Repositorio Institucional de Documentos

2021 124 Lou des Sole Baigo i Desa ollo de me odologías analí icas y es udios sob e la aplicabilidad de las p o eínas de ase aguda como bioma cado es de salud y bienes a animal en el pe o. Ca ac e ización de ITIH4 como nue a p o eína de ase aguda canina Di ec o /es Piñei o Pa do, Ma ilde Lamp ea e Palacios, Fe mín © Uni e sidad de Za agoza Se icio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Lou des Sole Baigo i DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS Y ESTUDIOS SOBRE LA APLICABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS DE FASE AGUDA COMO BIOMARCADORES DE SALUD Y BIENESTAR ANIMAL EN EL PERRO. CARACTERIZACIÓN DE ITIH4 COMO NUEVA PROTEÍNA DE FASE AGUDA CANINA Di ec o /es Piñei o Pa do, Ma ilde Lamp ea e Palacios, Fe mín Tesis Doc o al Au o 2019 Reposi o io de la Uni e sidad de Za agoza – Zaguan h p://zaguan.uniza .es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Escuela de Doc o ado P og ama de Doc o ado en Bioquímica y Biología Molecula Tesis Doc o al Desa ollo de me odologías analí icas y es udios sob e la aplicabilidad de las p o eínas de ase aguda como bioma cado es de salud y bienes a animal en el pe o Ca ac e ización de ITIH4 como nue a p o eína de ase aguda canina Memo ia p esen ada po Lou des Sole Baigo i Pa a op a al G ado de Doc o en Bioquímica y Biología Molecula Za agoza, diciemb e 2018 D. Fe mín Lamp ea e Palacios, Ca ed á ico de Bioquímica y Biología Molecula , Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula y Celula de la Uni e sidad de Za agoza, Dª. Ma ilde Piñei o Pa do, Doc o a en Ciencias Químicas, Di ec o a I+D de la emp esa Acu e Bio ech, Za agoza, CERTIFICAN: Que la memo ia i ulada “Desa ollo de me odologías analí icas y es udios sob e la aplicabilidad de las PFAs como bioma cado es de salud y bienes a animal en el pe o. Ca ac e ización de ITIH4 como nue a p o eína de ase aguda canina”, p esen ada po la Licenciada en Bioquímica Dª Lou des Sole Baigo i, ha sido ealizada bajo su di ección cumpliendo los equisi os exigidos en la legislación igen e pa a op a al G ado de Doc o en Bioquímica y Biología Molecula . Za agoza, 17 de diciemb e de 2018 Fe mín Lamp ea e Palacios Ma ilde Piñei o Pa do Pa a la ealización de es a esis se ha ecibido inanciación del P og ama Doc o ado Indus ial, Plan Es a al de In es igación Cien í ica y Técnica y de Inno ación 2013-2016. Índice 3.3 Concen ación de soluciones p o eicas po ul a il ación.......................... 70 3.3.1 Concen ación de mues as po p esión de ni ógeno ........................ 70 3.3.2 Ul a il ación impulsada po cen i ugación ........................................ 70 3.4 Cuan i icación de p o eína o al.................................................................. 71 3.5 Iden i icación de p o eínas ......................................................................... 72 3.5.1 MALDI TOF MS................................................................................... 72 3.5.2 LC-MS/MS........................................................................................... 72 3.6 Mé odos inmunoquímicos .......................................................................... 73 3.6.1 P epa ación de an isue os .................................................................. 73 3.6.2 P epa ación de columnas de inmunoa inidad..................................... 77 3.6.3 Ob ención de an icue pos ................................................................... 78 3.6.4 Técnicas de inmunop ecipi ación en gel............................................. 79 3.6.5 Mé odos inmunoenzimá icos............................................................... 81 3.6.6 Mé odo inmuno u bidimé ico pa a la cuan i icación de CRP canina.. 85 3.7 Validación de mé odos analí icos............................................................... 85 3.8 De e minación de PFAs en modelos expe imen ales ................................ 87 3.8.1 Medida de los ni eles de PFAs en mues as de ci ugía mayo .......... 87 3.8.2 Ca ac e ización de los ni eles de ITIH4 en pe as a ec adas po piome a.......................................................................................................... 88 3.8.3 PFA en sue os e hígados de pe os in ec ados con L. in an um. Es udio 1......................................................................................................... 90 3.8.4 E olución de las PFAs en animales in ec ados con L. in an um. Es udio 2......................................................................................................... 93 3.8.5 Asignación de alo es de PFAs en animales sanos ........................... 96 3.8.6 E aluación de los ni eles de PFA en pe os alojados en Cen os de P o ección....................................................................................................... 97 Índice 4 RESULTADOS................................................................................................ 99 4.1 Pu i icación de p o eínas y ob ención de an isue os................................ 101 4.1.1 Pu i icación de ITIH4 canina y ob ención de an isue os ................... 101 4.1.2 Pu i icación CRP canina y ob ención de an isue os. ........................ 103 4.1.3 Pu i icación de hap oglobina canina y ob ención de an isue os. ...... 105 4.1.4 Pu i icación de α1 glicop o eína ácida canina y ob ención de an isue os..................................................................................................... 109 4.2 Desa ollo y alidación de mé odos analí icos pa a la cuan i icación de PFAs caninas................................................................................................... 111 4.2.1 Desa ollo y alidación de mé odos de inmunodi usión adial pa a la cuan i icación de ITIH4, CRP, Hp y GPA caninas........................................ 111 4.2.2 Desa ollo y alidación de un ELISA pa a la de e minación de ITIH4 canina .......................................................................................................... 118 4.2.3 Desa ollo y alidación de un ELISA pa a la de e minación de Hp canina .......................................................................................................... 121 4.2.4 Mé odo u bidimé ico pa a la cuan i icación de CRP canina. Adap ación pa a su uso en placa mic o i e . ................................................ 124 4.3 Ca ac e ización de ITIH4 como PFA en el pe o. Modelos expe imen ales129 4.3.1 Es udio en mues as de pe os some idos a ci ugía mayo .............. 129 4.3.2 Ca ac e ización de los ni eles de ITIH4 en el sue o de pe as a ec adas po piome a................................................................................. 132 4.3.3 P o eínas de ase aguda as in ección expe imen al con L. in an um136 4.4 Asignación de los alo es de e e encia pa a las PFAs en animales sanos149 4.5 E aluación de los ni eles de PFAs en cen os de p o ección.................. 156 4.5.1 E olución de los animales en los cen os ......................................... 156 4.5.2 Ni eles de CRP en animales alojados en cen os de p o ección animal. Es udio 2.......................................................................................... 170 Índice 5 DISCUSIÓN.................................................................................................. 177 5.1 Pu i icación de p o eínas y ob ención de an isue os................................ 179 5.2 Desa ollo y alidación de mé odos analí icos......................................... 183 5.3 Respues a de ITIH4 du an e la ase aguda ............................................. 189 5.4 Ni eles de PFA en pe as a ec adas po piome a .................................. 195 5.5 PFAs como bioma cado es en L. in an um.............................................. 198 5.6 Ni eles de e e encia de las PFAs........................................................... 206 5.7 Ni eles de PFA en pe os alojados en cen os de p o ección animal. PFAs en la e aluación del bienes a animal.............................................................. 208 6 CONCLUSIONES ......................................................................................... 215 7 BIBLIOGRAFÍA............................................................................................. 219 8 ANEXOS....................................................................................................... 244 9 ÍNDICE DE TABLAS..................................................................................... 253 10 ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................... 257 11 ABREVIATURAS .......................................................................................... 263 In oducción 1 INTRODUCCIÓN In oducción In oducción 1.1 La espues a de ase aguda. La espues a de ase aguda (RFA) es una eacción compleja y no especí ica de un animal as un daño isula p oducido an o po agen es ex e nos como in e nos. A endiendo a su na u aleza, el agen e puede se ísico ( auma ismos, ci ugías, quemadu as…), químico (i i ación po óxicos) o biológico (in ección, c ecimien o umo al, al e aciones inmunológicas…). Es a espues a se conside a pa e del sis ema inna o de de ensa del o ganismo y ac úa como p edeceso a de la espues a inmune adqui ida. Se gene a du an e las p ime as e apas del a aque y es la esponsable de la supe i encia del indi iduo. En el si io de lesión se gene a una in lamación localizada y muy con olada ya que a a de adecua se a la magni ud de la amenaza. (Kushne 1982; Gabay e al., 1999; Ecke sall 2000). El inicio y la p og esión de la RFA esponden a una eacción coo dinada po los mediado es de in lamación. Las ci oquinas p oin lama o ias, ac o de nec osis umo al (TNF), in e leuquina-1 (IL-1) e in e leuquina-6 (IL-6), son los mediado es más impo an es en el inicio de la RFA. Es as ci oquinas inducen un núme o de espues as locales y sis émicas. Al inicio de la espues a se obse an cambios en el calib e, pe meabilidad y lujo ascula es. Se p oduce la ac eción de leucoci os a las zonas in lamadas y si es necesa io se ac i an las ías de coagulación y del complemen o pa a el desa ollo de una espues a de de ensa óp ima. El ejido in lamado y el sis ema ascula ci cundan e libe a una segunda oleada de ci oquinas que ac úan sob e los ó ganos diana dando luga a una eacción sis émica en la que se p oducen nume osos cambios isiológicos, me abólicos y endoc inos (Ceciliani e al., 2002) (Tabla 1). In oducción Tabla 1. Cambios neu oendoc inos, me abólicos, hema opoyé icos y hepá icos p oducidos en el o ganismo du an e la espues a de ase aguda. Cambios neu oendoc inos Fieb e, pé dida de ape i o y somnolencia Aumen o de la sec eción de ACTH (ho mona ad enoco ico ópica), co isol y ca ecolaminas Cambios me abólicos Aumen o del ca abolismo p o éico P oducción hepá ica de las P o eínas de Fase Aguda Aumen o de la lipogénesis hepá ica Aumen o de la lipólisis del ejido adiposo Disminución de la masa ósea Aumen o de la gluconeogénesis Disminución de la p o eín lipasa en músculo y ejido adiposo Hipe iglice idemia e hipocoles e olemia Cambios hema opoié icos Anemia (en en e medades c ónicas) Leucoci osis T omboci osis Cambios en cons i uyen es plasmá icos no p o éicos Hipozinquemia, hipo e emia e hipe cup emia Aumen o de las concen aciones plasmá icas de e inol y glu a ión Cecilliani e al., 2002. P o ein and Pep ide Le e s El sis ema ne ioso y el sis ema endoc ino se en a ec ados y es imulados po las ci oquinas p o-in lama o ias, p oduciéndose al e aciones en el compo amien o, cambios isiológicos, bioquímicos y nu icionales. La ac i ación del eje hipo álamo-pi ui a io-ad enal es una de las p incipales ca ac e ís icas neu oendoc inas de la RFA, que se aduce en la libe ación de sus ancias como la ho mona ad enoco ico ópica (ACTH), y el aumen o en los ni eles de co isol In oducción (Bo ghe i e al., 2009). Una de las p incipales mani es aciones clínicas es la ieb e. Se c ee que la ieb e puede se una espues a a la IL-6 median e la p oducción de p os aglandinas, o os mediado es que a ec an al hipo álamo (Dina ello 2004). Igualmen e se obse an cambios en la concen ación sé ica de iones como hie o y cinc, así como es su edis ibución en los ejidos donde eje cen una ac i idad an ioxidan e (Bo ghe i e al., 2009). Figu a 1. Esquema de la espues a de ase aguda. Fecha oja ep esen a e ec o inhibición In oducción Uno de los p incipales cambios me abólicos que se p oducen en el o ganismo es el cambio en la sín esis de las p o eínas de ase aguda (PFAs) (Gabay e al., 1999). Es as p o eínas pe enecen al g upo de p o eínas plasmá icas cuya concen ación cambia, al menos un 25 % su concen ación basal, como espues a a es ímulos in e nos o ex e nos en el o ganismo. El hígado es el p incipal ó gano que sin e iza PFAs, y su concen ación plasmá ica se e al e ada como consecuencia de las al e aciones de amaño, ul aes uc u a y ac i idad me abólica p oducidas en es e ó gano (Kushne 1982). La p oducción de las PFAs en el hígado iene es imulada po las ci oquinas p o-in lama o ias, conc e amen e la inducción de la exp esión de es as p o eínas se p oduce en los hepa oci os. Además de la p oducción hepá ica, las PFAs pueden se sin e izadas po o os ejidos como la glándula mama ia (G onlund e al., 2003; Ecke sall e al., 2006), la glándula sali al (Lecchi e al., 2009), el ac o gas oin es inal (V eugdenhil e al., 1999), los iñones y los pulmones (Ramado i e al., 1985) en e o os. Sin emba go, la apo ación ex a-hepá ica a las concen aciones plasmá icas du an e la ase aguda es pequeña. 1.1.1 Regulación de los cambios de ase aguda y sín esis de las PFAs Los monoci os/mac ó agos desempeñan un papel undamen al en el inicio de la cascada de e en os que se desencadenan du an e la RFA. Los mac ó agos p esen an en su supe icie ecep o es de pa ones de econocimien o (TLR, Toll Like Recep o s), que pueden in e acciona con de e minadas es uc u as molecula es compa idas po los mic oo ganismos y que se denominan PAMP (pa ones molecula es asociados a pa ógenos). La in e acción en e las secuencias PAMP y TLR p oduce la ac i ación de u as que ac i an al ac o nuclea NF-κB, que una ez ac i ado, mig a desde el ci oplasma al núcleo e induce la ansc ipción de ci oquinas p o-in lama o ias (Ga cía De Lo enzo Y Ma eos e al., 2000). La sín esis y libe ación de las PFAs se a ibuye al e ec o de los mediado es de in lamación libe ados po los monoci os, los mac ó agos y células es omales In oducción ac i adas. Es os mediado es de in lamación pueden ag upa se en cua o ca ego ías, ci oquinas de ipo IL-6, ci oquinas de ipo IL-1 (IL-1α, IL-1β, TNFα, TNFβ), glucoco icoides y ac o es de c ecimien o. Las ci oquinas ac úan como es imulado as de la exp esión génica de las PFA, mien as que los glucoco icoides y los ac o es de c ecimien o modulan la ac i idad de las p opias ci oquinas. (Baumann e al., 1994). Las p ime as ci oquinas libe adas as el es ímulo son el TNFα y la IL-1β, cada una de las cuales es imula la p oducción de la o a. La exp esión de TNFα, IL-1 e INF-ɣ es c ucial pa a la exp esión de o os mediado es como p os aglandinas y leuco ienos, que a su ez inducen la exp esión del ac o ac i ado de las plaque as y o as ci oquinas (IL-6, IL-8). La sín esis de la IL-6 iene es imulada po TNFα e IL-1, y a su ez la IL-6 es imula su p opia p oducción e inhibe la sín esis de TNFα e IL-1. La libe ación de ci oquinas an iin lama o ias (IL-4, IL-10) ambién disminuye la p oducción de TNFα e IL-1 en los monoci os. La unión de los mediado es de in lamación a sus espec i os ecep o es en los hepa oci os y la ansducción de es a señal, induce cambios en la exp esión génica de las PFAs (Baumann e al., 1994). Según el ipo de mediado es que egulan su sín esis, se suele habla de dos ipos de PFAs. Las PFAs de ipo I, aquellas inducidas po ci oquinas de ipo IL-1, y las PFAs de ipo II, las inducidas po ci oquinas del ipo IL-6. La IL-6 es capaz de es imula di ec amen e la sín esis de la mayo ía de las PFAs (Cas ell e al., 1989) y ambién puede ac ua de o ma siné gica con las ci oquinas de ipo IL-1 en la es imulación de las PFAs de ipo I. Las ci oquinas de ipo IL-1, no son capaces de es imula di ec amen e la sín esis de las p o eínas de ipo II y si ienen algún e ec o sob e su sín esis suele se de ipo inhibi o io (Baumann e al., 1994). La GPA, el componen e C3 del complemen o, el SAA, la Hp de a a, la CRP y la Apo A-I son PFAs de ipo I, mien as que la ITIH4, el ib inógeno, la Hp humana, la α1- an i ipsina y la ce uloplasmina son de ipo II (Piñei o e al., 1999; Gonzalez- Ramon e al., 2000; Haas e al., 2003; Na a o e al., 2005). En e las ci oquinas de ipo IL-6, además de la p opia IL-6 se encuen an o as como la oncos a ina M In oducción CRP; p o eina C eac i a, SAA; amiloide A sé ico, GPA; α1-glicop o eína ácida, Fb; ib inógeno, Hp; hap oglobina, Cp; ce uloplasmina, T ; ans e ina, Apo A-I; apolipop o eína A-I. Re isado en Pe e sen e al., 2004; Ecke sall e al., 2008; Kjelgaa d-Hansen e al., 2011; Gómez- Laguna e al., 2011 En gene al, en odas las especies de mamí e os es udiadas has a el momen o, exis e un inc emen o en la sín esis de la hap oglobina (Hp), ib inógeno (Fb) y α1-glicop o eína ácida (GPA), con excepción del ce do pa a es a úl ima (Lamp ea e e al., 1994), y una educción en la sín esis de la albúmina y la ans e ina (a excepción del pollo) du an e la RFA. Po el con a io la CRP y SAA mues an g andes di e encias de una especie a o a. A con inuación se desc iben algunas de las PFAs más ele an es: P o eína C eac i a La p o eína C eac i a (CRP) ue la p ime a PFA iden i icada en el sue o de humanos y p ima es no humanos (Abe ne hy e al., 1941). Su p esencia en los sue os in ec ados pudo pone se en e idencia po se p ecipi able po el polisacá ido C de las bac e ias del géne o Pneumococcus. A es a p opiedad debe su nomb e de p o eína C eac i a (CRP). Es una pen axina, que cons a de cinco subunidades unidas de mane a no co alen e y combinadas en o ma de es uc u a pen amé ica (Thompson e al., 1999). El peso molecula de la CRP humana es de 118 KDa po equilib io de sedimen ación o de 120 KDa de i ado de su secuencia de aminoácidos, con subunidades de 24,3 KDa (Volanakis e al., 1978). A di e encia de la mayo ía de PFAs la CRP no es una glicop o eína, excep o en la especie canina donde dos de sus cinco subunidades se encuen an glicosiladas (Caspi e al., 1984). La CRP iene