Repositorio Institucional de Documentos

2021 63 Llipsy Santiago García Relevancia de la inflamación mediada por la granzima A en autoinmunidad y cáncer Departamento Director/es Departamento de Microbiología, Pediatría, Radiología y Salud Pública Pardo Jimeno, Julian © Universidad de Zaragoza Servicio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Llipsy Santiago García RELEVANCIA DE LA INFLAMACIÓN MEDIADA POR LA GRANZIMA A EN AUTOINMUNIDAD Y CÁNCER Director/es Departamento de Microbiología, Pediatría, Radiología y Salud Pública Pardo Jimeno, Julian Tesis Doctoral Autor 2020 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Tesis doctoral Relevancia de la inflamación mediada por la granzima A en autoinmunidad y cáncer Memoria presentada por: Llipsy Santiago García Licenciada en Farmacia para optar al grado de Doctora en Ciencias por la Universidad de Zaragoza 2020 Dr. Julián Pardo Jimeno, Doctor en Ciencias e Investigador ARAID en el Centro de Investigaciones Biomédicas de Aragón (CIBA) de la Universidad de Zaragoza CERTIFICA: Que la Tesis Doctoral titulada: “Relevancia de la inflamación mediada por la granzima A en autoinmunidad y cáncer”, ha sido realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza y en el Centro de Investigaciones Biomédicas de Aragón bajo mi dirección, y que reúne las condiciones requeridas para que su autora, la Licenciada en Farmacia Llipsy Santiago García, pueda optar al Grado de Doctor en Ciencias por la Universidad de Zaragoza. Zaragoza, 14 de febrero de 2020 Fdo. Julián Pardo Jimeno. Este trabajo ha sido realizado gracias a una beca Universidad de ZaragozaBanco Santander para Latinoamericanos, curso 2012-2013, y a un contrato predoctoral para la formación de doctores otorgada por el Ministerio de Economía y Competitividad (SAF2014-54763-C2-1-R). Índice 1INTRODUCCIÓN --------------------------------------------------------------------------------------- 1 1.1 Inflamación en autoinmunidad y cáncer ----------------------------------------------------- 1 1.2 Mecanismos de citotoxicidad de las células efectoras del sistema inmunitario ---- 3 1.2.1 Exocitosis granular ------------------------------------------------------------------------- 3 1.2.1.1 Perforina (Perf) ---------------------------------------------------------------------- 5 1.2.1.2 Granzimas (Gzms) ----------------------------------------------------------------- 9 1.2.2 Inhibidores de Gzms: Serpinas --------------------------------------------------------- 20 1.3 Artritis reumatoide -------------------------------------------------------------------------------- 23 1.3.1 Epidemiología ------------------------------------------------------------------------------- 23 1.3.2 Etiología -------------------------------------------------------------------------------------- 24 1.3.2.1 Factores genéticos ---------------------------------------------------------------- 24 1.3.3 Sistema inmunitario y AR ---------------------------------------------------------------- 25 1.3.3.1 Autoanticuerpos en la patogenia de la AR ---------------------------------- 25 1.3.3.2 Fisiopatología de la AR ---------------------------------------------------------- 26 1.3.3.3 Papel patogénico de las células del sistema inmunitario en la AR ---- 28 1.3.3.4 Citoquinas en AR ------------------------------------------------------------------ 36 1.3.4 Modelos murinos para el estudio de AR --------------------------------------------- 38 1.3.4.1 CIA ------------------------------------------------------------------------------------ 40 1.4 Cáncer colorrectal -------------------------------------------------------------------------------- 44 1.4.1 Epidemiología ------------------------------------------------------------------------------- 44 1.4.2 Clasificación --------------------------------------------------------------------------------- 45 1.4.2.1 Estadificación ----------------------------------------------------------------------- 45 1.4.2.2 Clasificación según los Subtipos Moleculares de Consenso de CCR (CMSs) ----------------------------------------------------------------------------------------- 46 1.4.3 Etiología. Factores de riesgo ------------------------------------------------------------ 47 1.4.3.1 Factores hereditarios ------------------------------------------------------------- 47 1.4.3.2 Factores ambientales o factores relacionados con el estilo de vida --- 48 1.4.3.3 Antecedentes médicos personales -------------------------------------------- 49 1.4.4 Mecanismos mutacionales asociados al desarrollo de CCR -------------------- 51 1.4.4.1 Mecanismos epigenéticos ------------------------------------------------------- 51 1.4.4.2 CIN ------------------------------------------------------------------------------------ 51 1.4.4.3 MSI ------------------------------------------------------------------------------------ 52 1.4.5 Inflamación y cáncer colorectal --------------------------------------------------------- 52 Índice 1.4.5.1 patogenia molecular del CAC. Diferencias con el CCR esporádico y hereditario ------------------------------------------------------------------------------------- 53 1.4.5.2 Inflamación en la iniciación de CAC ------------------------------------------- 54 1.4.5.3 Inflamación en la progresión de CAC ---------------------------------------- 55 1.4.5.4 Inflamación en la invasión y metástasis del CAC -------------------------- 57 1.4.5.5 Citoquinas en CCR ---------------------------------------------------------------- 58 1.4.5.6 La vía COX-2/PGE2: inflamación y tumorigénesis colorrectal ---------- 69 1.4.6 Células del sistema inmunitario en CCR --------------------------------------------- 70 1.4.7 Papel de la microbiota intestinal en el desarrollo del cáncer -------------------- 73 1.4.8 Modelos experimentales para el estudio de CCR ---------------------------------- 75 1.4.8.1 Modelos in vivo --------------------------------------------------------------------- 75 1.4.8.2 AOM ---------------------------------------------------------------------------------- 76 1.4.8.3 Modelo de CAC. DSS/AOM ----------------------------------------------------- 77 2ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ---------------------------------------------------------------- 79 Objetivos ------------------------------------------------------------------------------------------------ 82 3MATERIALES Y MÉTODOS ----------------------------------------------------------------------- 85 3.1 Experimentos in vivo ---------------------------------------------------------------------------- 85 3.1.1 Ratones -------------------------------------------------------------------------------------- 85 3.1.1.1 Determinación del genotipo de los ratones ---------------------------------- 85 3.1.2 Artritis inducida por colágeno (CIA) --------------------------------------------------- 88 3.1.2.1 Preparación de la emulsión ----------------------------------------------------- 88 3.1.2.2 Inmunización ------------------------------------------------------------------------ 88 3.1.2.3 Monitorización y evaluación de la severidad de la artritis ---------------- 89 3.1.2.4 Anatomía patológica e inmunohistoquímica--------------------------------- 89 3.1.2.5 Análisis de proliferación de células T (incorporación de 3H-timidina) - 90 3.1.2.6 Ensayo de formación de fosas ------------------------------------------------- 91 3.1.3 Colitis y cáncer asociado a colitis ------------------------------------------------------ 91 3.1.3.1 Inducción de colitis crónica y aguda ------------------------------------------ 91 3.1.3.2 Inducción de cáncer asociado a colitis (CAC) ------------------------------ 92 3.1.3.3 Puntuación clínica ----------------------------------------------------------------- 94 3.1.3.4 Puntuación del daño macroscópico ------------------------------------------- 94 3.1.3.5 Evaluación histológica de la inflamación ------------------------------------- 95 3.1.3.6 Determinación del grado tumoral ---------------------------------------------- 95 3.1.3.7 Estudio inmunohistoquímico de marcadores de proliferación y EMT - 96 Índice 3.1.3.8 Estudio de la permeabilidad intestinal en ratones wt y GzmA-/- -------- 97 3.1.3.9 Aislamiento de linfocitos intraepiteliales (IELs) ----------------------------- 98 3.1.3.10 Composición de microbiota intestinal --------------------------------------- 98 3.2 Análisis de la expresión de proteínas ------------------------------------------------------- 99 3.2.1 Extracción de proteínas totales a partir del tejido congelado -------------------- 99 3.2.2 Ensayo colorimétrico Bradford para estimar la concentración de proteínas100 3.2.3 Cuantificación de proteínas por ELISA --------------------------------------------- 100 3.2.3.1 Cuantificación de Citoquinas por ELISA ----------------------------------- 100 3.2.3.2 Cuantificación de GzmA por ELISA ----------------------------------------- 101 3.2.3.3 Cuantificación Telopéptido C-terminal de colágeno tipo I (ICTP) por ELISA ----------------------------------------------------------------------------------------- 102 3.2.3.4 Cuantificación de anticuerpos IgG anti colágeno tipo II por ELISA -- 102 3.2.4 Análisis de proteínas por Western-Blot --------------------------------------------- 103 3.2.4.1 Extracción de proteínas totales a partir de lisados celulares ---------- 103 3.2.4.2 Separación de proteínas celulares. Electroforesis en gel de poliacrilamida ------------------------------------------------------------------------------- 104 3.2.4.3 Transferencia de proteínas a membranas --------------------------------- 104 3.2.4.4 Análisis de proteínas por inmunoblot (Western blotting) --------------- 104 3.2.5 Análisis de proteínas de la superficie celular por citometría de flujo -------- 106 3.2.5.1 Análisis intracelular de GzmA por citometría de flujo ------------------- 106 3.3 Sobreexpresión y purificación de proteínas --------------------------------------------- 107 3.3.1 Preparación de medios y cultivos de Escherichia coli y Pichia pastoris ---- 107 3.3.2 Expresión y purificación de GzmA en Escherichia coli ------------------------- 108 3.3.2.1 Inducción con IPTG ------------------------------------------------------------- 108 3.3.2.2 Obtención de cuerpos de inclusión ------------------------------------------ 109 3.3.2.3 Solubilización y replegamiento de las proteínas contenidas en los cuerpos de inclusión ---------------------------------------------------------------------- 109 3.3.2.4 Purificación mediante cromatografía de intercambio catiónico ------- 110 3.3.2.5 Activación de la pro-GzmA ---------------------------------------------------- 111 3.3.2.6 Determinación de la actividad enzimática de la proteína GzmA ----- 111 3.3.3 Expresión y purificación de Serpinb6b en Pichia pastoris. --------------------- 112 3.3.3.1 Inducción con metanol --------------------------------------------------------- 112 3.3.3.2 Lisis del pellet celular ----------------------------------------------------------- 113 3.3.3.3 Purificación mediante cromatografía de afinidad por níquel ---------- 113 Índice 3.4 Cuantificación de Prostaglandina E2 por ELISA ---------------------------------------- 114 3.5 Análisis de la expresión génica ------------------------------------------------------------- 114 3.5.1 Extracción de RNA y determinación de la expresión génica mediante RTqPCR ----------------------------------------------------------------------------------------------- 114 3.6 Cultivos celulares ------------------------------------------------------------------------------ 115 3.6.1 Líneas celulares -------------------------------------------------------------------------- 116 3.6.2 Mantenimiento de los cultivos celulares ------------------------------------------- 116 3.6.3 Congelación y descongelación de células ----------------------------------------- 117 3.6.4 Contaje y determinación de la viabilidad celular --------------------------------- 118 3.6.5 Inactivación del complemento en el suero fetal bovino ------------------------- 118 3.6.6 Generación de OCs a partir de diferentes precursores ------------------------- 118 3.6.7 Generación de macrófagos M1 derivados de la médula ósea (BMDM) ---- 120 3.6.8 Análisis de la expresión de IL-6 inducida por GzmA extracelular en macrófagos M1 ---------------------------------------------------------------------------------- 121 3.6.9 Activación in vitro de las vías p-STAT3 y NFκB en MC-38 -------------------- 121 3.7 Determinación de la correlación entre GZMA e inflamación en muestras de CCR humano ------------------------------------------------------------------------------------------------ 122 3.8 Análisis estadístico ---------------------------------------------------------------------------- 123 4RESULTADOS Y DISCUSIÓN ------------------------------------------------------------------ 124 4.1 Artritis inducida por colágeno. Papel de la GzmA en el modelo CIA -------------- 124 4.1.1 Evaluación de la severidad de la enfermedad ------------------------------------ 124 4.1.2 Estudio de anatomía patológica ------------------------------------------------------ 125 4.1.3 Respuesta inflamatoria in vivo durante CIA --------------------------------------- 128 4.1.4 Expresión de GzmA durante CIA ---------------------------------------------------- 129 4.1.5 Respuesta in vivo de células B al colágeno tipo II: ------------------------------ 130 4.1.6 Respuesta in vitro de células T al colágeno tipo II ------------------------------- 131 4.1.7 Estudio de la osteoclastogénesis in vivo durante CIA -------------------------- 134 4.1.8 Estudio de la osteoclastogénesis in vitro ------------------------------------------- 137 4.1.9 Mecanismo de la formación de OCs inducida por GzmA ---------------------- 143 4.1.10 Discusión --------------------------------------------------------------------------------- 147 4.2 Colitis y CAC. Papel de la GzmA en el modelo DSS y DSS/AOM. ---------------- 153 4.2.1 GzmA activa incrementada en el tejido de colon de animales tratados con DSS y DSS/AOM -------------------------------------------------------------------------------- 153 Índice 4.2.2 Evaluación de la colitis ulcerativa crónica in vivo -------------------------------- 156 4.2.3 Evaluación del daño macroscópico y microscópico en UC crónica in vivo 157 4.2.4 Cuantificación de citoquinas inflamatorias en explantes de cultivo de tejido de colon de ratones wt y GzmA-/- durante colitis crónica ------------------------------ 159 4.2.5 Evaluación del papel de la GzmA durante la colitis aguda in vivo: Puntuación clínica, pérdida de peso y evaluación del daño macroscópico ----------------------- 161 4.2.6 Cuantificación de citoquinas en explantes de cultivo de tejido de colon de ratones wt y GzmA-/- durante colitis aguda ----------------------------------------------- 163 4.2.7 Cáncer asociado a colitis en un modelo in vivo. Evaluación de la severidad de la enfermedad y del daño a nivel macroscópico ------------------------------------- 165 4.2.8 Evaluación del daño histológico, de los tumores y del grado tumoral ------- 166 4.2.9 Estudio de marcadores de EMT y proliferación tumoral ------------------------ 170 4.2.10 Estudio de la inflamación y la actividad de la COX-2 en explantes de cultivo de tejido de colon de ratones wt y GzmA-/- durante el desarrollo del CCR -------- 174 4.2.11 Papel de la microbiota intestinal en el CCR in vivo ---------------------------- 176 4.2.12 Estudio del papel de la Perf y la GzmB durante el desarrollo del CCR inducido con DSS/AOM ------------------------------------------------------------------------ 178 4.2.13 La producción de IL-6 y TNF- inducida por GzmA extracelular en macrófagos M1 incrementa la expresión de p-STAT3 y p-NF-kB en la línea celular de CCR MC38 ----------------------------------------------------------------------------------- 181 4.2.14 Estudio de la inhibición in vivo de la IL-6 y del TNF- durante el CAC inducido por DSS/AOM ------------------------------------------------------------------------ 184 4.2.15 Estudio del papel de la inhibición terapéutica in vivo de la GzmA durante el CAC inducido por DSS/AOM ----------------------------------------------------------------- 189 4.2.16 Correlación positiva entre expresión de GZMA e inflamación en muestras humanas de CCR ------------------------------------------------------------------------------- 190 4.2.17 Discusión --------------------------------------------------------------------------------- 193 5CONCLUSIONES ----------------------------------------------------------------------------------- 199 6BIBLIOGRAFÍA ------------------------------------------------------------------------------------- 201 INTRODUCCIÓN Introducción 1 1INTRODUCCIÓN 1.1 Inflamación en autoinmunidad y cáncer El sistema inmunitario protege al organismo de las infecciones y del desarrollo del cáncer, manteniendo la tolerancia hacia los tejidos propios sanos y las sustancias exógenas no dañinas, evitando reacciones autoinmunes y otros trastornos inflamatorios. Para llevar a cabo este objetivo cuenta con diversas células, tejidos y una amplia gama de moléculas solubles. El sistema inmunitario responde a señales de peligro endógenas y exógenas (1). Las señales de peligro desencadenadas por moléculas microbianas extrañas