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2021 106 Inés Mármol Peguero Evaluación del efecto antitumoral de nuevos complejos de oro (I) como potenciales agentes frente al cáncer colorrecta. Director/es Cerrada Lamuela, Elena Rodríguez Yoldi, María Jesús © Universidad de Zaragoza Servicio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Inés Mármol Peguero EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTITUMORAL DE NUEVOS COMPLEJOS DE ORO (I) COMO POTENCIALES AGENTES FRENTE AL CÁNCER COLORRECTA. Director/es Cerrada Lamuela, Elena Rodríguez Yoldi, María Jesús Tesis Doctoral Autor 2020 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Escuela de Doctorado Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas Evaluación del efecto antitumoral de nuevos complejos de oro(I) como potenciales agentes frente al cáncer colorrectal Inés Mármol Peguero Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas Universidad de Zaragoza Evaluación del efecto antitumoral de nuevos complejos de oro(I) como potenciales agentes frente al cáncer colorrectal Inés Mármol Peguero Tesis doctoral Doctorado en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas Directoras: Dra. Elena Cerrada Lamuela Dra. Mª Jesús Rodríguez Yoldi Mª Jesús Rodríguez Yoldi, Catedrática del departamento de Farmacología y Fisiología de la Universidad de Zaragoza Elena Cerrada Lamuela, Profesora Titular del departamento de Química Inorgánica de la Universidad de Zaragoza CERTIFICAN: Que Dª Inés Mármol Peguero , Graduada en Biotecnología por la Universidad de Zaragoza, ha realizado en los departamentos de Farmacología y Fisiología y de Química Inorgánica de la Universidad de Zaragoza, bajo nuestra dirección, el trabajo “Evaluación del efecto antitumoral de nuevos complejos de oro(I) como potenciales agentes frente al cáncer colorrectal”, que constituye su memoria para aspirar al grado de Doctor en Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas reuniendo, a nuestro juicio, las condiciones necesarias para ser presentada y defendida ante el tribunal correspondiente. En Zaragoza a 21 de Septiembre de 2020 Fdo. Dra. Elena Cerrada Lamuela Fdo. Dra Mª Jesús Rodríguez Yoldi ÍNDICE Resumen/Abstract…………………………………………………………………………………………………………………13 Abreviaciones…………………………………………………………………………………………………………………………19 INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………………………21 Transformación tumoral. Aparición y desarrollo del cáncer colorrectal………………………………23 Muerte celular. Apoptosis, necroptosis y autofagia…………………………………………………………….33 Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino……………….43 Búsqueda de soluciones a las limitaciones del cisplatino…………………………………………………….51 Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin.59 Farmacocinética. La albúmina sérica como transportador de fármacos………………………………69 Objetivos…………………………………………………………………………………………………………………………….73 Referencias…………………………………………………………………………………………………………………………75 MATERIAL AND METHODS.…………………………………………………………………………………………………….93 RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………………113 Capítulo 1……………………………………………………………………………………………………………………………..115 Referencias……………………………………………………………………………………………………………………….157 Capítulo 2……………………………………………………………………………………………………………………………..167 Referencias……………………………………………………………………………………………………………………….190 Capítulo 3……………………………………………………………………………………………………………………………..195 Fosfino complejos…………………………………………………………………………………………………………….202 Carbeno complejos…………………………………………………………………………………………………………..220 Referencias……………………………………………………………………………………………………………………….230 Capítulo 4……………………………………………………………………………………………………………………………..243 Referencias……………………………………………………………………………………………………………………….269 CONCLUSIONES/CONCLUSIONS…………………………………………………………………………………………….277 13 RESUMEN Dado el constante crecimiento del número de casos de cáncer de colon a nivel mundial, es necesario el desarrollo de nuevas terapias más seguras y eficaces para mejorar la calidad y la esperanza de vida de los pacientes de este trastorno. Los derivados de oro(I) se han postulado como una interesante alternativa a los actuales fármacos de platino, puesto que sus dianas terapéuticas son, en su mayoría, proteínas sobreexpresadas en las células tumorales. Esto los convierte en fármacos presumiblemente más seguros, al tiempo que mantienen la eficacia terapéutica de sus predecesores de platino. La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de nuevos complejos de oro(I) frente a un modelo celular de cáncer de colon, la línea Caco-2. Se ha profundizado en la influencia de los ligandos de coordinación en el efecto biológico de la molécula resultante, llevando a cabo para ello diversos ensayos entre los que se encuentran el estudio de las poblaciones apoptóticas, la medida de los niveles de especies reactivas de oxígeno y el análisis de la actividad de diversas enzimas y proteínas, entre otros. Asimismo, se ha desarrollado una nueva formulación compuesta por un alquino derivado de oro(I) y un extracto vegetal, se ha evaluado la capacidad antibacteriana de una serie de derivados de oro(I) siguiendo la filosofía del drug repurposing y se ha estudiado la influencia del centro metálico en cuanto a la acción biológica del complejo frente al cáncer de colon mediante la sustitución del oro(I) por plata(I). La memoria se ha estructurado en cuatro capítulos que se detallan a continuación. En el primer capítulo, se ha comparado el efecto antitumoral frente a la línea Caco-2 de tres alquino derivados de oro(I) coordinados con fosfinas solubles en agua: [Au(C≡CPh)(PTA)], [Au(C≡CPh)(DAPTA)] y [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)]. Se observó que cambios aparentemente mínimos en el diseño de la molécula pueden dar lugar a grandes diferencias en cuanto al mecanismo de acción causado por un fármaco antitumoral. Así, el complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] inhibe a la enzima redox tiorredoxina reductasa y causa un incremento en los niveles de especies reactivas de oxígeno, produciendo la muerte de las células tumorales por apoptosis intrínseca. Por su parte, el complejo [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] no muestra afinidad por la tiorredoxina reductasa e induce necroptosis en lugar de apoptosis. Se cree que este cambio en el mecanismo de acción podría estar motivado por la formación de agregados de varios complejos en la mitocondria, lo que provocaría un gran aumento en los niveles de especies reactivas de oxígeno, causando como consecuencia la activación de la proteína RIP-1, responsable de la necroptosis. En el segundo capítulo, se estudió el efecto combinado del complejo [Au(C≡C-2NC5H4)(PTA)] y un extracto de polifenoles ácidos del fruto de la Rosa canina sobre la línea Caco-2. La interacción entre ambos fármacos resultó ser de tipo aditivo, de modo que suponía un incremento de la actividad antitumoral respecto al efecto de cada 14 componente por separado. Dicha combinación produce un bloqueo de la necroptosis causada por el complejo metálico; en su lugar, desencadena la muerte por apoptosis, presumiblemente debido a un bloqueo del flujo autofágico provocado por la alcalinización de los lisosomas, que parece estar causado a su vez por una disrupción de la función normal mitocondrial. Dado que estos efectos no se han descrito al tratar el cultivo con los componentes aislados de este nuevo cóctel, se puede concluir que los resultados observados parecen ser debidos al efecto conjunto de ambos. En el tercer capítulo, se estudió el efecto de la unidad 3-hidroxiflavona como ligando de coordinación en cuatro series de alquino derivados de oro(I): [Au(L2a-d)PPh3], [Au(L2a-d)PTA], [Au(L2a-d)(IMe)] y [Au(L2a-d)(IPr)]. Mientras que los fosfino complejos mostraron un interesante efecto antitumoral, así como una buena selectividad, los carbeno complejos fueron descartados como potenciales agentes quimioterapéuticos por su escaso potencial antitumoral en comparación con otros complejos de oro(I). No obstante, se observó que algunos de ellos poseían un considerable efecto antibacteriano, al mostrar una capacidad antibacteriana moderada frente a especies Gram negativas y Gram positivas. Por su parte, los fosfino complejos fueron ensayados no solo frente a la línea Caco-2, sino que se incluyeron dos modelos tumorales adicionales (líneas MCF-7 y HepG2, adenocarcinoma de mama y hepatocarcinoma respectivamente) para determinar una posible selectividad frente a cáncer colorrectal, observándose una mejor respuesta frente al modelo de cáncer colorrectal. Un estudio en profundidad del mecanismo de acción de los complejos más activos [Au(L2b)PPh3] y [Au(L2c)PTA], reveló que el complejo [Au(L2b)PPh3] es capaz de inhibir a las enzimas tiorredoxina reductasa y ciclooxigenasa 2, causando una ruptura del equilibrio redox y la muerte por apoptosis, mientras que el complejo [Au(L2c)PTA] bloquea la acción de las enzima redox glutatión reductasa y tiorredoxina reductasa, así como la enzima ciclooxigenasa 1, siendo también capaz de inducir la muerte por apoptosis; no obstante, su efecto pro-apoptótico es más reducido que el del complejo [Au(L2b)PPh3] durante las primeras 24h de incubación, lo que podría estar mediado por un aumento de la autofagia citoprotectora en respuesta al tratamiento. En cualquier caso, ambos derivados se han revelado como complejos multidiana y aparentemente selectivos frente al cáncer colorrectal, lo que sería de gran interés de cara a sustituir al oxaliplatino. En el cuarto capítulo, se han ensayado una serie de derivados de oro(I) y plata(I) coordinados con ligandos derivados de la 2-anilinopiridina. Al estudiar en profundidad el efecto terapéutico de los complejos [Au(L1)(PPh3)](TfO) y [Ag(TfO)(L1)(PPh3)], se observó que no compartían dianas moleculares, al menos al ser ensayados en una concentración equivalente a sus IC50. El derivado de oro [Au(L1)(PPh3)](TfO) resultó ser capaz de inhibir a la enzima redox tiorredoxina reductasa y a la subunidad 20S del proteasoma, de modo que se trata de un complejo multidiana, mientras que el 15 mecanismo de acción del complejo de plata [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] no pudo ser identificado, si bien los datos obtenidos sugieren que podría causar un fallo mitocondrial que daría lugar a una activación de la apoptosis, siendo este proceso independiente del nivel de especies reactivas de oxígeno. Por su parte, el tratamiento de las células Caco2 con el complejo [Au(L1)(PPh3)](TfO) tuvo como consecuencia un aumento en la activación de la caspasa 8, lo que sugiere que los derivados de oro(I) podrían activar no solo la vía intrínseca de la apoptosis, sino también la extrínseca. La ausencia de un mecanismo de acción compartido entre los derivados de oro(I) y plata(I) podría indicar que no existirían resistencias cruzadas entre ambos. Por último, en este caso concreto se concluye que el complejo de oro [Au(L1)(PPh3)](TfO) podría ser de mayor interés que el análogo de plata [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] frente al tratamiento del cáncer colorrectal, dado que, aunque muestran valores comparables en cuanto a su eficacia, el derivado de oro(I) parece mostrar una mayor selectividad que su análogo de plata(I). En definitiva, los datos obtenidos sugieren que los derivados de oro(I) ensayados podrían tener un interesante futuro como agentes quimioterapéuticos frente al cáncer de colon, ya que se trata de complejos más selectivos que los fármacos de referencia utilizados, siendo también su efectividad mayor que la de estos en algunos casos. 16 ABSTRACT Given the incessant growth in colorectal cancer cases worldwide, the development of novel, safer and more effective therapeutic strategies is needed to improve both quality-of-life and life expectancy of patients. Gold(I) derivatives have arisen as a promising alternative to current platinum-containing drugs due to their affinity for proteins that are overexpressed on tumor cells. Therefore, this kind of drugs are supposed to be safer but to maintain the therapeutic efficacy of platinum-based metallodrugs. This Thesis has been focused on the evaluation of novel gold(I) complexes towards a model of colorectal cancer, Caco-2 cell line. The influence of coordination ligands on the biological effect of the resultant molecule has been in depth studied with a variety of assays that includes analysis of apoptotic populations, measurement of reactive oxygen species levels and analysis of certain enzymatic and proteic activities among others. Moreover, a novel drug combination containing an alkynyl gold(I) derivative and plant extracts has been developed, the antibacterial activity of a series of gold(I) derivatives has been evaluated according to drug repurposing philosofy and the replacement of gold(I) by silver(I) in regards to anti-colorectal cancer activity has been studied. Text has been structured on four chapters detailed below. On the first chapter, the antitumor effect of three alkynyl gold(I) derivatives coordinated with water soluble phosphines has been evaluated on Caco-2 cell line: [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a), [Au(C≡CPh)(DAPTA)] (1b) y [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a). It was observed that apparently minimal changes on molecule design might lead to great differences regarding to the mechanism of action of an antitumor drug. Complex [Au(C≡CPh)(PTA)] inhibited redox enzyme thioredoxin reductase and induced an increase in reactive oxygen species levels, thus leading to intrinsic apoptotic cancer cells death. On the other hand, complex [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] did not show any affinity for this enzyme and triggered necroptosis instead of apoptosis. This swicht on the mechanism of action might be explained by complex aggregation on mitochondria, which would lead to a high increase in reactive oxygen species levels that triggered protein RIP-1 activation, one of the main responsibles of necroptosis. On the second chapter, the combined effect of complex [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) and acidic polyphenols extract from the rosehip of Rosa canina on Caco-2 cell line was studied. The additive pharmacological interaction was responsible of an increase in antitumor activity in comparison to the effect of each agent individually. Drug combination induced a blockage of necroptosis triggered by the metallodrug; instead, drug combination lead to apoptotic cell death, probably due to an impairment of the autophagic flux triggered by lysosomes alkalization, which was caused by mitochondrial normal function disruption, was observed. Since the observed effects were not noticed 17 upon cell culture treatment with the single agents, the obtained results might be a direct consequence of the concomitant addition of both of them. On the third chapter, the influence of the molecule derived from 3-hydroxyflavone unit as ligand in four series of alkynyl gold(I) derivatives, namely [Au(L2a-d)PPh3], [Au(L2a-d)PTA], [Au(L2a-d)(IMe)] and [Au(L2a-d)(IPr)], was evaluated. Whereas the phosphine derivatives showed a promising antitumor effect as well as adequate selectivity as will be detailed below, carbene derivatives were discarded as potential chemotherapeutic agents due to their low antitumor potential compared with the phosphine analogues. However, some of them showed certain antibacterial effect towards both Gram positive and Gram negative strains. The antitumor potential of the phosphine derivatives was evaluated on Caco-2 cell line and on two additional tumor models (MCF-7 and HepG2 cell lines, breast adenocarcinoma and hepatocarcinoma respectively) to analyze a likely selectivity toward colorectal cancer, and the colorectal cancer model showed the best response to treatment. An in-deep study of the mechanism of action of the most active complexes, [Au(L2b)PPh3] and [Au(L2c)PTA], revealed that complex [Au(L2b)PPh3] inhibits both thioredoxin reductasa and cyclooxygenase-2 enzymes, leading to a redox balance disruption and apoptosis, whereas complex [Au(L2c)PTA] was able to block redox enzymes glutathione reductase and thioredoxin reductase activities as well as cyclooxygenase-1, triggering apoptotic cell death; however, its pro-apoptotic effect seems to be lower than the observed for [Au(L2b)PPh3] on the first 24h of incubation, which might be a consequence of an increase in cytoprotective autophagy as a response to treatment. Nevertheless, both derivatives are considered as multitarget complexes and apparently selective toward colorectal cancer, which might be of great interest in order to replace oxaliplatin. On the fourth chapter, a series of gold(I) and silver(I) derivatives with ligands derived from 2-anilino-pyridine were analyzed. After in-deep analyzing the biological action of complexes [Au(L1)(PPh3)](TfO) and [Ag(TfO)(L1)(PPh3)], where L1 consists of an adittional pyridine moitie, it was observed that they did not share molecular targets, at least when incubated at their IC50 values. Gold derivative [Au(L1)(PPh3)](TfO) was found to be able of inhibiting redox enzyme thioredoxin reductase and 20S proteasome, thus being a multitarget complex, whereas the mechanism of action of silver complex [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] remains unclear, although the obtained data suggest that mitochondrial disruption might lead to ROS-independent apoptosis. On the other hand treatment of Caco-2 cells with complex [Au(L1)(PPh3)](TfO) resulted in an increase of caspase 8 activation, which suggests that gold(I) derivatives might be able to trigger extrinsic apoptosis as well as the intrinsic pathway as has been widely reported previously. The lack of a shared mechanism of action between gold(I) and silver(I) derivatives might be indicative of an absence of cross-resistance among them. Lastly, in 18 this specific case, the gold complex [Au(L1)(PPh3)](TfO) might be of greater interest than its silver analogue [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] for colorectal cancer treatment, since the gold(I) derivative shows higher selectivity than its silver(I) analogue despite of displaying comparable efficacy. In summary, collected data suggets that the tested gold(I) derivatives might display a promising future as chemotherapeutic agents for colorectal cancer therapy, given their higher selectivity in comparison to reference drugs and even their greater efficacy in some cases. 19 ABREVIACIONES Δψ: potencial de membrana mitocondrial AECC: Asociación Española Contra el Cáncer AP: Acidic Polyphenol; polifenoles ácidos Apaf-1: Apoptosis Protease-Activating Factor 1; factor inductor de apoptosis 1 Auranofin: 2,3,4,6-tetra-6-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosato-S-trifenilfosfina oro(I) BSA: Bovin Serum Albumin; albúmina sérica bovina CIMP: CpG Island Methylator Phenotype; fenotipo metilador de las islas CpG CIN: Chromosomal instability; inestabilidad cromosómica Cisplatino: cis-diaminodicloroplatino(II) COX: ciclooxigenasa 2 CQ: cloroquina CRC: Colorectal Cancer; cáncer colorrectal DAPTA: 3,7-diacetil-1,3,7-triaza-5-fosfabiciclo[3.3.1]nonano DC: Drug Combination; cóctel farmacológico DHFR: dihidrofolato reductasa DMARDs: Disease-Modifying Antirheumatic Drugs DMSO: dimetilsulfóxido DTNB: 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) FBS: Fetal Bovine Serum FDA: Food and Drug Administration FITC: Fluorescein isotiocyanate GC: Gold Complex; complejo de oro GR: glutatión reductasa H2DCF-DA: 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate HSA: Human Serum Albumin; albúmina sérica 20 IAPs: Inhibitory Apoptosis Proteins; proteínas inhibitorias de la apoptosis IMe: 1,3-dimetilimidazol-2-ilideno IPr: 1,3-bis(2,6-di-i-propilfenil)imidazol-2-ilideno LADME: Liberación, Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción MLKL: Mixed Lineage Kinase Domain-Like MOMP: Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization; permeabilización de la membrana externa mitocondrial MSI: Microsatellite instability; inestabilidad de los microsatélites MTT: 3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide NAC: N-acetil-cisteína Nec-1: necrostatina-1 NF-κB: Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells NP: Neutral Polyphenols; polifenoles neutros PARP-1: poli ADP ribosa polimerasa 1 PBS: Phosphate Buffered Saline PTA: 1,3,5-triaza-7-fosfaadamantano RIP-1: Receptor Interacting Protein 1 ROS: Reactive Oxygen Species; especies reactivas de oxígeno SEOM: Sociedad Española de Oncología Médica SI: Selectivity Index; índice de selectividad SRB: Sulforhodamine B TE: Total Extract; extracto total TNF: Tumor Necrosis Factor; factor de necrosis tumoral TNFR1: TNF Receptor 1 TrxR: tiorredoxina reductasa VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor; factor de crecimiento del endotelio vascular INTRODUCCIÓN: Transformación tumoral. Aparición y desarrollo del cáncer colorrectal 27 Figura 3. Representación esquemática de los pasos de la secuencia adenoma-carcinoma en la mucosa intestinal a lo largo del tiempo. Los factores de riesgo del CRC pueden clasificarse en dos grandes grupos: modificables y no modificables (Figura 4). Los factores de riesgo no modificables pueden dividirse, a su vez, en primarios y secundarios. Los primarios son debidos a trastornos genéticos hereditarios, y son los responsables de solamente una proporción muy baja dentro del total de casos de cáncer de colon12, mientras que los secundarios son consecuencia de una enfermedad preexistente, principalmente los trastornos que se engloban bajo el término “enfermedad inflamatoria intestinal”. A este respecto es necesario matizar que, si bien el individuo no tiene control sobre la existencia previa de estos factores, sí puede, hasta cierto punto, retrasar la formación de los tumores y mejorar su pronóstico en caso de que lleguen a aparecer, a través de los factores no modificables21. Se plantearán a continuación dos ejemplos para ilustrar esta interdependencia entre los factores de riesgo no modificables y los modificables: - El síndrome de Lynch es un trastorno genético hereditario que se considera factor de riesgo no modificable de tipo primario, y está relacionado con la predisposición a sufrir diversos tipos de tumores, entre ellos el colorrectal. No obstante, no todos los pacientes que sufren esta enfermedad acaban desarrollando CRC, lo que sugiere que debe existir algún factor exógeno que influencie la aparición de este trastorno. Estudios epidemiológicos han puesto el foco sobre el tabaquismo y la obesidad como los principales factores de riesgo de desarrollar un tumor colorrectal en personas con la enfermedad de Lynch22,23. - El tabaco puede agravar también las lesiones de los pacientes de enfermedades inflamatorias intestinales y contribuir a la formación de un adenoma, ya que incrementa la inflamación de la mucosa al mismo tiempo que induce disbiosis21. INTRODUCCIÓN: Transformación tumoral. Aparición y desarrollo del cáncer colorrectal 28 Figura 4. Factores de riesgo que influyen sobre la aparición de un tumor colorrectal. Se clasifican en no modificables y modificables, los cuales a su vez pueden influir sobre los primeros al acelerar o frenar el desarrollo de la masa tumoral. Como ya se había adelantado, no cabe duda de que el estilo de vida tiene un gran peso en la aparición y el desarrollo de los tumores colorrectales. Esta influencia puede estar mediada por dos vías. Por un lado, determinados factores exógenos pueden potenciar una acumulación de potenciales carcinógenos en el tracto gastrointestinal. El tabaquismo es el mejor exponente de este supuesto, ya que entre sus componentes aparecen diversas moléculas de probado efecto mutagénico, además de ser capaces de inducir disbiosis como se ha mencionado anteriormente21. Por otro lado, el estilo de vida también puede alterar la homeostasis redox e inducir procesos inflamatorios en la mucosa intestinal. Tanto el estrés oxidativo como la inflamación crónicos pueden dar lugar a las lesiones intestinales que podrían actuar como precursoras del CRC (Figura 3). En lo relativo al papel de la dieta, es muy habitual caer en la falacia de suponer que existen alimentos protectores y alimentos dañinos. Sin embargo, no es tan importante la contribución de un único alimento concreto sino el cómputo global de alimentos consumidos por la persona a lo largo de su vida diaria lo que podría influir sobre la aparición de tumores colorrectales. En este aspecto, debe tenerse en cuenta además el impacto de la globalización sobre la dieta. Tradicionalmente, los alimentos que se consumían en una región eran los que se producían en esa zona concreta. Esto permitía hablar de patrones dietéticos muy diferentes entre sí, como la dieta mediterránea o la dieta nórdica. Ambos casos tenían en común un alto consumo de frutas y verduras, pescado azul y cereales, diferentes en cada caso dependiendo de las condiciones climáticas de cada región, entre otros muchos factores. La globalización ha difuminado las antes bien definidas fronteras entre los diferentes regímenes alimenticios a nivel mundial, permitiendo que puedan consumirse de manera habitual productos que INTRODUCCIÓN: Transformación tumoral. Aparición y desarrollo del cáncer colorrectal 29 antiguamente resultaba imposible adquirir. El principal inconveniente de esta situación aparece cuando se importan comportamientos que pueden influir negativamente sobre la salud del individuo. El más claro exponente es la denominada dieta occidental (Western Diet). La piedra angular de este patrón dietético son los alimentos ultraprocesados, ricos