Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis - A influência da concentração dos precursores e de outros fatores

Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/ Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores José Guilherme Domingues Araújo de Bragança dos Santos Mestrado de Viticultura e Enologia 2014 Orientador José António Couto, Escola Superior de Biotecnologia Católica do Porto Coorientador Jorge Bernardo Lacerda de Queiroz, Prof. Auxiliar da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/ Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores José Guilherme Domingues Araújo de Bragança dos Santos Mestrado de Viticultura e Enologia José António Couto, Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Jorge Bernardo Lacerda de Queiroz, Prof. Auxiliar da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto F C U P | I Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Índice geral Resumo................................................................................................................................1 Abstract..................................................................................................................................2 Introdução...........................................................................................................................3 1. A relação dos microrganismos com o vinho..................................................................3 1.1 As leveduras apiculadas............................................................................................3 1.2 Candida e Pichia .......................................................................................................3 1.3 Leveduras fermentativas ...........................................................................................4 1.4 Contaminações bacterianas ......................................................................................4 2. Brettanomyces/Dekkera bruxellensis...............................................................................5 2.1 Características da levedura.......................................................................................5 2.2 Efeitos negativos no vinho ........................................................................................5 2.3 Fenóis voláteis e os seus precursores ......................................................................6 3. Fatores que influenciam o crescimento de Dekkera bruxellensis e a produção de fenóis voláteis ....................................................................................................................... 7 3.1 Dióxido de enxofre (SO2)...........................................................................................7 3.2 Temperatura..............................................................................................................8 3.3 Etanol........................................................................................................................8 3.4 Concentração de açúcares........................................................................................9 3.5 Composição de aminoácidos.....................................................................................9 4. Objetivo desta tese ........................................................................................................10 Material e Métodos.............................................................................................................11 1. Levedura usada e condições de crescimento ..............................................................11 1.1 Efeito da concentração do precursor na produção de fenóis voláteis .....................11 1.2 Efeito do pH, SO2e etanol na produção de fenóis voláteis.....................................11 1.3 Efeito da fonte de carbono na produção de fenóis voláteis.....................................12 1.4 Efeito da fonte de azoto na produção de fenóis voláteis.........................................13 F C U P | II Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores 2. Análise de Fenóis Voláteis (Extração e método de análise) .......................................14 2.1 Protocolo de extração..............................................................................................14 2.2 Método de análise ...................................................................................................15 2.2.1 CG-FID.......................................................................................................15 2.2.2 Curvas de calibração..................................................................................15 Resultados e Discussão....................................................................................................17 1. Efeito da concentração do precursor na produção de fenóis voláteis .......................17 2. Efeito do pH, SO2 e etanol na produção de fenóis voláteis .......................................18 3. Crescimento e produção de fenóis voláteis – efeito das diferentes fontes de carbono .........22 4. Crescimento e produção de fenóis voláteis – efeito das diferentes