la capacidad de in lui en a ias e apas de la in lamación. Una unción impo an e es su capacidad de uni se a os o ilcolina en p esencia de Ca2+, pudiendo así econoce a pa ógenos ex años así como a os olípidos cons i uyen es de células p opias dañadas (Gabay e al., 1999; Thompson e al., In oducción 1999). Los complejos o mados po la CRP con células ex añas y dañadas ac i an la ía clásica del complemen o, lo que pe mi e la cap ación de dichos complejos po los mac ó agos g acias a los ecep o es de CRP p esen es en su memb ana(Du Clos e al., 2001). De es a mane a, la CRP puede inicia la eliminación de pa ógenos ex años y ambién de células p opias dañadas, p e iniendo, en es e úl imo caso, los p ocesos de au oinmunización. Recien emen e se ha is o la que la CRP es sec e ada en su o ma pen amé ica (pCRP), pe o du an e la in lamación puede apa ece ambién en o ma monomé ica (mCRP) que cons a de una única subunidad. Es a úl ima se o ma ía median e una disociación i e e sible de la pCRP en los si ios de in lamación, daño isula o in ección y se i ía, jun o con las p o eínas C1q y C4bp del complemen o, pa a modula más inamen e la ac i ación de la ía clásica del complemen o en células nec ó icas (Sp os on e al., 2018). O os e ec os p o- in lama o ios de la CRP incluyen la inducción de ci oquinas in lama o ias en monoci os (Ballou e al., 1992b) En medicina humana, la medida de la CRP es usada como un ma cado clínico de in lamación. A pesa de su al a de especi icidad, la concen ación de CRP e leja la p esencia y se e idad de los p ocesos in lama o ios o in ecciosos ac i os ( e isado, Pepys 1981). Los ni eles encon ados en adul os sanos, suelen se in e io es a 2 mg/L, aunque ni eles has a 10 mg/L pueden encon a se en indi iduos apa en emen e sanos. Po encima de 10 mg/L se conside an ele aciones no ables En indi iduos con in lamación, casi siemp e debidas a in ecciones se e as, pueden obse a se ni eles de has a 500 µg/mL (Ballou e al., 1992a). La medida de es a p o eína ha sido de u ilidad en la de ección de en e medades ca dio ascula es, además aumen os signi ica i os de CRP se han asociado a di e en es en e medades como apendici is, colecis i is, panc ea i is, meningi is y en diabe es ges acional y p eclampsia en e o as (Cao e al., 2018; Sp os on e al., 2018). Al igual que en humanos, la CRP es una PFA p incipal en pe o y su concen ación plasmá ica se ha is o aumen ada en di e sas pa ologías que In oducción a ec an a es a especie (Ecke sall e al., 2010). En el ce do ambién se han obse ado inc emen os en la concen ación plasmá ica de CRP como espues a en e a es ímulos in lama o ios de di e en e na u aleza, como la inyección con acei e de emen ina (Lamp ea e e al., 1994) o an e in ecciones ocasionadas po di e en es mic oo ganismos de mane a aislada (Heegaa d e al., 1998) o en combinación con o os (Pomo ska-Mol e al., 2013). En la especie equina se han encon ado aumen os de CRP as di e en es p ocesos in lama o ios (Takiguchi e al., 1990). Po el con a io, la CRP no se conside a de ase aguda en la especie bo ina (Pe e sen e al., 2004). Sin emba go, no hay unanimidad espec o a ése compo amien o en e los in es igado es, ya que se han desc i o inc emen os en su concen ación du an e in ecciones no males ocu idas en g anjas elacionándose su concen ación con el es ado de salud de los animales (Lee e al., 2003). En ga o, la CRP ampoco expe imen a cambios en e a in lamación (Kajikawa e al., 1999). Hap oglobina La hap oglobina (Hp) es una glicop o eína de la acción de las α2 globulinas del plasma de muchas especies animales. La Hp humana, y la de la mayo ía de los animales, es uc u almen e es á compues a po dos subunidades α y dos subunidades β o mando un díme o de dos cadenas αβ unidas co alen emen e po un puen e disul u o, en e dos esiduos Cys15 de cada cadena α. El gen humano de la Hp es á o mado po es alelos es uc u ales, los p oduc os de dichos alelos son los esponsables de la p esencia de los es ipos de Hp p esen es en la especie humana (1-1, 1-2, 2-2) de di e en e es uc u a y amaño (Pol icelli e al., 2008). La Hp canina, que p esen a simili ud con el sub ipo 1-1 humano, es un e áme o o mado po dos subunidades αβ de 47 KDa en las que cada subunidad con iene una cadena α de 18 KDa y una β de 34 KDa. Sin emba go, a di e encia de la Hp humana, los díme os αβ no es án unidos po puen es disul u o debido a que la Cys15 pa icipan e en el enlace es sus i uida po un esiduo Leu (Kumazaki e al., 1992; Mominoki e al., 1995). O a di e encia con la Hp humana es que la cadena α iene una secuencia de unión a oligosacá idos y In oducción es á glicosilada (Mominoki e al., 1995), a di e encia de la humana que unicamen e iene glicanos unidos a sus cadenas β. El pa ón de glicosilación de es a p o eína puede a ia con en e medades in lama o ias, au oinmunes y neoplasias (Ande sson e al., 2001). La unción biológica de la Hp, a la que debe su nomb e o o gado po sus descub ido es Polonowsky y Jayle (1983), se asocia a su capacidad pa a o ma complejos es ables con la hemoglobina. De es a o ma es capaz de con ola la disponibilidad del hemo ci culan e, impidiendo la pé didas excesi as de hie o po exc eción en la o ina (Gible 1974; Yang e al., 2003). Los complejos Hp- Hemoglobina son econocidos po ecep o es especí icos CD163, p esen es en los mac ó agos, y eliminados del o ganismo median e agoci osis lo que educe el daño oxida i o de la hemólisis (K is iansen e al., 2001). O as unciones a ibuidas a la Hp son: es imulación de la angiogénesis, inhibición de la ca epsina, hemaglu inación i al, modulación de la unción de los mac ó agos, es imulación de la o mación de p o aglandina E2, inhibición de la p oducción de supe óxidos y el aumen o de la p oducción de calcio en los neu ó ilos (Kohle e al., 1978; Oh e al., 1990; F ohlande e al., 1991). En el pe o la Hp es una PFA mode ada y esponde en e a di e sos es ímulos in lama o ios y en e medades in ecciosas. La Hp canina es especialmen e sensible al e ec o de los glucoco icoides. Valo es al os de Hp se han encon ado as el a amien o con es os y du an e hipe adenoco icoidismo (Ecke sall 2008). En o as especies como la po cina, aumen os de es a p o eína se han is o asociados con di e sos signos clínicos y si uaciones in lama o ias (Lamp ea e e al., 1994; So ensen e al., 2006; Saco e al., 2016). En caballos se han obse ado aumen os en los ni eles de Hp asociados a la in lamación p oducida po a i is, an o en sue o como en liquido sino ial (Ba achina e al., 2016). En bo ino las concen aciones de Hp en sue o son muy bajas (< 20 mg/L), a di e encia de o as especies como pe o, ga o, caballo y ce do cuyas concen aciones es án un ango de 1 a 2 mg/mL (Ecke sall 2008). Es a p o eína conside ada como PFA p incipal en el sue o bo ino, se ha es udiado ampliamen e In oducción en sue o en el diagnós ico de di e en es en e medades (Ecke sall e al., 2010) y en mues as de leche du an e mas i is (Pyo ala e al., 2011). La Hp ambién es p o eína de ase aguda en el es o de especies es udiadas, como humano, a a, a ón, conejo, ga o (Pu nam 1975, Pe e sen 2004). α1-glicop o eína ácida La α1-glicop o eína ácida (GPA), ambién conocida como o osomucoide, (Weime e al., 1950), es quizás la glicop o eína sé ica humana mejo ca ac e izada es uc u almen e. En el pe o es una glicop o eína de 43 KDa que p esen a un al o g ado de glicosilación, ap oximadamen e el 45 % de su peso. Debido a su al o con enido en ácidos siálicos la GPA p esen a un bajo pun o isoeléc ico, pI muy ácido y nume osas mic o o mas con pI comp endidos en e 2,8 y 3,8. (Dello e al., 1987; Fou nie e al., 2000). Al igual que la albúmina sé ica, la p o eína ijado a de d ogas más impo an e, la GPA puede uni se y anspo a sus ancias de o igen endógeno o exógeno como hepa ina, his amina, se o onina y es e oides (Fou nie e al., 2000). Es a capacidad de uni d ogas le con ie e una g an u ilidad en aplicaciones e apéu icas. La GPA es conside ada un an iin lama o io e inmunomodulado na u al. De es a o ma, inhibe la ac i ación de los neu ó ilos y aumen a la sec eción de ecep o es an agonis as de la IL-1 po los mac ó agos (Fou nie e al., 2000). Además, puede ayuda en la eliminación del lipopolisacá ido (LPS) uniéndose di ec amen e a él y neu alizando así su oxicidad (Moo e e al., 1997). Inhibe ambién la p oli e ación lin oci a ia inducida po mi ógenos (I oh 1989) y la ac i idad de las células NK (Na u al Kille ) (Okumu a e al., 1985). Se ha mos ado ambién que la ac i idad inmunomodulado a de la GPA depende de su glicosilación (Ha on el al, 1983). Finalmen e, es ele an e des aca que en lechones ecién nacidos la GPA puede alcanza concen aciones de casi 13 mg/mL, que disminuyen ápidamen e después del nacimien o (Lamp ea e e al., 1982; Lamp ea e e al., 1984). Dicha concen ación es más de 40 eces supe io a la concen ación de los adul os no males y ep esen a casi el 50 % de las In oducción p o eínas o ales del sue o de los ce di os ecién nacidos. Puede deci se que la GPA desempeña una unción desconocida pe o sin duda isiológicamen e impo an e en el pe iodo e al y neona al po cino. En la mayo ía de las especies es udiadas como homb e, a a, a ón (Kushne e al., 1994) GPA es una PFA. En las especies canina y elina GPA se compo a como una PFA posi i a mode ada. La GPA elina es un econocido ma cado de pe i oni is in ecciosa y ambién se han is o ni eles ele ados en neoplasias (Ecke sall e al., 2010). En ce do po el con a io la GPA no pa ece compo a se como una p o eína de ase aguda, ya que su concen ación no se ha is o signi ica i amen e modi icada signi ica i amen e du an e la espues a de ase aguda (Lamp ea e e al., 1994; Ecke sall e al., 1996) aunque ecien emen e se ha pos ulado su compo amien o como PFA nega i a debido a la disminución de su concen ación en el sue o de ce dos as in ección expe imen al con bac e ias an o G am posi i as como G am nega i as e in lamación asép ica inducida con acei e de emen ina (Heegaa d e al., 2013) Amiloide A sé ico El é mino amiloide A sé ico (SAA) comp ende a una amilia de p o eínas polimó icas codi icada po múl iples genes (Sipe 1999). Su secuencia es á muy conse ada en odos los mamí e os, así como en pája o y o as especies animales. P esen a un núme o a iable de iso o mas dependiendo de la especie animal. Los SAA 1 y SAA 2 son PFAs p incipales, ya que sus concen aciones aumen an has a 1000 eces du an e la in lamación. En leche se ha is o la p esencia de una iso o ma de es a p o eína denominada MAA di e en e a la del sue o y sin e izada po glándula mama ia en acas con mas i is (Ecke sall 2008). Po el con a io, la SAA 4 es inducida mínimamen e du an e la RFA y solo se ha encon ado en humanos y en a ones. Aunque SAA es una p o eína pequeña y su secuencia y polimo ismos son conocidos los de alles de su es uc u a idimensional son imp ecisos debido a su ca ác e hid o óbico (Sack 2018). In oducción Las SAAs son pequeñas apolipop o eínas de 12-14 KDa que se asocian ápidamen e du an e la RFA con la acción de las HDL3 en las que se hacen mayo i a ias, excediendo en can idad a la Apo A-I. Es o modi ica d ás icamen e el me abolismo del coles e ol. El SAA aumen a la a inidad de las HDL3 po los mac ó agos a la ez que disminuye la a inidad de las HDLs po los hepa oci os (Kisile sky e al., 1992). En onces, las HDLs se desplazan a los mac ó agos que engullen el coles e ol y los es os de lípidos en los si ios de nec osis. El coles e ol pod ía en onces se edis ibuido pa a usa lo en la epa ación del ejido y el exceso se ía exc e ado (S eel and Whi ehead, 1994). Además, se le han a ibuido o as unciones, como la inducción de enzimas que deg adan la ma iz ex acelula y eclu amien o quimio ác ico de células in lama o ias a los si ios de in lamación (Ye e al., 2015). El SAA 1 es á po encialmen e in oluc ado en la pa ogénesis de a ias en e medades in lama o ias c ónicas: es el p ecu so de la p o eína amiloide A deposi ada la amiloidosis y ambién ha sido implicada en la pa ogénesis de la a e oscle osis y la a i is euma oide (Ce on e al., 2005; Ecke sall 2008). El SAA se compo a como PFA p incipal en la mayo ía de las especies de mamí e os es udiadas (Pe e sen e al., 2004; Ce on e al., 2005), excep o en la a a (Kushne 1988). El SAA jun o con la CRP son las p incipales PFAs en el pe o. La de e minación de SAA es ú il en ga os donde ac úa como p incipal PFA en e a una amplia a iedad de p ocesos in lama o ios e in ecciosos (Ecke sall e al., 2010). En aca, aumen os en la concen ación de SAA se han asociado a in ecciones an o na u ales como expe imen ales, y jun o con Hp, el SAA ha sido p opues o como bioma cado de la mas i is (Ecke sall e al., 2010). Ele adas concen aciones de SAA se han encon ado en el sue o de caballos some idos a in lamación expe imen al ( e isado en (Ecke sall 2008)), además es a p o eína ha sido usada pa a di e encia casos in ecciosos como en e i is, en e ocoli is, pe i oni is, o abscesos abdominales, de casos no in ecciosos que causan dolo abdominal (Vandenplas e al., 2005) . En humanos SAA mues a una sensibilidad y apidez de espues a simila a la que p esen a CRP. Ni eles ele ados de es a p o eína se han encon ado asociados a e apas emp anas de di e sos ipos de In oducción cánce , lo que ha lle ado a e alua su papel como posible bioma cado en es e ipo de pa ologías; además debido a su ca ác e lipo ílico los cambios en la concen ación de SAA se han asociado a cambios en la o mación de HDL y a lesiones a e oscle ó icas, así como ambién se ha is o asociada a sa coidosis (Re isado en (Sack 2018)). Cadena pesada 4 del inhibido de ipsina in e -α La cadena pesada 4 del inhibido de ipsina in e -α (ITIH4) es una glicop o eína sé ica, que se incluye den o de la amilia del inhibido de ipsina in e -α (ITI), dada su homología secuencial con el es o de cadenas pesadas de es a supe amilia. La amilia ITI cons a de una se ie de p o eínas plasmá icas que esul an de la unión de una cadena lige a (bikunina) y di e en es cadenas pesadas, que se unen a a és de puen es de glicosaminoglicanos (Salie e al., 1996). La amilia de las cadenas pesadas cons a de 5 miemb os: H1, H2, H3, H4 y la úl ima ca ac e izada, la H5 (Himmel a b e al., 2004). La bikunina se encuen a unida a las cadenas H1, H2, H3 y H5, pe o no a la H4. La al a de bikunina, que con iene dos dominios inhibido es de la ipsina ipo kuni z, hace que la ITIH4, a di e encia del es o de miemb os de su amilia, no posea capacidad inhibi o ia de la ipsina (Gonzalez-Ramon e al., 1995). Inicialmen e, bajo el nomb e de sgp120 (se um glicop o ein 120 KDa), la ITIH4 humana ue clasi icada como una p o eína egulado a del complemen o (Hamme e al., 1989). Casi al mismo iempo y de mane a independien e, dos g upos japoneses deduje on la secuencia de 902 aminoácidos pa a la p o eína madu a a pa i de la secuencia de cDNA (Nishimu a e al., 1995; Saguchi e al., 1995). Debido a que es a p o eína es sensible a la deg adación median e la calic eína, algunos au o es pasa on a denomina le PK-120 (human plasma kallic ein-sensi i e p o ein de 120 KDa) (Nishimu a e al., 1995; Pu e al., 1995), mien as que o os la enomb a on como IHRP (ITI hea y chain ela ed p o ein) (Choi-Miu a e al., 1995; Saguchi e al., 1995), debido a la homología que p esen aba con las cadenas pesadas de amilia ITI. Poco an es de lle a se a cabo In oducción es os es udios, la ITIH4 ue desc i a como PFA po p ime a ez en la especie po cina, a la que se le denominó en o igen Pig-MAP (majo acu e phase p o ein in pigs); es a nue a p o eína po cina expe imen aba los mayo es aumen os de concen ación en el sue o, as la inducción de la ase aguda median e la inyección con acei e de emen ina (Lamp ea e e al., 1994). Pos e io men e es a nue a p o eína po cina ue iden i icada como una p o eína homóloga a la PK-120 humana, mos ando una homología de 85 % en la secuencia amino e minal (Gonzalez-Ramon e al., 1995). Es a p o eína plasmá ica pasó a denomina se ITIH4 (Salie e al., 1996), aunque el é mino Pig-MAP es comúnmen e u ilizado pa a denomina a es a p o eína en el ce do. G acias a los es udios de Saguchi y Nishimu a, se conoce la secuencia de la ITIH4 humana. El codón de iniciación ATG en el cDNA de es a ITIH4 es á lanqueado po una secuencia consenso de ipo Kozak (CCACCATGG), habi ual en euca io as supe io es (Saguchi e al., 1995). La p o eína se sin e iza en o ma de p ecu so con un pép ido señal de 28 aminoácidos. La p o eína madu a con iene cua o si ios de glicosilación (Asn53, Asn179, Asn489, Asn549), es esiduos de cis eína (Cys386, Cys719 y Cys879) y es si ios de econocimin o de la calic eina (A g455, A g633, A g660) den o de la secuencia (Phe-A g-Xaa) (Nishimuna e al., 1995, Saguchi e al., 1995). Debido a la acción de la calic eína, en p ime luga se ob ienen dos agmen os, uno de 100 KDa y o o de 35 KDa, seguidamen e el agmen o de 35 KDa pasa a 70 KDa y un agmen o eó ico de 30 KDa que no se ha encon ado (Pu e al., 1995). Los dos esiduos Cys719, Cys879 se encuen an en el agmen o de 35 KDa o mando un puen e disul u o. La simili ud en e ITIH4 y las cadenas pesadas de la amilia ITI, es á es ingida a los p ime os dos e cios de la secuencia amino e minal. En es a egión an o la ITIH4 como las o as cadenas pesadas poseen mo i os secuenciales de in e és, en e los que se encuen an un dominio Vaul , un si io de unión calcio y un dominio Von Willeb and. La egión ca boxilo e minal (el úl imo e cio de la secuencia) p esen a homología con p o easas dependien es de ATP (Saguchi e al., 1995). In oducción La ITIH4/Pig-MAP se ha es udiado ampliamen e en la especie po cina, donde es ca ac e izada como p incipal p o eína de ase aguda (Lamp ea e e al., 1994; Heegaa d e al., 1998). Su concen ación aumen a en in ecciones p oducidas an o po i us, como po bac e ias o pa ási os (Ca pin e o e al., 2007; Ma in De La Fuen e e al., 2010; Pomo ska-Mol e al., 2013). La Pig-MAP ambién se ha is o ele ada en si uaciones de es és y que comp ome en al bienes a animal como el anspo e (Piñei o e al., 2007b), el hacinamien o (Ma co-Ramell e al., 2011) o cambios en las pau as de alimen ación (Piñei o e al., 2007a). En el caso humano, aumen os de es a p o eína han sido desc i os en pacien es as di e en es p ocesos in lama o ios como in a o de mioca dio, angina de pecho o as in e enciones qui ú gicas, lo que pe mi ió ca ac e iza la como una PFA en es a especie (Piñei o e al., 1999). En la especia bo ina ambién ac úa como al y se ha is o inc emen os signi ica