en grasas animales, sal y azúcares, en detrimento de un consumo regular de frutas y verduras frescas. Mientras que la adherencia a patrones dietéticos tradicionales, como es la dieta mediterránea en nuestro país, se asocia con una menor incidencia de enfermedades degenerativas, entre ellas CRC, la dieta occidental induce inflamación y disbiosis, por lo que se la considera en parte responsable de la aparición de este trastorno24–26 (Figura 5). Los países en vías de desarrollo son un claro reflejo de la relación entre dieta occidental y cáncer colorrectal, ya que la industrialización ha ido de la mano con la adopción de esta dieta y un alarmante aumento de la incidencia de la enfermedad. El incremento del número de casos unido a la ausencia de programas de detección precoz ha hecho que la tasa de muerte es mayor en estas zonas que en países con una economía más consolidada13,14. Figura 5. Representación esquemática de las principales diferencias a nivel de contenido entre la Western diet y la dieta mediterránea, así como sus principales efectos en relación al riesgo de sufrir cáncer colorrectal. De lo anterior se deduce que el consumo habitual de alimentos de origen vegetal podría tener un efecto preventivo en la aparición de los tumores colorrectales. Se cree que los responsables de ello son su contenido en fibra y polifenoles. Bajo el término fibra se engloban todos aquellos polisacáridos que no son digeridos ni absorbidos por el tracto intestinal. El destino de dichos polisacáridos es, o bien pasar a formar parte de las heces, o bien ser aprovechados por algunas bacterias de la flora intestinal; a estos últimos se les denomina prebióticos, término que no debe ser confundido con INTRODUCCIÓN: Transformación tumoral. Aparición y desarrollo del cáncer colorrectal 30 probiótico (microorganismos vivos que son administrados para modificar la flora normal del individuo, por ejemplo mediante alimentos funcionales)27. El componente mayoritario de la fibra es la celulosa, aunque también contiene almidón resistente o pectinas entre otros. El consumo de fibra se asocia, por un lado, a un aumento del tránsito intestinal y a un incremento del volumen de las heces. En consecuencia, los potenciales carcinógenos que se encuentren en el lumen van a estar más diluidos y permanecerán menos tiempo en contacto con el epitelio intestinal, reduciendo las posibilidades de que causen alteraciones genéticas21,28. Por otra parte, el potencial prebiótico de algunos de estos polisacáridos favorece la proliferación de bacterias productoras de butirato. El butirato es un ácido graso de cadena corta que promueve la expresión de genes pro-apoptóticos en las células intestinales, por lo que posee potencial antitumoral. Es un producto normal del metabolismo de las bacterias butirogénicas tras la fermentación de algunos polisacáridos. El consumo de prebióticos tiene un beneficio secundario, ya que un aumento en la proporción de bacterias butirogénicas tiene como consecuencia una disminución en el número de otras especies que pueden promover la formación de tumores, entre las que destaca Fusobacterium nucleatum12,21,29. Este potencial de los prebióticos de corregir una potencial disbiosis y reducir así el riesgo de desarrollar un tumor colorrectal puede verse beneficiado por el consumo concomitante de alimentos funcionales ricos en probióticos30, ya que contribuiría a aumentar la población de bacterias “protectoras” y disminuir a la de bacterias potencialmente peligrosas. Los polifenoles, por su parte, son un grupo de metabolitos secundarios de las plantas, heterogéneo en cuanto a su estructura química y a las funciones que desempeñan dentro del vegetal. En situación basal, los polifenoles están implicados en el desarrollo de la planta, su pigmentación o la defensa frente a patógenos fúngicos, por ejemplo, aunque son de especial interés en la respuesta adaptativa frente a diferentes tipos de estrés: sequía, suelos con alta salinidad o temperaturas extremas, por citar algunos. La planta modifica su composición fenólica, tanto en contenido como en cantidad, para aumentar sus probabilidades de éxito frente a estos factores ambientales desfavorables. También influyen factores endógenos sobre la composición fenólica, siendo el más evidente la edad del vegetal. Es decir, la composición en polifenoles de una planta estará determinada por las condiciones en las que se ha desarrollado y su edad, principalmente. De ello se deduce que dos plantas de la misma especie que hayan crecido en regiones diferentes no van a tener la misma composición en polifenoles y, por supuesto, esta composición variará incluso más entre diferentes tipos de plantas31– 34. Al margen de sus funciones en el vegetal en el que se originan, en el organismo humano los polifenoles actúan como antioxidantes y antiinflamatorios. De ahí su posible efecto preventivo en la aparición de tumores colorrectales, ya que se cree que pueden reducir la inflamación y el estrés oxidativo en la mucosa intestinal y disminuir así la posibilidad de adquirir mutaciones que conduzcan a la transformación tumoral (Figura 3). En este sentido, un estudio realizado por investigadores de la Universidad Pública de INTRODUCCIÓN: Transformación tumoral. Aparición y desarrollo del cáncer colorrectal 31 Navarra y la Universidad de Zaragoza, en el que participó la autora de la presente tesis doctoral, demostró el efecto protector de polifenoles extraídos de las partes no comestibles de la alcachofa sobre un modelo de la mucosa intestinal sometida a estrés oxidativo exógeno. Los autores sugieren que los polifenoles podrían utilizarse como ingredientes clave en nuevos alimentos funcionales que mejoren la homeostasis del colon en personas con un riesgo medio de desarrollar esta enfermedad35. No obstante, ya que el CRC es una enfermedad multifactorial, llevar un estilo de vida adecuado no es garantía de no llegar a desarrollar en algún momento un tumor colorrectal. Además, debe tenerse en cuenta que los grupos de bajo riesgo no entran en los programas de detección precoz, y dado que las etapas iniciales de la enfermedad son asintomáticas, la lesión precancerosa puede no ser extirpada a tiempo en todos los casos. Una vez que la secuencia adenoma-carcinoma se ha completado y se ha establecido un carcinoma en la región colorrectal, se pueden distinguir varias etapas de acuerdo con el grado de desarrollo e invasión del tumor. Estas etapas o estadios se correlacionan con la prognosis y determinan el tipo de tratamiento a escoger. El sistema de estadificación TNM (Tamaño-Nodo-Metástasis) es uno de los más utilizados para determinar la etapa de desarrollo de un tumor. Se basa en el análisis de tres parámetros, y el estudio conjunto de los valores obtenidos para cada parámetro determina el estadio de la enfermedad36,37. Dichos parámetros son: - Grado de invasión local (Local invasion depth; parámetro T). Hace referencia, a grandes rasgos, al tamaño del tumor y a cuántas de las capas de la pared intestinal se han visto afectadas. - Nivel de propagación a los ganglios linfáticos adyacentes (Lymph node involvement; parámetro N). Dependiendo del grado de avance del tumor, este puede afectar a los ganglios linfáticos más cercanos a la zona en la que se origina. - Presencia de metástasis en regiones distantes al punto en el que se formó inicialmente la masa tumoral (Presence of distant metastases; parámetro M). De acuerdo con estos parámetros, se obtiene finalmente la estratificación de los grados de agresividad de un tumor que se muestra en la Figura 6. INTRODUCCIÓN: Transformación tumoral. Aparición y desarrollo del cáncer colorrectal 32 Figura 6. Representación esquemática de las diferentes etapas del desarrollo del CRC, siendo 0 la etapa menos avanzada y IV la más agresiva. Los tumores en los estadios del 0 al III se eliminan mediante cirugía, aunque para los tumores en estadio III, además de los casos más graves en estadio II, es necesario llevar a cabo también un tratamiento de quimioterapia36. El abordaje de un tumor en estadio IV resulta bastante más complicado, siendo algunos de ellos incluso incurables. En este extremo se suele recurrir a la combinación de varias estrategias terapéuticas, incluyendo cirugía, quimioterapia y radioterapia38. Dependiendo de si la quimioterapia se administra antes o después de la cirugía, podemos hablar de quimioterapia adyuvante o neoadyuvante. La primera busca eliminar toda célula tumoral que haya podido permanecer en el organismo tras la cirugía, mientras que la segunda se administra previamente a la resección para disminuir el tamaño de la masa tumoral y facilitar el procedimiento. Por lo general, los tumores en estadios II y III reciben quimioterapia adyuvante, mientras que la quimioterapia neoadyuvante es más propia del estadio IV o de casos muy avanzados en el estadio III39. En cualquier caso, ambas tienen el mismo fin: causar la muerte de las células tumorales. Por consiguiente, en el próximo apartado se va a discutir en profundidad el concepto de muerte celular, así como algunas de las principales vías a través de las cuales se induce este proceso. INTRODUCCIÓN: Muerte cellular. Apoptosis, necroptosis y autofagia 33 1.2. MUERTE CELULAR. APOPTOSIS, NECROPTOSIS Y AUTOFAGIA A pesar de que en la actualidad se sabe que son varias las vías a través de las cuales puede producirse la muerte de las células, que de acuerdo con lo desarrollado hasta el momento es el objetivo último de la quimioterapia, las dos más estudiadas y, por lo tanto, mejor caracterizadas, son apoptosis y necrosis. La apoptosis o muerte programada es un procedimiento habitual en el organismo para mantener una cantidad constante de células, así como para eliminar células que hayan sufrido algún daño y no puedan realizar su función correctamente. Este proceso está altamente regulado y culmina con la activación de unas proteasas denominadas caspasas ejecutoras, las caspasas 3, 6 y 7. La función de estas caspasas ejecutoras consiste en destruir diversas estructuras del interior celular, entre las que se encuentran los filamentos de actina del citoesqueleto, de modo que se produce un cambio en la morfología celular observable mediante microscopía óptica. El encogimiento celular va acompañado de una pérdida de sus conexiones con las células adyacentes. Se produce, además, una condensación y posterior fragmentación del núcleo celular. Finalmente, la célula apoptótica deriva en una serie de pequeñas vesículas denominadas cuerpos apoptóticos. Los cuerpos apoptóticos se forman a partir de la membrana plasmática, que forma vesículas que contienen los distintos orgánulos y fragmentos del núcleo. Los cuerpos apoptóticos serán fagocitados por los macrófagos del sistema inmune, finalizando así la apoptosis40,41. Otra de las dianas de las caspasas ejecutoras son las DNAsas, que quedan activadas en consecuencia y degradan el ADN nuclear. La fragmentación del ADN se produce en un característico patrón en escalera, que tradicionalmente ha sido uno de los marcadores moleculares del proceso apoptótico al analizarlo mediante electroforesis41. La activación de las caspasas ejecutoras puede darse a través de dos vías distintas, que se diferencian en el estímulo que induce el inicio de la apoptosis (Figura 7). Por un lado, la vía extrínseca depende de la activación de los denominados receptores de muerte. Dichos receptores pertenecen a la familia de los receptores del factor de necrosis tumoral (Tumor Necrosis Factor, TNF) y se encuentran en la superficie exterior de la célula, siendo algunos ejemplos Fas, TNFR1 o Trail42. Los distintos ligandos de estos receptores se encuentran expresados en la superficie de células del sistema inmune. La unión entre ligando y receptor promueve la migración de la pro-caspasa 8 a la membrana plasmática, lo cual resulta en su activación. Una vez la caspasa 8 está activada, es responsable de la inducción de la apoptosis de manera directa o indirecta, dependiendo del tipo de célula. De acuerdo a cómo responden a la activación de la caspasa 8, se puede clasificar a las células en tipo I y tipo II. En las células tipo I, la caspasa 8 activa a las caspasas ejecutoras sin necesidad de intermediarios, mientras que en las células tipo II es necesaria la inhibición de las proteínas inhibitorias de la apoptosis INTRODUCCIÓN: Muerte cellular. Apoptosis, necroptosis y autofagia 34 (Inhibitory Apoptosis Proteins; IAPs) mediante proteínas liberadas por la mitocondria, entre las que destaca Smac43,44. La apoptosis intrínseca, por su parte, puede ser causada por una gran variedad de estímulos. A grandes rasgos, estos estímulos se pueden dividir en positivos y negativos. Los estímulos negativos son aquellas sustancias que promueven la supervivencia de la célula en condiciones normales, como algunas hormonas, citoquinas o factores de crecimiento, de modo que su ausencia en el medio extracelular supone la señal de inicio para la activación de la maquinaria apoptótica. Los factores positivos inducen daños en la célula que la hacen inadecuada para un correcto funcionamiento, por lo que debe ser eliminada. Entre estos factores se cuentan los niveles altos de especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species; ROS), infecciones víricas o la entrada de toxinas en la célula. Una gran cantidad de fármacos quimioterapéuticos, entre ellos el cisplatino45, del que se hablará más adelante, actúan como iniciadores de la vía intrínseca de la apoptosis. En respuesta a los daños producidos por los estímulos mencionados, se rompe el equilibrio entre las proteínas pro y anti-apoptóticas de la familia Bcl-2. En situación basal, ambos tipos de proteínas se encuentran en la misma proporción en el interior celular, y las anti-apoptóticas inhiben a la acción de sus análogas mediante interacciones proteína-proteína. Al romperse el equilibrio en favor de las pro-apoptóticas, entre las que destacan BAX y BAK, éstas podrán llevar a cabo su función normal, que no es otra que generar poros en la membrana externa mitocondrial. Como consecuencia, se induce un aumento de la permeabilización de la membrana externa mitocondrial (Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization, MOMP), lo que se traduce en una pérdida del potencial de membrana mitocondrial. Además, se produce la liberación de proteínas mitocondriales como la anteriormente mencionada Smac o el citocromo c. Este último resulta de especial interés por su relevancia a la hora de formar el complejo proteico denominado apoptosoma junto con Apaf-1 (Apoptosis Protease-Activating Factor 1). El apoptosoma induce la activación de la caspasa 9, la cual a su vez activará a las caspasas ejecutoras43,46. Aunque ambas vías convergen en la activación de las caspasas ejecutoras, este no es su único punto en común, ya que la caspasa 8 también es capaz de inducir la MOMP. Esto es a causa de su capacidad de activar a la proteína BID, la cual a su vez puede activar a las proteínas pro-apoptóticas BAX y BAK para que induzcan la formación de poros en la mitocondria44. INTRODUCCIÓN: Muerte cellular. Apoptosis, necroptosis y autofagia 35 Figura 7. Vías extrínseca e intrínseca de la apoptosis. Existe una estrecha relación entre la apoptosis y el avance en el ciclo celular, siendo este el conjunto de fases que conducen a la división de una célula en dos células hijas. A grandes rasgos, el ciclo celular consta de dos fases: interfase y división. Existe, a su vez, una etapa quiescente o G0, durante la cual la célula no se prepara para dividirse. En la fase G0, la célula lleva a cabo las funciones propias del tejido en el que se encuentra, y se mantendrá en este estado hasta que sea necesario dividirse, por ejemplo, al producirse algún daño en el tejido que requiera de nuevas células para sustituir a las alteradas. Cuando la célula comienza el proceso de división, pasa de este estado quiescente a la primera de las etapas de la interfase, la fase G1. El objetivo de esta etapa es controlar la integridad del genoma para asegurar la ausencia de mutaciones que pudiesen resultar en células hijas alteradas. Para ello, existen los denominados puntos de control del ciclo celular (Figura 8). A continuación, se entra en la fase S, en la que se produce la replicación del ADN. De esta etapa se pasa a la fase G2, cuya razón de ser es idéntica a la de la fase G1: asegurar que no existen errores en el nuevo ADN replicado. Estas tres etapas constituyen la interfase, que da paso a la fase M, en la que se produce finalmente la división celular47–49. La razón que subyace a la antes mencionada relación entre apoptosis y ciclo celular es que un cese en la proliferación del cultivo suele ir acompañado por un incremento en la tasa de muerte celular. Ambos procesos están estrechamente regulados por los genes supresores de tumores tales como TP53, de modo que mutaciones en los mismos conducirán no solo a una pérdida de sensibilidad hacia la muerte celular sino también a un aumento de la proliferación. Entre otras funciones, la proteína p53 es capaz de inducir un cese en el avance entre fases del ciclo celular, lo que se traduce en un dramático aumento del número de eventos en una fase en concreto, siendo las más INTRODUCCIÓN: Muerte cellular. Apoptosis, necroptosis y autofagia 36 habituales G1 y G2. Esto es debido a que, al activarse, p53 bloquea a las proteínas responsables de la transición entre fases, que son las ciclinas D y E en el caso de la transición G1-S y la ciclina B para el paso entre la fase G2 y la mitosis. Estas ciclinas constituyen los ya mencionados puntos de control del ciclo celular (Figura 8). El estudio de la distribución de las poblaciones celulares en cada fase del ciclo es un proceso habitual a la hora de determinar el posible mecanismo de acción de un compuesto, ya que los compuestos que provocan un arresto en la fase G2/M suelen causar más daños que los que lo bloquean en la fase G0/G150–52. En este sentido, el hallazgo de un aumento en la población celular en la fase G2/M podría ser una señal de alarma en relación a la toxicidad sobre tejidos sanos. Esta es una de las causas por las que la inducción de daños sobre el ADN como principal mecanismo de acción de un fármaco quimioterapéutico53,54 puede resultar potencialmente peligroso, según se discutirá más adelante. Figura 8. Transición en el ciclo celular y principales puntos de control entre fases. Existen varios puntos dignos de mención en cuanto a la interconexión entre apoptosis y cáncer. En primer lugar, en el apartado 1.1. se mencionaba la pérdida de sensibilidad a la muerte celular como uno de las principales consecuencias del proceso de transformación tumoral4,5. Al principio del presente apartado, se comentaba que una de las funciones de la apoptosis es eliminar a las células dañadas, entre las que se cuentan aquellas que han sufrido la transformación maligna. La transformación tumoral es un proceso que tiene lugar a diario en el organismo humano, ya que los errores en la replicación del ADN son algo habitual; el problema aparece cuando estas alteraciones genéticas afectan a genes relacionados con el control de la apoptosis, puesto que entonces estas células dañadas no serán eliminadas y podrán continuar proliferando, dando lugar así a un tumor. Las mutaciones en genes supresores de tumores y protooncogenes relacionadas con este respecto tienen como consecuencia principal la sobreexpresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2, de modo que impiden la activación de la vía intrínseca. Por el contrario, la expresión de las caspasas ejecutoras se encuentra en niveles muy bajos55,56. En la Tabla 1 se recogen los principales mecanismos de resistencia a la apoptosis que se relacionan con el desarrollo de las INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 43 1.3. QUIMIOTERAPIA. DESCUBRIMIENTO DE LAS PROPIEDADES ANTITUMORALES DEL CISPLATINO. Según se adelantaba en el apartado 1.1, el propósito de la quimioterapia consiste en inducir la muerte de las células tumorales mediante el uso de fármacos. El medicamento quimioterapéutico ideal debería reunir dos características: ser efectivo, es decir, resultar altamente tóxico para la célula cancerosa, al tiempo que selectivo, lo cual implica que no causa daños sobre los tejidos sanos. En la actualidad, se dispone de una amplia gama de compuestos químicos que presentan una potente acción antitumoral, pero de limitada selectividad, dando lugar a severos efectos secundarios para el paciente. En consecuencia, aunque el tratamiento logre finalmente eliminar el tumor, una lacra muy seria del tratamiento será la merma de la calidad de vida del paciente oncológico. Debe tenerse en cuenta que el término “calidad de vida” hace referencia a un concepto completamente subjetivo que engloba tanto el bienestar físico como emocional del individuo, pero que, reducido a su mínima expresión, se puede entender como una situación de bienestar en la que el individuo es capaz de llevar una vida normal con la que se encuentre satisfecho92,93. Los conceptos esperanza de vida y calidad de vida no deben, por lo tanto, confundirse. Las prácticas clínicas actuales han logrado aumentar la primera, pero esto no en todos los casos va acompañado por una mejora de la segunda. Los supervivientes del cáncer colorrectal experimentan un detrimento de su salud física que, en muchos casos, va unido a episodios de depresión y de otros trastornos psicológicos94–96. Por ello, es necesario encontrar una alternativa a las actuales opciones farmacológicas que sea selectiva además de efectiva, para mejorar tanto la calidad como la esperanza de vida de los pacientes de cáncer de colon. Los dos pilares que sostienen el desarrollo de terapias selectivas son la investigación básica y la medicina personalizada. La investigación básica es esencial para conocer las diferencias entre una célula tumoral y una célula sana, lo que permitirá identificar dianas moleculares clave y diseñar los nuevos compuestos antitumorales en consecuencia. Por otra parte, la medicina personalizada implica realizar un análisis en profundidad de las características bioquímicas de cada tumor, para así poder escoger el mejor fármaco o combinación de fármacos para un paciente en concreto. Ambas disciplinas requieren tiempo y una gran inversión económica, además de necesitar de una comunicación constante entre los investigadores y los profesionales de la medicina, pero los beneficios a obtener son inmensos. Uno de los casos más representativos del gran avance que implica la unión de ambos conceptos lo encontramos en el tratamiento del cáncer de mama. Antiguamente, se tendía a pensar que todos los tumores que se desarrollaban en una zona concreta del organismo eran iguales, por lo que se administraba el mismo tratamiento a todos los pacientes. No obstante, no todos los pacientes de cáncer de mama respondían igual a la quimioterapia, lo que resultaba en una alta tasa de mortalidad. Por ello, se decidió analizar cada tumor de manera individualizada, encontrándose diferencias significativas entre unos y otros, siendo una de las más INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 44 evidentes la expresión o no del receptor de estrógenos en las células tumorales. Esto permitió diseñar terapias dirigidas hacia esta diana, en el caso de tumores que la expresaban, y aumentar el número de curaciones de forma considerable. De igual forma, se desarrollaron nuevas estrategias terapéuticas completamente diferentes para los tumores que no expresaban el receptor de estrógenos, gracias a estudios posteriores que lograron identificar nuevas dianas moleculares específicas para cada subtipo de cáncer de mama, aumentando todavía más la eficacia de la terapia97,98. Los avances realizados a este respecto en el desarrollo de terapias frente al cáncer colorrectal son más discretos, pero no por ello desdeñables. Día a día, se caracterizan nuevos biomarcadores que permiten un diagnóstico más rápido y fiable del perfil molecular del tumor, lo que permite al oncólogo escoger el tratamiento más adecuado para cada paciente. Además, estas nuevas técnicas de diagnóstico son menos invasivas, más fidedignas y más baratas en comparación con los métodos tradicionales como la colonoscopia12,99. Es decir, en la actualidad contamos con herramientas que facilitan la toma de decisiones en lo relativo a la quimioterapia para tratar el cáncer colorrectal. A continuación, se retomará el concepto de quimioterapia adyuvante desarrollado anteriormente para ahondar en los avances de la medicina personalizada en el tratamiento de esta clase de tumor. Según la definición previa (ver apartado 1.1) la quimioterapia adyuvante busca reducir las posibilidades de recurrencia y metástasis tras extraer el tumor mediante cirugía, destruyendo a las células tumorales que hayan podido permanecer en el organismo tras la intervención. Durante el siglo XX, se tenía la creencia de que este fin podría lograrse con un único fármaco muy potente, de manera similar a recurrir a un solo antibiótico para eliminar una infección bacteriana. No obstante, como ya hemos discutido a lo largo de esta sección, el uso de agentes quimioterápicos muy potentes puede tener como consecuencia graves efectos secundarios. Así, uno de los principales avances de la medicina personalizada en la lucha contra el CRC fue el desarrollo de cócteles de fármacos, es decir, combinaciones de varios medicamentos, cada uno dirigido hacia una diana terapéutica. Esta aproximación contaba con dos grandes ventajas. En primer lugar, permitía reducir las cantidades individuales de cada compuesto, lo que suponía un menor riesgo de efectos secundarios