fontes de azoto..25 Conclusão...........................................................................................................................27 Referências.........................................................................................................................28 F C U P | III Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Lista de Tabelas Tabela 1 - Experiências efectuadas em YM inoculado com Dekkera bruxellensis 1% (v/v)..12 Tabela 2 - Experiências efectuadas em vinho sintético inoculado com Dekkera bruxellensis 1% (v/v) ...............................................................................................................................14 Tabela 3 - Tempos de retenção médios para os compostos calibrados...............................15 Lista de Figuras Figura 1 - Formação de etilfenóis a partir dos precursores hidroxicinâmicos.........................6 Figura 2 -Curva de calibração para 4-etilfenol e 4-vinilfenol incluindo a equação de cada recta.....................................................................................................................................16 Figura 3 - Absorvância a várias concentrações de p-cumárico ao longo do tempo..............18 Figura 4 - 4-etilfenol produzido a partir de diferentes concentrações de p-cumárico............18 Figura 5 - Absorvância a diferentes valores de pH ao longo do tempo ...............................19 Figura 6 - Concentração de 4-etilfenol produzido a diferentes valores de pH .....................19 Figura 7 - Absorvância a diferentes concentrações de SO2livre ao longo do tempo...........20 Figura 8 - Produção de 4-etilfenol a diferentes concentrações de SO2 livre.........................20 Figura 9 - Absorvância a diferentes percentagens de etanol ao longo do tempo.................21 Figura 10 - 4-etilfenol produzido em diferentes concentrações de álcool ............................21 Figura 11 - Crescimento de D. bruxellensis ao longo do tempo em diferentes fontes de carbono (2g/L)......................................................................................................................22 Figura 12 - Produção de 4-etilfenol por D. bruxellensis em diferentes fontes de carbono....23 Figura 13 - Crescimento de Dekkera b. em diferentes combinações de fontes de carbono. 24 Figura 14 - 4-etilfenol produzido por D. bruxellensis em diferentes combinações de açúcares .............................................................................................................................................24 Figura 15 - Crescimento de D. bruxellensis ao longo do tempo em diferentes fontes de azoto .............................................................................................................................................25 Figura 16 - Produção de 4-etilfenol por D. bruxellensis em diferentes fontes de azoto........26 F C U P |1 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Resumo Os fenóis voláteis, mais precisamente os vinilfenóis e etilfenóis, são fonte de grande preocupação na indústria vitivinícola. Estes compostos podem ser produzidos nos vinhos a partir da actividade de Brettanomyces/Dekkera bruxellensis e de outros microrganismos, dando origem a odores não desejados, descritos como “medicinal”, “suor de cavalo” ou “couro”. O principal objetivo desta tese foi estudar a influência da concentração dos precursores na produção de fenóis voláteis por Dekkera bruxellensis PYCC 4801 identificando a concentração mínima necessária para a produção de níveis com impacto sensorial. Foi também avaliada a influência de fatores como o pH, a presença de etanol, a presença de SO2, diferentes fontes de carbono e azoto, neste metabolismo. Verificou-se que, nas condições estudadas, a quantidade de ácido p-cumárico necessária para a produção de cerca de 0,4 mg/L de fenóis voláteis (limite de perceção olfactiva referenciado na literatura) é 2 mg/L, correspondendo a uma taxa de conversão molar de 28% e obtendo apenas o 4-etilfenol como produto final. Factores como o pH, SO2e etanol não tiveram influência significativa na produção do nível de fenóis voláteis acima referido. Verificou-se que, embora o crescimento de D. bruxellensis PYCC 4801 seja afectado pela composição de açúcares, estes não afectam a capacidade da levedura metabolizar o ácido p-cumárico. Também se observou que a produção de fenóis voláteis não foi afectada pela composição azotada do meio, uma vez que diferentes fontes de azoto levaram à produção de níveis semelhantes de 4-etilfenol. Palavras-chave: Dekkera bruxellensis, ácido p-cumárico, 4-etilfenol, vinho F C U P |2 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Abstract Volatile phenols such as vinylphenols and ethylphenols are source of great concern in the wine industry. These compounds can be produced in wine from Brettanomyces/Dekkera bruxellensis and other organisms that cause unwanted odors described as "medicinal", "horse sweat" or "leather". The main purpose of this thesis was to study the influence of a low concentration of a precursor in the production of volatile phenols with sensory impact by Dekkera