plasmáticos de mioglobina e da redução do pH urinário. A mioglobina precipita nos túbulos renais causando obstrução. A obstrução leva a lesão da parede epitelial dos túbulos renais o que inverte o sentido da difusão do filtrado. A hipoperfusão renal e a isquemia contribuem finalmente para a necrose renal (Cunningham 1997). Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA _______________________________________ 68 osmolaridade diminui até atingir o limiar osmótico, os níveis de AVP circulante baixam ocorrendo excreção de água sem electrólitos. Desta forma, o organismo evita a redução da osmolaridade plasmática, repondo o equilíbrio electrolítico (Verbalis et al. 2007). Quando a secreção de AVP não é inibida perante o estímulo hipo-osmolar, ocorre retenção de água e aumenta a possibilidade de ocorrência de hiponatrémia (Verbalis et al. 2007). Na síndrome de secreção inapropriada da AVP (SIADH) a secreção persistente de AVP, mesmo perante o estímulo hipo-osmolar, desencadeia retenção de água impedindo o restabelecimento do equilíbrio hidro-electrolítico. Os motivos para a SIADH são vários e incluem a ingestão de substâncias como a MDMA que modificam os mecanismos de controlo da secreção da AVP (Verbalis et al. 2007). 3.1.3. Classificação da Hiponatrémia A osmolaridade dos fluidos corporais é mantida dentro dos limites fisiológicos através da secreção da AVP e da ingestão de água. Embora existam variações individuais, na população em geral, e sob condições normais de hidratação, a osmolaridade varia entre os 280 e 295 mOsm/kg H2O (Verbalis et al. 2007). Apenas os solutos para os quais as membranas são impermeáveis contribuem para a osmolaridade efectiva. Estes são assim responsáveis pela criação de gradientes através das membranas, influenciando o movimento osmótico da água entre o compartimento extracelular e o compartimento intracelular. A concentração dos solutos que efectivamente contribuem para o movimento osmótico da água é importante para determinar se o estado de hipo-osmolaridade está presente. Como o sódio e os seus respectivos aniões (dos quais se destaca o cloreto) são os solutos que mais contribuem para o equilíbrio osmótico, pode-se dizer que, geralmente, a hipo-osmolaridade é sinónimo de hiponatrémia (Verbalis et al. 2007). No contexto da hiponatrémia desencadeada pela MDMA, importa referir os tipos de hiponatrémia hipotónica. De uma forma simplificada, assume-se que a hipoosmolaridade plasmática traduz hiponatrémia hipotónica que resulta do excesso de água em relação ao soluto ou que, pelo contrário, resulta da depleção de soluto (Diringer 1992). Normalmente, nos estados de hiponatrémia as duas situações estão presentes: excesso de água e depleção de soluto. A hiponatrémia hipotónica pode ser de três tipos: _______________________________________ Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA 69 Hiponatrémia Hipovolémica, Hiponatrémia Euvolémica e Hiponatrémia Hipervolémica (Verbalis et al. 2007). 3.1.3.1. Hiponatrémia Hipovolémica A hiponatrémia hipovolémica resulta da redução do volume de fluido extracelular e da hipovolémia. A depleção de volume pode ter várias causas tal como descrito na Tabela 2. Como o volume extracelular não pode ser medido, a depleção é normalmente diagnosticada clinicamente através da história clínica, exame físico e dos resultados laboratoriais. Nesta situação, a concentração urinária de sódio é usualmente inferior a 30 mmol/L (Adrogue & Madias 2000). Tabela 2 - Etiologias da hiponatrémia com origem na perda de sódio (adaptado de Verbalis, 2007). Perdas renais de sódio Perdas extra renais de sódio • Tratamentos com diuréticos • Síndrome da perda de sal cerebral (‘‘Cerebral salt wasting syndrome’’ ou ‘‘CSWS’’) • Deficiência mineralocorticóide • Nefropatia da perda de sal (‘‘Saltwasting nephropathy) • Bicarbonatúria, glicosúria, cetonúria • Perdas gastrointestinais o Vómito o Diarreia • Perdas pelo suor o Exercício físico de resistência (prolongado) • Outras perdas o Pancreatite o Lesões musculares o Queimaduras o Obstruções intestinais 3.1.3.2. Hiponatrémia Euvolémica Existem diversas situações de hipo-osmolaridade com volume extracelular normal ou com alterações tão pequenas que não são clinicamente detectáveis (Tabela 3). A maior parte das situações de hiponatrémia euvolémica estão relacionadas com a SIADH. Clinicamente não existem sinais da alteração do volume extracelular e as concentrações urinárias de sódio estão aumentadas verificando-se progressivamente a diminuição da concentração do sódio plasmático à medida que a água ingerida é retida pela acção da Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA _______________________________________ 70 AVP. Nesta situação a concentração urinária é normalmente superior a 30 mmol/L. Por vezes, devido à depleção de sódio, esta concentração pode ser secundariamente baixa (Verbalis et al. 2007). 3.1.3.3. Hiponatrémia Hipervolémica A ocorrência de aumento de volume extracelular clinicamente detectável reflecte geralmente hipervolémia. Nesta situação a hipo-osmolaridade, sendo secundária a patologias associadas (Tabela 3), resulta da acumulação de água devido à redução da excreção desencadeada pela secreção de AVP (Nathan 2007). As concentrações urinárias de sódio são usualmente baixas, abaixo dos 30 mmol/L devido à activação do eixo renina-angiotensina-aldosterona que impede a excreção renal de sódio apesar do excesso de volume de líquidos. Tabela 3 - Etiologias da hiponatrémia com origem na diluição (adaptado de Verbalis, 2007). Excreção Renal de Água Diminuída Hiponatrémia Euvolémica • SIADH o Tumores o Distúrbios do Sistema Nervoso Central o Induzida por drogas (ex. MDMA) o Doenças pulmonares o SIDA o Exercício físico prolongado • Deficiência glucocorticoide • Hipotiroidismo Hiponatrémia Hipervolémica • Insuficiência Cardíaca congestiva • Cirrose • Síndroma nefrótico • Falha renal Ingestão Excessiva de Água • Polidipsia primária _______________________________________ Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA 71 3.2. Hiponatrémia desencadeada pela MDMA Existem na literatura vários relatos da ocorrência de hiponatrémia e edema cerebral após a utilização de MDMA. Esses casos clínicos estão resumidos na Tabela 4. Os efeitos adversos descritos são graves e potencialmente fatais (Henry et al. 1992; Holden & Jackson 1996; Maxwell et al. 1994; Parr et al. 1997). Todos os casos relatados ocorreram em jovens do sexo feminino, indicando uma possível predisposição deste género. Além disso, a ingestão excessiva de água parece ter contribuído para o agravamento da situação clínica. Em variadas situações clínicas descritas na literatura, na análise toxicológica apenas se detectou a presença de MDMA e seus metabolitos. A ausência de outras drogas permitiu avaliar e confirmar a contribuição da MDMA para o efeito de hiponatrémia (Holden & Jackson 