i os de es a p o eína an o en sue o (Piñei o e al., 2004), como en leche (Alonso-Faus e e al., 2012; Sole e al., 2018) de acas a ec adas po mas i is. En o as especies como o eja (Sendino 1988), a a (Da eau e al., 1998) o a ón (Duan e al., 2005) ambién se ha obse ado que es a p o eína ac úe como PFA posi i a. Has a el inicio de es a esis no se enían conocimien os ace ca del compo amien o de la ITIH4 canina en ase aguda. Resul ados sob e es a p o eína y su implicación como PFA se án discu idos en es e abajo. Aunque su es uc u a y su implicación en la ase aguda son conocidas, la unción biológica de la ITIH4 se desconoce oda ía. Un posible papel pod ía es a elacionado con la egulación de la mig ación celula y la p oli e ación du an e el desa ollo de la RFA, ya que uno de sus dominios (el dominio on Willeb and A) es á implicado en la in e acción con moléculas de la ma iz ex acelula (ECM), como el colágeno, p o eoglicanos o hepa ina (Salie e al., 1996). También se ha desc i o que inhibe la polime ización de la ac ina y la agoci osis en células polimo onuclea es (Choi-Miu a e al., 2000) y pa ece es a implicada an o el desa ollo como en la egene ación hepá ica (Bhanuma hy e al., 2002). In oducción Tabla 4. Mé odos analí icos come ciales alidados en la li e a u a, pa a la de e minación de las p incipales PFAs en pe o. PFA Tipo de ensayo Re e encia come cial Especi icidad Validación CRP ELISA ipo sándwich PHASE Canine CRP Assay ki , T idel a Pe o Kjelgaa d- Hansen 2003 a CRP Inmuno u bidimé ico Baye Humano Kjelgaa d- Hansen 2003 CRP Inmuno u bidimé ico Gen ian canine CRP Pe o Hills öm 2014; Kjelgaa d- Hansen 2014 CRP Inmuno u bidimé ico Tu bo e canine CRP, Acu e Bio ech Pe o Piñei oe al., 2018 CRP Poin o ca e Li eAssays canine CRP Pe o Ib aimi e al., 2013 CRP Poin o ca e EUROLYSER Diagnos ical Pe o Jasensky e al., 2015 Hp Espec o o omé ico PHASE Hap oglobin Assay ki , T idel a Mul iespecies Ma inez- Subiela 2005 Hp Inmuno u bidime ico Izasa Humano Tecles 2006 SAA ELISA sandwich T idel a Mul iespecies Ma inez- Subiela 2005 En el caso de la Hp el mé odo de cuan i icación más ampliamen e u ilizado es un mé odo espec o o omé ico basado en la medida de la ac i idad pe oxidasa del complejo Hp-hemoglobina (Ecke sall e al., 1999). Al no se un inmunoensayo no equie e la u ilización de an icue pos especí icos y po an o se conside a un mé odo mul iespecie, aunque es o no lo exime de una co ec a alidación pa a cada especie. En la li e a u a se ha encon ado su alidación pa a la de e minación de Hp canina (Ma inez-Subiela e al., 2005). Uno de los p incipales p oblemas que p esen a es e mé odo es la al a in e e encia de la hemólisis en la In oducción medida. Es e p oblema ambién se ha encon ado en el ensayo inmuno u bidimé ico desa ollado pa a la Hp humana y alidado pa a la Hp canina (Tecles e al., 2007). 1.5 Piome a canina La piome a es la a ección más común en pe as que han alcanzado la madu ez sexual y que se mani ies a median e acumulación de pus en el ú e o. Se a a de una en e medad g a e que puede supone una amenaza pa a la ida. Gene almen e, a ec a a pe as de mediana edad, aunque ambién puede mani es a se en pe as jó enes desde el cua o mes de edad, a pa i del p ime celo. Las pe as más suscep ibles son aquellas que nunca han p oc eado (Dab owski e al., 2007; Hagman 2018). Se a a de una in ección secunda ia, no con agiosa, ocasionada po una in ección bac e iana opo unis a que iene a o ecida po el aumen o de p oges e ona y po los cambios mo ológicos del endome io as el pe iodo de celo. E. coli es el pa ógeno que con mayo ecuencia se ha aislado del ú e o en piome a, aunque ambién se han encon ado o os o ganismos como S aphilococcus sp o S ep ococcus sp en e o os. Como espues a a los ni eles de sec eción de p oges e ona que se p oducen después del celo, puede da se un aumen o del g oso de la pa ed del endome io y la apa ición de quis es (hipe plasia endome ial quís ica, HEQ). Además la p oges e ona disminuye la con ac ilidad del ú e o y aumen a la sec eción de moco, acili ando el cie e del cuello del ú e o. Es e ambien e gene a unas condiciones a o ables pa a el c ecimien o bac e iano. Aunque la HEQ es un ac o de p edisposición, piome a y HEQ pueden desa olla se de mane a independien e (Hagman 2018) El cie e del cé ix es un ac o de e minan e en la g a edad de la en e medad. Si es e pe manece abie o las sec eciones p oducidas po la in ección pueden se expulsadas. En cambio si se obs uye comple amen e, debido a la apa ición de quis es en el endome io, al no pode p oduci se la In oducción desca ga aginal las sec eciones se acumulan dando luga a una in lamación en el ú e o, que se conoce como piome a ce ada. Se a a de una si uación aguda que e oluciona ápidamen e a es ado de g a edad. 1.5.1 Diagnós ico y a amien o de la piome a canina Además de la acumulación de pus en el ú e o, la piome a se ca ac e iza po una se ie de mani es aciones clínicas y pa ológicas an o a ni el local como sis émico, causadas p incipalmen e po las bac e ias y sus p oduc os bac e ianos. La piome a se ha asociado con endo oxemia y sepsis, aunque un diagnós ico emp ano y un a amien o adecuado acili an la supe i encia. Además de la desca ga aginal pu ulen a, que solo se p oduce en los casos de piome a abie a, en e los sín omas clásicos de piome a canina se incluyen ano exia, dep esión o le a gia, polidipsia (necesidad exage ada de bebe ), poliu ia, aquica dia, aquipnea, pulso débil y colo ano mal en las memb anas mucosas. Sín omas como ieb e, ano exia, deshid a ación, ómi os, dia ea y dolo abdominal es án p esen es en e el 15 % al 30 % de la pe as con piome a (Hagman 2018). La piome a es ácilmen e diagnos icable en su e sión clásica (piome a abie a), pe o no lo es an o en los casos en los que no se p oduce desca ga aginal (piome a ce ada). El diagnós ico de piome a ha de inclui un diagnos ico p elimina basado en la his o ia, un examen ísico y ginecológico en búsqueda de los signos clínicos de la en e medad así como es pa a de e mina pa áme os bioquímicos y hema ológicos y un diagnós ico de imagen del abdomen. La o a iohis e ec omía es el a amien o más segu o y e ec i o en la piome a canina, ya que se elimina la uen e de in ección y po an o su posible ecu encia. Además la o a is e ec omía se u iliza como mé odo de es e ilización qui ú gica de elección y como mé odo de p e ención. En el pos ope a o io es impo an e con ola los signos de in ección ya que una piome a a anzada jun o con un la go pe iodo de hospi alización puede de i a en pe i oni is (Ji pean e al., 2014c). Se ha e aluado la posibilidad de un a amien o pu amen e a macológico pa a el a amien o de piome a, pe o es a opción solo puede adminis a se en In oducción piome a abie a y as una cuidadosa selección del pacien e canino (Fieni e al., 2014). La de e minación de a iables in lama o ias y su seguimien o puede se ú il pa a la de ección emp ana de complicaciones y la de ección del p og eso de la in lamación sis émica. La de e minación de los ni eles de CRP, SAA y Hp se ha u ilizado en la moni o ización del pacien e as la o a iohis e ec omía. La concen ación de las PFAs disminuye de o ma g adual as la ci ugía (Dab owski e al., 2007), mien as que el aumen o o la no disminución en los alo es de es as pueden indica complicación as la ci ugía (Dab owski e al., 2009). Los ni eles de es as PFAs, han sido e aluados ambién pa a el diagnós ico de piome a, mos ando a iaciones en su concen ación en cuan o al ipo y la g a edad de la en e medad (Dab owski e al., 2013). En casos que cu san con sepsis se ha is o una impo an e ele ación de los ni eles de CRP y SAA (F ansson e al., 2007; Ji pean e al., 2014b). 1.6 Leishmaniosis canina La leishmaniosis es una en e medad pa asi a ia g a e ocasionada po p o ozoos de las di e en es especies del géne o Leishmania. Se a a de una zoonosis que a ec a a di e en es especies animales, incluido el homb e. Se conside a una de las en e medades pa asi a ias más impo an es después de la mala ia y la ila iasis lin á ica. El géne o Leishmania cuen a con más de 20 especies dando luga a las di e en es o mas clínicas de la en e mendad, en e ellas, la Lesihmaniosis isce al canina (Lcan), la o ma más g a e de la en e medad, que es á causada po el p o ozoo Leishmania in an um (WHO, 2017). Los p ime os casos de L. in an um en pe os se descub ie on en 1908, po Nicolle y Com e, en Túnez (Rioux e al., 1980). Desde en onces se han iden i icado a ias especies de Leishmania en pe os de dis in as pa es del mundo, A ica, Asia y Eu opa (Viejo Mundo) y Amé ica (Nue o Mundo). Hoy en In oducción día se acep a que el agen e causal de la Lcan en el Viejo Mundo, L. in an um, y su homólogo en el Nue o Mundo, L. chagasi, son la misma especie (Mau icio e al., 2000). La leishmaniosis se encuen a en egiones opicales y sub opicales, es endémica en 98 paises y se es ima una incidencia de dos millones de casos nue os al año, de los cuales 500.000 se deben a Lcan (WHO, 2017). La in ección po L. in an um en pe os es endémica en más de 70 países del mundo, aunque se desconoce la p e alencia global en pe os domés icos Lcan es endémica en odos los países de la cuenca medi e ánea, incluyendo Po ugal, España, F ancia, I alia, G ecia, C oacia, Albania, Mal a, Chip e y Tu quía (Duja din e al., 2008; Schallig e al., 2013). En odas es as egiones, el pe o es el p incipal ese o io pa a la in ección con L. in an um, an o en pe os como en humanos. 1.6.1 Ciclo de ida del pa ási o El ciclo na u al de la in ección po Leishmania implica además del p o ozoo un hospedado e eb ado (homb e o pe o) y un ec o . Los únicos ec o es capaces de ansmi i Leishmania son las hemb as de los lebó omos, insec os olado es de dos alas, que miden en e 2 y 3 mm de longi ud. Es impo an e la p esencia de es os ya que la ansmisión sos enida de Leishmania spp no suele ocu i en ausencia de ec o es. Leishmania iene un ciclo de ida dimó ico. En es ado ex acelula se encuen a alojado en el ac o diges i o del lebó omo en o ma de p omas igo e (Figu a 2, 1a), en es e es ado p esen a un cue po ala gado ( amaño, 15-24 µm x 2-4 µm) y un único lagelo, es e es ado supone la o ma in ec i a pa a el hospedado e eb ado. En es ado in acelula , den o del hospedado , se encuen a como amas igo e p esen ándose de o ma edondeada con un amaño de 2-3 µm y sin lagelo (Figu a 2, 1b). La hemb a del lebó omo al alimen a se de un animal e eb ado le inocula o mas in ec i as del pa ási o (Figu a 2, 1c). Den o de los mac ó agos del In oducción hospedado , el pa ási o en o ma de amas igo e es englobado po una acuola pa asi ó o a pa a elimina lo, pe o Leismania e ade las eacciones inmunológicas inespecí icas del huésped sob e i iendo y mul iplicándose po isión bina ia. La in ección se ex iende cuando las células pa asi adas se ompen y libe an los amas igo es, que se án agoci ados po más mac ó agos donde con inua án mul iplicándose. Además es a in ección se ex iende cuando los mac ó agos in ec ados después de di idi se de diseminan a a és de la piel o el o en e sanguíneo a ó ganos icos en células mac o ágicas como los lin onodos, la médula ósea, el hígado y el bazo (Solano-Gallego e al., 2011). Los pa ási os que se encuen an den o del hospedado pueden ol e al ac o diges i o del lebó omo median e la picadu a de es e, luga donde el pa ási o madu a y uel e a hace se in ec i o, lis o pa a epe i el ciclo. Du an e la alimen ación del lebó omo, las o mas no in ec i as del pa ási o de alojan en la pa e pos e io den in es ino medio, ahí madu an du an e 1-2 semanas esul ando la in ección ansmisible con p omas igo es me aclíclicos localizados en la pa e an e io del in es ino (Moody e al., 1993). Se han desc i o o as o mas de ansmisión de Leishmania en la que no se encuen a implicado el lebó omo (Figu a 2, 2), como la ansmisión e ical, la ansmisión median e ans usiones de sang e de donan e que con engan el pa ási o y ambién se ha desc i o la ansmisión ené ea. In oducción Solano-Gallego e al., 2011, Pa asi es & Vec o s Figu a 2. Ciclo de ida de L. in an um y o mas de ansmisión sin ec o . 1, ep esen a el ciclo de ida clásico de L. in an um; 1a, p omas igo e; 1b, amas igo e; 1c, diseminación del pa ási o. 2, o mas de ansmisión en ausencia de ec o : e ical (2a), ans usión sanguínea (2b) y ansmisión ené ea (2c). 1.6.2 Sin oma ología y diagnós ico Lcan cu sa con un amplio abanico de signos clínicos. El cuad o clínico es a iable y es á condicionado po la capacidad de p o ozoo pa a mul iplica se den o de las células del hospedado , así como de su habilidad pa a e adi la espues a inmuni a ia, además de los nume osos mecanismos pa ogénicos exis en es en la en e medad, los di e en es ó ganos a ec ados y la indi idualidad de la espues a inmuni a ia desa ollada po el hospedado (Bane h e al., 2008). Desde la piel los pa ási os se dis ibuyen po la sang e o la lin a a los nodos lin á icos, al bazo y de ahí a o os ó ganos como hígado y iñones (Al a e al., 2004). La lin adenomegalia y la esplenomegalia son signos ecuen es en es a en e medad, el bazo se conside a ó gano cla e pa a la supe i encia del pa ási o, ya que su espues a inmune es ine icaz an e la in ección. Las lesiones cu áneas en e las que se encuen an di e en es ipos de de ma i is, ulce as alopecias y onicog iposis, son las mani es aciones clínicas comunes. O as mani es aciones In oducción clínicas asociadas son las lesiones ocula es (conjun i i is y u eí is), pudiendo se es as úl imas la única mani es ación clínica. A o ia muscula , epis axis, p esencia de mucosas anémicas, hepa omegalia y daño enal, son o os sín omas a ene en cuen a (Bane h e al., 2008). El diagnós ico de la en e medad no es sencillo, se ecomienda una combinación de examen clínico-pa ológico con una con i mación de la en e medad median e di e sas écnicas, an o se ológicas como molecula es. - Diagnós ico clínico. Cons a de un examen ísico comple o que incluya examen de ma ológico, o almológico y p uebas de u ina del labo a o io. - Diagnós ico pa asi ológico, pa a de e mina la p esencia del pa asi o, puede ealza se median e di e en es écnicas, como his ología e inmunohis oquímica, obse ación di ec a median e mic oscopio a pa i de o is eñidos, o aislamien o de la especie median e cul i o. - Diagnós ico se ológico. Se ealiza median e la de ección de an icue pos especí icos con a el pa ási o en el sue o del hospedado . En e las écnicas cuan i a i as encon amos la inmuno luo escencia indi ec a (IFI), écnica de aglu inación di ec a (DAT) y ELISA. - Diagnós ico molecula . La de ección de DNA de Leishmania po PCR, p opo ciona un diagnós ico sensible y especí ico de la in ección. EL DNA de Leishmania puede ex ae se de di e en es ejidos, sang e o luidos biológicos. La inmuno luo escencia indi ec a (IFI), se conside a el mé odo de e e encia pa a el diagnós ico se ológico en la leishmaniosis clínica, debido a su al a especi icidad y sensibilidad, aunque pa ece se menos sensible en la de ección de In oducción in ecciones subclínicas (Maia e al., 2008). Debido a que muchos labo a o ios han es ablecido el pun o de co e de mane a a bi a ia, es posible encon a di e en es i ulaciones a la ho a de conside a posi i o a un animal, desde 1:40 a 1:80 e incluso 1:160 (G amiccia 2011). Es impo an e sub aya que pa a un diagnós ico co ec o, la in o mación p opo cionada an o po la e aluación clínicopa ológica, como se ológica y los da os de PCR, debe se a ada en conjun o (Solano- Gallego e al., 2011) En los úl imos años se han ealizado di e sos es udios con pe os in ec ados an o de mane a na u al como expe imen al con L. in an um, pa a e alua si la medida de las PFAs pod ían ayuda en el diagnós ico de la en e medad y/o en su moni o ización. (Ma inez-Subiela e al., 2002; Sasanelli e al., 2007; Ma inez-Subiela e al., 2011b; Ma inez-Subiela e al., 2014) 1.7 P o eínas de ase aguda como ma cado es de bienes a animal El e mino bienes a animal hace e e encia al es ado ísico y men al de un animal en elación a las condiciones en las que i e y mue e. Pa a e alua el bienes a animal se pueden plan ea p egun as ales como: • ¿El animal mues a signos de su imien o o dolo ? • ¿El animal es á sano y iene lo que quie e? • ¿El ambien e del animal cumple el p incipio de las cinco libe ades (libe ad de no ene hamb e ni sed; libe ad de con o ; libe ad de ausencia de dolo , lesiones y en e medad; libe ad de ausencia de miedo y dis és; libe ad de exp esa un compo amien o no mal)? (Fa m Animal Wel a e Council, 1992) La O ganización Mundial de la Salud Animal conside a que un animal se encuen a en un es ado sa is ac o io de bienes a cuan o es á sano, con o able y In oducción bien alimen ado, puede exp esa su compo amien o inna o y no su e dolo , miedo o dis és (WOAH, 2018). Teó icamen e, un animal puede encon a se en es si uaciones di e en es en cuan o a su g ado de adap ación al ambien e. En p ime luga , si el ambien e es o almen e inadecuado, la adap ación se á imposible y el animal mo i á o bien su i á lesiones o en e medades. En es e caso la mo alidad, la incidencia de lesiones causadas po el ambien e (po ejemplo, lesiones causadas po suelo inadecuado o debidas a o os animales) y la incidencia de en e medades causadas po el ambien e ac úan como indicado es de al a de bienes a . En segundo luga , es posible que el animal consiga adap a se al ambien e, pe o que dicha adap ación suponga un cos e pa a el animal aducido en una espues a de es és. Una si uación es esan e in ensa o p olongada puede ene e ec os nega i os en el animal, ales como disminución del c ecimien o, inhibición de la unción ep oduc i a o inhibición del sis ema inmuni a io, lo que cons i uyen indicado es de la al a del bienes a . Finalmen e, un animal puede encon a se en un ambien e lo su icien emen e sa is ac o io como pa a que su adap ación a él no le suponga un cos e, en es e caso el bienes a del animal se á adecuado.