son conocidas como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs, del inglés “Pathogen-Associated Molecular Patterns”). Por su parte, las señales de peligro desencadenadas por componentes celulares, liberados tras una lesión o muerte celular, son conocidos como patrones moleculares asociados a daños (DAMPs, del inglés “Damage-Associated Molecular Patterns”) (1). Tanto los PAMPs como los DAMPs son reconocidos por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs, del inglés “PatternRecognition Receptors”) (2), expresados por diferentes tipos celulares, lo que desencadena la expresión de citoquinas proinflamatorias como IL-1/β, IL-18, IL6 y TNF- (3, 4). La producción de estas citoquinas estimula la activación y/o perpetuación de la respuesta inmunitaria, incluidas las respuestas humorales (generación de anticuerpos) y celulares, que en última instancia son responsables de eliminar la célula afectada y/o el patógeno. La inflamación es parte de una respuesta biológica compleja al daño celular o a una infección, a través de la cual el sistema inmunitario intenta eliminar o neutralizar los estímulos perjudiciales, iniciando procesos de curación y regeneración en los tejidos dañados. Aunque el papel beneficioso de la inflamación es defender al huésped y asegurar su supervivencia, una inflamación no resuelta frente a estímulos continuos suscita una respuesta inflamatoria crónica, que sustenta muchos trastornos como enfermedad cardíaca o accidente cerebrovascular. También puede conducir a trastornos autoinmunes, como la artritis reumatoide y el lupus, así como a la génesis y progresión de diferentes Introducción 8 Una teoría alternativa sugiere que la Perf y las Gzms se unen a la membrana de la célula diana y se internalizan rápidamente en endosomas y posteriormente la Perf forma poros en la membrana del endosoma, liberándose Gzms al citosol. Inicialmente se propuso que el receptor de manosa 6 fosfato podría ser responsable de la unión de las Gzms a la membrana para su posterior endocitosis (53). Sin embargo, se ha demostrado que en células deficientes en este receptor, se produce igualmente la entrada de las Gzms (54).También se planteó que la unión de las Gzms a la membrana no depende de receptor, sino de la carga neta positiva de estas proteasas (55, 56). Figura 1.2 Mecanismos de acción propuestos para la Perf. Se indican los tres tipos de mecanismos propuestos (1, 2 y 3) según lo descrito en el texto. Más recientemente, ha surgido una teoría híbrida que sugiere que la Perf forma poros en la membrana plasmática de la célula diana, lo que permite la entrada de Ca2+. Este aumento de Ca2+ intracelular induce mecanismos de reparación en los que los lisosomas y endosomas se fusionan con la membrana plasmática con el fin de sellarla, produciéndose la endocitosis de la Perf junto con las Gzms (57). En el citosol se forman endosomas de gran tamaño donde las Gzms son liberadas por un proceso no conocido que requiere de la formación de poro por la Perf (58). Introducción 9 1.2.1.2 Granzimas Las granzimas (Gzms, enzimas asociadas a gránulos) son una familia de proteasas descubiertas en los años 80 (59, 60), originalmente identificadas en gránulos citosólicos (lisosomas secretores especializados o gránulos citotóxicos) de linfocitos Tc y células NK. La Perf, GzmA y GzmB son los constituyentes predominantes de los gránulos citotóxicos. Sin embargo, se han descrito otras Gzms menos abundantes, con posible significado funcional y con acciones biológicas no esclarecidas del todo, denominadas Gzms huérfanas (12, 34, 61). Se han encontrado Gzms en células de origen hematopoyético y no hematopoyético, fundamentalmente en linfocitos T CD8+ y células NK, pero también en otros grupos celulares como linfocitos Tγδ, linfocitos T CD4+, células T reguladoras (Treg), macrófagos, basófilos, mastocitos, espermatozoides, células de sertoli, queratinocitos, neumocitos, macrófagos alveolares y células epiteliales alveolares (62-69). Hasta la fecha, se han descrito 5 Gzms en humanos (A, B, H, K, y M) y 10 en ratón (A, B, C, D, E, F, G, K, M y N), siendo la GzmA y la GzmB las más abundantes y mejor caracterizadas (13). Las Gzms se clasifican según su especificidad de corte y su actividad proteolítica. Estas proteasas están reguladas por miembros de la familia de las serpinas (inhibidores de serina proteasas), que evitan la autolesión de la célula efectora (70). En la tabla 1.2 se muestran las Gzms expresadas en células de origen humano y murino, así como la actividad proteolítica, la especificidad de corte y las células que las expresan, tanto in vivo como ex vivo. Las Gzms son sintetizadas como zimógenos y en su extremo N-terminal poseen una secuencia de dos aminoácidos (Gly-Glu o Glu-Glu) que deben ser proteolizados para ser activadas. Posteriormente son transportadas del retículo endoplasmático (RE) al aparato de Golgi y de allí dirigidas a los gránulos citotóxicos. En su interior, la proteasa catepsina C (dipeptidil peptidasa I) degrada su secuencia N-terminal, activándolas. Las Gzms permanecen inactivas en el interior de los gránulos debido al pH bajo y a la formación de complejos con proteoglicanos como la serglicina (GzmB) y el sulfato de heparina (GzmA) (71). Introducción 10 Gzm Especie Actividad Especificidad de corte Tipo Celular GzmA h,m Triptasa Arg, Lys Tc, Treg, NK, NKT, GMC, Pne, Malv GzmB h,m ASPasa Asp > Glu Tc, Treg, NK, NKT, Mas, MDSCs (h), Bas (h), MØ (h), CDs, GMC, B cell (h), Ser, Pne, Quer GzmC m Quimasa Asn o Ser* NK GzmD m Quimasa Phe, Leu GMC GzmE m Quimasa Phe, Leu* GMC GzmF m Quimasa Phe, Leu* GMC GzmG m Quimasa Phe, Leu* GMC GzmH h Quimasa Phe > Tyr NK GzmK h,m Triptasa Arg, Lys Tc, NK, NKT (h), NK (h, CD56Bright) GzmM h, m METasa Met > Leu NK, NKT, Tγδ. GzmN m ? ? Sper Tabla 1.2 Gzms expresadas en células de origen humano y murino.Tc: Linfocitos T citotóxicos (CD8+ T, CD8+ T, CD8T). NK: Células NK. NKT: Células NKT. MDSCs: Células Supresoras de Origen Mieloide (del inglés “Myeloid-Derived Suppressor Cells”). Mas: mastocitos. Treg: Células T CD4+ reguladoras. Bas: basófilos. MØ: macrófagos. CDs: Células Dendríticas. Ser: Células de Sertoli. Sper: Espermatocitos. GMC: Células de la glándula metrial. Pne: neumocitos. Malv: Macrófagos alveolares. Quer: queratinocitos. * Hipotético pero no determinado experimentalmente. Una vez en el citosol de la célula diana, las Gzms ejercen sus funciones biológicas al cortar sustratos intracelulares cruciales que controlan la muerte celular (72, 73), la replicación viral (74) o la inflamación (75). También, algunas Gzms pueden liberarse al medio extracelular (65, 76), donde escinden proteínas de la matriz extracelular (ECM, del inglés “Extracellular Matrix”), de la unión celular y de la superficie celular. Este proceso está implicado en la angiogénesis e integridad vascular, la transmigración linfocitaria, la función de barrera, la inflamación o el envejecimiento y cicatrización de la piel, así como en las enfermedades ampollosas autoinmunes (pénfigo) (77-86). No obstante, en la actualidad, el papel exacto de cada Gzm en la muerte celular, la inflamación, o ambas, no está completamente descrito. En la tabla 1.3 se muestra una lista de varios de los sustratos extracelulares identificados para GzmA y GzmB (87). Introducción 11 Tabla 1.3 Sustratos extracelulares de GzmA y GzmB. Adaptado de (87). Granzima B La GzmB desempeña un papel relevante en la inducción de apoptosis. Esta serín proteasa corta residuos de ácido aspártico, siendo la caspasa-3 y la caspasa-7 alguno de sus sustratos intracelulares. La escisión de dichas caspasas induce la muerte celular por apoptosis (88). La GzmB puede inducir apoptosis a través de dos mecanismos: activando directamente a las caspasas (89, 90) o a través de la vía apoptótica mitocondrial (89, 91-94) (Figura 1.3). En experimentos realizados in vitro se ha observado que la GzmB humana muestra más afinidad por Bid, mientras que la de ratón es más afín a la caspasa3 (95-97). Sustrato Función propuesta/comentarios GzmA Fibronectina Migración de linfocitos Activador de plasminógeno prouroquinasa Migración de linfocitos a través de coágulos de fibrina Colágeno IV Migración de linfocitos Proteína básica de mielina Patogénesis de la esclerosis múltiple Proteoglicanos de membrana basal Migración de linfocitos Liberación del factor básico de crecimiento de fibroblastos Receptor similar a la trombina en neuritas Retracción de neuritas Desconocido Activación de monocitos Producción de citoquinas por monocitos, fibroblastos y células epiteliales Receptor de trombina (PAR-1??) Desensibilización de plaquetas Receptor Activado por Proteasa 2 (PAR-2, del inglés “ProteaseActivated Receptor 2”) Patogénesis de la colitis infecciosa GzmB Proteoglicanos de agrecano (cartílago) Patogénesis de la artritis reumatoide Receptor de glutamato neuronal Generación de autoantígenos en la encefalitis de Rasmussen Fibronectina (células musculares lisas) Muerte de células musculares independiente de la Perf Patogénesis de la aterosclerosis Vitronectina, fibronectina, laminina Muerte de células endoteliales independiente de la Perf Inhibición de la migración de células tumorales, migración de linfocitos Introducción 12 Inicialmente, se demostró in vitro que la GzmB purificada era capaz de activar directamente a la caspasa-3 (98). Asimismo se ha confirmado in vitro, que la GzmB puede activar a las caspasas-7, 8 y 10 (99). También se ha descrito que, al igual que la caspasa-3, la GzmB puede procesar directamente, y sin la mediación de las caspasas, al inhibidor de la DNAsa activada por caspasas (ICAD), provocando la activación de CAD y posterior fragmentación del DNA (100). Recientemente se ha descrito que la GzmB de ratón podría inducir apoptosis al degradar a la proteína antiapoptótica Mcl1, liberándose así la proteína proapoptótica Bim, que colaborará a su vez en la activación de Bax y Bak (101, 102). Se ha visto además, que esta proteasa puede inducir muerte celular al ser capaz de proteolizar directamente a la α-tubulina y a la filamina, provocando la desorganización del citoesqueleto (99, 103). La GzmB también puede activar la vía apoptótica mitocondrial, provocando la caída del potencial de membrana. Se ha determinado que la GzmB puede proteolizar a la proteína proapoptótica Bid, generando Bid truncado (tBid), con posterior activación de Bak y Bax, liberación de citocromo c (cit c), formación del apoptosoma y activación de la caspasa-9 (89). También se ha visto que la GzmB induce la caída del potencial a través de una vía independiente de Bid, Bak y Bax, y dependiente de las caspasas-3 y 7 (89, 104). Introducción 13 Figura 1.3 Apoptosis inducida por GzmB. Otras funciones de la GzmB La GzmB, además de funciones citotóxicas, se ha relacionado con procesos inflamatorios, el envejecimiento cutáneo, la cicatrización, las enfermedades cardiovasculares y también se le han atribuido funciones antivirales e inmunosupresoras (86). Se ha visto que la GzmB puede degradar sustratos relacionados con la coagulación como el factor von Willebrand o el fibrinógeno (105). Además, la GzmB puede proteolizar a la decorina, fibronectina y vitronectina (80, 106), por Introducción 14 lo que se le ha implicado en procesos de reparación tisular. También se ha relacionado con enfermedades cardiovasculares como arterioesclerosis o aneurismas. Se piensa que la GzmB puede actuar sobre componentes de la matriz extracelular como la fibrilina-1, provocando inestabilidad de las paredes vasculares (80, 107, 108). La GzmB también ha demostrado tener efectos antivirales directos. Además de su papel en la inducción de apoptosis en células infectadas, se ha visto que la GzmB, conjuntamente con la GzmH, puede inhibir la replicación de adenovirus y del virus del herpes simple, actuando sobre proteínas necesarias para la replicación (109, 110). Por otro lado, la GzmB puede ejercer efectos antivirales al proteolizar componentes celulares necesarios para replicación viral, transcripción, traducción, transporte intracelular y latencia viral (74). Se han detectado niveles elevados de GzmB en suero de pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas como artritis reumatoide (111) y asma (66). También, se ha visto expresión incrementada de GzmB en basófilos de pacientes asmáticos (66, 73). Se ha demostrado que la GzmB es capaz de escindir a la citoquina IL-1, aumentando su actividad proinflamatoria in vitro (112), aunque aún no está claro si este proceso está involucrado en la regulación de las respuestas inflamatorias in vivo. Se han descrito papeles opuestos para la GzmB, favoreciendo tanto respuestas proinflamatorias (77, 113) como antiinflamatorias (114, 115), en modelos in vivo de enfermedades infecciosas e inflamatorias. También se han descrito efectos inmunosupresores de la GzmB en cáncer (82). En los últimos años, se ha descubierto que diversos tipos celulares con funciones tumorigénicas expresan GzmB, por lo que esta proteasa podría contribuir a la progresión tumoral, inhibiendo la respuesta de las células inmunitarias contra el cáncer (82). La GzmB expresada por las células Treg favorece la progresión tumoral en modelos de ratón (116). Hallazgos recientes indican que una alta proporción de células T CD8+/Treg es un marcador de pronóstico favorable para varios carcinomas sólidos y hematológicos. Por lo tanto, la GzmB puede tener roles Introducción 15 opuestos, en referencia al desarrollo tumoral, dependiendo de la fuente celular (linfocitos Tc/células NK o Treg) y la abundancia relativa de esas células en el microambiente tumoral (117-119). Un subconjunto de linfocitos B humanos con funciones reguladoras (Bregs), también expresa GzmB (120), suprimiendo las respuestas antitumorales de las células T por un mecanismo no citotóxico que implica la escisión de la cadena ζ del receptor de células T (121). Estas células están presentes en el microambiente de diferentes tumores sólidos y tienen un papel potencial en la aparición y/o progresión de los tumores (122). De manera similar a lo que ocurre para las Treg, la abundancia relativa de linfocitos B citotóxicos GzmB+ frente a linfocitos Breg GzmB+ en el microambiente tumoral puede establecer el papel anti o protumoral de las células B que expresan GzmB. Otros tipos celulares con funciones tumorigénicas también expresan GzmB, incluidas las células dendríticas plasmocitoides (pCDs) y las MDSCs. Las pCDs humanas que expresan GzmB bloquean la expansión de las células T in vitro (123, 124), sin embargo el papel protumorigénico de la GzmB expresada por las MDSCs humanas requiere un mayor estudio (125). Recientemente se ha descrito que las MDSCs aisladas de ratones de tipo salvaje portadores de tumores expresaban GzmB y Perf, y que eran capaces de promover mayor progresión tumoral, al compararlas con MDSCs aisladas de ratones deficientes en GzmB (126). Los mastocitos, células importantes dentro del microambiente tumoral, también expresan GzmB en ausencia de Perf (65, 76). Se ha sugerido que este tipo de células también tiene dos roles opuestos en la progresión del cáncer (127). Por lo tanto, la GzmB de los mastocitos también puede regular negativamente las respuestas de las células T mediante mecanismos similares al de la GzmB de las células Breg. Algunos estudios sugieren que la GzmB derivada de mastocitos puede promover la permeabilidad vascular a través de la escisión de cadherinas y/o la liberación de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, del inglés “Vascular Endothelial Growth Factor”) (65, 77, 107). Introducción 16 Granzima A La granzima A (GzmA) es la proteasa más abundante. Es expresada por varios grupos celulares. Presenta actividad triptasa y es secretada por las células citotóxicas en forma de homodímero (128). Los ratones deficientes en GzmA carecen de defectos perceptibles en la citotoxicidad antitumoral (129). Sin embargo, se ha descrito que la GzmA, in vitro, es un mediador esencial en la citotoxicidad (72, 130). La capacidad citotóxica de la GzmA se demostró in vitro utilizando modelos heterólogos, observándose que, mientras que la GzmB necesitaba 4 h para inducir muerte celular, la muerte inducida por GzmA se producía a las 20 h, usando concentraciones micromolares (131, 132). Por el contrario, cuando se ensayó la GzmA en modelos autólogos (Perf, GzmA y células diana de la misma especie), no se observó que la proteasa indujera muerte celular, incluso a concentraciones micromolares, mientras que la GzmB inducía muerte celular a concentraciones nanomolares en las mismas líneas celulares (97, 133). Como se ha mencionado anteriormente, la GzmA induce muerte celular in vitro, cuando se utiliza a concentraciones micromolares junto con Perf u otros agentes de liberación (72, 130, 133). La citotoxicidad mediada por GzmA se acompaña de la escisión de varios sustratos intracelulares, incluida la proteína del complejo mitocondrial I, NDUFS3 (del inglés, “NADH Dehydrogenase Fe-S protein 3”), generando caída del potencial mitocondrial y producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés “Reactive Oxygen Species”) (130, 134). El aumento del nivel de ROS activa los mecanismos de reparación celular, incluido el complejo SET asociado al retículo endoplasmático (135, 136). El complejo SET activado se transloca al núcleo, donde la GzmA escinde varios componentes de este complejo (Ape1, HMGB2 y SET) (135, 137, 138), lo que lleva a la liberación de la endonucleasa, NM23-H1, que induce daño monocatenario en el DNA, lo que produce muerte celular (72, 134, 139, 140). Además, la GzmA puede dejar al DNA más accesible a la acción de las nucleasas al proteolizar a la histona H1 (130, 141, 142) (Figura 1.4). Se ha descrito que la GzmA de ratón es capaz de inducir una forma de muerte celular llamada atetosis. Esta se caracteriza por una cinética más lenta y Introducción 17 una morfología "similar a un gusano", totalmente diferente a la apoptosis o necrosis. La atetosis mediada por GzmA no requiere activación de caspasas, disrupción mitocondrial temprana, generación de ROS o pérdida de potencial de membrana mitocondrial, pero sí es imprescindible la correcta funcionalidad del citoesqueleto de actina (143). Recientemente se han atribuido otras funciones biológicas a la GzmA durante una respuesta inmunitaria (Figura 1.4). Hace varios años se demostró que la GzmA purificada o las células citotóxicas que expresan GzmA, inducían la liberación de IL-1β, TNF- e IL-6 en monocitos humanos y macrófagos de ratón (133, 144). Otros estudios mostraron que la GzmA extracelular es capaz de inducir la producción de IL-6 e IL-8 en fibroblastos, e IL-8 en células epiteliales (145). La inhibición de la caspasa-1 reduce la secreción de IL-1β y TNF- inducida por hGzmA en los monocitos, lo que indica que la proteasa podría ser activadora del inflamasoma (133). También se ha demostrado que la GzmA está elevada en pacientes con varios tipos diferentes de enfermedades infecciosas y trastornos inflamatorios crónicos, por ejemplo, en la artritis reumatoide (AR), (111, 146). Se ha descrito que la GzmA puede afectar al crecimiento intracelular de micobacterias en macrófagos humanos. En un estudio se demostró que la GzmA producida por células Tγδ humanas, o la GzmA recombinante, inhibían el crecimiento intracelular del patógeno, al inducir la producción de TNF- en los macrófagos (147). Esta proteasa también está incrementada durante la endotoxemia experimental y la sepsis bacteriana (148). Además, los ratones deficientes en GzmA fueron más resistentes al choque séptico inducido por LPS (133, 149). En nuestro grupo de investigación se demostró que la deficiencia en GzmA protege a los ratones contra la sepsis bacteriana in vivo sin comprometer el control del patógeno. Esta protección estuvo acompañada por una disminución de la producción de IL-1/β, TNF- e IL-6 en ratones GzmA knock-out (KO) (150). Por otro lado, los pacientes que sufren infecciones por el virus de EpsteinBarr, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y en pacientes con infecciones Introducción 24 Las mujeres tienen dos o tres veces más probabilidades de verse afectadas que los hombres. Una de cada 12 mujeres y 1 de cada 20 hombres desarrollarán una enfermedad reumática autoinmune inflamatoria durante su vida (194). 1.3.2 Etiología La etiología de la AR no se conoce por completo y se supone que se ve afectada por causas ambientales, predisposición genética y sexo. La hipótesis principal es que la AR es el resultado de una exposición ambiental o "desencadenante" en un individuo genéticamente susceptible (194, 203). Los factores de riesgo ambientales propuestos incluyen: género, tabaquismo, exposición a sílice, agentes infecciosos, deficiencia de vitamina D, obesidad y cambios en la microbiota, aunque los estudios para algunos de estos factores no son muy sólidos (194, 204). 1.3.2.1 Factores genéticos Estudios llevados a cabo en hermanos gemelos han estimado que la heredabilidad de la AR es de aproximadamente un 60 % (193). Diversos estudios han demostrado una fuerte correlación entre la presencia de AR y algunos alelos del antígeno leucocitario humano (HLA)-DR. Los alelos HLA-DRB1*01 y HLA-DRB1*04 (que codifican para la molécula DR4) son los más comúnmente encontrados en AR y su presencia se asocia con una enfermedad más severa y con alta mortalidad (205). Los mecanismos epigenéticos, incluidos la metilación del DNA y la acetilación de histonas, podrían tener un papel importante en el desarrollo de la AR. La metilación del DNA proporciona un mecanismo a través del cual los factores ambientales pueden inducir cambios en la actividad celular. Por ejemplo, en pacientes con AR positivos para anticuerpos antiproteínas citrulinadas (ACPAs, del inglés “Anti-Citrullinated Protein Antibody”), que además eran fumadores, se encontraron niveles de metilación más elevados cuando portaban el alelo de riesgo HLA-DRB1, en comparación con los que no lo portaban (194, 206). Introducción 25 1.3.3 Sistema inmunitario y artritis reumatoide 1.3.3.1 Autoanticuerpos en la patogenia de la AR Una característica destacada de la AR es la presencia de varios tipos de autoanticuerpos dirigidos hacía numerosos antígenos. La mayoría de esos anticuerpos no son específicos para AR (207). Los mismos contribuyen a la patología de la AR uniéndose directamente a sus antígenos, induciendo la formación de complejos inmunes, la activación del complemento y de receptores Fc, la producción de factores quimiotácticos y el reclutamiento de células polimorfonucleares. Estas participan en la reacción inflamatoria mediante la producción de proteasas que ocasionan daño tisular (208, 209). El autoanticuerpo más conocido es el factor reumatoideo (FR). Este biomarcador, fue incluido en los criterios de clasificación del Colegio Americano de Reumatología (CAR) (1987) (210, 211). El FR es una inmunoglobulina (IgM) dirigida contra la porción Fc de la IgG (211, 212). Es importante tener en cuenta que no en todos los casos de AR se expresa el FR, sin embargo, aquellos con FR positivo tienden a manifestarse con erosión ósea y peor pronóstico (213). El FR posee una gran sensibilidad para el diagnóstico de AR (de un 65 % a 85 %), el problema es su baja especificidad (50 % a 80 %), ya que puede detectarse en otros trastornos inflamatorios agudos y crónicos de tipo autoinmune o infeccioso, e incluso en poblaciones sanas, principalmente en mayores de 55 años (211). La citrulinación es una modificación post-traduccional que ocurre en los residuos de arginina contenidos en proteínas y péptidos. Este es un proceso normal, requerido en varias funciones fisiológicas. La peptidil arginina desaminasa tipo IV (PAD4), es la enzima responsable de la citrulinación posttraduccional de los residuos de arginina (193, 214). En la citrulinación ocurren procesos físico-químicos, que conducen a cambios en la masa molecular del péptido y llevan a la pérdida de la carga positiva de la arginina, adquiriendo la carga neutra de la citrulina. Esta nueva estructura del péptido es reconocida por el sistema inmunitario cuando es presentada por moléculas del HLA de clase II (215). Los residuos arginina citrulinados, con carga neutra, se unen con más eficacia a las moléculas HLA- Introducción 26 DR4. De esta forma se lleva a cabo la presentación de antígeno a las células T, que a su vez estimulan a las células B para sintetizar una gama de anticuerpos que reconocen autoproteínas, las proteínas citrulinadas (216, 217). Se han descrito distintas proteínas citrulinadas incluidas proteínas intracelulares (como las histonas) y proteínas de la matriz (fibronectina, colágeno, fibrinógeno, enolasa y vimentina) (218). La microbiota también puede inducir la citrulinación. Por ejemplo, P. gingivalis, común en la enfermedad periodontal, expresa la enzima peptidil arginina deiminasa (PAD) y puede inducir la citrulinación y, por lo tanto, promover la generación de ACPAs (219). Los ACPAs poseen una especificidad del 98 % y una sensibilidad del 80 % (220) y pueden detectarse hasta 15 años antes del inicio de los síntomas clínicos de AR. Esto indica una fase preclínica de la enfermedad en la que la activación inmunológica ya está en curso, lo que les confiere un alto valor predictivo (212). Otros anticuerpos también se han asociado con la AR. Por ejemplo, los anticuerpos contra antígenos carbamilados, también denominados anti-CarP (221), así como, el anticuerpo contra queratina K8 o anti-K8 (222), el anticuerpo anti-p68 y anti-Sa (223). Otros anticuerpos asociados con AR son anti-RA33, anti-calpastatina, anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos (ANCA), anticuerpos contra antígenos nucleares (ANA), anti-colágeno tipo II, antifibronectina y anti-GPI (Glucosa 6-Fosfato Isomerasa) (224). La mayoría de estos autoanticuerpos no son específicos de la AR, ya que también se encuentran fácilmente en otras enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la osteoartritis (223). 1.3.3.2 Fisiopatología de la AR Una articulación sana está compuesta por dos extremos óseos adyacentes cubiertos por una capa de cartílago (Figura 1.5 izquierda). El espacio entre los extremos se llama cavidad articular, la cual está delimitada por la membrana sinovial en ambos lados y contiene líquido sinovial. Por el contrario, en la AR (Figura 1.5 derecha), la membrana sinovial se vuelve hiperplásica e infiltrada por los leucocitos, causando inflamación crónica de la sinovial (sinovitis reumatoide), lo que causa desgaste en el cartílago y erosión ósea. Introducción 27 Figura 1.5 Cambios articulares en la artritis reumatoide. Izquierda: articulación sana. Derecha: articulación artrítica. La confluencia de la susceptibilidad genética y los factores ambientales determinan el desarrollo de una respuesta autoinmune que precede a la artritis clínica. Las modificaciones post-traduccionales, como la citrulinación (o carbamilación), pueden generar neoepítopos que el sistema inmunitario adaptativo es capaz de reconocer (193, 225, 226). Estos péptidos alterados son presentados por las APCs, activando así una respuesta inmunitaria adaptativa, lo que provoca la formación de autoanticuerpos. Las células B secretan estos autoanticuerpos, como por ejemplo ACPAs, además de citoquinas proinflamatorias que potencian la AR. La función principal de las células T es activar macrófagos y fibroblastos y transformarlos en células destructoras del tejido óseo. El infiltrado sinovial incluye células del sistema inmunitario innato y adaptativo (226) y crea un microambiente donde los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLS, del inglés “Fibroblast Like Synoviocytes”) y los macrófagos adquieren un fenotipo invasivo e inflamatorio, lo que conduce a la hiperplasia del revestimiento sinovial (227, 228). Los FLS, además de citoquinas, secretan Introducción 28 metaloproteasas (MMPs, del inglés “Matrix Metalloproteinases”) y colagenasa, promoviendo la destrucción del cartílago (226, 229). La infiltración de leucocitos y la secreción de citoquinas proinflamatorias como TNF- o RANKL (Ligando del Receptor Activador para el Factor Nuclear κB) favorecen, directa e indirectamente, la maduración de pre-osteoclastos a osteoclastos, lo que conduce a la erosión ósea (226). Las citoquinas y los factores de crecimiento liberados por las células infiltradas, junto con la hipoxia resultante de la hiperplasia sinovial, desencadenan la angiogénesis (226, 230), estableciendo un circuito de retroalimentación que favorece la infiltración constante de leucocitos y la inflamación crónica (Figura 1.6). Figura 1.6 Fisiopatología de la AR. Adaptado de (231). 1.3.3.3 Papel patogénico de las células del sistema inmunitario en la AR Como se ha mencionado anteriormente, en la patogénesis de la AR, como trastorno autoinmune, participan una gran variedad de diferentes poblaciones de Introducción 29 células inmunitarias, incluidos los linfocitos B y T, los macrófagos, además de los FLS y los osteoclastos. Linfocitos B Las células B, en el caso de la AR, funcionan como uno de los factores subyacentes del inicio de la AR (232). Las células B autorreactivas identifican los antígenos del huésped, desencadenando la destrucción de células o tejidos (232). En individuos sanos las células B autorreactivas se eliminan a través de procesos que están muy regulados por la tolerancia central y periférica (233). En pacientes con AR, ambos puntos de control son generalmente defectuosos, lo que lleva a la gran producción de células B maduras autorreactivas. Se ha demostrado, que los pacientes con AR no tratados, muestran un aumento de células B autorreactivas en la sangre periférica 3,4 veces superior en comparación con los pacientes sin AR (234). Tal defecto puede ser causado por una mutación en el gen PTPN22 que interrumpe la vía de señalización de BCR en el punto de control central de tolerancia de células B (235). Por otra parte, la mayor frecuencia de células B polirreactivas y autorreactivas en pacientes con AR, evidencian el deterioro de la tolerancia periférica (234). La disfunción de la tolerancia periférica propicia el aumento de la supervivencia y resistencia a la apoptosis de las células B (236). Las células B autorreactivas también pueden actuar como APCs para estimular la maduración y diferenciación de las células T en células T CD4+ de memoria (237). También se ha encontrado que la síntesis local de citoquinas como TNF-, IL-6, IL-12, IL-23 e IL-1, inducida por células B autorreactivas, actúa sobre otras células con relevancia patológica en la AR, lo que conduce a la disfunción inmune, inflamación y daño óseo (238). Un estudio demostró que la producción de RANKL está elevada en las células B de memoria de sangre periférica, el líquido sinovial y tejidos de pacientes con AR, en comparación con individuos sanos (239, 240). El mismo estudio también sugirió que las células B que expresan RANKL estaban altamente asociadas con la diferenciación de OCs (239). Introducción 30 Linfocitos T CD4+ Las células T CD4+ son los linfocitos más abundantes en el infiltrado sinovial (241), donde regulan otros tipos de células y desempeñan un papel central en la respuesta inmunitaria patológica que conduce al daño articular. Existen evidencias convincentes que respaldan que las células T CD4+ contribuyen significativamente a la respuesta autoinmune crónica durante la AR (242). Se pensaba que las células Th1, productoras de citoquinas proinflamatorias, eran las células principales en la patogénesis de la AR. El descubrimiento del papel de otros subtipos de células T CD4+ durante la AR, como las células Th2, Th17 y Treg, ha dejado claro que la patogénesis de la enfermedad es mucho más compleja. Durante su activación, las células T CD4+ interactúan con HLA de clase II, así como con moléculas coestimuladoras como CD28, que se expresan en la superficie de las APCs (243). El papel de las células T CD4+ en la inflamación crónica durante la AR también está respaldado por su asociación con los alelos MHC-II específicos, como el HLA-DR4. Como se mencionó anteriormente, esta interacción conduce a una forma más agresiva de AR (244). Las evidencias sugieren que las células T CD4+ (Th) contribuyen a la patogénesis de la AR principalmente a través de la secreción de citoquinas y quimioquinas (Figura 1.7) (242). Las células T CD4+ tipo 1 (Th1) están altamente activadas en la AR y secretan IFN-γ, IL-2 y TNF- (242). Además, las células Th1 activan a los macrófagos para que actúen como APCs (244). Otro tipo de células T CD4+ son las de tipo 2 (Th2). Este grupo celular produce IL-4 e IL-5, citoquinas que juegan un papel central en la activación de células B y en el cambio de isotipo de inmunoglobulinas (Igs) a IgE (245). Introducción 31 Por otra parte, las células Th17 contribuyen al desarrollo de AR en cada una de las fases de la enfermedad, es decir, en la iniciación, inflamación y destrucción ósea. Las células Th17 producen principalmente IL-17, que estimula la producción de citoquinas proinflamatorias, quimioquinas y MMPs (246). Además, estimulan a los linfocitos B para que produzcan autoanticuerpos, y activan a los FLS para que produzcan citoquinas y MMPs (247, 248). Figura 1.7 Células T CD4+ en la patogénesis de la AR. Adaptado de (249). Se ha detectado un mayor número de células Th17 y un incremento en los niveles de expresión de IL-17 en el suero de pacientes con AR en comparación con individuos sanos (250). Algunos estudios han mostrado que tanto la IL-17 sérica como las células Th17 circulantes se correlacionan con la puntuación de actividad de la enfermedad en 28 articulaciones (DAS28, del inglés “Disease Activity Score 28-joint counts”) (251), así como con marcadores comunes de la AR, como la proteína C reactiva (PCR) y la tasa de sedimentación eritrocitaria (TSE) (251, 252). Varios estudios han demostrado que IL-17 contribuye al crecimiento del pannus, la osteoclastogénesis y neoangiogénesis sinovial (253). Introducción 32 Además de las Th17, los macrófagos, los mastocitos y las células Tγδ del infiltrado sinovial, también producen IL-17 (254). Por otro lado, las células Treg CD4+CD25+, previenen la autoinmunidad al suprimir los linfocitos autorreactivos, a través de la producción de IL-10 y TGF-β (255). Sin embargo, las células Treg solo actúan en la supresión de la proliferación de células T efectoras, pero no inhiben la secreción de citoquinas proinflamatorias, como el TNF- o IL-6, producidas a partir de monocitos y células T activadas (256). Se han detectado células Treg en sangre y líquido sinovial de pacientes con AR (257). Sin embargo, el porcentaje de células Treg en pacientes con AR en comparación con individuos sanos es muy controvertido. Del mismo modo, se han observado resultados