por su acumulación a largo plazo en los tejidos sanos. Por otro lado, se aumentaba la eficacia del tratamiento al atacar a la célula tumoral por varios flancos de manera simultánea. Otra posible estrategia consiste en utilizar un único fármaco en combinación con radioterapia, ya que el tejido irradiado es más sensible a la acción del agente quimioterápico y permite utilizarlo en una dosis menor para disminuir los efectos secundarios. La Figura 11 muestra un resumen de las posibles opciones a elegir para tratar el cáncer colorrectal dependiendo del estadio en el que se encuentra, mientras que en la Figura 12 se recogen las estructuras químicas de algunos de los principales agentes quimioterapéuticos que se mencionan en la figura anterior37,39. INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 45 Figura 11. Esquematización de los tipos de quimioterapia adyuvante a administrar dependiendo del estadio en el que se encuentra el tumor colorrectal. N H 2 Pt H 2 N O OO OH N NH F O O H NN H N NH N H N O O HO HO O O H O NH 2 Oxaliplatino 5-Fluoracilo Leuvocorin Capecitabine HO OH O N N F HN O OCH 3 O N N O ON N O O O HO Irinocatecán Figura 12. Estructura química de algunos de los principales agentes utilizados en quimioterapia adyuvante frente al cáncer colorrectal. De acuerdo con la Figura 11, uno de los componentes más habituales de los cócteles de quimioterápicos utilizados frente al CRC es un derivado metálico de platino, el denominado oxaliplatino trans-L-1,2-diaminociclohexanoxalatoplatino(II). Es habitual administrarlo junto con moléculas orgánicas tales como leucovorin, 5-fluorouracilo, capecitabine o irinocatecán (Figura 12), así como con anticuerpos monoclonales. El oxaliplatino es un ejemplo interesante acerca de las ventajas de combinar investigación básica y medicina personalizada en la terapia frente al cáncer colorrectal, y para entender el avance que supuso este fármaco para los pacientes de CRC, es necesario hablar en primer lugar de su precursor, el derivado cisplatino. INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 46 Cisplatino es el nombre común que recibe el complejo cis-diaminodicloroplatino(II), cuya estructura se recoge en la Figura 13. El interés de este compuesto reside en que fue el primer compuesto de platino aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) para su uso en terapia clínica, así como el primer compuesto metálico en ser aprobado como fármaco antitumoral. Los primeros datos acerca del cisplatino datan del siglo XIX, cuando fue descrito por primera vez, pero no sería hasta los años 70 cuando se descubriría su acción anticancerígena. N H 2 Pt H 2 N O OO O Oxaliplatino H 3 N Pt H 3 N Cl Cl Cisplatino Figura 13. Estructura química de los derivados de platino cisplatino y oxaliplatino. El paso previo a este hallazgo fue un trabajo publicado en 1965 por los investigadores Rosenberg, Van Camp y Krigas, quienes observaron que al administrar este compuesto a un cultivo de la bacteria Escherichia coli se lograba reducir su crecimiento, puesto que el cisplatino impedía la división celular100. Dada la alta tasa de proliferación de las células tumorales, se planteó la posibilidad de que este compuesto actuase de manera similar a la observada sobre un cultivo de células humanas cancerosas. Así, se llevaron a cabo diversas investigaciones acerca del potencial antitumoral del cisplatino sobre distintos modelos tumorales, obteniéndose resultados muy prometedores. El gran éxito de los estudios preclínicos llegó cuando se observó un descenso del crecimiento de la masa tumoral en un modelo animal, lo que abrió la puerta finalmente a los ensayos en humanos. En esta etapa, no obstante, los resultados fueron agridulces. Por un lado, el cisplatino mostraba una alta tasa de eficacia sobre distintos tipos de tumores, tal y como cabía esperar tras los estudios previos. Sin embargo, resultaba muy tóxico para los tejidos sanos, produciendo una amplia gama de efectos secundarios entre los que destacaban los daños a nivel renal y neurológico. La alegría inicial que supuso el descubrimiento del cisplatino se enfrió al observar el descenso en la calidad de vida de los pacientes a los que se les administraba85,101. La razón por la cual el cisplatino resulta a la vez tan potente y dañino reside en su mecanismo de acción (Figura 14). Este complejo es inicialmente inactivo, y no será hasta que entre a la célula y sufra una reacción de acuación cuando será capaz de llevar a cabo su efecto biológico. En la acuación, uno o los dos ligandos cloro de la molécula son reemplazados por sendas moléculas de H2O. Este proceso ocurre espontáneamente debido a la baja concentración del ion cloruro en el interior de la célula. La especie resultante de sustituir los ligandos cloruro por moléculas de agua posee dos cargas positivas, por lo que siente una fuerte atracción por los grupos fosfato que forman parte de las cadenas de ADN. La afinidad entre el cisplatino y las bases nitrogenadas es INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 47 especialmente intensa en el caso de la guanina, con la que se une de forma covalente a través del N7 del anillo imidazol. La interacción entre el cisplatino y las bases nitrogenadas tiene como primera consecuencia la formación de un monoaducto. Los monoaductos pueden derivar en cruzamientos intra o interhebra, en caso de que se establezca una segunda interacción entre el fármaco y otra base nitrogenada. La formación de estos aductos genera torsión sobre la doble hebra de ADN, lo que le causa serios daños y es la principal causa de la muerte de la célula85,102. Aunque la célula normalmente cuenta con sistemas que reconocen específicamente los aductos ADNcisplatino y puede eliminarlos, algunos tumores poseen deficiencias en este sistema. Es por ello que unos tipos de cáncer van a responder mucho mejor a la terapia con cisplatino que otros85. Entre los tumores sobre los que es activo el cisplatino se encuentran algunos subtipos de cáncer de ovario, próstata, mama y cabeza y cuello. Sin embargo, no se utiliza de forma habitual frente al CRC dado su escaso efecto103. Figura 14. Esquematización del mecanismo de acción del cisplatino en la célula tumoral. Tras intercambiar los ligandos cloruro por moléculas de agua, se acumula en el núcleo y en la mitocondria, formando aductos tanto con el ADN genómico como con el mitocondrial. Los daños causados en el ADN mitocondrial inducen un fallo en el funcionamiento normal de la mitocondria, que tiene como consecuencia una producción excesiva de ROS. El estrés oxidativo induce, a su vez, daños sobre el ADN genómico, que ya se encontraba alterado por la previa formación de aductos con el fármaco. Esto conduce finalmente a la muerte de la célula. La formación del monoaducto inicial no siempre conduce a un cruzamiento intra o interhebra, ya que existe la posibilidad de que se forme un aducto ADN-cisplatinoproteína, debido a la atracción entre el fármaco activado y los grupos tiol de las proteínas. Las proteínas que intervienen en esta clase de aductos son las que normalmente se encuentran en estrecha conexión con el ADN, entre ellas las histonas, y estos aductos terciarios bloquean el acceso al resto de proteínas que deben INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 48 interaccionar con el ADN. Por ello, se impiden procesos como la replicación o la reparación del ADN, contribuyendo a la muerte de la célula85,104. La atracción entre el ADN y el cisplatino no se limita al ADN genómico, sino que el ADN mitocondrial también es susceptible de formar aductos con el fármaco. Esto genera un fallo en este orgánulo que da lugar a altos niveles de especies reactivas de oxígeno. El estrés oxidativo induce daños sobre distintas estructuras celulares, siendo uno de los más graves el generado sobre el ADN105. Las células tumorales, además, son especialmente sensibles a la ruptura de su homeostasis redox, ya que generan una mayor proporción de ROS que una célula sana por su alta tasa de proliferación. Para compensar esta producción excesiva, sus defensas antioxidantes están sobreexpresadas en comparación con las de una célula no tumoral, pero se establece así un equilibrio muy delicado cuya ruptura tiene como consecuencia inevitable la muerte de la célula tumoral106. Se ha observado que el estrés oxidativo que se genera en respuesta a este tratamiento es un componente necesario para la muerte de la célula tumoral inducida por el cisplatino junto con la formación de aductos con el ADN (Figura 14)107. Retomando las consideraciones iniciales en relación a la importancia de que un fármaco sea al mismo tiempo efectivo y selectivo, no debe resultar sorprendente que el uso clínico del cisplatino se vea limitado por sus graves efectos secundarios. Al estar su mecanismo de acción basado en su atracción por las bases nitrogenadas del ADN y en la producción de estrés oxidativo, que está mediada a su vez por su capacidad de dañar al ADN mitocondrial, no se dirige contra una diana molecular exclusiva de la célula tumoral, ya que esta macromolécula está presente en todas y cada una de las células del organismo. Se trata, pues, de un compuesto con una selectividad prácticamente nula. Por ello, causará serios daños sobre células cuya tasa de proliferación sea alta y, además, en las que sean especialmente sensibles al estrés oxidativo. Según se adelantaba en el apartado 1.2, los daños en el ADN tienen como consecuencia un cese del avance en el ciclo celular en la fase G2/M, lo que se corresponde con graves alteraciones a nivel celular52. La Tabla 3 recoge las principales estructuras afectadas por la terapia con cisplatino. A estos efectos secundarios consecuencia de un tratamiento de duración determinada, debe añadírseles el riesgo de que la terapia dé lugar a nuevos tumores, en especial leucemias, dado el potencial efecto mutágeno del fármaco a largo plazo53,54. INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 49 Tabla 3. Resumen de las principales regiones del organismo afectadas por el cisplatino y de las consecuencias que ello conlleva para el paciente. REGIÓN AFECTADA CONSECUENCIA REFERENCIA CÉLULAS DE LA CÓCLEA Pérdida irreversible de la audición Sheth et al . 108 CÉLULAS TUBULARES RENALES Insuficiencia renal aguda Volarevic et al . 109 CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS DE LA MÉDULA ÓSEA Mielosupresión Basu et al . 53 CÉLULAS EPITELIALES DEL TRACTO GASTROINTESTINAL Trastornos gastrointestinales: mucositis, náuseas, diarrea, malabsorción, etc. Shahid et al . 110 Además de que su uso clínico implique serios riesgos para la salud del paciente, existe un problema adicional a la terapia con cisplatino: la creciente resistencia de los tumores al tratamiento. Como su propio nombre indica, la resistencia a un medicamento supone una pérdida de su capacidad farmacológica debido al desarrollo de mecanismos adaptativos por parte de la célula tumoral. La resistencia a un medicamento puede ser intrínseca o adquirida. La primera clase implica que el tumor jamás responderá a ese tratamiento; en el segundo caso, el tratamiento funcionaría inicialmente, pero pasado un tiempo perdería su efecto por completo. Esto es un fenómeno frecuente en los tumores que reaparecen tras una remisión inicial111. En este punto, resulta interesante introducir los conceptos de quimioterapia de primera elección y quimioterapia de segunda elección, ya que esta última es a la que se recurre cuando falla la primera opción, frecuentemente en relación a la aparición de resistencias. En el caso concreto del cisplatino, existen varias estrategias que las células tumorales pueden llevar a cabo para sobrevivir a la terapia83–85, entre las que se encuentran: - Sobreexpresión de los sistemas de reparación del ADN: se incrementan los niveles de expresión de aquellas proteínas que reconocen y eliminan los aductos cisplatino-ADN, evitando el daño y, en consecuencia, la muerte celular. - Descenso en los niveles de expresión del transportador que permite la entrada en la célula del cisplatino: con esto, la célula logra una menor concentración intracelular del fármaco, lo que disminuye su efecto antitumoral. - Aumento en la expresión de transportadores de membrana que expulsan al cisplatino del interior celular: el efecto final es el mismo que en el caso anterior. INTRODUCCIÓN: Quimioterapia. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino 50 - Inactivación mediante la conjugación con glutatión o metalotioneínas: esta propiedad se basa en la capacidad del complejo de establecer uniones no específicas con diversas estructuras del interior celular, entre las que se encuentran, como se ha mencionado anteriormente, las proteínas. Los aductos resultantes no son tóxicos para la célula. - Desregulación de la maquinaria apoptótica: según se adelantaba en el apartado 1.2, algunos tumores pueden desarrollar una pérdida de sensibilidad a la muerte vía apoptosis en respuesta a una exposición prolongada a un medicamento66,67. En el caso concreto del cisplatino, los mecanismos más habituales son los que implican la ruptura del equilibrio entre proteínas pro y anti-apoptóticas. INTRODUCCIÓN: Búsqueda de soluciones a las limitaciones del cisplatino 51 1.4. BÚSQUEDA DE SOLUCIONES A LAS LIMITACIONES DEL CISPLATINO A la vista de los problemas derivados del uso clínico del cisplatino, durante los últimos años se han llevado a cabo numerosos intentos con el fin de reducir sus efectos secundarios y/o evitar la resistencia adquirida por los tumores. Estas estrategias podrían englobarse en tres grupos: uso de nanoportadores, diseño de análogos a partir de modificaciones de la estructura química del cisplatino y desarrollo de terapias combinatorias. El objetivo de los nanoportadores o nanocarriers consiste en facilitar la llegada del fármaco al microentorno tumoral. Con esto se consigue, por un lado, maximizar la cantidad del agente quimioterápico que entra en las células cancerígenas, con lo que la eficacia del tratamiento aumenta considerablemente. Por otro, se reduce la concentración de fármaco en el resto de tejidos, para disminuir los efectos secundarios. Existen otras ventajas al margen de estos dos puntos clave, entre las que se encuentran aumentar la vida útil del fármaco, puesto que su exposición a agentes reductores y/u oxidantes se ve reducida, o facilitar su entrada en la célula, especialmente útil para moléculas con un marcado carácter hidrófilo112. Un ejemplo de nanocarrier que ha sido fruto de numerosas investigaciones durante los últimos años son las nanopartículas de oro, ya que presentan una serie de propiedades que las hace muy interesantes para el transporte de fármacos quimioterapéuticos en el organismo. Destaca su capacidad de funcionalizarlas para maximizar su concentración en el microentorno tumoral113. El uso de nanopartículas de oro para mejorar la terapia con cisplatino permite aumentar la eficacia del tratamiento a la par que reducir sus efectos secundarios114–117. No obstante, los nanocarriers también pueden dar problemas por su toxicidad intrínseca118, por lo que esta estrategia todavía debe ser optimizada para poder utilizar con seguridad a aquellos agentes quimioterapéuticos que, como el cisplatino, sean potencialmente dañinos para los tejidos sanos. Por otra parte, modificar la estructura química del cisplatino para reducir sus efectos secundarios ha conducido a la síntesis de toda una serie de análogos del mismo, algunos de los cuales han sido aprobados por la FDA y posteriormente a nivel mundial (carboplatino y oxaliplatino), mientras que otros son utilizados en países concretos (lobaplatino en China, heptaplatino en Corea del Sur y nedaplatino en Japón) (Figura 15). La primera oleada de análogos del cisplatino que se desarrollaron tras el descubrimiento de sus propiedades antitumorales en los años 60 se denominaron análogos de segunda generación, entre los que destaca el carboplatino. Este complejo se diferencia de su predecesor en que los ligandos cloruro fueron sustituidos por el ligando bidentado del tipo dicarboxilato que le confiere mayor estabilidad al formar un quelato. Su efecto antitumoral es comparable al del cisplatino, pero sus efectos secundarios son menores, especialmente a nivel hematológico. No obstante, el carboplatino no responde igual de INTRODUCCIÓN: Búsqueda de soluciones a las limitaciones del cisplatino 52 bien frente a todos los tipos de tumores que sí se ven afectados por el tratamiento con cisplatino119,120. Por consiguiente, se continuaron sintetizando análogos del cisplatino, llegando así a la denominada tercera generación de análogos. De los análogos de tercera generación se va a resaltar al oxaliplatino, puesto que, este complejo es ampliamente utilizado en el tratamiento del cáncer colorrectal (ver apartado 1.3; Figura 11). N H 2 Pt H 2 N O OO O Oxaliplatino H 3 N Pt H 3 N O O Carboplatino O O N Pt N O O O Lobaplatino N Pt N O O O O Heptaplatino O OH 3 N Pt H 3 N O OO Nedaplatino H 2 H 2 H 2 H 2 Figura 15. Estructuras de los diferentes análogos del cisplatino. El oxaliplatino presenta diferencias significativas respecto a la sencilla estructura química de su predecesor. En primer lugar, los ligandos amoniaco del cisplatino son sustituidos por el ligando bidentado diaminociclohexano, mientras que los dos átomos de cloro son reemplazados por el anión oxalato. Dicho anión resulta clave para su funcionamiento, ya que en plasma es reemplazado y permite la activación de la molécula, lo que en el caso de su predecesor ocurría en el interior celular con la reacción de acuación. En cuanto a su mecanismo de acción (Figura 16), el oxaliplatino activado siente la misma atracción por las bases nitrogenadas del ADN que el cisplatino, por lo que va a formar aductos y cruzamientos intra e interhebras de igual manera. El efecto final, por lo tanto, será dañar el ADN e impedir su replicación y reparación. Sin embargo, la presencia del ligando diaminociclohexano en la molécula de oxaliplatino es la responsable de que este fármaco ocasione una mayor torsión sobre la hebra de ADN, causando lesiones más severas que el cisplatino y resultando, en consecuencia, un quimioterápico más activo. Curiosamente, el oxaliplatino forma menos aductos con el ADN que el cisplatino, lo cual es indicativo de la existencia de otros mecanismos de acción adicionales121,122. Dado que, según se mencionaba anteriormente, la inducción de estrés oxidativo es fundamental para el mecanismo de acción del cisplatino (ver apartado 1.3, pág. 45; Figura 14), cabría pensar que su análogo oxaliplatino podría igualmente causar una ruptura del equilibrio redox como parte de su efecto anticancerígeno, especialmente si se tiene en cuenta la existencia de los mecanismos de acción adicionales a la formación de aductos con el ADN. No obstante, se han realizado escasas investigaciones a este respecto. De acuerdo con la Figura 11 (apartado 1.3, pág. 46), es habitual administrar al oxaliplatino en combinación con anticuerpos monoclonales para el tratamiento de INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 59 1.5. USO DEL ORO EN MEDICINA. DESCUBRIMIENTO DE LAS PROPIEDADES ANTITUMORALES DEL AURANOFIN Entre la amplia gama de metales a los que puede recurrir la quimioterapia, el oro ocupa un lugar destacado. La relación entre el oro y la medicina viene de lejos, puesto que las primeras pruebas que se tienen acerca de su uso con fines terapéuticos datan del año 3000 a.c. aproximadamente. Los primeros registros acerca del uso del oro con fines no ornamentales aparecen en la cultura egipcia, si bien se le atribuían propiedades más místicas que terapéuticas, en relación al mantenimiento de la juventud y la vitalidad. Mejor documentada está la práctica médica en la antigua China, ya que se describen con detalle distintos remedios que incluían oro para tratar diversas afecciones, como el uso de polvo de oro para sanar heridas. Otras interesantes propiedades que se le atribuían estaban relacionadas con el alivio de la tos o la cura de la fiebre tifoidea153,154. No obstante, con el paso de los años las propiedades que realmente pudiese tener el oro sobre el organismo se perdieron en favor de un retorno a este misticismo que cultivaban los antiguos egipcios. Durante la Edad Media, los alquimistas volvieron a pensar en el oro como la clave de la juventud eterna, y buscaron nuevos métodos para obtener el mayor grado de pureza del metal, así como intentos de transmutar otros metales en oro. Evidentemente, estos intentos quedaron en nada, y en el siglo XV se retomó el estudio de las propiedades médicas del oro, aunque no sería hasta algunos siglos después cuando se lograsen avances significativos en este campo. El primer hallazgo realmente científico acerca del potencial terapéutico del oro recae sobre Robert Koch y su descubrimiento de las propiedades bacteriostáticas del complejo de oro(III) K[Au(CN)2]155. Su estudio resultó de gran relevancia, dado que escogió como modelo bacteriano al bacilo de la tuberculosis, el causante de una de las grandes epidemias de la época, ya que en el siglo XIX la tuberculosis era la primera causa de muerte en Estados Unidos156. No obstante, los ensayos sobre pacientes revelaron que este compuesto no solo no era efectivo frente al bacilo in vivo, sino que además resultaba muy tóxico, por lo que se dejó de administrar pasados unos años. De igual manera que la medicina moderna ha intentado reducir la toxicidad del cisplatino diseñando nuevos análogos, la lucha contra la tuberculosis en el siglo XX buscó nuevos compuestos de oro cuyo uso clínico resultase más seguro. Si bien se terminó descartando esta investigación por infructuosa, se observó que algunos pacientes a los que se les administraban tiolato derivados de oro(I) notaban una mejoría en el dolor articular. Esto hizo sospechar a los investigadores de la época que sus complejos podrían tener una aplicación en medicina alejada de la que habían buscado inicialmente, así que se abrió una nueva vía de investigación en el campo de la artritis reumatoide. A diferencia de lo que había ocurrido en el tratamiento de la tuberculosis, frente a esta otra enfermedad se obtuvieron éxitos notables157–159. Algunos de los principales INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 60 complejos de oro que se han utilizado en la práctica clínica por sus beneficios frente a la artritis reumatoide se muestran en la Figura 18. Figura 18. Estructura de una serie de complejos de oro(I) utilizados en el tratamiento de la artritis reumatoide. Se acuño así el término “crisoterapia”, que hace referencia precisamente al uso de complejos de oro en medicina. Los que se muestran en la Figura 18 son una serie de tiolatos de oro(I) que pertenecen al grupo de medicamentos antirreumáticos modificadores de la enfermedad o DMARDs (Disease-Modifying Antirheumatic Drugs). A pesar de que los DMARDs no hacen desaparecer la enfermedad, tienen un efecto beneficioso retrasando su curso natural. En el caso concreto de los complejos recogidos en la Figura 18, su administración intravenosa reducía los síntomas asociados a la enfermedad gracias a su efecto antiinflamatorio. Los primeros en ser comercializados fueron el tiomalato sódico de oro o Miocrisina™ y la aurotioglucosa o Solganol™, pero su uso no reportó grandes beneficios para los pacientes porque ejercían su efecto terapéutico a largo plazo, lo cual aumentaba el riesgo de sufrir efectos secundarios, entre los que destacaban nefrotoxicidad y diversos problemas cutáneos158–160. El desarrollo del auranofin (2,3,4,6-tetra-6-acetil-1-tio-β-D-glucopiranosato-Strifenilfosfina oro(I)) supuso un gran avance en el campo de la crisoterapia, aunque en su momento no se pudiese intuir la repercusión que este compuesto acabaría teniendo en la medicina moderna. Al igual que sus predecesores, el auranofin posee un centro metálico de oro(I), aunque presenta la novedad de tener dos ligandos coordinados al mismo: una molécula de trietilfosfina y un grupo tiolato de tipo carbohidrato (tioglucosa). La fosfina le dota de carácter lipófilo, por lo que tiene una mayor solubilidad que los complejos anteriores, lo que permitió que fuese administrado por vía oral en lugar de intravenosa. Pero, aunque su toxicidad sobre los tejidos sanos fuese menor que la mostrada por sus predecesores, su efecto terapéutico también era menos acusado. Por ello, se fue reduciendo su uso frente a la artritis reumatoide158,159. No obstante, se observó una menor predisposición al desarrollo de tumores en aquellos pacientes de artritis reumatoide que habían sido tratados con auranofin161. Este hecho, junto con el descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino y sus análogos, animó a los investigadores a evaluar el efecto del auranofin sobre diversas líneas tumorales162–167, encontrándose resultados esperanzadores que condujeron a resultados in vivo. Así, se comenzaron a sintetizar nuevos análogos de este INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 61 complejo y se continuaron los ensayos, llegándose a la conclusión de que el oro podría tener un futuro muy prometedor en la lucha contra el cáncer158,159. El oro puede presentar varios estados de oxidación, siendo los estados I y III los únicos en los que es estable en un medio acuoso, por lo que son los más interesantes de cara a diseñar fármacos. Los complejos de oro(I) presentan ciertas ventajas frente a los de oro(III), ya que son más estables desde un punto de vista termodinámico y además son menos susceptibles de ser reducidos a oro metálico. No obstante, la síntesis de complejos de oro(III) podría presentar ventajas significativas en el