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ESTUDIOS ANALÍTICOS PARA EVALUAR LA INTERACCIÓN ENVASE-ALIMENTO ANALYTICAL STUDIES TO EVALUATE THE INTERACTION BETWEEN PACKAGING AND FOOD Autora: LUCÍA COELLO ADIEGO Directoras: MARÍA CELIA DOMEÑO RECALDE MARGARITA PILAR AZNAR RAMOS Facultad de Veterinaria 2019/2020 Trabajo Fin de Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos 1 Índice 1. RESUMEN. ................................................................................................................................2 ABSTRACT. ................................................................................................................................2 2. INTRODUCCIÓN. .......................................................................................................................3 2.1. LOS ACEITES MINERALES. ..................................................................................................3 2.2. FUENTES DE CONTAMINACIÓN. ........................................................................................5 2.3. MARCADORES DE LOS ACEITES MINERALES. .....................................................................6 2.4. TINTAS. ..............................................................................................................................7 2.5. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ACEITES MINERALES. ...............................................................9 3. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS. .................................................................................................10 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL. ............................................................................................11 4.1. REACTIVOS..................................................................................................................11 4.2. INSTRUMENTACIÓN. ..................................................................................................12 4.3. OPTIMIZACIÓN DE LA FIBRA. ......................................................................................13 4.4. OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO DE INYECCIÓN. ............................................................16 4.5. DISEÑO DEL MÉTODO SCAN. ......................................................................................16 4.6. DISEÑO DEL MÉTODO SIM. .........................................................................................17 4.7. CÁLCULO DEL LÍMITE DE DETECCIÓN (LD) Y CUANTIFICACIÓN (LC). ...........................17 4.8. RECTAS DE CALIBRADO. ..............................................................................................19 4.9. MUESTRAS ANALIZADAS.............................................................................................19 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ................................................................................................20 5.1. OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO HS-SPME-GC-MS. ........................................................20 5.2. RESULTADOS SIM. ......................................................................................................22 5.3. RESULTADOS SCAN. ....................................................................................................27 6. CONCLUSIONES. .....................................................................................................................31 CONCLUSSIONS. .....................................................................................................................32 7. VALORACIÓN PERSONAL. .......................................................................................................33 8. BIBLIOGRAFÍA .........................................................................................................................34 9. ANEXOS. .................................................................................................................................38 ANEXO I. .................................................................................................................................38 ANEXO II. ................................................................................................................................41 ANEXO III. ...............................................................................................................................46 ANEXO IV. ...............................................................................................................................47 ANEXO V. ................................................................................................................................50 2 1. RESUMEN. Cada vez son más las personas que se preocupan por el consumo de alimentos envasados debido a una posible contaminación por la migración de compuestos químicos del envase al alimento. Estos envases suelen estar hechos con materiales multicapa, en los que además del polímero podemos encontrar otros componentes como tintas, adhesivos o barnices. Entre los compuestos de interés se encuentran los hidrocarburos de aceites minerales (MOHs) provenientes de distintos envases plásticos alimentarios. Estos pueden provenir de diversas fuentes, pero además se utilizan en las tintas de impresión y adhesivos que forman parte de los envases alimentarios. Dentro de los MOHs, se distingue la fracción de hidrocarburos saturados (MOSH) y la de hidrocarburos aromáticos (MOAH). El estudio se va a centrar en estos últimos debido a la gran toxicidad que supone su ingesta. Para ello, se va a optimizar un método de análisis mediante HSSPME-GC-MS (Microextracción en Fase Sólida por Espacio de Cabeza, Cromatografía de Gases y Espectrometría de Masas) y se van a utilizar dieciséis marcadores de MOAH como indicadores de contaminación. Mediante un análisis en modo SIM se cuantificarán estos compuestos en diferentes sets de muestras de materiales de envase multicapa en los que habían utilizado diferentes tecnologías para la aplicación de las tintas (flexografía y huecoreverso). Por otro lado, se llevó a cabo paralelamente un análisis en