Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas

i Ana Lúcia Caetano de Sousa Amorim Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO SETEMBRO/2012 ii Ana Lúcia Caetano de Sousa Amorim Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para a obtenção do grau de Mestre em Química DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO SETEMBRO/2012 iii Ana Lúcia Caetano de Sousa Amorim Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes Composição do Júri: Maria Clara Ramalho Monteiro Pires Basto, Professora Auxiliar do Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto (Representante da Comissão Científica do 2º Ciclo de Estudos em Química) – Presidente; Baltazar Manuel Romão de Castro, Professor Catedrático do Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto; Ana Cristina Freire, Professora Associada do Departamento de Química e Bioquímica da Universidade do Porto; Susana Luísa Henriques Rebelo, Investigadora Auxiliar do Laboratório Associado para a Química Verde – REQUIMTE – Pólo do Porto, Universidade do Porto DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO SETEMBRO/2012 iv AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer, em primeiro lugar, ao Professor Doutor Baltazar de Castro por me ter concedido a oportunidade de realizar este trabalho bem como todas as condições necessárias para a sua realização. À Doutora Ana Margarida Silva, pela orientação científica desta dissertação, constante apoio, optimismo e amizade com que sempre me presenteou. À Professora Doutora Maria Conceição Rangel, pelo apoio e disponibilidade demonstrados, contribuindo assim para o enriquecimento deste trabalho. À Doutora Andreia Leite, pela ajuda fundamental prestada na realização dos estudos fotofísicos, sempre disponível, sempre paciente. À Doutora Salete Balula e à Doutora Susana Rebelo, agradeço pela disponibilidade prestada na colaboração neste trabalho nomeadamente na síntese em fase sólida e catálise. À DoutoraVera pela simpatia e pela cedência do reator de aquecimento óhmico. Ao CeNTI, em especial à Dra. Andrea Carneiro pela cedência do reator monomodo de micro-ondas. À Mariana Andrade pela simpatia e pela colaboração prestada na aquisição dos espectros de RMN. À Inês Cardoso, por me ter dado a conhecer esta oportunidade; pela simpatia e amizade, e pela disponibilidade com que me ajudou a dar os primeiros passos neste trabalho. Ao André Barbosa, pela ajuda, paciência e disponibilidade sempre presentes ao longo destes meses de trabalho, sempre com a sua boa disposição. À Carla Queirós, por tem dispensado do seu tempo e paciência para gentilmente ajudar na fase final deste trabalho. Aos colegas do piso 2, agradeço os momentos de descontração e boa disposição contribuindo assim para um bom ambiente de trabalho. Às minhas amigas, pela preciosa amizade, luz e alegria com que brindam os meus dias. À minha família, pela união e companheirismo, e por estarem presentes nos momentos mais importantes da minha vida. Ao meu Pai, pela inesgotável paciência e amor de todos os dias; mais do que um pai, um companheiro único e incomparável. v Ao Leo, por segurar a minha mão, mesmo quando à distância, reconfortando-me e dando força em todos os momentos; pelo carinho e amor que me fizeram renascer. vi Dedicado à minha Mãe, com amor. vii RESUMO Os fluoróforos do tipo rodamina representam um grupo de compostos de elevado valor devido às suas excelentes propriedades fotofísicas. Deste modo, estes compostos têm sido amplamente utilizados na preparação de sensores fluorescentes. Por outro lado, o design de novos derivados de rodamina, designados por rosaminas, apresenta-se como uma boa alternativa uma vez que introduz vantagens do ponto de vista do processo de síntese. Estas vantagens traduzem-se na possibilidade de se isolar apenas um regioisómero com elevado rendimento e grau de pureza. O trabalho desenvolvido no âmbito desta dissertação tem como objetivo a síntese e caracterização de novos fluoróforos utilizando metodologias mais sustentáveis. Sintetizaram-se novos derivados de rosamina contendo grupos fenilo, naftilo ou unidades quelantes do tipo catecol ligados ao anel xanteno. Para isso, recorreu-se à reação de condensação de 3-dietilaminofenol e correspondente benzaldeído sob irradiação micro-ondas, seguida por uma etapa de oxidação. A etapa de oxidação é tipicamente levada a cabo utilizando-se cloranil como agente oxidante. Com o intuito de tornar a etapa de oxidação mais limpa e eficiente, estudaram-se outras metodologias alternativas ao uso de cloranil, nomeadamente, oxidação catalítica com peróxido de hidrogénio, oxidação com óxido de grafeno e também a oxidação com dióxido de manganês. Além dos métodos de aquecimento já descritos, estudou-se um método novo de aquecimento direto para síntese orgânica em meio aquoso baseado num reator de aquecimento óhmico. Este método permitiu obter a rosamina contendo o anel fenilo em condições mais sustentáveis. Ainda com o intuito de estabelecer protocolos mais limpos e eficientes, estudaram-se reações de síntese em fase sólida. Para tal testaram-se os suportes sólidos do tipo MCM-41 e nanopartículas de sílica, tendo-se observado que os suportes do tipo MCM-41 são mais resistentes às condições reacionais e por isso mais promissoras para virem a ser utilizadas na síntese de compostos orgânicos. As rosaminas sintetizadas foram caracterizadas por análise elementar, espetrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Estabeleceuse ainda as propriedades fotofísicas de uma das rosaminas sintetizadas, observando-se a sua potencial aplicação como sensor de pH. viii ABSTRACT Rhodamine-based fluorophores represent a high-value group of compounds due to their excellent photophysical properties. Because of this, these compounds have being widely used in the preparation of fluorescent sensors. On the other hand, the design of new rhodamine derivatives, called rosamines, appears as a good alternative because it introduces advantages in the synthesis process. These advantages makes possible to isolate only one regioisomer with high yield and purity. In this work new rosamine derivatives were synthesized, containing phenyl groups, naphthyl or catechol-based chelating units linked to xanthene ring. To achieve this, a condensation reaction of 3-diethylaminophenol and benzaldehyde was performed under micro-wave irradiation; and then an oxidation step was carried out. This latter step is typically carried out using chloranil as oxidative agent. Aiming to make the oxidation step more clean and efficient, a study of alternative methodologies to chloranil was carried out. Namely, catalytic oxidation with hydrogen peroxide, oxidation with graphene oxide and also oxidation with manganese dioxide. Beyond the heating methods already described, a new and direct way of heating for organic synthesis was studied. It is based in a reactor of ohmic heating. This method has allowed to get rosamine containing phenyl ring in a more sustainable conditions. Furthermore, aiming to establish environment-friendly protocols, a study of synthesis reactions in solid phase was carried out as well. For this purpose we tested the MCM-41 as solid support and also silicon dioxide nanoparticles. An observation was made that the former one are more resistant to reaction conditions and hence more promising to be used in solid phase organic synthesis. The rosamines synthesized were characterized by elemental analysis, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Photophysical properties of one of the synthesized rosamines were also established, by observing its potential application as pH sensor. ix RESUMÉ Les fluorophores du type rhodamine représentent un groupe de composés d’une grande valeur en raison de leurs excellentes propriétés photophysiques. Ainsi, ces composés ont été largement utilisés dans la préparation de senseurs fluorescents. D’autre part, le design de nouveaux dérivés de rhodamine, désignés rhosamines, se présente comme une bonne alternative une fois que cela introduit des avantages du point de vue du processus de synthèse. Ces avantages se traduisent par la possibilité d’isoler uniquement un régioisomère avec un rendement et un degré de pureté élevé. Au cour de ce travail de nouveaux dérivés de rhosamine ont été synthétisés contenant des groupes phényle, naphthyl ou des unités chélatantes du type catéchol lié à l’anneau xanthène. Pour cela, il fallu avoir recourt à la réaction de condensation de 3diéthylaminophénol et du benzaldéhyde correspondant sous irradiation micro-ondes, suivie par une étape d’oxydation. L’étape d’oxydation est typiquement effectuée en utilisant du chloranyle en tant qu’agent oxydant. Dans l’objectif de rendre l’étape d’oxydation plus propre et efficace, d’autres méthodes alternatives à l’utilisation du chloranyle ont été étudiées, notamment, l’oxydation catalytique avec du péroxyde d’hidrogène, l’oxydation avec de l’oxyde de graphène et encore l’oxydation avec du dioxyde de manganèse. En plus des méthodes de chauffage déjà décrite, une nouvelle méthode de chauffage direct pour la synthèse organique en milieu aqueux basée sur un réacteur de chauffage ohmique a été étudiée. Cette méthode a permis d’obtenir la rhosamine contenant l’anneau phényle dans des conditions plus viables. Toujours en vue d’établir des protocoles plus respectueux de l’environnement, des réactions en phase solide ont été étudiées. Pour cela les supports solides de type MCM41 et des nanoparticules de silice ont été testés, ayant été observé que les premiers sont plus résistants aux conditions réactionnelles et donc plus prometteurs pour à l’avenir être utilisé en synthèse organique. Les rhosamines synthétisées ont été caractérisées par analyse élémentaire, spectrométrie de masse et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire. Les propriétés photophysiques de l’une des rhosamines synthétisées ont aussi été établies, en observant son application potentielle en tant que senseur de pH. xvi Índice de esquemas Esquema 1.1 Diferentes formas da Rodamina B em solução. ...................................................................... 