1996; Maxwell et al. 1994; Parr et al. 1997). Os principais sintomas detectados estão de acordo com a SIADH, à excepção do edema que não acontece nesta síndrome (Henry et al. 1998; Holden & Jackson 1996; Parr et al. 1997). Os critérios que definem a SIADH são: hiponatrémia hipotónica, osmolaridade da urina superior ao valor adequado para a osmolaridade plasmática, natriurese aumentada, ausência de edema ou depleção de volume e função renal e supra-renal normais. Esta síndrome é causa relativamente comum da hiponatrémia e resulta do aumento aberrante ou sustentado dos níveis de AVP produzida pelo hipotálamo e libertada pela hipófise. A elevação da hormona AVP leva à retenção renal de água e expansão do fluido extracelular o que é compensado pelo aumento da excreção urinária de sódio (Na+). A retenção de água em simultâneo com excreção aumentada de sódio leva à hiponatrémia (Rai et al. 2006). A classificação da hiponatrémia desencadeada pela MDMA pode ser difícil já que, embora ocorra a sintomatologia da SIADH, tipicamente associada à hiponatrémia euvolémica, nos casos de ingestão de MDMA deve ser considerado o edema pois além da retenção de água mediada pela AVP pode haver ingestão excessiva de água. A hiponatrémia pode ainda ser agravada pela perda de sódio no suor devido à hipertermia desencadeada pela MDMA. A ocorrência de situações de hiponatrémia associadas à utilização de MDMA levou alguns autores a tentar estabelecer a relação entre os níveis plasmáticos da MDMA e os Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA _______________________________________ 72 níveis de AVP. Num estudo em humanos a administração de doses baixas de MDMA (40 mg) a indivíduos do sexo masculino provocou o aumento intenso e agudo do nível de vasopressina plasmática. Este ensaio mostrou um perfil de libertação totalmente aberrante da AVP quando comparado com a variação circadiana normal dos controlos (Forsling et al. 1998; Henry et al. 1998). Além disso, o estudo refere não haver correlação estatisticamente significativa entre a variação dos níveis plasmáticos da MDMA e da AVP (Henry et al. 1998). Esta falta de correlação foi mais tarde relacionada com a possibilidade de serem os metabolitos da MDMA os responsáveis pela libertação da AVP (Fallon et al. 2002; Forsling et al. 2001; Forsling et al. 2002). Forsling e colaboradores, nestes ensaios em humanos, detectaram mais tarde uma significativa correlação negativa entre as concentrações de MDMA e AVP uma hora após a administração. Esta correlação negativa mais uma vez mostrou a possibilidade de ser um metabolito, e não a MDMA, a provocar o aumento da AVP (Forsling et al. 2001). Estes resultados foram a base para que este grupo de trabalho realizasse um estudo para verificar a importância do metabolismo da MDMA na libertação da AVP e no desencadear da SIADH. Nesse contexto, foram realizadas experiências in vitro em hipotálamo isolado de rato. Além da MDMA foram testados os seus principais metabolitos (Figura 4): 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), N-metl-α-metildopamina (HHMA), α-metildopamina (HHA), 4-hidroxi-3-metoxianfetamina (HMA) e 4-hidroxi3-metoximetanfetamina (HMMA). Todos os compostos afectaram a libertação da vasopressina. Os metabolitos HMMA e HHA apresentam maior capacidade do que a MDMA para induzir a libertação de AVP. O metabolito HHMA apresentou menor actividade indutiva do que a HMMA e a HHA (Forsling et al. 2002). Este estudo, ao ser realizado em hipotálamo isolado de rato, permitiu excluir qualquer contribuição dos efeitos sistémicos provocados pela MDMA na libertação da AVP. Assim, os resultados obtidos mostram que a MDMA e os seus metabolitos actuam directamente no hipotálamo (Forsling et al. 2002). Os efeitos da MDMA no ser humano podem portanto resultar da acção directa da MDMA e seus metabolitos sobre o hipotálamo (Forsling et al. 2002). Tal como já foi referido, existem numerosos mecanismos capazes de desencadear a libertação de AVP. Mas não estão ainda estabelecidas as relações entre esses mecanismos, a acção da MDMA e a consequente libertação de AVP. Como a acção da MDMA resulta na estimulação do sistema serotonérgico, o mecanismo que mais provavelmente está envolvido é a regulação serotonérgica da secreção neuro-hormonal. _______________________________________ Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA 73 A activação de receptores serotonérgicos leva a aumentos dos níveis de AVP sistémica. A utilização de agonistas e antagonistas de selectividades conhecidas permitiu descobrir que os receptores 5-HT2C, 5-HT4 e 5-HT7 são importantes na regulação da secreção de AVP pela hipófise (Jørgensen et al. 2003b). Além da secreção, a serotonina também está envolvida na síntese da AVP. A síntese da AVP ocorre nos neurónios magnocelulares do núcleo hipotalâmico supraóptico e do núcleo hipotalâmico supraventricular. Verificou-se que a nível do núcleo hipotalâmico supraventricular a activação dos receptores 5-HT2 leva ao aumento do mRNA correspondente à vasopressina. Por outro lado, a síntese que ocorre no núcleo hipotalâmico supraóptico não depende da estimulação serotonérgica (Jørgensen et al. 2003a). Do que até agora foi exposto pode concluir-se que existem vários mecanismos que podem desencadear a hiponatrémia mediada pela MDMA e que tais mecanismos podem acontecer em simultâneo. Além disso, verificou-se a importância do metabolismo na indução da libertação da AVP pela MDMA. Finalmente, na literatura apenas estão descritas ocorrências de SIADH em mulheres. Estes pressupostos levam a questionar quais os factores que regulam a susceptibilidade individual ao aparecimento do SIADH. A contribuição do metabolismo da MDMA para a libertação de AVP destaca mais uma vez a importância das diferenças entre a capacidade metabólica individual. Como anteriormente se referiu, a transformação da MDMA em HHMA mediada pela isoenzima CYP2D6 do citocromo P450 pode influenciar a susceptibilidade individual para a libertação de AVP já que esta enzima apresenta polimorfismo genético existindo na população indivíduos com diferentes capacidades metabólicas (Bertilsson et al. 2002; Forsling et al. 2001; Lin et al. 1997). A formação do metabolito HMMA, que tem maior capacidade de induzir a libertação de AVP in vitro, depende da catecol-O-metiltransferase (COMT). A susceptibilidade individual também pode ser afectada pelo polimorfismo desta enzima (Forsling et al. 2002). De facto, na população humana, o polimorfismo genético da COMT apresenta uma distribuição trimodal onde se incluem: os indivíduos com baixa actividade enzimática (COMTLL), com actividade enzimática intermédia (COMTLH) e com alta actividade enzimática (COMTHH) (Männistö & Kaakkola 1999). Estudos com ratos fêmea mostraram que a sensibilidade do organismo à acção da AVP varia durante os ciclos reprodutivos (Forsling et al. 1996). A variação dos efeitos da AVP durante o ciclo menstrual também foi detectada em mulheres (Claybaugh et al. Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA _______________________________________ 74 2000). Assim, a variação da resposta à AVP associada a possíveis diferenças metabólicas e de género, podem ser a explicação para diferenças de susceptibilidade ao efeito de hiponatrémia desencadeado pela MDMA (Forsling et al. 2001). Tabela 4 - Resumo de Casos Clínicos de intoxicação com MDMA em que ocorreu hiponatrémia. F – feminino; Valores normais de sódio plasmático 135-145 mmol/L; Sódio plasmático <135 mmol/L é critério de hiponatrémia. Estudo Sexo (M/F) Idade (anos) Sintomas Sódio plasmático mmol/L Outras observações (Maxwell et al. 1994) – Caso 1 F 17 Tremuras epiletiformes, confusão mental, incontinência urinária, resposta à dor mas com apatia 130 Presença de MDMA na urina Episódio não fatal Ausência de outras drogas psicoactivas (Maxwell et al. 1994) – Caso 2 F 17 Confusão mental, sem capacidade de comunicar, incontinência 118 Presença de MDMA no plasma e na urina Dança contínua durante o final da tarde Ingestão de 5L de água Ausência de outras drogas (Holden & Jackson 1996) F 20 Incontinência urinária, confusão mental, prostração, sem resposta à dor, apatia, pupilas dilatadas e reflexo à luz reduzido, edema cerebral 112 Presença de MDMA na urina Ingestão de grande quantidade de água Excesso de Argininavasopressina (4,5pmol/L) Episódio não fatal (Parr et al. 1997) F 15 Vómito, confusão mental, dificuldade respiratória, hipoventilação, apneia, taquicardia, coma, edema pulmonar e edema cerebral 125 Ingestão de grande quantidade de água Presença de MDMA na urina e no plasma Ausência de outras drogas Episódio Fatal (Matthai et al. 1996) - Caso 1 F 15 Consciência diminuída, coma, edema cerebral moderado 119 Presença de MDMA na urina Episódio não fatal (Matthai et al. 1996) - Caso 2 F 16 Coma 112 Presença de MDMA na urina Episódio não fatal (Ajaelo et al. 1998) F 19 Contracções involuntárias das pernas e braços, coma, edema cerebral 115 Ingestão de MDMA e cerveja Episódio não fatal _______________________________________ Capítulo III – Hiponatrémia e MDMA 75 3.3. Conclusões A ingestão de MDMA desencadeia a libertação de AVP. A alteração do padrão de libertação desta hormona leva à SIADH. Esta síndrome associada aos efeitos de hipertermia com ingestão excessiva de água e perda de sódio pelo suor, levam à hiponatrémia frequentemente associada a hipervolémia. A redução das concentrações do sódio plasmático pode desencadear finalmente o edema e a morte cerebral. Desta forma, os profissionais de saúde envolvidos na gestão deste tipo de intoxicações devem estar alertados para este fenómeno, podendo assim optar pelas atitudes terapêuticas mais adequadas. Capítulo IV – Validação do método de (GC-MS) _______________________________ 76 Capítulo IV Validação do método de Cromatografia Gasosa com Detecção por Espectrometria de Massa (GC-MS/MS) para a quantificação simultânea da MDMA e dos seus metabolitos MDA, HMA e HMMA em plasma e urina _____________________________ Capítulo IV – Validação do método de GC-MS/MS 77 Capítulo IV – Validação do método de (GC-MS) _______________________________ 84 interno foram: PI (7,0 min); HMA (7,5 min); MDA (7,8 min); HMMA (8,2 min) e MDMA (8,7 min) (Figura 18). A identificação de cada analito nas amostras foi feita por comparação entre os tempos de retenção dos compostos puros com os compostos das amostras injectados nas mesmas condições cromatográficas. Para cada pico cromatográfico foi obtido o respectivo espectro de massa. Tabela 5 - Estrutura dos analitos e do padrão interno derivatizados, com proposta do padrão de fragmentação (Pizarro et al. 2002). Estrutura dos analitos e do padrão interno derivatizados Identificação MDMA N-TFA Padrão de fragmentação proposto. (Pizarro et al. 2002) MDA N-TFA Padrão de fragmentação proposto. (Pizarro et al. 2002) HMMA N-TFA, O-TFA Padrão de fragmentação proposto. (Pizarro et al. 2002) HMA N-TFA, O-TFA Padrão de fragmentação proposto. (Pizarro et al. 2002) 4-hidroxi-3-metoxibenzilamina Padrão Interno N-TFA, O-TFA Padrão de fragmentação proposto. _____________________________ Capítulo IV – Validação do método de GC-MS/MS 85 Tabela 6 - Iões seleccionados para a quantificação dos analitos por GC-MS/MS. Analito Iões seleccionados (m/z) Padrão Interno ou PI (4-hidroxi-3-metoxibenzilamina) 232 MDMA (3,4-metilenodioximetanfetamina) 135 162 MDA (3,4-metilenodioxianfetamina) 135 162 HMMA (4-hidroxi-3-metoximetanfetamina) 154 260 HMA (4-hidroxi-3-metoxianfetamina) 140 260 Figura 13 - Espectro de massa do derivado N-TFA da MDMA. Capítulo IV – Validação do método de (GC-MS) _______________________________ 86 Figura 14 - Espectro de massa do derivado N-TFA da MDA. Figura 15 - Espectro de massa do derivado N-TFA e O-TFA da HMMA. _____________________________ Capítulo IV – Validação do método de GC-MS/MS 87 Figura 16 - Espectro de massa do derivado N-TFA e O-TFA da HMA. Figura 17 - Espectro de massa do derivado N-TFA e O-TFA da 4-hidroxi-3-metoxibenzilamina. Capítulo IV – Validação do método de (GC-MS) _______________________________ 88 Figura 18 – Cromatograma de uma amostra de plasma obtido em modo ''Selected Ion'' com os seguintes iões: m/z=135, m/z=162 para a MDMA e MDA; m/z=140, m/z=260 para a HMA; m/z=154, m/z=260 para a HMMA; m/z=232 para o PI. Os tempos de retenção foram: PI (7,0 min); HMA (7,5 min); MDA (7,8 min); HMMA (8,2min) e MDMA (8,7 min). 4.3. Validação do Método A validação do método consistiu na avaliação da linearidade através da preparação das curvas de calibração, na avaliação do limite de quantificação (LOQ ou ‘‘Limit of Quantification’’), na avaliação do limite de detecção (LOD ou “Limit of Detection”), na avaliação da precisão, da exactidão e do rendimento do processo de extracção. 4.3.1. Calibração Foram preparadas curvas de calibração em plasma e urina. Cada um dos analitos foi adicionado a plasma e urina sem analitos (brancos), a partir das soluções concentradas previamente preparadas. As concentrações finais nas amostras foram: 0, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000 e 10000 ng/mL. Foi também adicionado a todas as amostras o PI na concentração final de 2500 ng/mL na urina e 5000 ng/mL no plasma. _____________________________ Capítulo IV – Validação do método de GC-MS/MS 89 4.3.1.1. Técnica para a preparação das amostras para as curvas de calibração 4.3.1.1.1. Urina • Prepararam-se alíquotas de 1 mL de urina. • A cada alíquota adicionaram-se 10 μL da solução de concentração adequada do respectivo analito, de forma a obter as concentrações finais referidas. • A cada uma das amostras assim preparadas adicionaram-se 10 μL de uma solução de PI com concentração de 250 μg/mL. • As amostras assim preparadas foram submetidas a hidrólise enzimática, extracção por SPE e derivatização, tal como foi anteriormente descrito. 