modo SCAN para identificar compuestos de otras familias diferentes a los MOHs que pudiesen provenir de las tintas o adhesivos utilizados en los materiales. ABSTRACT. More and more people are concerned about the consumption of packaged food due to possible contamination due to the migration of chemical compounds from the packaging to the food. These containers are usually made with multilayer materials, in which in addition to the polymer we can find other components such as inks, adhesives or varnishes. Among the compounds of interest are mineral oil hydrocarbons (MOHs) from different plastic food containers. These can come from various sources, but they are also used in printing inks and adhesives that are part of food packaging. Within the MOHs, the fraction of saturated hydrocarbons (MOSH) and that of aromatic hydrocarbons (MOAH) are distinguished. The study is going to focus on the latter due to the 3 great toxicity of their intake. For this, an analysis method will be optimized using HS-SPME-GC- (MS Microextraction in Solid Phase by Headspace, Gas Chromatography and Mass Spectrometry) and sixteen MOAH markers will be used as contamination indicators. Through an analysis in SIM mode, these compounds will be quantified in different sets of samples of multilayer packaging materials in which they had used different technologies for the application of the inks (flexography and reverse hue). On the other hand, an analysis in SCAN mode was carried out in parallel to identify compounds from families other than MOHs that could come from the inks or adhesives used in the materials. 2. INTRODUCCIÓN. 2.1. LOS ACEITES MINERALES. Los aceites minerales son productos compuestos en su mayoría por hidrocarburos (MOH), derivados principalmente de la destilación del petróleo crudo. Sin embargo, también se pueden producir hidrocarburos sintéticamente a partir del carbón, gas natural y biomasa, es decir, pueden formarse de manera natural a partir de bacterias, hongos, organismos marinos, plantas e insectos, y en el procesado de algunos alimentos, como tratamientos térmicos, refinados de aceites, etc. Tienen numerosas utilidades comerciales, en las que se incluyen: aditivos alimentarios, piensos, productos fitosanitarios, materiales en contacto con los alimentos, usos en la medicina, lubricantes, tintas de impresión, etc. Los MOH pueden estar presentes en los alimentos, o por vía directa a través de los materiales de embalaje mediante el contacto directo, el uso de aditivos alimentarios y coadyuvantes tecnológicos, lubricantes de la maquinaria empleada durante la cosecha y producción de alimentos, etc., o bien como consecuencia de la contaminación ambiental. Todos estos usos pueden suponer una fuente de exposición para los consumidores según la Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición (AECOSAN, 2017). En los aceites minerales se encuentran tres clases principales de hidrocarburos: • Parafinas (alcanos lineales y ramificados) • Naftenos (cicloalcanos con sustituyentes alquílicos) 4 • Aromáticos (incluyendo hidrocarburos aromáticos policíclicos HAPs alquil sustituidos, con cantidades pequeñas de HAPs). Sin embargo, también pueden contener pequeñas cantidades de compuestos nitrogenados y azufrados. Según la opinión científica emitida por el Panel de Contaminantes de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) de 2020 sobre la evaluación del riesgo de los aceites minerales, estos se agrupan en dos categorías: • Aceites minerales saturados (MOSH: Mineral Oils Saturated Hydrocarbons), que comprenden los grupos de parafinas y naftenos. Son de cadena abierta. • Aceites minerales aromáticos (MOAH: Mineral Oils Aromatic Hydrocarbon). Pueden contener azufre. Cabe destacar que la EFSA ha tenido en cuenta, para la evaluación del riesgo, hidrocarburos con un número de átomos de carbono comprendido entre 10 y 50. Se encuentran entre los productos comerciales de los que se posee poca información sobre su composición química, ya que sus especificaciones suelen referirse a las propiedades relacionadas con el uso al que se destinan, como las propiedades físico-químicas y la viscosidad, entre otras. Los productos pueden tener la misma especificación, pero distinta composición química dependiendo de la fuente del aceite y su procesado. Los aceites minerales de grado alimentario se tratan de forma que el contenido de hidrocarburos aromáticos sea mínimo. Según la Recomendación (UE) 2017/84 de la Comisión, de 16 de enero de 2017, sobre la vigilancia de hidrocarburos de aceites minerales en alimentos y en materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos, se considera que, en los alimentos, los MOH son tratados de manera que se reduzca al mínimo el contenido de hidrocarburos aromáticos de aceites minerales (MOAH). Esto es debido a los posibles efectos de los MOH sobre la salud humana. Los MOAH pueden actuar como carcinógenos y genotóxicos, mientras que algunos MOSH se acumulan en los tejidos humanos y pueden causar efectos nocivos en el hígado. Es por esto por lo que es importante organizar la vigilancia de los MOH para entender mejor la presencia de MOSH y MOAH en los productos alimenticios que más contribuyen a la exposición alimentaria. Los hidrocarburos saturados pueden acumularse en los tejidos grasos humanos. Se detectaron MOSH con una cadena de carbono hasta C45 y se cuantificó en los órganos de ratas (hígado, 5 bazo). Los MOSH con una cadena de carbono por debajo de C16 no se acumulan en el cuerpo humano. Según el Dictamen de la EFSA de 2012, se identifica la exposición humana a hidrocarburos de aceites minerales de diferentes fuentes entre 0,03 y 0,3 mg de MOH/kg de peso corporal, siendo más alta en los consumidores más jóvenes que en los adultos y ancianos, suponiendo que aproximadamente solo el 20% de esta ingesta proviene de MOAH. La estimación más elevada de los grandes consumidores se encontró en niños de 3 a 10 años, contribuyendo significativamente en su exposición total la migración procedente de los materiales de envasado de papel y cartón reciclado, es decir, los fabricados con fibras recicladas, por los posibles efectos sobre la salud humana (Muncke, 2013). Según el estudio del Instituto Federal de