Potencial de trombina endógeno no doente cirrótico

Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Estudante: José Ricardo Cancela Oliveira Estudante do 6º ano do Mestrado Integrado em Medicina Nº Aluno: 200901299 Endereço Eletrónico: [email protected] Orientador: Isabel Maria Teixeira de Carvalho Pedroto Grau académico: Licenciada em Medicina Título profissional: Professora Auxiliar Convidada do ICBAS Coorientador: Manuel César Santos Araújo de Campos Grau académico: Licenciado em Medicina Título profissional: Professor Auxiliar Convidado do Icbas Afiliação: Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar – Universidade do Porto Rua de Viterbo Ferreira n.º 228, 4050-313 Porto, Portugal ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico ii ABSTRACT The liver plays a central role in each phase of the clotting process, as it synthesizes the majority of coagulation factors, anticoagulants and proteins involved in fibrinolysis as well as thrombopoeitin. Cirrhosis is characterized by decreased levels of most procoagulants factors, with the exceptions of factor VIII and von Willebrand factor, which are elevated. Decreased levels of the procoagulants are, however, accompanied by decreases in levels of such naturally occurring anticoagulants as antithrombin and protein C. In physiologic conditions, the coagulation system is balanced by these two opposing drivers. Conventional coagulation tests such as prothrombin time and activated partial thromboplastin time don’t reflect the coagulation status of these patients, because they are only responsive to procoagulants factors. The thrombin generation test is a global test that measures the overall tendency of a plasma sample to form thrombin after initiation of coagulation. The endogenous thrombin potential may be considered a measure of the amount of thrombin that a given plasma sample may generate under the specified experimental conditions and represents the balance between the proand anticoagulant proteins operating in plasma. This test mimics more closely than any other what occurs in vivo. Several studies have used this test to investigate the coagulation function in patients with cirrhosis. They concluded that generation of thrombin is normal or increased in cirrhosis. Severe thrombocytopenia may limit thrombin generation in these patients. The bleeding events frequently observed in patients with end-stage liver disease are mainly due to hemodynamic alterations secondary to portal hypertension and the derangement of coagulation may not play a major role. In the future, it is expected that prospective clinical trials will be able to relate the results of thrombin generation with bleeding events and generate new guidelines for the prophylactic and therapeutic use of blood products in cirrhosis. ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico iii RESUMO O fígado desempenha um papel fundamental em cada etapa do processo de coagulação, uma vez que sintetiza a maioria dos fatores de coagulação, anti-coagulantes e proteínas envolvidas na fibrinólise, assim como a trombopoietina. A cirrose hepática é caracterizada por uma diminuição da maioria dos fatores pró-coagulantes, com a exceção do fator VIII e fator de von Willebrand, que se encontram elevados. A diminuição dos níveis de fatores pró-coagulantes é, no entanto, acompanhada por uma diminuições nos níveis dos fatores anticoagulantes como a antitrombina e a proteína C. Em condições fisiológicas, o sistema de coagulação encontra-se balanceado, com diminuição simultânea de fatores próe anticoagulantes. Os testes de coagulação convencionais, tais como o tempo de protrombina e o tempo de tromboplastina parcial ativada, não refletem o equilíbrio hemostático destes doentes, visto serem apenas influenciados por fatores pró-coagulantes. O teste de geração de trombina é um teste global que mede a aptidão de uma amostra de plasma para formar trombina após a iniciação da coagulação. O potencial de trombina endógeno consiste numa medição da quantidade de trombina que uma dada amostra de plasma pode formar, em condições experimentais especificas, e representa o equilíbrio entre fatores próe anticoagulantes no plasma. Este teste é o que mais se aproxima das condições que ocorrem in vivo. Vários estudos avaliaram a hemostase em doentes cirróticos através da utilização deste teste. Eles concluíram que doentes cirróticos produzem uma quantidade normal ou aumentada de trombina. A trombocitopenia grave pode limitar a produção de trombina nestes doentes. Os eventos hemorrágicos frequentemente observados em doentes hepáticos crónicos são devidos a alterações hemodinâmicas secundárias à hipertensão portal e o grau de coagulopatia não parece desempenhar um papel importante. No futuro, é expectável que ensaios clínicos prospetivos sejam capazes de relacionar os resultados dos testes de geração de trombina com eventos hemorrágicos e conduzam a novas diretrizes para o uso profilático e terapêutico dos produtos sanguíneos na cirrose. ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico iv Conteúdos: Lista de Abreviaturas.............................................................................................. 