4.3.1.1.2. Plasma • Prepararam-se alíquotas de 500 μL de urina. • A cada alíquota adicionaram-se 10 μL da solução de concentração adequada do respectivo analito, de forma a obter as concentrações finais referidas. • A cada uma das amostras assim preparadas adicionaram-se 10 μL de uma solução de PI com concentração de 250 μg/mL. • As amostras assim preparadas foram submetidas a hidrólise enzimática, extracção por SPE e derivatização, tal como foi anteriormente descrito. 4.3.2. Precisão Foi determinada a precisão intra-dia do método de GC-MS/MS para todos os analitos através de cinco quantificações de uma mesma amostra, ao longo de um dia. Na urina, a concentração das amostras testadas foi de 500 ng/mL. No plasma a concentração das amostras foi de 200 ng/mL. Foi também avaliada a precisão do método de extracção, executando a extracção de cinco alíquotas da mesma amostra. A concentração das alíquotas de urina foi de 200 Capítulo IV – Validação do método de (GC-MS) _______________________________ 90 ng/mL e a concentração das alíquotas de plasma foi de 500 ng/mL para todos os analitos. A precisão inter-dia foi avaliada para todos os analitos em três amostras com concentrações diferentes fazendo uma determinação por dia, durante três dias. Na urina, foram testadas as concentrações de 50, 100 e 500 ng/mL. No plasma, foram testadas concentrações de 50, 100 e 200 ng/mL. Todos os extractos foram injectados em duplicado. 4.3.3. Exactidão A exactidão foi determinada para todos os analitos em três amostras de concentrações distintas. Nas amostras de urina as concentrações testadas foram de 50, 100 e 500 ng/mL. Nas amostras de plasma as concentrações testadas foram de 50, 100 e 200 ng/mL. Todos os extractos foram injectados em duplicado. 4.3.4. Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) Os limites de detecção foram determinados com amostras de plasma e urina cuja concentração originou um sinal 3 vezes superior ao ruído. Os limites de quantificação foram determinados com amostras de plasma e urina cuja concentração originou um sinal 10 vezes superior ao ruído. Os limites foram determinados injectando 10 vezes a amostra cuja concentração correspondeu aos critérios referidos. Foram utilizados dois modos de aquisição de sinal: “Full Scan Mode” com aquisição total de iões (TIC ou “total ion current”) com razão m/z entre 50-600 unidades de massa atómica (uma) e “Full Scan Mode” com “μSYS” em que os iões a fragmentar são previamente seleccionados e só estes entram para a fonte de fragmentação, aumentando desta forma a sensibilidade da detecção. _____________________________ Capítulo IV – Validação do método de GC-MS/MS 91 4.3.5. Avaliação do Rendimento do Procedimento de Extracção O rendimento da extracção por SPE foi avaliado para todos os analitos testando três amostras fortificadas com concentrações distintas e avaliando as respectivas recuperações por comparação a extractos fortificados com os respectivos analitos em que o PI foi adicionado após a extracção. Nas amostras de plasma as concentrações testadas foram de 20, 50 e 800 ng/mL. Na urina apenas foi testada a concentração de 20 ng/mL. Todos os extractos foram injectados em duplicado. Capítulo IV – Validação do método de (GC-MS) _______________________________ 92 4.4. Resultados e Discussão A quantificação da MDMA e dos seus metabolitos no plasma e na urina, pelo método de GC-MS/MS descrito, foi validada. Um exemplo de cromatograma tipicamente observado, numa amostra de plasma, está representado na Figura 18. Os espectros obtidos para cada um dos analitos e PI derivatizados estão representados nas figuras Figura 13 - Figura 17. Para a realização dos cálculos foram determinadas as razões de áreas entre os picos dos analitos e o pico do PI: De acordo com os métodos de validação, foram obtidos os resultados que se seguem. 4.4.1. Curvas de Calibração e Linearidade As curvas de calibração do método de GC-MS/MS foram lineares para todos os analitos entre os 0-10000 ng/mL. Esta gama de linearidade foi observada para ambas as matrizes em estudo. Os coeficientes de correlação obtidos nas respectivas regressões lineares foram sempre superiores a 0,99 (Tabela 7). Tabela 7 - Estudo da linearidade. Curvas de Calibração e coeficientes de correlação obtidos. Estudo de linearidade Plasma Equação gama (ng/mL) r2 HMA y=0,005x+0,0022 0-10000 0,9944 MDA y=0,0004x+0,0074 0-10000 0,9983 HMMA y=0,0007x+0,0194 0-10000 0,9963 MDMA y=0,0004x-0,0139 0-10000 0,9995 Urina HMA y=0,0008x-0,0177 0-10000 0,9985 MDA y=0,0046x-0,0972 0-10000 0,9989 HMMA y=0,0021x-0,0778 0-10000 0,9933 MDMA y=0,0045x+0,263 0-10000 0,9996 _____________________________ Capítulo IV – Validação do método de GC-MS/MS 93 4.4.2. Precisão A precisão do método foi expressa como coeficiente de variação: A precisão intra-dia do método de GC-MS/MS foi inferior a 10% para todos os analitos e em ambas as matrizes (Tabela 8). A precisão do método extractivo também foi determinada, para todos os analitos e nas duas matrizes, tendo sido sempre inferior a 13% (Tabela 8). No que diz respeito à precisão inter-dia foram obtidos valores abaixo dos 14% e dos 16% para a urina e para o plasma respectivamente (Tabela 9). Tabela 8 - Precisão intra-dia do método de GC-MS/MS e do método de extracção para as duas matrizes. A concentração das amostras de plasma foi de 200 ng/mL, a concentração das amostras de urina foi de 500 ng/mL Precisão (%) Plasma (200 ng/mL) HMA MDA HMMA MDMA Método GC-MS/MS 3,96 4,12 5,00 4,87 Método de Extracção 3,10 9,92 4,96 9,88 Urina (500 ng/mL) Método GC-MS/MS 6,81 8,76 9,65 3,57 Método de Extracção 4,77 12,37 9,11 11,03 Precisão (%) = Desvio Padrão/Média (n=5) Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 100 __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 101 5. CAPÍTULO V - Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 5.1. Introdução Tal como já foi anteriormente referido, a MDMA é capaz de desencadear a secreção de AVP em humanos (Henry et al. 1998). Estudos in vitro demonstraram também que para além da MDMA, alguns dos seus metabolitos têm a capacidade de desencadear a libertação de AVP (Forsling et al. 2002). Até ao presente momento não existem descritos na literatura estudos sobre a indução da secreção de AVP in vivo em animais de experiência. Tal conhecimento será útil para estudos futuros sobre estados de hiponatrémia e desequilíbrio hidro-electrolítico causados pela MDMA. Neste trabalho foi estudada a capacidade da MDMA estimular a secreção da AVP no rato. Foram também avaliadas as possíveis correlações entre a secreção da AVP e os níveis plasmáticos e urinários de MDMA, MDA, HMA e HMMA. O principal objectivo deste estudo foi elucidar a acção da MDMA na libertação da AVP num modelo animal, in vivo. Pretendeu-se também verificar a influência do metabolismo na libertação da AVP in vivo e observar quais as consequências desse mesmo efeito. 