Evaluación de Riesgos (BfR, 2019) se ha definido un valor de 12 mg/kg de alimento para MOSH con una cadena de carbono de C10 a C16 como valor de referencia para una migración tolerable de papeles, cartones o cartones hechos con fibras recicladas. Para una longitud de cadena de C16 a C20, se estableció un nivel de migración tolerable de 4 mg/kg de alimento. Hasta ahora no se ha definido ninguna migración tolerable para las otras fracciones debido a la falta de datos toxicológicos. Aun así, no ha sido posible establecer un valor de Ingesta Diaria Admisible (IDA), ya no se ha considerado adecuados los valores de las IDA tomados como referencia en el estudio del Panel de la EFSA (EFSA, 2017). Según un estudio de la EFSA sobre migración de aceites minerales en alimentos envasados con papel y cartón reciclados, se demuestra que cuando no se utilizaban barreras funcionales (recubrimientos que impidan migrar) existía una transferencia significativa hacia los alimentos. Los materiales reciclados se pueden utilizar en todas las etapas de la cadena de suministro de alimentos (producción, almacenamiento y procesado de materias primas, transporte, refinado, producción y comercio). Por tanto, los puntos de entrada de estos contaminantes son posibles en cualquiera de esas etapas. 2.2. FUENTES DE CONTAMINACIÓN. Según el panel de la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AECOSAN, 2020), se han identificado las fuentes de contaminación de aceites minerales en los alimentos. Estas 6 fuentes son los materiales en contacto con los alimentos como, por ejemplo, tintas de impresión en papel y cartón, lubricantes para la fabricación de latas de conserva, adhesivos, etc. Algunos parámetros, como el tiempo de conservación y las condiciones de almacenamiento, pueden incrementar la migración de los MOH del embalaje a los alimentos. Dado que los MOH son más fáciles de detectar en grandes cantidades, en la estrategia de muestreo se deben de tener en cuenta esos parámetros cuando su migración es la más alta. En lo referente a las tintas se encuentran ciertos problemas con el fenómeno set off. Este se produce porque los materiales de envases flexibles, como puede ser la tapa de un yogur, se guardan en rollos. Durante su almacenamiento, la cara interna del material, que estará en contacto con el alimento, entra a su vez en contacto con la cara externa, donde se encuentran las tintas, de forma que los compuestos presentes en las tintas podrán ser transferidos a la cara interna del material (Portal Graf, 2017) (La imprenta, 2019). Figura 1: Imagen explicativa de la impresión set off. Los aceites minerales también pueden proceder de la maquinaria empleada en la cosecha, como diésel y aceite lubricante; así como de aceites lubricantes utilizados en el sector industrial y de agentes de limpieza a base de disolventes con aceites minerales. Por último, otras fuentes de contaminación son los aditivos alimentarios, coadyuvantes tecnológicos y otros usos: antiadherentes, aceites para recubrimiento de alimentos, aceites minerales en piensos, antiespumantes, ceras parafínicas autorizadas, coformulantes de productos fitosanitarios y agentes antipolvo en cereales. 2.3. MARCADORES DE LOS ACEITES MINERALES. Como ya se ha explicado anteriormente, hoy en día es imposible analizar individualmente cada compuesto que forma parte del grupo de hidrocarburos de los aceites minerales. Por tanto, se han seleccionado una serie de posibles marcadores con la finalidad de detectar, identificar y 7 cuantificar los hidrocarburos aromáticos procedentes de las muestras de distintos envases alimentarios empleando la técnica GC-MS. Los MOAH con tres anillos aromáticos pueden ser genotóxicos, por lo que es necesario desarrollar un método analítico para MOAH con más de un anillo aromático, pudiendo proponer o recomendar un límite (Maes et al., 2019). Se recomendaron el Antraceno y el Perileno como marcadores de aceites minerales, pero no fueron suficientes. Normalmente, para demostrar la presencia de MOAH se utilizaban las relaciones m/z (masa/carga) tales como 91, 105, 113 y 119 para su identificación en un Detector de Masas, pero estas masas coincidían con muchas sustancias naturales como terpenos, fitoesteroles, olefinas y carotenoides. Estas sustancias pueden interferir con el análisis espectral de masas y aumentar el valor de la detección señal, provocando una sobreestimación de los resultados en el análisis MOAH. Se han mostrado resultados concluyendo que los marcadores químicos son necesarios para llegar específicamente a la fuente de contaminación y su relación con los aceites minerales (Spack et al., 2017). 2.4. TINTAS. Actualmente, las tintas de impresión se fabrican a base de pigmentos, aceites vegetales y de aceites minerales. Esto es debido a la mejoría en cuanto al rendimiento, es decir, la capacidad de la tinta para imprimir un número determinado de pliegos. Las tintas de impresión para envases de alimentos no están cubiertas por ninguna legislación específica de la UE. Por lo tanto, se siguen las Directrices de European Printing Ink Association sobre tintas de impresión aplicadas a las superficies de materiales y envases que están en contacto con los alimentos. Las tintas para envases se formulan y fabrican de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación de EuPIA, teniendo en cuenta muchos parámetros individuales y variables relacionados con el sustrato, la aplicación y el uso final con el fin de minimizar el potencial de migración de los componentes de la tinta a los alimentos y permitir que el envase final cumpla con los requisitos legales del Reglamento (CE) nº 1935/2004 (EuPIA, 2019). Las tintas de impresión que se utilizan comúnmente en materiales plásticos multicapa utilizados para el envasado de alimentos presentan compuestos que pueden migrar a dichos alimentos por difusión a través de las multicapas y por el fenómeno del “set-off”, explicado anteriormente. Para evitar este problema, el diseño correcto del embalaje es fundamental. Se ha estudiado la 8 seguridad por diseño de materiales multicapa (Domeño et al., 2017), determinando la migración de 4 multicapas diferentes fabricadas con tereftalato de polietileno (PET), aluminio (Al) y