5 Esquema 1.2 Rota de síntese recorrendo a SPOS para preparar arilpropanolaminas. ................................ 15 Esquema 3.1 Pigmentos sintetizados através de reações de substituição eletrofílica aromática. ............... 39 Esquema 3.2 Síntese da rosamina 2 (R= 1’-naftilo). .................................................................................. 41 Esquema 3.3 Síntese da rosamina 3, R= 2’-naftilo. .................................................................................... 42 Esquema 3.4 Análogo hidroxilado (3a) isolado durante a síntese da rosamina 3 e a sua respetiva forma protonada. ................................................................................................................................................... 43 Esquema 3.5 Síntese da rosamina 4a (R=2’,3’-OBn). ................................................................................ 44 Esquema 3.6 Síntese da rosamina 5a (R=3’,4’-OBn). ................................................................................ 44 Esquema 3.7 Reação de hidrogenólise da rosamina 4a (R=2,3-OBn). ....................................................... 45 Esquema 3.8 Reação com BCl3 com formação da rosamina 4b. ................................................................ 46 Esquema 3.9 Reação com BCl3 com formação da rosamina 5b. ................................................................ 46 Esquema 3.10 Reação de clivagem dos grupos protetores com BCl3. ........................................................ 46 Esquema 3.11 Reação de síntese proposta para a imobilização do ligando vanilina em suporte sólido..... 65 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 1 Abreviaturas AE - análise elementar CeNTI – Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes DDQ – 5,6-diano-2,3-dicloro-1,4-benzoquinona DCM - diclorometano DMF – N,N-dimetilformamida DMSO – dimetilsulfóxido EDTA – do Inglês “Ethylene diamine tetraacetic acid” EM – espetroscopia de massa ESI – ionização em electrospray FAB – do Inglês “fast atomic bombardement” GO – óxido de grafeno HRESI – alta resolução em ESI IV – infravermelho IUPAC – do Inglês “International Union of Pure and Applied Chemistry” M+•– ião molecular [M+H]+ – ião molecular protonado MCM – do Inglês “mobil chrystalline materials” MO – micro-ondas Rf – factor de retenção SEM – do Inglês “scanning electron microscopy” SPOS – do Inglês “solid phase organic synthesis” TLC – do Inglês “thin layer chromatography” p-TsOH – ácido p-toluenossulfónico TFA – ácido trifluoroacético UV-Vis – ultravioleta/visível QC – Química combinatória λmáx – comprimento de onda para máximo de absorvância λ exc – comprimento de onda de excitação Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 2 Abreviaturas para Ressonância Magnética Nuclear COSY – correlation spectroscopy d – dupleto dd – duplo dupleto HMBC – heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy HSQC – heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy J – constantes de acoplamento m – multipleto ppm – partes por milhão q – quarteto RMN - ressonância magnética nuclear RMN de 13C - ressonância magnética nuclear de carbono 13 RMN de 1H - ressonância magnética nuclear de protão s – singuleto t – tripleto TMS – tetrametilsilano δ – desvio químico Capítulo 1 Introdução Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 4 1. Introdução 1.1 Fluoróforos O trabalho desenvolvido no âmbito desta dissertação tem como objetivo a síntese e caracterização de novos fluoróforos utilizando metodologias mais sustentáveis. O termo fluoróforo, segundo Lavis e Raines,1 define-se como uma unidade fluorescente que pode ser composta por moléculas pequenas ou proteínas e que confere à molécula, na qual está inserida, propriedades fluorescentes. Em 1845 Herschel reportou a emissão visível de uma solução aquosa de quinina (Figura 1.1).1 Assim, esta molécula estabeleceu-se historicamente como o primeiro fluoróforo estudado e classifica-se como fluoróforo endógeno. A sua importância em termos de química orgânica medicinal motivou o desenvolvimento do primeiro corante sintético têxtil, “mauvine”, em 1865, e o aparecimento dos primeiros espetrofluorímetros.1 Muitos compostos naturais exibem, tal como a quinina, uma fluorescência mensurável, nomeadamente os aminoácidos aromáticos como o triptofano. Figura 1.1 Estrutura molecular da quinina. Existem várias classes de fluoróforos, como são exemplo os compostos aromáticos policíclicos, as cumarinas, as quinolinas e os imidazois.2 Atualmente, os fluoróforos podem ser classificados tendo em conta as suas propriedades fotofísicas (absorção e emissão) quando conjugados ou complexados com determinado analito. Deste modo os fluoróforos podem ser divididos em duas classes principais: fluoróforos com emissão até 500 nm e fluoróforos com emissão acima de 500 nm. Nestes últimos incluem-se os fluoróforos do tipo rodamina e fluoresceína pertencentes à família dos xantenos.3 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 5 1.1.1 Anel Xanteno Os xantenos constituem a classe de compostos fluorescentes mais investigada devido sobretudo às suas propriedades fotofísicas: espetro de absorção e emissão, rendimentos quânticos e tempo de vida de fluorescência.4 O primeiro corante fluorescente derivado do anel xanteno – fluoresceína - foi sintetizado por Bayer, em 1871.1 No âmbito do presente trabalho existe particular interesse em explorar os derivados de rodamina, família de compostos que contem igualmente o anel xanteno no seu esqueleto. A rodamina B (Esquema 1.1) é uma das rodaminas mais utilizadas, foi sintetizada pela primeira vez em 1905 por Noelting e Dziewonsky,1 tendo sido posteriormente utilizada na determinação colorimétrica de vários metais de relevância biológica.5 A rodamina B, dependendo do valor de pH do meio pode adquirir diferentes formas, designadamente a forma de spirolactona, que não é fluorescente e é incolor, e a forma aberta resultante da protonação do grupo carboxilato, que por sua vez apresenta uma forte fluorescência e adquire a cor rosa (Esquema 1.1). O valor de pKa da rodamina B é de 3,7.6 Esquema 1.1 Diferentes formas da Rodamina B em solução. 1.1.2 Conceção clássica de sondas fluorescentes Tradicionalmente as sondas fluorescentes são concebidas de forma a incluírem na sua estrutura um recetor ou ligando responsável pela deteção do analito e um fluoróforo responsável pela sua sinalização. A conceção destas sondas pode seguir as três abordagens seguintes: -sondas fluorescentes intrínsecas: onde o mecanismo de transdução do sinal envolve a interação do analito com um ligando que faz parte do sistema π do fluoróforo; Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 6 -sondas fluorescentes extrínsecas: onde o ligando está covalentemente ligado ao fluoróforo, no entanto estes são eletronicamente independentes. Uma vez que a ligação covalente se faz através de um espaçador, ambas as unidades estão relativamente próximas; a interação do analito com o ligando induz alterações na sua fluorescência. -sondas conjugadas “ensemble”: o conjugado unidade quelante-fluoróforo é seletivamente dissociado por adição de um analito, resultando numa resposta detetável pelo fluoróforo. Com o intuito de se procurar protocolos mais limpos e eficientes, estudaram-se diferentes metodologias de síntese no âmbito da ‘Química Verde’, para preparar novas sondas fluorescentes derivadas do fluoróforo rodamina. 1.2 Metodologias de síntese no âmbito da ‘Química Verde’ 1.2.1 Princípios de ‘Química Verde’ Em 1994, um estudo levado a cabo pelo Conselho Europeu da Indústria Química revelou que 60% da opinião pública tinha uma visão negativa acerca desta indústria. Nos EUA, um ano antes, um estudo semelhante revelava que apenas 26% da opinião pública via com bons olhos a Indústria Química. As principais razões que conduzem à formação de opiniões mais desfavoráveis relacionam-se com as adversidades associadas ao impacto ambiental, segurança e resíduos resultantes. Os processos industriais conduzem à formação de toneladas de resíduos, pelo que a redução e eliminação destes resíduos é cada vez mais tema preocupante não só na indústria como para as autoridades responsáveis e opinião pública em geral. No entanto, a Indústria Química é das mais bem-sucedidas e diversificadas indústrias de produção no mundo inteiro.7 O aparecimento da ‘Química Verde’ está associado à procura de metodologias mais sustentáveis, sendo um conceito complexo e difícil de definir, mas que se relaciona com a extensão em que as caraterísticas da Química praticada assentam no Desenvolvimento Sustentável. É por isso importante avaliar a sustentabilidade das práticas em Química, desde as reações de síntese aos processos de fabrico industrial, bem como os próprios produtos e respetiva utilização. No entanto, esta avaliação é bastante complexa pois a Química tem um alcance vasto e diversificado – aplica-se aos compostos, à sua utilização, aos processos para o seu fabrico industrial, etc.; envolve diferentes parâmetros de benignidade ambiental desde os processos de fabrico aos Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 7 compostos e é determinada por um conjunto de várias caraterísticas que permitam a Sustentabilidade (Figura 1.2).8 Ou seja, que o composto/ processo seja:  por si só benigno – não apresente efeitos nocivos para o Homem e Ambiente;  utilize de forma eficiente os átomos dos reagentes e não origine muitos resíduos, particularmente se apresentam toxicidade;  possa ser preparado por reações em condições suaves e que não consumam muita energia;  utilize reagentes resultantes de matérias primas renováveis.8 Figura 1.2 Requisitos de uma síntese ideal.7 É de assinalar que a transposição da Química Laboratorial para a Industrial é complexa, pois nesta estão envolvidos um grande número de produtos químicos diversificados e variados processos de fabrico.8 É cada vez mais urgente a procura de vias de síntese “mais verdes” que as tradicionais e de as classificar consoante o desenvolvimento “verde” do processo de modo a conseguir-se alcançar processos industriais mais eficientes e benignos para o meio ambiente, do que os atualmente utilizados. É necessário, por isso, avaliar quantitativamente a “verdura” das reações, vias de síntese, processos químicoindustriais, etc., de modo a catalogar as alternativas disponíveis em cada caso e facilitar assim a escolha das mais apropriadas para se atingir a Sustentabilidade.9,10 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 8 1.2.2 Síntese assistida por micro-ondas Foi em 1946, que Spencer se deparou com a irradiação por micro-ondas como método de aquecimento aquando da realização de experiências no seu laboratório. Numa dessas experiências, em que procurava obter um novo tubo de vácuo (magnetrão –Figura 1.3 i), Spencer descobriu que a barra de chocolate que tinha no seu bolso derretera devido à exposição a esta radiação. Foi na sequência deste acontecimento que já em 1947, Spencer desenvolveu o primeiro forno de micro-ondas de uso doméstico (Figura 1.3 ii).11 Figura 1.3. (i): Imagem de um magnetrão gerador de micro-ondas para rádios e radares. (ii): Primeiro forno micro-ondas de uso doméstico em 1947.11 Na década de 90, surgiram os primeiros fornos micro-ondas para uso laboratorial. E em 1986, os grupos de investigação de Gedye e Giguere descreveram as primeiras reações em síntese orgânica, em vasos abertos, recorrendo a radiação microondas por meio de fornos micro-ondas domésticos.12,13 Nesta altura, as experiências eram realizadas sem qualquer controlo da temperatura ou pressão causando acidentes. No entanto, verificou-se, em alguns casos, que este tipo de aquecimento reduzia significativamente os tempos de reação comparativamente com as experiências desenvolvidas sob condições de aquecimento convencional. Desde então esta técnica tem sido das mais desenvolvidas no âmbito da química orgânica, fato que se observa pelo crescente número de publicações sobre este tema. Tradicionalmente, as reações químicas são aquecidas recorrendo-se a uma fonte de calor externa, banho de óleo ou manta de aquecimento. Esta forma de aquecimento é um método bastante lento e ineficiente de transferência de energia para uma mistura (i) (ii) Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 9 reacional, pois apresenta uma elevada inércia térmica, uma vez que depende de processos de convecção e condução do calor e da condutividade térmica dos diferentes materiais através dos quais o calor tem de penetrar, resultando muitas vezes numa temperatura do vaso de reação superior à da mistura reacional. Por sua vez, o aquecimento por micro-ondas proporciona um aquecimento mais eficiente, já que este é gerado internamente por absorção direta da radiação micro-ondas por moléculas polares presentes na mistura reacional, por exemplo, solventes, reagentes, catalisadores. Na Tabela 1.1 apresentam-se as principais caraterísticas de ambos os tipos de aquecimento.14 Tabela 1.1 Aquecimento convencional versus aquecimento com radiação micro-ondas. A radiação micro-ondas (onde 2,45 GHz é a frequência utilizada nos fornos domésticos e de síntese química) é convertida em aquecimento segundo dois mecanismos principais: polarização dipolar e condução iónica. Os iões ou dipolos presentes numa dada reação, quando sujeitos à radiação micro-ondas, vão alinhar-se segundo o campo elétrico aplicado. Como o campo aplicado oscila, os iões ou dipolos vão realinhar-se com a corrente elétrica alternada e, durante esse processo, a energia é perdida na forma de calor através de fricção molecular e perdas dielétricas. A quantidade de calor gerado por este processo está diretamente relacionada com a capacidade dos materiais para se alinharem à frequência do campo aplicado. Se o ião ou dipolo não tem tempo para realinhar ou reorienta muito rapidamente com o campo Aquecimento convencional Aquecimento por micro-ondas A energia é transferida através das paredes do vaso reacional, e em seguida, dissipada para a mistura reacional. A radiação micro-ondas é absorvida diretamente pelas moléculas presentes na mistura reacional, sendo as paredes do vaso reacional transparentes à radiação Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 16 o princípio da toxicidade seletiva e usar estes compostos no tratamento de doenças de origem microbiana.26 A primeira cura utilizando corantes data de 1891 por Guttmann e Ehrlich, quando dois pacientes com malária foram tratados com azul de metileno (Figura 1.7). Ehrich foi também responsável pela demonstração das propriedades antibacterianas de aminoacridinas (Figura 1.7). Alguns destes compostos foram utilizados como desinfetantes de feridas durante a 1ª Guerra Mundial. Consequentemente, em 1940, as aminoacridinas antibacterianas foram bastante usadas pelas populações civis bem como por militares. Um outro derivado da acridina, designado por quinacrina, teve um papel importante no tratamento da malária aquando da escassez da quinina. Outros corantes antibacterianos foram usados durante esta época tais como: azul de metileno, mercurocromo e também prontosil que levou posteriormente à síntese de diversas sulfonamidas antibacterianas (Figura 1.7). Apesar da atividade dos corantes antibacterianos, estes compostos foram caindo em desuso tendo sido substituídos por outros fármacos como a penincilina, e subsequentemente por agentes sintéticos como as fluoroquinolonas. Figura 1.7 Representação de alguns compostos fluorescentes com atividade antibacteriana. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 17 A Histoquímica dedica-se ao estudo da constituição química e metabolismos das células e tecidos. As moléculas fluorescentes desempenham nesta ciência um papel importante na medida em que permitem a obtenção de imagens microscópicas de contraste através da marcação de estruturas biológicas. Os corantes neste âmbito funcionam como marcadores de moléculas como anticorpos e na deteção de enzimas,27 permitindo o diagnóstico de determinadas doenças. Na Figura 1.8 exemplifica-se o modo de atuação de marcação de estruturas biológicas através do uso de várias classes de moléculas fluorescentes. Figura 1.8 Modo de atuação de moléculas fluorescentes por marcação de estruturas biológicas. 1.3.1 Sondas de pH A determinação do valor de pH é um parâmetro importante em diversas áreas que vão desde o ambiente, às ciências da vida, passado pelos processos industriais. Tipicamente recorre-se aos sensores potenciométricos para medição do valor de pH, no entanto os sensores de pH óticos surgem como uma alternativa vantajosa na medida em que tornam o processo de medição menos invasivo, ou seja, permitem medições sem necessitar aceder à amostra. Por outro lado, os sensores óticos são sistemas miniaturizados e têm ainda a particularidade de permitirem efetuar medições de pH em zonas com elevados campos magnéticos. A maioria dos sensores óticos de pH descritos é constituída por moléculas fluorescentes que se encontram integradas em dispositivos que recebem o sinal ótico.28 Atualmente, existem vários compostos fluorescentes que podem funcionar como sondas de pH. A Figura 1.9 apresenta dois derivados de catecol constituídos por uma unidade de catecol ligada covalentemente a anéis aromáticos do tipo fenilo ou piridilo, através de um sistema de ligações π.28 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 18 Figura 1.9 Derivados de catecol utilizados como sondas de pH. A Figura 1.10 ilustra um composto fluorescente do tipo rosamina aplicado como sensor de pH que possui duas especialidades de relevo: (i) grupos do tipo piperazina sensíveis ao pH e (ii) ligação covalente a um suporte sólido com o intuito de facilitar a aplicação dos compostos.29 Figura 1.10 Derivado do tipo rosamina utilizado como sonda de pH. 1.3.2 Sensores de iões de metal Os iões de metal são essenciais a todas as formas de vida, no entanto alterações no regulamento homeostático destes estão fortemente relacionados com várias patologias humanas, incluindo cancro, diabetes e doenças neurodegenerativas. Sensores de iões de metal em células que respondam de forma seletiva e sensível permitem determinar as consequências destes desequilíbrios nas células. O uso crescente da microscopia confocal motivou o desenvolvimento de moléculas fluorescentes, oferecendo um vasto conjunto de sondas capazes de responder a acontecimentos intracelulares tais como: a localização de proteínas, marcação