5.2. Materiais e Métodos 5.2.1. Materiais utilizados Todos os reagentes usados nas experiências tinham elevado grau de pureza. O inibidor de proteases fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) foi obtido da Sigma Aldrich (Saint Louis, Missouri). O cloridrato de (±)3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) foi obtido por extracção de comprimidos apreendidos pela Policia Judiciária Portuguesa. O sal assim obtido foi caracterizado por ressonância magnética nuclear e por espectrometria de massa. Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 102 5.2.2. Animais Foram utilizados ratos Wistar “outbread”, machos e fêmeas, com pesos compreendidos entre 250 e 300 g. Estes animais foram adquiridos ao laboratório Charles River (Barcelona, Espanha). Os animais foram aclimatizados em gaiolas de polietileno de rede metálica no topo e acamadas com aparas de madeira. A temperatura do biotério foi mantida a 22±2 ºC, humidade entre 40 e 60% e ciclos dia/noite de 12/12 horas. Os animais tiveram livre acesso a água e alimento até ao início das experiências. Nas experiências com duração de 1 hora o alimento foi retirado antes da administração de MDMA ou NaCl 0,9%. Os ensaios tiveram sempre início às 16 h. As experiências foram realizadas de acordo com as orientações para a experimentação animal declaradas pela União Europeia (Convenção Europeia para a protecção de animais vertebrados usados com objectivos experimentais e científicos de 1986, acrescentada da adenda de 1998 da respectiva convenção). 5.2.2.1. Protocolo experimental para animais sacrificados uma hora após a administração de MDMA 1. Seis animais seleccionados foram pesados e colocados separadamente em gaiolas de polietileno com rede metálica no topo. 2. O alimento foi retirado e os animais passaram a ter apenas acesso a água ad libitum. 3. As gaiolas foram alinhadas e devidamente identificadas, alternando animais controlo com animais tratados com MDMA. 4. Com intervalos de 10 minutos os animais foram injectados com uma solução de MDMA preparada em NaCl 0,9% ou com solução de NaCl 0,9%, por via intraperitonial (i.p.). Para os animais tratados com MDMA o volume injectado foi ajustado ao peso de forma a administrar a dose de 20 mg/kg. 5. Uma hora após a injecção os animais foram anestesiados com éter. 6. Através da utilização de um cateter foi puncionada a veia cava inferior (Figura 19). __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 103 7. O primeiro mililitro de sangue foi rapidamente recolhido e transferido para um tubo contendo EDTA. 8. O restante sangue foi recolhido para uma seringa heparinizada e transferido para tubos contendo EDTA. 9. As amostras foram centrifugadas a 1600g durante 15 min a 4 ºC. 10. O plasma assim obtido foi transferido para eppendorf e guardado a -80 ºC até à execução de ensaios posteriores. Nota: os tubos para recolha das amostras foram mantidos em gelo até ao armazenamento final. O estudo foi conduzido em diversas séries de ensaios. Os ensaios realizados com machos e com fêmeas ocorreram sempre em separado. 5.2.2.2. Protocolo experimental para animais sacrificados 24h após a administração da MDMA 1. Seis animais seleccionados foram pesados e colocados separadamente em gaiolas metabólicas da Tecniplast (Buguggiate, Itália). 2. As gaiolas foram alinhadas e devidamente identificadas, alternando animais controlo com animais tratados com MDMA. 3. Com intervalos de 10 minutos os animais foram injectados com uma solução de MDMA preparada em NaCl 0,9% ou com solução da NaCl 0,9%, por via intraperitonial (i.p.). Para os animais tratados com MDMA o volume injectado foi ajustado ao peso de forma a administrar a dose de 20 mg/kg. 4. Os recipientes de recolha da urina foram mantidos em gelo e com 200 μL de PMSF 100 mM. 5. Vinte e quatro horas após a injecção, as urinas foram recolhidas e os animais foram anestesiados com éter. 6. Através da utilização de um cateter foi puncionada a veia cava inferior (Figura 19). 7. O primeiro mililitro de sangue foi rapidamente recolhido e transferido para um tubo contendo EDTA. Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 104 8. O restante sangue foi recolhido para uma seringa heparinizada e transferido para tubos contendo EDTA. 9. As amostras de sangue foram centrifugadas a 1600g durante 15 min a 4 ºC. 10. O plasma assim obtido foi transferido para eppendorf e guardado a -80 ºC até à execução de ensaios posteriores. 11. As amostras de urina foram centrifugadas a 1600g durante 15 min a 4 ºC. Finalmente foram decantadas e guardadas a -80 ºC até à execução de ensaios posteriores. Nota: • Os tubos para recolha das amostras foram mantidos em gelo até ao armazenamento final. Figura 19 - Sistema circulatório venoso do rato. A punção para recolha de amostra foi realizada na veia cava inferior. 5.2.2.3. Administração da MDMA As soluções de MDMA foram preparadas em solução de NaCl 0,9% (m/v) e injectadas intraperitonialmente num volume de 1 mL/kg. A MDMA foi administrada na dose de 20 mg/kg. Os animais controlo foram injectados com solução isotónica de NaCl 0,9% (m/v). __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 105 5.2.2.4. Técnica de colheita de sangue A técnica de colheita de sangue venoso anteriormente descrita foi adaptada tendo em consideração as possíveis variações dos níveis de AVP consequentes à hipovolémia desencadeada durante a recolha. Com o objectivo de evitar estas variações foi utilizada uma técnica de recolha sequencial do sangue venoso. Para tal, com a ajuda de um cateter, fez-se a recolha rápida e sem ocorrência de hemorragia do primeiro mililitro de sangue e de seguida procedeu-se à recolha do restante sangue. Deste modo obtiveram-se duas amostras, a que foi recolhida em primeiro lugar foi utilizada exclusivamente para a quantificação da AVP e a que foi recolhida em segundo lugar foi utilizada exclusivamente para a quantificação dos metabolitos. 5.2.3. Quantificação da AVP A quantificação da AVP foi realizada em amostras de plasma e de urina. Para as séries de ensaios em que os animais foram sacrificados 1h após a administração da MDMA ou NaCl 0,9% (m/v) a AVP foi quantificada no plasma. Nos animais sacrificados 24h após a administração da MDMA a AVP foi quantificada no plasma e na urina recolhida ao longo desse período. 