polietileno (PE). Las diferencias estructurales entre los materiales, como la presencia de tintas o revestimientos de laca, así como las diferencias entre la posición de las capas, permitieron el estudio de enfoque de la seguridad por diseño. Así pues, según Domeño et al., se puede conocer la importancia de la seguridad del enfoque de diseño al fabricar materiales en contacto con los alimentos, particularmente si el material final es un impreso multicapa. Se concluye que, con el uso apropiado de la estructura y el barniz correcto, se puede prevenir o disminuir considerablemente el problema de “set-off” de modo que los materiales finales cumplan con la legislación de la UE para materiales en contacto con los alimentos. Según el dossier de Food Packaging Forum de 2017, las capas que actúan como barrera en la superficie interna del envase minimizan la migración de compuestos, recomendando su uso ya que se reduce la migración en un 99% y garantiza que ninguna sustancia desconocida alcance una concentración que pueda poner en peligro la salud del consumidor, recomendando los materiales PA y PET como barreras protectoras contra la migración de aceite mineral. En cuanto a la migración de las tintas, el sector alimentario europeo (Food and Drink Europe) ha presentado una `caja de herramientas´ (BLL, 2019) para la prevención de la transferencia de hidrocarburos de aceites minerales a los alimentos. Informan sobre las tintas de impresión, entre otras fuentes, y sus correspondientes rutas de entrada o las causas de esta. En cuanto a la entrada de MOSH/MOAH por envases primarios, se recomienda utilizar tintas de baja migración y sin aceite mineral, evitando el arrastre de tintas que contienen aceite mineral en la empresa de imprentas (en los soportes de aceite mineral que contienen tintas de otros procesos de impresión durante la reconfiguración de la máquina en la empresa de impresión, por ejemplo), aplicando en todo momento las “Buenas Prácticas de Fabricación”. También se recomienda utilizar la barrera funcional con envase con impresión interior, usando tintas de impresión sin aceite mineral para la impresión en el interior también, teniendo cuidado con los falsos positivos en los resultados de las tintas de impresión sin aceite mineral causados por sustancias asociadas con agentes aglutinantes. Por último, se recomienda evitar el contacto de superficies impresas con superficies de contacto con alimentos con la impresión según estipula el Reglamento nº2023/2006. 15 parcialmente entrecruzadas o fuertemente entrecruzadas. Las fases no ligadas son estables en algunos disolventes orgánicos miscibles con el agua. Por su parte, las fases ligadas son estables con todos los disolventes polares a excepción de algunos apolares. Y en cuanto a las fases entrecruzadas, son estables en la mayoría de disolventes orgánicos miscibles con el agua, además de algunos apolares (Vera, 2013). Para el desarrollo del método se probaron tres tipos de fibras diferentes tres fibras diferentes: DVB/CAR/PMDS (Divinilbenceno/Carboxen/polidimetilsiloxano) con 50/30 µm de espesor, CAR/PMDS (Carboxen/polidimetilsiloxano) con 85 µm de espesor y PMDS (Polidimetilsiloxano) con 100 µm de espesor. Para el estudio, se utilizaron 10 μL de un vial de 20 mL que contenía una disolución de 10 ppm de los 16 compuestos nombrados anteriormente, y se inyectó en el cromatógrafo empleando un mismo método de inyección estándar (con temperatura de incubación de 50ºC y un tiempo de extracción de 15 minutos). En la figura 4, puede observarse la alta polaridad y capacidad de extracción de la fibra de DVB/CAR/PMDS, por tanto, tiene una mayor utilidad para extraer compuestos polares. La fibra CAR/PMDS, posee una cierta apolaridad y una capacidad de extracción media, siendo poco selectiva. Ésta es la que se emplea al principio para el método estándar. Por último, la fibra PMDS, se observa que posee una muy alta apolaridad y capacidad de extracción, siendo muy selectiva. Como la columna cromatográfica es apolar, esta fibra es la más interesante por la gran capacidad de separación de compuestos apolares, como son los de este trabajo. Figura 4: Polaridad/Capacidad de extracción de las distintas fibras de SPME de “Supelco”. 16 4.4. OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO DE INYECCIÓN. La optimización del método de inyección es importante debido al binomio tiempo/temperatura de extracción, ya que influye la volatilidad de los compuestos presentes en las muestras. Se inyectan de forma repetida las disoluciones patrón correspondientes a las concentraciones de 1 ppm; 0,1 ppm; 0,01 ppm y 0,001 ppm con distintos métodos de inyección, variando únicamente el tiempo de inyección y temperatura de incubación (ver Tabla 7), manteniéndose el tiempo de desorción en 2 minutos para evitar una posible pérdida de compuestos o un error en el proceso. Temperatura de incubación (ºC) Tiempo de extracción (s) V1 88 1050 V2 31 1050 V3 60 60 V4 40 1800 V5 60 1050 V5 60 1050 V6 40 300 V7 80 1800 V8 60 2111 V5 60 1050 V9 80 300 V5 60 1050 V5 60 1050 4.5. DISEÑO DEL MÉTODO SCAN. Primero se emplea el detector de iones en “modo SCAN o barrido” con la finalidad de seleccionar todos los iones monitoreados y confirmar los tiempos de retención de los estándares. Así pues, se identifican todos los compuestos de cada una de las muestras utilizando el espectrómetro de Tabla 7: Distintos tiempos y temperaturas de las disoluciones patrón correspondientes a las concentraciones de 1ppm, 0,1ppm, 0,01ppm y 0,001ppm. Tabla 1arcohiris y gruap ti 17 masas y dichos iones monitoreados se seleccionan en base a su abundancia relativa en el espectro. El rango de masas que se emplean para este método es de 50 a 400 mz. Así pues, es útil para poder observar los resultados obtenidos cambiando variables. Los datos se adquirieron y procesaron utilizando el software de análisis de datos MSD ChemStation. 