bruxellensis PYCC 4801. It was also evaluated the influence of pH, ethanol, SO2, the presence of different carbon and nitrogen sources on this metabolism. Under the conditions studied, it was found that the amount of p-coumaric acid required to produce about 0.4 mg/L of volatile phenols (olfactory perception threshold referenced in the literature) is 2 mg/L, corresponding to a conversion rate of 28 % molar yield. Only 4-ethylphenol was detected as the final product. Factors such as pH, SO2, and ethanol had no significant influence on the production levels of volatile phenols. Although growth of D. bruxellensis PYCC 4801 is affected by the composition of sugars, they do not affect the ability of the yeast to metabolize p-coumaric acid. It was also observed that the production of volatile phenols was not affected by the composition of nitrogen in the medium, since different nitrogen sources led to the production of similar levels of 4-ethylphenol. Keywords: Dekkera bruxellensis, p-coumaric acid, 4-ethylphenol, wine F C U P |3 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Introdução 1. A relação dos microrganismos com o vinho O interesse pelo estudo da ação dos microrganismos na fermentação de bebidas alcoólicas existe há muitos anos. No século XIX, Louis Pasteur observou a ação das leveduras na transformação do sumo de uva em vinho, enquanto observava que outros microrganismos, por exemplo as bactérias, podiam ser prejudiciais para a qualidade do mesmo (Oelofse, 2008). Desde essa descoberta, a microbiologia dos vinhos tem sido alvo de estudo intenso e hoje sabemos que já existe uma grande diversidade de microrganismos envolvida no processo de vinificação. A levedura principal e mais conhecida na fermentação alcoólica é a Saccharomyces cerevisae. Existem, porém, muitas outras leveduras envolvidas na fermentação e ainda outras que podem desenvolver-se em etapas pós fermentativas causando a deterioração do vinho. 1.1 As leveduras apiculadas As leveduras apiculadas, caracterizadas pela sua forma oval, são particularmente frequentes nas superfícies das uvas e no mosto depois do esmagamento (Malfeito-Ferreira 2010). Espécies do género Kloeckera/Hanseniaspora são controladas facilmente através do uso de dióxido de enxofre sendo inibidas durante a fermentação. No entanto podem crescer rapidamente no início da fermentação e produzir acetato de etilo (causador de aroma a verniz) (Romano 2005). 1.2 Candida e Pichia Existem espécies, como por exemplo dos géneros Candida e Pichia que formam biofilmes na superfície do mosto ou vinho. De crescimento rápido e de natureza aeróbia – se o ar presente no topo das unidades de armazenamento não for minimizado –, estas leveduras produzem acetaldeído que provoca um aroma de maçã podre. Vinhos tintos jovens, antes da fermentação malolática, com níveis reduzidos de dióxido de enxofre, podem sofrer este defeito. Se a contaminação for elevada, pode ocorrer sedimentação em garrafa (MalfeitoFerreira 2010). F C U P |4 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores 1.3 Leveduras fermentativas Sacharomyces cerevisiae e Saccharomyces bayanus são as espécies mais desejadas para a fermentação do vinho; no entanto, também podem provocar a sua deterioração. Pode ocorrer um desequilíbrio nutricional no mosto, o que leva à produção de maus aromas, transmitidos por compostos de enxofre reduzidos (Bell e Henschke 2005). O facto de hoje em dia o mosto ser manipulado de modo a evitar o contato com o oxigénio, contribui para esse desequilíbrio. Estas espécies podem produzir fenóis voláteis, mais precisamente vinilfenóis, devido ao uso de enzimas pectolíticas usadas para clarificar o mosto que libertam ácidos hidroxicinâmicos e que são descarboxilados pela levedura. Os amuos de fermentação constituem outro problema. Normalmente, os vinhos em que a fermentação amua contêm uma acidez volátil mais elevada, de origem difícil de determinar, porque pode ser resultado da atividade das leveduras de fermentação, leveduras de contaminação ou bactérias. (Malfeito-Ferreira 2010). 1.4 Contaminações bacterianas Uvas muito maduras tem tendência para possuir populações bacterianas maiores. Certas condições climáticas, também promovem esta situação. Uma contaminação elevada de bactérias lácticas ou acéticas fazem com que, quando a fermentação estiver a abrandar, estas compitam com a levedura por nutrientes aumentando o risco da fermentação amuar. Bactérias do ácido láctico, que causam este problema, podem ser travadas com o uso de lisozima. Nessas condições e caso se pretenda realizar a fermentação maloláctica, será necessário inocular o mosto com bactérias malolácticas. (Kennedy, 2008) Contaminações microbiológicas podem ocorrer em qualquer etapa da vinificação. Superfícies dos equipamentos de vinificação, difíceis de higienizar, constituem focos de contaminação ao promoverem o crescimento de microrganismos com os quais o mosto ou o vinho entram em contato. Por exemplo, as barricas, que embora promovam a melhoria das propriedades organolépticas do vinho tinto, são difíceis de descontaminar, devido ao material poroso da madeira, tornando o crescimento