campo de la quimioterapia, puesto que es isoelectrónico con el cisplatino (ambos poseen una configuración electrónica d8), dando una geometría plano cuadrada. Se pensaba, por consiguiente, que los complejos de oro(III) podrían poseer un mecanismo de acción similar al del cisplatino, así como un efecto terapéutico comparable158,159,168. A pesar de que a priori poseen una menor estabilidad que los complejos de oro(I), una adecuada elección de ligandos de coordinación ha permitido sintetizar numerosos derivados de oro(III) con un interesante potencial anticancerígeno, según puede observarse en exhaustivas revisiones bibliográficas realizadas durante los últimos años168–177. A pesar de que la presente memoria se va a centrar en el papel antitumoral de los complejos de oro(I), existen algunos puntos interesantes a considerar en cuanto al potencial clínico de los complejos de oro(III). Dadas sus similitudes con el cisplatino, podría pensarse que el uso de estos derivados podría dar lugar igualmente a graves efectos secundarios debido a una hipotética capacidad de interaccionar con el ADN. Aunque sí se han descrito algunos casos en los que la interacción directa con esta macromolécula parece ser uno de sus mecanismos de acción178–180, también se han identificado otras dianas moleculares diferentes y de gran interés en terapia. Por ejemplo, destaca la capacidad de algunos derivados de oro(III) de inducir una disminución en los niveles de expresión de la ciclina B1, lo que induce un cese del avance en el ciclo celular en la fase G2/M181, o la afinidad que muestran otros complejos de esta clase de inhibir a la enzima poli ADP ribosa polimerasa 1 (PARP-1), de modo que pueden bloquear la reparación del ADN182– 184. Estos estudios muestran que, a pesar de las características que comparten el cisplatino y los complejos de oro(III), estos últimos tienen un mayor potencial antitumoral en cuanto a las dianas moleculares con las que pueden interaccionar, de modo que poseen un interesante y prometedor futuro en quimioterapia. Por su parte, el potencial anticancerígeno de los complejos de oro(I) ha sido objeto de un mayor número de investigaciones durante los últimos años. Solamente en lo respectivo a su uso frente al cáncer de colon se han publicado alrededor de un centenar de artículos científicos, centrados en la síntesis y caracterización de complejos tanto mononucleares como dinucleares. Los avances más recientes han sido recogidos en una revisión en la que participó la autora de la presente tesis doctoral113; en dicho artículo, se detalla el mecanismo de acción de complejos de tipo fosfino derivados mono y dinucleares con fosfinas mono y bidentadas, complejos con ligandos S-dadores, carbeno INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 62 derivados, entre los que se cuentan los biscarbeno complejos, en su mayoría mononucleares y, por último, los alquinil derivados, de los que se incluye un menor número de ejemplos. Además, los ensayos realizados en el marco de esta tesis doctoral se han centrado, principalmente, en el uso de complejos de oro(I) como potenciales agentes quimioterapéuticos frente a cáncer colorrectal. Los complejos de oro(I) presentan de forma general una geometría lineal. El centro metálico puede estar coordinado a diferentes tipos de ligandos para modificar sus propiedades químicas y biológicas. A diferencia de lo que ocurría en el proceso de activación del oxaliplatino, esta clase de complejos no suelen sufrir procesos de acuación; sin embargo, los ligandos pueden intercambiarse por biomoléculas una vez en el interior de la célula158,159. Al ser un ácido blando185, el oro(I) siente una especial atracción por los átomos de azufre y selenio, pero no tanta por el nitrógeno como les ocurre a los derivados de platino, ni por el oxígeno. Es por ello que los complejos de oro(I) van a presentar una menor afinidad por el ADN que el cisplatino y sus análogos en condiciones fisiológicas186. En su lugar, estos complejos interaccionan principalmente con los grupos tiol de proteínas y péptidos, en especial por aquellas que contengan azufre y/o selenio como las selenoproteínas. Las selenoproteínas son un grupo de proteínas que contienen el residuo selenocisteína. La selenocisteína es una modificación del aminoácido esencial cisteína, y dada su importancia en el correcto funcionamiento del organismo, existe una corriente de investigadores que la consideran un aminoácido esencial más. Por lo general, el residuo selenocisteína se localiza en el centro activo de estas proteínas y es clave para su función, que suele estar relacionada con reacciones de oxidación-reducción187. Destaca como selenoproteína de gran interés para el propósito de la presente tesis doctoral la tiorreoxina reductasa (TrxR), el posible punto de convergencia entre el efecto antitumoral del auranofin y su uso como DMARD. La TrxR es una oxidorreductasa que forma parte del sistema tiorredoxina, necesario para el mantenimiento de la homeostasis redox en el interior celular. Este sistema, que se encuentra tanto en el citosol como en el interior mitocondrial, cuenta con tres componentes: la tiorredoxina, la tiorredoxina reductasa y el NADPH. La Figura 19 muestra el ciclo de reacciones oxidación-reducción que caracterizan a este sistema. La función de este sistema redox consiste en activar a las peroxidasas intracelulares para que éstas puedan eliminar activamente el peróxido de hidrógeno. Esta activación es llevada a cabo por la tiorredoxina, mediante el traspaso de electrones provenientes del NADPH. En el proceso, la enzima queda oxidada y debe volver a su forma reducida para ser funcional de nuevo. Es aquí cuando interviene la TrxR, quien toma los electrones del NADPH en primer lugar y los transfiere a la tiorredoxina oxidada, completando el ciclo. Es decir, ni la tiorredoxina ni la tiorredoxina reductasa son enzimas con capacidad INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 63 antioxidante per se, sino que su contribución sobre el equilibrio redox es indirecta, aunque no por ello menos importante188,189. Como puede observarse en la Figura 19, los tres componentes del sistema tienen el mismo peso en el proceso, y la ausencia o el malfuncionamiento de cualquiera de ellos conduciría a un incremento en los niveles de ROS que tendría consecuencias catastróficas para la célula. Esto es debido a que, como adelantábamos al describir el mecanismo de acción del cisplatino (ver apartado 1.3, pág. 45; Figura 14) y del oxaliplatino (ver apartado 1.4, pág. 54Figura 16), los radicales libres dañan distintas estructuras del interior celular y tienen un papel clave en la inducción de la muerte celular105,107,123. Al contribuir al correcto mantenimiento de los niveles de ROS, el sistema tiorredoxina y, por extensión la TrxR, están involucrados en el control de numerosos procesos celulares de gran importancia, entre los que se cuentan la progresión en el ciclo celular o la regulación de la muerte celular188. Figura 19. Funcionamiento del sistema antioxidante tiorredoxina. La tiorredoxina activa a las peroxidasas intracelulares al donarle los electrones que provienen del NADPH, quedando oxidada durante el proceso. Al transmitirle los electrones del NADPH, la tiorredoxina reductasa es capaz de reducir a la tiorredoxina oxidada y devolverla así a un estado funcional. Dada la relevancia del sistema tiorredoxina para la célula, existe un segundo sistema antioxidante que sirve como refuerzo en caso de que esté comprometido: el sistema glutatión-glutarredoxina (Figura 20). Este sistema se compone de cuatro elementos: NADPH, glutatión reductasa (GR), glutatión y glutarredoxina. La GR pertenece a la misma familia de oxidorreductasas que la TrxR, aunque se diferencian en que la primera no es una selenoproteína. Pese a esto, la función de ambas enzimas es prácticamente idéntica: transferir electrones del NADPH a otra entidad, que en este caso es el péptido glutatión, para finalmente activar a la glutarredoxina, encargada final del mantenimiento de la homeostasis redox mediante la activación de las peroxidasas celulares, al igual que la tiorredoxina. No obstante, la glutarredoxina tiene una actividad al margen de su función antioxidante indirecta, que no es otra que la activación de ciertas proteínas, como por ejemplo la ribonucleasa, mediante la reducción de puentes disulfuro que se hayan podido formar en un entorno con un marcado carácter pro-oxidante. Esto hace que el sistema glutatión-glutarredoxina esté implicado en procesos celulares como la síntesis INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 64 de los desoxirribonucleótidos del ADN. Finalmente, la glutarredoxina es capaz de cederle electrones a la tiorredoxina oxidada cuando la TrxR es incapaz de hacerlo, de ahí su papel como refuerzo del sistema tiorredoxina cuando su actividad puede verse comprometida que se mencionaba antes189,190. Figura 20. Funcionamiento del sistema glutatión-glutarredoxina. La glutatión reductasa (GR) transfiere los electrones del NADPH al péptido glutatión, quien a su vez se los transfiere a la glutarredoxina. Una vez activada, la glutarredoxina puede transferir sus electrones a la tiorredoxina, en caso de que la actividad de la tiorredoxina reductasa se encuentre comprometida, o bien activar a otras proteínas al reducir los puentes disulfuro que se hayan podido formar en un ambiente pro-oxidante. Aunque su defecto pueda estar relacionado con la aparición de patologías, también un excesivo funcionamiento del sistema tiorredoxina puede contribuir a la aparición o al desarrollo de ciertas patologías. La artritis reumatoide parece ser una de estas enfermedades relacionadas con la sobreexpresión de tiorredoxina y TrxR. Ambas proteínas se encuentran en una cantidad muy superior a lo esperado en el líquido sinovial de las regiones inflamadas de pacientes de este trastorno191. Erróneamente, podría suponerse que la sobreexpresión de los componentes del sistema es un mecanismo para combatir el estrés oxidativo que promueve el desarrollo de esta enfermedad. No obstante, el efecto real es el contrario. La tiorredoxina promueve el reclutamiento y la maduración de las células dendríticas, quienes secretan citoquinas pro-inflamatorias y contribuyen al progreso del trastorno192. De ahí el potencial terapéutico del auranofin frente a la artritis reumatoide. Al ser una selenoproteína, el auranofin se va a sentir naturalmente atraído hacia la TrxR. Si esta enzima, además, está sobreexpresada, las posibilidades de que fármaco y enzima se encuentren en el medio extracelular o intracelular se multiplican. Así, se piensa que el efecto anti-inflamatorio de este compuesto puede estar mediado por la inhibición de la actividad normal de la tiorredoxina reductasa. Al inutilizar a la TrxR, todo el sistema tiorredoxina deja de funcionar, generando un gran estrés oxidativo que causa INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 65 la muerte de aquellas células que sobreexpresen a los componentes de este sistema, que como se ha mencionado anteriormente son las responsables de la liberación de citoquinas pro-inflamatorias192,193. También se ha encontrado una sobreexpresión de la tiorredoxina reductasa en algunos tipos de tumores, siendo especialmente llamativo el caso del cáncer colorrectal. Dado que las células tumorales producen una mayor cantidad de ROS que las células sanas por su rápido metabolismo, también cuentan con una mayor expresión de los sistemas de defensa antioxidante para compensar. El estudio de los niveles de expresión de la TrxR se utiliza para determinar la prognosis de un tumor, ya que cuanto mayor sea este valor, más alto será el grado de agresividad de la enfermedad187,188. Se establece así un paralelismo entre la artritis reumatoide y el cáncer, siendo el punto de convergencia los niveles anormalmente altos de TrxR y la efectividad del auranofin frente a ambos trastornos, por lo demás tan diferentes. Efectivamente, diversas investigaciones independientes apuntan a esta enzima redox como la principal diana terapéutica del auranofin194. En general, los complejos de oro(I) que se han sintetizado y evaluado durante la última década comparten con su predecesor la capacidad de inhibir a la TrxR, por lo que se han destinado grandes esfuerzos a mejorar la interacción complejo-enzima y así aumentar la efectividad de la terapia113,195,196. Esta estrategia cuenta, además, con la ventaja de ser selectiva frente a las células tumorales, puesto que su sensibilidad al estrés oxidativo es mayor que la de una célula normal106. En consecuencia, los complejos de oro podrían ser una alternativa igual o más eficaz que los de platino frente al CRC, y, dado que su mecanismo de acción parece más selectivo, su toxicidad en tejidos sanos podría ser menor. Además, varios derivados han sido probados con éxito sobre líneas celulares resistentes a cisplatino, lo que apunta a un posible uso de los complejos de oro(I) en tumores resistentes a las estrategias terapéuticas tradicionales197,198. También es interesante, aunque haya sido objeto de menores investigaciones hasta el momento, la capacidad del auranofin de inhibir la expresión de la isoforma mitocondrial de esta enzima (TrxR2)164, ya que apuntaría a una posible capacidad de los derivados de oro(I) a inhibir la acción de esta enzima no solo de forma directa, sino también indirecta. De acuerdo con investigaciones posteriores, el mecanismo de acción del auranofin no se limita a la inhibición de la TrxR, sino que existen otras dianas moleculares con las que podría interaccionar. Es relativamente reciente el descubrimiento de la capacidad de este complejo de interferir con el sistema ubiquitina-proteasoma, responsable de la renovación proteica en el interior celular. El proteasoma es una estructura proteica cuya función principal es la proteólisis, es decir, la degradación enzimática de proteínas, con lo que evita la formación de agregados proteicos que están detrás de diversos trastornos199–205. Está compuesto por dos subunidades, la 19S o partícula reguladora, que prepara al sustrato para la degradación, y la 20S, la partícula central, la que posee la actividad proteasa. Como paso previo a su destrucción en el proteasoma, las enzimas INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 66 ubiquitinasas añaden residuos de ubiquitina a aquellas proteínas que van a ser degradadas, entre las que se cuentan no solo las viejas sino también las mal plegadas. Los residuos de ubiquitina son identificados por el proteasoma, lo que permite que la proteólisis sea selectiva y controlada206–208. Dada su capacidad proteolítica, el proteasoma está directamente relacionado con el control de diversos procesos celulares, entre los que se cuentan la progresión en el ciclo celular, la respuesta inmune o la muerte celular. Además, resulta crucial para la respuesta a diversos estreses, ya que debe eliminar a las proteínas que se dañen como consecuencia206–209. Por ello, según se ha mencionado anteriormente, alteraciones en el proteasoma que le impidan realizar su función normal son la base de diversas enfermedades, entre las que destacan las neurodegenerativas199–202. Por otra parte, de forma similar a lo que ocurría en el caso de la tiorredoxina reductasa, algunas células tumorales, entre las que se encuentran las de CRC, tienen una dependencia muy alta del proteasoma. Existen varias razones que lo explican. En primer lugar, las células transformadas se valen de su proteasoma para eliminar a las proteínas que controlan el avance en el ciclo celular, para así poder continuar con su alta tasa de proliferación; también lo utilizan para degradar a las proteínas resultantes de la expresión de los genes supresores de tumores. Por otra parte, el proteasoma es responsable de la activación del factor de transcripción NF-κB, que está directamente implicado en el desarrollo tumoral al inducir la síntesis de citoquinas pro-inflamatorias y de proteínas anti-apoptóticas. En situación basal, el factor NF-κB se encuentra retenido en el citoplasma por la proteína IκB, que es ubiquitinada en presencia de citoquinas proinflamatorias y posteriormente degradada en el proteasoma; esto permite que el factor NF-κB migre al núcleo, donde promueve la transcripción de los genes relacionados con los procesos antes mencionados (inflamación e inhibición de la apoptosis)210. Por estos motivos, el uso de inhibidores del sistema ubiquitina-proteasoma con fines quimioterapéuticos resulta una aproximación interesante. Uno de los ejemplos más representativos es el anticuerpo bortezomib, capaz de inhibir la función proteasomal en un 30%, de modo que es tóxico para una célula tumoral pero no para una célula sana210. A la vista de estos datos, el sistema ubiquitina-proteasoma puede ser considerado como una diana específica de cáncer colorrectal, de forma similar a lo que ocurre con la tiorredoxina reductasa. El tratamiento con auranofin causa un incremento en los niveles de proteínas ubiquitinadas en el interior celular. Este efecto está mediado por una inhibición de las deubiquitinasas asociadas a la subunidad 19S; es decir, el tratamiento no afecta directamente a la actividad proteolítica de la subunidad 20S, pero al impedir la deubiquitinación ésta se bloquea y se acumulan proteínas viejas y/o mal plegadas en el interior celular, causando la muerte de la célula. La inhibición de este sistema es parte esencial de la inducción de muerte mediada por este complejo de oro(I), tanto o más INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 67 como la inhibición de la TrxR. A esta conclusión llegaron Liu et al. tras realizar una serie de ensayos sobre la línea HepG2 en presencia de dos compuestos antioxidantes: Nacetil-cisteína y terbutil hidroquinona. El primero de ellos, además de ser capaz de reducir los niveles de ROS en el medio intracelular, causa un cambio estructural en la molécula de auranofin que le impide llevar a cabo la inhibición de las deubiquitinasas, de modo que revierte por completo su letalidad sobre las células tumorales. La terbutil hidroquinona, sin embargo, solamente tiene función antioxidante, de modo que reduce la capacidad del auranofin de causar la muerte celular, pero no la elimina completamente211. Por lo tanto, tanto la inhibición de la función proteasomal como de la tiorredoxina reductasa son elementos necesarios para el efecto antitumoral del auranofin. Figura 21. Esquematización del mecanismo de acción del auranofin en la célula tumoral. Una vez en el interior de la célula, el auranofin es capaz de bloquear la actividad de la isoforma citoplasmática de la enzima redox tiorredoxina reductasa, causando un aumento de radicales libres que contribuye a la muerte de la célula; además, es capaz de reducir la expresión de la isoforma 2, que se expresa en la mitocondria. Por último, puede inhibir a las deubiquitinasas asociadas a la subunidad 19S del proteasoma, lo que de forma indirecta provoca el bloqueo de la degradación proteica que lleva a cabo este orgánulo de forma normal. Este descubrimiento plantea la posibilidad de que los complejos de oro(I) puedan actuar como complejos multidiana o “multitarget”, siendo capaces de atacar a la célula tumoral por varias vías simultáneamente. Anteriormente, mencionábamos que el efecto del oxaliplatino se ve potenciado al ser administrado junto con otros fármacos que actúan siguiendo distintos mecanismos, ya que, entre otros beneficios, se consigue reducir la aparición de resistencias121. Cuando se interfiere con una sola diana, a la célula tumoral le resulta relativamente sencillo desarrollar un mecanismo para solventar el INTRODUCCIÓN: Uso del oro en medicina. Descubrimiento de las propiedades antitumorales del auranofin 68 problema. En el caso del oxaliplatino o el cisplatino, consistiría en sobreexpresar los sistemas de reparación del DNA83,84,128. Sin embargo, cuando la acción de varios componentes celulares se ve afectada, como ocurre al utilizar cócteles de medicamentos o compuestos multitarget, la célula tumoral tiene más complicado proteger todas las dianas afectadas, aumentando así las probabilidades de éxito de la quimioterapia. iNTRODUCCIÓN 75 Referencias (1) Real Academia de la Lengua. 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NaOH (0.4 g) was added to a methanol (20 mL) solution of 2-hydroxyacetophenone (3.32 mmol) and benzaldehyde or the different para-substituted benzaldehydes (3.32 mmol). The reaction was refluxed for 3 h until it acquires an intense orange color. The reaction was cooled to room temperature and followed by the addition of NaOH (0.4 g) dissolved in 20 mL of water and 1.45 mL of H2O2 (33% w/v). After 3 h of stirring, the mixture was poured into an ice-water solution affording yellow solids, which were filtered off and dried in air. General procedure for the preparation of the propargyl flavones (HL-2a-d). K2CO3 in excess and propargylbromide (1.6 equivalents) were added to a solution of flavones HL1a-d. The reaction was heated under reflux for 6 hours, and after this time, the excess of base was filtered off and the residue was evaporated to dryness. Synthesis of 3a-d and 4a-d series was described by Mármol et al.2 To a solution of KOH (0.225 mmol) in MeOH (ca. 10 mL) containing L2a-d (0.15 mmol) was added [AuCl(PR’3)] (PR’3 = PPh3, PTA) (0.15 mmol). The corresponding solids precipitated in the methanolic solution, and were isolated by filtration after 20 h of stirring at room temperature, washed with methanol and diethyl ether, and dried in vacuo. Synthesis of the [Au(L)(NHC)] complexes (series 5a-d and 6a-d). To a solution of KOH (0.35 mmol) in MeOH (ca. 10 mL) containing La-d (0.2 mmol) was added [AuCl(NHC)] (NHC = IMe, IPr) (0.18 mmol). The corresponding solution was evaporated to dryness after 8 h of stirring at room temperature. Dichloromethane (10 mL) was added and the solution was filtered over Celite, concentrated and the addition of diethyl ether lead to white solids, which isolated by filtration and dried in air. Experimental 96 3. Synthesis of gold(I) and silver(I) complexes with Nor S-donor ligands derived from 2-anilino-pyridine Synthesis of the ligands {(4-pyCO)N(Ph)(py)} (L1) and {(2-(C4H4S)CO)N(Ph)(py)} (L2). To a dichloromethane solution (10 mL) of 2-anilinopyridine (0.3404 g, 2 mmol) under argon atmosphere was added NEt3 (0.2626 g, 2.6 mmol) and 4-chlorocarbonylpyridine (0.3560 g, 2 mmol) or 2-chlorocarbonylthiophene (0.2932 g ,2 mmol). The reaction was stirred for 24h at room temperature. The solution was washed with a saturated solution of NaHCO3 and then washed with dichloromethane (3x20mL) and dried with anhydrous MgSO4. Then the solution was filtered through Celite and the solution was reduced to minimum volume under vacuum. The addition of n-hexane afforded a white solid which was filtered of and washed with n-hexane. Synthesis of the complexes [Au(L)(PPh3)](OTf) (L1, 7a; L2, 7b). To a dichloromethane solution (10 mL) of [AuCl(PPh3)] (0.1484 g, 0.3 mmol) was added [Ag(OTf)] (0.0848 g, 0.33 mmol). After 45 min of stirring protected from light, the white solid (AgCl) was filtered through Celite and the solution was added to dichloromethane solution (10 mL) of L1 (0.0743 g, 0.27 mmol) or L2 (0.0757 g, 0.27 mmol). The reaction was stirred for 2h at room temperature. Then the solution was reduced to minimum volume under vacuum. A white solid was obtained and washed with n-hexane. Synthesis of the complexes [Ag(OTf)(L)(PPh3)] (L1, 8a; L2, 8b). To a dichloromethane solution (10 mL) of [Ag(OTf)(PPh3)] (0.1557 g, 0.3 mmol) was added L1 or L2 (0.3 mmol). After 45 min of stirring protected from light at room temperature, the solution was reduced to minimum volume under vacuum. A white solid was obtained and washed with n-hexane. Synthesis of the complexes [Ag2(OTf)2(L)(PPh3)2] (L1, 9a; L2, 9b). To a dichloromethane solution (10 mL) of [Ag(OTf)(PPh3)] (0.1557 g, 0.6 mmol) was added L1 or L2 (0.3 mmol). After 45 min of stirring protected from light at room temperature, the solution was reduced to minimum volume under vacuum. A white solid was obtained and washed with n-hexane. Synthesis of the complexes [Ag(OTf)(L)]2 (L1, 10a; L2, 10b). To a dichloromethane solution (10 mL) of [Ag(OTf)] (0.051 g, 0.2 mmol) was added L1 or L2 (0.2 mmol). After 45 min of stirring protected from light at room temperature, the solution was reduced to minimum volume under vacuum. A white solid was obtained and washed with nhexane. Synthesis of the complexes [Ag(OTf)(L)2] (L1, 11a; L2, 11b). To a dichloromethane solution (10 mL) of [Ag(OTf)] (0.051 g, 0.2 mmol) was added L1 or L2 (0.4 mmol). After 45 min of stirring protected from light at room temperature, the solution was reduced to minimum volume under vacuum. A white solid was obtained and washed with nhexane. Experimental 97 Distribution coefficient calculation N-octanol-water partition coefficient was determined by the shake-flask method. PBS buffered distilled water (100 ml, phosphate buffer [PO43-] = 10 μM, 0.15 mM NaCl, pH 7.4) and 100 ml of n-octanol were shaken together 72h to allow saturation of both phases. Approximately 1 mg of each complex was mixed in 5 ml of aqueous and organic phase for 10 min respectively. The resultant emulsion was centrifuged to separate the phases and complex concentration on each one was determined by UV absorbance spectroscopy. LogP7.4 was defined as log([compound(organic)]/[compound(aqueous)]). Study of complex-BSA interaction A 1 mM stock solution of bovine serum albumin (A2153 Sigma-Aldrich) was prepared in PBS at pH 7.4 (real concentration was confirmed by UV-Vis spectroscopy, Ɛ280 nm = 