(Zúñiga e al., 2011). Al no pode el animal comunica su es ado, la es imación del bienes a animal es indi ec a y habi ualmen e se deduce de la ausencia de indicado es de males a , su imien o o en e medad, así como en el conocimien o de las necesidades isiológicas y el compo amien o de los animales (Zúñiga e al., 2011). La e aluación del bienes a animal no es un p oblema esuel o y la necesidad de c i e ios obje i os y alidados cien í icamen e se ha pues o de mani ies o. No malmen e se conside a que la e aluación del bienes a debe basa se en un conjun o de indicado es que incluyan la obse ación del compo amien o del animal jun o con la de e minación de pa áme os isiológicos. Los ni eles de co isol en plasma, sali a y/o o ina, se u ilizan ecuen emen e pa a la medida del es és, pe o es os pa áme os pueden no e leja una asociación con el es ado emocional (Taylo e al., 2006). An eceden es y obje i os La CRP posee en ajas desde el pun o de is a diagnós ico pa a el seguimien o de p ocesos in lama o ios, sin emba go o as PFAs pueden se in e esan es desde el pun o de is a diagnós ico, bien po que su ciné ica es más len a y p olongada ( a dan más en aumen a pe o pe manecen ele adas más iempo), o bien po que su espues a puede se di e en e en unción de la pa ología que a ec a al animal y pod ían ene in e és como he amien as de diagnós ico di e encial. Po ejemplo en es udios ecien es se ha is o que los pe os con en e medades nasales p esen an ni eles ele ados de CRP y Hp, y que la concen ación de es a úl ima es di e en e en los animales que p esen an aspe gilosis y los que p esen an ini is c ónica (Sheahan e al., 2010). El uso de p o eínas como la AGP, o una combinación de PFAs (Chase e al, 2012), pod ía se in e esan e pa a el diagnós ico y seguimien o de di e en es ipos de cánce , pe mi iendo p edeci la ecaída an es de que se de ec e sin oma ología clínica (Hann, 1999). El in e és en el uso de las PFAs como bioma cado es de salud y bienes a animal ha ido inc emen ando p og esi amen e en las úl imas décadas. Sin emba go la al a de me odología especí ica de especie, adecuadamen e alidada, se ha conside ado como una de las p incipales limi aciones pa a la inco po ación de es os pa áme os en la clínica (Kjelgaa d-Hansen e al., 2011). Aunque ac ualmen e exis en di e en es mé odos pa a la cuan i icación de las p incipales PFAs caninas, los esul ados ob enidos con las di e en es me odologías pueden se en algunos casos muy a iables, debido a la al a de es anda ización de las medidas analí icas. En es e sen ido el uso de mé odos adecuadamen e alidados, así como de un ma e ial de e e encia común al que pode e e i las medidas, se ía undamen al pa a pode ob ene esul ados compa ables en e labo a o ios. El o igen de es a esis se encuen a en los abajos pione os lle ados a cabo en el depa amen o de bioquímica y biología molecula y celula , po el g upo del P o eso Lamp ea e, que lle a on a la ca ac e ización de la espues a de ase aguda en la especie po cina, y el descub imien o de la Pig-MAP, nue a p o eína sé ica y PFA p incipal en el ce do, ambién conocida como ITIH4 An eceden es y obje i os (Lamp ea e e al., 1994; Gonzalez Ramón e al., 1995). La pig-MAP ha sido ampliamen e es udiada po el g upo del depa amen o de Bioquímica de la Uni e sidad de Za agoza en di e en es modelos de ase aguda, incluyendo in ecciones í icas, bac e ianas y pa asi a ias, y en di e en es si uaciones causan es de es és, demos ando se un excelen e ma cado de si uaciones pa ológicas y dis és en el ce do (Heegaa d e al, 2011; Piñei o e al., 2007). Muchos de es os abajos ue on posibles g acias a la colabo ación con a ios g upos eu opeos en dos Acciones Conce adas y un P oyec o Eu opeo, dedicados al es udio de las PFAs po cinas y su posible u ilización en la medicina e e ina ia. Al mismo iempo se es udió la nue a p o eína ITIH4 en o as especies como la humana, bo ina y o ina, donde ambién se compo a como PFA posi i a. En es a esis se con inúan es os es udios cen ados en la especie canina, El obje i o gene al de es e abajo ha sido ca ac e iza la espues a de la ITIH4, jun o con o as PFAs caninas en di e en es si uaciones de ase aguda y es udia sus posibles usos como bioma cado es en di e en es p ocesos in lama o ios o en e medades caninas. Pa a ello se ha aislado la p o eína y se han p epa ado an icue pos especí icos con los que se ha desa ollado me odología analí ica pa a su cuan i icación en sue o. La ITIH4 se ha e aluado jun o con o as de las p incipales PFAs caninas en di e en es modelos expe imen ales. Pa a la cuan i icación de es as PFAs se ha desa ollado y alidado, igualmen e, me odología analí ica p opia, especí ica pa a la especie canina. Como se ha indicado an e io men e las PFAs pueden aumen a ambién en si uaciones de es és, po lo que se ha p opues o su uso como ma cado es gene ales de bienes a animal. Como es bien sabido el bienes a animal, su e aluación y mejo a, es un ema de in e és c ecien e, no solo en animales de g anja, sino ambién en animales de compañía. P ueba de ello es la ecien e c eación de la no ma AENOR pa a la ce i icación de cen os de p o ección animal, p omo ida po AVEM (Asociación Española de Ve e ina ios Municipales). La e aluación del bienes a animal es un ema complejo, y el dispone de pa áme os obje i os pa a su e aluación esul a de g an ele ancia. Po ello es a An eceden es y obje i os esis incluye un es udio en colabo ación con AVEM pa a de e mina los ni eles de PFAs en animales alojados en cen os de p o ección y su posible u ilización como ma cado es de bienes a animal. A con inuación se de allan cada uno de los obje i os de es a esis: Obje i o 1. Aislamien o y ca ac e ización de la ITIH4 y o as PFAs p incipales en la especie canina. Las p o eínas pu i icadas du an e el desa ollo de es e abajo han sido: ITIH4, CRP, Hp y GPA Obje i o 2. Ob ención de an isue os y an icue pos especí icos pa a cada una de las cua o p o eínas pu i icadas. Obje i o 3. Desa ollo y alidación de mé odos analí icos pa a la cuan i icación de es as p o eínas, median e écnicas de inmunop ecipi ación o ensayos inmuno enzimá icos. Obje i o 4. E aluación de la ITIH4, jun o con o as PFAs en la especie canina, en di e en es modelos expe imen ales: • ci ugía mayo • animales a ec ados po piome a • animales in ec ados de o ma expe imen al po Leishmania in an um Obje i o 5. E aluación de ni eles de las PFAs en animales acogidos en cen os de p o ección, como posibles ma cado es de bienes a animal. Ma e iales y mé odos 3 MATERIALES Y MÉTODOS Ma e iales y mé odos Ma e iales y mé odos 3.1 Técnicas elec o o é icas 3.1.1 Elec o o esis en gel de Poliac ilamida con SDS (SDS-PAGE) La SDS-PAGE se empleó pa a analiza mues as p o eicas de di e sos o ígenes. Se u iliza on geles e icales discon inuos de 0,75 mm de espeso y 8 x 7 cm, que con enían SDS al 0,1 % cons i uidos po un gel concen ado de 1 cm de longi ud y un po cen aje de poliac ilamida del 4 % y un gel sepa ado de 6 cm de longi ud y un po cen aje de poliac ilamida que a ió en el ango de 10-15 % dependiendo del amaño molecula de las p o eínas a analiza . La elación de ac ilamida-bisac ilamida (Bio-Rad) en los geles ue 30:0,8. Las mues as a analiza se mezcla on en elación 2:1 con ampón de ca ga (TRIS/HCl 0.25M, glice ol 20%, SDS 4%, β-me cap oe anol 2%, azul de b omo enol 0.02% pH 8.6). Se desna u aliza on calen ando a 100 ºC du an e 5 min en un e mo-bloque o baño seco, y se aplica on a los pocillos si uados en la pa e supe io del gel y sume gidos en ampón de elec o o esis (TRIS/HCl 0,025M, glicina 0,192M, SDS 1%, pH 8,6). La elec o o esis se lle ó a cabo du an e ap oximadamen e 1 ho a 30 min a 120V, 20 mA po gel. A con inuación las p o eínas se iñe on con azul de Coomasie (apa ado 3.1.3) o se ans i ie on a memb ana (apa ado 3.1.2). En odos los casos en uno de los pocillos se aplicó una solución de ma cado es de pesos molecula es p e eñidos ( ango 10-260kDa, Spec aTM Mul icolo B oad Range P o ein Ladde , Fe men as). 3.1.2 T ans e encia de p o eínas a memb anas Las p o eínas sepa adas median e elec o o esis se ans i ie on a memb anas de ni ocelulosa (Hybond-C ex a, Ame sham Biosciences) median e un sis ema de ans e encia semiseca (T ans-Blo SD semid y ans e cell, Bio- Rad). T as sume gi la ni ocelulosa y el gel du an e 5 minu os en el ampón de ans e encia (TRIS/HCl 0,048 M, glicina 0,039 M, SDS 0,037 %, me anol 20 % pH 9,2) (Bje um and Scha e -Nielsen, 1986) se colocó sob e el ánodo una capa de papel de il o g ueso (Wha man) humedecida con el ampón de ans e encia, Ma e iales y mé odos sob e ella la ni ocelulosa, a con inuación el gel y po úl imo o a capa de papel de il o, e i ando que se o masen bu bujas de ai e en e las dis in as capas. La ans e encia se lle ó a cabo a un ol aje de 20 V, 400 mA du an e 1 ho a. La de ección de las p o eínas ijadas a la ni ocelulosa se ealizó u ilizando an icue pos especí icos (apa ado 3.6.3). 3.1.3 Tinción de p o eínas La inción de p o eínas se e ec uó po inme sión de los geles du an e 4-6 h en una solución colo an e de azul de Coomasie (Sigma) 0,5 g/L en ácido acé ico glacial al 6 %, me anol al 45 % y agua des ilada al 49 %. La decolo ación del ondo del gel se e ec uó po la ado du an e 12 ho as y a ios cambios, con una solución decolo an e que con enía ácido acé ico glacial al 10 %, me anol al 25 %, glice ol 2 % y 63 % de agua des ilada. A con inuación los geles ue on a ados con una solución p ese ado a (70 % me anol, 3 % glice ol, 27 % agua) pa a e i a su o u a du an e el secado. Finalmen e, se seca on en e dos láminas de papel de celo án humedecidas en la solución p ese ado a, y suje as a una placa de id io pa a e i a que se dis o siona an. 3.2 Pu i icación de p o eínas Pa a la pu i icación de las di e en es p o eínas sé icas aisladas en es e abajo se u iliza on sue os de pe o con di e en es p ocesos in lama o ios, que ue on p opo cionados po la p o eso a Anna Bassols (Se icio de Bioquímica Clínica de la Uni e sidad Au ónoma de Ba celona). 3.2.1 Pu i icación de CRP La p o eína C- eac i a se ha pu i icado median e c oma og a ía de a inidad con una esina de aga osa a la que se ha unido co alen emen e os o ilcolina (Pie ce TM ρ-Amino Phospho yl Choline Aga ose, The moFishe ). Ma e iales y mé odos Se hizo pasa a lujo len o una can idad de 200 mL de sue o de pe o a a és de la columna de 5 mL de os o ilcolina-aga osa, p e iamen e equilib ada en ampón TRIS 0,05 M, NaCl 0,15 M, CaCl2 2mM, azida sódica al 0,1%, pH 8 (Tampón TRIS-Ca). T as la a exhaus i amen e con el mismo ampón, la p o eína ijada a la columna se eluyó en acciones de 1,5 mL u ilizando como ampón de elución TRIS 0,05M, NaCl 0,15 M, EDTA 2 mM, azida sódica 0,1 % pH 8 ( ampón TRIS-EDTA). La p o eína ob enida se dializó en e a ampón de diálisis (TRIS 0,1 M, NaCl 0,2 M, azida sódica 0,1%, pH 7,5), se concen ó median e cen i ugación en ubos Amicon 30KDa (Me ck Millipo e) (apa ado 3.3.2) has a alcanza una concen ación de 2 mg/mL y se almacenó a -20 ºC has a su uso. 3.2.2 Pu i icación de ITIH4 La p o eína ITIH4 se ha aislado a pa i de sue o de pe o, no necesa iamen e de ase aguda, median e una c oma og a ía de inmunoa inidad u ilizando una columna que con enía an icue pos an i Pig-MAP unidos de mane a co alen e a una columna HiT ap NHS-ac i a ed HP (GE Heal hca e) de 1 mL (apa ado 3.6.2.1). Es a e apa de inmunoa inidad ap o echa la ue e eac i idad c uzada exis en e en e los an icue pos desa ollados en conejo en e a la p o eína po cina Pig-MAP y su p o eína homóloga canina, la ITIH4. T as equilib a la columna en ampón PBS-NaCl 0,5M (KH2PO4 8 mM, K2HPO4 1,7 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4), se hizo pasa un olumen de 15 mL de sue o de pe o. T as la a la columna con abundan e PBS-NaCl 0,5 M (5 olúmenes) y comp oba que la Abs280nm del excluido e a meno que 0,01, se eluyó con Glicina-HCl (Glicina 0,1 M, NaCl 0,4 M, pH 2,8) en olúmenes de 1 mL sob e ubos que con enían su icien e can idad de K2HPO4 0,5 M pa a neu aliza el pH. Se ecogie on odas las acciones eluídas y se dializa on en e a PBS. La p o eína se concen ó median e cen i ugación en ubos Amicon de 30 KDa (apa ado 3.3.2) has a alcanza 1 mg/mL y se almacenó a -20 ºC has a su uso. Ma e iales y mé odos 3.2.3 Pu i icación de Hap oglobina La pu i icación de hap oglobina (Hp) se lle ó a cabo a pa i de un sue o de pe o de ase aguda median e un p ocedimien o que cons aba de las siguien es e apas: p ecipi ación accionada con sul a o amónico sa u ado, seguida de una c oma og a ía en Azul de Cibac on – Shepa ose 4B, y una pos e io il ación en Sephac yl S200. P ecipi ación con sul a o amónico Se ealizó una p ecipi ación de las p o eínas de sue o con una disolución sa u ada de sul a o amónico (NH4)2SO4. En p ime luga se ealizó una p ecipi ación añadiendo a 50 mL de sue o el olumen necesa io de solución de sul a o amónico sa u ado pa a alcanza un 40% de sa u ación de sul a o amónico en la mezcla. T as incuba du an e 1 ho a a 4 ºC y en agi ación se cen i ugó a 5000g y 4ºC du an e 30 minu os. El sob enadan e se ecogió con cuidado sepa ándolo de la acción p ecipi ada. A es e sob enadan e se le añadió más sul a o amónico has a alcanza una concen ación de sul a o amónico equi alen e al 60 % de sa u ación. Se incubó en agi ación du an e 1 ho a a 4 ºC y se cen i ugó a 4 ºC du an e 30 minu os a 5000g. Se e i ó con cuidado el sob enadan e de la acción p ecipi ada. El p ecipi ado ob enido se esuspendió con un olumen de PBS igual a la mi ad del olumen de sue o de pa ida, eliminándose el sul a o amónico median e diálisis en e a PBS. C oma og a ía de Azul de Cibac on La acción p ecipi ada con sul a o amónico al 60 % de sa u ación, que con enía Hp y albúmina como componen es p incipales, se some ió a una c oma og a ía en una columna de Azul de Cib ac on – Sepha ose 4B, p e iamen e equilib ada en ampón TRIS 0,02 M, NaCl 0,05M pH 7,5 (Tampón de La ado). El amaño de la columna de Cib ac om y el olumen del p ecipi ado e- suspendido y dializado, se adecuó en p opo ción 1:1 ( : ). Ma e iales y mé odos T as aplica la mues a y la a la columna con el Tampón de La ado, se eunie on los ubos del pico p incipal de la acción excluida en e los que se encon aba la Hp. La acción ob enida ue dializada en e a PBS y se concen ó 10 eces espec o del olumen inicial del sue o de pa ida. T as con inua el la ado de la columna de Cibac on con un olumen de ampón de la ado 5 eces mayo que el de la columna, se eluye on las p o eínas ijadas con ampón TRIS 0,05 M, NaSCN 0,2 M, pH 8,0, lo que pe mi ió ob ene albúmina de pe o bas an e pu i icada, que se gua dó pa a o os usos. Fil ación en gel (Sephac yl S200) La acción de Hp ob enida en la e apa an e io se hizo pasa po una columna de Sephac yl S200 High Resolu ion (GE Heal hca e). Las dimensiones de la columna ue on: 1 m de al u a y 1,5 cm de diáme o. T as equilib a la columna en PBS, se hizo pasa po la columna 1 mL de la acción concen ada a un lujo cons an e y con inuo. Se ecogie on acciones de 1mL, se midió la abso bancia a 280 nm y se ep esen ó el c oma og ama. Los ubos que o maban los p incipales picos del c oma og ama se analiza on median e elec o o esis SDS-PAGE y wes e n-blo (apa ados 3.1.1 y 3.6.5.1). Las acciones que con enían Hp se eunie on y concen a on has a alcanza una concen ación de 2 mg/mL. Pa a aumen a el g ado de pu eza de la Hp, se ealizó una segunda il ación en gel. 3.2.4 Pu i icación de α1-glicop o eína ácida El p ocedimien o u ilizado pa a la pu i icación de α1-glicop o eína ácida (GPA) se basó en su p opiedad de man ene se en solución en medios con sales o disol en es en los que p ecipi an la mayo ía de las p o eínas plasmá icas. La p ime a e apa consis ió en una p ecipi ación del sue o de pa ida con una solución p ecipi an e que con enía sul a o amónico (NH4)2SO4 420 g/L y ácido iclo oacé ico (TCA) 24,75 g/L. La p ecipi ación se ealizó en p opo ción 1:1 ( : ) de sue o de pe o con la disolución p ecipi an e. Es a disolución se añade poco a Ma e iales y mé odos ayuda de un bis u í y se la ó con abundan e PBS has a que la A280nm del PBS de la ado ue meno de 0,05. Seguidamen e el gel se bloqueó con e anolamina 1 M, pH 8,0 incubando du an e 1 ho a a empe a u a ambien e y agi ación o a o ia sua e, o oda la noche a 4 ºC. El exceso de e anolamina se e i ó con una bomba a acío. Después el gel se la ó con glicina-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 2,8 du an e 15 minu os a empe a u a ambien e y se neu alizó ápidamen e con ampón os a o 0,5 M. Finalmen e se equilib ó en PBS que con enía azida sódica al 0,1 %. Inmunoadso ción de an isue os Una ez p epa ado el gel de inmunoadso ben e se incubó du an e al menos 20 ho as, a 4 ºC y con agi ación sua e con una solución de an isue o. La p opo ción de an isue o añadido al inmunoadso ben e se de e minó en unción del g ado de inespeci icidad de cada an isue o, siendo 1:1 ( : ) la p opo ción u ilizada en la mayo ía de los casos. T anscu ido el iempo de incubación se ecupe ó el an isue o y se la ó el inmunoadso ben e con un olumen de PBS con azida sódica al 0,1% equi alen e al olumen de inmunoadso ben e u ilizaso. Los la ados con PBS se ealiza on incubando du an e 30 minu os a 4ºC y con agi ación, has a que la A280nm ue meno de 0,1. El inmunoadso ben e se egene ó con glicina 0,1 M, NaCl 0,4 M, pH 2,8, se neu alizó con 1 olumen de disolución K2HPO4 0,5 M y se eequilib ó con PBS con azida sódica 0,1%. El an isue o ob enido, jun o con los la ados cuya A280nm e a supe io a 0,1 se concen a on has a el olumen inicial de an isue o median e ul a il ación (apa ado 3.3.1). La especi icidad del an isue o ob enido se comp obó median e inmunoelec o o esis (apa ado 3.6.4.2) y Wes e n blo (apa ado 3.6.5.1). El an isue o se conse ó a 4 ºC pa a uso u ina io y a -20 ºC pa a su conse ación a la go plazo. Ma e iales y mé odos 3.6.2 P epa ación de columnas de inmunoa inidad 3.6.2.1 Columna de an icue pos an i Pig-MAP La columna de an icue pos an i Pig-MAP u ilizada pa a la pu i icación de la ITIH4 de pe o se p epa ó median e la inmo ilización de 4 mg de an icue pos an i Pig-MAP, p e iamen e desa ollados en el labo a o io, a una columna HiT ap NHS-ac i a ed HP (GE Heal hca e) de 1 mL. El acoplamien o se lle ó a cabo según las indicaciones del ab ican e. El isop opanol que p o ege los g upos NHS se eliminó haciendo pasa po la columna una solución de HCl 1 mM p een iado, con la ayuda de una je inga. Inmedia amen e después, se añadie on a la columna los an icue pos an i Pig- MAP concen ados has a un olumen de 1 mL y dializados en ampón de acoplamien o (NaHCO3 0,2 M, NaCl 0,5 M pH 8,3). Los an icue pos se incuba on en la columna du an e 30 minu os a empe a u a ambien e. A con inuación, los an icue pos no ijados se eluye on con 3 mL de ampón de acoplamien o pa a calcula la e icacia de la ijación. T as es e paso in e medio, se la ó la columna con es ciclos al e nos de una solución de e anolamina 0,5 M, NaCl, 0,5 M pH 8,3 (6 mL) y de ace a o de sodio 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4 (6 mL). En el segundo ciclo la e anolamina se incubó du an e 30 minu os pa a bloquea los cen os ac i os. Finalizados los ciclos la columna se equilib ó con 2 olúmenes de PBS con azida al 0,1 %. El endimien o de la ijación se calculó a pa i de la abso bancia a 280 nm de los an icue pos aplicados a la columna de HiT ap y de los an icue pos no ijados a dicha columna as la incubación. El an icue po eluido de la columna de HiT ap con iene muchas sales que in e ie en en la medida a 280 nm. Pa a elimina es as sales, 0,5 mL de dichos an icue pos ue on c oma og a iados en una columna PD-10 Desal ing Column (GE Heal hca e) p e iamen e equilib ada en PBS. Una ez eliminadas las sales in e e en es se ecalculó la abso bancia a 280 nm de la acción no acoplada a la columna de HiT ap. Ma e iales y mé odos 3.6.2.2 Columnas de ITIH4 y de Hap oglobina caninas Pa a la pu i icación de an icue pos an i ITIH4 y an i Hp, ue necesa io p epa a dos columnas de inmunoa inidad, HiT ap NHS-ac i a ed HP (GE He al hca e) de 1 mL, en las cuales se inmo iliza on 2 mg de ITIH4 y 3 mg de Hp, espec i amen e. El acoplamien o de es as p o eínas a sendas columnas, se ealizó siguiendo el mismo p ocedimien o que se ha desc i o an e io men e en la p epa ación de la columna de an icue pos an i pig-MAP u ilizada pa a la pu i icación de la ITIH4 de pe o. 3.6.3 Ob ención de an icue pos 3.6.3.1 Pu i icación de an icue pos La pu i icación de los an icue pos especí icos an i ITIH4 y an i Hp caninas se lle ó a cabo haciendo pasa 3 mL de un an isue o an i ITIH4 o an i Hp especí ico (apa ado 3.6.1.2) po la columna de 1mL de HiT ap-NHS a las que se habían ijado co alen emen e las p o eínas ITIH4 y Hp, espec i amen e. La pu i icación de los an icue pos con es as columnas p e-empaque adas se ealizó con la ayuda de un equipo AKTA p ime plus (Ame sham Biosciences). T as la a la columna con PBS (5 eces el olumen de la columna), los an icue pos ijados a la columna se eluye on con el ampón de elución (glicina 0,1 M, NaCl 0,4 M, pH 2,8). Se ecogie on acciones de 1 mL en ubos que con enían 150 µL de ampón de K2HPO4 0,5 M. Finalmen e los an icue pos se dializa on en e a PBS y se concen a on median e p esión po N2 (apa ado 3.3.1) a 4 mg/mL. Se midió la A280nm y se congela on a -20ºC has a su uso. 3.6.3.2 Ma caje de an icue pos con pe oxidasa Pa e de los an icue pos inmunopu i icados se unie on co alen emen e a pe oxidasa de ábano, (Pe oxidase om ho se adish, HPR IV, Sigma). Ma e iales y mé odos Según el p o ocolo p e iamen e desc i o (A ameas 1969) se añadie on 2 mg de pe oxidasa po mg de an icue po inmunopu i icado y se disol ió sua emen e. Seguidamen e se añadió 50 µL de glu a aldheído al 1 % po mL de an icue po. La mezcla se incubó en oscu idad du an e 3 ho as en agi ación o a o ia. Pasado es e iempo se añadió 50 µL de glicina 1 M y se incubó du an e 2 ho as de la misma mane a (oscu idad y agi ación o a o ia). El an icue po ma cado se dializó en e a PBS y se conse ó a -20 ºC has a su uso. 3.6.4 Técnicas de inmunop ecipi ación en gel Se han u ilizado di e sas écnicas de inmunop ecipi ación pa a ca ac e iza y cuan i ica las dis in as p o eínas y an icue pos gene ados a lo la go de es e es udio. En odos los casos se p epa a on geles al 1% de aga osa en agua y se aplica on sob e placas de id io. Es os geles se deja on seca has a su comple a e apo ación, de mane a que se o mase una p ime a capa seca sob e el id io en el que luego se aplica ía el gel de aga osa sob e el que pos e io men e se desa olla on las eacciones de inmunop ecipi ación. Los inmunop ecipi ados o mados se la a on du an e 48 ho as con abundan e PBS con azida sódica al 0,1 %, ealizando a ios cambios. Se secó el gel po comple o, se iñó con azul de Coomasie y se la ó con una solución decolo an e (apa ado 3.1.3). 3.6.4.1 Inmunodi usión doble Se u ilizó un mé odo basado en el de Ouch e lony (Ouch e lony 1949). Sob e po as de mic oscopio se p epa ó un gel de 2-3 mm de espeso al 1 % en aga osa en ampón PBS. En el gel se pe o a on pocillos de 3 mm de diáme o en o ma de ose a, sepa ados en e sí de o ma equidis an e, en los que se coloca on las mues as, y en el cen o ambién de o ma equidis an e o o pocillo en el que se colocó el an isue o. Ma e iales y mé odos A con inuación se mues a un esquema gene al pa a el análisis de an isue os as las sang ías: A: An isue o 1 y 4. P o eína pu i icada 2 y 5. Sue o de concen ación al a 3 y 6. Sue o de concen ación baja (o un excluido como con ol nega i o) En el caso de la p o eína pu i icada y del sue o de concen ación al a, debe ealiza se una dilución pa a ca ga de 1 a 3 µg de la p o eína a es udio. El sue o de baja concen ación o sue o usado como con ol nega i o se u iliza á a la misma dilución que el sue o de concen ación al a. El an isue o se añade sin hace ninguna dilución p e ia. En cada pocillo se añadió un olumen de 15 µL. T as aplica las mues as en los pocillos se dejó di undi a empe a u a ambien e y den o de una cáma a húmeda du an e 12 – 24 ho as. Pasado ese iempo se comp obó si se habían p oducido líneas de p ecipi ación y pos e io men e se p ocedió al la ado y secado según se ha desc i o an e io men e. 3.6.4.2 Inmunoelec o o esis Se ealizó en geles de aga osa al 1 % en ampón ba bi u a o sódico 25 mM, pH 8,2, con un espeso de 1,8 mm, p epa ados sob e placas de id io de 9x12 o 9,5x7,5 cm (G aba e al., 1953). Las mues as se aplica on en pocillos de 2,5 mm de diáme o sepa adas 1,5 cm a una dis ancia 1/4 del eco ido elec o o é ico. Se deja un pocillo lib e (p e e iblemen e el del ex emo) pa a ca ga 3 µL de una solución de Neg o Amido de mane a que indique el en e de Ma e iales y mé odos la elec o o esis. Los con ac os en e el gel y las cube as que con enían el mismo ampón que el gel, se e ec ua on median e puen es de papel Wha man nº 1. La sepa ación elec o o é ica se ealizó du an e 1 ho a y media a 120 V. Una ez ealizada la elec o o esis se p ac ica on unos canales de 1,5 mm, equidis an es en e los pocillos, donde se aplica on 100 µL del an isue o co espondien e. Se dejó di undi du an e 24-48 ho as en cáma a húmeda y el gel se la ó, secó y iño como an e io men e se ha explicado. 3.6.4.3 Inmunodi usión adial Pa a alo a de o ma cuan i a i a y especí ica las p o eínas de una ma iz compleja como es el sue o sanguíneo se ealizó inmunodi usión adial (Mancini e al., 1965), u ilizando geles de aga osa al 1 % en ampón ba bi u a o sódico 25 mM, pH 8,2, de 1,8 mm de espeso . En la p epa ación del gel se incluyó una p opo ción de an isue o, cuando la aga osa se encon aba undida y a empe ada a 56 ºC. La p opo ción de an isue o depende de su concen ación de an icue pos especí icos y del ango de concen ación de las mues as a analiza , ajus ándose ambas expe imen almen e. Se p ac ica on unos pocillos de 2,5 mm de diáme o sepa ados 2 cm en e sí. Aplicadas las mues as (6 µL) se deja on di undi 48 ho as en cáma a húmeda. Pos e io men e se la ó, se secó y se iñó de la mane a habi ual. La medida del diáme o de los cí culos de inmunop ecipi ación pe mi e una de e minación cuan i a i a de la p o eína que se ealiza con e e encia a una se ie de pa ones con concen aciones conocidas de la p o eína a analiza . 3.6.5 Mé odos inmunoenzimá icos. 3.6.5.1 Wes e n blo . T as la ans e encia de p o eínas sepa adas median e SDS-PAGE a memb anas de ni ocelulosa (3.1.1 y 3.1.2), la de ección especí ica de cada p o eína se ealizó según el mé odo desc i o po Towibin (Towbin e al., 1979) con alguna modi icación de allada a con inuación. Ma e iales y mé odos Las memb anas se incuba on du an e 1 ho a a empe a u a ambien e o oda la noche a 4 ºC con una solución de leche semidesna ada en pol o al 5% (p/ ) en PBS-azida sódica. Seguidamen e las memb anas se la a on 4 eces du an e 2 minu os con agi ación igo osa, con una solución que con enía TRIS/HCl 0,01M, NaCl 0,2M, Tween-20 0,5% pH 8,0 ( ampón B). Pos e io men e se incuba on du an e 1 ho a con el co espondien e an isue o o an icue po especí ico disuel o en ampón B con leche en pol o al 0,17% (p/ ). La dilución óp ima se de e minó en cada caso. Finalizada la incubación se la ó 4 eces con ampón B del mismo modo desc i o an e io men e. A con inuación las memb anas se incuba on con un segundo an icue po an i-IgG de conejo, ma cado con os a asa alcalina (Sigma) diluido en ampón B con leche al 0,17% (p/ ) du an e 1 ho a a empe a u a ambien e y agi ación sua e. T as la a con el ampón B 4 eces, los inmunocomplejos se de ec a on median e un e elado químico o un e elado quimioluminiscen e. El e elado químico se e ec uó sob e la memb ana añadiendo una solución p epa ada en el momen o de su u ilización, que cons a de: 11 mL de ampón TRIS/HCl 0,2 M, MgCl2 1 mM, pH 9,6; 0,185 mL de una solución de 4 mg/mL de 5-b omo-4-clo o-3-indolil- os a o (BCIP) en dime il o mamida (DMF) y 1,25 mL de una disolución 1 mg/mL de ni oazul de e azolio (NBT) en DMF (Sigma). Las soluciones s ock de BCIP y NBT se conse a on en oscu idad a -20 ºC. La eacción se de u o eliminando la solución de e elado y la ando la memb ana con abundan e agua des ilada. En los casos en los que se deseó conse a la memb ana pa a un pos e io e elado con o o an icue po, se u ilizó un e elado quimioluminiscen e. En es e caso el an icue po secunda io u ilizado ue un an i-IgG en conejo ma cado con pe oxidasa. El inmunocomplejo o mado ue ac i ado con un sus a o come cial pa a la de ección de la enzima pe oxidasa (Enhanced chemiluminescen subs a e o de ec ion o HRP, Pie ceTM ECL Wes e n Blo ing Subs a e, The mo). T as la exposición con olada de la pe oxidasa ac i ada del inmunocomplejo en una memb ana Ame sham Hype ilm (GE Heal hca e), el e elado se lle ó a cabo median e la inme sión de la memb ana p ime o en una Ma e iales y mé odos solución de e elado (Kodak) has a que apa ecie on las bandas de inmunocomplejo, y as la a con agua des ilada, po inme sión en una solución de ijación. El paso de exposición y e elado se ealizó en un cua o oscu o. En ambos casos el iempo de e elado, y en caso del e elado quimioluminniscen e el iempo de exposición, depende de la can idad de mues a aplicada (can idad de p o eína a e ela ) y de la sensibilidad del an icue po u ilizado. 3.6.5.2 ELISA En es e abajo se han desa ollado dos ELISAS ipo sándwich pa a la cuan i icación de las p o eínas ITIH4 y Hp caninas, espec i amen e. En el desa ollo de ambos ELISAS se u ilizó la misma me odología. P epa ación de placas apizadas con el an icue po Los an icue pos inmunopu i icados (apa ado 3.6.3.1) se diluye on en PBS es é il que con enía ime osal al 0,01% y se lle a on a la concen ación deseada, 4 µg/mL pa a el ELISA de Hp y 6 µg/mL pa a el ELISA de ITIH4. 100 µL de es a disolución que con enía el an icue po de cap u a, se dispensa on en cada uno de los pocillos de mic oplacas pa ibles de 96 pocillos (12 x 8) (G eine bio-one) con ayuda de una pipe a mul icanal y se incubó a 4 ºC du an e un pe iodo de iempo comp endido en e 16 y 18 ho as. Pasado es e iempo, el an icue po se e i ó y los pocillos se la a on es eces con PBS, con ayuda de un la ado de placas (Tecan). Pa a e i a el pegado inespecí ico de o as p o eínas al plás ico, cada uno de los pocillos de las placas se incuba on con 300 µL de una solución de o oalbúmina al 3 % en PBS, du an e 3 ho as a empe a u a ambien e. T as e i a la o oalbúmina se la a on los pocillos 4 eces con PBS y se deja on seca las placas a empe a u a ambien e. Una ez secas las placas se embolsa on y se sella on con una bosa de agen e desecan e en su in e io y se almacena on a 4ºC has a su uso. Ma e iales y mé odos Cuan i icación median e ELISA Las mues as de sue o de pe o se diluye on, como se indica en la Tabla 5, en un ampón que con enía PBS con o oalbúmina al 0,05 % pH 7,4. Se aplica on 100 µL de mues a en cada pocillo y se incuba on du an e 30 minu os a empe a u a ambien e. T as la a es eces con PBS, los pocillos se incuba on du an e 30 minu os con 100 µL de an icue po ma cado con pe oxidasa (Ab conjugado) (apa ado 3.6.3.2) diluido en el mismo ampón de dilución que las mues as. Pasado ese iempo y as la a es eces con PBS se añadie on a cada pocillo 100 µL de una solución de sus a o c omógeno 3,3’,5,5’ e ame ilbencidina (TMB) (P e-s ained TMB Plus-2, KEM EN TEK Diagnos ics) y se incubó du an e 30 minu os a empe a u a ambien e. La eacción se pa ó añadiendo 100 µL de una solución de ácido sul ú ico 0,5 N. Se midió la abso bancia a 450 nm de cada uno de los pocillos de la placa con un lec o de placas (Sun ise, Tecan). La concen ación de p o eína en las mues as p oblema se calculó po in e polación en una cu a de calib ado ob enida con una mues a de sue o es ánda de concen ación conocida, u ilizado ambién pa a la inmunodi usión adial. Aunque la me odología desa ollada ue la misma pa a los dos ELISAS desa ollados, la dilución de las mues as de sue o y del an icue po conjugado u o que ajus a se pa a cada uno de los ELISAS desa ollados, así como el ango de concen aciones de la ec a de calib ado. Tabla 5. Condiciones especí icas de la cu a de calib ado, dilución de mues a y dilución de conjugado pa a cada uno de los ELISAS desa ollados. ELISA ITIH4 ELISA Hp Rango cu a de calib ado 21 - 700 ng/mL 4 - 130 ng/mL Dilución del sue o 1/4000 1/50000 Dilución del Ab conjugado 1/6000 1/120000 Ma e iales y mé odos 3.6.6 Mé odo inmuno u bidimé ico pa a la cuan i icación de CRP canina El desa ollo de un mé odo inmuno u bidimé ico pa a la de e minación de p o eína C- eac i a en sue o de pe o se ealizó en el con ex o de un p oyec o INPACTO (IPT-010000-2010-001), median e el desa ollo de inmunopa iculas de la ex asociadas de mane a co alen e al an icue po an i CRP (Piñei o e al., 2018). El undamen o de es a écnica se basa en la u bidez p oducida debido a la o mación de inmunoag egados que se da cuando la CRP eacciona con las inmunopa ículas. La de e minación de CRP se ealizó de o ma au omá ica, u ilizando un analizado Olympus AU400. T es mic oli os de sue o de pe o, se mezclan con 230 µL de ampón de eacción (R1) al que se le añaden 70 µL de inmunopa ículas de la ex (R2) y se mide la Abs600nm inmedia amen e después de mezcla . T as incuba a 37 ºC du an e 4 minu os se ealiza una segunda lec u a a la misma longi ud de onda. El aumen o de la u bidez se de e mina median e la medida de Abs a 600nm (segunda lec u a menos p ime a), y es p opo cional a la concen ación de CRP en la mues a. La concen ación de CRP se calcula median e in e polación en la cu a de calib ado cons uida a pa i de las diluciones del calib ado de CRP. El analizado calcula de o ma au omá ica la concen ación de CRP a pa i de la cu a de calib ado ob enida con los calib ado es, median e un ajus e poligonal 3.7 Validación de mé odos analí icos La alidación de los mé odos ELISA desa ollados en es a esis se ealizó median e la de e minación de los siguien es pa áme os: lími es de de ección y cuan i icación, imp ecisión ( epe i i idad y ep oducibilidad), y e acidad. El lími e de de ección (LoD) y de cuan i icación (LoQ) se de e minó median e la medida de mues as de blanco, compues as po el ampón de dilución de mues a sin anali o, de acue do a las siguien es ecuaciones: LoD = C media+3×SD; LoQ=C media+(10 ×SD) Ma e iales y mé odos como la media geomé ica de la exp esión de dos genes no malizado es, glice aldehído-3- os a o deshid ogenasa (GADPH) y β-2-mic oglobulina (β2M). Tabla 6. Secuencia de los cebado es (D) di ec o y (R) e e so diseñada pa a cada gen, amaño del p oduc o ampli icado (pb) y empe a u a de anillamien o (Tm). Gen Secuencia cebado es pb Tm (ºC) CRP D: 5´ AGACCTGGACGAAAAAGCCTT 3´ R: 5´ CCTTCATCGGCTTCTGCAACT 3´ 89 60 ITIH4 D: 5´ CACATCCAATTCAAGCCGCA 3´ R: 5´ TCGATCTGAATGGAGCCTCCA 3´ 116 64 GADPH D: 5´ TGGCAAAGTGGATATTGTCG 3´ R: 5´ AGATGGACTTCCCGTTGATG 3´ 60 β2M D: 5´ TCTACATTGGGCACTGTGTCAC 3´ R: 5´ AAGAGTTCAGGTCTGACCAAG 3´ 136 60 Los cebado es u ilizados pa a ampli ica la exp esión de ITIH4 y CRP (sin e izados po In i ogenTM) ue on diseñados en el labo a o io con la ayuda del p og ama P ime Exp ess (so wa e de Applied Biosys ems). Las secuencias se ob u ie on en las bases de da os del Cen o Nacional pa a la In o mación Bio ecnológica (NCBI), USA. Dichas secuencias se localiza on en di e en es exones pa a e i a la ampli icación de DNA genómico. Asimismo, se ealizó una búsqueda BLAST en el genoma de pe o pa a e i a la exis encia de si ios de unión inespecí ica de los cebado es. Los cebado es de los genes con ol GADPH (Zhang e al., 2013) y β-2-mic oglobulina (Kisiel e al., 2012) se selecciona on según bibliog a ía ya publicada. Cuan i icación y análisis es adís ico Ma e iales y mé odos La cuan i icación de CRP, ITIH4, Hp y GPA, se ealizó median e inmunodi usión adial, u ilizando los an isue os especí icos y de especie desa ollados p e iamen e. Las di e encias en los ni eles de las PFAs an o en sue o como en hígado en e el g upo de animales no in ec ados y el g upo de animales in ec ados se analiza on median e el es es adís ico Mann-Whi ney. 3.8.4 E olución de las PFAs en animales in ec ados con L. in an um. Es udio 2. Animales y oma de mues a En un segundo es udio, se dispuso del sue o de 10 pe os de aza Beagle, 5 machos y 5 hemb as, odos ellos in ec ados expe imen almen e con L. in an um de la misma o ma que en el es udio an e io . La oma de mues a y el examen clínico se ealiza on a di e en es iempos a lo la go del es udio. La mues a a iempo 0 se ob u o an es de la in ección, una ez los animales hubie on pasado un pe iodo de aclima ación al cen o. T as la in ección se ecogie on mues as a di e en es iempos pa a e alua la e olución de las PFAs. Es os iempos ue on: 24 h y 48 ho as, 1 semana, y 2, 3, 4, 6, 8 y 10 meses pos in ección. Diagnós ico se ológico Con el in de alo a la p esencia de an icue pos en e a Leishmania in an um en los animales, se ealiza on las écnicas se ológicas IFI (inmuno luo escencia indi ec a) y ELISA. Po o a pa e, pa a la de e minación de la ca ga pa asi a ia se ealizó una PCR en iempo eal en los ejidos conside ados habi ualmen e como diana, los lin onodos y la médula ósea. Es as écnicas ue on ealizadas po el Depa amen o de Pa ología Animal, de la uni e sidad de Za agoza. Ma e iales y mé odos El ELISA come cial, CIVTEST Canis Leishmania 192 (HIPRA S.A.), se ealizó de acue do a las ins ucciones indicadas en el mismo. Las mues as de sue o se analiza on po duplicado a una abso bancia de 450nm. Pa a la in e p e ación de los esul ados se calculó el alo de azón (Rz) pa a cada mues a, de acue do con la siguien e ecuación: Rz=A450nm mues aA450nmcon ol posi i o Una ez ob enidos los esul ados, los c i e ios de co e pa a conside a a un animal como posi i o, nega i o o dudoso, se es ablecie on de acue do a las ecomendaciones del ab ican e del ELISA, en unción del alo ob enido de Rz: Nega i o ELISA: < 0,9 Dudoso ELISA: 0,9-1,1 Posi i o ELISA: > 1,1 En los casos en los que el ELISA p esen ó dudas, los esul ados ob enidos de la i ulación de an icue pos median e IFI, ambién pe mi ió clasi ica a los animales, de acue do a los siguien es alo es: Nega i o IFI: <1/40 Posi i o IFI: ≥1/40 Diagnós ico clínico El diagnós ico clínico se ealizó median e una hoja de egis o de signos clínicos, indi idual pa a cada animal. En dicha hoja se egis a on pa áme os gene ales del animal como empe a u a y peso, y signos clínicos especí icos de leishmaniosis. Pa a cada animal se asignó una pun uación clínica (PC) ob enida como la suma de cada sín oma indi idual empleando el esquema de pun uaciones p e iamen e desc i o po Manna (Manna e al., 2009) y con las modi icaciones adop adas po el g upo de En e medades Me axénicas de la Uni e sidad de Za agoza al y como se mues a en la siguien e abla. Tabla 7. Desc ipción de los signos clínicos es ablecidos en la explo ación clínica pa a calcula la pun uación clínica de cada pacien e. Ma e iales y mé odos Signos clínicos G adación Pé dida de peso 0; 0% de pé dida, 1; <20 %, 2; >20 % Sin omas ocula es: conjun i i is/u ei is 0; ausencia, 1; mode ada, 2; g a e Sín omas cu áneos: alopecias/úlce as 0; ausencia, 1; mode ada, 2; g a e Lin adenopa ía 0 ausencia, 1 p esencia Mucosas anémicas 0 ausencia, 1 p esencia Onicog iposis 0 ausencia, 1 p esencia A o ia del músculo empo al 0 ausencia, 1 p esencia Esplenomegalia a la palpación 0 ausencia, 1 p esencia Cualquie o o sín oma elacionado con la in ección 0 ausencia, 1 p esencia Pe is 2018 T as egis a los signos clínicos los animales se ag upa on en es g upos en unción de la can idad de signos exp esados, clasi icación basada en Ab anches (Ab anches e al., 1991) y según las modi icaciones de Molina (Molina e al., 1994). Asín omá icos: ausencia de sín omas y signos clínicos debidos a la in ección po Leishmania. En es e g upo se desca ó el aumen o de amaño mode ado de lin onodos, así como casos de mucosas anémicas. Oligosin omá icos: sín omas mode ados, incluyendo dos signos clínicos, aumen o de amaño de los lin onodos jun o con onicog iposis o alopecia /de ma i is ex olia i a. Polisin omá icos: sín omas e iden es, incluyendo 3 o más signos de en e medad. Cuan i icación y análisis es adís ico Ma e iales y mé odos Las de e minaciones de ITIH4 y Hp se ealiza on median e los ELISAs desa ollados, y la cuan i icación de CRP median e un ensayo inmuno u bidimé ico. Median e los es Saphi o-Wilk y Kolmogó no -Smi no , se comp obó que las mues as no seguían la no malidad. Las di e encias en e los dis in os iempos pa a cada PFA se analiza on median e el es no pa amé ico K uskal-Wallis, aplicando el pos es Dunn. Las co elaciones en e los da os de sin oma ología clínica, se ología y PFAs se calcula on median e el cálculo del alo del coe icien e de co elación Rho de Spea man. 3.8.5 Asignación de alo es de PFAs en animales sanos Animales Pa a la asignación de alo es de e e encia pa a las PFA en animales sanos, se u iliza on 165 animales. 72 animales pe enecían a la aza Beagle de edad comp endida en e 6 y 12 meses, 37 machos y 35 hemb as. El es o de animales 98, pe enecían a o as azas y ambién algunos de ellos e an mes izos. De es os animales 45 e an animales en egados a cen os de p o ección (23 machos y 22 hemb as) con edades comp endidas desde los 5 meses has a los 10 años, 22 ue on donan es y el es o, ue on pe as u ilizadas como con oles sanos en los es udios de o a iohis e ec omía y piome a, con edades comp endidas desde los 5 meses has a los 13 años. Los sue os de los pe os Beagle ue on p opo cionados po el g upo del p o eso Juan An onio Cas illo. Cuan i icación y análisis es adís ico Las PFAs ue on cuan i icadas po los mé odos desa ollados en es a esis, ELISA ipo sándwich pa a ITIH4 y Hp, IR pa a GPA, e inmuno u bidime ía pa a CRP. Ma e iales y mé odos Se es udió la no malidad de las mues as median e los es Saphi o-Wilk y Kolmogó no -Smi no . El cálculo del in e alo de e e encia pa a cada una de las p o eínas se ealizó median e los pe cen iles 3 – 97 %. Los análisis compa a i os en e las poblaciones en unción de la aza, edad y sexo se analiza on median e el es Mann-Wi hney. 3.8.6 E aluación de los ni eles de PFA en pe os alojados en Cen os de P o ección. El es udio ealizado en los Cen os de P o ección se lle ó a cabo en colabo ación con la Asociación Española de Ve e ina ios Municipales (AVEM) Consis ió en la ecogida de mues as de sang e de pe os que ue on alojados en di e en es cen os de p o ección dis ibuidos po la geog a ía española. En es e es udio han colabo ado un o al de 11 Cen os de P o ección de di e en es comunidades au ónomas. El es udio ue ap obado po la Comisión É ica Aseso a pa a la Expe imen ación Animal (PI56/15). Animales y oma de mues a Se ob u o el sue o de 61 pe os de di e en es azas y edades comp endidas en e los 2 meses y los 10 años, que ue on ecogidos en es cen os de p o ección de di e en es á eas geog á icas de España. La oma de mues a se ealizó a di e en es iempos, una p ime a en el momen o de la llegada del animal al cen o, o a a los 2 ó 3 días de pe manencia en el cen o, una e ce a a los 15 días y la úl ima as un mes de pe manencia en el cen o. En algunos casos no ue posible ob ene las mues as de los úl imos iempos debido a la salida del animal del cen o po causas adop i as. En los cen os en los que no ue posible la ecogida de mues as se iadas, se ecogie on mues as de los animales que llegaban a los cen os de p o ección y ambién de o os animales que lle aban un iempo alojados en los mismos. Pa a cada animal se comple ó una icha con da os como edad, sexo, peso, es ado sani a io y nu icional o si son animales ecogidos o en egados en e Ma e iales y mé odos o os. El modelo de la icha a ellena pa a cada animal puede e se en el Anexo Figu a 1. Cuan i icación y Análisis es adís ico Las de e minaciones de ITIH4 y Hp se ealiza on median e los ELISAs desa ollados, y la cuan i icación de CRP median e un ensayo inmuno u bidimé ico. Se comp obó que las mues as no seguían la no malidad median e los es Saphi o-Wilk y Kolmogó no -Smi no pa a cada una de las PFAs es udiadas. Debido a que no se pudo asumi la no malidad de las mues as, las p uebas de con as en con los alo es medios de las PFAs se ealiza on con el es K uskall- Wallis cuando el ac o iene más de dos ni eles, y Mann-Wi hney cuando el ac o iene dos ni eles, y cuando K uskall-Wallis ha salido signi ica i o en los ac o es de más de dos ni eles pa a con as a los g upos dos a dos. Resul ados 4 RESULTADOS Resul ados Resul ados 4.1 Pu i icación de p o eínas y ob ención de an isue os 4.1.1 Pu i icación de ITIH4 canina y ob ención de an isue os La pu i icación de la p o eína ITIH4 se ha lle ado a cabo de mane a sa is ac o ia en una sola e apa, median e c oma og a ía de a inidad, u ilizando an icue pos an i ITIH4 po cina/Pig-MAP que econocen la p o eína homóloga canina. En una e apa p e ia, se comp obó la eac i idad c uzada exis en e en e la ITIH4 canina y los an isue os an i Pig-MAP disponibles en nues o labo a o io (Gonzalez-Ramon e al., 1995). Pa a el aislamien o de an icue pos an i Pig-MAP, se p epa ó una columna de a inidad que con enía Pig-MAP pu i icada unida co alen emen e a Sepha ose 4B (Sigma). Los an icue pos an i Pig-MAP se inmo iliza on en una columna de NHS-HiT ap (apa ado 3.6.2.2) pa a p epa a la columna de a inidad, que ue u ilizada pa a la pu i icación de la p o eína ITIH4 canina. Figu a 4. Análisis po SDS-PAGE (10 %) de las acciones ob enidas du an e la pu i icación de la ITIH4 canina. a) Tinción de p o eínas con azul de Coomasie. M, ma cado es de peso molecula (Sigma); 1, sue o de pe o de ase aguda u ilizado como Resul ados Figu a 10. Análisis median e SDS-PAGE (12 %) de las acciones ob enidas du an e las di e en es e apas del p oceso de pu i icación de Hp de pe o. 1, Sue o de pe o de pa ida; 2, F acción seleccionada as la p ecipi ación accionada con ssa; 3, F acción ob enida as la c oma og a ía en Azul de Cibac ón – Sepha ose 4B (excluido); 4, F acción inal de Hp de pe o ob enida as las dos e apas de il ación en Sephac yl S-200. La Hp pu i icada se u ilizó pa a inmuniza conejos, lo que pe mi ió ob ene un an isue o que al se en en ado po inmunoelec o o esis al sue o de pe o p oducía una banda p incipal, que co espondía a la Hp, pe o ambién o as líneas más débiles ( e Figu a 11a). Pa a elimina es as inespeci icidades se p epa ó un inmunoadso ben e con las acciones de sue o de pe o ca en es de Hp, ob enidas du an e el p oceso de pu i icación. Después de la inmunoadso ción, el an isue o an i Hp eaccionó de mane a especí ica con la Hp de pe o median e inmunoelec o o esis (Figu a 11a), econociendo po igual, an o a la p o eína pu i icada, como la Hp p esen e en el sue o de pe o. La especi icidad del an isue o an i Hp ob enido puede ap ecia se ambién al u iliza lo pa a el e elado de sue o de pe o median e SDS-PAGE al 12 % y Wes e n blo . Como puede ap ecia se en la Figu a 11 b, el an isue o econoce una sola banda que co esponde con la cadena pesada de la Hp. Resul ados Figu a 11. Análisis po inmunoelec o o esis (a) y po Wes e n blo (b) del an isue o an i Hp de pe o desa ollado a) S, sue o de pe o; P Hp canina pu i icada. Canales: an isue o an i Hp canina an es (Ai) y después de adso be (A ). b) Wes e n blo de sue o de pe o, e elado con el an isue o an i Hp de pe o especí ico (1/5000) y an i IgG de conejo unida a pe oxidasa (1/20000). 4.1.4 Pu i icación de α1 glicop o eína ácida canina y ob ención de an isue os. La pu i icación de la α1 glicop o eína ácida (GPA), se lle ó a cabo median e un p ocedimien o de dos e apas. En una p ime a e apa, la adición de una mezcla de sul a o amónico y ácido iclo oacé ico al sue o de pe o, pe mi ió sepa a una p o eína que mos ó una banda de 44 KDa median e SDS PAGE, (Figu a 12 ca il 2) del es o de las p o eínas del sue o median e p ecipi ación de es as úl imas. Es a banda que pe manece en la acción del sob enadan e, coincide con el peso molecula desc i o pa a la GPA de pe o. En una segunda e apa se aumen ó el g ado de pu eza de es a p o eína haciendo pasa dicho sob enadan e po una columna de in e cambio ca iónico (columna de ambe li a IRC-50) en la que la GPA debido a su bajo pI no se ija a la ma iz. La p o eína que no se unió a la ma iz de ambe li a ue dializada en e a PBS y concen ada has a Resul ados ap oximadamen e 2 mg/mL. Dicha p o eína ue iden i icada como GPA de pe o median e MALDI-TOF (Tabla 1 Anexos). Figu a 12. SDS-PAGE de las acciones ob enidas en la pu i icación de GPA. Ca il 1, sue o de pe o; ca il 2, sob enadan e de la p ecipi ación con ádico iclo oacé ico y sul a o amónico, que con iene la GPA; ca il 3, excluido de la columna de ambe li a que con iene la GPA de pe o pu i icada, el núme o 8 de es e ca il indica la banda eco ada y analizada median e MALDI TOF en la abla 1 del Anexo. M, peso molecula (Sigma). La inmunización de es a p o eína pu i icada en conejos pe mi ió ob ene un an isue o an i GPA, que econoce po igual a la p o eína pu i icada y a la GPA p esen e en el sue o de pe o median e inmunoelec o o esis (Figu a 13). Es os an isue os no mos a on ninguna banda adicional al en en a los al sue o de pe o, po lo que la especi icidad mos ada po inmunoelec o o esis se conside ó adecuada y no ue necesa io some e los a inmunoadso ción. Resul ados Figu a 13. Análisis po inmunoelec o o esis del an isue o an i GPA canino. S, sue o de pe o; P GPA canina pu i icada. En el canal, an isue o an i GPA canina (A ). 4.2 Desa ollo y alidación de mé odos analí icos pa a la cuan i icación de PFAs caninas 4.2.1 Desa ollo y alidación de mé odos de inmunodi usión adial pa a la cuan i icación de ITIH4, CRP, Hp y GPA caninas A pa i de los an isue os especí icos desa ollados, y como mé odo de medida inicial pa a la cuan i icación de ITIH4 canina, se puso a pun o la écnica de inmunodi usión adial (IR). A su ez, ambién se puso a pun o la misma me odología pa a la cuan i icación de CRP, Hp y GPA, a pa i de los an isue os p e iamen e desa ollados. Las p o eínas pu i icadas (ITIH4, CRP, Hp y GPA) se u iliza on como pa ón pa a asigna el alo de e e encia a un sue o de pe o, que pos e io men e se u ilizó como calib ado en los espec i os mé odos de IR. Se ealizó una alidación inicial del mé odo de e minando la p ecisión, ango de linealidad y lími e de cuan i icación. En las igu as 15, 16, 17 y 18, se mues a un esumen con los p incipales pa áme os calculados pa a cada uno de los mé odos de IR desa ollados y alidados. El ango de abajo se seleccionó median e la elección del ango lineal que p esen ó la cu a dosis- espues a del calib ado . A modo de ejemplo se mues a en la igu a 14, la cu a dosis- espues a del calib ado pa a la cuan i icación de ITIH4 canina. Como puede e se, a concen aciones po encima de 0,28 mg/mL Resul ados de ITIH4 la cu a del calib ado sa u a, mien as que po debajo de 0,017 mg/mL el diáme o del halo de p ecipi ación es muy pequeño y no hay di e encias en e las dis in as concen aciones. La selección del ango de abajo se e ec uó de la misma mane a pa a el es o de p o eínas (CRP, Hp, GPA); es os alo es pueden e se en las igu as 15 a 18, ango lineal. Figu a 14. Cu a dosis- espues a del calib ado pa a cuan i icación de ITIH4 canina po IR. Se ep esen a el diáme o al cuad ado del halo de p ecipi ación (exp esado en mm2), en e a la concen ación de ITIH4 en mg/mL. Se e aluó la e acidad del ensayo compa ando la cu a dosis- espues a ob enida con la p o eína pu i icada y un sue o de pe o de al a concen ación de la p o eína de in e és. Pa a ello se p epa a on diluciones se iadas del sue o canino y se compa ó el alo ob enido en el ensayo con el eó ico, calculado a pa i del alo de la mues a sin dilui y el ac o de dilución. Los alo es de concen ación ob enidos pa a cada una de las diluciones no di ie en más del 10 % de los alo es eó icos (da os no mos ados), sin que se obse e des iación de la linealidad en el ango de abajo del ensayo, pa a ninguno de los cua o mé odos de IR desa ollados (Figu as 15 a 18, Linealidad). El lími e de cuan i icación (LoQ) se de e minó median e la dilución de un sue o de pe o de baja concen ación de la PFA co espondien e. Se ealiza on Resul ados diluciones de concen aciones dec ecien es de anali o y se analiza on po quin uplicado en el mismo gel. El lími e de cuan i icación se es ableció pa a el mínimo alo de concen ación que cumplie a con es os dos pa áme os: un CV meno del 10 % y un po cen aje de e o en la cuan i icación in e io al 5 % espec o de su alo eó ico. El lími e de cuan i icación u ilizando el an isue o an i ITIH4 canino especí ico al 2% en el gel, ue de 0,022 mg/mL de ITIH4. Los sue os se aplica on al gel diluidos 1:5, po lo que la mínima can idad de ITIH4 en sue o que puede cuan i ica se en las condiciones analí icas seleccionadas es de 0,11 mg/mL. En las igu as 15, 16, 17 y 18, se ecogen los LoQ de e minados pa a las di e en es PFA. El es udio de la p ecisión de los mé odos de IR se ealizó median e el cálculo de los coe icien es de a iación (CV) in a (n=5) e in e (n=6) ensayo pa a es sue os de pe o con di e en es concen aciones del anali o co espondien e (al a, media y baja). Los esul ados de los ensayos mos a on una baja imp ecisión pa a los mé odos de IR desa ollados, siendo los CV, meno es del 7 % pa a la ITIH4, meno es del 8 % pa a la CRP, meno es del 6 % pa a la Hp y del 5 % pa a la GPA (Figu as 15 a 18, p ecisión). En odos ellos, sal o pa a la mues a de al a concen ación de CRP, el CV in a ensayo ue in e io al 5 %. Resul ados Figu a 15. P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de IR pa a la cuan i icación de la ITIH4 canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se ep esen a el alo el alo de e minado pa a las di e en es diluciones del sue o de pe o en e al alo espe ado eó icamen e ( alo calculado a pa i del alo del sue o sin dilui y el ac o de dilución). La línea neg a ep esen a el ajus e median e mínimos cuad ados de los pun os y la línea oja discon inua la igualdad y=x. Resul ados Figu a 16. P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de IR pa a la cuan i icación de la CRP canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se ep esen a el alo el alo de e minado pa a las di e en es diluciones del sue o de pe o en e al alo espe ado eó icamen e ( alo calculado a pa i del alo del sue o sin dilui y el ac o de dilución). La línea neg a ep esen a el ajus e median e mínimos cuad ados de los pun os y la línea oja discon inua la igualdad y=x. Resul ados Figu a 17.P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de IR pa a la cuan i icación de la Hp canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se ep esen a el alo el alo de e minado pa a las di e en es diluciones del sue o de pe o en e al alo espe ado eó icamen e ( alo calculado a pa i del alo del sue o sin dilui y el ac o de dilución). La línea neg a ep esen a el ajus e median e mínimos cuad ados de los pun os y la línea oja discon inua la igualdad y=x. Resul ados Figu a 18. P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de IR pa a la cuan i icación de la GPA canina. * Linealidad: Linealidad con la dilución, se ep esen a el alo el alo de e minado pa a las di e en es diluciones del sue o de pe o en e al alo espe ado eó icamen e ( alo calculado a pa i del alo del sue o sin dilui y el ac o de dilución). La línea neg a ep esen a el ajus e median e mínimos cuad ados de los pun os y la línea oja discon inua la igualdad y=x. Resul ados coe icien e de co elación (R) ue supe io a 0,99, siendo la ecuación que elaciona ambos mé odos la siguien e: HpELISA (mg/mL) = 0,9896 x HpIR (mg/mL) + 0,0369 El in e alo de con ianza de la pendien e, calculado al 95%, es u o comp endido en e 0,963 y 1,011 y el in e alo de con ianza de la o denada en el o igen en e -0,062 y 0,136 mg/mL. Po an o la pendien e no di ie e de uno, y la o denada en el o igen no di ie e de ce o, po lo que exis e equi alencia analí ica en e ambos mé odos. Figu a 22. Compa a i a de los alo es ob enidos median e ELISA e IR pa a Hp de pe o. La línea neg a ep esen a el ajus e po mínimos cuad ados de los alo es ep esen ados. La línea oja discon inua ep esen a y=x. 4.2.4 Mé odo u bidimé ico pa a la cuan i icación de CRP canina. Adap ación pa a su uso en placa mic o i e . Los an isue os an i CRP canina ob enidos al y como se han desc i o en es a esis, ue on u ilizados pa a el desa ollo de un mé odo inmuno u bidimé ico pa a Resul ados la de e minación de CRP canina (Piñei o e al., 2018). Es e abajo se engloba den o del p oyec o IPT-010000-2010-001. La alidación del mé odo u bidimé ico ue ealizada en el Se ei de Bioquímica Clinica Ve e ina ia, de la Uni e sidad Au ónoma de Ba celona u ilizando un analizado Olympus AU400 y se desc ibe en Piñei o e al., 2018. A modo in o ma i o se desc iben a con inuación en la igu a 23 los p incipales pa áme os e aluados y los esul ados ob enidos. Figu a 23. Ca ac e ís icas analí icas del mé odo inmuno u bidimé ico pa a la cuan i icación de CRP canina. Da os p oceden es de Piñei o e al., 2018. Debido a la necesidad del uso de un analizado au omá ico pa a la medida de CRP po es e mé odo y a que no es común que los labo a o ios que no sean clínicos posean es e ipo de apa a os, el ensayo inmuno u bidimé ico se adecuó y se alidó pa a ealiza se en mic oplacas y medi se con ayuda de un lec o de Resul ados placas mic o i e . Además median e es a adap ación de la me odología ue posible cuan i ica la CRP en aquellas mues as de las que no se disponía de un olumen su icien e pa a ealiza la cuan i icación median e un analizado au omá ico. El olumen de los eac i os u ilizados pa a al análisis de las mues as en mic oplaca ue el mismo que se desc ibe pa a la cuan i icación de CRP canina en analizado au omá ico (Tabla 10). Sin emba go pa a adap a el p ocedimien o a la lec u a en placa mic o i e se ealizó una lec u a a pun o inal, u ilizando un único eac i o ob enido median e la mezcla de las can idades co espondien es de R1 (bu e ) y R2 ( eac i o lá ex), al que se es ó un blanco de eac i o. Las mues as (3 µL) se aplica on di ec amen e en la placa mic o i e , se añadió el eac i o, se mezcló y se incubó du an e 10 minu os, as los cuales se ealizó una medida a 595 nm. Pa a la op imización del iempo de lec u a se u o en cuen a la ciné ica de la eacción. Se u ilizó un iempo en el que la eacción alcanza el equilib io, de modo que las di e encias de iempo de eacción en e las p ime as y úl imas mues as aplicadas a la placa mic o i e ue a i ele an e. Tabla 10. Compa a i a de las condiciones pa a el análisis de CRP canina del nue o ensayo inmuno u bidimé ico en un analizado Olympus AU 400 y adap ado a mic oplaca.