de microrganismos indesejáveis, como por exemplo Brettanomyces/Dekkera bruxellensis, mais difícil de controlar (Suárez et al, 2007) mesmo com técnicas recentes. F C U P |5 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores 2. Brettanomyces/Dekkera bruxellensis 2.1 Características da levedura Dekkera bruxellensis (anamorfo da Brettanomyces bruxellensis) foi isolada pela primeira vez por Claussen, em 1903, a partir de diferentes cervejas inglesas (Gilliland, 1961). As células desta levedura são elipsoidais a esféricas, mas também cilíndricas e alongadas. Podem formar pseudomicélio e o seu crescimento é lento. Em condições aeróbias, produzem ácido acético, a partir de glucose, em grandes quantidades (Van der Walt, 1964). Possuem metabolismo oxidativo ou fermentativo, sendo este último promovido pela presença de oxigénio - efeito Custer, caracterizado pela inibição temporária da fermentação sob condições anaeróbias (Wijsman et al., 1984; Scheffers, 1979). D. bruxellensis não cresce em meios sem vitaminas, requerendo biotina e/ou tiamina para crescer (Barnett et al., 2000). D. bruxellensis possui um conjunto de adaptações que lhe permite sobreviver nos ambientes fermentativos do mosto e do vinho em maturação. Tal como a S. cerevisiae, é tolerante ao etanol, anaeróbia facultativa e não possui DNA mitocondrial (Woolfit et al., 2007). Ambas as espécies realizam a fermentação alcoólica, na presença de elevadas concentrações de glucose, em aerobiose (Kurtzman, 1998). No entanto, D. bruxellensis utiliza a glucose de forma menos eficiente e cresce mais lentamente do que S. cerevisiae (Silva, 2004), mas consegue assimilar uma maior variedade de fontes de carbono (Conterno et al., 2006). Estes factores explicam a presença de D. bruxellensis nos vinhos, após as fermentações alcoólica e maloláctica, durante a maturação, onde existe uma concentração de etanol elevada e açúcares residuais (Woolfit et al., 2007). 2.2 Efeitos negativos no vinho Os produtos metabólicos formados por Brettanomyces/Dekkera que afetam a qualidade do vinho são os fenóis voláteis, tetrahidropiridinas e ácido acético (Dias et al., 2003a). Os efeitos negativos estão relacionados com a perda de cor do vinho, aumento de acidez volátil, odores de rato, produção de aminas biogénicas e de maus aromas de carácter fenólico (Malfeito-Ferreira 2010). As enzimas cinamato descarboxilase e vinilfenol redutase estão ativas na D. bruxellensis, em condições vínicas e, por isso, esta levedura é vista como a principal produtora de fenóis voláteis, responsáveis pelos maus aromas (Dias et al., 2003a) caracterizados no ponto seguinte. F C U P |12 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Adicionou-se 120 µL da solução concentrada de ácido p-cumárico a 60 mL de YM inoculado com D. bruxellensis. Para o ensaio com o SO2preparou-se uma solução de bissulfito de sódio (20 g/L) a partir da qual se prepararam as concentrações indicadas na Tabela 1. O volume final de meio de cultura foi 60 mL em todos os ensaios. Adicionou-se 120 µL da solução concentrada de ácido p-cumárico a 60 mL de YM inoculado com D. bruxellensis. As diferentes concentrações de etanol foram obtidas adicionando ao meio diferentes volumes de etanol a 99,5% (v/v). O volume final de meio de cultura foi 60 mL em todos os ensaios. Da mesma forma, adicionou-se 120 µL da solução concentrada de ácido pcumárico a 60 mL de YM inoculado com D. bruxellensis. Estes ensaios foram efetuados duplicado. Tabela 1 – Experiências efetuadas em YM inoculado com Dekkera bruxellensis 1% (v/v) Ensaios iniciais efetuados Composto Concentração Ácido pcumárico 0,6 mg/L 1 mg/L 2 mg/L - pH 3,2 3,4 3,6 3,8 SO2Total 20 mg/L 40 mg/L 80 mg/L - Etanol 0% 4% 8% 10% 1.3 Efeito da fonte de carbono na produção de fenóis voláteis Foi preparado um vinho sintético tendo por base o vinho modelo descrito por Liu et al. (1994), composto por YNB sem aminoácidos e sem sulfato de amónio (DifcoTM), ao qual se adicionou sulfato de diamónio (2 g/L) e se variou a fonte de carbono (2 g/L). A esterilização do vinho sintético foi efetuada por filtração, usando filtros de acetato de celulose de 0.22 µm de porosidade (FrilaboTM, Maia, Portugal). Testou-se o crescimento com glucose, frutose, arabinose e xilose, a 2 g/L cada (Tabela 2). Foram preparadas soluções concentradas destes açúcares a 20 g/L. Adicionou-se em cada F C U P |13 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores amostra 6 mL de cada solução de açúcar correspondente, 6mL de YNB, ajustou-se o pH, adicionou-se 2,4 mL de etanol 99,5% e 120 µL da solução concentrada de ácido p-cumárico perfazendo cada amostra com água desionizada. Depois testou-se uma combinação de glucose e frutose, arabinose e xilose e uma combinação de todas as fontes de carbono. Adicionou-se 3 mL da solução de 20 g/L de cada açúcar, 6 mL de YNB e 6 mL de sulfato de diamónio, ajustou-se o pH, adicionou-se 2,4 mL de etanol 99,5% e 120 µL da solução concentrada de ácido p-cumárico para criar as amostras, perfazendo-as com água desionizada. Foi adicionada 1,5 mL da solução de 20 g/L de cada açúcar, no caso da amostra com a combinação de todas as fontes de carbono. Estes dois ensaios foram realizados em duplicado. 