4.6. DISEÑO DEL MÉTODO SIM. Posteriormente se emplea modo de monitoreo selectivo de iones (SIM) cuya finalidad es la detección de los marcadores de MOAH seguido de un análisis cuantitativo de dichos analitos. Con este método se puede obtener un límite de detección más bajo que con el método SCAN, ya que la sensibilidad es de diez a cien veces mejor (Shimadzu, 2021). Con este método se obtuvo la recta de calibrado con los patrones y se realizó una posterior interpolación en la recta para obtener la concentración. El método se elabora a partir del cromatograma de una disolución patrón de 0,5 ppm; y para todos los compuestos se introduce en el programa: el área del pico que corresponde al compuesto, la masa mayoritaria que corresponde con la masa de cuantificación, la segunda masa más abundante que corresponde con la masa de confirmación y el intervalo de tiempo en el que el equipo procesa estas masas. Con la fibra PMDS seleccionada, los patrones preparados, las variables de inyección establecidas y el método de cuantificación generado se procede a inyectar todos los patrones con los que se van a establecer los límites de detección y cuantificación y se van a obtener las rectas de calibrado para cada uno de los compuestos, para posteriormente poder interpolar las áreas en dichas rectas y obtener así la concentración de los compuestos. 4.7. CÁLCULO DEL LÍMITE DE DETECCIÓN (LD) Y CUANTIFICACIÓN (LC). El límite de detección (LD) es la concentración más pequeña del compuesto mediante la cual el pico de la señal es tres veces la altura del ruido. Es decir, representa la cantidad más pequeña del analito en la muestra que puede ser distinguida de forma fiable del valor cero, incorporándose en un mismo parámetro las probabilidades de cometer errores por falso no detectado y falso detectado (Cuadros et al., 2013). Su fórmula es 𝐿𝐷 =3𝑥ℎ𝑟𝑥𝐶1 ℎ𝑚−ℎ𝑏 , en la que: “hr” es la altura del ruido; “C1” es la menor concentración en la que la altura del pico del compuesto es 3 veces mayor a la del ruido; “hm” 18 es la altura del pico correspondiente al compuesto” y “hb” es la altura del blanco en el tiempo que aparece el pico. El límite de cuantificación (LC) del método cuantitativo es la mínima concentración o masa de analito que ha sido validada con una exactitud aceptable aplicando el método analítico completo. A menudo es definido arbitrariamente como la mínima cantidad de analito que puede ser cuantificada con una precisión del 10 o 20%. Esto se basa en el hecho contrastado de que la desviación estándar relativa aumenta drásticamente cuando disminuye la cantidad de analito (Cuadros et al., 2013). Su fórmula es: 𝐿𝐶 =10𝑥ℎ𝑟𝑥𝐶1 ℎ𝑚−ℎ𝑏 Los límites de detección y de cuantificación se necesitan para poder realizar las rectas de calibrado de cada uno de los compuestos. Así pues, se calculan una vez se ha seleccionado el método de cuantificación a realizar, la fibra PMDS, las variables de inyección y los patrones. En la Tabla 8 se muestran los límites de detección y cuantificación obtenidos. Compuesto Tiempo retención (min) Masas de conf. LD (ppm) LC (ppm) 1 2-MN 10,08 142,1 (115,1) 0,63 2,10 2 1-MN 10,26 142,1 (115,1) 0,36 1,19 3 BP 11,22 154,1 0,64 2,15 4 2,6-MN 11,55 156,2 (141,1) 0,56 1,86 5 ACE 12,53 153,10 (75,1) 0,08 0,26 6 9,9-DMF 13,68 179,1 (194,2) 0,00 0,01 7 2,6-DIPN 15,31 197,2 (212,2) 0,00 0,00 8 3,3,5,5-TMB 15,97 210,2 (195,2) 0,00 0,00 9 4-MBT 16,79 198,10 (165,1) 0,01 0,02 10 4,6-DMBT 17,78 212,10 (197,1) 0,01 0,02 11 3,6-DMP 18,32 206,10 (191,2) 0,00 0,01 12 1-MPYR 20,78 216,10 (189,3) 0,03 0,09 13 BZNT 21,87 234,10 (189,1) 0,16 0,52 14 CHRY 22,42 228,20 (200) 0,58 1,93 Tabla 8: Parámetros analíticos del método. 19 4.8. RECTAS DE CALIBRADO. La validación de los métodos analíticos para el análisis cualitativo y cuantitativo de los analitos por GC-MS, también se realizó determinando la linealidad y rango lineal, además del LD y LC. Así pues, habiendo seleccionado la fibra PMDS, teniendo los patrones preparados, las variables de inyección estipuladas, el método de cuantificación generado y los patrones con los que se van a establecer los límites de detección y cuantificación inyectados, se procede a generar las gráficas con rectas de calibrado para cada analito con sus funciones relacionadas con la señal emitida (ver Anexo II). La linealidad y el rango lineal se determinaron mediante calibración estándar externa empleando ocho soluciones diferentes: 0,1ppm; 0,5ppm; 0,75ppm; 1ppm; 2,5ppm; 5ppm; 7,5ppm y 10ppm tomando las áreas de los compuestos en dichos patrones. 4.9. MUESTRAS ANALIZADAS. Las muestras que se han empleado para el análisis proceden de distintos polímeros de envases plásticos para diversos alimentos (infantiles, sazonadores culinarios, …). Los distintos polímeros procedían de tres sets de muestras diferentes. El set 1 contenía diferentes envases flexibles del tipo flexo-reverso (FR), tomando 3 muestras: la primera (A) era el polímero base (sin tinta), la segunda (B) era un polímero con tinta y la tercera (C) era un polímero con tinta y adhesivo (material final). El segundo set contenía envases flexibles del tipo flexo-anverso (FA), tomando esta vez 2 muestras: la primera (A) era el polímero base y la segunda (B) era un polímero con tinta. Por último, el set 3 contenía envases del tipo hueco-reverso (HR), cogiendo 3 muestras: la primera (A) era el polímero base, la segunda (B) era un polímero con tinta y la tercera (C) era un polímero con tinta y adhesivo (material final). Las muestras se protegieron con papel de aluminio para evitar la contaminación cruzada en el laboratorio. Los materiales se cortaron en pequeños trozos de aproximadamente 1 cm de cada lado. Posteriormente, se pesaron las muestras en viales de vidrio de 20 mL con tapón de aluminio y se inyectaron mediante HS-SPME-GC-MS. Las muestras se analizaron por SIM y SCAN. 20 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 5.1. OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO HS-SPME-GC-MS. Para la optimización de las condiciones de análisis se analizó un patrón de 10 ppm con los compuestos, empleando tres fibras diferentes (PMDS, CAR/PMDS y DVB/CAR/PMDS) y un mismo método de inyección estándar: temperatura de extracción de 50ºC y un tiempo de extracción de 15 minutos. La figura 19 muestra una sección de la superposición de los cromatogramas obtenidos para cada una de las fibras y señaliza los compuestos identificados. A partir del cromatograma puede interpretarse que la fibra PMDS es la más apropiada para la determinación de nuestros analitos, ya que es la más selectiva de todas y tiene una alta capacidad de extracción para los distintos compuestos. Esta fibra cuenta con una estructura apolar. En la figura 20, puede observarse el cromatograma de los patrones analizados en una disolución de 10ppm. Figura 19: Sección cromatrograma HS-SPME-GC-MS del patrón 10ppm en la que se superpone la fibra DVB/CAR/PMDS (representada en color negro), fibra PMDS (representada en color azul) y CAR/PMDS (representada en color rojo). 