5.2.3.1. Princípio do método Neste trabalho, a quantificação da vasopressina foi executada através de um Imunoensaio Enzimático (EIA), que existe em “Kit” comercialmente disponível (Assay Designs, Michigan). Este método de quantificação é um imunoensaio competitivo. Para tal, é utilizado um anticorpo policlonal específico para a vasopressina. Este anticorpo tem capacidade para se ligar competitivamente à AVP das amostras, do padrão e à AVP covalentemente associada a uma molécula de fostatase alcalina. Uma vez aplicados nos poços da placa, as moléculas de AVP dos padrões, das amostras e da fosfatase-AVP ligam-se competitivamente ao anticorpo durante uma Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 106 incubação a 4 ºC. Os complexos assim formados fixam-se nos poços da placa, já que estes estão revestidos com anticorpos anti-IgG. Após a lavagem dos poços, são adicionados os reagentes para que a reacção colorimétrica, catalisada pela fostatase alcalina, ocorra. Deste modo, a intensidade da cor amarela formada é inversamente proporcional à quantidade de AVP existente na amostra ou padrão. A intensidade da cor deve ser medida num leitor de placas. Antes de executar a técnica, as amostras de plasma e urina foram sujeitas a um processo de extracção em que se removem as proteínas e possíveis interferentes lipófilos. 5.2.3.2. Técnica de extracção • Prepararam-se alíquotas de 200 μL de amostra. • Foram adicionados 400 μL de acetona refrigerada a 0 ºC. Agitou-se em vortex. • O sobrenadante foi transferido para novo tubo e o resíduo rejeitado. • Foram adicionados 1400 μL de éter de petróleo refrigerado a 0 ºC. Agitou-se em vortex. • A camada etérea superior foi rejeitada e a fase aquosa foi cuidadosamente transferida para um tubo de vidro. • Evaporou-se à secura sob corrente de azoto. • Reconstituiu-se o resíduo com 120 μL de “Assay Buffer” 5.2.3.3. Técnica para a quantificação (Tabela 13) • Pipetaram-se 100 μL de “Assay Buffer” (tampão de ensaio) para o poço NSB (ligação não específica) e 100 μL para o poço B0 (Padrão 0 pg/mL de AVP). • Pipetaram-se 100 μL de cada padrão de AVP para os respectivos poços. • Pipetaram-se 100 μL de cada amostra para os respectivos poços. • Pipetaram-se 50 μL de “Assay Buffer” para o poço NSB. • Pipetaram-se 50 μL do conjugado azul (complexo fosfatase-AVP) para cada poço à excepção do poço TA (actividade total) e Branco. __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 107 • Pipetaram-se 50 μL do anticorpo anti-AVP para todos os poços à excepção do poço TA, Branco e NSB. • A placa foi selada e misturou-se cuidadosamente. A incubação durou 24h a 4 ºC. • Cada poço foi lavado três vezes com 400 μL de solução de lavagem. • A placa foi cuidadosamente seca. • Pipetaram-se 5 μL do conjugado azul ao poço TA. • Pipetaram-se 200 μL da solução de p-nitrofenil fosfato (pNpp) para todos os poços (substrato para a fosfatase alcalina). • A mistura foi incubada a 37 ºC durante 1h, sem agitação. • Para terminar a reacção, adicionaram-se 50 μL de solução STOP a cada poço (solução aquosa de fosfato trisódico). • A leitura das densidades ópticas (DO) a 405 nm com correcção a 570 nm foi realizada imediatamente no leitor de placas (Ceres 9000). Tabela 13 - Resumo do procedimento experimental para a quantificação da AVP. Poço Tampão de ensaio Padrões ou amostra Conjugado Azul anticorpo Anti-AVP Incubação 24h a 4 ºC e Lavagens 3×400μL. Conjugado Azul pNpp Solução STOP B0 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL P1 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL P2 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL P3 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL P4 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL P5 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL P6 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL P7 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL Amostra 100μL 50μL 50μL 200μL 50μL NSB 100+50μL 50μL 200μL 50μL Branco 200μL 50μL TA 5μL 200μL 50μL Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 108 5.2.3.4. Cálculos Os valores das concentrações das amostras foram calculados a partir da curva de calibração. A curva de calibração foi obtida através de uma curva logística de 4 parâmetros executada no programa GraphPad Prism 4 (GraphPad, Califórnia). 1. Os valores das DO a 405 nm foram corrigidos subtraindo-lhes os valores obtidos a 570 nm. 2. Foi calculada a percentagem de ligação da AVP-Fosfatase aos anticorpos anti-AVP de acordo com a seguinte fórmula: 3. Os valores são calculados automaticamente em função da curva obtida (Figura 20). Todas as amostras foram testadas em duplicado. Os valores de DO resultam da média de duas leituras. Para cada ensaio foi realizada uma curva de calibração. Curva de Calibração para a Quantificação da AVP 0 1 2 3 4 0 25 50 75 100 Padrões log [Concentração (pg/ml)] % de ligação Figura 20 - Curva de calibração para a quantificação da AVP. __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 109 5.2.4. Quantificação da MDMA e dos metabolitos MDA, HMA e HMMA A MDMA e os metabolitos MDA, HMA e HMMA foram quantificados no plasma e na urina recorrendo ao método de GC-MS/MS validado e descrito anteriormente no Capítulo IV. 5.2.5. Análise estatística Os resultados apresentam-se sob a forma de média ± erro padrão, para o número de animais testados em cada experiência. A análise estatística das concentrações de AVP foi realizada recorrendo ao teste de tStudent para amostras não emparelhadas. As diferenças foram consideradas significativas para P≤0,05. As correlações entre as concentrações de AVP e as concentrações de MDMA, MDA, HMA e HMMA foram estabelecidas através do coeficiente de correlação de Pearson. As correlações foram consideradas estatisticamente significativas para P≤0,05. Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 116 5.3.5. Efeitos da MDMA na excreção de urina em fêmeas 24h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0,9% O volume médio de urina excretada durante 24 horas foi de 41 ± 6 mL para os animais controlo, injectados com NaCl 0,9%. Nos animais injectados com MDMA (20 mg/kg) o volume médio de urina excretada foi de 13 ± 3 mL (Tabela 18). A comparação das médias mostrou que existem diferenças significativas na excreção urinária dos animais tratados em relação aos controlos (P<0,01) (Figura 25). Tabela 18 – Volume de urina excretada em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. Animais ♀T24h Volume de urina excretada (mL) CONTROLO MDMA 20 mg/kg 1 54 12 2 36 8 3 26 6 4 30 26 5 57 20 6 8 Média=41 ± 6 n=5 Média=13 ± 3 n=6 (Média ± Erro Padrão) __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 117 Quantidade de urina excretada CONTROLO MDMA 20 mg/kg 0 10 20 30 40 50 ** Volume de Urina (ml) Figura 25 - Efeito da MDMA sobre a excreção de urina em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração. Os valores são apresentados sob a forma de média±erro padrão (**P≤0,01 vs controlo). 5.3.6. Efeitos da MDMA na razão entre o volume de água ingerida e o volume de urina excretada em fêmeas 24h após a administração de MDMA (20 mg/kg) ou NaCl 0,9% A média das razões entre o volume de água ingerida e o volume de urina excretada para os animais controlo foi de 1,43 ± 0,09. Nos animais injectados com MDMA (20 mg/kg) a média das razões foi de 3,12 ± 0,28 (Tabela 19). A comparação das médias mostrou que existem diferenças significativas na razão entre o volume de água ingerida e o volume de urina excretada dos animais tratados em relação aos controlos (P<0,001) (Figura 26). Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 118 Tabela 19 – Razão entre o volume de água ingerida e o volume de urina excretada em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração de MDMA ou NaCl 0,9%. Animais ♀T24h Razão VH2O ingerida/VUrina CONTROLO MDMA 20 mg/kg 1 1,39 3,33 2 1,39 3,75 3 1,54 3,33 4 1,67 2,31 5 1,14 2,25 6 3,75 Média=1,43 ± 0,09 n=5 Média=3,12 ± 0,28 n=6 (Média ± Erro Padrão) Razão V H2O /V Urina do ensaio em fêmeas 24h CONTROLO MDMA 20 mg/kg 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 *** Razão V H2O /V Urina Figura 26 - Efeito da MDMA sobre a excreção de urina em fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração. Os valores são apresentados como a razão entre o volume de água ingerido e o volume de urina excretada, sob a forma de média±erro padrão (***P≤0,001 vs controlo). __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 119 5.3.7. Estudo das correlações entre concentrações de AVP e as concentrações de MDMA, MDA, HMA e HMMA 5.3.7.1. Correlações entre as concentrações plasmáticas de AVP e as concentrações plasmáticas de MDMA, MDA, HMA e HMMA quantificadas 1h após a administração da MDMA (20 mg/kg) em fêmeas. Não foram estabelecidas correlações estatisticamente significativas entre as concentrações de MDMA e dos metabolitos e a concentração plasmática de AVP, 1 hora após a administração de MDMA (20 mg/kg) a fêmeas (Tabela 20). Tabela 20Correlação entre as concentrações plasmáticas de AVP e as concentrações plasmáticas da MDMA, MDA, HMA e HMMA para as fêmeas Wistar sacrificadas 1h após a administração da MDMA (20 mg/kg). ♀T1h AVP (pg/mL) MDMA (ng/mL) MDA (ng/mL) HMA (ng/mL) HMMA (ng/mL) 1 45,863282,98 276,83 26,60920,92 2 160,043170,71 275,90 29,39703,07 3 5,162477,67 615,24 32,40498,90 4 4,731510,75 217,81 22,06257,51 5 48,023419,99 284,34 33,41928,55 6 27,661847,51 268,08 25,80371,46 7 141,343351,03 157,26 22,66613,63 8 81,852757,07 202,28 24,41781,27 9 24,052071,03 466,15 25,79515,09 10 15,132530,91 401,77 33,35767,81 11 38,871996,26 277,43 26,14547,87 12 182,222485,98 369,55 32,04727,46 13 62,192511,13 322,16 27,89778,49 n=13 64,39 ± 16,60 2570±169,5 647,1±56,14 27,84±1,095 318,1±33,78 (Média ± Erro Padrão) Coeficiente de Pearson r 0,4918 0,3347 0,04273 -0,3418 Valor de P vs AVP 0,0878 0,2636 0,8898 0,2530 Intervalo de Confiança de 95% -0,081 a 0,82 -0,75 a 0,26 -0,52 a 0,58 -0,27 a 0,75 Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 120 5.3.7.2. Correlações entre as concentrações urinárias de AVP e as concentrações urinárias de MDMA, MDA, HMA e HMMA para as fêmeas sacrificadas 24h após a administração da MDMA (20 mg/kg). Foram estabelecidas correlações estatisticamente significativas entre as concentrações da MDMA e dos metabolitos e a concentração urinária de AVP, 24 horas após a administração de MDMA (20 mg/kg) a fêmeas. Entre a AVP e a MDMA, MDA, HMA foram estabelecidas correlações positivas (P<0,05). Para o metabolito HMMA também foi estabelecida correlação positiva com significado estatístico (P<0,01). O coeficiente de Pearson mais elevado foi obtido para o metabolito HMMA (Tabela 21). Tabela 21 - Correlação entre as concentrações urinárias de AVP e as concentrações urinárias da MDMA, MDA, HMA e HMMA para as fêmeas Wistar sacrificadas 24h após a administração da MDMA (20 mg/kg). ♀T24h AVP (pg/mL) MDMA (ng/mL) MDA (ng/mL) HMA (ng/mL) HMMA (ng/mL) 1 137,77 141237,00 60590,26 10539,30 62092,34 2 128,31 316378,20 125569,10 21836,14 113701,90 3 203,95 304764,60 105909,50 18551,36 133655,40 4 26,26 45876,82 15941,66 1945,83 11763,83 5 51,05 55801,29 17257,21 2923,06 12555,45 6 61,53 70883,91 24471,61 3660,45 13117,69 n=6 101,5 ± 27,29 155824±50820 58290±19511 9909±3505 57814±22406 (Média ± Erro Padrão) Coeficiente de Pearson r 0,86 0,84 0,85 0,92 Valor de P vs AVP 0,028 (*) 0,038 (*) 0,033 (*) 0,0083 (**) Intervalo de Confiança de 95% 0,16 a 0,98 0,080 a 0,98 0,11 a 0,98 0,45 a 0,99 (**) P≤0,01 vs AVP (*) P≤0,05 vs AVP __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 121 5.4. Discussão 5.4.1. Efeito da MDMA na concentração plasmática da AVP (1h após a administração) Com a execução deste trabalho foi possível verificar que a administração de MDMA a ratos desencadeia um aumento da secreção da AVP. Tal observação foi feita quer para animais machos, quer para animais fêmeas. Em ambos os géneros foram detectadas diferenças estatisticamente significativas entre os níveis plasmáticos de AVP nos animais controlo e nos animais administrados com MDMA (20 mg/kg). Tais diferenças foram detectadas uma hora após a administração da MDMA. Estes resultados estão de acordo com as expectativas existentes em relação à acção da MDMA na secreção de AVP. Por um lado, havia já sido descrito na literatura aumentos dos níveis séricos da AVP em humanos do sexo masculino (Henry et al. 1998), por outro, estão também descritos na literatura ensaios in vitro em que se demonstrou a acção directa da MDMA e de alguns dos seus metabolitos sobre o hipotálamo isolado de rato desencadeando secreção de AVP (Forsling et al. 2002). À semelhança dos resultados experimentais descritos na literatura, em que o aumento da AVP foi detectado em seres humanos do sexo masculino (Forsling et al. 2001), também neste trabalho foi detectado um aumento da secreção da AVP em ratos do sexo masculino. De facto, estas evidências experimentais demonstram que a secreção de AVP induzida pela MDMA é independente do género. No entanto, a modulação da secreção de AVP para a manutenção do equilíbrio hidro-electrolítico é influenciada pelas hormonas sexuais femininas e este facto pode contribuir para a maior incidência da hiponatrémia nas utilizadoras recreativas da ecstasy (Somponpun 2007). Os fenómenos de hiponatrémia em mulheres poderão estar associados a diferenças de género na susceptibilidade à acção da AVP. Além disso, também existem comportamentos típicos dos utilizadores da MDMA que poderão facilitar a hiponatrémia, nomeadamente a ingestão exagerada de água e o exercício físico intenso. Estes comportamentos potenciam a hipertermia e a perda de sódio no suor (Verbalis et al. 2007). No género feminino existe também o factor hormonal que, provavelmente, potencia as perdas de sódio e aumenta a ingestão de água. Por exemplo, durante a fase da Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 122 ovulação a temperatura corporal da mulher aumenta, podendo, na presença da MDMA, estar agravado o mecanismo de perda de sódio pelo suor e levar a uma ingestão excessiva de água. Com este trabalho foi pela primeira vez demonstrado um aumento in vivo da secreção de AVP em animais de experiência sujeitos a tratamento com MDMA. O modelo experimental descrito