1.4 Efeito da fonte de azoto na produção de fenóis voláteis Foram testadas diferentes fontes de azoto: aminoácidos (alfa-alanina, lisina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico), fosfato de diamónio, aminoácidos em conjunto com fosfato de diamónio e sulfato de diamónio apenas (1 g/L de concentração total) (Tabela 2). Foi criada uma solução de 10 g/L dos aminoácidos e de 20 g/L do fostato de diamónio e de sulfato de diamónio. Para o meio com aminoácidos foi adicionado 6 mL da solução concentrada dos aminoácidos, 6 mL de solução concentrada de glucose, 6mL de YNB, ajustou-se o pH, adicionou-se 2,4 mL de etanol 99,5% e 120 µL da solução concentrada de ácido p-cumárico perfazendo cada amostra com água desionizada. Para as amostras do fostato de diamónio e sulfato de diamónio foi adicionado 3 mL da solução concentrada correspondente a cada amostra, 6 mL de solução concentrada de glucose, 6 mL de YNB, ajustou-se o pH, adicionou-se 2,4 mL de etanol 99,5% e 120 µL da solução concentrada de ácido p-cumárico perfazendo cada amostra com água desionizada. No caso da amostra com aminoácidos em conjunto com fostato de diamónio, foi adicionado 3 mL da solução concentrada de aminoácidos e 1,5 da solução concentrada de fostado de diamónio, 6 mL de solução concentrada de glucose, 6mL de YNB, ajustou-se o pH, adicionou-se 2,4 mL de etanol 99,5% e 120 µL da solução concentrada de ácido p-cumárico perfazendo cada amostra com água desionizada. Esta experiência foi realizada em triplicado. F C U P |14 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Tabela 2 – Experiências efetuadas em vinho sintético inoculado com Dekkera bruxellensis 1% (v/v) Ensaio Conjunto de compostos testados Açúcares (2g/L total) Glucose Frutose Arabinose Xilose Combinação de açúcares (2 g/L total) Glucose/Frutose Xilose/Arabinose Glucose/Frutose/ Xilose/Arabinose - Combinação de Fontes de azoto (1g/L total) Aminoácidos Fosfato de Diamónio Aminoácidos/Fosfato de Diamónio Sulfato de Diamónio *Aminoácidos: alfa-alanina, lisina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico 2. Análise de Fenóis Voláteis (Extração e método de análise) 2.1 Protocolo de extração A análise dos etilfenóis foi realizada segundo o protocolo descrito por Bertrand (1981). Preparou-se uma solução de 50:50 (v/v) de éter dietílico:n-hexano (ambos da Merck, Darmstadt, Alemanha). Uma solução de 3-octanol, com a concentração de 8 mg/L em metanol, foi usada como padrão interno. As amostras foram centrifugadas à rotação de 4000 rpm durante 10 minutos (Centromix, Selecta, Barcelona, Espanha). 50 mL do sobrenadante foram transferidos para um balão volumétrico de 100 mL. Foram acrescentados 50 µL da solução de padrão interno, 3-octanol. As amostras foram sucessivamente extraídas usando a mistura de éter dietílico e n-hexano acima descrita. Foram realizadas três extrações com adição de 4 mL, 2 mL e 2 mL da mistura dos solventes de extração. A amostra é, então, colocada em agitação durante 5 minutos após adição dos solventes. A fase orgânica, que permanecia no topo da ampola de decantação, foi recolhida ao longo das três extrações para frascos de “headspace” e a fase inorgânica foi deixada no balão volumétrico. A fase orgânica de cada extração foi recolhida com o uso de pipetas de Pasteur e transferida para um vial de 1,50 ml, onde foram concentradas a aproximadamente metade F C U P |15 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores do volume original, sob uma corrente de azoto, pronto para a análise instrumental no cromatógrafo de gás CG-FID. 2.2 Método de análise 2.2.1 CG-FID Depois de realizada a extração, as amostras foram analisadas por Cromatografia Gasosa com um detetor de Ionização por Chama (CG-FID 5890A da Hewlett Packard). A coluna usada foi do tipo FFAP (BP1), com dimensões 50 m por 0,22 mm por 0,25 µm (SGE, Austin, EUA). Injetou-se 2 µl de amostra num injetor aquecido a 250 ºC, com tempo de splitless de 0,3 min e fluxo de splitless de 30 ml/min. O gás transportador foi o hidrogénio, a um fluxo de 1 mL/min. O forno começou com uma temperatura de 40 ºC no minuto inicial, seguida de um aumento de 2 ºC por minuto até aos 220 ºC durante 20 minutos. 2.2.2 Curvas de calibração As curvas de calibração foram obtidas usando soluções padrão contendo 4-etilfenol (99%, Sigma-Aldrich, Alemanha), e 4-vinilfenol (10% solução em propilenoglicol, SAFC, Inglaterra). Na Tabela 3 podemos verificar os tempos de retenção médios de cada composto processado pelo CG-FID. Tabela 3 – Tempos de retenção médios para os compostos calibrados Compostos Tempo de retenção médio (min.) 3-Octanol 54,96 4-etilfenol 56,84 4-vinilfenol 63,98 F C U P |16 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Na Figura 2 podemos observar a boa correlação entre as áreas dos picos cromatográficos e as concentrações dos compostos. Figura 2 - Curva de calibração para 4-etilfenol e 4-vinilfenol incluindo a equação de cada reta. y = 0.7536x + 0.2591 R² = 0.9926 y = 0.0781x - 0.0018 R² = 0.9992 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Área dos fenóis voláteis / Área do padrão interno