1 Introdução ................................................................................................................ 3 Hemostase no doente cirrótico ............................................................................... 4 Alterações do Número e Função das Plaquetas ............................................................................. 4 Infeção e Heparinoides endógenos ................................................................................................ 6 Fibrinólise ..................................................................................................................................... 6 Distúrbios da coagulação .............................................................................................................. 7 Avaliação Laboratorial da Coagulação ............................................................... 10 Tempo de Protrombina (PT) ....................................................................................................... 10 Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (aPTT) .................................................................... 10 Validade Clinica do Tempo de Protrombina e Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada ........ 11 Tromboelastografia (TEG) ......................................................................................................... 12 Teste de Geração de Trombina e Potencial de Trombina Endógeno............... 14 Trombografia Automática Calibrada (CAT) .............................................................................. 14 ETP no Doente Cirrótico ...................................................................................... 18 Conclusão ............................................................................................................... 23 Bibliografia............................................................................................................. 24 ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 1 Lista de Abreviaturas FVIII – Fator VIII FvW - Fator de von Willebrand PC – Proteína C PS – Proteína S t-PA - Ativador do Plasminogénio Tecidual PAI-1 - Inibidor do Ativador do Plasminogénio Tipo I u-PA - Ativador do Plasminogénio de Urocinase TAFI - Inibidor da Fibrinólise Ativado pela Trombina FVIIa – Fator VII ativado TF – Fator Tecidual FXa – Fator X ativado FV – Fator V FVa – Fator V ativado FIXa – Fator IX ativado FVII – Fator VII FVIIIa – Fator VIII ativado FXI – Fator XI FXIa – Fator XI ativado FXII – Fator XII ativado TFPI – Inibidor da Via do Fator Tecidual TM – Trombomodulina APC – Proteína C ativada PT – Tempo de Protrombina INR – Índice Internacional Normalizado ISI – Índice de Sensibilidade Internacional aPTT – Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada MELD - Modelo para Doença Hepática Terminal TEG – Tromboelastografia CAT - Trombografia Automática Calibrada ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 2 CTI - Inibidor da Tripsina do Milho ETP - Potencial de Trombina Endógeno ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 3 Introdução A cirrose hepática representa um estadio avançado de fibrose hepática progressiva como resposta a uma lesão hepática crónica, por vezes complicada pelo síndrome de hipertensão portal ou por insuficiência hepática de gravidade variável. O fígado é essencial na hemostase através da produção da maioria dos fatores de coagulação (todos exceto o Fator de von Willebrand e Fator VIII), das proteínas anticoagulantes naturais (proteínas C e S), proteínas relacionadas com a fibrinólise e trombopoietina, responsável pela produção de plaquetas. Os doentes cirróticos desenvolvem alterações hemostáticas complexas, secundárias à sua doença. A insuficiência hepática é responsável por um maior risco de hemorragia por alterações hemodinâmicas (hipertensão portal) ou devido à coagulopatia secundária. Contudo, estudos recentes têm demostrado um estado de hipercoagubilidade em doentes cirróticos que aumentam o risco de complicações trombóticas nestes doentes. Os doentes cirróticos têm assim um distúrbio complexo da hemostase, com diminuição de fatores pró-coagulantes e anticoagulantes, o que acarreta um risco acrescido de eventos hemorrágicos, mas também, de eventos trombóticos. Os testes laboratoriais convencionais (Tempo de Protrombina e Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada) não refletem o balanço da coagulação da mesma forma que ela ocorre in vivo, sendo maus preditores do risco hemorrágico/trombótico. O desenvolvimento de testes laboratoriais que permitam avaliar de uma forma global a hemostase neste grupo de doentes é de extrema importância para a sua monitorização, profilaxia e tratamento. Existem agora novos exames que poderão ser usados para este fim, como a Tromboelastografia e os Testes de Geração de Trombina. Esta revisão temática tem como objetivo rever os distúrbios hemostáticos no doente cirrótico, a utilização dos testes convencionais e as conclusões de vários estudos relativas ao uso do Teste de Geração de Trombina, e consequentemente do Potencial de Trombina Endógeno, no doente cirrótico. ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 4 Hemostase no doente cirrótico A coagulação é um processo complexo que envolve um conjunto dinâmico e interligado de múltiplas etapas que podem ser resumidas em quatro fases. 1. Iniciação e formação do tampão plaquetário; 2. Propagação do processo de coagulação para a cascata da coagulação; 3. Cessação da coagulação por meio de mecanismos de controlo anti-trombóticos; 4. Remoção do coágulo por fibrinólise. Os indivíduos saudáveis possuem quantidades adequadas de fatores de coagulação, proteínas reguladoras e plaquetas de forma a poderem iniciar a formação de um coágulo quando necessário, assim como, limitarem o seu crescimento a locais de dano vascular e promoverem a sua dissolução. O fígado desempenha um papel fundamental no sistema hemostático e doentes com cirrose apresentam diminuição dos níveis da maioria dos fatores pro-coagulantes, com exceção do fator VIII (FVIII) e do fator de von Willebrand (FvW), que se encontram elevados. Contudo, verificase também uma diminuição dos níveis de fatores anticoagulantes naturais, como a antitrombina e a proteína C (PC). Desta forma, o sistema de coagulação encontra-se balanceado, com diminuição simultânea de fatores próe anticoagulantes. Apesar disso, muitos livros ainda referem a doença hepática crónica como um epítome de distúrbios hemorrágicos adquiridos.[1]–[4] Alterações do Número e Função das Plaquetas Existem três fases da coagulação nas quais as plaquetas desempenham um papel crucial: hemostase primária (interações entre as plaquetas e paredes endoteliais), coagulação (geração de trombina), e fibrinólise (dissolução do coágulo).[5] As plaquetas aderem às paredes dos vasos danificados através de uma interação com uma proteína multimérica (FvW), promovendo assim a agregação e, posteriormente, a formação de um tampão hemostático primário. As plaquetas também suportam a geração de trombina pela ligação de fatores de coagulação ativados às suas superfícies.[1] A trombocitopenia é definida como qualquer diminuição do número de plaquetas abaixo do limite normal, geralmente 140X109/L, e pode estar presente em até 76% dos doentes cirróticos.[6] ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 5 Apesar da trombocitopenia não estar associada a uma aumento do risco hemorrágico por varizes esofágicas ou por outros locais, ela está associada a perda sanguínea em procedimentos cirúrgicos.[7] Trombocitopenia moderada (50-75X109/L) é observada em aproximadamente 13% dos doentes, enquanto que a trombocitopenia grave (<50X109/L) ocorre em apenas 1 % dos doentes.[8] Este valor (50X109/L) é muitas vezes usado como cut-off para procedimentos invasivos em doentes cirróticos devido ao risco comprovado de hemorragia. Isto por sua vez interfere com intervenções diagnósticas e terapêuticas como a biopsia hepática, terapia antivírica e cirurgia eletiva.[9]–[12] Várias teorias têm tentado explicar a génese da trombocitopenia nestes doentes. A diminuição da produção de trombopoietina e/ou aumento da sua destruição, sequestro esplénico devido à hipertensão portal, destruição de plaquetas mediada por auto-anticorpos, aumento do consumo plaquetário devido a um baixo grau de coagulação intravascular disseminada e supressão da medula óssea devida à doença hepática subjacente são algumas das explicações possíveis, contudo, a causa exata ainda é desconhecida, sendo provavelmente multifatorial.[13]–[16] A disfunção plaquetária também pode contribuir para um estado de hipocoagubilidade. Estes defeitos qualitativos plaquetários são dinâmicos e refletem o estado de saúde geral do doente.[5] Eles podem manifestar-se em qualquer fase da interação plaqueta-parede vascular: adesão, agregação e ativação. Tem-se verificado que a aderência de plaquetas ao subendotélio de vasos lesados se encontra alterada em doentes cirróticos.[17] Este defeito é parcialmente compensado pelo aumento concomitante do FvW. Os níveis de ADAMTS 13, uma metaloprotease plasmática que limita a função in vivo do fator de von Willebrand, estão também reduzidos nos doentes cirróticos. Este facto pode contribuir para o retorno da função plaquetária.[18] Desta forma, existe apenas uma fraca relação entre a contagem de plaquetas e o tempo de hemorragia.[19] A agregação plaquetária, que pode ocorrer como resposta a uma grande variedade de estímulos (ADP, trombina, colagénio, epinefrina ou ristocetina), encontra-se também reduzida em doentes cirróticos.[20] As plaquetas de doentes cirróticos exibem uma reduzida sinalização transmembranar e uma progressiva incapacidade de ativação em resposta a estímulos adequados, o que lhes confere um estado irresponsivo. As razões que explicam este fenómeno são as seguintes: 1) défice de armazenamento com uma concentração de grânulos densos, que contêm moléculas sinalizadoras pro-trombóticas (por exemplo, fator plaquetário 4, beta-tromboglobulina e serotonina), anormalmente baixa; 2) secreção de níveis desproporcionadamente altos de ATP que antagoniza ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 12 cirrose.