poderá ser utilizado para compreender melhor a maior susceptibilidade à hiponatrémia do género feminino. A influência das hormonas femininas e a fase do ciclo reprodutivo na secreção da AVP e no controlo do equilíbrio hidro-electrolítico são apenas dois exemplos de estudos a fazer que permitirão compreender melhor a hiponatrémia desencadeada pela MDMA. 5.4.2. Efeito da MDMA na concentração plasmática da AVP (24h após a administração) O efeito na secreção da AVP 24h após a administração da MDMA foi avaliado apenas em ratos fêmeas. Neste estudo não foram detectadas diferenças significativas nos níveis plasmáticos de AVP entre os animais tratados e os controlos. De facto os estudos em humanos mostram que a elevação dos níveis plasmáticos da AVP após a administração da MDMA, atingem o seu máximo 1 a 2 horas após a administração (Henry et al. 1998). O resultado obtido neste ensaio está de acordo com estas observações pois, embora possam existir diferenças na secreção de AVP entre o rato e o humano, seria improvável detectar, no rato, o aumento da secreção da AVP induzida pela MDMA 24 horas após a administração. A comparação entre as concentrações plasmáticas de AVP obtidas mostra que os animais tratados com MDMA apresentam uma tendência para terem concentrações plasmáticas de AVP inferiores 24 horas após a administração. Este fenómeno pode estar relacionado com os efeitos da MDMA, podendo ter ocorrido depleção das reservas de AVP e ou supressão da sua síntese. Verificou-se também que os dois grupos de animais apresentavam concentrações plasmáticas de AVP tendencialmente mais elevadas do que o observado nos controlos do mesmo género sacrificados 1 hora após a administração. De facto, sabe-se que as __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 123 gaiolas metabólicas são um factor de stress para os animais, podendo ter sido esse o motivo para concentrações plasmáticas de AVP tendencialmente mais elevadas. Neste trabalho foi também avaliado o efeito da MDMA na quantidade de AVP excretada na urina no final das 24 horas. A quantificação da AVP nas amostras de urina mostrou que os animais injectados com MDMA apresentam concentrações superiores de AVP do que os controlos. Este resultado mostra que embora não seja possível detectar aumentos plasmáticos de AVP 24 horas após o tratamento com MDMA, é possível detectar o aumento da excreção de AVP induzida pela MDMA. 5.4.3. Efeito da MDMA na excreção de urina (24h após a administração) Os resultados deste estudo mostram que os animais tratados com MDMA excretam menos urina do que os controlos. Ao comparar a razão entre a água ingerida e a urina excretada, verifica-se que existe menor quantidade de urina excretada relativamente à água ingerida pelos ratos tratados com MDMA. Estes resultados demonstram claramente uma acção antidiurética e esta acção provavelmente estará relacionada com os aumentos na secreção de AVP anteriormente detectados. A retenção de água aqui detectada poderá ser a causa da hiponatrémia descrita nos humanos (Ajaelo et al. 1998; Matthai et al. 1996; Maxwell et al. 1994). A acção da MDMA leva aos sintomas que caracterizam a SIADH. A acompanhar as alterações da secreção da AVP temos, tal como já foi referido, comportamentos que facilitam a hiponatrémia (Verbalis et al. 2007). 5.4.4. Correlações entre as concentrações de AVP e as concentrações de MDMA, MDA, HMA e HMMA em fêmeas Com este trabalho foi feita a avaliação das correlações entre as concentrações plasmáticas de AVP e dos metabolitos em estudo uma hora depois da administração da MDMA a fêmeas. Ao contrário do que seria de esperar, não se obtiveram correlações estatisticamente significativas entre as concentrações de AVP e de MDMA ou de qualquer outro metabolito. De facto, em humanos, já havia sido descrito na literatura a Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA __________________ 124 existência de correlações inversas entre a concentração de MDMA e a concentração de AVP. Nesse estudo, Forsling e colaboradores demonstraram que, uma hora após a administração da MDMA, quanto maiores eram as concentrações plasmáticas de AVP, menores eram as concentrações de MDMA detectadas no plasma (Forsling et al. 2001). Estes autores consideraram que, provavelmente, o efeito farmacológico da MDMA sobre a secreção da AVP poderia ter sido exercido por um metabolito. Esta suposição foi, em certa medida, apoiada através de ensaios em hipotálamo isolado de rato onde se verificou a capacidade dos metabolitos MDA, HMMA, HMA, HHMA e HHA para desencadear a libertação de AVP (Forsling et al. 2002). No que diz respeito aos resultados que estabelecem correlações entre a concentração de AVP e as concentrações de MDMA no plasma em humanos, estes não estão em concordância com os resultados obtidos para os ratos. No entanto, é importante considerar as diferenças farmacocinéticas e farmacodinâmicas entre as duas espécies. Para esclarecer melhor a influência dos metabolitos na secreção da AVP in vivo, deveriam ser realizadas experiências com tempos de sacrifício anteriores e posteriores a 1 hora. Dessa forma, seria possível perceber qual o momento em que, nos animais, se atinge a concentração máxima de AVP e quantificar nesse momento as concentrações de MDMA, MDA, HMA e HMMA por forma a estabelecer novas correlações. Por outro lado, na avaliação das correlações entre as concentrações urinárias de AVP e da MDMA, MDA HMA e HMMA, foram observadas correlações estatisticamente significativas. Estas correlações mostraram que para concentrações superiores de AVP ocorrem também concentrações superiores de MDMA, MDA e HMA (P<0.05). Para o metabolito HMMA foi estabelecida uma correlação positiva mais forte (P<0.01), mostrando que maiores concentrações urinárias deste metabolito são acompanhadas com maiores aumentos das concentrações de AVP. Este resultado foi de encontro ao esperado, pois o metabolito HMMA foi identificado como sendo o que tem maior capacidade para induzir a secreção de AVP em hipotálamo isolado de rato (Forsling et al. 2002). Além disso, dos coeficientes de Pearson obtidos para cada metabolito o coeficiente mais elevado foi o correspondente ao metabolito HMMA, mostrando que, comparativamente à MDMA, MDA e HMA, este metabolito é o que mais facilmente consegue elevar as concentrações de AVP. A obtenção de correlação positiva para a MDMA não foi de acordo com o esperado pois na literatura foi identificada correlação negativa entre as concentrações plasmáticas da MDMA e os níveis de AVP (Forsling et al. 2001). A explicação para esta __________________ Capítulo V – Indução da Secreção da Vasopressina pela MDMA 125 discordância poderá estar relacionada com o facto das concentrações urinárias da MDMA ao final de 24 horas não reflectirem as concentrações plasmáticas no momento em que ocorrem as variações na secreção de AVP após a administração da MDMA.