Concentração (mg/L) 4-etilfenol 4-vinilfenol F C U P |17 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Resultados e Discussão 1. Efeito da concentração do precursor na produção de fenóis voláteis Começou-se por testar o efeito da presença do ácido p-cumárico no crescimento da levedura e a concentração inicial mínima necessária para se produzir uma quantidade de 4etilfenol percétivel sensorialmente (~0,4 mg/L). A concentração de ácido p-cumárico não teve influência no crescimento da levedura como podemos verificar na Figura 3. A Figura 4 mostra que quanto maior é a quantidade de precursor maior é produção de 4etilfenol e que, nestas condições experimentais, é necessário ter 2 mg/L de ácido pcumárico para se obter cerca de 0,4 mg/L de 4-etilfenol. É importante referir que não foi detetada a presença de 4-vinilfenol o que significa que todo o ácido p-cumárico utilizado pela levedura foi convertido no produto final da via metabólica. A percentagem de conversão molar de 0,6, 1 e 2 mg/L de ácido p-cumárico em 4-etilfenol é 30, 38 e 28% respectivamente. As experiências seguintes foram realizadas com essa concentração de ácido p-cumárico. Produção de fenóis voláteis por Figura 3 - Absorvância a várias concentrações de ácido p Figura 4 - 4etilfenol produzido a partir de diferentes concentrações de ácido p 2. Efeito do pH, SO 2 e etanol na produção de fenóis voláteis De seguida, testouse valores de pH ( seu efeito na produção de 4etilfenol. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 04.5 63.7 86.5 Abs 660 nm 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 4-etilfenol (mg/L) Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Absorvância a várias concentrações de ácido p -cumárico ao longo do tempo. etilfenol produzido a partir de diferentes concentrações de ácido p -cumárico. e etanol na produção de fenóis voláteis se valores de pH ( Tabela 1 ), comuns em vinhos tintos, e verificou etilfenol. 86.5 87.5 91.6 111.5 113 189 Horas 0 mg/L 0,6 mg/L 1 mg/L 2 mg/L 0,6 mg/L 1 mg/L 2 mg/L F C U P |18 Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores e etanol na produção de fenóis voláteis ), comuns em vinhos tintos, e verificou -se o 0 mg/L 0,6 mg/L 1 mg/L 2 mg/L 0,6 mg/L 1 mg/L 2 mg/L Produção de fenóis voláteis por De acordo com a Figura 5 , esta gama de valores de pH não afeta o crescimento de bruxellensis PYCC 4801. Também etilfenol, tendo em conta os valores de pH testados trabalhos anteriores (Suárez, 2007). sendo este um valor comum em vinhos tintos Figura 5 - Absorvância a diferentes valores de pH ao longo do tempo. Figura 6 - Concentração de 4etilfenol produzido a diferentes valores de pH. 0 1 2 3 4 0 23 40 Abs 660nm 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 4-etilfenol mg/L Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores , esta gama de valores de pH não afeta o crescimento de PYCC 4801. Também não há diferenças significativas na produção de 4 etilfenol, tendo em conta os valores de pH testados (Figura 6) , que está de acordo com 2007). Decidiuse proceder aos ensaios seguintes sendo este um valor comum em vinhos tintos . Absorvância a diferentes valores de pH ao longo do tempo. etilfenol produzido a diferentes valores de pH. 64 130 150 174 Horas F C U P |19 Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores , esta gama de valores de pH não afeta o crescimento de D. não há diferenças significativas na produção de 4 - , que está de acordo com se proceder aos ensaios seguintes a pH 3,6, pH 3,2 pH 3,4 pH 3,6 pH 3,8 pH 3,2 pH 3,4 pH 3,6 pH 3,8 Produção de fenóis voláteis por A Figura 7 mostra que o SO2 afeta o crescimento de completamente na presença de 80 m 4etilfenol nas amostras em que ocorre crescimento. mg/L de SO2 afetar o crescimento, principalmente a fase lag, não afeta a produção de fenóis voláteis obtida na fase estacionária. SO2 livre para eliminar células viáveis deste microrganismo. Barata que a levedura consegue crescer e produzir fenóis voláteis a valores super Figura 7 - Absorvância a diferentes concentrações de SO Figura 8 - Produção de 4etilfenol a diferentes concentrações de SO 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 017 35 59 Abs 660nm Horas 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Concentração de 4-etilfenol (mg/L) Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores afeta o crescimento de D. bruxellensis PYCC 4801 inibindo completamente na presença de 80 m g/L de SO 2 total. Na Figura 8, observase produção de etilfenol nas amostras em que ocorre crescimento. Podemos realçar que apesar de 40 afetar o crescimento, principalmente a fase lag, não afeta a produção de fenóis voláteis obtida na fase estacionária. Ribéreau-Gayon et al., (2006) , aconselham 30 mg/L de livre para eliminar células viáveis deste microrganismo. Barata et al., (2007) sugerem que a levedura consegue crescer e produzir fenóis voláteis a valores super iores. Absorvância a diferentes concentrações de SO 2 total ao longo do tempo. etilfenol a diferentes concentrações de SO 2 total (nula a 80mg/L de SO 2 ) 0 mg/L 40 mg/L 59 123 140 164 Horas 0 mg/L 20 mg/L 40 mg/L 80 mg/L 0 mg/L 20 mg/L 40 mg/L 80 mg/L F C U P |20 Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores PYCC 4801 inibindo -o se produção de Podemos realçar que apesar de 40 afetar o crescimento, principalmente a fase lag, não afeta a produção de fenóis , aconselham 30 mg/L de (2007) sugerem iores. 