[57] Podemos assim concluir que estes exames são maus preditores de eventos hemorrágicos nos cirróticos. Desta forma, possuem pouca utilidade na profilaxia de eventos hemorrágicos ou na abordagem e orientação clínica. Os testes que refletem a produção de trombina na presença de trombomodulina aparentam ter uma maior validade clínica, como será discutido mais adiante para o Potencial de Trombina Endógeno. Tromboelastografia (TEG) A TEG é um ensaio in vitro que permite uma observação e um registo contínuo de todas as funções hemostáticas que resultam na formação e dissolução de um coágulo. Este teste foi pela primeira vez introduzido em 1948 para investigar doentes que possuíam doenças hemorrágicas e pode ser considerado como um protótipo de um teste global da hemostase, visto que, alegadamente, ele reflete a contribuição da hemostase primária, cascata da coagulação e fibrinólise. No passado o uso desta técnica era limitado devido a uma baixa uniformização de resultados, baixa reprodutividade e dificuldade de interpretação. Contudo, o conceito desta técnica foi revisto recentemente e acoplado a novas tecnologias computorizadas.[48] Esta combinação, em associação com novos materiais e equipamentos, tornou esta técnica mais popular, sendo especialmente usada em intervenções cirúrgicas major como o transplante de fígado e procedimentos cardiovasculares.[59] Existem dois dispositivos disponíveis comercialmente: “Thrombelastograph Haemostasis Analyzer 5000” e o “ROTEG”.[60] Existem 5 parâmetros que são registados numa TEG. O tempo de reação (r), em minutos, representa a latência de formação do coágulo desde o início da cascata de coagulação até à formação inicial de fibrina (amplitude de 2mm). O tempo r corresponde ao INR e aPTT.[61] O tempo cinético (k), em minutos, equivale ao tempo requerido desde a formação inicial de fibrina (2mm) até o coágulo alcançar uma firmeza específica (amplitude de 20mm). O ângulo ɑ, em graus, equivale à cinética da formação do coágulo. Este valor é calculado através de uma linha tangente à curva do traçado no final do tempo r com ponto de partida na linha basal. Este valor reflete a taxa de formação de fibrina e a ligação cruzada de plaquetas, sendo maioritariamente influenciado pela concentração de fibrinogénio e número de plaquetas. A amplitude máxima, em milímetros, mede a tensão máxima do coágulo, sendo influenciada pelo número/função das plaquetas e concentração de fibrinogénio. Por último, a lise do coágulo após 30 minutos, em percentagem, corresponde à dissolução do coágulo após 30 minutos de ter alcançado a amplitude máxima. Este parâmetro é uma medida da fibrinólise. A TEG pode ainda detetar os efeitos de heparinoides ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 13 endógenos e exógenos, antagonistas da vitamina K, e agentes antiplaquetários, dependendo de detalhes específicos da técnica usada.[60], [62] A primeira utilização da TEG na doença hepática foi para encaminhar a reposição de fatores pro--hemostáticos em doentes submetidos a transplante hepático, tendo reduzido as necessidades transfusionais.[63] Alguns estudos realizados nos últimos anos têm avaliado a TEG no contexto da cirrose hepática. Doentes cirróticos têm frequentemente parâmetros da TEG normais. Num grupo de 273 doentes com cirrose estável, os parâmetros médios e medianos da TEG estavam dentro dos limites normais, embora a amplitude máxima diminuísse em proporção com o grau de trombocitopenia. Pelo contrário, num grupo de 48 doentes com cirrose estável, porém mais descompensada (INR≥1.5), o valor da amplitude máxima média encontrava-se abaixo dos limites normais, provavelmente devido ao baixo número de plaquetas. O ângulo ɑ também apresentava valores inferiores ao normal em doentes com cirrose descompensada e hipofibrinogenemia.[60] Foi também constatado, através do uso da TEG, que doentes com cirrose secundária a doença hepática colestática (cirrose biliar primária ou colangite esclerosante primária) se encontravam hipercoagulados relativamente a individuos sem doença hepática colestática e individuos saudaveis. Em contraste, o INR e outros testes laboratoriais usados frequentemente não conseguiram diferenciar este grupo dos restantes.[64] Um outro estudo constatou um estado de hipercoagubilidade nos individuos com doença hepática colestática. Este estudo atribui as diferenças observadas à maior concentração de fibrinogénio e à melhor função plaquetária nesta população de doentes.[65] A TEG demonstrou utilidade clínica como preditor de complicações de doença hepática, como a hemorragia gastrointestinal e a infeção.[60] Constatou-se que a TEG é superior ao INR e ao número de plaquetas para estimar o risco de re-hemorragia por varizes esofágicas.[66] Apesar de todas as aparentes vantagens associadas ao uso clinico deste teste, são necessários dados mais robustos para a sua validação clínica no futuro. ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 14 Teste de Geração de Trombina e Potencial de Trombina Endógeno O teste de geração de trombina mede a capacidade de produção de trombina de uma amostra de plasma através da ativação in vitro da coagulação com fator tecidual ou outro trigger. Ao contrário dos testes de coagulação clássicos (PT e aPTT), que apenas exploram a fase inicial da coagulação, estes testes exploram também a fase de propagação (quando a maior proporção de trombina é produzida por mecanismos de retroalimentação que ocorrem ao nível dos fatores V, VIII e XI) e a fase de cessação (quando a formação de trombina termina por vias anti-coagulantes e toda a atividade da trombina é inibida por inibidores da protéase plasmática). A curva de geração de trombina resultante reflete e integra todas as reações proe anticoagulantes que regulam a formação e inibição de trombina. Tendo em consideração que a trombina é a enzima final e o principal interveniente do processo de coagulação, os testes de geração de trombina mostram um elevado potencial como testes globais da coagulação.[67] O primeiro teste de geração de trombina foi introduzido em 1953. Este ensaio era de difícil realização e constituía uma técnica imprecisa. Ao longo do tempo, surgiram sucessivas melhorias e diferentes métodos para medição da produção de trombina foram desenvolvidos e usados em diferentes estudos. De seguida será descrito a técnica do método mais frequentemente usado: Trombografia Automática Calibrada (CAT). Trombografia Automática Calibrada (CAT) A CAT depende da utilização de uma substrato fluorogenico de baixa afinidade (Z-Gly-GlyArg-AMC) para monitorizar continuamente a atividade da trombina no plasma. Visto que a fluorescência não sobre influência das alterações provocadas pela turbulência associada à formação do coágulo, este teste pode ser realizado com plasma completo rico ou pobre em plaquetas, em condições semelhantes às que ocorrem in vivo. Contudo, uma calibração apropriada é necessária para corrigir efeitos inerentes ao filtro, isto é, a supressão do sinal fluorescente por moléculas do substrato que já teriam sido convertidas e pela cor do plasma, que difere entre amostras de plasma individuais. Este teste é realizado numa placa de microtitulação e as leituras do sinal fluorescente são convertidas automaticamente em curvas de geração de trombina por programas especializados.[67] ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 15 Cada CAT requere duas medições do sinal de fluorescência da mesma amostra. Numa célula da placa de microtitulação, a célula de medição, é adicionado ao plasma TF e vesiculas de fosfolípidos sintéticos para iniciar a coagulação e induzir a formação de trombina. Numa segunda célula, a célula de calibração, uma quantidade apropriada de substrato (o “calibrador de trombina”) é adicionada ao plasma sem ativação da coagulação. O calibrador de trombina consiste em trombina ligada à ɑ2-macroglobulina (ɑ2M-trombina), uma forma de trombina que não pode ser inibida pelos inibidores da protéase plasmática. Uma mistura de CaCl2 e substrato fluorogenico é posteriormente adicionada a ambas as células e o sinal fluorescente produzido é registado em tempo real por um fluorómetro. A fluorescência registada na célula de medição é produzida pela trombina gerada no plasma após a iniciação da coagulação e, após correções apropriadas, forma a base para o cálculo da curva de geração de trombina. Na célula de calibração o substrato fluorogenico é convertido a um ritmo constante pelo calibrador de trombina. Obtém-se desta forma um traçado fluorescente linear, cuja inclinação equivale ao fator de calibração necessário para converter as unidades de fluorescência em unidades de concentração de trombina (nM). Há medida que mais substrato é convertido, o traçado fluorescente na célula de calibração diminui a sua inclinação devido aos efeitos inerentes ao filtro e ao consumo de substrato. O desvio da linearidade é quantificado por programas especializados e usado para corrigir o registo fluorescente da célula de medição. Além disso, o sinal produzido resultante da conversão do substrato pela ɑ2M-trombina é subtraído por meio de um algoritmo matemático. A curva de geração de trombina é então calculada através da primeira derivação do traçado fluorescente totalmente corrigido.[67] A curva de geração de trombina é caracterizada por uma curta fase de iniciação (lag phase), seguida por uma produção exponencial de trombina (propagação) que posteriormente desaparece devido à inibição causada pela atuação da antitrombina. Vários parâmetros podem ser obtidos a partir de uma curva de geração de trombina, incluindo o tempo de iniciação (lag time), tempo para atingir o pico de concentração de trombina (peak time), concentração máxima de trombina (peak height) e área sob a curva (Potencial de Trombina Endógeno – ETP). O lag time é definido como o tempo necessário para a concentração de trombina alcançar 1/6 da concentração máxima e mostra uma boa correlação com o PT. O ETP representa todo o trabalho enzimático desempenhado pela trombina durante o tempo em que está ativa e é considerado o parâmetro mais preditivo do risco hemorrágico/trombótico. Tempos de iniciação prolongados e ETP/Peak height diminuídos sugerem um estado hipocoagulado, com maior risco hemorrágico. Pelo contrário, tempos de ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 16 iniciação diminuídos e ETP/Peak height aumentados indicam um estado hipercoagulado, com maior risco trombótico.