de moléculas, determinação da distribuição de organelos e viabilidade celular. Fluoróforos que permitam localizar a presença de certos iões de metal quer nas regiões intra ou extracelular continuam a dar um forte contributo no estudo e compreensão dos equilíbrios homeostáticos associados a diversas doenças. Existe por Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 19 isso uma necessidade premente no desenvolvimento de sensores de iões de metal de importância biológica como por exemplo: o Zn(II), o Cu(II) e o Fe(III). O zinco é o segundo ião de metal mais abundante presente no corpo humano e existe exclusivamente na sua forma divalente no meio biológico. A quantidade de tipos de células que acumulam e mobilizam zinco promoveu interesse no desenvolvimento de sensores para Zn2+. Este ião de metal pode ter a função de ácido de Lewis, cofactor de enzimas e outras proteínas. Além disso, relaciona-se com atividades neuronais uma vez que é libertado aquando os fenómenos de sinapse. Na Figura 1.11 são apresentados alguns sensores para Zn2+ do tipo ‘turn-on’.30 Figura 1.11 Duas sondas fluorescentes para Zn2+ do tipo ‘turn-on’. Em meio biológico é possível encontrar predominantemente estados de oxidação Fe2+ e Fe3+, ligados a enzimas e proteínas de armazenamento. A deteção de ferro no meio celular por agentes fluorogénicos pode ser realizada por fenómenos de surgimento ou extinção de fluorescência. A Figura 1.12 ilustra estruturas de duas sondas fluorescentes para Fe(III).31, 32 Figura 1.12 Duas sondas fluorescentes para Fe3+ do tipo ‘turn-on’ e ‘turn-off’, respetivamente. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 20 1.4 Fluoróforos com aplicações ambientais A contaminação ambiental por metais pesados tem contribuído para o desenvolvimento de novas técnicas de identificação e seletividade de modo a estudar a ação destes agentes tóxicos. Este problema reflete-se particularmente no meio aquático através da bioacumulação destes metais e respetiva persistência no meio ambiente. Metais pesados como o mercúrio, chumbo e cádmio são considerados neurotoxinas e têm efeitos nefastos a nível da saúde pré-natal e nos primeiros estágios de desenvolvimento infantil. Os alvos mais prováveis de acumulação de chumbo e cádmio incluem proteínas dependentes de cálcio e zinco, e potenciais ligandos presentes nas células para espécies orgânicas de mercúrio incluindo a glutationa e outros antioxidantes. Porém, o mecanismo relacionado com a atividade tóxica destes metais permanece ainda pouco conhecido. Estas dificuldades motivam o desenvolvimento de moléculas fluorescentes que atuem como sensores na deteção de metais pesados em amostras biológicas. Na Figura 1.13 apresenta-se o primeiro sensor de mercúrio desenvolvido por Lippard e Nolan. Além de detetar Hg2+, apresenta também seletividade para outros iões de metal como é o caso do Pb2+ e Cd2+. A Figura 1.13 apresenta ainda um outro sensor semelhante ao anterior, capaz de detetar os níveis de mercúrio presentes em amostras de águas.30 Figura 1.13 Duas sondas fluorescentes de Hg2+. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 21 Neste trabalho sintetizaram-se derivados de rosamina (Figura 1.14) com diferentes grupos substituintes ligados ao anel xanteno recorrendo a diferentes tipo de aquecimento, nomeadamente aquecimento convencional e micro-ondas. Em anexo encontra-se a lista relativa aos compostos sintetizados no âmbito deste trabalho. Com o intuito de explorar metolodogias mais limpas e eficientes realizaram-se os seguintes estudos: - Síntese de rosamina em meio aquoso recorrendo ao aquecimento Óhmico; - Síntese de rosamina utilizando diferentes metodologias de oxidação; - Estudo preliminar de síntese em fase sólida por imobilização de precursor em fase sólida, para posterior aplicação na síntese de rosamina. Figura 1.14 Derivados de rosamina preparados no âmbito deste trabalho. Capítulo 2 Parte experimental Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 23 2. Parte experimental 2.1 Reagentes, solventes e equipamentos Os reagentes comerciais utilizados na síntese dos compostos foram obtidos através da Sigma-Aldrich e não sofreram qualquer purificação prévia. As balanças utilizadas nas pesagens foram: balança Analítica Metler AT 201 (2x10-5g) e balança semi-analítica Metler (2x10-4g). As sínteses dos compostos foram realizadas recorrendo-se a diferentes tipos de aquecimento: aquecimento convencional, aquecimento por radiação micro-ondas e aquecimento em reator óhmico. No aquecimento convencional utilizaram-se placas de aquecimento Corning com sensor de temperatura, modelo (Cat. 6795PR). No aquecimento recorrendo à irradiação por micro-ondas utilizou-se um forno micro-ondas com sistema de cavidade monomodo da CEM Discover. O equipamento de aquecimento óhmico utilizado está a ser desenvolvido no Departamento de Química da Universidade de Aveiro ao abrigo do projeto FCT PTDC/QUI-QUI/102454/2008 e da patente Portuguesa “Reator com aquecimento óhmico para síntese química, respetivo método e suas aplicações” (PAT No 20111000073974). As reações foram seguidas através de cromatografia em camada fina utilizandose folhas de sílica gel 60 F254. A separação dos compostos resultantes das várias misturas reacionais foi realizada utilizando a técnica de cromatografia rápida (“flash”) com sílica gel 60 (0,040-0,063 mm) da Merck. Para alguns compostos, para melhor separação, foi necessário recorrer à cromatografia em camada fina preparativa em placas de vidro (20x20 cm) revestidas por uma camada de sílica gel 60 F254 (Merck) com cerca de 0,5 mm de espessura e secas em estufa a 100ºC durante 10 horas. Os espetros de RMN de 1H e 13C foram adquiridos no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear da Universidade do Porto (LRMN-CEMUP) e registados num aparelho Bruker Avance III 400. O espetrofotómetro opera à frequência de 400,15 MHz para 1H e 100,62 MHz para 13C. Nos espetros de RMN de 1H e de 13C foi usado como padrão interno o TMS (δ= 0 ppm). Os desvios químicos são expressos em δ (ppm) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). Os espetros bidimensionais (2D) incluindo espetros de correlação 1H/1H (COSY), espetros de correlação 1H/13C HSQC e HMBC foram adquiridos usando programas padrão disponíveis no espetrofotómetro. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 24 Os espetros de massa e as análises elementares foram obtidos em Santiago de Compostela nas Unidades de Espetrometria de Massa e Análises Elementares, respetivamente. Os espetros eletrónicos de absorção foram obtidos através do espetrofotómetro Shimadzue UV3600 UVeViseNIR equipado com Varian Cary Single Cell Peltier Accessory para controlo da tenperatura. Os espetros de emissão de fluorescência foram obtidos através de um fluorímetro Varian Cary Eclipse TM equipado com Signal Cell Peltier Acessory para controlo da temperatura. A caracterização dos compostos resultantes dos estudos de síntese em Fase Sólida foi realizada por espectroscopia vibracional de infra-vermelhos (IV) através do espectrómetro de FT-IV Jasco 460 Plus (alcance 4000-400 cm-1), por difração de raiosX de pós e por microscopia de varrimento eletrónico (SEM) - microscópio eletrónico de varrimento de alta resolução FEI Quanta 400 FEG ESEM - e espectroscopia de energia dispersiva (EDS), equipado com um espectrofotómetro de microanálise de Raios-X EDAX Genesis X4M. As amostras foram analisadas em pó, revestidas por uma camada fina de ouro. 2.2 Síntese de precursores 2.2.1 Síntese de 2,3–dibenziloxibenzaldeído (2,3-OBn) Uma solução de 2,3-dihidroxibenzaldeído (1,00 g; 7,24 mmol) e carbonato de potássio (2,20 g; 15,9 mmol) em DMF (20 mL) a 0 ºC, foi adicionado gota a gota, brometo de benzilo (1,89 mL; 15,9 mmol) sob atmosfera de árgon. Após agitação magnética durante 15 min a 0ºC, a mistura reacional foi mantida em agitação à temperatura ambiente durante 6 h. De seguida, a mistura foi precipitada num banho de água e gelo e neutralizada com ácido cítrico. O sólido obtido foi filtrado e lavado com água. Por fim, o sólido foi dissolvido em clorofórmio e cristalizado em n-hexano. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 25 Obteve-se 1,72 g de composto (rendimento 75%). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ: 5,19 (2 H, s, 3-CH2C6H5); 5,20 (2 H; s; 2-CH2C6H5); 7,11 (1 H; dt; J= 8,0 e J= 0,8 Hz; H-5); 7,24 (1 H; dd; J= 8,0 e J= 1,6 Hz; H-4 ou H-6); 7,32-7,43 (9 H; m; H-Ar); 7,467,49 (2 H; m; H-Ar); 10,26 (1 H, d; J= 0,8, CHO) ppm.33 2.2.2 Síntese de 3,4-dibenziloxibenzaldeído (3,4-OBn) Uma solução de 3,4-dihidroxibenzaldeído (1,00 g; 7,24 mmol) e carbonato de potássio (2,20 g; 15,9 mmol) em DMF (20 mL) a 0ºC, foi adicionado gota a gota, brometo de benzilo (1,89 mL; 15,9 mmol) sob atmosfera de árgon. Após agitação magnética durante 15 min a 0ºC, a mistura reacional foi mantida em agitação à temperatura ambiente durante 6 h. De seguida, a mistura foi precipitada num banho de gelo e água e neutralizada com ácido cítrico. O sólido obtido foi filtrado e lavado com água. Por fim, o sólido foi dissolvido em clorofórmio e cristalizado em n-hexano. Obteve-se 1,93 g de composto (rendimento de 84 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ: 5,22 (2 H; s; 3-CH2C6H5); 5,26 (2 H; s; 4-CH2C6H5); 7,02 (1 H; d; J= 8,0 Hz; H-5); 7,32-7,49 (12 H; m; H-Ar); 9,81 (1 H; s; CHO) ppm. 2.3 Síntese de rosaminas utilizando diferentes métodos de aquecimento 2.3.1 Procedimento geralAquecimento convencional (banho de óleo) Uma solução de 3-dietilaminofenol (1,72 mmol), um aldeído aromático (0,86 mmol) e ácido p-TsOH (0,10 mmol) em ácido propiónico (10 mL) foi agitada a 65ºC durante 16 h. Após arrefecimento à temperatura ambiente, a mistura reacional foi adicionada a uma solução aquosa de acetato de sódio 3 M (100 mL). A suspensão resultante foi extraída 3 vezes com clorofórmio. A fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro e evaporada à secura com a ajuda do evaporador rotativo. O sólido obtido foi dissolvido em 40 mL de uma mistura de clorofórmio/metanol (1:1) ao qual se adicionou cloranil (0,11 g; 0,43 mmol). A mistura foi vigorosamente agitada durante 2 h e concentrada em vácuo. O resíduo obtido foi purificado por “cromatografia rápida” utilizando uma mistura de clorofórmio/metanol (9:1) como eluente. Por fim, realizou-se Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 32 2.4.1 Rosamina 1 (R=H) Obteve-se 96 mg (rendimento de 45%) de rosamina 1 utilizando o aquecimento com irradiação micro-ondas e 131 mg (rendimento de 31%) no aquecimento Óhmico. RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ: 1,34 (12 H, t, J= 7,2 Hz, 4x CH3), 3,67 (8 H, q, J= 7,2 Hz, 4x CH2), 6,86 (2 H, d, J= 2,4 Hz, H-4 e H-5), 6,95 (2 H, dd, J= 9,6 e J= 2,4 Hz, H-2 e H-7), 7,36 (2 H, d, J= 9,6 Hz, H-1 e H-8), 7,37-7,39 (2 H, m, H-2’ e H-6’), 7,617,64 (3 H, m, H-3’, H-4’ e H-5’) ppm. RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) δ: 12,8 (CH3); 46,4 (CH2); 96,7 (C-4 e C-5); 113,5 (C-1a e C-8a); 114,4 (C-2 e C-7); 129,1 (C-3’ e C5’); 129,5 (C-2’ e C-6’); 130,5 (C-4’); 131,9 (C-1’); 132,3 (C-1 e C-8); 155,7 (C-3 e C6); 157,5 (C-9); 158,2 (C-4a e C-5a) ppm. EM (FAB+) m/z: 399 (M)+.. C27H31N2OCl. 2H2O. CHCl3 Calculado C, 56,96; H, 6,15; N, 4,74. Encontrado C, 57,08; H, 6,20; N, 4,77. 2.5 Síntese de rosaminas utilizando diferentes metodologias de oxidação Os ensaios relativos à etapa de oxidação, recorrendo ao uso de diferentes metodologias, foram realizados na sequência da reação de condensação de 3dietilaminofenol com benzaldeído de acordo com o procedimento geral descrito anteriormente, usando o aquecimento por micro-ondas. Deste modo, os estudos realizados descrevem tentativas de oxidação da rosamina 1. 2.5.1 Oxidação com cloranil em aquecimento por micro-ondas Para se proceder à etapa de oxidação concentrou-se a mistura reacional com a ajuda do evaporador e dissolveu-se em 4 mL de uma mistura de diclorometano/ metanol (1:1). De seguida adicionou-se cloranil (61,0 mg). A mistura foi colocada num vaso reacional de 10 mL, que foi seguidamente fechado e colocado na cavidade do reator de micro-ondas CEM. A reação foi aquecida a 60ºC (com 1 min de rampa a 60ºC e 10 min de reação a 60ºC, utilizando 50 W de potência máxima). O resíduo obtido foi purificado por “cromatografia rápida” utilizando uma mistura de clorofórmio/ metanol (9:1) como eluente. A rosamina 1 (95,5 mg) foi obtida com rendimento de 44%. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 33 2.5.2 Oxidação com DDQ em aquecimento por micro-ondas Para se proceder à etapa de oxidação concentrou-se a mistura reacional com a ajuda do evaporador e dissolveu-se em 4 mL de uma mistura de diclorometano/metanol (1:1). De seguida adicionou-se DDQ (56,0 mg). A mistura foi colocada num vaso reacional de 10 mL, que foi seguidamente fechado e colocado na cavidade do reator de micro-ondas CEM. A reação foi aquecida a 60ºC (com 1 min de rampa a 60ºC e 10 min de reação a 60ºC, utilizando 50 W de potência máxima). O resíduo obtido foi purificado por “cromatografia rápida” utilizando uma mistura de clorofórmio/metanol (9:1) como eluente. A rosamina 1 (36,0) foi obtida com rendimento de 30%. 2.5.3 Oxidação com dióxido de manganês em aquecimento por micro-ondas Para se proceder à etapa de oxidação concentrou-se a mistura reacional com a ajuda do evaporador e dissolveu-se em 4 mL de diclorometano. Adicionou-se de seguida 5 equivalentes molar (0,213 g, 2,46 mmol) de dióxido de manganês. A mistura foi colocada num vaso reacional de 10 mL, que foi seguidamente fechado e colocado na cavidade do reator de micro-ondas CEM. A reação foi aquecida a 100ºC (com 1 min de rampa a 100ºC e 1 min de reação a 100ºC, utilizando 50 W de potência máxima). O resíduo obtido foi purificado por “cromatografia rápida” utilizando uma mistura de clorofórmio/ metanol (9:1) como eluente. A rosamina 1 foi obtida em pequena quantidade. 2.5.4 Oxidação catalítica com peróxido de hidrogénio Para se proceder à etapa de oxidação concentrou-se a mistura reacional com a ajuda do evaporador e dissolveu-se em 5 mL de etanol. De seguida adicionou-se o complexo de Fe(III) da porfirina (iii) (6,0 mg) e o aducto H2O2-ureia (232,9 mg). A mistura foi colocada num vaso colocada reacional de 10 mL, que foi seguidamente fechado e colocado na cavidade do reator de micro-ondas. A reação foi aquecida a 60ºC (com 1 min de rampa a 60ºC e 40 min de reação a 60ºC, utilizando 60 W de potência máxima). A evolução da reação foi controlada por TLC, no entanto a baixa quantidade de rosamina 1 obtida não justificou a purificação da mistura reacional. 2.5.5 Oxidação com óxido de grafeno Para se proceder à etapa de oxidação concentrou-se a mistura reacional com a ajuda do evaporador e dissolveu-se em 5 mL de etanol. De seguida adicionou-se óxido de grafeno (50,0 mg) e aducto H2O2-ureia (230 mg). A mistura foi colocada num vaso Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 34 reacional de 10 mL, que foi seguidamente fechado e colocado na cavidade do reator de micro-ondas CEM. A reação foi aquecida a 60ºC (com 1 min de rampa a 60ºC e 40 min de reação a 60ºC, utilizando 60 W de potência máxima). A evolução da reação foi controlada por TLC, no entanto a baixa quantidade de rosamina 1 obtida não justificou a purificação da mistura reacional. 2.6 Síntese orgânica em fase sólida 2.6.1 Material MCM-41 A funcionalização do material MCM-41 (500 mg) foi efectuada com 3- (cloropropil)-trimetiloxissilano (25 µL) dissolvido em tolueno anidro (20 mL). A mistura foi mantida em aquecimento a 70 ºC e atmosfera de árgon durante 24 h. Por fim, a mistura foi filtrada, obtendo-se um sólido branco. 2.6.2 Reação de MCM-41 com o ligando vanilina Dissolveu-se vanilina (92,0 mg; 0,605 mmol) em DMF seca (5 mL). De seguida, adicionou-se Cs2CO3 (0,197 g; 0,606 mmol) e, cerca de 20 min depois, adicionou-se o material MCM-41 (180 mg). A mistura foi mantida em aquecimento a 50ºC, e atmosfera de árgon durante 24 h. Por fim, o composto foi filtrado e lavado com DMF, diclorometano, metanol e éter dietilico (5x15 mL cada) e deixou-se a evaporar. Capítulo 3 Resultados e discussão Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 36 3. Resultados e discussão 3.1 Síntese de precursores 3.1.1 Síntese de 2,3–dibenziloxibenzaldeído (2,3-OBn) e 3,4–dibenziloxibenzaldeído (3,4-OBn) Para se proceder à obtenção das rosaminas 4b (R=2’,3’-OH) e 5b (R=3’,4’-OH) foi necessário sintetizar, previamente, os respetivos precursores, 2,3– dibenziloxibenzaldeído (2,3-OBn) e 3,4–dibenziloxibenzaldeído (3,4-OBn). As rosaminas referidas contêm na sua estrutura uma unidade catecol. No entanto, para facilitar a sua preparação os grupos hidroxilo desta unidade foram previamente submetidos a uma reação com brometo de benzilo de modo a serem protegidos. A reação de proteção é descrita no Esquema 3.1 e Esquema 3.2, e envolve a benzilação dos grupos hidroxilo dos catecóis. Figura 3.1 Síntese do precursor 2,3-OBn. Figura 3.2 Síntese do percursor do 3,4-OBn. Ambos os precursores, 2,3-OBn e 3,4-OBn, foram obtidos com bons rendimentos, 75% e 84%, respetivamente. O precursor substituído na posição orto (2,3OBn) apresenta um valor de rendimento relativamente mais baixo que pode ser explicado pelo facto de nesta posição existir maior impedimento estéreo em relação ao grupo aldeído do anel aromático. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 37 3.1.2 Caracterização estrutural Relativamente à caracterização por espetroscopia de ressonância magnética nuclear, verifica-se que as interações eletrónicas de grupos substituintes com o sistema de eletrões π estão bem presentes nos derivados do benzeno. Os grupos substituintes podem aumentar ou diminuir a densidade eletrónica do anel, em particular em determinadas posições desse mesmo anel, por efeitos indutivos ou por efeitos de ressonância. Substituintes dadores de eletrões aumentam a densidade eletrónica do anel benzénico, principalmente das posições orto e para (ex. grupos OR, OH, NH2, etc) e consequentemente provocam uma maior blindagem desses protões, surgindo a ressonância destes a menores valores de desvio químico do que os do benzeno não substituído. Pelo contrário, os substituintes atraidores de eletrões, como é exemplo o grupo CHO, diminuem a densidade eletrónica dos anéis benzénicos, fazendo-se sentir este efeito mais significativamente nas posições orto e para provocando desproteção dos seus protões, tal como se verifica no Esquema 3.3. Os sinais correspondentes à ressonância destes protões surgem assim a maiores valores de desvio químico do que os do benzeno não substituído. Figura 3.3 Estruturas de ressonância em derivados do benzaldeído. A Tabela 3.1 mostra os desvios químicos (em ppm) dos sinais atribuídos à ressonância dos protões de ambos os precursores 2,3-OBn e 3,4-OBn sintetizados. Tabela 3.1. Comparação dos valores dos desvios químicos (ppm) dos espetros de RMN de 1H dos precursores 2,3-OBn e 3,4-OBn em CDCl3. Precursor CHO H-Ar OCH2C6H5 2,3-OBn 10,26 7,46-7,49 7,32-7,43 7,24 (H-4 ou H-6) 7,11 (H-5) 5,20 (2-CH2-) 5,19 (3-CH2-) 