43,284 M-1·cm-1). Gold complexes were dissolved on DMSO to achieve a 6 mM stock solution and six aliquots of 2.5 μl were added to a 50 mM solution of BSA in PBS placed in a quartz cuvette of 1 cm optical path, giving rise to the final concentrations of 5, 10, 15, 20, 25 and 30 μM. The fluorescence spectra were recorded on a Jobin-Yvon-Horiba fluorolog FL-3-11 spectometer. The samples were excited at 295 nm and the emission spectra were recorded in a range from 310 to 450 nm with emission slits set to 1.6 nm. Samples were measured upon 4 min incubation with each gold aliquot. Fluorescence intensities of PBS and gold complexes were irrelevant under described conditions, as were the effect of the addition of gold aliquots and the effect of incubation time between measurements. Data were analyzed by using Stern-Volmer equation: F0/F = 1 + Ksv[gold complex] = 1 + KqƬ0[gold complex], in order to obtain Stern-Volmer Quenching constant (Ksv). The binding constant (Kb) was quantified by using the modified Stern-Volmer equation: log[(F0-F)/F] = logKb + nlog[gold complex] Preparation of Rosa canina extracts R. canina rosehip extracts were provided by members of Applied Chemistry department from Public University of Navarra as described by Jiménez et al.3 Rosehips were harvested in 2014 from a field called Ca’l retor, located in Mariola Mountain, Alicante, Spain. Rosehip peel and pulp (10 g) were homogenized with ultraturrax and then macerated for 24 h in a 250 mL acetone:water (80:20 v/v) solution. After this phase, the sample was lyophilized (Telstar, model Cryodos-50, Spain) to eliminate solvents and all the antioxidants are present in the residue obtained (Total Extract, TE). This extract was then fractionated using a solid phase chromatography to obtain three different antioxidants fractions. First of all, the residue was solved in sulphuric acid (5 ml, 0.5 M), the solution was centrifuged (15000 rpm, 30 min) and passed through a Chromabond C-18 cartridge (Scharlab S.L., Barcelona) previously conditioned (2 ml of Experimental 98 methanol and 5 ml of 5 mM H2SO4). Polar substances, such as vitamin C, were extracted with 2 mL of 5 mM H2SO4. Phenolic compounds retained in the cartridge, were eluted with methanol (2 ml) and distilled water (5 ml). From this solution, considered as purified rosehip extract, neutral and acidic phenols were extracted and fractioned. In brief, the purified rosehip extract pH was adjusted to 7.0 (using a 2 M NaOH solution) and passed through a preconditioned Chromabod cartridge with 8 mL of methanol followed by 4 mL of distilled-deionized water. The column was washed with 10 ml of distilled-deionized water and neutral phenols (NP) were eluted using methanol (12 ml). The effluent portion pH was adjusted to 2.0 (using 2.0 M HCl) and then it was passed through a cartridge preconditioned with methanol (8 ml) and HCl (4 ml, 0.01 M). Subsequently column was washed with HCl (5 ml, 0.01 M) and the retained fraction (acidic phenols, AP) was eluted using methanol (12 ml). The three fractions were dried using the lyophilizer and then were frozen at -80°C until dilution on cell culture medium for cell treatment (see below ‘Cell treatment’ section). Cell culture Four different human cancer cell lines have been used during the previously discussed work. Details regarding their origin are summarized: - Caco-2 cells: colorectal adenocarcinoma. Kindly provided by Dr. Edith BrotLaroche (Université Pierre et Marie Curie-Paris 6 UMR S872, Les Cordeliers, France). - HepG2 : hepatocellular carcinoma. Kindly provided by Dr. María Angeles Alava (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Zaragoza, Spain). - MCF-7: breast adenocarcinoma. Kindly provided by Dr. Carlos J. Ciudad and Dr. Verònica Noé (Departamento de Bioquímica y Fisiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Spain). - MDA-MB-231: breast adenocarcinoma. Kindly provided by Dr. Carlos J. Ciudad and Dr. Verònica Noé (Departamento de Bioquímica y Fisiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Spain). Cell lines were maintained in a humidified atmosphere of 5% CO2 at 37ºC. Cells (passages 20-40) were grown in Dulbecco’s Modified Eagles medium (DMEM) (Gibco Invitrogen, Paisley, UK) supplemented with 20% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acids, 1% penicillin (1000 U/ml), 1% streptomycin (1000 μg/ml) and 1% amphotericin (250 U/ml). Culture medium was replaced every two days and cells were passaged enzymatically with 0.25% trypsin-1 mM EDTA and sub-cultured on 25 cm2 flasks at a density of 2·104 cells/cm2. Experimental 99 For assays on cancer cell models (undifferentiated Caco-2, HepG2, MCF-7 and MDA231 cells), treatment was added 24h post-seeding and then incubated the required time for each experiment. For assays on differentiated Caco-2 cells -a model of the gastrointestinal barrier-, cells were cultured on 96-wells plates under standard culture conditions for 7 to 9 days, until reaching 80% confluence as confirmed by optic microscopy observance. Traditionally, it was considered that differentiation was reached upon two weeks post-seeding; however, Natoli et al.4 found that sub-culturing cells at 50% confluence for maintenance instead at 80% resulted in a high conservation of proliferative capacity, thus reaching differentiation faster. Treatment was added after this differentiation time without further considerations. Cell treatment Gold(I) and silver(I) complexes were initially solved on DMSO to a concentration of 20 mM and then diluted on cell culture medium without fetal bovine serum (FBS) to the required work concentrations. Rosa canina extracts were solved on FBS-free medium to a concentration of 1 mg/ml and then diluted on FBS-free medium to the required work concentrations. For treatment, cell culture medium was replaced with medium containing complexes and/or plant extracts and cells were incubated at 37ºC for a variable time depending on the assay. Mock-treated cells or negative control was included on each experiment (cells treated with 3.5 nM DMSO). When a pre-incubation with a selected compound was needed prior to cell treatment with metallic complexes/plant extract, those compounds were previously solved on the required solvent as summarized below and then diluted on FBS-free medium to work concentrations. Cells were pre-incubated at 37ºC and then cell culture medium was replaced with medium containing metallic complexes and/or plant extracts for further incubation at 37ºC. - Necrostatin-1 (N9037, Sigma-Aldrich): 20 mg/ml DMSO - N-acetyl-cysteine (A9165, Sigma-Aldrich): 33 mg/ml DMSO - SN-50 (481480, Sigma-Aldrich): already solved - TNFR1 analog (SRP6389, Sigma-Aldrich): 50 μg/mL PBS (phosphate buffered saline) - Chloroquine (C6628, Sigma-Aldrich): 10 ml/ml PBS Experimental 100 Cell proliferation determination 1. MTT assay MTT assay depends on 3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (CT01-5 Sigma-Aldrich). Mitochondrial dehydrogenase from viable cells is able to reduce MTT reactive to formazan, a reaction that can be followed spectrophotometrically due to the color change from yellow to blue5. MTT reactive was solved on DMSO to a concentration of 5 mg/ml. Cells were plated in 96-well plates at a density of 4000 cells per well, incubated 24h under standard cell culture conditions (for assays with cancer models) and then treated and incubated the required time for each determination. After such incubation with treatment, 10 μl of 5 mg/ml MTT solution were added to each well and cells were then incubated for 3 h at 37ºC. Medium was replaced by inversion and 100 μl DMSO were added to each well to solve formazan crystals. Plates were shaken 5 min and absorbance was measured at 560 nm with DTX 800 (Beckman Coulter) (chapter 1) or SPECTROstar Nano (BMG Labtech) (chapters 2-4). Absorbance was proportional to number of living cells and converted to percentage of cell viability comparing to data obtained from negative control. 2. SRB assay The sulforhodamine B (SRB) assay is considered as an indirect method to determine cell viability, and it is recommended for those situations when MTT assay should be avoided6,7. This method is based on the capacity of SRB to bind cell proteins, thus the amount of dye might be correlated to cell mass8. Cells were plated in 96-well plates at a density of 4000 cells per well, incubated 24h under standard cell culture conditions (for assays with cancer models) and then treated and incubated the required time for each determination. After such incubation with treatment, cells were fixed with 500 g/l trichloroacetic acid for 1h at 4ºC, washed with PBS and stained with 4g/l of SRB for 20 min at room temperature covered from light. Plates were washed three times with 10 ml/l of acetic acid to remove unbounded dye and protein-bound dye was extracted with 10 mmol/l Tris base. Absorbance was measured at 540/620 nm with SPECTROstar Nano (BMG Labtech) and considered equivalent to cell viability. Results were expressed as percentage of cell viability comparing to data obtained from negative control. IC50 and Selectivity Index calculation For IC50 calculation, a stock solution of gold(I) and silver(I) complexes in DMSO was added to cells in a concentration range of: Experimental 107 solution and incubated 15 min at room temperature covered from light. After incubation, cells were washed with 2 ml PBS containing 0.1% digitonin and centrifuged 300 g 5 min. 2 μl of - Recombinant Anti-TXNRD1 antibody [EPNCIR129] (Alexa Fluor® 647) (ab203261, Abcam). (Ex) = 652 nm;Em) =668 nm. were added to each sample and the resultant mixture was incubated 1h at room temperature. Finally, cells were centrifuged 5 min at 500 g, washed twice with PBS and resuspended in 400 μl of PBS. Fluorescence was analyzed with FACSARRAY BD equipped with an argon ion laser. Measurement of cellular GR activity Glutathione reductase activity can be followed spectrophotometrically due to the loss of absorbance at 340 nm, consequence of NADPH oxidation12. Caco-2 cells were grown in 96-wells plates at a density of 4000 cells per well, and after overnight incubation under standard culture conditions, were exposed to treatment for the required incubation time. Then, cell culture medium was removed and replaced with modified RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% SDS, 1% DOC, 1 mM NaF, miliQ water, EDTA-free protease inhibitor cocktail). Samples were shaken 20 min and 25 μl PBS were added to each well. Then, reaction mix (0.1 M Tris-HCl pH 8, 0.02 mM NADPH, miliQ water) was added to each sample and reaction was then started by adding 0.52 mM GSSG. Absorbance at 340 nm was recorded for 6 min DTX 800 (Beckman Coulter) (chapter 1) or SPECTROstar Nano (BMG Labtech) (chapters 3 and 4). In order to convert absorbance data in percentage of GR activity, the following calculations were performed: GR activity = |ΔAbs| Ɛ··[] where |ΔAbs| = AbsLast cycle -Abs0, ƐGSSG = 373 M·cm-1 and [Prot] was determined with Bradford method. GR activity value obtained from complex-free samples (negative control) was considered as 100% of activity, and the rest of conditions were expressed in consequence. Measurement of intracellular ROS levels 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) is a cell-permeable probe that becomes fluorescent when oxidized (DCF), thus fluorescence signal is considered as a direct measurement of intracellular ROS levels13. A stock solution of 3981 μM was prepared on methanol, then diluted on PBS to the required work concentration. Caco-2 cells were grown in 96-wells plates at a density of 4000 cells per well, and after overnight incubation under standard culture conditions, were exposed to treatment for the required incubation time. Then, cells were washed twice with PBS and Experimental 108 incubated 20 min with 100 μl of 20 mM H2DCF-DA (410217, Sigma Aldrich) at 37ºC covered from light. Cells were washed three times with PBS and 100 μl of PBS were added to each well. Fluorescence was then analyzed with DTX 800 (Beckman Counter) (chapter 1) or FLUOstar Omega (BMG Labtech) (chapters 2-4). Excitation and emission settings were 485 and 535 nm respectively. Analysis of intracellular ROS levels by fluorescence microscopy Caco-2 cells were plated in 96-well plates at a density of 4000 cells per well, then incubated 24h under standard cell culture conditions and exposed to IC50 of [Au(C≡C-2NC5H4)(PTA)] (2a) for 80 min. Then, CellROX® Deep Red Reagent (C10422, ThermoFisher) was added to each well to a final concentration of 5 μM. Cells were incubated 30 min at 37ºC and fluorescence was analyzed using confocal microscopy in a Nikon Eclipse Ti® inverted fluorescence microscope, coupled with a confocal module. Excitation and emission settings were 644 and 665 nm respectively. Fluorescence intensity was analyzed with Fiji software. Determination of RIP-1 protein levels Caco-2 cells were plated on 75 cm2 flasks at a density of 500,000 cell per flask, incubated 24h under standard cell culture conditions and then exposed to IC50 value of [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) or 2a+acidic polyphenols extract from R. canina (DC) for 24h. Cells were then collected by tripsinization and 100 μl of fixation solution INTRACELL (Intra 100-T, Immunostep) were added to each 50 μl of cells. The resultant mixture was then incubated for 5 min at room temperature and washed with PBS. Cells were resuspended on 50 μl of PBS and 100 μl of permeabilisation solution INTRACELL (Intra 100-T, Immunostep) along with 3 μl anti-RIP-1 antibody (ab72139, Abcam) were added to each sample. After 1 h incubation at 4ºC, cells were washed with 1 ml PBS and 50 μl of permeabilisation solution INTRACELL (Intra 100-T, Immunostep) were added. Finally, secondary antibody goat anti-mouse ALEXA 488 was added and samples were incubated for 30 min at 4ºC. Cells were washed and resuspended on 200 μl of PBS and fluorescence was analyzed using FACSARRAY BD equipped with an argon ion laser. Measurement of autophagosomes formation Caco-2 cells were seeded in 96-well plates at a density of 4·103 cells/well, grown 24h under standard cell culture conditions and then incubated with treatment for the required time. For autophagosomes formation, Autophagy Assay Kit (MAK138, Sigma Aldrich) was used according to manufacturer’s instruction. Fluorescence intensity (λex=360/λem=520 nm) was measured with FLUOstar Omega (BMG Labtech). Fluorescence intensity was normalized with cell viability for assays at 24h incubation. The obtained values of fluorescence intensity are considered as a reflection of total autophagosomes formation. Experimental 109 Determination of lysosomal alkalization Caco-2 cells were plated on 25 cm2 flasks at a density of 300,000 cell per flask, incubated 24h under standard cell culture conditions and then exposed to the corresponding treatment (Drug Combination (DC): [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) and acidic polyphenols from Rosa canina) for 24 or 48h. Cells were then collected by tripsinization and changes in lysosomal acid content were measured with LysoTracker Green DND-26 (L7526, Molecular Probes). The dye was first diluted on DMEM to a concentration of 75 nM. Then, 1 mL of diluted LysoTracker was added to each 50 μL of cell sample. Cells were incubated 2h at room temperature covered from light and then were centrifuged 5 min at 1200 rpm. Pellet was resuspended on 200 μL of PBS and the fluorescence signal (λex=504/λem=511 nm) was analyzed by FACSARIA BD equipped with an argon ion laser. Measurement of COX-1/2 activity Caco-2 cells were plated on 25 cm2 flasks at a density of 300,000 cell per flask, incubated 24h under standard cell culture conditions and then exposed to IC50 values of [Au(L2b)PPh3] (3b) or [Au(L2c)PTA] (4c) for 2 or 24h. Cell medium was collected and cells were scraped and lysed. COX-1/2 enzymatic activity of cell lysates was analyzed with Cyclooxygenase (COX) Activity Assay Kit (ab204699, Abcam) according to manufacturer’s instructions. Fluorescence was measured with FLUOstar Omega Microplate Reader (BMG Labtech). Analysis of 20S proteasome activity Caco-2 cells were grown at 25 cm2 flasks at a density of 300.000 cells per flask and incubated overnight under standard culture conditions. Cells were exposed to IC50 values of [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) and [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a) for 24h, then collected by tripsinization, lysed with saponine (5 mg/ml in PBS) and centrifuged at 13000 rpm for 15 min at 4ºC. Supernatant was further analyzed with Proteasome 20S Activity Assay Kit (MAK172, Sigma Aldrich) according manufacturer’s instructions. Fluorescence was measured with FLUOstar Omega (BMG Labtech). Protein concentration was determined with Bradford method as previously described. Caco-2 spheroids generation Caco-2 cells (3·103 cells per plate) were mixed with a high viscosity methylcellulose solution previously described by Ayuso et al.14. 100 μl of the resultant solution were seeded on a round-bottom 96-well plate. Spheroids were grown for 72h and incubated with rising concentrations of [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) (3, 4 and 5 μM) for 24h. For cell viability measurement, spheroids were stained with Hoechst 33342 (4 mg/ml) and propidium iodide (4 mg/ml) for 30 min. Then, fluorescence was analyzed using Experimental 110 confocal microscopy in a Nikon Eclipse Ti® inverted fluorescence microscope, coupled with a confocal module and fluorescence intensity was analyzed with Fiji software. Disk diffusion test A disk diffusion assay was used to determine the diameter of the inhibition zone of complexes 5a-d and 6b-d on selected bacteria strains (E. coli, P. aeruginosa, S. enterica, E. faecalis, L. monocytogenes, S. epidermidis, S. aureus; see Table 17 on Chapter 3 for further details) and was performed following the method by Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI)15. Each disk (Oxoid, England) (6 mm in diameter) was impregnated with 10 µL of each gold complex or control (DMSO for negative control, phenol for positive control). Active cultures (0.5 McFarland) from all strains previously showed on Table 17 (see Chapter 3) were spread with a cotton swab onto MuellerHinton Agar (MHA, Oxoid, England). Plates were allowed to dry for 3 to 5 minutes. Flame sterilized tweezers were used to place the disks onto inoculated MHA plates, one disk in each of the eight equal parts. The plates were allowed to stand for 15 minutes and then they were inverted and incubated for 22 h ± 2 h at 37 ºC ± 1 °C. Upon incubation, diameter of inhibition zone was measured. Statistical analysis All assays were performed at least three times, and the obtained data were subjected to one-tailed Student’s test. Differences were considered significant at p < 0.05. Experimental 111 References 1. Vergara, E. et al. Antiproliferative activity of gold(I) alkyne complexes containing water-soluble phosphane ligands. Organometallics 29, 2596–2603 (2010). 2. Mármol, I. et al. Alkynyl Gold(I) complexes derived from 3-hydroxyflavones as multi-targeted drugs against colon cancer. Eur. J. Med. Chem. 183, (2019). 3. Jiménez, S. et al. Rosa canina extracts have antiproliferative and antioxidant effects on caco-2 human colon cancer. PLoS One 11, e0159136 (2016). 4. 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Study of the chemotactic response of multicellular spheroids in Experimental 112 a microfluidic device. PLoS One 10, e0139515 (2015). 15. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard. (2012). 113 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 114 115 CAPITULO 1 ALQUINIL DERIVADOS DE ORO(I) CON FOSFINAS HIDROSOLUBLES - J Inorg Biochem . 2017 ; 166:108 - 121 - J Inorg Biochem. 2017; 176:123-133 116 CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 123 Para obtener una primera idea acerca de la selectividad de 1a y 2a, se incubaron durante 72h sobre la línea Caco-2 diferenciada en cantidades equivalentes a sus IC50 (Tabla 4). En ninguno de los dos casos se obtuvieron diferencias significativas respecto al control negativo, si bien es cierto que la reproducibilidad de los ensayos no fue la ideal (Figura 26). Los datos obtenidos parecen indicar que la mucosa intestinal podría tolerar bien el tratamiento con ambos derivados, aunque con estos datos preliminares no pueden descartarse que en un organismo vivo se produjesen trastornos gastrointestinales a consecuencia de la terapia. Serían necesarios estudios sobre modelos animales para ampliar la información al respecto. Figura 26. Estudio de la toxicidad sobre un modelo in vitro de la mucosa intestinal. Efecto de 72h de incubación con 1a (2,65 µM) o 2a (3,80 µM) en la línea Caco-2 diferenciada. Con [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) se llevó a cabo una segunda aproximación acerca de su toxicidad en tejidos sanos al calcular el valor de su IC50 en células Caco-2 diferenciadas. A partir de este valor y del obtenido previamente en células indiferenciadas (Tabla 4), se calculó el valor del índice de selectividad (Selectivity Index; SI). Se usaron cisplatino y auranofin como controles positivos. Si bien en cuanto a su efectividad 2a resulta menos potente que el auranofin, aunque esta diferencia no es demasiado pronunciada, su uso clínico podría suponer una ventaja considerable en cuanto a su toxicidad sobre tejidos sanos, ya que su SI es mucho mayor que el de este fármaco comercial (Tabla 5). Por consiguiente, los datos obtenidos hasta el momento apuntan hacia la posibilidad de que este nuevo derivado de oro reúna las características de eficacia y selectividad que mencionábamos necesarias para el quimioterápico ideal. CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 124 Tabla 5. Valores de IC50 y SI de 2a, así como de los fármacos comerciales cisplatino y auranofin, calculados tras 72h de incubación sobre células Caco-2 diferenciadas. Complejo IC 50 (µM) SI [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) 51,04 ± 1,28 13,43 Auranofin 6,21 ± 0,44 3,45 Cisplatin 151,13 ± 58,12 3,31 Antes de profundizar en el mecanismo de acción de ambos complejos, se consideró que podría ser interesante obtener una idea preliminar acerca de sus propiedades farmacocinéticas, en concreto con aquellas relacionadas con su distribución en el organismo. De acuerdo con lo desarrollado en el apartado 1.6, la albúmina sérica es una de las principales implicadas en el transporte de gran parte de los fármacos por el torrente sanguíneo. Dado que la albúmina sérica bovina (Bovin Serum Albumin; BSA) presenta una homología del 75,6% con la HSA43, es posible utilizarla como modelo para predecir el comportamiento de un fármaco en presencia de la albúmina sérica humana. De los 583 residuos que constituyen a la BSA, destacan los triptófanos en posición 134, localizado en la superficie del subdominio IB, y en posición 212 en el bolsillo hidrofóbico del subdominio IIA. El interés de ambos residuos reside en que dotan a la proteína de fluorescencia intrínseca, y dado que el espectro de fluorescencia de una molécula está condicionado por su entorno, en caso de que una molécula establezca una interacción con la BSA se traducirá en una modificación de dicho espectro de fluorescencia. Este fenómeno se denomina desactivación o “quenching” de la fluorescencia, y se define como el descenso en la intensidad de la fluorescencia de una molécula debido a cambios conformacionales de la misma o a la interacción con moléculas adicionales44–46. Por lo tanto, se analizó el espectro de fluorescencia de la BSA en presencia de diferentes concentraciones del complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a) de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección experimental. En la Figura 27 puede observarse que se produce un descenso en la fluorescencia de la proteína conforme se aumenta la concentración del complejo metálico. Estos datos de fluorescencia fueron analizados para obtener la constante de desactivación de Stern-Vomer KSV. Para ello, se utilizó la ecuación de Stern-Volmer descrita en la sección experimental y se representó el valor F0/F (F0 y F = intensidad en ausencia y presencia del complejo metálico 1a respectivamente) frente a las concentraciones del mismo; la línea obtenida (Figura 28A) proporciona el valor de la constante de desactivación, que se recoge asimismo en la Tabla 6. De igual manera, se estudió la interacción entre BSA y el complejo metálico a diferentes temperaturas para elucidar el posible mecanismo a través del cual se producía dicha interacción. La CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 125 ecuación de Stern-Volmer modificada (ver sección experimental) permitió calcular la constante de enlace Kb o constante de asociación aparente, así como el número de sitios de unión o valor n. Ambos parámetros, que se recogen en la Tabla 6, pueden ser deducidos a partir de la pendiente y la ordenada en el origen, respectivamente, de la recta resultante de representar log[(F0-F)/F] versus concentración de 1a (Figura 28B). Figura 27. Estudio de la interacción de 1a con la proteína BSA. Desactivación de la fluorescencia intrínseca de la BSA a 295 K en presencia de concentraciones crecientes de 1a (5, 10, 15, 20, 25 y 30 μM). La flecha indica la disminución de la intensidad de la señal conforme aumenta la concentración del complejo metálico. Tabla 6. Valores de la constante de desactivación (Ksv), la constante de unión (Kb) y los parámetros termodinámicos relativos a la interacción entre BSA y 1a a diferentes temperaturas. T (K) n K sv (L·mol-1·104) Kb (M-1) ΔG0 (KJ·mol-1) ΔH0 (KJ·mol-1) ΔS0 (J·mol1·K-1) 295 1,09 2,9 7,21·10 4 - 27,60 161,13 639,76 304 1,34 1,75 6,38·10 5 - 33,36 161,13 639,76 310 1, 44 1,61 1,66·10 6 - 37,20 161,13 639,76 La constante de enlace Kb calculada a 295 K tiene un valor de 7,21·104 M-1, una cifra que, si bien es mayor que la obtenida por otros autores para la interacción entre cisplatino y HSA47, se trata de un dato muy próximo al de otros complejos de oro(I) y oro(III)48,49, ya que se encuentran dentro de un rango de entre 103 y 104 M-1. Este resultado parece sugerir que 1a es capaz de interaccionar significativamente con la CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 126 proteína BSA, lo que podría implicar que la BSA sería la principal responsable de transportarlo por el torrente sanguíneo. Figura 28. A) Representación de la ecuación de Stern-Volmer que muestra la pérdida de fluorescencia de la BSA en presencia de concentraciones crecientes de 1a a 295 K, a partir de la cual se obtiene el valor de Ksv. B) Representación de la ecuación modificada de Stern-Volmer que muestra la pérdida de fluorescencia de la BSA en presencia de concentraciones crecientes de 1a a 295 K, a partir de la cual se obtiene el valor de Kb. C) Representación de lnKb frente a 1/T. En la Figura 28A se puede observar que se obtiene una relación lineal al representar F0/F frente a la concentración del complejo metálico, lo que se corresponde con la existencia de un único mecanismo de desactivación de la señal luminiscente. Se han descrito dos tipos de mecanismos a través de los cuales puede producirse la desactivación de la fluorescencia. Por un lado, la desactivación de tipo estática tiene lugar cuando el agente desactivante forma un complejo no fluorescente al interaccionar con el fluoróforo; por otro, cuando ambos agentes colisionan de forma continuada se habla de una desactivación dinámica50. Esta última depende de la difusión, de modo que altas temperaturas dan lugar a mayores coeficientes de difusión y por lo tanto a un mayor valor de la constate Ksv. El análisis de la interacción entre ambos agentes realizado y = -19380x + 76,946 R² = 0,9915 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 LnKb 1/T (K-1) y = 29000x + 0,9577 R² = 0,9643 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0,0E+00 1,0E-05 2,0E-05 3,0E-05 F0/F [Complex] (mol L-1) y = 1,0951x + 4,8581 R² = 0,9816 -1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 -5,4 -5,15 -4,9 -4,65 -4,4 log[(F0-F)/F] log[complex] A B C CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 127 a diferentes temperaturas permite determinar el tipo de mecanismo según el cual se induce la desactivación de la fluorescencia. Según se recoge en la Tabla 6, los valores de ambas constantes Ksv y Kb disminuyen conforme se aumenta la temperatura, lo que implica que se forma un complejo entre la BSA y 1a. Es decir, se trata de un mecanismo de desactivación de tipo estático50,51. Finalmente, se calcularon los parámetros termodinámicos ΔGo, ΔHo, y ΔSo con la ecuación de van’t Hoff (lnKb = -Ho/RT + So/R; Kb es la constante de unión a diferentes temperaturas y R la constante de los gases) para así poder determinar las fuerzas que permiten la interacción entre BSA y 1a, pudiendo tratarse de interacciones de van der Waals, puentes de hidrógeno y/o atracciones de tipo electrostáticas e hidrofóbicas. La entalpia de intercambio Ho se calcula a partir de la pendiente de la línea obtenida al representar lnKb frente a 1/T (figura 28C) y Go se estima a partir de la ecuación Go = Ho -TSo. En este caso, se han obtenido valores de ΔHo y ΔSo por encima de 0 (Tabla 6), que indican la existencia de interacciones hidrofóbicas entre la proteína y el derivado metálico52. Por otro lado, el valor de ΔGo se encuentra por debajo de cero, lo que es indicativo de que este proceso tiene lugar de forma espontánea. Finalmente, al aumentar el número de sitios de unión (parámetro n de la Tabla 6) al inducirse el incremento de la temperatura, puede concluirse que existe un componente dinámico en la unión entre ambas moléculas. A continuación, se llevó a cabo el mismo estudio con [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a). Tal como puede apreciarse en la Figura 29, conforme se incrementaba la concentración del derivado se observaba un descenso en la fluorescencia de la BSA, de forma similar a lo que ocurría con su análogo 1a. No obstante, al procesar los datos de fluorescencia obtenidos mediante la ecuación de Stern-Volmer y representar el cociente F0/F frente a la concentración de 2a se obtiene una curva ascendente (Figura 30A) en lugar de una recta como ocurría en el caso de 1a (Figura 28A). Mientras que la recta indica la existencia de un único mecanismo de desactivación de la luminiscencia, la curva ascendente sugiere que coexisten los dos mecanismos previamente descritos. Asimismo, este patrón podría ser consecuencia de que el complejo metálico es capaz de unirse en más de un lugar de la proteína; en este supuesto, el complejo podría sentir una afinidad distinta por cada uno de estos sitios, o bien la proteína podría experimentar un cambio conformacional como consecuencia de la interacción, dejando así expuestos otros sitios de interacción que resultaban previamente inaccesibles50. De nuevo, se estudió la interacción entre el complejo metálico y la proteína a distintas temperaturas para así poder determinar los valores de Kb a dichas temperaturas y calcular los parámetros termodinámicos ΔHo, ΔSo y ΔGo (Tabla 7) tal y como lo habíamos medido en el caso del complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a). En este caso, el valor de la constante de enlace a temperatura ambiente es del orden de 108 M-1, un valor muy superior al previamente calculado para el análogo 1a (Tabla 6); esta cifra es más similar CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 128 a la hallada por Ji et al. al analizar la interacción entre una serie de nanopartículas de oro y la BSA53. Finalmente, mediante el cálculo de los parámetros termodinámicos se ha determinado el tipo de enlaces que podrían mediar la interacción entre 2a y la BSA. Al obtenerse un valor negativo para ΔGo, se puede concluir que el proceso es espontáneo, igual que pasaba en el caso anterior, aunque al calcular los valores de ΔHo y ΔSo encontramos otra diferencia con respecto a 1a, dado que en este caso ambos se encuentran por debajo de cero; esto sugiere que la interacción entre el complejo 2a y la BSA depende de la formación de enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals54. Los resultados obtenidos hasta el momento apuntan a que ambos derivados de oro(I) son capaces de interaccionar con la proteína BSA, de modo que es razonable suponer que la albúmina sérica podría ser la principal responsable de transportarlos por el torrente sanguíneo. No obstante, se han observado diferencias significativas en cuanto a la naturaleza de la interacción con la proteína entre los dos complejos, que podrían estar causadas por la presencia del nitrógeno adicional en la fórmula química de 2a. Figura 29. Estudio de la interacción de 2a con la proteína BSA. Desactivación de la fluorescencia intrínseca de la BSA a 295 K en presencia de concentraciones crecientes de 2a (5, 10, 15, 20, 25 y 30 μM). La flecha indica la disminución de la intensidad de la señal conforme aumenta la concetración del complejo metálico. CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 129 Figura 30. A) Representación de la ecuación de Stern-Volmer que representa la pérdida de fluorescencia de la BSA en presencia de concentraciones crecientes de 2a a 295 K, a partir de la cual se obtiene el valor de Ksv. B) Representación de la ecuación modificada de Stern-Volmer que representa la pérdida de fluorescencia de la BSA en presencia de concentraciones crecientes de 2a a 295 K, a partir de la cual se obtiene el valor de Kb. C) Representación de lnKb frente a 1/T. Tabla 7. Valores de la constante de desactivación (Ksv), la constante de unión (Kb) y los parámetros termodinámicos relativos a la interacción entre BSA y 1a a diferentes temperaturas. T (K) n Kb (M-1) ΔG0 (KJ·mol-1) ΔH0 (KJ·mol-1) ΔS 0 (J·mol-1·K-1) 295 1,70 2,3·10 8 - 78,78 - 105,9 47,54 304 1,62 8,98·10 7 - 78,78 - 105,9 46,58 310 1,60 5,95·10 7 - 78,78 - 105,9 45,95 A continuación, se retomó el estudio relativo acerca del efecto antitumoral de ambos complejos [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a) y [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a). Para ello, se redujo el tiempo de exposición de 72 a 24h y todos los experimentos desarrollados a continuación fueron realizados sobre células Caco-2 indiferenciadas, añadiendo una cantidad equivalente al IC50 de los complejos que se muestra en la Tabla 4 salvo que se especifique y = 1,1205e65043x R² = 0,9947 0 2 4 6 8 10 0,0E+00 1,5E-05 3,0E-05 F0/F [2a] (mol L-1) y = 1,6956x + 8,3916 R² = 0,9919 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6 1,1 -5,5 -5 -4,5 log[(F0-F)/F] log[2a] y = 9476x - 12,738 y = 9476x - 12,738 R² = 0,9826 16 18 20 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 Ln Kb 1/T (K-1) C A B CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 130 lo contrario. Al realizarse una primera determinación de la viabilidad celular con los parámetros especificados, puede observarse que ambos complejos son capaces de disminuir la proliferación del cultivo, si bien el complejo 1a parece ser más efectivo que el 2a (Figura 31A). Debido a ello, se quiso ahondar en el efecto antiproliferativo de 2a. Con este fin, se realizó una curva dosis-respuesta a dos tiempos de incubación (24 y 72h) con el complejo 2a para analizar el efecto de tiempo y concentración sobre su efecto citotóxico, encontrándose que era dependiente de ambos factores (Figura 31B). Estos datos sugieren que, para igualar el efecto antitumoral del complejo 1a en un tiempo de incubación concreto, podría ser necesario aumentar la concentración de 2a. Con esta primera aproximación se plantean dos escenarios: o bien el compuesto 2a tiene más dificultades para acceder a la célula, y por consiguiente requiere más tiempo para ejercer su acción biológica, o bien sus mecanismos de acción difieren, siendo más lento el de dicho complejo. A B Figura 31. Análisis del efecto citotóxico sobre células Caco-2 indiferenciadas. A) Efecto de 1a y 2a tras 24h de incubación en células Caco-2 indiferenciadas en cantidades equivalentes a sus IC50. *p<0,05 vs control negativo. B) Curva dosis-respuesta tras 24 (cuadrados) o 72h (círculos) de exposición con 2a. La siguiente etapa del estudio consistió en analizar el tipo de muerte inducida por ambos complejos sobre la línea Caco-2 tras 24h de incubación. Para ello, se recurrió a la doble tinción Anexina V-FITC (Fluorescein isotiocyanate) y yoduro de propidio55. Esta CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 131 técnica permite distinguir cuatro poblaciones celulares diferentes: células vivas, necróticas, en apoptosis temprana y en apoptosis tardía. Uno de los primeros eventos de la apoptosis consiste en la translocación del fosfolípido fosfatidilserina de la cara citoplasmática a la extracelular de la membrana plasmática. La anexina V es capaz de unirse a este fosfolípido, por lo que coordinarla con un compuesto fluorescente como el isotiocianato de fluoresceína permitirá identificar a las células en apoptosis temprana. El yoduro de propidio, por su parte, es capaz de unirse a los ácidos nucleicos, pero dado que no puede atravesar la membrana plasmática solo dará fluorescencia en aquellas células cuya membrana esté comprometida, que serán las necróticas y las que se encuentren en la fase tardía de la apoptosis; estas últimas, además, serán doble positivas porque también darán la señal FITC. Finalmente, las células vivas serán doble negativas. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 32. En primer lugar, es destacable el hecho de que ninguno de los complejos estudiados induce aumentos significativos en el número de células necróticas, lo que es de interés clínico de acuerdo con lo desarrollado en el apartado 1.256. En lo que respecta al complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a), puede observarse un considerable aumento del número de células en apoptosis tardía, lo que podría ser indicativo no solo de su capacidad de inducir apoptosis sino además de su ya mencionado posible rápido efecto biológico. No obstante, el resultado obtenido para su análogo [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) es muy diferente, ya que en este caso solo se obtuvo un ligero aumento en la población celular en apoptosis tardía, junto con un incremento no significativo del número de células en apoptosis temprana. Figura 32. Estudio de las poblaciones apoptóticas y necróticas en un cultivo de células Caco-2 indiferenciadas tras 24h de tratamiento con A) DMSO (control negativo; 2 μM); B) 1a (IC50); C) 2a (IC50). La Figura 28 se toma además como ejemplo para indicar la relación entre cada uno de los cuadrantes del histograma y la fluorescencia de las dos sondas utilizadas. Células vivas: ausencia de fluorescencia. Células necróticas: fluorescencia yoduro de propidio. Células en apoptosis temprana: fluorescencia FITC. Células en apoptosis tardía: doble fluorescencia. A pesar de que la hipótesis inicial de que 1a actúa a mayor velocidad que 2a parece estar validada por los resultados mostrados en las Figuras 31A y 32, el ligero aumento CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 132 en el número de células en apoptosis tardía inducido en respuesta al tratamiento con 2a no permite aplicar el principio de Ockham y aceptar como válida esta suposición, ya que la disminución en la viabilidad del cultivo reflejada en la Figura 31A no puede explicarse únicamente con ese leve incremento de células en apoptosis tardía. Esto obliga a buscar alternativas a la hipótesis inicial, entre las que se encuentran suponer que 2a no causa la muerte de las células tumorales mediante la inducción de apoptosis. Para comprobarlo, se estudió mediante doble tinción fluorescente Hoechst 33342 y CellEvent Caspase-3/7 Green detection reagent la activación de las caspasas ejecutoras 3 y 7 tras 24h de exposición a 2a (Figura 33). Al no encontrarse evidencias de la activación de dichas proteasas, se pudo concluir que el derivado causaba la muerte celular a través de un mecanismo independiente de caspasas, lo que podría descartar la inducción de apoptosis. La imagen de fluorescencia revela, además, otros dos datos de gran relevancia. El primero de ellos, una efectiva disminución de la población celular en respuesta al tratamiento que concuerda con la Figura 31A. El segundo y de mayor interés, el aumento del volumen celular como consecuencia de la incubación con 2a. Esta característica morfológica no es propia de las células apoptóticas, ya que este tipo de muerte celular cursa con un encogimiento del volumen celular57,58. Si bien se han documentado casos en los que un agente quimioterapéutico puede inducir apoptosis por vías que no requieren la activación de las caspasas, la formación de los cuerpos apoptóticos parece ser una etapa común y obligatoria59–61. Por tanto, la ausencia de este marcador, junto con la ya mencionada no activación de caspasas ejecutoras, permite concluir que 2a induce un tipo de muerte distinto tanto a apoptosis como a necrosis. Figura 33. Doble tinción con Hoechst 33342 (azul) y CellEvent Caspase-3/7 Green detection reagent (verde) tras 24h de incubación con 2a (IC50). Se marcan con flechas blancas células cuyo volumen ha aumentado de forma apreciable. Llegados a este punto, había quedado patente que la respuesta celular variaba considerablemente dependiendo de a qué complejo fuese expuesta, por lo que se vio necesario estudiar por separado el efecto biológico de cada uno de ellos. Así pues, se decidió continuar caracterizando el tipo de apoptosis inducida por el complejo CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 139 Efectivamente, los resultados mostrados en la Tabla 8 revelan que la incubación con 1a no solo no reduce la actividad de la GR, sino que incluso la aumenta ligeramente, aunque de forma no significativa. Este aumento puede ser consecuencia del antes mencionado papel del sistema glutatión-glutarredoxina como “custodio” de la actividad de la tiorredoxina ante una disfunción de la TrxR (ver apartado 1.5, pág. 64; Figura 20). Tabla 8. Medida de actividades de enzimas redox como potenciales dianas terapéuticas 1a. Se incluyen resultados obtenidos con enzimas recombinantes y procedentes de lisados celulares (células Caco-2 tras 24h de incubación con el complejo). *p<0,05 vs control negativo. **p<0,005 vs control negativo. Concentración 1a (µM) Enzima Actividad enzimática (μmol·mg− 1·min− 1) % actividad enzimática 0 (control negativo) TrxR (recombinante) 0,30 ± 0,03 100 2,65 TrxR (recombinante) 0,22 ± 0,03 * 72,63 5,30 TrxR (recombinante) 0,19 ± 0,02 ** 64,86 0 (control negativo) TrxR (cél. Caco - 2) 0,15 ± 0,03 100 2,65 TrxR (cél. Caco - 2) 0,13 ± 0,01 * 85, 84 0 (control negativo) GR (cél. Caco - 2) 1,55 ± 0,33 100 2,65 GR (cél. Caco - 2) 1,75 ± 0,53 112, 67 Si bien se ha comprobado que 1a es capaz de realizar un bloqueo directo de la actividad de la TrxR, con los datos obtenidos hasta el momento no se puede descartar que también lleve a cabo una inhibición indirecta de la enzima, esto es, una reducción de su nivel de expresión. Chen et al. observaron que el tratamiento con auranofin podía disminuir los niveles de expresión de la isoforma mitocondrial de la tiorredoxina reductasa88, de modo que inspirados por sus resultados se decidió analizar los niveles de expresión de la tiorredoxina y la TrxR de células Caco-2 tras 24h de exposición al complejo metálico. Las Figuras 39A y 39B muestran que la expresión de ambos genes TXN y TXNRD1 se incrementaba en respuesta al tratamiento. Estos resultados permitieron descartar que 1a llevase a cabo una inhibición indirecta de cualquiera de las dos enzimas, puesto que ocurría justo lo opuesto. Tras obtenerse estos datos, se determinó la cantidad de la enzima TrxR presente en el interior celular mediante citometría de flujo, observándose un incremento efectivo en respuesta a la sobreexpresión del gen (Figura 39C). Este aumento de la expresión génica, que se traduce a su vez en una mayor cantidad de proteína, podría ser la respuesta de la célula al bloqueo farmacológico de la TrxR, un pre-mecanismo de CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 140 resistencia a la terapia. No obstante, de acuerdo con los datos obtenidos, esta estrategia no consigue evitar la muerte celular. Sin embargo, la capacidad de la célula de sobreexpresar tanto la TrxR como la tiorredoxina, así como el hecho de que se incremente la actividad de la GR (Tabla 8), debe ser tenido en consideración, ya que una terapia prolongada podría dar lugar a una resistencia efectiva a través de la combinación de estos tres elementos. Futuros experimentos en modelos animales deberán tener en cuenta estos datos para tratar de hacer más efectiva la terapia usando los complejos de oro junto a bloqueantes del sistema glutatión-glutarredoxina para quizá aumentar las posibilidades de éxito del tratamiento, ya que, según se desarrollará más adelante, la inhibición concomitante de TrxR y GR implica una mayor probabilidad de éxito terapéutico89. Figura 39. Efecto de 24h de tratamiento con 1a (IC50) sobre la expresión génica de células Caco2. A) Determinación del nivel de expresión del gen TXN. B) Determinación del nivel de expresión del gen TXNRD1. C) Medida de la cantidad de proteína TrxR en el interior celular. Dado el papel clave de la TrxR en el mantenimiento de la homeostasis redox, al inhibir su actividad mediante la incubación con 1a era esperable un incremento en los niveles de especies reactivas de oxígeno. De acuerdo con investigaciones previas respecto al mecanismo de acción del auranofin, la ruptura del equilibrio redox estaría directamente relacionada con la capacidad del compuesto de inducir la muerte de la célula tumoral15,90–92. Por lo tanto, se midieron los niveles de ROS en células Caco-2 tras 1h de exposición a 1a y a auranofin como control positivo. Se observó un aumento significativo (p<0,001) con respecto al control negativo (Figura 40), lo que permitió concluir que, efectivamente, el bloqueo de la TrxR se tradujo en una ruptura del equilibrio redox que podría ser una de las causas de la inducción de apoptosis. CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 141 Figura 40. Medida de los niveles de ROS en células Caco-2 tras 1h de exposición a 1a (IC50) o a un control positivo (auranofin, 1,80 µM). Los resultados se expresan como valores promedio de unidades arbitrarias de fluorescencia. **p<0,005 vs control negativo. ***p<0,001 vs control negativo. Este incremento en los niveles de ROS también podría ser la razón por la que se observa un arresto en la fase G2/M del ciclo celular (Figura 37). Wang et al. observaron que una alta producción de ROS tenía como consecuencia la activación de Chk1/2, una proteína que bloquea la acción de Cdc25C, la cual a su vez promueve el paso de la fase G2 a la mitosis93. Por otra parte, de acuerdo con los resultados obtenidos por Kang et al., la activación de la proteína p38 en respuesta a un incremento en los niveles de ROS está a su vez relacionada con un cese del ciclo en la fase G2/M94. En este sentido, nuestros resultados podrían sugerir que los elevados niveles de ROS causados a consecuencia del tratamiento con el complejo metálico causan graves daños en el ADN durante la fase G2 del ciclo, lo que provocaría que el punto de control que determina la entrada en la mitosis iniciase la apoptosis para mantener la integridad del genoma. Así mismo, esta producción aberrante de ROS también podría estar relacionada con la inducción de apoptosis a través de una segunda vía, dado que la activación de la proteína p38 también está relacionada con un incremento en la tasa de activación de la caspasa 993,94. No obstante, en nuestro caso concreto esto es poco probable, dada la escasa activación de esta caspasa según se puede apreciar en la Figura 36A. Por último, el exceso de ROS podría ser también responsable del efecto observado sobre la expresión génica de los miembros del sistema tiorredoxina (Figura 39). En presencia de altas cantidades de ROS, se produce una estabilización del mRNA que codifica a la TrxR para así contribuir a una mayor producción de esta enzima y poder evitar la muerte desencadenada por una cantidad aberrante de ROS95. Esto podría explicar por qué el aumento de expresión del gen TXNRD1 (Figura 39B) se traduce en un incremento efectivo de la cantidad de TrxR en el medio intracelular (Figura 39C). Esta explicación también es aplicable al aumento de expresión del gen TXN96. CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 142 Así, se da por concluido el estudio preliminar acerca del uso potencial del complejo 1a con fines quimioterapéuticos frente al CRC. Su mecanismo de acción se esquematiza en la Figura 41. Figura 41. Representación esquemática del mecanismo de acción del complejo 1a sobre células Caco-2. Se retomó entonces el análisis de las propiedades antiproliferativas del complejo [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a). El escaso aumento en los niveles de apoptosis y necrosis de acuerdo con los datos de citometría de flujo (Figura 32), unido a la ausencia de activación de caspasas y el fenotipo necrótico (Figura 33) nos indujeron a sospechar que este derivado podría inducir necroptosis en lugar de apoptosis. Además de las ya citadas evidencias, es pertinente mencionar una más. A la hora de detectar células necroptóticas mediante citometría de flujo, la doble tinción con anexina V-FITC y yoduro de propidio posee una importante limitación. Ya que durante la necroptosis no se produce la traslocación de la fosfatidil serina a la cara externa de la membrana plasmática, podría caerse en el error de suponer que las células necroptóticas darían un marcaje negativo para anexina V-FITC. No obstante, en la práctica las células en apoptosis tardía y las necroptóticas pueden confundirse. Debe tenerse en cuenta que uno de los primeros eventos de la necroptosis es la ruptura de la membrana plasmática debido a la excesiva hinchazón celular, lo que va a permitir la entrada en la célula de ambas sondas, de forma similar a lo que les ocurre a las células en apoptosis tardía97. De ahí que sea necesario medir otros parámetros, como el tamaño de las células, o incluir marcadores específicos de necroptosis en la mezcla de sondas para poder diferenciar ambas poblaciones. En nuestro caso concreto, el aumento de la CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 143 población celular en apoptosis tardía respecto al control negativo (Figura 32C) podría tratarse, en realidad, de células necroptóticas mal clasificadas. Se comenzó el estudio de marcadores necroptóticos mediante el análisis de la tasa de activación de la proteína RIP-1, que en el apartado 1.2 se mencionaba como una de las principales responsables de este tipo de muerte (ver Figura 9; pág. 41) tras incubar un cultivo de células Caco-2 con 2a durante 24h. Se observó un aumento de 8,5 veces en su nivel de expresión (Figura 42A), lo cual parecía confirmar su implicación en el tipo de muerte inducida por el complejo metálico. Para confirmarlo, se pre-incubó el cultivo con el inhibidor específico de RIP-1 necrostatina-1 (Nec-1). De acuerdo con la Figura 42B, el pre-tratamiento con Nec-1 aumentó significativamente