[67] Os testes de geração de trombina apresentam uma variabilidade intrae inter-teste inferior a 10% para todos os parâmetros avaliados, o que torna este teste reproduzível.[68], [69] As condições experimentais do exame podem ser facilmente modificadas para propósitos específicos, o que constitui uma vantagem relativamente a outros exames. Por exemplo, a coagulação pode ser iniciada com diferentes concentrações de TF (ou mesmo um outro iniciador) e a concentração e composição dos lípidos adicionados pode ser alterada. O inibidor da tripsina do milho (CTI – Corn Trypsin Inhibitor), um inibidor específico do FXIIa pode ser adicionado para bloquear a ativação de contacto. A trombomodulina solúvel (TM) ou a proteína C ativada (APC) podem ser incluídos no ensaio de forma a alterar a via anticoagulante da PC. As condições experimentais devem ser determinadas rigorosamente, visto que elas determinam quais as vias proe anti-coagulantes contribuem para a produção de trombina e, consequentemente, influenciam o resultado final. Por exemplo, a concentração de TF irá determinar a contribuição da coagulação intrínseca no processo de geração de trombina e qual o papel desempenhado pelo TFPI ou PS na inibição da formação de trombina. De maneira semelhante, a adição de TM ou APC aumenta a sensibilidade do exame para a via anticoagulante desempenhada pela PC. Sendo assim, os fatores de coagulação e inibidores que atualmente contribuem para a modulação da curva de geração de trombina, os fatores determinantes do teste, sofrem alterações de acordo com as condições experimentais utilizadas. Vários estudos, realizados sob diferentes condições experimentais avaliaram a influência de diferentes determinantes na formação de trombina. Contatou-se que os principais determinantes são o fibrinogénio e TFPI quando são usadas baixas concentrações de TF, contudo, quando são usadas altas concentrações, os principais determinantes são a protrombina e antitrombina. Também foi demonstrado que a função plaquetária exerce uma forte influência quando é utilizado plasma rico em plaquetas. A geração de trombina é também influenciada por variantes biológicas como a idade, sexo, índice de massa corporal, fatores genéticos e condições adquiridas (p.e. gravidez, contraceção oral, etc.), os quais influenciam os níveis de certos fatores de coagulação e inibidores. Esta variabilidade de resultados sob diferentes condições experimentais pode ser usada para identificar processos ou proteínas específicas da coagulação que sejam responsáveis pelo fenótipo de um doente.[67] ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 17 Os testes de geração de trombina são cada vez mais utilizados, sendo atualmente realizados em vários laboratórios em todo o mundo. Embora o seu uso tenha principalmente um fim investigacional, a sua potencial utilização clinica como preditor de risco hemorrágico/trombótico tem sido explorada por vários estudos. No futuro, estes testes poderão ser usados em decisões clinicas relacionadas com a prevenção e tratamento de distúrbios da coagulação. Contudo, existem ainda alguns problemas. A diferença de protocolos e condições experimentais, com uso de diferentes reagentes a concentrações desiguais, torna difícil o estabelecimento de intervalos de referência para os parâmetros avaliados e a sua comparação entre diferentes laboratórios. Existem ainda questões relacionadas com a colheita da amostra, a preparação do plasma e outras variáveis pré-analíticas que podem influenciar o resultado final. ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 18 ETP no Doente Cirrótico Nos últimos anos vários estudos realizados avaliaram a hemostase no doente cirrótico através da utilização de testes de geração de trombina, partindo do pressuposto que os testes convencionais eram incapazes de refletir um balanço global da coagulação, sendo maioritariamente influenciados por fatores pró-coagulantes, não refletindo alterações nos fatores anti-coagulantes, que estão presentes na maioria dos doentes. Um estudo publicado em 2005 por Tripodi et al. avaliou a função hemostática em doentes cirróticos através de um teste de geração de trombina em plasma sem plaquetas. Constatou-se que a produção de trombina se encontrava diminuída quando o teste era realizado sem TM, o que é consistente com os níveis reduzidos de protrombina que são frequentemente encontrados nestes doentes. Contudo, quando o exame era realizado com a adição de TM, de forma a ocorrer uma ativação completa da PC, os doentes com cirrose produziam quantidades semelhantes de trombina relativamente ao grupo controlo, apesar de possuírem um TP e aPTT superior. Isto sugere que a redução de protrombina é compensada pela redução de PC, mantendo o equilíbrio da hemostase inalterado. Constatou-se mesmo que a redução da PC era superior à da protrombina, o que poderia explicar a baixa frequência de hemorragias em outros locais além do trato gastro-intestinal. Existem ainda outros fatores que podem ser responsáveis pela normal produção de trombina. O FVIII está aumentado em doentes cirróticos comparativamente a individuos normais, e constatouse previamente que elevados níveis deste fator estão