contradictorios en pacientes con AR cuando el porcentaje de células Treg se correlacionó con múltiples características clínicas como DAS28, edad, sexo, TSE, PCR, FR y duración de la enfermedad (257). Las células T también desempeñan un papel fundamental en la estimulación de las células B y la producción de autoanticuerpos, lo que en consecuencia, contribuye a la patogénesis de la AR (258). Las células T auxiliares foliculares (Tfh) son la población dominante de células T que interactúa con los linfocitos B, generalmente dentro de los folículos de los órganos linfoides secundarios (SLOs, del inglés “Secondary Lymphoid Organs”) y los tejidos periféricos inflamados (258). En general, las Tfh tienen como características fundamentales la expresión del receptor inducible y coestimulador de linfocitos T (ICOS), el receptor de quimioquina 5 (CXCR5), el receptor de inhibición de respuesta de muerte celular programada 1 (PD-1), y el factor de transcripción Bcl-6 (258, 259). Los linfocitos Tfh proporcionan señales de ayuda a los linfocitos B del folículo vía CD40L, y las citoquinas IL-21, IL-4 e IL-10 (260). Existe otro tipo de células T auxiliares de células B en la membrana sinovial durante AR, conocidas como células T auxiliares periféricas (Tph), que no expresan CXCR5 y solo expresan moderadamente Bcl-6. Las células Tph CXCR5-PD-1hi, una vez activadas, secretan CXCL13 para reclutar células B y producen IL-21, lo que propicia la supervivencia, proliferación y maduración de las células B (258-260). Introducción 33 Macrófagos Los macrófagos son fundamentales en la fisiopatología de la AR (261, 262). Son muy abundantes en la membrana sinovial inflamada y en la unión cartílagopannus. Se ha demostrado correlación entre la progresión radiológica de la destrucción articular y el grado de infiltración de macrófagos sinoviales (263). Además, existe relación entre la eficacia terapéutica de la terapia antirreumática convencional con la regulación negativa de las funciones del sistema de fagocitos mononucleares (264, 265). También, se ha demostrado la eficacia de las terapias biológicas dirigidas contra las citoquinas producidas predominantemente por macrófagos (266, 267). En una articulación inflamada, los macrófagos secretan TNF-, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IL-8 y el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF, del inglés “Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor”) (226). Además, están involucrados en la liberación de enzimas de degradación de la matriz, en la producción de ROS y especies reactivas de nitrógeno (RNS, del inglés “Reactive Nitrogen Species”), también en procesos de fagocitosis y presentación de antígeno (193), todo lo que conduce a la destrucción articular (193, 226, 261). Este patrón de expresión de citoquinas proinflamatorias y óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS, del inglés “Inducible Nitric Oxide Synthase”) sugiere un fenotipo predominante de macrófagos M1. Además, los macrófagos también median múltiples procesos biológicos relacionados con la AR, como el reclutamiento de linfocitos, angiogénesis y proliferación de FLS (193, 226, 261). Similar a las células B, los macrófagos actúan como APCs y se ha demostrado que expresan HLA-DR y moléculas de adhesión de leucocitos, lo que permite a los macrófagos participar en la activación de las células T junto con las células B (238). La activación de células T mediada por macrófagos da como resultado la producción de células T efectoras, que a su vez expresan mediadores proinflamatorios como IL-1, IL-1β y MMPs, que incrementan la patogénesis de la AR (268). Sinoviocitos tipo fibroblasto Los FLS son un componente importante de la arquitectura de la articulación. En una articulación sana, los FLS forman el revestimiento sinovial y Introducción 40 Clasificación Modelo Agente inductor/gen diana Dependencia del MHC Artritis inducida por proteoglicanos (PGIA) Proteoglicano de cartílago humano Independiente de MHC Artritis inducida por glucosa.6.fosfato isomerasa (G6PI) G6PI heteróloga Independiente de MHC Modelos genéticos Ratones K/BxN TCR específico para para un epítopo de ribonucleasa de páncreas bovino (KRN) H2g7 Ratones SKG Dominio SH2 del gen ZAP-70 Nd Ratones transgénicos para el gen del factor de necrosis tumoral humana (HTNFG) TNF- humano Independiente de MHC Ratones IL-1ra-/- Receptor de IL-1 Nd Tabla 1.7 Modelos utilizados para la inducir AR. Nd= no determinado 1.3.4.1 CIA Este es el modelo de artritis inducida mejor caracterizado y más utilizado. Comparte muchas características patológicas e inmunológicas similares con la AR humana (Tabla 1.8) (296-298). En el modelo CIA, la respuesta inmunitaria se dirige contra el antígeno articular colágeno tipo II (CII) (299). La inducción de artritis en CIA está mediada por las respuestas Th1 y Th17, siendo las células Th17, al parecer, las que desempeñan el papel patológico dominante (300). También, se observa falta de tolerancia y la generación de autoanticuerpos contra colágeno (301). En 1977, se inmunizaron por primera vez ratas con una emulsión de CII humana, de pollo o de rata, en adyuvante completo de Freund (CFA, del inglés “Complete Freund´s Adjuvant”), lo que condujo al desarrollo de una poliartritis erosiva asociada con una respuesta autoinmune contra el cartílago (302). Posteriormente, otros grupos de investigación describieron protocolos similares para la inducción de CIA en ratones (293) y primates no humanos (303). Introducción 41 La susceptibilidad a CIA en ratones, al igual que en AR, está asociada con la expresión de moléculas de MHC de clase II específicas. Las cepas que expresan haplotipo H-2q (DBA/1) o H-2r (B10.RIII) son susceptibles a CIA (304, 305). Los DBA/1 (H-2q) responden a CII de pollo, murino, bovino, porcino y humano (306) y los B10.RIII (H-2r) responden exclusivamente a CII bovino y porcino (307, 308). No obstante, estudios posteriores han demostrado que es posible inducir artritis en ratones C57BL/6 (H-2b), utilizando CII de pollo (309, 310). Diferencias Similitudes CIA Compromiso articular no simétrico Enfermedad transitoria No manifestaciones sistémicas. Enfermedad poliarticular Susceptibilidad asociada al MHC-II Patología articular: Hiperplasia de la membrana sinovial Infiltración inmune sinovial Neutrófilos en el líquido sinovial Formación Pannus Destrucción ósea por osteoclastos Marcadores serológicos: FR Anticuerpos anti-CII ACPAs Características inmunológicas: Aumento de la expresión de citoquinas Generación de autoanticuerpos Mediado por células T AR Compromiso articular simétrico Enfermedad crónica Manifestaciones sistémicas extraarticulares. Tabla 1.8 Similitudes y diferencias entre la AR humana y la CIA. Papel de los linfocitos T en CIA Como se mencionó anteriormente, las células T juegan un papel importante en la patogénesis de la AR (298). Desde el punto de vista experimental, las evidencias han demostrado que la administración de células T específicas de CII puede inducir artritis en ratones sanos (311). Además, los ratones deficientes para células T CD4+ son menos susceptibles a CIA que los ratones de tipo Introducción 42 salvaje. Se ha demostrado que la deficiencia de células T CD8 no afecta la susceptibilidad a CIA (312). La administración de colágeno tipo II induce una fuerte activación de los linfocitos T, que a su vez, estimulan a los linfocitos B a producir anticuerpos (313). Anteriormente, se consideró que las respuestas inmunitarias, tanto en la AR como en CIA, estaban mediadas por células Th1. Sin embargo, los estudios sobre el papel del IFN-γ endógeno, citoquina prototipo de la respuesta Th1, mostraron resultados contradictorios. Se descubrió que los ratones que carecen de IFN-γR funcional no están protegidos sino que desarrollan una forma más severa de CIA (314). Recientemente, se ha implicado a las células Th17, que producen IL-17 e IL-22, en la patogénesis de CIA (315). La diferenciación a Th17 esta mediada por TGF-β, IL-6 e IL-23, mientras que IFN-γ suprime su diferenciación (316). La IL-17 promueve la inflamación en el modelo CIA al favorecer la producción de otras citoquinas proinflamatorias como TNF-, IL-1β, IL-6 y RANKL (317). Otros estudios han mostrado que la neutralización de la IL17 endógena por anticuerpos (318, 319) o la eliminación del gen IL-22 (320), protege contra la enfermedad, proporcionando así evidencia adicional sobre el papel de las células productoras de IL-17 en CIA. Papel de los linfocitos B en CIA Las células B pueden contribuir a la artritis inducida por CIA, al igual que en la patogénesis de RA, a través de la producción de autoanticuerpos, pero también promoviendo la secreción de citoquinas, como IL-6, o haciendo funciones de APCs para activar células T específicas frente a, fundamentalmente, CII. En el suero de animales artríticos, se han detectado anticuerpos contra diferentes proteínas, además del colágeno tipo II (313). Los isotipos de anticuerpos anti-CII que se encuentran elevados en CIA son IgG1 e IgG2a/c (309, 321) y dependen de la concentración de Mycobacterium tuberculosis del CFA (321). En ratones C57BL/6 se requieren dosis altas de M. tuberculosis para la activación y maduración de las CDs (322). Los anticuerpos específicos frente a CII producidos por las células B activadas inducen respuesta local inflamatoria mediada por macrófagos, granulocitos y células T, dando lugar a la destrucción de hueso y cartílago (323). Introducción 43 Se ha demostrado que los ratones deficientes en células B son resistentes a la artritis inducida por CIA (324). También, que la transferencia de suero de ratones artríticos a ratones sanos induce inflamación severa, y aunque el anticuerpo ya no se detecte, la respuesta inflamatoria persiste. Esto indica que la respuesta humoral tiene un papel fundamental en el establecimiento de la respuesta autoinmune en este modelo (325). Introducción 44 1.4 Cáncer colorrectal 1.4.1 Epidemiología El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el mundo. Es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado a nivel mundial, con una incidencia de 1,8 millones de casos nuevos en 2018. Representa la cuarta causa de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 881.000 muertes (326, 327). Sin embargo, en los Estados Unidos y en otros países desarrollados, el CCR es la segunda causa más común de muerte por cáncer, a pesar de los importantes avances en detección temprana, cirugía y tratamiento de esta patología. Con respecto al género, la prevalencia de CCR se comporta de manera muy similar en ambos sexos, aunque es ligeramente mayor en hombres (10,9 %) que en mujeres (9,5 %) (327). Además, el riesgo de desarrollar CCR aumenta con la edad. De hecho, más del 90 % de los pacientes diagnosticados tienen más de 50 años y la edad promedio de diagnóstico del CCR es de 64 años. La raza es también un factor que influye en la incidencia del CCR, siendo más elevado en personas de raza negra (327, 328). Según la Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM) y la Asociación Española Contra el Cáncer (AECC), en la población española el CCR es uno de los más frecuentemente diagnosticado (15 % del total), siendo detectados en 2017 aproximadamente 34.331 casos. En hombres, es el segundo más frecuente después del cáncer de próstata. En mujeres, el cáncer de mama es el más frecuentemente diagnosticado y en segundo lugar se sitúa el CCR. Con respecto a mortalidad, el primero en ambos sexos es el cáncer de pulmón, seguido del CCR, con 15.923 defunciones al año (329). Introducción 45 1.4.2 Clasificación 1.4.2.1 Estadificación Los carcinomas colorrectales son clínicamente estadificados utilizando la clasificación TNM (tumor, ganglios linfáticos, metástasis), establecido por The American Joint Committee on Cancer (AJCC) (330). La categoría T describe la extensión de la propagación a través de las capas que forman la pared del colon y el recto (Tis, T1, T2, T3, T4). La categoría N indica si el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos cercanos (N0, N1, N2). La categoría M indica si hay metástasis a órganos distantes (MX, M0, M1). En la figura 1.9 se esquematizan las etapas del CCR según la clasificación TNM. Figura 1.9 Estadios del CCR según la clasificación TNM establecida por AJJC. Estadio 0: cáncer en la etapa más temprana; No ha crecido más allá de la mucosa del colon o del recto. Estadio I: el cáncer ha crecido a través de la muscularis mucosa hasta la submucosa o también puede haber crecido en la muscular propia. Estadio II: el cáncer ha crecido en las capas más externas del colon o del recto, o las ha atravesado, pero no ha llegado a ganglios u órganos cercanos. Estadio III: el cáncer ha crecido a través de la mucosa hacia la submucosa, y también puede haber crecido hacia la muscularis propia. Se ha diseminado a ganglios linfáticos cercanos o en áreas de grasa cerca de los ganglios linfáticos. No se ha propagado a sitios distantes. Estadio IV: el cáncer se ha diseminado a 1 o más órganos distantes, o a un grupo distante de ganglios linfáticos, y puede o no, haberse diseminado a partes distantes del peritoneo. Introducción 46 1.4.2.2 Clasificación según los Subtipos Moleculares de Consenso de CCR (CMSs) El CCR es una enfermedad heterogénea desde el punto de vista biológico y las variadas tasas de respuesta a los regímenes terapéuticos estándar sugieren que es molecularmente heterogéneo. En un esfuerzo por relacionar el fenotipo de las células cancerosas con el comportamiento clínico de la enfermedad, y con el objetivo de establecer un tratamiento racional usando terapias específicas, el consorcio de subtipos de CCR unificó, en un único sistema de consenso, a seis sistemas de clasificación molecular independientes (331, 332). Este consenso dio lugar a la conformación de cuatro grupos diferentes, conocidos como subtipos moleculares de consenso (CMS, del inglés “Consensus Molecular Subtypes”) (333) y su clasificación se basa en las características epigenómicas, transcriptómicas, microambientales, genéticas y clínicas de los tumores. Tabla 1.9 Resumen de las principales características de los CMSs del CCR establecidos en el consorcio internacional. MSI: inestabilidad de microsatélite (del inglés, “Microsatellite Instability”). CAFs: fibroblastos asociados a cáncer (del inglés, “Cancer-Associated Fibroblasts”). CIN: inestabilidad cromosómica (del inglés, “Chromosomal Instability”). MSS: estabilidad de microsatélite (del inglés, “Microsatellite Stability”). SCNA: alteraciones somáticas del número de copias (del inglés, “Somatic Copy-Number Alterations”). EMT: transición epitelio mesénquima (del inglés, “Epithelial Mesenchymal Transition”). CMS1 CMS2 CMS3 CMS4 Nombre alternativo MSI, inmune canónica, epitelial metabólico Mesenquimal Características MSI Activación inmunológica Hipermetilaciones Hipermutaciones Mutaciones en BRAF Bajo CAFs CIN MSS Alta SCNA Baja metilación Activación de Wnt y MYC Muy bajo CAFs Poco InmunogéniCo CIN Baja SCNA Moderada metilación Mutaciones en KRAS Bajo CAFs Altamente inmunogéni-co Desregulación metabólica CIN MSS Alta SCNA Baja metilación Activación de TGF-β Alto CAFs Inflamación EMT Invasión estromal y angiogénesis Incidencia 14 % 37 % 13 % 23 % Introducción 47 En la tabla 1.9 se muestra un resumen de las principales características del CCR según la clasificación de los CMSs establecidos en el consorcio internacional CRCSC (del inglés, “Colorectal Cancer Subtypìng Consortium”). 1.4.3 Etiología. Factores de riesgo El CCR es una enfermedad heterogénea, con respecto a la localización anatómica del tumor, las diferencias genéticas, raciales y también por la influencia del el estilo de vida implicadas en su desarrollo. Por tanto, el CCR se considera una enfermedad compleja en donde participan factores de riesgos genéticos y ambientales. 1.4.3.1 Factores hereditarios La mayoría de los CCR se diagnostican en personas sin antecedentes familiares de CCR y son de origen esporádico, los restantes se relacionan con la historia familiar y/o enfermedades intestinales inflamatorias (334). Aproximadamente una tercera parte de todos los casos familiares de CCR tienen una etiología genética bien definida (335). El riesgo de padecer CCR en personas con antecedentes familiares varía en función del grado de parentesco con el familiar afectado y la edad en la que dicho familiar desarrolló el cáncer (336). Los principales síndromes hereditarios asociados con el CCR son: el síndrome de Lynch (CCR hereditario sin poliposis o HNPCC), que es la forma más común de cáncer de colon hereditario, responsable de aproximadamente un 2 % de todos los casos de CCR (337), y la poliposis adenomatosa familiar (FAP, del inglés “Familial Adenomatous Polyposis”), causada por mutaciones en el gen APC (338). También hay otros síndromes hereditarios menos comunes que incrementan el riesgo de CCR. Existe un 20-30 % de todos los casos de CCR que se presenta en pacientes con antecedentes familiares de CCR, sin embargo estos no cumplen los criterios de CCR hereditario, lo que indica cierta susceptibilidad genética. A aquellos CCR con diverso grado de agregación familiar se les denomina CCR Introducción 48 familiar, y se distingue de los síndromes mencionados anteriormente por no seguir un patrón de herencia tan bien definido (339). 