la viabilidad celular en comparación con aquellas que solamente fueron incubadas con el complejo 2a (p<0,05), si bien no se consiguió reducir por completo el efecto antiproliferativo del complejo de oro. A B Figura 42. Análisis de la implicación de RIP-1 en la muerte celular inducida tras 24h de incubación con 2a (IC50). A) Niveles de expresión de la proteína RIP-1 tras 24h de incubación con DMSO (panel superior; control negativo, 2 μM) o 2a (panel inferior). B) Estudio del efecto del inhibidor de RIP-1 necrostatina-1 (50 µM, 1h) sobre la capacidad antiproliferativa de 2a. *p<0,05 respecto al control negativo. #p<0,05 respecto a células tratadas con 2a. Una vez demostrada la implicación de RIP-1 en la muerte celular inducida por 2a, se amplió el estudio utilizando dos inhibidores de puntos clave de la ruta necroptótica mejor caracterizada: aquella que depende de la unión entre TNF-α y su receptor TNFR1 (ver apartado 1.2, pág. 41; Figura 9). En primer lugar, se recurrió a un análogo del TNFR1 que impide su unión con TNF-α, observándose que el pre-tratamiento con este compuesto tenía un efecto similar al previamente encontrado con Nec-1 (Figura 43A). A continuación, se utilizó el compuesto SN50, capaz de bloquear la traslocación al núcleo de NF-κB y, por consiguiente, su efecto sobre la expresión de diversos genes relacionados con la expresión de citoquinas pro-inflamatorias entre las que se incluye el propio TNF-α, y se encontró de nuevo que remitía el efecto antiproliferativo de 2a CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 144 (Figura 43B). Por lo tanto, los resultados mostrados en las Figuras 42 y 43, sugieren que 2a induce la ruta necroptótica dependiente de TNF-α. A B Figura 43. Efecto de inhibidores de puntos clave de la necroptosis dependiente de TNF-α sobre la capacidad antiproliferativa de 2a (IC50) tras 24h de incubación. A) Pre-incubación con un análogo de TNFR1 (5 μM, 1 h). *p<0,05 respecto al control negativo. #p<0,05 respecto a células tratadas con 2a. B) Pre-incubación con SN50 (1 μM, 1 h). *p<0,05 respecto al control negativo. #p<0,05 respecto a células tratadas con 2a. No obstante, según puede observarse en las Figuras 42B y 43 ninguno de los tres inhibidores utilizados dio lugar a una recuperación de la viabilidad celular comparable a la del control negativo, es decir, no se produjo en ningún caso una anulación del efecto antiproliferativo de 2a. Kim et al.98 observaron que el pre-tratamiento con Nec-1 tampoco pudo bloquear por completo la necroptosis causada por un compuesto natural sobre células NSCLC, un modelo de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Cui et al. 99 obtuvieron resultados similares al inducir necroptosis sobre células de cáncer de próstata (línea PC-3) con selenito. En este caso particular, sin embargo, sí lograron una protección completa al recurrir a un inhibidor selectivo de la RIP-3. Tomando estos dos trabajos en consideración, es posible deducir que RIP-3 puede tener un papel mucho más relevante que RIP-1 en cuanto al control del proceso necroptótico, a pesar de que forzosamente deba ser activada por RIP-1, lo que se ve apoyado por los resultados obtenidos por otros investigadores acerca de su implicación crucial en la necroptosis mediada por TNF-α100. En este sentido, se podría quizá establecer una comparación CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 145 entre RIP-3 y las caspasas ejecutoras en cuanto a su papel determinante para el proceso de muerte celular. Dado que en el estudio del efecto de 2a nos hemos limitado a analizar el efecto de RIP-1 utilizando al inhibidor selectivo Nec-1, la hipótesis acerca del mayor peso de RIP3 en este proceso no puede ser confirmada ni descartada por el momento. Debe tenerse en cuenta, además, que no existen datos hasta el momento acerca del papel de RIP-3 en la inducción de necroptosis sobre la línea Caco-2, de modo que son necesarios más datos relativos a este modelo tumoral para esclarecer el porqué de los datos obtenidos hasta el momento. Al margen de esta posible relevancia de RIP-3, existe una segunda hipótesis que podría explicar los resultados mostrados en las Figuras 42B y 43, fundamentada en la estrecha relación entre los diferentes tipos de muerte celular. Anteriormente, se ha discutido acerca del papel de la necroptosis como mecanismo de emergencia en caso de que la apoptosis se encuentre bloqueada101. Se han encontrado también evidencias de que puede suceder a la inversa, es decir, que el bloqueo de la necroptosis tenga como consecuencia un aumento de la apoptosis. Han et al.102 observaron que el uso de Nec-1 podía causar un aumento de la apoptosis en dos modelos de leucemia (líneas K562 y HL60) tratadas con el compuesto natural shikonina. También se han dado casos en los que un único compuesto puede inducir al mismo tiempo apoptosis y necroptosis, de acuerdo con la investigación realizada por Khorsandi et al.103 acerca del efecto antitumoral de la quercetina sobre células MCF-7 (carcinoma de mama). Los autores demostraron que, tanto la inhibición de las caspasas mediada por zVAD (un conocido inhibidor de la apoptosis) como el bloqueo de la necroptosis causado por Nec-1 promovían una recuperación parcial de la viabilidad celular tras el tratamiento con quercetina. Observaron, además, que el uso de Nec-1 tenía como consecuencia inesperada un descenso en los niveles de expresión de BAX junto con un aumento en los de Bcl-2 en comparación con células tratadas únicamente con quercetina. Es decir, el bloqueo de la necroptosis podía tener un efecto anti-apoptótico como consecuencia, observándose que el uso de Nec-1 tenía un mayor efecto protector que el de z-VAD para la viabilidad del cultivo tratado con quercetina. En vista de esta curiosa relación entre ambos tipos de muerte celular, consideramos interesante volver a analizar con la doble tinción anexina V-FITC y yoduro de propidio al cultivo de Caco-2 tras 24h de incubación con 2a, aunque en esta ocasión tras una preincubación con Nec-1. Se obtuvo un incremento en el número de células en apoptosis temprana, concomitante con un descenso en la población en apoptosis tardía (Figura 44). De acuerdo con la suposición inicial de que las células en apoptosis tardía podrían ser células necroptóticas97, los resultados obtenidos sugieren que, al bloquear la necroptosis con Nec-1, los daños inducidos por 2a son todavía incompatibles con la vida, CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 146 por lo que la muerte de la célula es inevitable y se induce apoptosis de manera alternativa. Figura 44. Estudio de las poblaciones apoptóticas de un cultivo de células Caco-2 incubadas durante 24h con 2a (IC50) en presencia o ausencia de un pre-tratamiento con Nec-1 (50 µM, 1h). Si bien las pruebas obtenidas hasta el momento parecen indicar que 2a efectivamente induce la muerte por necroptosis como primera alternativa, todavía quedaba pendiente determinar el mecanismo molecular que desencadenaba esta respuesta. Además, dado el diferente comportamiento mostrado respecto a 1a, no podía descartarse que todos los procesos descritos hasta el momento fuesen consecuencia de una interacción directa con el ADN. Esta hipótesis se sustentaba sobre el hecho de que, recientemente, se ha descubierto la capacidad del cisplatino para inducir necroptosis sobre algunas líneas celulares104. Además, otros autores han relacionado la inducción de daños sobre el ADN con la muerte por necroptosis105. Por tanto, se evaluó la capacidad de 2a de interaccionar con el plásmido pIRES2-EGFP. Se utilizaron dos concentraciones distintas del complejo y al cisplatino como control positivo. La Figura 45 permite descartar la interacción directa entre el ADN y 2a, lo que, además de sugerir que el derivado de oro podría ser menos tóxico que el cisplatino, algo que ya se había sospechado al calcular sus respectivos índices de selectividad (Tabla 5), da pie a continuar la búsqueda de su mecanismo de acción, presumiblemente más selectivo. CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 147 Figura 45. Interacción entre el plásmido pIRES2-EGFP (carril 2) con 2a en una proporción complejo:plásmido de 0,5 (carril 6), 1 (carril 7) o 2 (carril 8), así como con cisplatino como control positivo (ratio 0,5 carril 3; ratio 1 carril 4; ratio 2 carril 5). Marcador de peso molecular en el carril 1. Tras haber descartado una interacción directa con el ADN como responsable de la inducción de la necroptosis, pasamos a considerar una hipotética ruptura del equilibrio redox como causa de la misma. Existen numerosas referencias acerca del papel clave de las especies reactivas de oxígeno en esta clase de muerte celular. Se ha observado que la propia proteína RIP-1, una vez activada, podría inducir la producción de ROS al causar un descenso en los niveles de expresión de la enzima mitocondrial responsable de la conversión de ADP en ATP. Este aumento de ROS genera, a su vez, un bucle de retroalimentación que conduce a un mayor aumento de la actividad de la RIP-1106,107. También la activación de la RIP-3 puede intervenir en la ruptura de la homeostasis redox, ya que en su caso es capaz de activar a enzimas relacionadas con la glicólisis y la respiración aerobia. Al aumentar ambos procesos, se produce como consecuencia un exceso de ROS106,108, que presumiblemente contribuiría a mantener a la RIP-1 activada y funcional según lo descrito anteriormente, contribuyendo asimismo a la activación de la propia RIP-3. Si bien es cierto que estos datos no apuntan a la generación de ROS como principales responsables de la necroptosis, sí dejan patente su relevancia para que el proceso continúe. Una prueba más contundente acerca del papel de las ROS como inductores de este tipo de muerte la presentaron Yu et al.109, al detallar la acción antitumoral de la citronela sobre un modelo de cáncer de pulmón humano (células NC1H1299). En el citado trabajo, los autores observaron dos picos en la producción de ROS: el primero de ellos se daba antes de finalizar las 6h de incubación, por lo que lo atribuyeron al efecto directo de la citronela, mientras que el segundo pico se daba pasadas 12h de tratamiento y lo atribuyeron al bucle de retroalimentación, es decir, al proceso necroptótico en sí. Por todo ello, se analizaron los niveles de ROS en células Caco-2 tras 1h de incubación con 2a. Se utilizó la sonda fluorescente CellROX® Deep Red Reagent y microscopía de fluorescencia. La Figura 46A muestra un notable aumento de la fluorescencia, que se corresponde con un incremento del nivel intracelular de ROS en respuesta al tratamiento con el derivado metálico. Para confirmar que este hecho guardaba relación con la muerte celular, se analizó la viabilidad del cultivo tras un pre-tratamiento con el CAPÍTULO 1: Alquinil derivados de oro(I) con fosfinas hidrosolubles 148 antioxidante N-acetil-cisteína (NAC). El uso de este compuesto sí revirtió por completo el efecto del complejo metálico sobre la muerte del cultivo (Figura 46B), lo que no se había conseguido con ninguno de los inhibidores específicos de la necroptosis utilizados previamente (Figuras 42B y 43). Esto demuestra el papel central de la producción de ROS en la muerte celular inducida por 2a. Figura 46. Influencia de 2a sobre la producción de ROS. A) Análisis de la cantidad total de ROS en el interior celular tras 1h de incubación con DMSO (panel izquierdo; control negativo, 2 μM) o 2a (IC50) (panel derecho) utilizando la sonda fluorescente CellROX® Deep Red Reagent. B) Influencia de la pre-incubación con NAC (30 mM, 1h) sobre la viabilidad celular tras 24h de incubación con 2a (IC50). *p<0,05 vs control negativo. #p<0,05 vs 2a. Una vez demostrado el papel esencial de la inducción de estrés oxidativo para el efecto antiproliferativo de [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), se decidió estudiar el potencial de RIP-1 en esta producción de ROS, ya que de acuerdo con los trabajos anteriormente mencionados la activación de esta proteína puede tener como consecuencia un aumento en los niveles de especies reactivas de oxígeno106–108. Se determinaron los niveles de ROS tras una pre-incubación con Nec-1 y se encontró que, efectivamente, la inhibición de RIP-1 promovía un descenso en los niveles de ROS, comparable tanto al del control negativo como al utilizar NAC (Figura 47). Estos resultados son similares a los obtenidos por Yu et al. 109 en relación al pico de ROS obtenido una vez se activaba la maquinaria necroptótica, y dejan constancia una vez más del papel de RIP-1 en la generación de ROS, necesaria a su vez para el bucle de retroalimentación ROS-RIP-1 que induce la formación del necrosoma y la consiguiente muerte celular vía necroptosis. CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 251 En nuestra experiencia, la tendencia que muestran los complejos de oro(I) es a ejercer un mayor efecto antiproliferativo sobre el modelo de cáncer colorrectal, lo que se hace evidente si observamos los resultados obtenidos con las series 3a-d y 4a-d (ver Capítulo 3, pág. 205; Tabla 12). Este comportamiento también se observó con el complejo [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), cuyo IC50 sobre células MCF-7 tiene un valor de 19,02 ± 0,02 µM, 5 veces mayor que sobre células Caco-233. Trabajos de otros autores muestran pautas similares tanto con complejos de oro(I)34, como de oro(III)35. Una posible explicación a estas diferencias reside en la afinidad de los complejos de oro por la tiorredoxina reductasa, enzima que está sobreexpresada de forma habitual en cáncer colorrectal, pero no en todos los subtipos de cáncer de mama. En este sentido, la inhibición de la TrxR puede ser de gran interés en tumores colorrectales dada su alta dependencia de su acción redox36,37, pero se ha observado que en tumores de mama positivos para el receptor de estrógenos la situación es completamente diferente. Un estudio llevado a cabo por Cañas et al.38 sobre la línea MCF-7, modelo de cáncer de mama positivo para el receptor de estrógenos, reveló que la inhibición de la TrxR causada por auranofin tenía como consecuencia un aumento en la cantidad de proteínas nitrosiladas. Esta ruptura de la homeostasis S-nitrosotiol causaba un efecto proliferativo sobre el cultivo celular. Es decir, en el caso de complejos de oro cuya única diana sea la TrxR, es esperable que su efecto terapéutico sea menor en la línea MCF-7 que en otros modelos celulares como puede ser la línea Caco-2. De hecho, esto explicaría en parte el hecho de que el complejo [Au(L2b)PPh3] (3b) (siendo L2b el alquino derivado de la 3hidroxiflavona 2-(4-bromofenil)-3-hidroxi-4H-cromen-4-one) tuviese un efecto considerablemente mayor sobre la línea Caco-2 que sobre la MCF-7 (ver Capítulo 3, pág. 205; Tabla 12), ya que dos de sus dianas terapéuticas eran la COX-2), que no se expresa en la línea MCF-7, y además la TrxR, cuya inhibición podría incluso tener el efecto contrario al deseado38. Retomando el papel del complejo [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) sobre la línea MCF-7 a la vista de estas consideraciones, estos datos podrían interpretarse de dos maneras. Puede suponerse que este complejo carece de afinidad por la TrxR y que en su lugar afecta a otra diana, o bien que se trata de un complejo multitarget y que además de inhibir a dicha enzima afecte a otras dianas que sí son clave para la supervivencia de la línea MCF-7. Tomando como modelo a la línea Caco-2, se decidió analizar la capacidad de 7a de inhibir a la TrxR tras 24h de incubación. Se encontró un descenso significativo (p<0,05) en la actividad de la enzima (Figura 75), lo cual la señala como una de sus potenciales dianas terapéuticas. Por lo tanto, esto parece invalidar la primera de las hipótesis planteadas. CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 252 Figura 75. Efecto del complejo 7a (IC50) sobre la TrxR de células Caco-2 tras 24h de incubación. *p<0,05 vs control negativo. En el ya mencionado trabajo de Cañas et al.38, los autores descubrieron que la inhibición de la TrxR llevada a cabo por el tratamiento con auranofin sí causaba la muerte de las células MCF-7 si se bloqueaba al mismo tiempo la expresión del receptor de estrógenos. De acuerdo con estos resultados, cabría la posibilidad de que el complejo 7a actúe no solo como inhibidor de la TrxR sino, además, como un antagonista del receptor de estrógenos. De acuerdo con esta aproximación, el efecto proliferativo causado por la inhibición de la tiorredoxina reductasa podría quedar anulado y causar la muerte de la célula. Este efecto antagonista podría estar mediado por un bloqueo directo del receptor o bien por una inhibición indirecta al reducir su nivel de expresión. Se decidió llevar a cabo un ensayo preliminar para determinar si el mecanismo de acción de los ligandos y los complejos podría estar relacionado con el receptor de estrógenos. Para ello, se calculó el IC50 de ambos ligandos y de los complejos [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) y [Au(L2)(PPh3)](TfO) (7b) a modo de ejemplo sobre la línea celular MDA-MB-231, un modelo de cáncer de mama que no expresa el receptor de estrógenos39. Los valores obtenidos tras 72h de incubación se muestran en la Tabla 20. CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 253 Tabla 20. Valores de IC50 (µM) obtenidos para los complejos 7a y 7b, así como para sus ligandos L1 y L2, tras 72h de incubación en células MDA-MB-231. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. *p<0,05 vs ligando. Complejo IC 50 ( μ M) L1 5,69 ± 0,11 [Au(L1)(PPh 3 )](TfO) ( 7a ) 0,78 ± 0,20* L2 154,09 ± 0,01 [Au(L2)(PPh 3 )](TfO) ( 7b ) 0,27 ± 0,05* Si comparamos estos resultados con los previamente obtenidos sobre la línea MCF-7 (Tabla 19), el dato más llamativo es el IC50 del ligando L2, ya que es aproximadamente 12 veces mayor en el modelo que no expresa el receptor de estrógenos que en el que sí lo expresa. Esta marcada diferencia podría implicar que el ligando L2 es capaz de interaccionar con el receptor de estrógenos, lo que explicaría su considerable efecto sobre la línea MCF-7. El ligando L1, por el contrario, resulta más efectivo frente al modelo negativo para el receptor de estrógenos que para el positivo, por lo que se descarta la hipótesis planteada en este supuesto. De igual manera, los dos derivados de oro(I) ensayados sobre la línea MDA-MB-231 muestran valores comparables a los previamente obtenidos en la línea MCF-7 (complejo 7a), o incluso exhiben un mayor efecto antiproliferativo (complejo 7b). Por tanto, parece quedar descartada la posibilidad de que el efecto biológico de los complejos esté mediado por una fuerte interacción con el receptor de estrógenos. No obstante, los datos obtenidos en la línea MDA-MB-231 resultan interesantes en tanto a que todos los resultados obtenidos hasta el momento apuntan a que esta serie de derivados de oro(I) podrían tener un futuro prometedor en el tratamiento del cáncer de mama, independientemente de que se exprese o no el receptor de estrógenos. Existen evidencias de que el auranofin es capaz de reducir la actividad de la enzima telomerasa mediante la producción de ROS y la inactivación de STAT3 en células MDA-MB-23140. Puesto que la actividad telomerasa es clave para las células tumorales, esta podría ser una de las dianas a través de las cuales los complejos 7a y 7b llevan a cabo su efecto antiproliferativo. No obstante, serán necesarios futuros ensayos en esta dirección para poder ahondar en esta hipótesis. A continuación, se procederá a comparar la efectividad de los distintos derivados de plata de acuerdo con los valores de sus IC50 recogidos en la Tabla 19. En el caso de los complejos 7-11a con el ligando L1 (N-fenil-N-(piridin-2-il)isonicotinamida), aquellos derivados coordinados con un único ligando (complejos [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a) y [Ag2(TfO)2(L1)(PPh3)2] (9a)) muestran un mayor efecto antiproliferativo que sus análogos coordinados con dos ligandos (complejos 10a y 11a) sobre ambos modelos CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 254 tumorales. Los datos obtenidos parecen indicar que la presencia de estos dos ligandos tipo 2-anilinopiridina podría dificultar la entrada en la célula o bien impedir una unión efectiva a la diana terapéutica, lo que explicaría su menor efecto antiproliferativo en comparación con sus análogos. De igual manera, son en general más efectivos los complejos con dos centros metálicos ([Ag2(TfO)2(L1)(PPh3)2] (9a) y [Ag(TfO)(L1)]2 (10a)) que aquellos que cuentan con un único átomo de plata, salvo la ya mencionada excepción de 10a en la línea MCF-7. A grandes rasgos, estos derivados podrían ordenarse de acuerdo con su efecto terapéutico de la siguiente manera: 9a > 8a > 10a > 11a. Los complejos con el ligando tiofeno L2 (N-fenil-N-(piridin-2-il)tiofeno-2carboxamida) (7b-11b), sin embargo, muestran un comportamiento diferente, puesto que los derivados coordinados con dos ligandos L2 (complejos [Ag(TfO)(L2)]2 (10b) y [Ag(TfO)(L2)2] (11b)) tienen un mayor efecto antitumoral que los que solo cuentan con un ligando. Considerando que el ligando L2 posee un efecto citotóxico considerable por sí solo, estos resultados no deberían ser sorprendentes, puesto que gran parte de la acción biológica de los derivados podría ser consecuencia directa de la presencia del ligando. En este caso, además, las diferencias entre los derivados mono o dinucleares son menos acusadas que en el caso de los complejos 7a-11a. Posteriormente, se obtuvo una primera aproximación acerca de la toxicidad de los derivados de oro y plata sobre tejidos sanos calculando el valor del IC50 tras 72h de exposición sobre la línea Caco-2 diferenciada, así como los valores del índice de selectividad correspondientes (Tabla 21). Según puede observarse, son varios los complejos con un índice de selectividad superior al del cisplatino y auranofin. Por el contrario, los ligandos libres muestran una selectividad escasa, con valores de SI en el mismo rango que el de los dos controles positivos en la línea Caco-2 y en el rango del auranofin en la línea MCF-7. Estos datos sugieren que, a pesar de que los ligandos muestran un cierto efecto antiproliferativo por sí solos, especialmente sobre la línea Caco-2 (Tabla 19), su uso como quimioterápicos estaría descartado debido a su potencial toxicidad sobre los tejidos sanos. De entre los complejos que poseen índices de selectividad superiores a los de cisplatino y auranofin, se escogió a aquellos que, además, destacasen por su potencial antiproliferativo. Teniendo en cuenta, por lo tanto, los datos de las Tablas 19 y 21 de manera conjunta, los derivados más prometedores resultaron ser los complejos [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a), [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a), [Ag(TfO)(L2)]2 (10b) y Ag(TfO)(L2)2] (11b). No obstante, se optó por descartar a los dos derivados con el ligando L2, puesto que según se ha mencionado anteriormente, gran parte de su efecto biológico podría estar mediado por el ligando, siendo la coordinación al centro metálico una forma de reducir su toxicidad en tejidos sanos más que una estrategia para aumentar su acción antitumoral. Por consiguiente, en futuros ensayos solamente se tomarán en consideración los complejos 7a y 8a. Dado que ambos complejos son mononucleares y poseen un único ligando de tipo 2-anilinopiridina, se aprovechó además para comparar CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 255 la eficacia del centro metálico en dos complejos que por lo demás son análogos. Es decir, se comparó el potencial anticancerígeno de un complejo de oro(I) con el de uno de plata(I). Tabla 21. Estudio preliminar de la selectividad de los complejos de oro y plata mediante el cálculo del IC50 tras 72h de exposición en células Caco-2 diferenciadas y la determinación del índice de selectividad a partir de los datos de IC50 en células tumorales. Complejo IC50 (µM) en Caco-2 diferenciadas Índice de selectividad Caco - 2 MCF - 7 L1 125,76 ± 13,43 1,26 7,21 [Au(L1)(PPh 3 )](TfO) ( 7a ) 39,40 ± 23,39 17,67 85,65 [Ag(TfO)(L1)(PPh 3 )] ( 8a ) 9,44 ± 2,12 1,71 1,31 [Ag 2 (TfO) 2 (L1)(PPh 3 ) 2 ] ( 9a ) 10,88 ± 2,82 43,52 2,65 [Ag(TfO)(L1)] 2 ( 10a ) 48,74 ± 10,01 6,50 - [Ag(TfO)(L1) 2 ] ( 11a ) 120,51 ± 11,52 11,79 7,73 L2 124,29 ± 7,50 2,56 9,96 [Au(L2)(PPh 3 )](TfO) ( 7b ) 13,53 ± 0,02 3,61 3,83 [Ag(TfO)(L2)(PPh 3 )] ( 8b ) 10,23 ± 4,02 1,44 1,52 [Ag 2 (TfO) 2 (L2)(PPh 3 ) 2 ] ( 9b ) 39,65 ± 19,06 2,75 5,34 [Ag(TfO)(L2)] 2 ( 10b ) 55,40 ± 1,43 41,97 20,91 [Ag(TfO)(L2) 2 ] ( 11b ) 80,26 ± 26,90 19,02 89,18 Cisplatin o 151,13 ± 58,12 3,31 3,61 Auranofin 6,21 ± 0,44 3,45 8,06 Puesto que ya se ha propuesto a la tiorredoxina reductasa como potencial diana del complejo de oro 7a, y existen algunas evidencias de que los derivados de plata podrían interaccionar de manera similar con esta enzima 25,41, se analizó la actividad de la TrxR de un cultivo de células Caco-2 tras 24h de incubación con el complejo de plata 8a. Al no encontrarse ningún efecto sobre la función de la enzima tratando el cultivo con una cantidad equivalente al IC50 del complejo (5 μM), se duplicó esta cantidad, obteniéndose entonces una reducción significativa (p<0,05) en la actividad enzimática (Figura 76). CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 256 Figura 76. Efecto de dos concentraciones de 8a (IC50: 5 μM y 2xIC50: 10 μM) sobre la enzima Trxr de células Caco-2 tras 24h de incubación. *p<0,05 vs control negativo. Estos resultados parecen sugerir que el complejo [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a) es capaz de