associados a marcadores bioquímicos de formação de trombina – fragmento 1+2 de protrombina. Os baixos níveis de antitrombina e TFPI podem também ajudar a restaurar o balanço hemostático e evitar a ocorrência de hemorragias. Estes resultados sugerem que a ocorrência de eventos hemorrágicos se deve principalmente a alterações hemodinâmicas, como a hipertensão portal, e não é dependente de alterações do sistema hemostático. Eles também ajudam a explicar a baixa eficácia clinica de agentes pró-coagulantes como o fator VII recombinante ativo no controlo da hemorragia por varizes esofágicas. Outra implicação clínica destes resultados consiste no facto do PT e aPTT serem inadequados para predizer o verdadeiro risco hemorrágico em doentes que serão submetidos a procedimentos invasivos como a biopsia hepática ou cirurgia de transplante.[57] A formação de trombina in vivo é também dependente da função plaquetária, o que sugere que certos graus de trombocitopenia ou trombocitopatia possam afetar a produção de trombina nos ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 19 doentes cirróticos. Um estudo realizado em 2006 Tripodi et al. avaliou esta hipótese através de um teste de geração de trombina. Os investigadores tentaram usar um exame com condições experimentais que mimetizassem o melhor possível as condições que ocorrem in vivo, isto é, a presença de fatores de coagulação, a presença de TM para uma ativação ótima da PC e a presença de plaquetas. O número de plaquetas das amostras foi ajustado para corresponder a uma contagem padronizada (i.e., 100 X 109/L) e também para a contagem de plaquetas do doente. Os resultados mostraram que a produção de trombina se encontrava normal quando eram usadas amostras de plasma ricas em plaquetas com o ajuste prévio da contagem de plaquetas para 100 X 109/L. Concluiu-se então que as plaquetas de doentes cirróticos são capazes de suportar uma produção adequada de trombina. Contudo, quando o número de plaquetas foi ajustada para a contagem de plaquetas do doente, refletindo a presença de trombocitopenia, as diferenças entre doentes e grupo controlo foi estatisticamente diferente, e houve doentes que produziram baixos níveis de trombina. Curiosamente, estes doentes eram os que apresentavam as contagens de plaquetas mais baixas, o que sugere que o número de plaquetas tenha um papel chave na produção de trombina e na tendência para eventos hemorrágicos. Esta conclusão é suportada por 3 linhas de evidência. Primeiro, houve diferença estatisticamente significativa entre doentes (baixo número de plaquetas) e grupo controlo (normal número de plaquetas). Segundo, a quantidade de trombina formada correlacionava-se com o número de plaquetas. Terceiro, a quantidade de trombina gerada aumentou significativamente quando o número de plaquetas foi ajustado para 100 X 109/L. Este aumento é estatisticamente significativo, contudo, a sua relevância in vivo ainda não foi estabelecida. Estas conclusões poderiam justificar a transfusão plaquetária ou o tratamento com trombopoietina recombinante humana naqueles doentes com trombocitopenia severa quando têm hemorragias espontâneas ou antes de serem submetidos a uma cirurgia ou biopsia hepática. As plaquetas transfundidas poderiam proporcionar as superfícies fosfolipídicas adequadas para complementar a produção normal de trombina. Embora a sobrevivência das plaquetas esteja reduzida em doentes cirróticos, o que poderá limitar a transfusão plaquetária como medida terapêutica, o mesmo não se passa para o uso de trombopoietina. Ensaios clínicos serão necessários para determinar o valor clinico destas medidas terapêuticas no controlo e profilaxia de eventos hemorrágicos, mesmo como alternativa ao fator VII recombinante ativo.[70] Um outro estudo realizado em 2010 por Gatt et al. teve como objetivo demostrar a utilidade de um teste de geração de trombina, o CAT, em doentes com cirrose hepática, especialmente aqueles com coagulopatia evidenciada por um INR aumentado. Os autores quiseram verificar as ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 20 conclusões do estudo realizado em 2005 por Tripodi et al., que, segundo eles, poderiam ter sido influenciadas pela ativação de contacto, um fenómeno que resulta num aumento na produção de trombina como resultado da ativação do FXII, especialmente quando se usam baixas concentrações de TF, ou pelo viés existente devido ao facto de alguns doentes possuírem um PT normal. Os investigadores referiram ainda que apesar do ETP ser normal, podem ocorrer defeitos em outros momentos da produção de trombina que podem ser demonstrados por alterações dos parâmetros da curva de geração de trombina. Para evitar o fenómeno de ativação de contacto foi usado neste estudo o CTI. Foram registados, tanto para o grupo controlo como para o grupo de doentes, os seguintes parâmetros do teste de geração de trombina: lag time, peak time, peak height, ETP e start tail time (tempo decorrido entre o inicio e o fim da reação). Foi também calculada a velocidade máxima de produção de trombina pela divisão entre o peak time e a lag time. A taxa de inibição de trombina foi calculada a partir da seguinte fórmula: 