21 Figura 20: Cromatograma de los compuestos. Posteriormente, se seleccionaron las condiciones de tiempo y temperatura de extracción. En la figura 21, se puede observar una representación gráfica de la comparación de resultados realizada con el programa Design Expert en el que se han integrado las áreas de las señales emitidas por cada uno de los patrones. La figura representa el área total de todos los compuestos integrados. Aunque el área máxima se observó a unas condiciones de 80ºC y 30 minutos de extracción, las condiciones finalmente seleccionadas fueron : • Temperatura de extracción: 60ºC • Tiempo de extracción: 1050 segundos (17,5 minutos). La razón de esta elección fue que los compuestos más volatiles no eran detectados con suficiente sensibilidad a 80ºC y 30 minutos, probablemente debido a que a esas condiciones eran desplazados por los compuestos más pesados. En las condiciones seleccionadas (60 ºC y 17,5 min) era posible detectar estos compuestos con suficiente sensibilidad. Figura 21: Gráfica 3D comparativa de las condiciones óptimas de inyección. 22 Cabe destacar que los dos últimos compuestos, el benzo(d)fluoranteno y perileno, no se tienen en cuenta en el presente estudio ya que no se puede obtener una sensibilidad adecuada, por lo que no se pueden obtener resultados precisos con estos. 5.2. RESULTADOS SIM. Lo que se buscaba mediante el análisis por SIM era determinar los marcadores de MOAHs presentes en los diferentes sets de muestras, determinar su origen (polímero, tintas o adhesivos) y cuantificarlos. Una vez obtenidas las áreas de los distintos compuestos en todas las muestras de los 3 sets, se procede a interpolar las señales de los compuestos en las ecuaciones de las rectas de calibrado (ver anexo II). Los resultados obtenidos de las muestras de los sets se reflejan en las Tablas 9, 10 y 11. Las casillas en color rojo corresponden a los compuestos que están por debajo del LD, las de color amarillo a los que están por encima del LD y por debajo del LC y las de color verde son los valores de los compuestos que están por encima del LC. Estos últimos son los únicos que se han podido cuantificar. Siete de los compuestos estudiados se pudieron cuantificar en las muestras analizadas ya que sus valores estaban por encima del LC. Estos compuestos fueron: acenafteno; 9,9dimetilfluoreno; diisopropinaftaleno; 3,3,5,5-tetrametilbifenilo; 4-metildibenzotiofeno; 4,6dimetildibenzotiofeno y 3,6-dimetilnaftaleno. Por otro lado, seis de los compuestos se pudieron detectar en todas las muestras pero estaban por debajo del LC: 2-metilnaftaleno; 1metilnaftaleno; bifenilo; 2,6-dimetilnaftaleno; 1-metilpireno y benzo(b)napto(2,1-d)tiofeno. Solamente un compuesto, el criseno, contaba con valores por debajo del límite de detección. Los cromatogramas de las muestras FR, FA y HR se encuentran en el anexo III (Figuras 22, 23 y 24). 23 Tabla 9: Concentración (ppm), media y desviación estandar de los distintos marcadores en las muestras FR (set1). Compuestos FR A1 FR A2 FR A3 Media Desv. Est. FR B1 FR B2 FR B3 Media Desv. Est. FR C1 FR C2 FR C3 Media Desv. Est. 2-MN LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC 1-MN LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC BP LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC 2,6-MN LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC ACE 0,518 0,543 0,535 0,532 0,0127 0,385 0,384 0,436 0,402 0,0300 0,383 0,383 0,383 0,383 0,0002 9,9-DMF 0,110 0,110 0,110 0,110 0,0002 0,114 0,113 0,107 0,111 0,0038 0,116 0,115 0,114 0,115 0,0010 2,6-DIPN 0,061 0,062 0,062 0,062 0,0002 0,068 0,068 0,071 0,069 0,0018 0,060 0,059 0,059 0,059 0,0005 3,3,5,5-TMB 0,217 0,219 0,217 0,218 0,0011 0,217 0,219 0,217 0,218 0,0008 0,217 0,217 0,217 0,217 0,0001 4-MBT 0,064 0,057 0,054 0,058 0,0050 0,061 0,061 0,049 0,057 0,0066 0,049 0,049 0,049 0,049 0,0001 4,6-DMBT 0,097 0,097 0,096 0,097 0,0003 0,096 0,096 0,096 0,096 0,0002 0,096 0,096 0,096 0,096 0,0002 3,6-DMP 0,108 0,115 0,120 0,115 0,0057 0,078 0,078 0,078 0,078 0,0002 0,079 0,079 0,078 0,079 0,0005 1-MPYR LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC BZNT LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC CHRY <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD <LD 24 Tabla 10: Concentración (ppm), media y desviación estándar de los distintos marcadores en las muestras FA (set 2). Compuestos FA A1 FA A2 FA A3 Media Desv. Est. FA B1 FA B2 FA B3 Media Desv. Est. 2-MN LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC 1-MN LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC BP LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC 2,6-MN LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC ACE 0,435 0,437 0,441 0,438 0,0028 0,384 0,383 0,404 0,390 0,0115 9,9-DMF 0,109 0,110 0,107 0,109 0,0016 0,118 0,119 0,123 0,120 0,0025 2,6-DIPN 0,065 0,062 0,063 0,063 0,0013 0,066 0,070 0,070 0,069 0,0022 3,3,5,5-TMB 0,217 0,217 0,217 0,217 0,0001 0,217 0,218 0,218 0,218 0,0005 4-MBT 0,049 0,049 0,050 0,049 0,0005 0,049 0,051 0,050 0,050 0,0011 4,6-DMBT 0,096 0,096 0,096 0,096 0,0001 0,095 0,096 0,095 0,096 0,0004 3,6-DMP 0,078 0,078 0,078 0,078 0,0001 0,078 0,080 0,078 0,079 0,0010 1-MPYR LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC BZNT LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC LD-LC CHRY <LD <LD <LD <LD <LD <LD 31 tinta; y el tercero es el palmitato de isopropilo (trazo rojo), proveniente del envase con tinta más adhesivo. Posteriormente, se superpusieron las muestras más representativas del set 2, FA A y FA B (ver figura 26 del anexo IV). Así pues, de los dos compuestos identificados (trazo azul) provenientes de la tinta de esos envases, el más intenso es el sebacato de dibutilo. Se puede observar también una señal muy intensa (trazo negro) de un compuesto únicamente presente en el material sin tinta. Finalmente, se superpusieron las muestras más representativas del set 3, HR A, HR B y HR C (ver figura 27 del anexo IV). Se observa claramente un pico con una intensidad destacable, que se identifica con el compuesto 7,9-Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5)deca-6,9-diene-2,8-diona. Este proviene principalmente del polímero base (trazo negro). Este compuesto posee unas excelentes propiedades para ser empleado en materiales de envasado plástico de alimentos (Chemical Book, 2020). 