interaccionar con la TrxR, si bien es necesario aumentar la cantidad del mismo en el cultivo para observar un efecto significativo. Esto podría sugerir que la TrxR no es la diana principal del complejo, sino que se interacciona con ella una vez que esta hipotética diana principal queda saturada. Por tanto, estos resultados no invalidarían los previamente encontrados por otros autores sobre enzimas recombinantes, ya que en efecto parece existir una cierta atracción entre los complejos de plata(I) y la tiorredoxina reductasa, aunque puede que no sea la diana molecular por la que sienten una mayor afinidad, de modo que es posible que la TrxR no sea la única diana de esta clase de complejos. Si bien los resultados de Citta et al.41 sugieren que los complejos de plata podrían ser inactivos frente a la enzima glutatión reductasa (GR), Lee et al.42 observaron que la administración de nitrato de plata en la planta acuática Lemna paucicostata tenía un considerable efecto inhibitorio sobre dicha enzima. Aunque deberíamos basarnos en los resultados de Citta et al.41, ya que fueron obtenidos sobre un modelo tumoral, no puede ser descartada la existencia de una cierta afinidad entre los complejos de plata y la enzima GR notificada por Lee et al.42, lo que podría apuntar a esta proteína como una potencial diana de 8a. Por lo tanto, se decidió evaluar la actividad de esta enzima en células Caco-2 tras 24h de incubación con los dos complejos de oro y plata 7a y 8a respectivamente (Figura 77). El complejo de oro 7a fue incluido en el estudio para determinar si se trataba de un inhibidor específico de la TrxR o si, por el contrario, se trataba de un compuesto multitarget. CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 257 Figura 77. Análisis de la actividad GR de células Caco-2 tras 24h de incubación con los complejos de oro y plata. A) Efecto de 7a (IC50). B) Efecto de 8a (IC50 y 2xIC50). *p<0,05 vs control negativo. #p<0,05 vs IC50. De acuerdo con los datos de la Figura 77A, el complejo [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) parece ser un inhibidor selectivo de la TrxR, como es habitual para los complejos de oro(I) dada su alta afinidad por las selenoproteínas como la tiorredoxina reductasa43,44. En este caso, no se encuentra un aumento de la actividad GR para compensar el bloqueo de la tiorredoxina reductasa que sí se había observado en apartados anteriores de la presente memoria (ver Capítulo 3, pág. 212; Figura 69B). En cuanto al cultivo tratado con el complejo [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a), los resultados resultan sorprendentes (Figura 77B). Al incubar las células con una cantidad equivalente al IC50 del derivado de plata, se observa un enorme incremento de la actividad de la enzima, que sufre una reducción al duplicar la cantidad de compuesto a añadir, recuperándose unos valores comparables a los del control negativo. Este aumento en la actividad de la GR podría corresponderse con un mecanismo de la célula tumoral para evitar el efecto antiapoptótico de 8a, ya que la sobreexpresión de la GR se puede correlacionar con la resistencia a la quimioterapia45. Por otra parte, también puede producirse un aumento en los niveles de actividad de la GR sin necesidad de que aumente su nivel de expresión. Estos cambios son dependientes de los niveles de ROS y se cree que son parte de un mecanismo defensivo de la célula frente a un exceso de estrés oxidativo, siendo su misión principal mantener constantes los niveles de glutatión reducido para evitar la muerte celular46. En cualquier caso, al aumentar la concentración de 8a tiene lugar una considerable pérdida en la actividad de la GR, hasta tal punto que no existen diferencias significativas respecto al control negativo. Puede suponerse que el posible efecto protector se perdería, quizá debido al bloqueo de otras macromoléculas clave para la célula tumoral, por ejemplo la TrxR (Figura 76). En cualquier caso, ninguna de las enzimas redox estudiadas hasta el momento parecen ser las dianas principales del derivado de plata(I) 8a. CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 258 A la vista de los resultados obtenidos hasta el momento, se decidió analizar los niveles de ROS tras 1h de incubación con ambos complejos; del complejo 8a se ensayaron las dos concentraciones ya probadas para medir las actividades enzimáticas. Tal y como cabía esperar, se observa un incremento significativo (p<0,05) de los niveles de ROS tras la incubación con el complejo de oro 7a, siendo esta la consecuencia del bloqueo de la TrxR (Figura 78A). Por otra parte, el tratamiento con el IC50 del complejo de plata 8a no tiene ningún efecto sobre el equilibrio redox, si bien al duplicar la cantidad a añadir sí se obtiene un aumento significativo (p<0,05) respecto al control negativo (Figura 78B). De nuevo, estos resultados se correlacionan con los previamente obtenidos al analizar la actividad TrxR (Figura 76), ya que cuando se añade al cultivo una cantidad equivalente al IC50 de 8a no se observan cambios en la función de la enzima, no así al duplicar la concentración. Por otro lado, se descarta que el aumento en la actividad de la GR observado al tratar el cultivo con el IC50 del derivado de plata esté motivado por un exceso de ROS, según se planteaba anteriormente46. Figura 78. Medida de los niveles de ROS en células Caco-2 tras 1h de incubación con A) 7a (IC50) o B) dos concentraciones de 8a (IC50 y 2xIC50). *p<0,05 vs control negativo. Tras descartar a estas dos enzimas redox como principales dianas terapéuticas del complejo de plata 8a, y observar que el complejo de oro 7a podría actuar como un inhibidor selectivo de la TrxR, pasamos a investigar el posible papel del proteasoma en el efecto antiproliferativo de ambos compuestos. En el apartado 1.5 se ha mencionado la capacidad del auranofin de inhibir a las enzimas deubiquitinasas asociadas a la subunidad 19S del proteasoma47, de forma similar a lo descrito por Chen et al.32 con una serie de nuevos derivados de plata. Sin embargo, también se ha descrito que existen derivados de oro capaces de inhibir a la subunidad 20S del proteasoma31,48. Por tanto, se decidió analizar la actividad quimotripsina del proteasoma, que se corresponde con su capacidad proteolítica, tras 24h de incubación con ambos complejos (Figura 79). CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 259 Figura 79. Efecto de 24h de incubación de los complejos 7a y 8a sobre la actividad quimotripsina (subunidad 20S) del proteasoma de células Caco-2. *p<0,05 vs control negativo. De acuerdo con la Figura 79, puede observarse que el tratamiento con el complejo de oro 7a induce un descenso significativo en la capacidad proteolítica del proteasoma, lo que se corresponde con una inhibición de su función normal. Por consiguiente, este derivado parece actuar como un compuesto multitarget capaz de inhibir tanto a la TrxR como a la subunidad 20S del proteasoma. Por el contrario, al tratar el cultivo con su análogo de plata no solo no se observa un descenso en la actividad proteasa de este orgánulo, sino que incluso se aprecia un aumento significativo (p<0,05) de la misma. Este incremento en la actividad del proteasoma podría causar a su vez el aumento en la actividad de la GR previamente mostrado en la Figura 77B, puesto que se ha recogido que la actividad proteasomal podría estar directamente relacionada con el estatus redox de la célula y causar un aumento en los niveles de expresión de la glutatión reductasa entre otras enzimas antioxidantes49. La Figura 79 permite, además, descartar que el derivado de plata cause su efecto antitumoral a través del bloqueo de la subunidad 20S del proteasoma. Estos resultados concordarían con los previamente obtenidos por Chen et al.32, según los cuales los complejos de plata parecen sentir una mayor afinidad por las deubiquitinasas asociadas al proteasoma que por la subunidad 20S. Por lo tanto, sigue sin tenerse clara la diana terapéutica con la que interacciona el complejo de plata para causar el descenso en la viabilidad celular observado. A continuación, se estudió la capacidad de ambos complejos de inducir apoptosis en el cultivo de células Caco-2. Inicialmente, el tiempo de incubación se fijó en 24h, aunque no se obtuvo ningún resultado apreciable con el complejo de plata 8a. Se podría haber optado por aumentar la concentración a añadir, de forma similar a como se había hecho para medir la actividad TrxR y GR, aunque en este caso se prefirió incrementar el tiempo de incubación hasta las 48h (Figura 80). El motivo tras esta decisión fue, precisamente, los cambios observados al aumentar la concentración del complejo en cuanto a su efecto sobre las enzimas redox. Aumentar la concentración de un fármaco para determinar su CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 260 afinidad por una proteína es una aproximación comparable a realizar un ensayo con enzimas recombinantes. Es decir, es una manera de “forzar” una interacción para obtener no tanto una idea del mecanismo de acción del complejo en concreto que se está ensayando, sino de otros derivados que compartan ciertas características con él. En este sentido, debe tenerse en cuenta que la afinidad de los complejos de plata por la tiorredoxina puede ser limitada, pero no se puede negar su existencia. No obstante, al doblar la cantidad de compuesto que se añade al medio de cultivo podrían obtenerse, de igual manera, resultados “forzados” al bloquearse enzimas y vías que no lo harían de tratarse el cultivo con el IC50 del compuesto. Teniendo en cuenta que el tipo de muerte celular puede ser determinante a la hora de escoger el tumor que mejor responda a un tratamiento concreto (por ejemplo, un fármaco capaz de inducir necroptosis sería adecuado para un tumor resistente a la apoptosis), nos pareció arriesgada la posibilidad de alterar estos resultados. Por ello, se aumentó el tiempo de exposición, ya que en casos anteriores esta estrategia había dado buenos resultados (ver Capítulo 3, pág. 217; Figura 72A). Figura 80. Estudio de las poblaciones apoptóticas y necróticas en un cultivo de células Caco-2 indiferenciadas tras 48h de tratamiento con A) DMSO (control negativo); B) 7a (IC50); C) complejo 8a (IC50). Los resultados obtenidos muestran que ambos compuestos inducen un aumento de la población apoptótica tras 48h de incubación. En el caso del complejo de oro 7a (Figura 80B), se observa un aumento de 4,4 veces en el porcentaje de células en apoptosis temprana, y de 7 veces en el de apoptosis tardía, mientras que el complejo de plata 8a (Figura 80C) induce un aumento de 7,7 veces en el porcentaje de células en apoptosis temprana y de 3,6 veces en el de apoptosis tardía. Según se apuntaba anteriormente, el complejo de plata podría tardar más tiempo que su homólogo de oro en inducir la muerte del cultivo celular, lo que parece corroborar el hecho de que 7a cause un aumento en la población de células en apoptosis tardías mientras que 8a hace lo propio en las que se encuentran todavía en una fase temprana de esta clase de muerte. Por otra parte, ninguno de los complejos indujo cambios significativos en la población necrótica. Por lo tanto, los resultados mostrados en la Figura 80 sugieren que ambos compuestos inducen la muerte por apoptosis tras 48h de incubación. Para confirmarlo, CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 267 Figura 84. Mecanismo de acción del complejo [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) sobre células Caco-2. Por otra parte, se ha comparado el efecto de sustituir un átomo de oro por un átomo de plata en el centro metálico de un potencial agente antitumoral. En este caso concreto, se ha obtenido un efecto antiproliferativo mayor para el derivado de oro que para el de plata en términos de IC50, y además se ha observado que el primero posee una mayor capacidad pro-apoptótica que el segundo. Por lo tanto, se ha concluido que el derivado de oro ensayado posee un mayor interés como potencial quimioterapéutico que su análogo de plata. Sin embargo, dados los resultados obtenidos no puede negarse el potencial de los derivados de plata como complejos anticancerígenos. A pesar de no haberse identificado su diana o dianas terapéuticas, los resultados preliminares sugieren que, al inducir apoptosis independiente de ROS, su impacto sobre los tejidos sanos podría ser bajo. Por lo tanto, parece que este complejo cumple el criterio de selectividad que es requisito imprescindible para los agentes quimioterapéuticos del futuro. De acuerdo con la literatura científica previa, la mitocondria y/o las deubiquitinasas asociadas a la subunidad 19S del proteasoma podrían ser sus dianas terapéuticas más probables, aunque serán necesarios futuros ensayos para poder confirmarlo. Resulta interesante, además, el hecho de que los derivados de oro(I) y plata(I) podrían no compartir dianas terapéuticas, de acuerdo con los datos aquí mostrados. Esto podría ser de gran relevancia en cuanto a que los complejos de plata(I) podrían ser utilizados como quimioterapia de segunda elección en caso de que el tumor desarrollase resistencia a la terapia con oro(I), y viceversa. Por otro lado, este trabajo pone de manifiesto la necesidad de validar los resultados obtenidos al realizar ensayos de actividad enzimática utilizando proteínas recombinantes sobre modelos celulares, puesto que podrían obtenerse conclusiones poco acertadas. En este sentido, se ha propuesto a la tiorredoxina reductasa como una posible diana terapéutica de los derivados de plata, y si bien nuestros datos sugieren que, en efecto, los complejos de CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 268 plata(I) pueden llegar a inhibir la acción de dicha enzima, es necesario aumentar la concentración del mismo para poder observar este efecto en un ensayo sobre un cultivo celular. Por lo tanto, sería recomendable repetir todo ensayo realizado en un entorno acelular sobre un modelo tumoral antes de darlos por válidos, lo que pone el foco sobre la importancia de los equipos de investigación multidisciplinares para un adecuado avance de la investigación biomédica. CAPÍTULO 4: Complejos de oro(I) y plata(I) con ligandos derivados de 2-anilinopiridina 269 REFERENCIAS (1) Zhang, Z.; Wang, H.; Yan, M.; Wang, H.; Zhang, C. Novel Copper Complexes as Potential Proteasome Inhibitors for Cancer Treatment (Review). Mol. 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According to preclinical data obtained, the main goal proposed at the beginning - which consisted on finding a safer and more efficient alternative to cisplatincan be considered fulfilled. Upon concomitant analysis of IC50 values and Selectivity Index, certain complexes highlight among all of them, which are [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), 3a-d series ([Au(L2a-d)PPh3]) coordined to ligands derived from 3-hydroxyflavone units, specially [Au(L2b)PPh3] (3b), [Au(L2c)PTA] (4c), which also contains a molecule derived from 3hydroxyflavone, and [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) coordinated to a molecule derived from 2anilinopiridine, according to both safety and efficacy parameters. [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a) might be included in this category as well, given that, although its Selectivity Index has not been calculated, a model of gastrointestinal barrier (differentiated Caco-2 cells) showed no changes in cell viability upon treatment with IC50 value of this derivative compared to negative control, which might be indicative of tumor selectivity as well as clinical efficacy. Nevertheless, a series of novel gold(I) derivatives that might display a promising clinical future has been identified. The choise of the appropiate ligands has an undeniable heft on the therapeutic effect of the resultant molecule. A clear example is found on chapter 1 when comparing the bioactivity of complexes [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a) and [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), since the addition of a single nitrogen atom on the alkynyl skeleton results on differences regarding the affinitty toward thioredoxin reductase, as well as the type of cell death induced. The extra nitrogen facilitates interaction between molecules of [Au(C≡C-2NC5H4)(PTA)], thus the capacity of interacting with thioredoxin reductase showed by complex [Au(C≡CPh)(PTA)] is lost. This fact is responsible of the mechanism of acon exerted by complex 2a, since the formation of such complexes aggregates on mitochondria leads to mitochondrial failure and, as a consequence, to necroptotic cell death, whereas complex 1a triggered intrinsic apoptosis as usual for gold(I) derivatives, a mechanism of action that shares with auranofin among others. Similarly, the election of 3-hydroxyflavone unit as ligand has shown to be an interesting strategy in order to lead complexes to molecular targets by which gold(I) derivatives usually display few or even no attraction, such as cyclooxygenase enzyme, as shown on chapter three. Two derivatives have been identified as cyclooxygenase inhibitors: [Au(L2b)PPh3] (3b) and [Au(L2c)PTA] (4c), which are able to inhibit isoformms 2 and 1 respectively. The molecule derived from 3-hydroxyflavone might be responsible of the affinity of [Au(L2c)PTA] (4c) for the redox enzyme glutathione reductase as well, given that gold complexes do not interact with this enzyme due to ist lack of the selenenocysteine aminoacid. On the other hand, both complexes are able to inhibit the most usual molecular target of gold derivatives, the enzyme thioredoxin reductase, which suggests that the metallic centre is as relevant as the ligands in regards to CONCLUSIONS 286 mechanism of action of the resultant complex. This capacity of interacting with more than one biomolecule at once showed by these complexes, turn them into multitarget complexes, which must be taken into consideration for future studies given the relevance of this kind of drugs on chemotherapy. Lastly, it must be carefully considered that, despite both complexes are able to trigger apoptosis, complex [Au(L2c)PTA] (4c) showed a slower pro-apoptotic effct than complex [Au(L2b)PPh3] (3b), probably because of an activation of cytoprotective autophagy. In light of this, the combination of this complex with an autophagy inhibitor might increase its therapeutic effect. Therefore, the choice of the ligand will strongly influence the antitumor effect of the complexes, thus becoming themselves more appropiate for the treatment of concrete subtypes of cancer. E.g. [Au(L2b)PPh3] (3b) might be more useful against those tumors displaying an overexpression of cyclooxygenase-2, whereas complex [Au(C≡C-2NC5H4)(PTA)] (2a) might be of great interest for the treatment of apoptosis-resistant cancer. Consequently, creating multidisciplinary teams that collaborate close on each stage of the projects, from complex synthesis to analysis of its antitumor effect, must be a priority on the development of novel chemotherapeutic drugs. On the other hand, the development of a novel drug cocktail containing [Au(C≡C-2NC5H4)(PTA)] (2a) and acidic polyphenols from the rosehip of the wild plant Rosa canina has proved that, as well as was previously observed when combining cisplatin and several plant extracts, the therapeutic effect of gold(I) derivatives might be improved with the concomitant addition of plant extracts. The additive pharmacological interaction between both agents suggests a way to increase the antiproliferative effect of the metallodrug instead by increasing its concentration; wich might be beneficial in order to reduce side effects derived by drug acummulation. The plant extract does not potentiate the mechanism of action of the metallodrug itself, instead, the combination blocks necroptosis triggered by the gold derivative upon autophagy activation in order to maintain cellular integrity. In adittion, since mitochondria are quite damaged due to treatment, lysosomes are affected as well and the autophagic flux remains uncomplete, thus triggering apoptosis cell death. Nevertheless, results obtained so far are enterelly preclinical, and assays on animal models must be performed to validate them. Despite the proposed thesis was initially focused on the development of novel chemotherapeutic agents for the treatment of colorectal cancer, some of the derivatives was tested towards further cancer models. This analysis allowed us to study their selectivity towards colorectal cancer. As an example, complex [Au(L2b)PPh3] (3b) studied on chapter 3, showed twice antiproliferative effect on Caco-2 cell line than on an hepatocarcinoma model, and a 9-fold increase on MCF-7 cell line (breast adenocarcinoma) compared to Caco-2 cell line, wich suggetst that might be selective toward a colorectal cancer subtype whose molecular profile was close to the one of Caco-2 cells. Not only likely colorectal cancer-selective complexes have been identified: CONCLUSIONS 287 complex [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) displayed great antiproliferative effect towards two breast cancer models (MMCF-7 and MDA-MB-231 cell lines). These data show up the relevance of evaluating the effect of the complexes toward a panel of different cancer models despite the main purpose is finding a chemotherapeutic agent against a very specific cancer type, since unexpected but interesting results might be obtained. This fact is closely related with the current idea of drug repurposing, which pleads with giving a second chance to drugs as novel therapeutic option for diseases other than the ones they were initially designed for. In this respect, on chapter 3 the antibacterial potential of series 5a-d ([Au(L2a-d)(IMe)] and 6a-d ([Au(L2a-d)(IPr)]) has been studied towards a panel of Gram positive and Gram negative bacteria. Despite that these complexes were initially synthethized as chemotherapeutic agents, their relatively low antiproliferative capacity in comparison to their phosphine gold(I) homologues might have supposed their definitive discard as drugs. However, upon evaluating their antibacterial effect they have received a second opportunity. Again, the choice of the appropiate ligands is proved to be relevant, so that the presence of phosphines (series 3a-d and 4a-d) leads to a high cytotoxicity toward the evaluated cancer cell models, whereas the replacement of phosphines by carbenes results on a reduction in this cytotoxicity in benefit of their antibacterial properties. It is of great interest the capacity of complex [Au(L2b)(IMe)] (5b) to inhibit not only Gram positive bacteria growing, which is common for gold(I) derivatives, but also Gram negative. This finding suggests it might inhibit the usual molecular target of antibacterial gold(I) complexes, redox enzyme thioredoxin reductase, and also display certain affinity for other bacterial proteins. Further studies will be needed in order to fully characterize the antibacterial effect of complex [Au(L2b)(IMe)] (5b). In the last chapter, the replacement of gold(I) by silver(I) has been analyzed in terms of the antitumor properties. According to the obtained data, the gold complex [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) displays a 2.5-fold increase in IC50 compared to silver(I) counterpart [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a); besides, the gold(I) derivative displays a 10-fold increase in Selectivity Index, which is of great relevance. Taken together, these results suggest that, in this specific case, the gold complex [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) might be a more adequate therapeutic option than [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a) for the management of colorectal cancer. On the other side, both complexes do not share molecular targets, since complex [Au(L1)(PPh3)](TfO) (7a) triggers ROS-dependent apoptosis mediated by inhibition of thioredoxin reductase and 20S proteasome, whereas complex [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a) induces ROS-independent apoptosis; molecular targets of this derivative have not been yet identified, although the obtained data suggest that mitochondria disruption might be involved. This might be indicative of a lack of crossresistance between both gold(I) and silver(I) complexes, which suggests [Ag(TfO)(L1)(PPh3)] (8a) could be used as back-up treatment for the management of tumor resistant to gold-containing drugs. Finally, the activation of extrinsic apoptosis CONCLUSIONS 288 pathway triggered by gold(I) derivatives has been mentioned in this chapter. The capacity of this type of chemotherapeutic agents of triggering extrinsic apoptosis has been poorly studied yet, and might be an interesting knowledge field to explore in a near future. Similarly, the silver derivative showed the capacity of activating caspase 8, which suggests it might trigger extrinsic apoptosis as well. In summary, gold(I) complexes might be a strong alternative to the current platinumbased drugs for colorectal cancer treatment. This doctoral thesis proves that there are still numerous unknowns to solve regarding to the antitumor properties of these molecules, given that it has been identified molecular targets that have not been considered yet, and also alternative cell death pathways have been observed in response to treatments. Research on this knowledge field must pursue, transferring these preclinical studies to 3D and/or animal models in order to advance in the search of a novel effective and selective drug to replace the current therapeutic strategies. CONCLUSIONS 289