𝑝𝑒𝑎𝑘 ℎ𝑒𝑖𝑔ℎ𝑡(𝑛𝑀) 𝑆𝑇𝑇− 𝑝𝑒𝑎𝑘 𝑡𝑖𝑚𝑒 (min) Neste estudo foi usado um extrato de veneno de cobra, o Protac®, como substituto da TM recombinante solúvel, que demonstrou em outros estudos ser adequado para ativação da PC. O rácio de ETP foi calculado pela divisão do ETP com Protac® pelo ETP sem Protac®. Foi calculado o PT e INR para todas as amostras assim como os níveis de FVIII, antitrombina, PC, PS livre, FII e FV, TFPI e fibrinogénio. Os resultados do estudo mostraram que doentes com cirrose e INR aumentando têm um perfil hipercoagulante de produção de trombina com uma velocidade máxima de geração de trombina aumentada, taxa de inibição de trombina diminuída, ETP aumentado após a adição de Protac® e rácios de ETP aumentados. Este foi o primeiro estudo a demonstrar um estado hipercoagulante no doente cirrótico. Verificou-se também que a fase inicial de formação de trombina, representada pelo lag time, é normal neste grupo de doentes. Os níveis de antitrombina estavam correlacionados positivamente com o lag time. O TFPI demostrou ser uma variável independente do lag time. O rácio de ETP aumentado demonstra uma maior resistência ao veneno de cobra por parte do grupo de doentes, que produzem mais trombina quando este extrato é adicionado. Esta resistência aumentada pode ser explicada pela redução dos níveis de PC, mas também pela redução dos níveis de FV e pelo aumento dos níveis de FVIII, que por sua vez dificultam a ativação da PC, visto que o FV atua como um cofator da PC na inativação do FVIIIa. Os resultados obtidos são consistentes com outros estudos que demonstraram que os doentes ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 21 hepáticos não estão protegidos de eventos trombóticos apesar de terem um INR aumentado, e tinham um risco trombótico aumentado quando comparados com o grupo controlo. Verificou-se também que a maioria dos doentes com INRs superiores a 1.2 são resistentes ao Protac® mas os doentes com INRs entre 1.21 e 2.0 também demostraram uma aumento na velocidade de produção de trombina, possivelmente devido a uma estado pro-coagulante. Mais estudos serão necessários para investigar um maior grupo de doentes com INRs superiores a 2.5, de forma a determinar se este fenómeno apenas se verifica para doentes com coagulopatia ligeira a moderada. Existiram ainda algumas limitações associadas a este estudo que devem ser mencionadas. Os autores não usaram plasma rico em plaquetas, da mesma forma que o estudo realizado em 2005, o que torna este exame menos sensível à presença de trombocitopenia. Outra limitação refere-se às diferenças de idade e de género entre o grupo de doentes e o grupo controlo. Apesar destas limitações, podese concluir que o balanço hemostático nos doentes cirróticos favorece a ocorrência de eventos trombóticos, ao contrário do que se acreditava antigamente. Mais uma vez, constatou-se que os testes convencionais (PT/INR) não devem ser usados para avaliar o risco hemorrágico e na maioria dos casos, a transfusão profilática de fatores de coagulação não é justificada e pode mesmo ser perigosa por aumentar o risco trombótico e atrasar procedimentos terapêuticos e diagnósticos clinicamente importantes. Os autores defendem mesmo que estes resultados justificam a realização de mais estudos de forma a criarem-se novas orientações clínicas para o uso profilático ou terapêutico de produtos sanguíneos e que o uso de testes de geração de trombina poderá ser a melhor alternativa para a avaliação da hemostasia e orientação do uso de agentes hemostáticos neste grupo de doentes.[71] Por fim, um último estudo realizado em 2012 por Nam Youngwon et al. investigou a relação entre os diferentes fatores pro-coagulantes e anticoagulantes e os testes convencionais (PT e aPTT) e o teste de geração de trombina, numa amostra de doentes cirróticos. Os autores também usaram o teste de geração de trombina com duas concentrações diferentes de TF (1 e 5pM) para investigar se os doentes com cirrose exibiam um estado hipoou hipercoagulante. Os parâmetros registados para o teste de geração de trombina foram o lag time, o ETP e o peak height. Neste estudo foi utilizado TM recombinante solúvel e o rácio de ETP foi calculado dividindo o ETP com TM pelo ETP sem TM. Foi também calculado o PT e o aPTT, níveis de fibrinogénio, níveis de fatores de coagulação (II, V, VII, VIII, IX e X), níveis de antitrombina, PC e PS. Os resultados demonstraram que os níveis de FII, FV, FVII e FIX influenciam significativamente o PT. Como o fígado produz a grande maioria dos fatores de coagulação, o ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Potencial de Trombina Endógeno no Doente Cirrótico 28 [71] A. Gatt, A. Riddell, V. Calvaruso, E. G. Tuddenham, M. Makris, and A. K. Burroughs, “Enhanced thrombin generation in patients with cirrhosis-induced coagulopathy,” J. Thromb. Haemost. JTH, vol. 8, no. 9, pp. 1994–2000, Sep. 2010. [72] N. Youngwon, J.-E. Kim, H. S. Lim, K.-S. Han, and H. K. Kim, “Coagulation proteins influencing global coagulation assays in cirrhosis: hypercoagulability in cirrhosis assessed by thrombomodulin-induced thrombin generation assay,” BioMed Res. Int., vol. 2013, p. 856754, 2013.