3,4-OBn 9,81 7,32-7,49 7,02 (H-5) 5,26 (4-CH2-) 5,22 (3-CH2-) Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 38 Observando a Tabela 3.1, verifica-se então que os sinais correspondentes à ressonância dos protões 2-CH2 e 4-CH2, isto é posições orto e para, surgem relativamente mais desprotegidos, com valores de desvios químicos de 5,20 e 5,26 ppm, do que os sinais atribuídos à ressonância dos protões 3-CH2, posição meta, que surgem a 5,19 e 5,22 ppm, respetivamente nos derivados 2,3-OBn e 3,4-OBn. A ressonância do protão do grupo aldeído surge a valores de desvio químico particularmente elevados (δH ~ 10 ppm) que se deve em larga medida à presença do átomo de oxigénio, muito eletronegativo, e ao efeito da anisotropia magnética da ligação C=O. Particularmente, no precursor 2,3-OBn a ressonância do protão surge a 10,26 ppm, enquanto que no precursor 3,4-OBn a ressonância do protão surge a 9,81 ppm. Tipicamente a ressonância do protão do grupo aldeído aparece a 9,87 ppm no caso do benzaldeído34 o que sugere que no precursor 2,3-OBn exista uma desproteção devido à presença do grupo substituinte OCH2C6H5 na posição orto. Existem exemplos em que o arranjo geométrico em zig-zag proporciona constantes de acoplamento de longa distância especialmente significativas. Tal verificou-se para o precursor 2,3-OBn pelo aparecimento do sinal atribuído ao protão do grupo formilo com constante de acoplamento 5J HH= 0,8 Hz à semelhança do exemplo do 2-clorobenzaldeído com 5J HH= 0,7 Hz, tal como mostra a Figura 3.4.33 Figura 3.4 Constantes de acoplamento de longa distância de arranjo geométrico em zig-zag. 3.2 Síntese de rosaminas utilizando diferentes métodos de aquecimento 3.2.1 Síntese das rosaminas 2, 3, 4a e 5a (R= 1’-naftilo, 2’-naftilo, 2,3-OBn, 3,4-OBn) As rosaminas preparadas, no âmbito deste trabalho, contêm no seu esqueleto um anel xanteno, podendo ser comparadas a outros pigmentos deste tipo, como por exemplo, a fluoresceína e a rodamina B. Esta família de pigmentos segue uma rota de síntese do tipo substituição eletrofílica aromática (Esquema 3.1). Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 39 Esquema 3.1 Pigmentos sintetizados através de reações de substituição eletrofílica aromática. Os derivados de rodamina funcionalizados são geralmente preparados através de reações de condensação e sob condições fortemente ácidas, apresentando dificuldades na purificação, uma vez que se obtêm misturas de 4’- e 5’-regioisómeros, que são difíceis de separar. Assim as rosaminas, por não possuírem o grupo ácido carboxílico na posição 2’, são consideradas uma boa alternativa às rodaminas clássicas, uma vez que a síntese destes compostos conduz à formação de um único regioisómero (Figura 3.5).35 Figura 3.5 Estruturas dos compostos rodamina B e rosamina, respetivamente. Neste trabalho, procedeu-se à síntese de rosaminas recorrendo a uma rota de síntese semelhante, envolvendo a reação de 3-dietilaminofenol com um benzaldeído em meio ácido, seguindo-se uma etapa de oxidação com cloranil. As reações de síntese foram realizadas por diferentes tipos de aquecimento: aquecimento clássico (banho de óleo) e aquecimento por radiação micro-ondas. Relativamente à síntese de rosaminas considera-se que a sua rota de síntese é semelhante à dos derivados da fluoresceína. A rosamina deverá formar-se ao longo de 3 etapas. Sendo que a primeira envolve a formação de um carbocatião por protonação do Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 40 átomo de oxigénio do grupo carbonilo do benzaldeído, carbocatião esse que irá reagir com o fenol substituído segundo uma reação de substituição eletrofílica aromática. 1ª Etapa Na 2ª etapa o intermediário formado é protonado e gera um novo carbocatião que vai sofrer nova reação de substituição eletrofílica aromática. O átomo de oxigénio do anel aromático adjacente sofre um ataque nucleofílico ao catião formado gerando uma nova ligação éter entre os dois anéis aromáticos. A subsequente desidratação restaura o carácter aromático do anel conduzindo à formação do anel xanteno. 2ª Etapa Por último, a oxidação do anel formado conduz à síntese do esqueleto da rosamina. 3ªEtapa Inicialmente, foram sintetizadas duas rosaminas com os grupos 1-naftilo e 2naftilo ligados ao anel xanteno formando as respetivas rosaminas 2 (R= 1’-naftilo) e 3 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 41 (R= 2’-naftilo), recorrendo ao aquecimento convencional através de banho de óleo e aquecimento por micro-ondas utilizando um dispositivo CEM Discover que se trata de um reator com cavidade monomodo (Figura 3.6). Figura 3.6 Reator micro-ondas CEM Discover. Na síntese da rosamina 2 (R= 1’-naftilo) foi usada a reação entre 1-naftaldeído e 3-dietilaminofenol, em meio ácido (ácido propiónico), na presença de p-TsOH, seguida por oxidação com cloranil (Esquema 3.2). Para esta rosamina obteve-se os seguintes rendimentos, 15% e 18%, para o aquecimento convencional e aquecimento por microondas, respetivamente. A reação ocorrida em micro-ondas apresenta vantagens comparativamente à reação em aquecimento convencional, nomeadamente, o tempo de reação que para o primeiro tipo de aquecimento é de apenas 10 min enquanto que, no aquecimento convencional, o tempo de reação foi de 16 h (Tabela 3.2). Esquema 3.2 Síntese da rosamina 2 (R= 1’-naftilo). Relativamente à síntese que conduziu à formação da rosamina 3 (R= 2’-naftilo) os protocolos utilizados foram semelhantes aos da síntese da rosamina 2 (R= 1’-naftilo), modificando-se apenas o aldeído usado, que neste caso foi o 2-naftaldeído (Esquema 3.3). A rosamina 3 (R= 2’-naftilo) apresenta menor impedimento estéreo, tendo sido A radiação micro-ondas é direcionada ao vaso reacional. Aquecimento homogéneo. Só pode ser irradiado um vaso de cada vez. Dispositivo CEM Cavidade Monomodo Especificidades do aquecimento vaso Magnetrão Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 48 Tabela 3.4 Comparação dos valores dos desvios químicos (ppm) dos espetros de RMN de 1H das rosaminas 1, 2 e 3 em CDCl3 e das rosaminas 4b e 5b em CD3OD. Rosamina H-1, 8 H-2, 7 H-4, 5 H-arilo ou H-naftilo CH2 CH3 1, R= H 7,36 6,95 6,86 7,37-7,39 (H-2’, 6’) 7,61-7,64 (H-3’, 4’, 5’) 3,67 1,34 2, R= 1’-naftilo 7,05 6,77 6,94 7,31-7,45 (H-2’, 6’, 8’) 7,57 e 7,69 (H-3’, 7’) 8,01 e 8,10 (H-4’, 5’) 3,65 1,33 3, R= 2’-naftilo 7,47 6,98 6,91 7,52 (H-3’) 7,66-7,73 e 7,95-8,06 (H-1’, 5’, 6’, 7’, 8’) 8,14 (H-4’) 3,68 1,36 4b, R= 2‘,3‘-OH 7,26 7,14 6,96 6,66 (H-6’), 6,89 (H-5’), 7,07 (H-4’), 9,00 (OH), 9,96 (OH) 3,65 1,21 5b, R= 3‘,4‘-OH 7,47 7,16 6,94 6,79 (H-6’) 6,94 (H-2’), 7,05 (H-5’), 9,77 (OH) 3,65 1,23 O espetro de RMN de 1H da rosamina 1 (R=H), tida como referência da família de compostos sintetizados neste trabalho, evidencia os sinais típicos do esqueleto xanteno, que são: um tripleto a 1,34 ppm e um quarteto a 3,67 ppm correspondentes à ressonância dos grupos etilo; um dupleto a 6,86 ppm correspondente à ressonância dos protões H-4 e H-5; um duplo dupleto a 6,95 atribuído à ressonância dos protões H-2 e H-7 e um dupleto a 7,36 ppm devido à ressonância dos protões H-1 e H-8. Existem ainda os sinais relativos à ressonância dos protões do anel fenilo ligado ao anel xanteno na posição 9, que surgem como dois multipletos a 7,37-7,39 ppm atribuído aos protões H-2’ e 6’ e a 7,61-7,64 ppm correspondente aos protões H-3’, 4’ e 5’. Para a série substituída na posição 9 do anel xanteno com anéis naftilo (rosamina 2 (R= 1’-naftilo) e 3 (R= 2’-naftilo)), os espetros de RMN de 1H mostram igualmente os sinais característicos do anel xanteno e, em particular para a rosamina 2, os sinais correspondentes às ressonâncias dos protões H-2, 7 e H-1, 8 aparecem relativamente desviados para campos mais altos, 6,77 e 7,05 ppm, respetivamente. Esta alteração dos desvios químicos é causada pelo facto do anel naftilo estar ligado pela posição 1’ ao anel xanteno, resultando num maior impedimento estéreo. Para a rosamina 3 a ligação do anel naftilo dá-se pela posição 2’ e por isso tem menos influência na ressonância dos protões H-2, 7 e H-1, 8 que surgem a 6,98 e 7,47 ppm, respetivamente. Para a série substituída na posição 9 do anel xanteno com unidades catecol (rosamina 4b (R= 2’,3’-OH) e 5b (R= 3’,4’-OH)), os espetros de RMN de 1H mostram tal como esperado os sinais característicos do anel xanteno sem alterações assinaláveis Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 49 em relação à ressonância dos respetivos protões da rosamina 1 de referência. O que melhor diferencia estas duas rosaminas são os sinais correspondentes à ressonância dos protões presentes nos respetivos anéis fenilo, como se evidencia na Figura 3.9. Dado o esquema de substituição nas posições 2’ e 3’, para a rosamina 4b surgem três sinais com constantes de acoplamento vicinal (3J) da ordem dos 7,6-8,0 Hz correspondentes aos protões das posições 4’, 5’ e 6’. Relativamente à rosamina 5b em que a substituição é feita nas posições 3’ e 4’, aparece um sinal com acoplamento a longa distância (4J) de 2,1 Hz correspondente a H-2’, um sinal com 3J= 8,0 Hz correspondente a H-5’ e um sinal com 3J= 8,0 e 4J= 2,1 Hz correspondente a H-6’. Figura 3.9 Atribuição dos protões presentes nos anéis fenilo das rosaminas 4b e 5b. Os espetros de RMN de 13C para as diferentes rosaminas 1, 2, 3, 4b e 5b apresentam nove sinais característicos correspondentes aos átomos de carbono do anel xanteno comum a estes compostos, não sofrendo alterações significativas nos valores de desvio químico, como se pode verificar na Tabela 3.5. Além disso surgem sinais correspondentes à substituição que ocorre na posição 9 do anel xanteno, quando esta é feita por um grupo naftilo nas posições 1’ ou 2’ (rosaminas 2 e 3) e também quando a substituição é feita pelas respetivas unidades catecol (rosaminas 4b e 5b). As ressonâncias dos carbonos 4a e 5a surgem a maiores valores de frequência (158,7-157,4 ppm) uma vez que estes átomos de carbono aromáticos estão sob o efeito indutivo desprotetor do átomo de oxigénio que lhes é vizinho. Além disso, a ressonância do carbono 9 surge tipicamente a (158,5-155,6 ppm) dado que corresponde à posição onde o anel xanteno é substituído por outro anel aromático contribuindo assim para elevados valores de frequência. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 50 Tabela 3.5 Desvios químicos δ (ppm) dos sinais obtidos nos espetros de RMN de 13C das rosaminas 1, 2 e 3 em CDCl3 e das rosaminas 4b e 5b em CD3OD. 1 (R=H) 2 (R=1’-naftilo) 3 (R=2’-naftilo) 4b (R=2‘,3‘-OH) 5b (R=3‘,4‘-OH) C-1e C-8 132,3 132,1 132,9 131,9 132,1 C-2 e C-7 114,4 114,3 114,7 114,3 114,2 C-3e C-6 155,7 155,8 156,2 155,1 154,9 C-4 e C-5 96,7 96,9 96,9 95,8 95,9 C-4a e C-5a 158,2 158,1 158,7 157,4 157,4 C-1a e C-8a 113,5 * 114,1 113,0 112,5 C-9 157,5 156,7 158,5 155,6 157,3 C-fenilo ou naftilo 131,9 (C-1’) 129,5 (C-2’ e C-6’) 129,1 (C-3’e C-5’) 130,5 (C-4’) 114,4; 125,2; 125,3; 127,1 e 127,8 (C-2’, C3’, C-6’, C-7’ e C-8’); 128,9 (C4’ ou C-5’); 129,6; 130,6 (C4’ ou C-5’); 126,7 (C-3’); 128,1; 128,50; 128,54; 128,8; 129,4 (C-4’); 129,7; 130,0; 133,2; 134,4 117,2 (C-4’); 119,3 (C-1’); 119,5 (C-5’); 120,4 (C-6’); 143,0 (C-2’); 145,8 (C-3’); 116,0 (C-5’); 117,3 (C-2’); 121,7 (C-6’); 122,3 (C-1’); 145,6 (C-3’); 147,8 (C-4’); NCH2CH3 46,4 46,4 46,5 45,3 45,3 NCH2CH3 12,8 12,8 12,8 12,5 12,5 * não se conseguiu fazer a atribuição A título de exemplo apresentam-se os espectros de RMN monoe bidimensionais realizados para a rosamina 5b onde R=3,4-OH, e que permitiram a atribuição dos sinais correspondentes aos protões e carbonos. O espetro que se segue corresponde ao espetro de RMN de 1H representado na Figura 3.10. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 51 Figura 3.10 Espetro de RMN de 1H da rosamina 5b. O espetro de COSY (Figura 3.11) permitiu identificar os protões acima assinalados no espetro de RMN de 1H. Figura 3.11 Espectro de COSY da rosamina 5b. Na Figura 3.12 está representado o espetro de RMN de 13C referente à rosamina 5b bem como a sua expansão da zona aromática para melhor atribuição dos carbonos. A CH3 CH2 H-4, 5 e H-2’ H-6’ H-5’ H-1, 8 H-2, 7 OH Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 52 atribuição dos carbonos foi feita com a ajuda dos espetros de HSQC e HMBC (Figura 3.13). Figura 3.12 Espetro de RMN de 13C da rosamina 5b. Figura 3.13 Espetros de HSQC e HMBC da rosamina 5b. 3.2.3.2 Espectrometria de massa A caracterização por EM foi realizada utilizando como métodos de ionização FAB+ e ESI para as rosaminas preparadas. A título de exemplo, para a rosamina 5b onde R=3,4-OH, o espetro de massa em ESI revelou a presença do pico do ião molecular, M+., a m/z 431, confirmando deste modo que estamos na presença da rosamina sintetizada. CH3 CH2 C-4, 5 C-4a, 5a C-9C-3, 6 C-4’C-3’ C-1, 8 C-1’ C-6’ C-1a, 8a C-2, 7 C-5’ C-2’ HSQC HMBC Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 53 3.2.3.3. Estudo das propriedades fotofísicas da rosamina 5b Com o objetivo de estabelecer as propriedades fotofísicas das rosaminas sintetizadas, realizaram-se estudos espetroscópicos de absorção e emissão e determinouse a absortividade molar  para os compostos de acordo com a lei de Lambert-Beer (Equação 3.1). A(λ)=(λ).c.l. Equação 3.1 Equação utilizada para a determinação da absortividade molar (  ), onde A é a absorvância máxima, c a concentração molar do composto e l é a largura da célula (1 cm). De modo a determinar as possíveis alterações no perfil do espetro de UV-Vis da série de rosaminas substituídas na posição 9 do anel xanteno com anéis naftilo (rosamina 2 (R= 1’-naftilo) e 3 (R= 2’-naftilo)) relativamente ao perfil do espetro da rodamina B, obtiveram-se os respetivos espetros em etanol (Figura 3.14). Figura 3.14 Comparação de espetros de UV-Vis da rodamina B e rosaminas 2 e 3. Os espetros obtidos mostram que a introdução dos anéis naftilo na posição 9 do anel xanteno não introduz alterações no perfil espetros de UV-Vis das rosaminas 2 e 3 relativamente à rodamina B. Obtiveram-se também os respetivos espetros de UV-Vis em diclorometano. Analisando os resultados obtidos nos dois solventes utilizados (Tabela 3.6) verificou-se que, no solvente prótico (etanol) o λmáx(abs) das rosaminas sintetizadas é desviado para λ superiores (menor energia) relativamente à rodamina B, não se 400 450 500 550 600 650 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 A  /nm Rod B 2 3 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 54 verificando uma alteração significativa nos valores de  . Quanto aos resultados obtidos no solvente aprótico (diclorometano) verifica-se que o λmáx(abs) das rosaminas sintetizadas não significativamente alterado enquanto que, o valor de  é inferior nas rosaminas sintetizadas, apresentando a rosamina 3 o valor mais baixo devido à livre rotação do anel naftilo, substituído na posição 2’, o que não acontece na rosamina 2 devido ao impedimento estéreo. A rodamina B apresenta um valor de  superior ao encontrado para as rosaminas sintetizadas devido à existência do grupo substituinte ácido carboxílico na posição 2’ do anel fenilo, impedindo a rotação do anel. Tabela 3.6 Comprimento máximo de absorção (λmáx(abs)) e absortividade molar (  ) das rosaminas 2 e 3. Rosamina Solvente λmáx(abs) (nm)  (cm-1mol dm-3)104 2 EtOH 560 5.48 CH2Cl2 561 6.85 3 EtOH 558 5.10 CH2Cl2 560 2.58 Rodamina B EtOH 543 3.25 CH2Cl2 555 11.2 Relativamente às rosaminas substituídas na posição 9 do anel xanteno com unidades catecol, apenas se estudou o comportamento da rosamina 5b (R= 3’,4’-OH) em água, visto este composto apresentar dois grupos hidroxilo passíveis de ser desprotonados a diferentes valores de pH. Os parâmetros espetroscópicos do espetro de UV-Vis da rosamina 5b a pH 6,52 (valor de pH da solução inicial obtida por dissolução da rosamina 5b em água) encontram-se na Tabela 3.7. Tabela 3.7 Comprimento máximo de absorção (λmáx(abs)) e absortividade molar (  ) da rosamina 5b. Rosamina Solvente λmáx(abs) (nm)  (cm-1moldm-3)104 5b Água (pH 6,52) 554 5,12 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 55 As Figuras (Figura 3.15 e Figura 3.16) apresentam os espetros de absorção para a gama de pH de 2 a 12. Figura 3.15 Espetro de absorvância obtido para a rosamina 5b, na gama de pH de 2 a 7, em água. Figura 3.16 Espetro de absorvância obtido para a rosamina 5b, na gama de pH de 7 a 12, em água. Os espetros de UV-Vis obtidos para a rosamina 5b mostram que à medida que o valor de pH da solução vai aumentando a absorvância do composto diminui. Observamse também alterações no perfil da banda, observando-se uma diminuição do máximo da banda a =554 nm e um alargamento da banda com o aumento de pH. 400 450 500 550 600 650 700 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Abs (nm) 207 256 305 349 402 455 501 548 605 652 702 Aumento pH 400 450 500 550 600 650 700 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Abs (nm) 702 749 794 849 906 945 1002 1050 1097 1155 1202 Aumento pH Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 56 Realizaram-se também estudos da variação de fluorescência em função do pH na gama 2 a 12 (Figura 3.17 e Figura 3.18). Figura 3.17 Espetro de fluorescência obtido para a rosamina 5b, na gama de pH de 2 a 6, em água. Figura 3.18 Espetro de fluorescência obtido para a rosamina 5b, na gama de pH de 6 a 12, em água. 560 580 600 620 640 660 680 700 0 100 200 300 400 500 600 700 IF (nm) 215 263 312 365 422 445 506 545 597 Aumento pH 560 580 600 620 640 660 680 700 0 100 200 300 400 500 IF (nm) 597 706 794 844 913 964 993 1045 1097 1147 1207 Aumento pH Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 57 Figura 3.19 Influência do pH na intensidade de fluorescência rosamina 5b, em água. Verificou-se que a fluorescência do composto diminui gradualmente à medida que o valor de pH do meio aumenta, levando à extinção total de fluorescência a partir de pH= 9,64 (Figura 3.19). O estudo do comportamento da rosamina 5b em função do pH sugere que o composto assume três formas (catiónica, neutra e aniónica) quando ocorre dissociação dos protões dos grupos hidroxilo da unidade catecol (Figura 3.20). Figura 3.20 Esquema de dissociação da rosamina 5b. Segundo o esquema de dissociação proposto e tendo em conta os resultados obtidos nos estudos espetroscópicos efetuados sugere-se que a desprotonação dos grupos hidroxilo levam a uma diminuição de absorvância assim como de intensidade de fluorescência, verificando-se uma extinção total da fluorescência para valores de pH superiores a 9,64. 