1.4.3.2 Factores ambientales o factores relacionados con el estilo de vida Dieta La dieta contribuye al desarrollo del CCR, jugando un papel adverso o protector en su desarrollo, independientemente de la obesidad. La dieta tiene un impacto significativo en el microbioma del colon, donde las bacterias superan en número a las células huésped (10:1). Diferentes alimentos tienen efectos variados sobre la microflora y la inflamación intestinal (340). El consumo de carne roja, carne procesada y carne cocinada muy hecha o en contacto directo con el fuego se ha asociado a un mayor riesgo de sufrir CCR (341). En 2015, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) otorgó a la carne procesada la categoría de "carcinógena" y la carne roja como "probablemente carcinógena", principalmente debido a su impacto en el riesgo de CCR (342). Por otro lado, una dieta rica en fibra, vegetales, frutas, leche u otros productos lácteos (el calcio que estos alimentos contienen) parece ejercer un efecto protector. Una dieta rica en fibra puede reducir el riesgo de CCR al disminuir el pH del colon sigmoide, reducir el tiempo de tránsito del colon y, por lo tanto, minimizar la exposición a posibles carcinógenos (343). Se ha demostrado asociación entre el aumento del consumo de frutas y verduras y la reducción del riesgo de CCR (344). El efecto protector contra el CCR es debido a la gran cantidad de fibra, ácido fólico, antioxidantes y vitaminas que poseen estos alimentos (345). Actividad Física y Obesidad Diversos estudios, realizados en diferentes poblaciones, muestran que los individuos físicamente más activos, especialmente si lo son durante largos periodos de tiempo, presentan un menor riesgo de CCR, con una reducción de la incidencia de hasta un 50 % (346). Introducción 49 Por otro lado, un gran número de estudios epidemiológicos sugieren que la obesidad, es un factor de riesgo para el CCR, mientras que la pérdida de peso se convierte en un factor protector (347). Tabaquismo Estudios recientes muestran que el consumo de tabaco, es un factor de riesgo para el CCR en ambos sexos, existiendo una clara asociación entre el tabaquimo, los adenomas colorrectales y el CCR (348). Consumo de alcohol El consumo moderado a alto de alcohol se asocia con un mayor riesgo de CCR (348). Los mecanismos por los cuales el alcohol actuaría como carcinógeno en el colon incluyen: el incremento de la proliferación mucosa, la activación de sustancias pro-carcinógenas en el intestino, cambios en la composición de la bilis y elevación de la concentración de nitrosaminas (349). En la tabla 1.10 se muestra un resumen de los factores relacionados con el estilo de vida y que influyen aumentando o disminuyendo el riesgo a padecer CCR. Aumentan el riesgo de CCR Disminuyen el riesgo de CCR Carnes procesadas y carnes rojas Modo de cocción. Dieta rica en fibra, frutas y verduras Calcio y suplementos de calcio en la dieta Niveles adecuados de vitamina D Niveles adecuados de ácido fólico Obesidad Sedentarismo Actividad física Tabaquismo Consumo moderado-elevado de alcohol Tabla 1.10 Resumen de los factores relacionados con el estilo de vida que influyen en el riesgo de CCR.e figura 1.4.3.3 Antecedentes médicos personales Uso de medicamentos Varios estudios han demostrado que el uso prolongado de aspirina, y otros fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINEs), reduce el riesgo de CCR (348, 350-352), debido a que disminuyen la inflamación intestinal. Sin embargo, el Introducción 56 supervivencia, proliferación y crecimiento de las células, así como la angiogénesis, la invasividad, la motilidad, la producción de citoquinas y quimioquinas (391, 392). Se ha detectado activación aberrante de ambos factores de transcripción en aproximadamente el 50 % de los CCR y CAC (393, 394). Existe amplia evidencia que demuestra que STAT3 desempeña un papel primordial en la progresión del CAC. Se ha demostrado que citoquinas como la IL-6, IL-11 o la IL-22 y varios factores que influyen en el crecimiento del tumor, como factor de crecimiento epidérmico (EGF, del inglés “Epidermal Growth Factor”), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, del inglés “Hepatocyte Growth Factor”) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, del inglés “Vascular Endothelial Growth Factor”), directa o indirectamente causan la activación de STAT3 (6, 395). La activación de STAT3 induce la expresión de genes antiapoptóticos, como Bcl-2 o Bcl-xL, además induce la expresión de genes proliferativos como la ciclina D1 o c-Myc, y VEGF, que es un potente factor proangiogénico (396). STAT3 activado también puede inducir una activación prolongada de NF-κB, una peculiaridad importante en la patogénesis del CAC, ya que estos dos factores de transcripción activan los genes necesarios en cada paso del desarrollo del cáncer (394, 397). Se ha encontrado que la activación de NF-κB en las células mieloides (especialmente los macrófagos y CDs de la lámina propia), da como resultado la producción de citoquinas que son fundamentales en el crecimiento y proliferación del tumor, promoviendo la supervivencia de células epiteliales pre-malignas generadas durante las etapas tempranas de la tumorigénesis del CAC (398). Se conoce que la actividad antiapoptótica de NF-κB está mediada por la activación de Bcl-2, Bcl-xL y cFLIP, junto con otros genes (399). La inactivación de NF-κB en células mieloides mediante la ablación de IKKβ, la quinasa requerida para su activación, inhibió la producción de mediadores inflamatorios, incluidas citoquinas como la IL-6 y el TNF-, e impidió la proliferación de células epiteliales durante la inducción de CAC. Como resultado, la carga tumoral se redujo debido a la aparición de menos tumores, de menor tamaño (398). Introducción 57 1.4.5.4 Inflamación en la invasión y metástasis del CAC Desde la perspectiva clínica, la metástasis es la situación más crítica del cáncer, ya que más del 90 % de la mortalidad por cáncer es causada por metástasis. Estudios recientes muestran que la metástasis requiere una colaboración estrecha entre las células cancerosas, las células inmunitarias e inflamatorias y los elementos del estroma. El microentorno inflamatorio puede influir en varias etapas claves de la metástasis. El primer paso que debe ocurrir es la EMT (del inglés, “Epithelial Mesenchymal Transition”), en la que las células cancerosas adquieren características fibroblastoides, por tanto aumentan su motilidad y capacidad de invasión (400, 401). Este proceso está regulado por varias citoquinas proinflamatorias, incluida la IL-1, TNF-, IL-6, el factor 1α inducible por hipoxia (HIF1α, del inglés “Hypoxia-Inducible Factor 1α”) y, principalmente, por TGF-β (400402) (Figura 1.11C). La activación de la señalización de NF-κB y/o STAT3 puede facilitar la EMT al aumentar significativamente la movilidad de las células premetastásicas, favoreciendo su migración e invasión. Este proceso está mediado por el efecto de estos factores de transcripción sobre la expresión de los reguladores de la EMT, y también por la capacidad de ambos para regular el citoesqueleto (400402). En el segundo paso hacia la metástasis, las células cancerosas se introducen en vasos sanguíneos y linfáticos. La inflamación puede promover esto a través de la producción de mediadores que aumentan la permeabilidad vascular. Posteriormente, las células que inician la metástasis sobreviven y viajan a través de la circulación. Por otra parte las integrinas permiten la extravasación de células cancerosas circulantes y, finalmente, los progenitores metastásicos individuales interactúan con las células inmunitarias, inflamatorias y estromales y comienzan a proliferar (403). Las quimioquinas pueden estimular directamente la migración de las células malignas hacia los vasos sanguíneos y órganos distantes. El receptor de quimioquina CXCR3 es fundamental para la metástasis en los ganglios linfáticos Introducción 58 (404) y sus niveles se incrementan drásticamente durante la malignización (404). Dentro de las quimioquinas que activan el receptor CXCR3 durante la metástasis se incluyen CXCL9, CXCL10, CXCL11 y CCL21, las cuales se regulan mediante la señalización de proteínas oncogénicas tales como Ras (405). Las señales inflamatorias, además, regulan la producción y actividad de las MMPs, y facilitan la invasión y extravasación de células cancerosas (406). Los CCR humanos sobreexpresan MMPs 1, 2, 3, 7, 9 y 13. Varias citoquinas proinflamatorias pueden aumentar la expresión de distintas MMPs, lo que proporciona un estímulo para el aumento de la migración celular. Las citoquinas más implicadas, aunque no las únicas, son TNF- y TGF-β (6). Figura 1.11 Papel de la inflamación en la iniciación (A), promoción (B) y metástasis (C) de CCR. 1.4.5.5 Citoquinas en CCR Las citoquinas producidas por células inmunitarias, fibroblastos, células estromales y células epiteliales cancerosas tienen funciones diversas y pleiotrópicas en las diferentes etapas de la progresión del CCR. En las primeras etapas de la tumorigénesis, varias citoquinas potencian las respuestas Introducción 59 citotóxicas de los linfocitos T CD8+ y las células NK. Además, pueden inducir la liberación de IFN-γ, inhibir la angiogénesis e impedir el crecimiento y la diseminación de las células cancerosas. Todos estos efectos mediados por citoquinas inhiben la progresión del tumor. Sin embargo, en tumores bien establecidos, muchas citoquinas pueden promover la progresión del tumor favoreciendo la proliferación, inhibición de la apoptosis, la angiogénesis, la reorganización estromal, facilitar EMT, así como la metástasis y supresión de inmunidad antitumoral. En la mayoría de los casos, las citoquinas promotoras de tumores actúan de manera paracrina, aunque varios tipos de células cancerosas producen sus propias citoquinas, incluida la IL-6, para lograr el mismo efecto (6, 407). De forma general, las citoquinas promotoras de tumores son producidas por los macrófagos de la lámina propia y las CDs durante los estados tempranos del desarrollo de la CAC o por las células T durante la progresión del tumor y en etapa tardía (6, 395). Las citoquinas, como el TNF- e IL-6, son consideradas trascendentales en el CCR, debido al papel que desempeñan en la activación de los factores de transcripción oncogénicos NF-κB y STAT3, respectivamente, en células epiteliales intestinales (IECs, del inglés “Intestinal Epithelial Cells”), promoviendo la proliferación y resistencia a la apoptosis (391). Por el contrario, otras citoquinas, como el IFN-γ y la IL-15, promueven la inmunidad protectora mediada por las células citotóxicas. Por otra parte la producción de las citoquinas antiinflamatorias IL-10 y TGF-β, por las células Treg, son esenciales en el control de la inflamación intestinal. No obstante, el papel supresor de las células Treg puede ser perjudicial debido al deterioro de las respuestas inmunitarias protectoras (408). En la figura 1.12 se muestra los efectos de las principales citoquinas involucradas en CCR. Introducción 60 Figura 1.12 Propiedades de las citoquinas en la patogenia del CCR (adaptado de (409). TNF-  El factor de necrosis tumoral α (TNF-, del inglés “Tumor Necrosis Factor”) es una citoquina proinflamatoria, que desempeña un papel importante en diversos eventos celulares, incluida la proliferación celular, la diferenciación y la muerte celular (410). Aunque el TNF- se identificó por primera vez como una citoquina supresora de tumores, debido a su capacidad para inducir muerte celular en ciertos tipos de células, las evidencias han demostrado que también puede actuar como agente promotor de tumores que vincula la inflamación y el cáncer (411, 412). Las principales fuentes de producción de TNF- en procesos inflamatorios son de linaje monocitos/macrófagos. Sin embargo, otros tipos de células también pueden producir TNF-, incluidos mastocitos, linfocitos T y B, células NK, neutrófilos, células endoteliales, células musculares lisas y cardíacas, fibroblastos y osteoclastos (413). La unión del TNF- a sus receptores TNFR1 y TNFR2 conduce al reclutamiento de proteínas intracelulares que activan múltiples vías de Introducción 61 transducción de señales: las señales asociadas a FAS, a través del dominio de muerte (FADD)/caspasa 8/caspasa 3, la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK, del inglés “Mitogen Activated Protein Kinase”), de la quinasa Jun (JNK)/proteína de activación 1 (AP-1), y la vía NF-κB (409, 410). La activación de MAPK, JNK/AP-1 y NF-κB inducen la expresión de varias moléculas que incluyen las citoquinas IL-1, IL-6, varias quimioquinas, moléculas de adhesión, COX-2 y MMPs. Cuando el TNF- se une a su receptor TNFR1 también puede ocurrir un tipo de muerte programada denominada necroptosis. Que la necroptosis se desencadene dependerá de diferentes factores como el nivel de activación de la caspasa-8 y la fosforilación de proteínas como RIPK1 (del inglés, “Receptor Interacting Protein Kinase 1”), RIPK3 (del inglés, “Receptor Interacting Protein Kinase 3”) y de MLKL (del inglés, “Mixed Lineage Kinase domain-Like protein”) (414). Se ha comprobado expresión incrementada de TNF- en el colon de pacientes con UC activa y CCR avanzado, pero no en la mucosa normal. Además, los niveles séricos de TNF- se han correlacionado de manera directa con la progresión de CCR y la supervivencia reducida de los pacientes con CCR (415, 416). El TNF- aumenta la permeabilidad vascular, lo que facilita la intravasación y extravasación de núcleos metastásicos (417, 418). La señalización del TNF- también induce EMT, por tanto favorece metástasis, ya que estabiliza al factor de transcripción SNAIL-1, previniendo su degradación (419). IL-1 La familia de citoquinas IL-1 comprende 11 miembros. Estos incluyen citoquinas con actividad agonista (IL-1, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36, IL-36β, IL36γ), miembros con actividad antagonista del receptor (IL-1R, IL36R, IL-38), y con actividad antiinflamatoria (IL-37) (420). Las citoquinas de la familia IL-1 se expresan en todo el tracto gastrointestinal (TGI), desempeñando un papel esencial en la regulación de la inmunidad de la mucosa contra los patógenos intestinales (420, 421). Las más estudiadas de la familia son IL-1β, IL-1, IL-18 e IL-33. Introducción 62 IL-1 A diferencia del precursor de IL-1β, el precursor de IL-1 es completamente activo y funciona como una "alarma" al iniciar rápidamente una respuesta inflamatoria, mediando así las fases tempranas de la inflamación (422). Además del precursor de IL-1 liberado por las células necróticas, hay una forma de membrana de IL-1 presente en los monocitos activados (420). La propia IL-1 puede actuar como una oncoproteína, y la expresión de la misma induce cambios neoplásicos en las células. La IL-1 de macrófagos y CDs puede inducir el reclutamiento de neutrófilos (420, 421). La IL-1 producida por las células cancerosas del colon puede aumentar la angiogénesis mediante la modulación de las células estromales en el microentorno tumoral (423). IL-1β Durante la EII, las CDs y los macrófagos de la lámina propia secretan ingentes cantidades de citoquinas pro-inflamatorias, como la IL-1β y la IL-18, después de ser activadas por el inflamasoma, en respuesta a la presencia de microbiota comensal o a la señalización de receptores tipo Toll (TLR, del inglés “Toll-Like Receptors”) (424). El inflamasoma es un complejo proteico, formado básicamente por una molécula sensora (generalmente un receptor NLR), la proteína adaptadora ASC (del inglés, “Apoptosis-Associated Speck-like Protein Containing a CARD) y la procaspasa-1. La activación del inflamasoma posibilita la proteólisis de la caspasa-1, que se encuentra en forma de procaspasa-1 inactiva (425). Una vez activada, la caspasa-1 proteoliza a la pro-IL-1β y a la pro-IL-18, generándose las formas activas de estas dos importantes citoquinas proinflamatorias (Figura 1.1) (425). Se han encontrado niveles altos de IL-1β en varios tipos de cáncer y durante la progresión de CCR (426). Esta citoquina es un potente activador de la vía NF-κB (427, 428). La IL-1β puede también activar la ruta de Wnt-β-catenina en el CCR, inactivando GSK3β, induciendo EMT y características de célula madre, como la capacidad de formación de colonias, la expresión de genes de células madre (BMI1 y NES) y el incremento a la resistencia frente a la Introducción 63 quimioterapia. En este proceso juega un papel primordial el factor de transcripción pro-mesenquimal ZEB1 (426, 427). Además, se ha reportado que los transcritos de IL-1β están aumentados en las biopsias de tumores de pacientes con CCR metastásico (429) y que polimorfismos en el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1R) pueden asociarse con CCR (430). El bloqueo in vivo de IL-1β usando IL-1R recombinante disminuyó significativamente el desarrollo de tumores en el modelo DSS/AOM (431), lo que indica un papel pro-tumorigénico de IL-1β en este contexto. La IL-1β puede actuar directamente sobre las IECs (431) y sobre las células tumorales (427) para inducir su proliferación. Asimismo, IL-1β promueve el reclutamiento de MDSCs, lo que promueve la progresión de CCR (6, 391, 407, 420). La IL-1β también desempeña un papel importante en la angiogénesis del tumor, actuando indirectamente sobre las células endoteliales (432, 433). IL-1β favorece la supervivencia de las células endoteliales mediante la estimulación de las