6. CONCLUSIONES. Debido a la dificultad de análisis de los aceites minerales provenientes de tintas de envases plásticos alimentarios y para evitar una incorrecta interpretación de los resultados de estos (por ejemplo, sobreestimación por poca definición cromatográfica), se seleccionaron 16 marcadores de dichos aceites minerales, para los cuales se optimizó un método de análisis por HS SMPE-GCMS capaz de detectar estos compuestos con una gran sensibilidad. El método no permitió detectar los dos últimos marcadores seleccionados: el benzo(d)fluoranteno y perileno. Pudo comprobarse que, para las distintas muestras de polímeros analizados, 7 de los 14 compuestos estaban por encima del límite de cuantificación y por tanto pudieron cuantificarse y emplearse como marcadores de los MOAHs. Estos fueron: ACE; 9,9-DMF; 2,6-DIPN; 3,3,5,5TMB; 4-MBT; 4,6-DMBT y 3,6-DMP. Tras realizar para cada set una comparación de los distintos materiales (polímero, polímero con tinta y polímero con tinta más adhesivo), se pudo observar que en los envases donde la tecnología flexo-reverso (FR) había sido utilizada, se detectaban los compuestos 2,6-diisopropilnaftaleno, proveniente de la tinta, y la 9,9-dimetilformamida, proveniente del adhesivo. Para los envases donde se había utilizado la tecnología flexo-anverso (FA), se observaron esos 2 mismos compuestos procedentes ambos de la tinta. Finalmente, para los envases con tecnología hueco-reverso (HR), además de esos 2 compuestos que provenían de la tinta, se detectó el 4-MBT proveniente del adhesivo. 32 Por otro lado, al analizar las muestras con el método SCAN se pudo observar la presencia de una gran cantidad de compuestos diferentes a los MOAHs procedentes de las tintas y adhesivos en las muestras de los 3 tipos de sets. De las muestras del set formado por envases flexo-reversos, los compuestos más intensos fueron: el acetiltributilcitrato, proveniente de la tinta; el palmitato de isopropilo, proveniente del adhesivo; y el ácido 4-isoquinolincarboxílico proveniente del polímero base. De los envases flexo-anversos, el sebacato de dibutilo fue el compuesto más intenso proveniente de las tintas. Por último, del set formado por materiales hueco-reversos, fue el 7,9-Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5)deca-6,9-diene-2,8-diona el compuesto más intenso proveniente del polímero base. Es muy importante el continuo estudio de los compuestos químicos presentes en los envases alimentarios, ya que estos pueden migrar al alimento envasado y repercutir en la salud de quienes lo ingieren. No solo hay que evaluar los polímeros sino las tintas y los adhesivos utilizados, ya que como muestra el trabajo la composición del material final de envase dependerá de la combinación de los materiales utilizados y de la tecnología utilizada para su aplicación. CONCLUSSIONS. Due to the difficulty of analyzing mineral oils from food plastic packaging inks and to avoid an incorrect interpretation of their results (for example, overestimation due to poor chromatographic definition), 16 markers of these mineral oils were selected for the which was optimized an analysis method by HS SMPE-GC-MS capable of detecting these compounds with great sensitivity. The method did not allow the detection of the last two selected markers: benzo (d) fluoranthene and perylene. It was found that, for the different samples of polymers analyzed, 7 of the 14 compounds were above the limit of quantification and therefore could be quantified and used as markers of MOAHs. These were: ACE; 9,9-DMF; 2,6-DIPN; 3,3,5,5-TMB; 4-MBT; 4,6-DMBT and 3,6-DMP. After making a comparison of the different materials for each set (polymer, polymer with ink and polymer with ink plus adhesive), it was observed that in the containers where flexo-reverse (FR) technology had been used, the compounds 2 were detected , 6-diisopropylnaphthalene, from the ink, and 9,9-dimethylformamide, from the adhesive. For the containers where the flexo-obverse (FA) technology had been used, the same 2 compounds were observed from both the ink. Finally, for packages with hollow-reverse (HR) technology, in addition to those 2 compounds that came from the ink, 4-MBT from the adhesive was detected. 33 On the other hand, when analyzing the samples with the SCAN method, it was possible to observe the presence of a large amount of compounds other than MOAHs from the inks and adhesives in the samples of the 3 types of sets. Of the samples from the set consisting of flexoreverse containers, the most intense compounds were: acetyltributylcitrate, from the ink; isopropyl palmitate, from the adhesive; and the 4-isoquinolinecarboxylic acid from the base polymer. Of the flexo-obverse containers, dibutyl sebacate was the most intense compound from the inks. Finally, from the set formed by hollow-reverse materials, 7,9-Di-tert-butyl-1oxaspiro (4,5) deca-6,9-diene-2,8-dione was the most intense compound from of the base polymer. The continuous study of the chemical compounds present in food packaging is very important, since these can migrate to the packaged food and affect the health of those who eat it. It is not only necessary to evaluate the polymers but also the inks and adhesives used, since as the work shows, the composition of the final packaging material will depend on the combination of the materials used and the technology used for its application. 