2 4 6 8 10 12 0 100 200 300 400 500 600 700 IFmلx pH Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 64 elevado impedimento estéreo do suporte sólido que por vezes não permite que a reação de síntese seja completa. Neste trabalho procurou-se estudar novos suportes sólidos, mais resistentes às condições reacionais. Deste modo, testaram-se como suportes sólidos as sílicas do tipo MCM-41 e nanopartículas de sílica. O sistema poroso hexagonal MCM-41 (Figura 3.26) pertence aos materiais da família M41S sendo o material mais estudado, devido às suas propriedades texturais únicas, nomeadamente à grande área superficial (1000 m2g-1), ao elevado número de poros (1 cm3g-1) e à distribuição regular do tamanho dos poros.45 O diâmetro destes poros varia entre 15 a 100 Å e pode ser controlado por alteração do comprimento da cadeia carbonada do surfactante utlizado na síntese. As suas paredes de sílica são estruturalmente semelhantes às da sílica amorfa e a sua espessura é de aproximadamente 1 nm. As superfícies interiores dos canais contêm grupos Si-OH nucleófilos, que permitem a imobilização de complexos inorgânicos e organometálicos.46 Figura 3.26 Representação esquemática do material MCM-41.47 Existem vários métodos de introduzir grupos funcionais nos materiais mesoporosos.48 Tradicionalmente, os dois métodos mais usados são: o “grafting”, em que os grupos funcionais são inseridos numa fase pós-síntese, e co-condensação, na qual os grupos funcionais são inseridos juntamente com a fonte de sílica (síntese direta). Ambos se baseiam na ligação covalente entre os grupos funcionais e a estrutura siliciosa. O método “grafting”, pode ser realizado através de um (ou mais) dos seguintes procedimentos: - introdução dos grupos orgânicos funcionais por reação direta de organossilanos com os grupos silanol da superfície (procedimento seguido na funcionalização do MCM-41 neste trabalho); Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 65 - ancoragem de grupos funcionais através de ligações covalentes e/ou reconhecimento molecular com os grupos previamente fixados; - conversão, por reação química, dos grupos funcionais introduzidos noutros. Este método apresenta as seguintes vantagens: - a estrutura dos materiais resultantes é altamente ordenada, uma vez que a estrutura original é preservada após a reação de funcionalização; - os grupos funcionais podem ser escolhidos de acordo com os objetivos prédeterminados; - os materiais apresentam estabilidade hidrotérmica relativamente elevada. No entanto, a dificuldade em controlar a distribuição dos grupos funcionais através deste método constitui a principal desvantagem deste método. Neste trabalho pretendeu-se estudar métodos de síntese em fase sólida, escolhendo-se para isso a vanilina, e procurando perceber quais as condições ideias para a sua imobilização num material suporte. A vanilina, sendo um derivado do 3,4dihidroxibenzaldeído e por isso um precursor semelhante ao utilizado na preparação das rosaminas deste trabalho, foi selecionada para a realização dos testes de otimização da síntese em fase sólida. Além disso este composto dispensou a sua preparação, uma vez que se encontra disponível comercialmente. O esquema de reação proposto é apresentado no Esquema 3.11. A síntese foi desenvolvida em meio básico, Cs2CO3, de modo a gerar-se o alcóxido da vanilina e assim imobilizar este ligando no material de suporte. Esquema 3.11 Reação de síntese proposta para a imobilização do ligando vanilina em suporte sólido. 3.3.3.1 Funcionalização dos suportes Os materiais suportes usados são comerciais (nanopartículas de sílica e MCM41). Estes materiais foram previamente funcionalizados com 3-(cloropropil)- Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 66 trimetilsilano de forma a introduzir-se o grupo funcional –Cl na sua superfície. A reação de funcionalização ocorre através da interação dos grupos hidroxilo na superfície dos materiais com os grupos metóxilo do organossilano (Figura 3.27). O procedimento seguido foi baseado no descrito na literatura.49 Figura 3.27 Superfície dos matérias utilizados após funcionalização com 3-(cloropropil)-trimetilsilano. Na Figura 3.28 apresentam-se os espectros de IV relativos à funcionalização dos materiais de suporte: MCM-41 e nanopartículas de sílica. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 67 Figura 3.28 Espetros de IV relativos à funcionalização de MCM-41 e nanopartículas de sílica. 3.3.3.2 Imobilização de Vanilina em nanopartículas de sílica A primeira experiência realizada consistiu na imobilização da vanilina em nanopartículas de silica. A caracterização do material foi realizada pelas técnicas de espetroscopia de IV e por SEM. A imagem de SEM (Figura 3.29) demonstra que as nanopartículas de sílica com morfologia esférica bem definida, foram destruídas no meio reacional aquando da imobilização da vanilina, provavelmente devido ao carácter básico da solução. A figura 3.26 mostra a ausência de unidades esféricas, observando-se unicamente um material heterogéneo sem unidades bem definidas. 400900140019002400290034003900 número de onda (cm-1) MCM-41-Cl MCM-41 Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 68 Figura 3.29 Imagem de SEM de nanopartículas de sílica após funcionalização A destruição do material das nanopartículas de sílica foi também confirmada por IV, uma vez que as bandas características da sílica não são observadas no espectro, na região de 400-1100 cm-1: υas (Si-O-Si), υs (Si-O-Si) e δ (O-Si-O) (Esquema 3.30).50 Figura 3.30 Espetros de IV do material após funcionalização (Sílica -Cl) e após imobilização (Sílica Van). 400900140019002400290034003900 número de onda (cm-1) Sílica Van Sílica -Cl Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 69 3.3.3.3 Imobilização de Vanilina em MCM-41 O outro material testado, trata-se de uma estrutura mesoporosa, com canais bem definidos e de paredes robustas: o MCM-41. Com este suporte obtiveram-se melhores resultados, uma vez que este mostrou ser estável às condições do meio reacional, tal se verifica pelos dados obtidos na caracterização por IV e SEM. O espectro de IV (Figura 3.31) apresenta as bandas características da silica na região de 400-1100 cm-1: υas (Si-O-Si), υs (Si-O-Si) e δ (O-Si-O). Para além das bandas características do suporte, observam-se ainda as bandas correspondentes ao organossilano na superfície do material, nomeadamente a 2900-3000 cm-1 duas bandas de fraca intensidade correspondestes a υs (CH2) e υas (CH2). A banda larga a 3200-3600 cm-1 é atribuída à υs (OH).51,52 Figura 3.31 Espetros de IV do material após funcionalização (MCM-41-Cl) e após imobilização (MCM41 Van). As imagens de SEM obtidas para o material MCM-41 antes e logo após imobilização da vanilina apresentam-se do ponto de vista da sua morfologia bastante idênticas (Figura 3.32 e Figura 3.33). Indicando que durante esta experiência, ao contrário da anterior, o material de suporte não foi destruído. Sendo a vanilina uma molécula relativamente pequena a imagem após imobilização não mostra diferenças significativas. 400 900 1400 1900 2400 2900 3400 3900 número de onda (cm-1) MCM-41 Van MCM-41-Cl Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 70 Figura 3.32 Imagem de SEM de MCM-41 após funcionalização. Figura 3.33 Imagem de SEM de MCM-41 após imobilização da vanilina. Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 71 3.3.3.4 Análise Elementar Realizaram-se análises elementares de C e H das amostras MCM-41-Cl e para MCM-41 Van, ou seja, do material funcionalizado e do material após imobilização da vanilina, respetivamente. A partir da quantidade de carbono encontrada para o material funcionalizado, foi possível determinar a quantidade de organossilano presente na superfície do material MCM-41-Cl, sendo esta de 1,08x10-4 mol. Da análise de carbono efectuada ao MCM-41 após imobilização da vanilina e atendendo à quantidade de organossilano previamente determinada, foi possível conhecer a quantidade de vanilina imobilizada no suporte MCM-41 funcionalizado, sendo esta de 0,89x10-4 mol. Os estudos de síntese em fase sólida foram desenvolvidos em estreita colaboração com a investigadora Doutora Salete Balula, que gentilmente disponibilizou os materiais suporte utilizados, bem como, ajudou na realização das experiências. Capítulo 4 Considerações finais Design de novos fluoróforos utilizando metodologias mais limpas e eficientes 2012 73 4. Considerações finais Este trabalho teve como objetivo principal a preparação de novos fluoróforos do tipo rosamina, estes compostos foram preparados através de reação de condensação entre benzaldeídos – com grupos hidroxilo nas posições 2 e 3 e 3 e 4, respetivamente – e naftaldeídos – ligados pelas posições 1 e 2 – com 3-dietilamonofenol, em condições ácidas. Pretendeu-se também comparar dois tipos de aquecimento: aquecimento convencional (banho de óleo) e radiação micro-ondas, verificando-se que com este último se conseguem tempos de reação significativamente mais reduzidos (horas vs. minutos) e de um modo geral, com rendimentos superiores. Outra componente importante deste trabalho consistiu no estudo de metodologias mais limpas e eficientes nomeadamente na etapa de oxidação da preparação das rosaminas. Os resultados obtidos permitem-nos concluir que existem metodologias que futuramente merecem ser exploradas como são exemplo, a oxidação catalítica com peróxido de hidrogénio e a oxidação recorrendo ao óxido de grafeno. Ainda com o objetivo de implementar protocolos mais limpos foi preparada uma rosamina recorrendo ao método de aquecimento óhmico utilizando água como solvente sendo de salientar o sucesso dos resultados aqui obtidos: redução do tempo de reação quando comparado com o aquecimento convencional e também o uso de um solvente benigno na preparação de uma rosamina. Algumas das rosaminas preparadas neste trabalho, contendo grupos hidroxilo, mostraram propriedades espetroscópicas, nomeadamente UV-Vis e fluorescência, sensíveis às alterações do pH do meio. Estas caraterísticas sugerem uma potencial aplicação no desenvolvimento e construção de novos sensores óticos de pH.