(* empe a u a ambien e) Analizado Olympus AU400 Adap ado a mic oplaca Vol. de mues a (µL) 3 3 Vol. de ampón de eacción, R1 (µL) 230 230 Vol. de inmunopa ículas de la ex, R2 (µL) 70 70 Longi ud de onda (nm) 600 595 Tempe a u a de la eacción (ºC) 37 20-25* P ime a lec u a (s) 216 600 Segunda lec u a (s) 450 --- Tiempo en que se añaden las inmunopa ículas (s) 180 Mezcla R1+R2 desde inicio Mé odo de calib ación Poligonal Polinomio o den 2 Resul ados El mé odo se alidó ealizando un es udio del lími e de cuan i icación, la p ecisión, linealidad, y compa a i a con el mé odo alidado pa a Olympus AU400. EL LoQ del mé odo adap ado a placa mic o i e , se ha de e minado median e el cálculo del e o o al, a pa i del e o ob enido (bias) al medi una mues a de concen ación baja y su coe icien e de a iación (4 epe iciones en 4 ensayos), median e la ó mula: %Te = %bias + 2CV. Como c i e io se ha seleccionado aquella concen ación cuyo Te no supe e el 30 %. El LoQ del ensayo ue de 3,3 mg/L de CRP. La p ecisión se e aluó median e el cálculo del CV in a e in e ensayo, pa a dos mues as de sue o de di e en e concen ación. Tal y como se mues a en la abla 11, el CV ue in e io al 6% Tabla 11. Es udio de la p ecisión pa a la de e minación de CRP median e inmuno u bidime ía en placa mic o i e . Se e ec ua on cálculos de los CV in a-ensayo (n=15) e in e -ensayo (n=15) pa a dos mues as de sue o de pe o son di e en es concen aciones de CRP (al a y baja). Conc (mg/mL) CV (%) in a-ensayo CV (%) in e -ensayo 21 5,6 5,4 90 3,5 4,6 La linealidad se ha e aluado a pa i de diluciones, de una mues a de sue o de pe o de concen ación conocida (113 mg/L). En la igu a 24 se mues a la ep esen ación de los alo es ob enidos en el ensayo pa a cada una de las diluciones p epa adas, compa ando con los alo es eó icos calculados a pa i de la concen ación de la mues a sin dilui y del ac o de dilución. Como puede e se, los alo es ob enidos pa a cada una de las diluciones se ajus an a los alo es eó icos espe ados, sin que se obse e des iación de la linealidad en el ango analí ico. Resul ados Figu a 24. Es udio de la linealidad median e dilución de un sue o de pe o de concen ación conocida. La línea neg a co esponde al ajus e po mínimos cuad ados de los alo es ob enidos en el ensayo, ep esen ados en e a los alo es espe ados ( alo calculado a pa i del alo de la mues a sin dilui y el ac o de dilución). La línea oja ep esen a y=x. En la igu a 25, se mues a la compa ación de los alo es ob enidos pa a las mues as de sue o de pe o analizadas median e el mé odo inmuno u bidimé ico en placa y con un analizado au omá ico Olympus AU400. Se analiza on 26 mues as de sue os po duplicado, po ambos mé odos. El análisis median e eg esión lineal mos ó una ele ada co elación en e ambos mé odos. El coe icien e de co elación (R) ue supe io a 0,98, siendo la ecuación que elaciona ambos mé odos la siguien e: CRPplaca (mg/L) = 0,956 x CRPOlympus (mg/L) + 3,499 El in e alo de con ianza de la pendien e, calculado al 95%, es u o comp endido en e 0,882 y 1,025 y el in e alo de con ianza de la o denada en el o igen en e -0,049 y 7,048 mg/L. Po an o la pendien e no di ie e de uno, y la Resul ados o denada en el o igen no di ie e de ce o, po lo que exis e equi alencia analí ica en e ambos mé odos. Figu a 25. Compa a i a de los alo es ob enidos median e el mé odo inmuno u bidimé ico pa a CRP canina adap ado a placa y con el analizado Olympus AU400 pa a CRP de pe o. La línea neg a ep esen a el ajus e po mínimos cuad ados de los alo es ep esen ados. La línea oja discon inua ep esen a y=x. 4.3 Ca ac e ización de ITIH4 como PFA en el pe o. Modelos expe imen ales 4.3.1 Es udio en mues as de pe os some idos a ci ugía mayo . Pa a de e mina si la ITIH4 se compo a como PFA en el pe o, se han medido los ni eles de es a p o eína, jun o con el es o de PFAs pa a las que se han desa ollado inmunoensayos en es a esis (CRP, Hp y GPA), en mues as de sue o de animales some idos a ci ugía mayo . La medida de dichas p o eínas se ealizó median e IR. En el es udio se e alua on 10 hemb as suje as a mas ec omía (g upo Mas , igu a 26), y 9 a o a iohis e ec omías (g upo OVH, Resul ados igu a 26). Se ob u ie on mues as de sang e inmedia amen e an es de la ci ugía (con ol) y anscu idas 24 ho as de la misma. Figu a 26. E olución de las PFAs caninas en pe as as ci ugía mayo . Los da os es án exp esados como media ± SD. a) CRP, en mg/L; b) ITIH4, en mg/mL; c) Hp, en mg/mL y d) GPA, en mg/mL. Las mues as Con ol es án omadas an es de la ci ugía y las mues as Pos , 24 h después de la ci ugía. O a iohis e ec omia (OVH, n = 9) y Mas ec omía (Mas , n = 10).* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Los alo es de CRP en las mues as de sue os de los animales some idos a ci ugía mos a on un aumen o signi ica i o espec o del alo que p esen aban Resul ados es os mismos animales an es de la ci ugía (Figu a 26.a). Es e aumen o medio es más ele ado en el g upo de pe as a las que se p ac icó una mas ec omía en compa ación con el g upo OVH. La concen ación de CRP en los animales suje os a mas ec omía expe imen ó un inc emen o supe io a 32 eces el alo p e- ci ugía, alcanzando un alo p omedio de 190 ± 102 mg/L de CRP (media ± SD). Los animales suje os a OVH mos a on un inc emen o supe io a 20 eces el alo inicial (con ol p e-ci ugía). Los dos g upos con ol p esen a on alo es de CRP po debajo de 10 mg/L. Las mues as de sue o de pe o ob enidas 24 ho as después de ambas ci ugías (OVH y Mas ), p esen a on aumen os signi ica i os en el alo de ITIH4 espec o del con ol, (Figu a 26.b). En ambos casos el inc emen o ue supe io a 3,5 eces, conc e amen e 3,7 eces pa a OVH y 4 eces pa a Mas , no obse ándose di e encias signi ica i as en e las dos ci ugías. La concen ación de ITIH4 en los sue os de pe o pos ci ugía alcanzó alo es p omedio de 0,86 ± 0,39 mg/mL as OVH, y 0,82 ± 0,32 mg/mL as mas ec omía. An es de la ci ugía el g upo de animales que iba a se some ido a OVH mos ó un alo p omedio de 0,23 ± 0,12 mg/mL de ITIH4, simila al del g upo de animales suje os a mas ec omía (0,21 ± 0,13 mg/mL de ITIH4). Los ni eles medios de Hp ambién aumen a on as ambas ci ugías (Figu a 26,c). El g upo suje o a mas ec omía mos ó un inc emen o medio de ap oximadamen e 3 eces el alo inicial alcanzándose alo es de 3,51 ± 1,71 mg/mL de Hp (media ± SD) 24 ho as después de la mas ec omía, en e a un alo inicial de 1,10 ± 0,75 mg/mL de Hp. Los animales suje os a OVH mos a on un inc emen o medio de 1,8 eces el alo inicial de Hp, aumen ando desde un alo p omedio de 1,23 ± 0,72 mg/mL has a 2,25 ± 1,14 mg/mL. Los sue os de los animales p esen a on di e encias signi ica i as en los alo es de α1-glicop o eína ácida (GPA) an es y 24 ho as as ambas ci ugías. Los animales some idos a OVH, expe imen a on un aumen o desde 0,20 ± 0,19 mg/mL has a 0,34 ± 0,20 mg/mL de GPA, espec i amen e. 24 ho as as la mas ec omía el alo de GPA (media ± SD) se io aumen ado de 0,20 ± 0,15 Resul ados mg/mL a 0,82 ± 0,32 mg/mL de GPA, mos ando un inc emen o signi ica i o de 4 eces espec o del con ol y supe io al expe imen ado po los animales some idos a OVH. Tabla 12. Co elación en e las concen aciones de las di e en es PFA de e minadas en el es udio. Se mues an los alo es del coe icien e de co elación Rho de Spea man en e las PFAs es udiadas (ITIH4, CRP, Hp y GPA) en el o al de la población de animales del es udio (n=19). CRP Hp GPA Rho p Rho p Rho p ITIH4 0,77 <0,001 0,58 <0,001 0,57 <0,001 CRP 0,52 0,0016 0,57 <0,001 Hp 0,62 <0,001 p signi icación de la co elación de Spea man El cálculo de los coe icien es de co elación de Spea man, mos ó una co elación signi ica i a en e ITIH4 y el es o de las PFAs (CRP, Hp y GPA; Tabla 8), siendo la co elación en e CRP e ITIH4 la más ele ada (Rho= 0,77). Las co elaciones en e ITIH4 y Hp o GPA (Rho=0,58 y Rho=0,57 espec i amen e), ue on equi alen es a la mos ada en e CRP y Hp (Rho=0,52) o Hp y GPA (Rho=0,57). 4.3.2 Ca ac e ización de los ni eles de ITIH4 en el sue o de pe as a ec adas po piome a. Pa a la de e minación de ITIH4 como en piome a, se es udió es a p o eína en mues as de sue o p oceden es de 11 pe as a ec adas po piome a ce ada Resul ados (G upo piome a) y se compa a on sus alo es con los encon ados en 14 pe as sanas (G upo con ol). La espues a de ITIH4 se compa ó con la espues a de CRP y Hp. Los animales a ec ados po piome a p esen a on una ele ación signi ica i a en los ni eles de: empe a u a co po al, ecuen o o al de glóbulos blancos, hemoglobina, hema oc i o, alanina amino ans e asa y ni óg eno u éico en sang e, espec o al g upo con ol (Tabla 7). Tabla 13. Pa áme os clínicos en g upo con ol y en el g upo piome a. Con ol Piome a media ± SD ango media ± SD ango p alo TC (ºC) 37,6 ± 0,3 37,1-38,2 38,6 ± 0,6 37,5-39,4 0,0010 WBC (x109/L) 10,7 ± 1,9 7,7-14,2 28,7 ± 6,3 21,9-39,2 <0,0001 Neu ó ilos (%) 1,1 ± 0,7 0-2 4,5 ± 1,5 4-6 <0,0001 HGB (g/dL) 15,9 ± 1,5 13,8-18,7 21,3 ± 2,0 18,9-25,4 <0,0001 H (%) 43,2 ±2,1 39,2-48,1 56,7 ± 1,5 54,1-58,5 <0,0001 ALT (U/L) 35,6 ± 5,6 25-45 57,0 ± 7,4 50-72 <0,0001 Bili ubina (mg/dL) 0,14 ± 0,04 0,1-0,2 1,54 ± 0,92 0,7-3,1 <0,0001 C ea inina (mg/dL) 0,9 ± 0,2 0,54-1,2 2,0 ± 0,4 1,7-3,1 <0,0001 BUN (mg/dL) 29,6 ± 6,5 21-42 62,5 ± 19,7 44-102 <0,0001 TC: empe a u a co po al, WBC: ecuen o o al de glóbulos blancos, HGB: hemoglobina, H : hema oc i o, ALT: Alanina amino ans e asa, BUN: Ni ógeno u eico en sang e (del inglés, Blood u ea ni ogen) Resul ados E olución de las PFAs en animales in ec ados con L. in an um Figu a 30. E olución de la concen ación de las PFA en animales in ec ados con L. in an um. Se ep esen a la media ± SD pa a: a) CRP, b) ITIH4 y c) Hp, los as e iscos ep esen an el ni el de signi icación de cada uno de los iempos en e al iempo inicial Resul ados p e-in ección (T0) *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Se ep esen a la e olución indi idual de cada animal (1 a 10) pa a: d) CRP, e) ITIH4 y ) Hp. En la Figu a 30 a y d, se mues a la e olución de la concen ación de CRP du an e el pe iodo expe imen al. T as la in ección expe imen al, a las 24 ho as se p odujo un aumen o ele ado y signi ica i o de la CRP, que alcanzó un alo medio de 82 ± 48 mg/L (Figu a 30 a), sin emba go la magni ud del aumen o no ue igual en odos los animales. T as alcanza un pico máximo a las 24 ho as, los alo es de CRP disminuye on de o ma p og esi a en los siguien es pun os expe imen ales, pa a ol e al es ado inicial a pa i de 1 semana. A pa i de los dos meses, los ni eles de CRP aumen a on paula inamen e, obse ándose un aumen o signi ica i o a pa i de los 8 meses, y man eniéndose la concen ación de CRP ele ada has a el inal del es udio. Los alo es de ITIH4 comienzan a ele a se de mane a mode ada a pa i de la in ección (Figu a 30 b). El pico máximo se alcanzó a las 48 ho as (aumen o medio de 2 eces el alo inicial), man eniéndose los ni eles ele ados anscu ida 1 semana. Pasado ese iempo la concen ación de ITIH4 descendió de mane a g adual has a alcanza de o ma gene al los ni eles iniciales a los 2-3 meses. La concen ación media de ITIH4 comenzó a ele a se de nue o a pa i del sex o mes, aunque el inc emen o no se hizo signi ica i o has a el décimo mes, cuando se alcanzó un alo medio de 0,39 ± 0,21 mg/mL de ITIH4, que ep esen a un aumen o de 2,7 eces el alo p e-in ección. Du an e los días pos e io es a la in ección con L. in an um los alo es de Hp en el sue o expe imen a on un aumen o mode ado (Figu a 30 c). A las 48 ho as se obse a un aumen o medio de 2 eces el alo p e-in ección, que se man iene anscu ida 1 semana. Es e inc emen o es compa able con el expe imen ado po la ITIH4. Al igual que la ITIH4 la concen ación de Hp ecupe a los alo es iniciales a los 2 meses pos -in ección. A los es meses as la in ección se obse a un aumen o de Hp mode ado aunque signi ica i o (1,5 eces espec o del iempo inicial), seguido de un aumen o de 1,8 eces en el iempo inal del es udio (10 meses). Es e aumen o a los es meses no se ha obse ado an e io men e con la CRP ni con la ITIH4. De man ea indi idual alo es indi iduales de CRP, Resul ados ITIH4 y Hp, ob enidos pa a cada animal, di ie en conside ablemen e de unos a o os a lo la go de odo el es udio alcanzando las máximas concen aciones a di e en es iempos, independien emen e del animal y de la p o eína (Fig 30 d, e, ). Co elación de sin oma ología, se ología y PFAs Tabla 16. Cálculo del alo del coe icien e de co elación Rho de Spea man, en e las PFAs es udiadas (ITIH4, CRP, Hp), las i ulaciones de an icue pos ob enidas median e inmuno luo escencia indi ec a (IFI) y ELISA y la pun uación clínica asignada (PC) Log IFI ELISA PC Rho p Rho p Rho p CRP 0,52 <0,0001 0,54 <0,0001 0,45 <0,0001 ITIH4 0,56 <0,0001 0,58 <0,0001 0,41 <0,0001 Hp 0,36 0,003 0,34 0,007 0,25 0,045 PC 0,69 <0,001 0,68 <0,001 p signi icación de co elación de Spea man Los alo es del coe icien e de co elación Rho de Spea man p esen ados en la abla 16, mues an una co elación mode ada en e las PFAs y las écnicas de diagnós ico se ológico, exp esadas como log IFI y Rz del ELISA. CRP e ITIH4 p esen a on alo es de co elación simila es an o pa a IFI, como pa a ELISA y pa a la PC. En cambio, la co elación encon ada pa a la Hp con cada una de las écnicas se ológicas y con la pun uación clínica, ue meno . Las co elaciones en e la pun uación clínica y las écnicas de diagnós ico se ológico (IFI y ELISA) son más al as que las que se encon a on en e la pun uación clínica y las PFAs, indicando una elación gene al en e la sin oma ología y la p esencia de an icue pos en e a Leishmania. Resul ados E aluación indi idual de cada uno de los animales A con inuación, en las g á icas siguien es, se ep esen an los alo es de cada una de las PFAs (CRP, ITIH4 y Hp), jun o con los alo es de la pun uación clínica ob enida, y el esul ado ob enido po las écnicas se ológicas ELISA e IFI, de mane a indi idual pa a cada animal in oluc ado en el es udio. Si de acue do con el análisis se ológico, el animal dio esul ado posi i o en e a la in ección po Leishmania in an um el colo de la ba a de pun uación clínica cambia de mo ado a na anja. Aunque en las g á icas ep esen adas hay animales que a lo la go del es udio se mues an nega i os en e a la in ección con Leishmania según el c i e io adop ado, hay que des aca que al inal del es udio, un análisis de qPCR con i mó que odos los animales e an posi i os a iempo inal. Resul ados Figu a 31. Rep esen ación de la e olución de los alo es de CRP y la pun uación clínica de cada uno de los animales. Las ba as ep esen an el alo de pun uación clínica (PC) asignada. El colo de las ba as indica el esul ado de los análisis se ológicos en e a Leishmania in an um; na anja posi i o, mo ado: nega i o. Flecha na anja en el Resul ados animal 9, ep esen a que el animal es posi i o a Leishmania en el análisis se ológico, pe o su PC es 0 po eso la ausencia de ba a. En la igu a 31, puede obse a se que el iempo de apa ición de los sín omas clínicos en los animales (PC ≥ 2), así como su se e idad, ue muy a iable, aunque a pa i de los 6 meses la mayo ía de los animales ue on posi i os en e a la in ección con L. in an um (ba a na anja). De acue do a los alo es de CRP, puede e se que no odos los animales p esen a on la misma e olución, es deci , no odos los animales mues an el pico máximo en los mismos iempos, sino que dependiendo del animal el pico máximo se obse a en e los 6- 10 meses PI, e incluso algunos animales no p esen an es e aumen o al inal del pe iodo expe imen al. El aumen o de los alo es de CRP no pa ece an icipa se a la sin oma ología clínica, pe o sí se pueden asocia alo es ele ados de CRP a animales con un peo p onós ico: pun uación clínica al a y animales posi i os en e a Leishmania. Los animales 1, 6, 7, 8 y 9 mos a on alo es de CRP po encima