7. VALORACIÓN PERSONAL. La realización de este trabajo de manera experimental me ha ayudado a ampliar conocimientos teóricos y prácticos del ámbito de la química analítica, como también de las técnicas instrumentales del análisis químico (asignaturas cursadas en el primer curso del grado Ciencia y Tecnología de los Alimentos). He podido relacionar contenidos del grado, como son las posibles intoxicaciones por ingesta de compuestos, con la química, con la optimización de todo un método, el uso de un cromatógrafo de gases y el uso de un programa mediante el cual he aprendido a leer cromatogramas. También he aprendido la importancia del análisis de los envases empleados para alimentos, en concreto los plásticos, ya que en una simple bolsa de snacks infantiles se pueden identificar una gran cantidad de compuestos, en su mayoría tóxicos a grandes cantidades de ingesta, que poseen propiedades plastificantes. Por último, quiero agradecer la ayuda y orientación de mis directoras Celia Domeño y Margarita Aznar, sin la cual este trabajo no hubiese podido llevarse a cabo. 34 8. BIBLIOGRAFÍA 1. Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición (2017). Aceites minerales. Disponible en: https://www.aesan.gob.es/AECOSAN/docs/documentos/seguridad_alimentaria/gestio n_riesgos/Aceites_minerales.pdf [Consultado 13-07-2020] 2. Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (2020). Hidrocarburos de aceites minerales. Disponible en: https://www.aesan.gob.es/AECOSAN/web/seguridad_alimentaria/ampliacion/aceites_m inerales.htm [Consultado: 14-07-2020]. 3. Recomendación (UE) 2017/84 de la Comisión, de 16 de enero de 2017, sobre la vigilancia de hidrocarburos de aceites minerales en alimentos y en materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos. Boletín Oficial del Estado, núm. 12, de 17 de enero de 2017, páginas 95 a 96. 4. Muncke, J. (2013). Migración. 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Disponible en: https://www.atsdr.cdc.gov/es/phs/es_phs73.html [Consultado 11-01-2021]. 27. Chemical Book (2020). What is 7,9-ditert-butyl-1-oxaspiro[4.5]deca-6,9-diene-2,8-dione?. Disponible en: https://www.chemicalbook.com/Article/What-is-7-9-ditert-butyl-1oxaspiro-4-5-deca-6-9-diene-2-8-dione-.htm [Consultado 12-01-2021]. 38 9. ANEXOS. ANEXO I. Tabla 2: Tabla de los patrones con sus respectivos pesos. A partir de 100ppm Objetivo Peso dis. Madre (g) Peso disoluci. Final (g) 10ppm 0,3054 3,0107 7,5ppm 0,1921 2,5803 5ppm 0,137 2,778 2,5ppm 0,069 2,769 A partir de 10ppm Objetivo Peso dis. Madre (g) Peso disoluci. Final (g) 0,05ppm 0,133 2,6704 0,01ppm 0,0308 3,1012 0,005ppm 0,027 5,7464 A partir de 1ppm Objetivo Peso dis. Madre (g) Peso disoluci. Final (g) 0,05ppm 0,133 2,6704 0,01ppm 0,0308 3,1012 0,005ppm 0,027 5,7464 A partir de 100ppb Objetivo Peso dis. Madre (g) Peso disoluci. Final (g) 1ppb 0,0289 2,9029 Concentración por compuesto a partir de la 100ppm Compuestos 100ppm 10ppm 7,5ppm 5ppm 2,5ppm 2-MN 99,062 10,049 7,375 4,885 2,469 1-MN 108,079 10,963 8,046 5,330 2,693 BP 104,142 10,564 7,753 5,136 2,595 2,6-MN 99,433 10,086 7,403 4,904 2,478 ACE 100,851 10,230 7,508 4,974 2,513 9,9-DMF 103,834 10,533 7,730 5,121 2,587 2,6-DIPN 102,485 10,396 7,630 5,054 2,554 3,3,5,5-TMB 102,124 10,359 7,603 5,036 2,545 4-MBT 101,012 10,246 7,520 4,982 2,517 4,6-DMBT 100,516 10,196 7,483 4,957 2,505 3,6-DMP 99,428 10,086 7,402 4,903 2,478 1-MPYR 100,839 10,229 7,507 4,973 2,513 BZNT 102,953 10,443 7,665 5,077 2,565 CHRY 106,741 10,828 7,947 5,264 2,660 Tabla 3: Concentraciones por compuesto en patrones 10ppm; 7,5ppm; 5ppm y 2,5ppm. 39 Concentración por compuesto a partir de la 10ppm Compuestos 10ppm 1ppm 0,5ppm 0,1ppm 0,75ppm 2-MN 10,049 1,004 0,499 0,100 0,753 1-MN 10,963 1,095 0,544 0,109 0,821 BP 10,564 1,055 0,524 0,105 0,791 2,6-MN 10,086 1,008 0,500 0,100 0,756 ACE 10,230 1,022 0,508 0,102 0,766 9,9-DMF 10,533 1,052 0,523 0,105 0,789 2,6-DIPN 10,396 1,039 0,516 0,104 0,779 3,3,5,5-TMB 10,359 1,035 0,514 0,103 0,776 4-MBT 10,246 1,024 0,508 0,102 0,768 4,6-DMBT 10,196 1,019 0,506 0,102 0,764 3,6-DMP 10,086 1,008 0,500 0,100 0,756 1-MPYR 10,229 1,022 0,508 0,102 0,766 BZNT 10,443 1,043 0,518 0,104 0,782 CHRY 10,828 1,082 0,537 0,108 0,811 Concentración por compuesto a partir de la 1ppm Compuestos 1ppm 0,05ppm 0,01ppm 0,005ppm 2-MN 1,004 0,050 0,010 0,005 1-MN 1,095 0,055 0,011 0,005 BP 1,055 0,053 0,010 0,005 2,6-MN 1,008 0,050 0,010 0,005 ACE 1,022 0,051 0,010 0,005 9,9-DMF 1,052 0,052 0,010 0,005 2,6-DIPN 1,039 0,052 0,010 0,005 3,3,5,5-TMB 1,035 0,052 0,010 0,005 4-MBT 1,024 0,051 0,010 0,005 4,6-DMBT 1,019 0,051 0,010 0,005 3,6-DMP 1,008 0,050 0,010 0,005 1-MPYR 1,022 0,051 0,010 0,005 BZNT 1,043 0,052 0,010 0,005 CHRY 1,082 0,054 0,011 0,005 Tabla 5: Concentraciones por compuesto en patrones 0,05ppm; 0,01ppm y 0,005ppm. Tabla 4: Concentraciones por compuesto en patrones 1ppm; 0,5ppm; 0,1ppm y 0,75ppm. 40 Concentración por compuesto a partir de la 0,1ppm Compuestos 0,1ppm 0,001ppm 2-MN 0,100 0,001 1-MN 0,109 0,001 BP 0,105 0,001 2,6-MN 0,100 0,001 ACE 0,102 0,001 9,9-DMF 0,105 0,001 2,6-DIPN 0,104 0,001 3,3,5,5-TMB 0,103 0,001 4-MBT 0,102 0,001 4,6-DMBT 0,102 0,001 3,6-DMP 0,100 0,001 1-MPYR 0,102 0,001 BZNT 0,104 0,001 CHRY 0,108 0,001 Tabla 6: Concentraciones por compuesto en patrón 0,001ppm. 47 ANEXO IV. Figura 25: Cromatograma de las señales resultantes de la superposición de las muestras A, B y C del set 1 (FR). 48 Figura 26: Cromatrograma de las señales obtenidas de la superposición de las muestras A y B del set 2 (FA). 49 Figura 27: Cromatrograma de las señales obtenidas de la superposición de las muestras A, B y C del set 3 (HR). 50 ANEXO V. Acrónimos • 2-MN: 2-metilnaftaleno • 1-MN: 1-metilnaftaleno • BP: bifenilo • 2,6-MN: 2,6-dimetilnaftaleno • ACE: acenafteno • 9,9-DMF: 9,9-dimetilfluoreno • 2,6-DIP: diisopropinaftaleno • 3,3,5,5-TMB: 3,3´,5,5´-tetrametilbifenilo • 4-MBT: 4-metildibenzotiofeno • 4,6-DMBT: 4,6-dimetildibenzotiofeno • 3,6-DMP: 3,6-dimetilfenantreno • 1-MPYR: 1-metilpireno • BZNT: benzo(b)napto(2,1-d)tiofeno • CHRY: criseno • HPLC: “High Performance Liquid Chromatography” o cromatografía líquida de alta eficacia. • GC: “Gas Chromatography” o cromatografía de gases. • FID: “Flame Ionization Detector” o detector de ionización de llama. • HS: “Head Space” o espacio de cabeza. • MS: “Mass Spectrometry” o espectrometría de masas. • SPME: “Solid Phase Micro Extraction” o microextracción en fase sólida. • SIM: “Selected Ion Monitoring” o monitor selectivo de iones.