células del músculo liso vascular para secretar VEGF (434). En resumen, la evidencia sugiere que IL-1β es un activador indirecto de las células endoteliales y la angiogénesis, a través de la regulación de las moléculas pro-inflamatorias y angiogénicas. IL-18 Descrita por primera vez en 1989 como "factor inductor de IFN-γ", la IL-18 está estrechamente relacionada con la IL-1β, ya que ambas se sintetizan primero como precursores inactivos, necesitando caspasa-1 para su escisión (420). Las dos pueden ser procesadas extracelularmente por proteinasa-3 y ambas tienen receptores señuelo. Similar a IL-1, el precursor de IL-18 se encuentra en casi todas las células mesenquimales en humanos y ratones (435). La IL-18 es un componente importante de la respuesta de las células Th1 y de las células NK. Estudios recientes sugieren un efecto protector de la IL-18 en el CAC, al favorecer la respuesta Th1 y la activación de los CTL (436, 437). No obstante, la IL-18 se ha implicado en varias enfermedades, incluyendo EII (420, 438). Introducción 64 IL-23 La IL-23 es una citoquina de la familia de la IL-12, producida por las APCs durante la inflamación intestinal. Es considerada regulador crítico de la EII en humanos y en varios modelos murinos de colitis (424, 439). Los niveles de IL-23 se elevan en el suero de pacientes con CCR, y se correlacionan positivamente con la expresión de VEGF (440). Altos niveles de IL23, en tejido tumoral primario, fueron predictivos de una mayor tasa de metástasis del CCR (441). La IL-23 prolonga la actividad de las células Th17 locales (442) y posiblemente suprime la función de las células Tregs (443). Es posible que la IL23 controle la expresión de varias citoquinas pro-inflamatorias y protumorigénicas, como la IL-6, la IL-17 y la IL-22, y estas citoquinas transmitan el efecto oncogénico de la IL-23 en el microambiente tumoral (444, 445). Estas citoquinas pueden a su vez activar la proliferación de células tumorales a través de STAT3 y NF-κB. IL-17 La IL-17 es una citoquina que une a los sistemas inmunitarios adaptativos e innatos. La familia de la IL-17 contiene 6 miembros: IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL17D, IL-17E e IL-17F (446). Las células Th17 desempeñan un papel importante en la defensa del huésped contra los microorganismos extracelulares, pero también participan en patologías crónicas como las enfermedades inflamatorias y las enfermedades autoinmunes (6, 391, 407). Los miembros de la familia IL-17, como IL-17A, IL-17C e IL-17F, regulan las funciones de las células epiteliales del colon en la EII y CAC. Se ha demostrado que IL-17A está elevada en las biopsias de tejido de pacientes con EII (6, 391, 407). IL-17A es el miembro más ampliamente estudiado de esta familia en el contexto de la EII y la tumorigénesis intestinal. IL-17A parece ser protector contra la colitis, mientras que favorece el desarrollo del cáncer de colon. Por ejemplo, el bloqueo de IL-17A fue ineficaz e incluso exacerbó la EII en algunos pacientes, debido al papel crítico que desempeña IL-17A en el mantenimiento de la homeostasis de la barrera epitelial (447). Por el contrario, la expresión de IL-17A Introducción 65 está elevada en CAC y CCR esporádico y empeora la progresión de la enfermedad (448, 449). Aunque en general se acepta que las células Th17 son la fuente principal de IL-17A en el microambiente tumoral, los CTLs, las células T γδ y las ILCs también son importantes productores de IL-17A (409). Las CDs que se infiltran en el tumor pueden promover la producción de IL-17 en células T γδ a través de IL-23 y, de forma similar a los estudios en modelos de ratón, las células T γδ intratumorales humanas promueven el reclutamiento y expansión de MDSCs (450, 451). Por lo tanto, IL-17A puede contribuir indirectamente al silenciamiento inmune en el microentorno tumoral. Además de las células hematopoyéticas, los CAFs también pueden expresar IL-17A en respuesta a quimioterapia en CCR humano y en modelos murinos de xenotransplante (452). La IL-17A puede actuar sobre las células del estroma tumoral, promoviendo la resistencia a terapias antiangiogénicas (453). IL-22 La IL-22 es una citoquina de la familia IL-10 producida por ILCs del grupo 3, células Th17, células Th22 y posiblemente neutrófilos (454, 455). La IL-22 tiene un papel crucial en la resolución del daño tisular inducido por la lesión microbiana, las ROS y otros estímulos dañinos ya que aumenta la proliferación, la supervivencia y la regeneración de las IECs (454). Se cree que las acciones multifacéticas de la IL-22 preservan la integridad del epitelio intestinal al prevenir el daño tisular causado por la infección y la inflamación (456-458). Sin embargo, esta citoquina también puede promover colitis en algunos entornos al favorecer la secreción de otras citoquinas pro-inflamatorias y perpetuar la respuesta inflamatoria (454). En humanos, se han asociado niveles séricos elevados de IL-22 con la resistencia a la quimioterapia en pacientes con CCR, resistencia mediada por la secreción autocrina de IL-8 dependiente de STAT3 (459). Kryczek et al recientemente demostraron que la IL-22 promueve CCR activando STAT3 (460). Introducción 72 Grupo Celular Funciones antitumorales Funciones protumorales CDs Presentación antigénica a linfocitos T. Activación de células T CD8+. Diferenciación de células Th1 (IL-12) (524, 525). Señales inhibitorias de linfocitos T (PD-L1, PD-L2). Diferenciación de células Th2, células Th17 y células Treg (524, 526). Células Inmunosupresoras de origen mieloide (MDSC) Disminución de la proliferación de linfocitos T. Inducción de apoptosis de linfocitos T y células NK. Producción de IL-10 y TGF-β. Producción de MMPs y factores angiogénicos (505). Neutrófilos Neutrófilos proinflamatorios N1. Eliminación de células tumorales. Producción de ROS, TNF-, IL-12, CCL3. Reclutamiento y activación de células T CD8+ (527, 528). Neutrófilos antinflamatorios N2. Producción de ROS. Quimiotaxis de células Th2 y células Treg (529-531). Células B Producción de anticuerpos antitumorales. Producción de IFN-γ o IL-12. Citotoxicidad directa (516, 532). Producción de IL-10, TGF-β. Reclutamiento de MDSCs. Polarización a macrófagos de fenotipo M2. Diferenciación de células Treg (533). Células NK Eliminación de células tumorales (Perf, GzmB, FasL, TRAIL). Producción de citoquinas (IFN-γ y TNF-). Quimiotaxis de CDs (CCL5 y CXCL1) (534-536). Células NKT Producción de citoquinas. Activación de células T CD8+ (537, 538). Producción de citoquinas. Polarización de macrófagos a fenotipo M2. Aumento de la proporción y actividad de células Treg (538, 539). ILCs Eliminación de células tumorales. Producción de citoquinas (IFN-γ y TNF-) (540) Producción de citoquinas. Producción de Areg Polarización de macrófagos a fenotipo M2. Reclutamiento de MDSCs (540, 541). Tabla 1.11 Papel de las diferentes subpoblaciones del sistema inmunitario en la inmunidad antitumoral y en la inflamación que favorece CCR. Areg: anfirregulina, ADCC: citotoxicidad mediada por anticuerpos (del inglés, “Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity”). Introducción 73 1.4.7 Papel de la microbiota intestinal en el desarrollo del cáncer En el intestino humano hay 500 tipos diferentes de microorganismos y el colon contiene más de 1013 células bacterianas (542). La microflora intestinal tiene importantes funciones inmunitarias, metabólicas y homeostáticas, afecta la proliferación y supervivencia de las células epiteliales y proporciona protección contra los patógenos (543). La microbiota intestinal metaboliza los carbohidratos no absorbidos, las células epiteliales muertas y el moco. También produce metabolitos que influyen en la función de las células epiteliales, el balance de energía y las respuestas inmunitarias (544, 545). Además produce vitaminas, ácidos grasos de cadena corta que regulan la respuesta inflamatoria en EII y metaboliza los ácidos biliares (546). Los estudios han demostrado que el desarrollo de CAC depende cualitativa y cuantitativamente de la microflora intestinal (547-549). La interrupción de la homeostasis de la microflora intestinal podría promover el cáncer de varias maneras. Los patógenos microbianos pueden causar inflamación intestinal a través de la activación de PRRs o por endocitosis, también por adherencia y secreción de toxinas o invasión (550). La inflamación intestinal puede ser el resultado de un equilibrio aberrante entre la microflora protectora (tolerogénica) y microflora agresiva (proinflamatoria, inductora de daño, protumorigénica). Los cambios en el número, la diversidad y la estabilidad de las bacterias comensales (disbiosis), particularmente Clostridia spp, pueden alterar los procesos fisiológicos normales y provocar enfermedades, incluido CCR (551); así que, la cantidad y calidad de la microbiota gastrointestinal afecta el desarrollo de CAC (548). La especie Bacteroides fragilis enterotoxigénica puede promover la tumorigénesis del colon, si es capaz de inducir daño tisular y colitis, con la activación posterior de STAT3 y la producción de IL-17 (552). Es posible que solo las bacterias que inducen una combinación de lesión tisular e inflamación promuevan el cáncer, mientras que la inflamación sin ciclos continuos de lesión y reparación es insuficiente para la inducción tumoral. Otros patógenos o comensales condicionales también contribuyen a la tumorigénesis, por ejemplo, la especie Enterococcus faecalis puede promover la producción de ROS. En el caso de Streptococcus bovis, Bacteroides fragilis y otras bacterias producen Introducción 74 citoquinas que favorecen supervivencia y angiogénesis (IL-6, IL-8, IL-17) (553). Asimismo, se ha encontrado, en muestras de tumores colorrectales y en tejidos adyacentes a tumores, la acumulación de muchas especies bacterianas (547). En la tabla 1.12 se muestra un resumen de los microorganismos relacionados con el CCR y la EII. Microorganismo Mecanismo patológico En CCR Bacteroides fragilis enterotoxigénica Activación de STAT3. Lesiones en la estructura y función de IECs. Producción de IL-17. Activación de NF-κB y Wnt. Bacteroides vulgates Señalización dependiente de MyD88. Activación de NF-κB. Bifidobacterium longum Clostridium butyricium Mitsuokella multiacida Aumento de presencia bacteriana en tumores colorrectales y en tejidos adyacentes a tumores. Escherichia coli productora de colibactina Producen el metabolito carcinogénico colibactina. Colonización intracelular. Enterococcus faecalis Producción de ROS y daño en el DNA. Streptococcus bovis Producción de IL-8. Formación de criptas aberrantes. Aumento de la proliferación de IECs. Fusobacterium Nucleatum Aumento de presencia e invasividad bacteriana en tumores colorrectales. Lesiones en la estructura y función de IECs. Activación de Wnt. Daños en DNA, MSI. Inhibición de la acción citolítica de las células NKs. Condición: libre de gérmenes Resistencia al cáncer de colon. En EII Bacteroides fragilis Estimulación de la producción de IL17. Bacteroides thetaiotaomicron Cambios de glucosilación (adhesión defectuosa y migración) Clostridium difficile Aumento de presencia bacteriana en el tejido. Clostridium leptum y coccoides Alteración de la diversidad de la microbiota con cambio a potencial proinflamatorio/pro-tumorigénico. Escherichia coli invasiva Colonización de IECs. Producción de IL-8, IFN-γ, TNF- y de la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 6 (CEACAM6). Tabla 1.12 Microorganismos relacionados con el CCR y EII. Adaptado de (6). Introducción 75 1.4.8 Modelos experimentales para el estudio de CCR Existen varios modelos, tanto in vitro como in vivo, para el estudio del CCR. Estos han proporcionado herramientas importantes para investigar el desarrollo y la patogénesis, los mecanismos etiológicos y fisiopatológicos, así como el tratamiento del CCR humano. 1.4.8.1 Modelos in vivo El estudio de la carcinogénesis de colon en roedores tiene una larga historia, que se remonta a casi 80 años (554). Estos modelos ofrecen muchas ventajas: son altamente reproducibles, son útiles para estudiar la influencia de factores genéticos y ambientales que influyen en el desarrollo del CCR y, además, recapitulan la patogénesis del CCR humano, al menos en las primeras etapas (555). Los modelos murinos para estudiar la patogénesis del CCR son relevantes dada la alta frecuencia de tumores generados en la porción distal del colon de ratones, así como la histogénesis de múltiples adenomas con el posterior desarrollo de adenocarcinomas (556). Otra gran ventaja de los modelos murinos es la disponibilidad de información genética extensa sobre líneas individuales de ratones, la existencia de paneles de ratones endogámicos recombinantes y el número cada vez mayor de modelos genéticos transgénicos, knockout y knockin, disponibles (557). Una desventaja notable de estos modelos es la falta general de fenotipo invasivo y metastásico (558). Recientemente, se ha desarrollado un modelo de CCR en ratones transgénicos, con mutaciones en cuatro genes implicados en CRC humano: APC, K-ras, TGFBR2 y p53. Estos ratones desarrollaron tumores intestinales metastásicos, con características de los CCR MSS humanos, incluida la baja carga mutacional, invasión estromal y activación de TGF-β (468). Se han desarrollado muchos modelos in vivo para estudiar el CCR:  Animales genéticamente modificados  Modelos de xenotransplantes  Modelos químicamente inducidos Introducción 76 Modelos inducidos por agentes químicos En la tabla 1.13 se muestran los carcinogénicos usados para inducir CCR. Grupo Carcinogénico Aminas heterocíclicas 2-amino-33-metilimidazol [4,5-f] quinolina (IQ) 2-amino-1-metil-6-fenilimidazol [4,5-b] piridina (PhIP) Aminas aromáticas 3,2'-dimetil-4-aminobifenilo (DMBA) Compuestos de alquilnitrosamida metilnitrosourea (MNU) N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) Dimetilhidrazina y metabolitos 1,2-dimetilhidrazina (DMH) Azoximetano (AOM) Tabla 1.13 Carcinogénicos usados en modelos experimentales para inducir CCR. 1.4.8.2 AOM El AOM es el carcinogénico más utilizado para inducir, y así estudiar, el CCR esporádico. Este modelo aprovecha el organotropismo o afinidad química que tiene AOM por el colon. El AOM es un metabolito de la DMH, y es precursor del carcinógeno metilazoximetanol (MAM). Ambos se han utilizado para inducir CCR en ratones y ratas (558). Tanto DMH como AOM requieren varios pasos de activación metabólica para inducir aductos reactivos con el DNA. La hidroxilación de AOM da como resultado la formación del metabolito reactivo MAM, un ion metildiazonio, que puede alquilar macromoléculas en el hígado y el colon, incluida la adición de grupos metilo en la posición O6 o N7 de la guanina (O6metil-deoxiguanosina y N7-metil-deoxiguanosina) en la molécula de DNA. La metilación en la posición O6 de la guanina ha demostrado ser la principal lesión promutagénica producida por el AOM (559). Los tumores inducidos por AOM comparten muchas de las características histopatológicas del CCR humano. Con frecuencia tienen mutaciones en KRAS y β-catenina, algunos muestran MIS, lo que indica un sistema de reparación de desajuste defectuoso (560, 561). Sin embargo, las mutaciones de APC son Introducción 77 menos frecuentes en roedores y rara vez se observan mutaciones de p53 (558, 562). La tendencia a hacer metástasis es baja (563). 1.4.8.3 Modelo de CAC. DSS/AOM Varios trabajos han confirmado la relevancia del modelo DSS (Sulfato de Dextrano Sódico)/AOM en el estudio de los mecanismos de la carcinogénesis colorrectal humana. Se ha demostrado que, debido a los efectos sinérgicos entre AOM y DSS, se acorta considerablemente el tiempo de latencia en comparación con el modelo clásico de CCR espontáneo, que se basa en inyecciones repetidas de AOM, o en comparación con los modelos basados únicamente en la administración de DSS a diferentes dosis y pautas. El tratamiento con DSS/AOM reproduce la carcinogénesis colorrectal promovida por una fase inicial de inflamación aguda, causando un rápido crecimiento de múltiples tumores de colon en 8-10 semanas, mientras que en los otros modelos hay un tiempo de latencia de aproximadamente 30 semanas (564). El modelo DSS/AOM es particularmente útil cuando se estudia la iniciación y progresión de CAC. El uso de DSS en combinación con AOM da como resultado una incidencia del 80-100 % de tumores en el colon de cepas sensibles en comparación con el 15–20 % cuando se administra DSS solo (558). Los tumores son muy frecuentes en la parte distal del colon, que también es la ubicación predominante del CCR humano. A menudo comienzan con un crecimiento polipoide y presentan características histopatológicas similares al CCR humano (558, 562). Vías genéticas involucradas en el modelo DSS/AOM Las evidencias muestran características muy similares entre el CCR humano y el inducido en roedores por DSS/AOM, también a nivel molecular. Dichos tumores presentan desregulación de la vía de señalización de APC/βcatenina, como por ejemplo la expresión aberrante de APC, además de mutaciones y la localización celular alterada de β-catenina (565-567). También se ha demostrado que están desregulados genes diana de la vía de señalización de APC/β-catenina, como el oncogén cMyc, ciclina D1 y quinasa dependiente de ciclina 4 (Cdk4) (567). En concordancia con los hallazgos encontrados en el CCR humano, los tumores inducidos por DSS/AOM también tienen mutaciones Introducción 78 de KRAS y mayores niveles de las enzimas, COX2 y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) (560, 566). Las alteraciones genéticas en el gen p53, tan comúnmente encontradas en el CCR humano, no se observan en el modelo de CAC inducido con DSS/AOM (558, 562, 568, 569). El gen p53 permanece sin mutar, a pesar de que los animales p53-/- desarrollan más tumores si son tratados con AOM (570). ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Antecedentes y Objetivos 79 2ANTECEDENTES Y OBJETIVOS La inflamación es un mecanismo clave que regula la actividad del sistema inmune en situaciones fisiológicas, por ejemplo, durante la eliminación de tumores y agentes patógenos. Sin embargo, la inflamación crónica también regula respuestas fisiopatológicas durante las enfermedades infecciosas, autoinmunes, así como en la génesis y progresión del cáncer (4-6, 193, 571, 572). Se ha realizado un gran esfuerzo para comprender las vías y mecanismos moleculares que regulan la respuesta inflamatoria y los elementos clave de esta. Varios estudios han permitido concluir que, tanto la respuesta inflamatoria inmune, que conducen a la eliminación de patógenos y tumores, como los trastornos inflamatorios crónicos, que conducen al desarrollo de enfermedades, comparten los mismo mecanismos (7-11). Esta dualidad ha dificultado el tratamiento de los trastornos asociados a inflamación crónica sin predisponer a la aparición de efectos secundarios graves. En la mayoría de las terapias se han utilizado compuestos inmunosupresores de amplio espectro como esteroides o agentes que bloquean la función de las citoquinas, incluidos los antagonistas de los receptores IL-1β, IL-6 y TNF-, o anticuerpos bloqueantes (7, 573-576) y como era de esperar, los efectos secundarios de estos compuestos pueden ser graves, especialmente, los pacientes presentan un alto riesgo de infección con patógenos que incluyen tuberculosis (577) y probablemente linfoma y melanoma (578). Las células citotóxicas (células NK y linfocitos T citotóxicos) son esenciales para la defensa del huésped contra patógenos y tumores, siendo responsables de la eliminación de las células afectadas, pero también pueden estar implicadas en el daño asociado a inflamación crónica porque producen cantidades significativas de citoquinas proinflamatorias y también son capaces de regular su producción por otros grupos celulares (12, 13). Uno de los mecanismos que utilizan estas células para ejercer sus efectos citotóxicos es la exocitosis granular. Este es un proceso de interacción funcional entre la Perf (citolisina formadora de poros) y las Gzms, una familia de serina Materiales y Métodos 85 3MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Experimentos in vivo 3.1.1 Ratones En los experimentos in vivo se siguieron los protocolos de experimentación animal aprobados por el comité de ética del Centro de Investigación Biomédica de Aragón (CIBA). Los experimentos de artritis inducida por colágeno (CIA) se realizaron según el procedimiento de experimentación PI 33/13, mientras que los de colitis y CCR asociado a colitis (CAC) se realizaron según el procedimiento de experimentación PI 17/15. En todos los experimentos de CIA se usaron ratones hembra. Para los experimentos de colitis y CAC se usaron ratones macho. En ambos modelos de experimentación animal se usaron ratones de entre 8 y 12 semanas de edad. Los animales utilizados en los diferentes ensayos fueron los siguientes: 1. Animales control (wild type -wt-) • C57BL/6 (B6) procedentes de los laboratorios Janvier, o de la colonia estable criada y mantenida en el animalario del CIBA. 2. Animales Knock-out (KO): en los experimentos se utilizaron ratones C57BL/6 deficientes en algunas proteínas del sistema inmune implicadas en el mecanismo de exocitosis granular. • Ratones deficientes en granzima A (GzmA-/-), granzima B (GzmB-/-) o perforina (Perf-/-). Estos animales fueron amablemente proporcionados por el Dr. Markus Simon del Instituto Max-Planck de Inmunobiología y Epigenética, Friburgo, Alemania y mantenidos en el animalario del CIBA. Los animales fueron criados y mantenidos en ambiente libre de patógenos, con alimentación y agua a libre demanda. 3.1.1.1 Determinación del genotipo de los ratones Para comprobar el genotipo de los ratones utilizados en los experimentos, se realizó PCR del DNA obtenido de la cola (siempre después del sacrificio del Materiales y Métodos 86 animal) o de los dedos (antes del destete, aprovechando el tejido que se retira para identificar a los ratones). Para obtener el DNA se siguió el siguiente protocolo: se introdujo el fragmento de tejido seccionado en un tubo de 1,5 ml y se añadieron 50 μl de una solución 25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA. La mezcla se incubó 1 h a 95 ºC y posteriormente se enfrió 15 min a 4 ºC. Luego se añadieron otros 50 μl de una solución 40 mM Tris-HCl para neutralizar el NaOH. Por último se eliminaron los restos de tejido residuales y el sobrenadante se utilizó para la PCR o se guardó a –20 ºC. La amplificación del DNA se llevó a cabo en diferentes mezclas utilizando en cada caso los cebadores adecuados para detectar los genes correspondientes a cada proteína. Las secuencias de los oligonucleótidos usados como cebadores de la reacción (588), así como el protocolo utilizado para realizar la PCR fueron: Proteína Cebador Secuencia GzmA O1 Neo2A 5’-CGG AGA ACC TGC GTG CAA TC-3’ HF-I1 5’-AGG AGC AAT ATA TAC CAA TGG-3’ HF-7AS 5’-AGG TAG GTG AAG GAT AGC CAC-3’ GzmB Neo2S 5’-TTC CTC GTG CTT TAC GGT ATC-3’ ST-1S 5’-CTG CTA CTG CTG ACC TTG TCT-3’ ST-1AS 5’-TGA GGA CAG CAA TTC CAT CTA-3’ Perf O1Neo2A 5’-CGG AGA ACC TGC GTG CAA TC-3’ JT98 5’-CCA CTC CAC CTT GAC TTC AAA AAG GCG-3’ JT272 5’-TGG GCA GCA GTC CTG GTT GGT GAC CTT-3’ Tabla 3.1 Secuencias de los cebadores utilizados para la PCR de genotipado.ura Materiales y Métodos 87 Mezcla de reacción (volumen total 25 µL) SuperHotMaster Mix 2X (BIORON) 12,5 µL Agua para PCR 9.5 µL GzmA O1 Neo2A 0.75 µL (0.3 µM) HF-I1 0.75 µL (0.3 µM) HF-7AS 1.5 µL (0.6 µM) GzmB Neo2S 0.75 µL (0.3 µM) ST-1S 0.75 µL (0.3 µM) ST-1AS 1.5 µL (0.6 µM) Perf O1Neo2A 0.75 µL (0.3 µM) JT98 0.75 µL (0.3 µM) JT272 1.5 µL (0.6 µM) Tabla 3.2 Mezcla de la reacción de la PCR de genotipado.a Se añadió 1 μl del DNA obtenido, previamente extraído del tejido, a 25 μl de esta mezcla de reacción. Se llevó a cabo la PCR utilizando el siguiente programa: Condiciones de la reacción Calentamiento inicial 94 ºC 2 min Desnaturalización 94 ºC 10 seg 35 ciclos Hibridación 55 ºC 20 seg Extensión 72 ºC 60 seg Extensión 72 ºC 5 min Tabla 3.3 Condiciones de la reacción de la PCR de genotipado.ur Los productos de amplificación obtenidos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 % en TBE (0,045 M Tris-borato, 1 mM EDTA) que contenía dsGreen Gel Staining Solution, 10.000× (Lumiprobe), que se une específicamente al DNA, facilitando la visualización de las bandas del DNA amplificado. Como marcador de peso molecular se utilizó 100 bp DNA ladder (IBIAN). La visualización se llevó a cabo en el transiluminador Gel Doc 2000 de BioRad Laboratories (Hércules, CA). La determinación del genotipo de cada ratón se llevó a cabo de la siguiente manera: Materiales y Métodos 88 Tabla 3.4 Tamaño de los productos de amplificación de la PCR de genotipado. 3.1.2 Artritis inducida por colágeno (CIA) La artritis se indujo utilizando colágeno de pollo tipo II (Chondrex) en adyuvante completo de Freund (CFA) (Chondrex). A los 21 días de la primera inmunización los ratones fueron reexpuestos al colágeno, siguiendo el mismo procedimiento, pero esta vez usando adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Chondrex). A continuación se detalla la preparación de la emulsión de colágeno y el proceso inmunización: 3.1.2.1 Preparación de la emulsión Se añadió el volumen de CFA (o IFA en el caso de la 2a inmunización) necesario, en dependencia del número de animales a inmunizar, en un recipiente de vidrio limpio y seco, previamente enfriado en hielo. Se añadió con micropipeta, poco a poco, colágeno de pollo tipo II y se resuspendió tras cada adición para que al mezclar se fuera formando la emulsión. Cuando todo el volumen de colágeno de pollo tipo II había sido añadido se resuspendió de manera continua hasta que se terminó de formar la emulsión. Se comprobó la estabilidad de la emulsión formada añadiendo una gota de la misma a un poco de agua, al no deshacerse se consideró que la emulsión era estable. Durante todo el proceso los reactivos y la emulsión se mantuvieron en hielo para evitar la desnaturalización del colágeno de pollo tipo II. 3.1.2.2 Inmunización Se inyectaron lentamente 100 µl de la emulsión a cada ratón, a 1,5 cm de la base de la cola, por vía intradérmica. Cuando la inoculación era correcta había resistencia del tejido a la inyección sino, era indicativo de una inyección subcutánea o profunda. Proteína Genotipo +/+ (bp) Genotipo -/- (bp) GzmA 450 320 GzmB 360 430 Perf 660 950 Materiales y Métodos 89 El día 21 después de la inmunización primaria se realizó una segunda inmunización en la que se usó la misma concentración de colágeno de pollo tipo II, sin embargo, en esta ocasión el colágeno de pollo tipo II se emulsionó en IFA (el uso de CFA en la inmunización de refuerzo no está permitido). El protocolo utilizado para realizar la inducción de la artritis se muestra de forma esquemática en la figura 3.1. Figura 3.1 Protocolo de inducción de CIA. 3.1.2.3 Monitorización y evaluación de la severidad de la artritis Para la monitorización macroscópica de la artritis se estableció un sistema de puntuación en los que se evaluó la severidad de la enfermedad teniendo en cuenta varios signos clínicos de artritis. Cada miembro se valoró individualmente, lo que supuso un máximo de 16 puntos por ratón. La evaluación se realizó semanalmente, de la siguiente manera: 0 = normal 1 = eritema e hinchazón leve confinada al mediopié (articulaciones tarsales) o articulación del tobillo 2 = eritema e hinchazón leve que se extiende desde el tobillo hasta el mediopié 3 = eritema e hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo hasta la articulación metatarsiana 4 = eritema e hinchazón severa del tobillo, el pie y los dedos, con rigidez articular 3.1.2.4 Anatomía patológica e inmunohistoquímica Para la evaluación histológica, los ratones artríticos se sacrificaron a las 2 (enfermedad temprana) o 7 (enfermedad tardía) semanas después del inicio de la AR. En primer lugar, las articulaciones se fijaron en una solución de Materiales y Métodos 90 formaldehído 10 % en PBS durante 24-48 h a temperatura ambiente. Posteriormente se descalcificaron durante 3 semanas a 4 ºC en tampón TrisEDTA. Transcurrido este tiempo las muestras se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones de 3 µm y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Las secciones fueron analizadas, estableciéndose una puntuación histológica de 0 a 4 para la inflamación, la erosión ósea y del cartílago así como la hiperplasia sinovial. El análisis histológico lo llevó a cabo un histopatólogo entrenado, mediante un estudio ciego. La inmunohistoquímica (IHQ) se realizó en secciones de tejido embebido en parafina siguiendo la técnica de tinción con avidina-biotina-inmunoperoxidasa, sin recuperación previa de antígeno. Brevemente, se desparafinaron secciones de 4 µm y se bloqueó la actividad de peroxidasa endógena con H2O2 al 3 %, y después se incubó durante 30 min en suero de conejo al 10 %. La incubación con el anticuerpo anti-receptor de calcitonina de conejo (LS-C42899; LSBio) se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron durante 30 min con inmunoglobulinas biotiniladas, seguido de incubación durante 30 min con una dilución 1:25 del complejo avidina-biotinaperoxidasa (ambos de Vector Laboratories). La diaminobencidina (DAB, Sigma) se utilizó como cromógeno y la hematoxilina como contratinción nuclear. 3.1.2.5 Análisis de proliferación de células T (incorporación de 3H-timidina) Se sacrificaron ratones artríticos en diferentes momentos después del inicio de la enfermedad, se extirparon ganglios linfáticos inguinales, braquiales y axilares. Se procesaron por maceración hasta obtener una suspensión de células en medio RPMI (1x107 cel/ml) y se cultivaron durante 72 h a 37 ºC y 5 % de CO2 en presencia de 0, 50 o 100 µg/ml de colágeno de pollo tipo II. Se añadió 3H-timidina (Amersham) a los cultivos celulares durante las últimas 18 h (1 µCi/pocillo, equivalente a 1 µL por pocillo) y se cuantificó la radioactividad en un contador de centelleo líquido (Beckman). La concanavalina A (1 µg/ml) se usó como control positivo de la proliferación de células T. Materiales y Métodos 91 Paralelamente, se cultivaron células de ganglios linfáticos en las mismas condiciones anteriormente expuestas, pero en lugar de agregar 3H-timimida, se recuperaron los sobrenadantes del cultivo celular, después de 24 h, y se cuantificaron las citoquinas IL-1, IL-6, IFN-, TNF- e IL-17, usando el correspondiente "Ready-Set-Go", de Affymetrix (eBioscience) (ver sección 3.2.3.1). 3.1.2.6 Ensayo de formación de fosas La reabsorción ósea mediada por OCs se evaluó utilizando cortes de dentina de ballena (589). Las colonias CFU-GM se incubaron durante 15 días en rodajas de dentina previamente tratadas con M-CSF (25 ng/ml) (Prepotech) en presencia o ausencia de GzmA (3,5 µg/ml) o TNF (100 ng/ml). Como control positivo se utilizaron RANKL (50 ng/ml) (Biotech) más M-CSF. Los OCs se separaron con tripsina, y la formación de fosas se verificó por microscopía confocal. 3.1.3 Colitis y cáncer asociado a colitis La inducción de colitis aguda o crónica se realizó empleando Sulfato de Dextrano Sódico (DSS, del inglés “Dextran Sulfate Sodium”) (MW 36.000–50.000 de MP Biomedicals). Por otro lado, la inducción de CAC se realizó con una combinación de DSS y azoximetano (AOM) (Sigma Aldrich) (564, 590). 3.1.3.1 Inducción de colitis crónica y aguda La colitis crónica se indujo mediante 3 ciclos de DSS al 2,5 %, administrado en el agua de beber. Cada ciclo tuvo una duración de cinco días, seguidos de 2 semanas de descanso con agua sin tratamiento. Todos los ratones tuvieron acceso ad libitum al agua de beber, que contenía DSS al 2,5 % o agua sin tratamiento (grupo control). En algunos experimentos se indujo colitis aguda, para lo cual se administró DSS al 2,5 % en el agua de beber durante cinco días (un ciclo), y los animales fueron sacrificados 10 días después de iniciar el tratamiento. Materiales y Métodos 92 3.1.3.2 Inducción de cáncer asociado a colitis (CAC) El CAC se indujo mediante inyección intraperitoneal (ip) de una dosis única del agente mutagénico AOM (10 mg/kg) el primer día de tratamiento, seguido de 3 ciclos de DSS al 2,5 % en el agua de beber durante cinco días, con descanso entre ciclos de dos semanas. Para llevar a cabo estos experimentos, se preparó una solución de AOM, en solución salina isotónica, a una concentración de 1 mg/ml. Para la mayor precisión en la dosificación, cada animal se pesó y se calculó el volumen a administrar multiplicando el peso del animal (kg) x la dosis (mg/kg) y luego se dividió por la concentración de la solución de trabajo (mg/ml). Al preparar la solución de trabajo a 1 mg/ml se garantizó que: Volumen de AOM a administrar (µL) = peso del ratón (g) x 10 El mismo volumen de solución isotónica se inoculó en los grupos control. En la figura 3.2 se muestra el protocolo utilizado para inducir colitis y CAC. Figura 3.2 Protocolo de inducción de Colitis y CAC. En tres experimentos independientes se inhibió in vivo la GzmA en ratones wt tratados con DSS/AOM. Para ello se indujo CAC, tal y como se indica anteriormente. A partir del día 35, un grupo de ratones se trató con cinco dosis de serpinb6b, un inhibidor selectivo de la GzmA de ratón. Se administraron 20 µg por vía intravenosa cada dos días. Como control se utilizó un grupo de ratones a los cuales se les administró serpinb6b previamente inactivado con tripsina. Los ratones fueron sacrificados 49 días después de iniciar el experimento. Se analizó el daño a nivel macroscópico en el colon, así como la incidencia, el número y el Materiales y Métodos 93 tamaño de los tumores. Una porción de colon se cultivó para determinar el nivel de citoquinas inflamatorias presentes en el sobrenadante del cultivo de los explantes de tejido de colon. En algunos experimentos se inhibió in vivo la IL-6 en ratones wt y en ratones deficientes en GzmA-/-, tratados con DSS/AOM. Para ello, se indujo CAC tal y como se indica anteriormente. En dos experimentos, a partir del día 35 y hasta el día 50, a un grupo de ratones de ambas cepas se les administró un total de 6 dosis del anticuerpo monoclonal anti-IL6 (MP5-20F3, BioXcell). El sacrificio se realizó el día 56 después de iniciado el tratamiento con DSS/AOM. Se administraron 200 µg/ratón del anticuerpo por vía i.p cada 72 h. Como control, se utilizaron ratones a los cuales se les administró un isotipo IgG1 hecho en rata (BioXcell). En otro experimento se inhibió de forma tardía la IL-6, esta vez se administraron un total de 5 dosis, a razón de 200 µg/ratón del anticuerpo monoclonal anti-IL6, por vía ip cada 48 h, desde el día 56 hasta el día 64 del tratamiento. El sacrificio se realizó el día 70. En la necropsia se analizó el daño a nivel macroscópico en el colon, así como la incidencia y el número de tumores. Una porción de colon se cultivó para determinar el nivel de citoquinas inflamatorias presentes en el sobrenadante del cultivo de los explantes de tejido de colon. Se realizó un experimento en el que se inhibió in vivo el TNF-α, en ratones wt y en ratones deficientes en GzmA-/-, tratados con DSS/AOM. Para ello, se indujo CAC tal y como se indica anteriormente. En dicho experimento, a partir del día 56 y hasta el día 60, a un grupo de ratones de ambas cepas se les administró un total de 5 dosis de del antagonista específico del TNF- humano, Enbrel (etanercept) (Pfizer), cedido amablemente por la Dra. Ana María Ortiz García del servicio de reumatología del Hospital universitario de La Princesa. El sacrificio se realizó 67 días después de iniciar el tratamiento con DSS/AOM. Se administraron 5 mg/kg/ratón, del antagonista por vía ip cada 24 h. Como control se utilizaron ratones a los cuales se les administró PBS. En la necropsia se cuantificó el número de tumores por ratón, así como la incidencia de tumores. Materiales y Métodos 100 3.2.2 Ensayo colorimétrico Bradford para estimar la concentración de proteínas Se cuantificó la concentración de proteínas recombinantes y de proteínas totales extraídas de lisados celulares o de tejidos, mediante el ensayo Bradford. Para ello se utilizó el kit Quick StartTM Bradford Protein Assay BioRad. Brevemente, se preparó la curva patrón de BSA como se indica en el manual de procedimiento del Kit. Se utilizó como diluyente el mismo tampón en el que se disolvieron las muestras a analizar. Se cargaron 5 μl de las diferentes concentraciones de la curva patrón y de las muestras, por triplicado, en una placa de 96 pocillos de fondo plano y, a continuación, se añadieron 245 μl de azul de Coomassie. Se incubó a temperatura ambiente durante 5 min y finalmente se midió la absorbancia a 595 nm. Se determinó la concentración de la proteína en cuestión (o de las proteínas totales) utilizando la recta de calibrado. 