0 mg/L 20 mg/L 40 mg/L 80 mg/L 0 mg/L 20 mg/L 40 mg/L 80 mg/L Produção de fenóis voláteis por O efeito da percentagem do etanol, em condições laboratoriais, difere bastante em relação às condições naturais. As experiências de consegue desenvolverse a 10% de etanol em vinho sintético, e Barata que se desenvolve a 13,8% em vinho tinto levedura a 10% de etanol ( Figura 9 selvagens estão mais adaptadas ao álcool do que as estirpes laboratoriais. Não há diferenças significativas na produção de 4 (Figura 10). Figura 9 - Absorvância a dife rentes percentagens de etanol ao longo do tempo. Figura 10 - 4etilfenol produzido em diferentes concentrações de álcool 0 1 2 3 4 0 25 42 Abs 660nm 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 4-etil-fenol (mg/L) Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores O efeito da percentagem do etanol, em condições laboratoriais, difere bastante em relação às condições naturais. As experiências de Conterno et al., (2006) revelam que a levedura se a 10% de etanol em vinho sintético, e Barata et al ., (2007) mostra que se desenvolve a 13,8% em vinho tinto . Nesta experiência não houve crescimento da Figura 9 ), no entanto, t emos de ter em conta que as estirpes selvagens estão mais adaptadas ao álcool do que as estirpes laboratoriais. Não há diferenças significativas na produção de 4 - etilfenol nas amostras em que houve crescimento rentes percentagens de etanol ao longo do tempo. etilfenol produzido em diferentes concentrações de álcool (nulo a 10%) 0% 8% 68 135 151 179 Horas 4 8 Percentagem de álcool F C U P |21 Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores O efeito da percentagem do etanol, em condições laboratoriais, difere bastante em relação revelam que a levedura ., (2007) mostra . Nesta experiência não houve crescimento da emos de ter em conta que as estirpes selvagens estão mais adaptadas ao álcool do que as estirpes laboratoriais. Não há etilfenol nas amostras em que houve crescimento 0% 4% 8% 10% F C U P |28 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Referências Agnolucci, M., Rea, F., Sbrana, C., Cristani, C., Fracassetti, D., Tirelli, A., Nuti, M., (2010) Sulphur dioxide affects culturability and volatile phenol production by Brettanomyces/ Dekkera bruxellensis. International Journal of Food Microbiology. 143, 76e80. Barata, A., Nobre, A., Correia, P., Malfeito-Ferreira, M., Loureiro, V., (2006) Growth and 4ethylphenol production by the yeast Pichia guilliermondii in grape juices. American Journal of Enology and Viticulture. 57, 133-138. Barata A., Caldeira J., Botelheiro R., Pagliara D., Malfeito-Ferreira M., Loureiro V. (2007) Survival patterns of Dekkera bruxellensis in wines and inhibitory effect of sulphur dioxide. International Journal of Food Microbiology 121 201-207. Barata, A., Caldeira, J., Botelheiro, R., Pagliara, D., Malfeito-Ferreira, M., Loureiro, V. (2007)b Survival patterns of Dekkera bruxellensis in wines and inhibitory effect of sulphur dioxide. International Journal of Food Microbiology 121(2), 201e207. Barata, A., Pagliara, D., Piccininno, T., Tarantino, F., Ciardulli, W., Malfeito-Ferreira, M. & Loureiro, V. (2008) The effect of sugar concentration and temperature on growth and volatile phenol production by Dekkera bruxellensis in wine. FEMS Yeast Res 8(7), 1097-1102. Barnett, J.A. (2000) A history of research on yeasts 2: Louis Pasteur and his contemporaries, 1850-1880. Yeast 16(8), 755-771. Bell S-J, Henschke PA (2005) Implications of nitrogen nutrition for grapes, fermentation and wine. Australian Journal of Grape and Wine Research 11:242–295 Bertrand, A. (1981) Formation des substances volatiles au cours de la fermentation alcoolique. Incidence sur la qualité des vins. Colloquium Society For Microbiology, Reims 251–267. F C U P |29 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Blomqvist J. (2011) Dekkera bruxellensis – a CompetitiveYeast for Ethanol Production from Conventionaland Non-conventional Substrates. http://pub.epsilon.slu.se/8404/1/Blomqvist_J_20111027.pdf. Consultado a 15-07-2014 Butzke C., (2010) Winemaking problems solved. Great Abington, Cambridge. Chandra M., Barata A., Ferreia-Dias S. Malfeito-Ferreira M. Loureiro V. (2014) A Response Surface Methodology study on the role of factors affecting growth and volatile phenol production by Brettanomyces bruxellensis ISA 2211 in wine. Food Microbiology, 42, 40-46. Chatonnet P., Viala C. Dubourdieu D. (1997) Influence of Polyphenolic Components of Red Wines on the Microbial Synthesis of Volatile Phenols. American Journal of Enology and Viticulture, Vol. 48, No. 4. Conterno, L., Joseph, C.M.L., Arvik, T.J., Henick-Kling, T., Bisson, L.F., (2006) Genetic and physiological characterization of Brettanomyces bruxellensis strains isolated from wines. American Journal of Enology and Viticulture 57, 139–147. Couto, J.A., Neves, F., Campos, F., Hogg, T. (2005) Thermal inactivation of the wine spoilage yeasts Dekkera/Brettanomyces. International Journal of Food Microbiology 104(3), 337-344. Dias L., Pereira-da-Silva S., Tavares M., Malfeito-Ferreira M., Loureiro V. (2003)a. Factors affecting the production of 4-ethylphenol by the yeast Dekkera bruxellensis in enological conditions. Food Microbiology 20 (2003) 377-384 Dias, L., Dias, S., Sancho, T., Stender, H., Querol, A., Malfeito-Ferreira, M., Loureiro, V., (2003)b. Identification of yeasts isolated from wine-related environments and capable of producing 4-ethylphenol. Food Microbiology. 