de 11 mg/L, alcanzando algunos de ellos alo es de CRP has a 60 mg/L, an es de la apa ición de sin oma ología clínica (PC < 2) y ambién an es de que el animal ue a posi i o a Leishmania según el análisis se ológico. Es os aumen os mode ados de CRP se p oduje on al p incipio de la in ección en e los 3 y los 6 p ime os meses según el animal. Po el con a io, los animales 3 y 4, mos a on alo es de CRP po debajo de 11 mg/L a lo la go de odo el es udio, independien emen e de la sin oma ología y de la posi i idad an e la in ección. Solo al inal del es udio, a los 10 meses as la in ección, mos a on una ele ación en la concen ación de CRP alcanzando alo es de 28 mg/L y 45 mg/L pa a el animal 3 y el animal 4, espec i amen e. Los animales 2, 5, 9 y 10 son los que p esen an mayo es alo es de CRP alcanzando picos máximos po encima de 80 mg/L. En es os animales no se e que los alo es ele ados de CRP se an icipen a la sin oma ología clínica o al í ulo ele ado de an icue pos. En algunos casos el aumen o de CRP se p oduce al Resul ados mismo iempo que de ec an los sín omas clínicos y an icue pos en e a Leishmania, como es el caso de los animales 5 y 9. Resul ados Figu a 32. Rep esen ación de la e olución de los alo es de ITIH4 y la pun uación clínica de cada uno de los animales. Las ba as ep esen an la pun uación clínica (PC) asignada. El colo de las ba as indica el esul ado de los análisis se ológicos en e a Laishmania in an um; na anja: posi i o, mo ado: nega i o. La lecha na anja en el animal 9, ep esen a que el animal es posi i o a Leishmnia en el análisis se ológico, pe o su PC es 0. En la igu a 32 puede e se la e olución de la concen ación de ITIH4 a lo la go del es udio, en cada uno de los animales que o man pa e del g upo expe imen al. Al igual que sucede con la CRP no odos los animales alcanza on alo es máximos de ITIH4 en el mismo iempo as la in ección con L. in an um (10 meses pos -in ección). Los animales 2 y 5 son los que mayo alo de concen ación de ITIH4 mos a on a los seis meses as la in ección. El máximo inc emen o de ITIH4 lo expe imen ó el animal núme o 2 aumen ando más de 6 eces su alo p e- in ección mien as que el animal 5 aumen ó más de 2 eces su alo inicial. Es en el úl imo mes, donde un 60 % de los animales (animal 2, 3, 5, 8, 9 y 10) p esen a on alo es de ITIH4 iguales o supe io es a 0,42 mg/mL, alo máximo de no malidad es ablecido en beagles, llegando a alcanza alo es indi iduales p óximos a 0,7 mg/mL de ITIH4. Los animales 2, 5, 8 y 10 son aquellos que además de con i ma se la in ección median e se ología, mos a on los alo es más al os de pun uación clínica, po encima de 3, al inal del es udio. La concen ación de ITIH4 ob enida pa a el es o de los animales ue meno , independien emen e de la sin oma ología clínica y del esul ado se ológico obse ados. Resul ados Figu a 33. Rep esen ación de la e olución de los alo es de Hp y la pun uación clínica de cada uno de los animales. Las ba as ep esen an la pun uación clínica (PC) asignada. El colo de las ba as indica el esul ado de los análisis se ológicos en e a Leishmania: na anja; posi i o, mo ado; nega i o. La lecha na anja en el animal 9, Resul ados ep esen a que el animal es posi i o en e a Leishmania en el análisis se ológico, pe o su PC es 0. Como se ha mencionado an e io men e pa a los alo es de CRP e ITIH4, la e olución de los alo es de concen ación de Hp es di e en e pa a cada animal. A los 6 meses, se p odujo un aumen o muy ele ado del ni el de Hp en el sue o de dos animales (animal 2 y 5), es os alo es supe a on los 5 mg/mL de Hp. Es os animales coinciden con los que p esen a on alo es de ITIH4 po encima de 0,52 mg/mL a los 6 meses as la in ección (Figu a 36). Es ableciendo el pun o de co e pa a Hp en 2,3 mg/mL, alo po debajo del cual se conside a que los animales se encuen an den o de los alo es de e e encia asignados pa a animales sanos pa a es a p o eína (apa ado 4.4), la Hp solo se an icipa a los sín omas clínicos y a la p esencia de la in ección en los animales 2, 3 y 8. El es o de animales (1, 4, 6, 7, 9 y 10) p esen ó alo es de Hp in e io es o iguales a 2,3 mg/mL y en los iempos en los que se supe ó dicho alo , ue independien emen e de la pun uación clínica y de si esul ado se ológico indicaba esul ados posi i os o no. 4.4 Asignación de los alo es de e e encia pa a las PFAs en animales sanos Pa a la asignación de alo es de e e encia pa a las PFA en animales sanos, se u iliza on 165 animales, de los cuales 72 pe enecían a la aza Beagle de edades comp endidas en e 6 y 12 meses, siendo 37 de ellos machos y 35 hemb as. El es o de animales, 98, pe enecían a o as azas y ambién algunos de ellos e an mes izos, con edades comp endidas en e los 5 meses y los 10 años. De es os animales 23 e an machos, 49 e an hemb as y del es o no se 9 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Cambios neu oendoc inos, me abólicos, hema opoyé icos y hepá icos p oducidos en el o ganismo du an e la espues a de ase aguda. ....................................................... 18 Tabla 2. Clasi icación de las PFAs según la especie animal ............................................. 27 Tabla 3. Ejemplos de pa ologías caninas en las que se han e aluado las PFAs. ............. 39 Tabla 4. Mé odos analí icos come ciales alidados en la li e a u a, pa a la de e minación de las p incipales PFAs en pe o. ...................................................................................... 44 Tabla 5. Condiciones especí icas de la cu a de calib ado, dilución de mues a y dilución de conjugado pa a cada uno de los ELISAS desa ollados............................................... 84 Tabla 6. Secuencia de los cebado es (D) di ec o y (R) e e so diseñada pa a cada gen, amaño del p oduc o ampli icado (pb) y empe a u a de anillamien o (Tm)....................... 92 Tabla 7. Desc ipción de los signos clínicos es ablecidos en la explo ación clínica pa a calcula la pun uación clínica de cada pacien e. ................................................................ 94 Tabla 8. Es udio de la p ecisión del ELISA de la ITIH4 canina........................................ 119 Tabla 9. Es udio de la p ecisión del ELISA de la Hp canina.. .......................................... 122 Tabla 10. Compa a i a de las condiciones pa a el análisis de CRP canina del nue o ensayo inmuno u bidimé ico en un analizado Olympus AU 400 y adap ado a mic oplaca…………………………………………………………………………………...…...126 Tabla 11. Es udio de la p ecisión pa a la de e minación de CRP median e inmuno u bidime ía en placa mic o i e .. ......................................................................... 127 Tabla 12. Co elación en e las concen aciones de las di e en es PFA de e minadas en el es udio.............................................................................................................................. 132 Tabla 13. Pa áme os clínicos en g upo con ol y en el g upo piome a.......................... 133 Tabla 14. Cálculo del alo del coe icien e de co elación Rho de Spea man, en e las PFAs es udiadas (ITIH4, CRP, y Hp) en el o al de la población de animales del es udio (n=25)............................................................................................................................... 135 Tabla 15. Pun uación clínica (PC) asignada pa a cada animal in ec ado, clasi icación según c i e ios sin oma ológicos y alo es de CRP (mg/L), ITIH4 (mg/mL), Hp (mg/mL) y GPA (mg/mL) cuan i icados. ............................................................................................ 138 Tabla 16. Cálculo del alo del coe icien e de co elación Rho de Spea man, en e las PFAs es udiadas (ITIH4, CRP, Hp), las i ulaciones de an icue pos ob enidas median e inmuno luo escencia indi ec a (IFI) y ELISA y la pun uación clínica asignada (PC)........ 142 Tabla 17. Valo es ob enidos en el cálculo del in e alo de e e encia pa a CRP, ITIH4, Hp y GPA, en animales clínicamen e sanos.......................................................................... 151 Tabla 18. Valo es p omedio y angos ob enidos pa a ITIH4 y de GPA en Beagles y el es o de azas............................................................................................................................ 152 Tabla 19. Valo es p omedio y angos ob enidos de ITIH4 en machos y hemb as en la aza Beagle. ............................................................................................................................. 153 Tabla 20. Ca ac e ís icas de los cen os de p o ección ................................................... 169 Tabla 21. Compa ación en e las secuencias de aminoácidos de ITIH4 en ce do, humano, aca y pe o............................................................................¡E o !Ma cado no de inido. 10 ÍNDICE DE FIGURAS Figu a 1. Esquema de la espues a de ase aguda............................................................ 19 Figu a 2. Ciclo de ida de L. in an um y o mas de ansmisión sin ec o . ....................... 50 Figu a 3. Implicación de los ejes hipo alámico-pi ui a io-ad enoco ico ópico (HPA) y simpá ico-ad eno-medula (SAM) en la espues a isiológica al es és, a pa i de la ac i ación del sis ema ne ioso cen al (SNC) an e una señal de pelig o o ala ma.. ........ 55 Figu a 1. Análisis po SDS-PAGE (10 %) de las acciones ob enidas du an e la pu i icación de la ITIH4 canina......................................................................................... 101 Figu a 2. Análisis po inmunoelec o o esis de los an isue os an i ITIH4......................... 103 Figu a 3. Análisis po SDS PAGE 12 % de la CRP canina.............................................. 104 Figu a 4. Ca ac e ización del an isue o an i CRP de pe o desa ollado......................... 105 Figu a 5. Análisis de las acciones de sue o de pe o p ecipi adas con sul a o amónico sa u ado (ssa).................................................................................................................. 106 Figu a 6. C oma og a ía de exclusión molecula (Sephac yl S-200)................................ 107 Figu a 7. Análisis median e SDS-PAGE (12 %) de las acciones ob enidas du an e las di e en es e apas del p oceso de pu i icación de Hp de pe o......................................... 108 Figu a 8. Análisis po inmunoelec o o esis (a) y po Wes e n blo (b) del an isue o an i Hp de pe o desa ollado ....................................................................................................... 109 Figu a 9. SDS-PAGE de las acciones ob enidas en la pu i icación de GPA.. ............... 110 Figu a 10. Análisis po inmunoelec o o esis del an isue o an i GPA canino................... 111 Figu a 11. Cu a dosis- espues a del calib ado pa a cuan i icación de ITIH4 canina po IR...................................................................................................................................... 112 Figu a 12. P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de inmunodi usión adial pa a la cuan i icación de la ITIH4 canina median e IR............. 114 Figu a 13. P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de inmunodi usión adial pa a la cuan i icación de la CRP canina median e IR. ............. 115 Figu a 14.P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de inmunodi usión adial pa a la cuan i icación de la Hp canina median e IR................. 116 Figu a 15. P incipales pa áme os de e minados en los es udios de alidación del mé odo de inmunodi usión adial pa a la cuan i icación de la GPA canina median e IR.............. 117 Figu a 16. Es udio de la linealidad median e dilución de un sue o de pe o de concen ación conocida.................................................................................................... 120 Figu a 17. Compa a i a de los alo es ob enidos median e ELISA e inmunodi usión adial (IR).. .................................................................................................................................121 Figu a 18. Es udio de la linealidad en ELISA de Hp median e dilución de un sue o de pe o de concen ación conocida............................................................................................... 123 Figu a 19. Compa a i a de los alo es ob enidos median e ELISA e IR pa a Hp de pe o. ......................................................................................................................................... 124 Figu a 20. Ca ac e ís icas analí icas del mé odo inmuno u bidimé ico pa a la cuan i icación de CRP canina.. ........................................................................................ 125 Figu a 21. Es udio de la linealidad median e dilución de un sue o de pe o de concen ación conocida.................................................................................................... 128 Figu a 22. Compa a i a de los alo es ob enidos median e el mé odo inmuno u bidimé ico pa a CRP canina adap ado a placa y con el analizado Olympus AU400 pa a CRP de pe o................................................................................................................................. 129 Figu a 24. E olución de las PFAs caninas en pe as as ci ugía mayo ......................... 130 Figu a 25. Compa a i a de los ni eles de las PFAs caninas en pe os sanos y pe os a ec ados po piome a..................................................................................................... 134 Figu a 26. Rep esen ación de los alo es de las PFAs en mues as de sue o, pa a el g upo de animales no in ec ado y pa a el g upo de animales in ec ado.. ........................ 137 Figu a 27. Rep esen ación compa a i a de los ni eles de exp esión de mRNA en mues as hepá icas.. ........................................................................................................................ 138 Figu a 28. E olución de la concen ación de las PFA en animales in ec ados con L. in an um............................................................................................................................ 140 Figu a 29. Rep esen ación de la e olución de los alo es de CRP y la pun uación clínica de cada uno de los animales............................................................................................ 144 Figu a 30. Rep esen ación de la e olución de los alo es de ITIH4 y la pun uación clínica de cada uno de los animales............................................................................................ 147 Figu a 31. Rep esen ación de la e olución de los alo es de Hp y la pun uación clínica de cada uno de los animales................................................................................................. 148 Figu a 32. Dis ibución de los alo es de PFAs en sue os de pe os sanos.................... 150 Figu a 33. Compa a i a de los alo es de PFAs en unción de la aza. .......................... 152 Figu a 34. Compa a i a de los alo es de PFA en e machos y hemb as en la población de Beagles. ........................................................................................................................... 153 Figu a 35. Compa a i a de los alo es de PFA en e machos y hemb as en el g upo de animales que engloba a ias azas.................................................................................. 154 Figu a 36. Valo es de PFA en pe os ag upados según la edad: cacho os, adul os jó enes y adul os.............................................................................................................. 155 Figu a 37. Dis ibución de los alo es de CRP en los animales en el momen o de la llegada al cen o............................................................................................................... 156 Figu a 38. Dis ibución de los alo es de ITIH4 en los animales en el momen o de la llegada al cen o............................................................................................................... 158 Figu a 39. Dis ibución de los alo es de Hp en los animales en el momen o de la llegada al cen o............................................................................................................................ 159 Figu a 40. E olución de los ni eles de CRP du an e la pe manencia de los animales en los cen os de p o ección....................................................................................................... 160 Figu a 41. Compa a i a de la concen ación de CRP (media ± SD) en e los dis in os cen os de p o ección, pa a cada iempo de oma de mues a. ....................................... 162 Figu a 42. E olución de los ni eles de ITIH4 du an e la pe manencia de los animales en los cen os de p o ección. ................................................................................................ 163 Figu a 43. Compa a i a de la concen ación de ITIH4 (media ± SD) en e los dis in os cen os de p o ección, pa a cada iempo de oma de mues a. ....................................... 165 Figu a 44. E olución de los ni eles de Hp du an e la pe manencia de los animales en los cen os de p o ección....................................................................................................... 166 Figu a 45. Compa a i a de la concen ación de Hp (media ± SD) en e los dis in os cen os de p o ección, pa a cada iempo de oma de mues a..................................................... 168 Figu a 46. Compa a i a de los alo es de CRP en los animales en egados y ecogidos en los cen os de p o ección.. ............................................................................................... 170 Figu a 47. Valo es de CRP en los animales ag upados en unción de su es ado nu icional: Muy delgado, delgado, no mal y obeso-sob epeso. ........................................................ 172 Figu a 48. Valo es de CRP en los animales ag upados en unción de su compo amien o: apá ico, equilib ado, ne ioso y ag esi o.. ....................................................................... 174 Figu a 49. Valo p omedio de CRP pa a los animales alojados en cada uno de los cen os pa icipan es en el es udio y ca ac e ís icas de cada cen o............................................ 175 Figu a 50. Valo es de CRP en unción de la ecuencia del paseo en oda la población y en animales sin sin oma ología clínica.................................................................................. 176