20, 567-574. F C U P |30 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Dugelay I., Gunata Z., Sapis J.C., Baumes R., Bayonove C., (1993) Role of cinnamoyl esterase activities from enzyme preparations on the formation of volatile phenols during winemaking. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 41, 2092-2096. Edlin, D.A.N., Narbad, A., Dickinson, J.R., Lloyd, D., (1995) The biotransformation of simple phenolic compounds by Brettanomyces anomalus. FEMS Microbiol. Lett.125, 311-316. Gerbeaux, V., Jeudy, S., & Monamy, C. (2000) Study of phenol volatiles in Pinot noir wines in Burgundy. Bulletin de l’OIV, 73, 581–599. Gilliland, R.B., (1961) Brettanomyces. I. Occurrence, characteristics, and effects on beer flavour. Journal of the Instute of Brewing 67, 257e261. Kennedy, K. (2008) How to avoid stuck fermentations. The Australian & New Zealand grapegrower & winemaker 107, www.winebiz.com.au, Novembro 2008 – Issue 538 Kurtzman, C. P., and J. W. Fell. (1998) The yeasts, a taxonomic study, 4th ed. Elsevier Science B.V., Amsterdam, The Netherlands. Kurtzman, C.P., Fell, J.W., Boekhout, T. (2011) The yeasts, a taxonomic study. 5. ed: Elsevier; 1). ISBN 978-0-444-52149. Liu S. Q., Davis C. R., e J. D. (1994)Brooks Growth and Metabolism of Selected Lactic Acid Bacteria in Synthetic Wine.American Journal of Enology and Viticulture 1995 46:166-174 Loureiro, V., e Malfeito-Ferreira, M. 2003. Spoilage yeast in the wine industry. International Journal of Food Microbiology, 23 - 50. Malfeito-Ferreira, M., Rodrigues, N., Loureiro, V., (2001) The influence of oxygen on the ‘‘horse sweat taint’’ in red wines. Italian Food Beverage Technology. 24, 34–38. Malfeito-Ferreira (2010) Yeasts and wine off-flavours: a technological perspective. SpringerVerlag and the University of Milan 2010 Ribéreau-Gayon, P., Dubourdieu, D., Donèche, B., Lonvaud, A. (2006) Handbook of enology (vols 1 e 2). The microbiology of wine and vinification. Wiley, Chichester. F C U P |31 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Rodrigues, N., Gonc¸alves, G., Pereira-da-Silva, S., Malfeito-Ferreira, M., Loureiro, V. (2001) Develpment and use of a new medium to detect yeast of the genera Dekkera/ Brettanomyces sp. Journal of Applied Microbiology, 90, 588–599. Romano P (2005) Proprietà technologiche e di qualità delle specie di lieviti vinari. In: Vicenzini M, Romano P, Farris G (eds) Microbiologia del vino. Ambrosiana, Milano, pp 101– 131 Scheffers, W.A. (1979). Anaerobic inhibition in yeasts (Custer's effect). Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology 45(1), 150-150. Silva, P., H. Cardoso, and H. Geros. (2004) Studies on the wine spoilage capacity of Brettanomyces/Dekkera spp. American Journal of Enology and Viticulture. 55:65-72. Silva B. M., Silva L. R., Valentão P., Seabra R. M., Andrade P. B., Trujillo M. E., Velázquez E. (2007) HPLC Determination of Free Amino Acids Profile of Dão Red Wine: Effect of Dekkera bruxellensis Contamination. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 30:9-10, 1371-1383,DOI: 10.1080/10826070701276630 Smith, M.T., Yamazaki, M., Poot, G.A. (1990) Dekkera, Brettanomyces and Eeniella - Electrophoretic Comparison of Enzymes and DNA-DNA Homology. Yeast 6(4), 299-310. Suárez, R., Suárez-Lepe, J.A., Morata, A., Calderón, F., 2007 The production of ethylphenols in wine by yeasts of the genera Brettanomyces and Dekkera: a review. Food Chemistry. 102, 10e21. Torija, M.J., Rozes, N., Poblet, M., Guillamon, J.M., Mas, A. (2003) Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology 80(1), 47-53. Van Der Walt, J.P. (1964) Dekkera, new genus of Saccharomycetaceae. Antonie Van Leeuwenhoek Journal of Microbiology and Serology 30(3), 273-&. F C U P |32 Produção de fenóis voláteis por Brettanomyces/Dekkera bruxellensis A influência da concentração dos precursores e de outros fatores Wijsman, M.R., Vandijken, J.P., Vankleeff, B.H.A., Scheffers, W.A. (1984) Inhibition of fermentation and growth in batch cultures of the yeast Brettanomyces intermedius upon a shift from aerobic to anaerobic conditons (Custers effect). Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology 50(2), 183-192. Woolfit M., Rozpedowska E., Piskur J., Wolf K., (2007) Genome Survey Sequencing of the Wine Spoilage Yeast Dekkera (Brettanomyces) bruxellensis. American Society for Microbiology, p. 721-733 Wagener, G.W.W. (1981) The effect of different thermovinification systems on red wine quality. American Journal of Enology and Viticulture, Lockeford, v.32, n.3, p.179-184, 1981.