3.2.3 Cuantificación de proteínas por ELISA 3.2.3.1 Cuantificación de Citoquinas por ELISA Para cuantificar, en los sobrenadantes de cultivos de células de ganglios linfáticos, en los explantes de tejido de colon o en el suero, las siguientes citoquinas: IL-1, IL-6, IFN-, TNF-, IL-10 e IL-17, se utilizaron los correspondientes Kits "Ready-Set-Go", de Affymetrix (eBioscience). Para el caso específico del tejido de colon, éste se cortó en porciones de 30 mg (distal y proximal) y se mantuvo en 2 ml de medio de cultivo (DMEM suplementado con SFB al 10 %, glutamina 10 mM, HEPES 10 mM (Sigma) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina) a 37 ºC, en una atmósfera de 5 % de CO2. Después de 24 h, se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron a 500 xg durante 10 min y se almacenaron alicuotadas a -80 ºC para posteriormente realizar el ELISA correspondiente. En el caso del cultivo de células de ganglios linfáticos se procedió según lo descrito en la sección 3.1.2.5. De forma general, se adicionaron 100 µl del anticuerpo de captura a la concentración recomendada, en tampón de revestimiento, a la placa de ELISA Materiales y Métodos 101 de 96 pocillos (NUNC Maxisorp) y se incubó toda la noche a 4 ºC. Se lavó la placa 3 veces con 200 µl de solución de lavado (1X PBS con 0.05 % Tween-20) y seguidamente se bloqueó con 200 µl de tampón de ensayo durante 1 h a temperatura ambiente. Se adicionó el patrón y el blanco como recomienda el fabricante, además de las muestras diluidas en tampón de ensayo, incubándose 2 h a temperatura ambiente. Tras lavar la placa 3 veces con solución de lavado, se adicionaron 100 µl del anticuerpo de detección conjugado con biotina a la concentración recomendada y se incubó 1 h a temperatura ambiente. Se lavó la placa 3 veces con solución de lavado, se adicionaron 100 µl de enzima avidinaHRP (1:4000 en tampón de ensayo) y se incubó durante 30 min. Seguidamente, se lavó la placa 5 veces y se adicionaron 100 µl de TMB (3,3’,5,5’- Tetrametilbenzidina), tras 15 min se detuvo la reacción adicionando 50 µl de H2SO4 1M. Se determinó la absorbancia en un lector de placa (Synergy™ HT, BioTek) a 450 nm y 570 nm y se restaron los valores obtenidos a dichas longitudes de onda (Abs 450-Abs 570). 3.2.3.2 Cuantificación de GzmA por ELISA Para cuantificar GzmA de ratón a partir de proteínas totales de tejido congelado, en los sobrenadantes de cultivos de explantes de tejidos de colon o en suero, se realizó un ELISA tipo sándwich indirecto usando anticuerpos contra GzmA de ratón hechos en rata y conejo. Estos anticuerpos fueron previamente producidos inmunizando ratas o conejos, siguiendo protocolos convencionales. Como anticuerpo de captura se utilizó IgG de conejo purificado a 2 µg/ml, disueltos en NaHCO3, pH 9,6. Como anticuerpo de detección se usó el inmunosuero policlonal de rata diluido en PBS (1: 1000). Como anticuerpo secundario se usó anticuerpo contra IgG de rata hecho en cabra (Sigma) conjugado con HRP, diluido en PBS (1: 20000). Se determinó la absorbancia en el lector de placa (Synergy™ HT, BioTek) a 405 nm y 570 nm y se restaron los valores obtenidos a dichas longitudes de onda (Abs 450-Abs 570). Materiales y Métodos 102 3.2.3.3 Cuantificación Telopéptido C-terminal de colágeno tipo I (ICTP) por ELISA Se obtuvo suero de ratones wt y de ratones GzmA-/- y se congeló a -80 ºC para el posterior análisis de ICTP, con un kit de ELISA de BlueGene, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la detección y cuantificación de ICTP este kit se basa en la técnica de inmunoensayo enzimático competitivo, utilizando un anticuerpo monoclonal antiICTP y un conjugado de ICTP-HRP. Las muestras de ensayo se incubaron con el conjugado ICTP-HRP en una placa recubierta con el anticuerpo monoclonal anti-ICTP durante 1 h. Después de este período, la placa, previamente lavada, se incubó con un sustrato para la enzima peroxidasa. El producto de la reacción enzima-sustrato formó un complejo de color azul. Finalmente, se agregó una solución para detener la reacción. La intensidad del color se midió espectrofotométricamente a 450 nm en un lector de placa (Synergy ™ HT, BioTek). En este tipo de ensayo la intensidad del color era inversamente proporcional a la concentración de ICTP, ya que el ICTP de las muestras y el conjugado ICTP-HRP compiten por el sitio de unión del anticuerpo anti-ICTP. Para evaluar los resultados en primer lugar se realizó una curva que relacionaba la intensidad del color (Abs) con la concentración de los estándares. Posteriormente se extrapoló la concentración de ICTP en cada muestra a partir de esta curva estándar. 3.2.3.4 Cuantificación de anticuerpos IgG anti colágeno tipo II por ELISA Para cuantificar anticuerpos totales IgG frente a colágeno tipo II en el suero de ratones con CIA, se utilizó un kit de ELISA de Chondrex, siguiendo las instrucciones del fabricante. En este kit de ELISA las placas estaban recubiertas con colágeno de pollo tipo II. Los estándares y las muestras se analizaron por duplicado. Se usaron las diluciones recomendadas por el fabricante y se incubaron a 4 ºC toda la noche. Como anticuerpo secundario se usó una IgG anti-ratón hecha en cabra, conjugada con HRP (1:200), proporcionada en el Kit. Se agregaron 100 µl de solución de anticuerpo secundario a cada pocillo y se Materiales y Métodos 103 incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Como agente cromógeno se utilizó el diclorhidrato de orto-fenilendiamina (OPD) durante 30 min y tras detener la reacción (H2SO4 1M) se leyó la placa a 490 y 630 nm. Para la determinación de anticuerpos IgG1 e IgG2c anti colágeno tipo II en el suero se realizó un ELISA. Brevemente, se diluyó el colágeno bovino tipo II en Tris/HCl 0,05 M a una concentración final de 5 µg/ml, se inmovilizó en placas Nunc MaxiSorp para ELISA y se incubó a 4 ºC durante toda la noche. Después, se bloquearon las uniones inespecíficas con PBS y 2 % de BSA, durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se incubó con diluciones seriadas de suero de ratones wt y de ratones GzmA-/- con artritis inducida por colágeno. Como anticuerpos de detección se usaron anticuerpos contra IgG1 o IgG2c (Southern Biotech) de ratón, hechos en cabra, conjugados con HRP, diluidos en PBS con 1 % BSA (1:500). Se añadieron 50 µl de TMB como agente cromógeno y luego se detuvo la reacción con 25 µl de H2SO4 1M tan pronto como los controles sanos se volvieron azules. Se realizó la lectura de la placas en el lector de placa (Synergy™ HT, BioTek) a 450 y 570 nm. 3.2.4 Análisis de proteínas por Western-Blot 3.2.4.1 Extracción de proteínas totales a partir de lisados celulares Para realizar los lisados celulares, se retiró cuidadosamente el medio de cultivo de las células adherentes. Las células se lavaron dos veces con PBS frío. Posteriormente se añadió tampón RIPA (25mM Tris-HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% SDS) (Thermo Fisher) frío a las células. Se utilizó 1 ml de tampón RIPA por cada 5 × 106 células. Previamente, justo antes de ser utilizado, se adicionó al tampón RIPA cóctel de inhibidor de proteasa Complete™ (Roche) e inhibidor de fosfatasas (Sigma). Se incubó en hielo durante 5-10 min, girando la placa de vez en cuando para lograr una distribución uniforme. Se recogió el lisado con ayuda de un raspador de células y se transfirió a un tubo de microcentrífuga. Las muestras se centrifugaron a 14.000 xg durante 15 min a 4 ºC, para sedimentar los residuos celulares. Se recogió el sobrenadante en un nuevo tubo para su posterior análisis. La concentración de proteínas totales se Materiales y Métodos 104 determinó usando Quick StartTM Bradford Protein Assay (Bio-Rad) (ver sección 3.2.2) Una vez determinada la concentración de proteínas totales en el lisado celular se añadió tampón de carga 3X (Tris-HCl 150 mM pH 7,4, Sigma; 3 %, SDS, Merck; molibdato de sodio 0,3 mM, Sigma; pirofosfato de sodio 30 mM, Sigma; fluoruro de sodio 30 mM, Sigma; glicerol 30 % v/v, Scharlau; 2-βmercaptoetanol 30 % v/v, Sigma y azul de bromofenol 0,06 % p/v). Finalmente, los lisados se incubaron durante 5-10 min a 95 ºC en un baño seco (Selecta), se centrifugaron, y se cargaron en un gel o bien se almacenaron a -20 ºC hasta su posterior uso. 3.2.4.2 Separación de proteínas celulares. Electroforesis en gel de poliacrilamida La separación de proteínas en función de su peso molecular se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida que contenía un 0,1 % de SDS. El porcentaje de poliacrilamida varió entre el 10 y el 12 %, dependiendo del tamaño de las proteínas a analizar. La electroforesis se realizó a un amperaje constante de 20 mA/gel y un voltaje de 180 V durante 60-90 min. 3.2.4.3 Transferencia de proteínas a membranas Finalizada la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (del inglés, “Polyvinylidene fluoride”), pre-incubadas 30 s con metanol. El proceso se llevó a cabo en un equipo de transferencia semiseca de BioRad. La transferencia se realizó a 20 V y 400 mA durante 55 min. 3.2.4.4 Análisis de proteínas por inmunoblot (Western blotting) Las proteínas celulares fijadas en las membranas de PVDF se analizaron con anticuerpos específicos. Previamente, y una vez terminada la transferencia, la membrana se bloqueó en una solución de PBS y 5 % de leche en polvo desnatada, a pH 7,4, durante 60 min. Seguidamente, la membrana se incubó durante toda la noche, a 4 ºC con agitación suave, con el anticuerpo específico para detectar la proteína deseada. Los anticuerpos se diluyeron en PBS pH 7,4 Materiales y Métodos 105 con 0,1 % de Tween-20 y leche en polvo desnatada al 2,5 % (p/v) (solución A). Finalizada la incubación, se desechó la solución con el anticuerpo y la membrana se lavó con PBS pH 7,4 que contenía 0,1 % de Tween-20 (solución B), 4 veces durante 5 min, agitando moderadamente. Seguidamente, las membranas se incubaron en la solución A con el anticuerpo secundario correspondiente (Tabla 3.6). Esta incubación se realizó durante 1 h a temperatura ambiente y con agitación suave. Transcurrido el tiempo de incubación la solución del anticuerpo secundario se eliminó y se lavó 3 veces la membrana durante 10 min, agitando moderadamente, con la solución B. La detección de los inmunocomplejos se realizó mediante captación de la señal infrarroja. Las membranas se escanearon en el ODYSSEY CLx (LI-COR). El análisis cuantitativo de las bandas se realizó por densitometría con la ayuda del software ImageJ. De este modo, se analizó, en función de la intensidad de cada banda por unidad de superficie, el nivel de expresión de la proteína de interés y de una proteína de referencia, concretamente β-actina o GAPDH. Los anticuerpos primarios y secundarios usados en este estudio, las concentraciones a las que fueron utilizados, así como la casa comercial de la que procedían, se indican en la tabla 3.6. Anticuerpo Concentración Casa comercial Anti-p-STAT3 (Tyr705) 1/1000 Cell Signaling Anti-p-NF-κB p65 (Ser536) 1/1000 Cell Signaling Anti-IκBα (44D4) 1/1000 Cell Signaling Anti-β-Actina 1/5000 Sigma Anti-GAPDH 1/5000 Sigma IRDye® 800CW Anticuerpo anti-ratón hecho en cabra 1/20000 LI-COR IRDye® 680RD Anticuerpo anti-ratón hecho en cabra 1/20000 LI-COR Tabla 3.6 Anticuerpos primarios y secundarios usados para western blot. GAPDH (del inglés, “Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase”). Materiales y Métodos 106 3.2.5 Análisis de proteínas de la superficie celular por citometría de flujo El análisis de la presencia de determinadas proteínas de membrana mediante citometría de flujo se realizó con anticuerpos conjugados con fluorocromos (Tabla 3.7). Para ello, las IELs aisladas se incubaron en 100 µl de PBS suplementado con 5 % de SFB durante 15 min a 4 ºC, con la cantidad de anticuerpo indicada por la casa comercial. Trascurrido este tiempo, se lavaron 3 veces con PBS suplementado con 5 % de SFB y se analizaron por citometría de flujo. En los casos en los que no se hizo el análisis inmediatamente, las células fueron fijadas con paraformaldehido al 2 % (PFA 2 %) a 4 ºC hasta 24 h después. 3.2.5.1 Análisis intracelular de GzmA por citometría de flujo Las Gzms son proteínas intracelulares contenidas en los gránulos citotóxicos. Para analizar su expresión en IELs, las células se fijaron durante 15 min a 4 ºC con 200 µl de PFA 1 % en PBS. A continuación se lavaron 2 veces con PBS suplementado con 5 % de SFB y se resuspendieron en 100 µl de una solución de permeabilización (saponina 0.1 % en PBS suplementado con 5 % de SFB) que contiene el anticuerpo que reconoce a la GzmA (anti-GzmA PE; dilución 1/1000). Como control se usó el isotipo IgG1 de ratón hecho en cabra conjugado con PE (dilución 1/1000). Se incubaron las células con el anticuerpo y el isotipo durante 1 h a temperatura ambiente. Para finalizar, las células se lavaron 2 veces con el tampón de permeabilización y se resuspendieron en PFA 2 % para su análisis por citometría de flujo. En la tabla 3.7 se muestran los anticuerpos utilizados en el análisis de proteínas por citometría de flujo, así como la concentración a las que fueron usados y la casa comercial de la que procedían. Materiales y Métodos 107 Anticuerpo Concentración Casa comercial CD3 FITC 1/50 Miltenyi Biotec CD8α APC 1/250 Miltenyi Biotec CD4 APC 1/50 Miltenyi Biotec Granzima A PE 1/1000 Miltenyi Biotec IgG1 PE 1/1000 Miltenyi Biotec NK1.1 APC-Vio770 1/50 Miltenyi Biotec CD45 VioBlue 1/250 Miltenyi Biotec CD11b FITC 1/50 Miltenyi Biotec F4/80 APC 1/50 Miltenyi Biotec Ly6G VioBlue 1/250 Miltenyi Biotec Tabla 3.7 Anticuerpos usados para citometría de flujo.ie de tabla 3.3 Sobreexpresión y purificación de proteínas 3.3.1 Preparación de medios y cultivos de Escherichia coli y Pichia pastoris El manejo de cultivos de E. coli y P. pastoris se realizó dentro del área estéril creada por la llama de un mechero de alcohol, usando siempre medios de cultivo autoclavados. Para preparar medio Luria Bertani (LB), se pesaron 10 g de triptona (Panreac), 5 g de extracto de levadura (Panreac) y 5 g de NaCl (Merk). Se disolvieron en 950 ml de agua destilada, se ajustó el pH de la solución a 7,5 y se completó el volumen hasta 1L. Se esterilizó la solución en autoclave (Autestar Mod 4376, Selecta). Para preparar placas de LB-agar, se pesaron 20 g de Agar (Sigma) y se disolvieron en 1 L de LB. Para preparar medio YPD (del inglés, “Yeast Extract Peptone Dextrose Medium”) se disolvieron en 900 ml de agua: 20 g de peptona (Panreac) y 10 g de Materiales y Métodos 108 extracto de levadura (Panreac). Se esterilizó la solución en autoclave y cuando se enfrió la solución a ~ 60 ºC se agregaron 100 ml de una solución de Dglucosa (Merk) 10 X, previamente preparada y esterilizada por filtración (20 g en 100 ml de agua). Para preparar medio YPM (del inglés, “Yeast Extract Peptone Methanol Medium”) se disolvieron en 900 ml de agua: 20 g de peptona (Panreac) y 10 g de extracto de levadura (Panreac). Se esterilizó la solución en autoclave y cuando se enfrió la solución a ~ 60 ºC se agregaron 100 ml de una solución de metanol (Panreac) 10 X, previamente preparada y esterilizada por filtración (5 ml en 100 ml de agua). Para preparar medio con biotina y dextrosa para la regeneración celular (RBD) primero se disolvieron 186 g de D-sorbitol (Sigma) y 20 g de agar bacteriológico en 790 ml de agua y se esterilizó la solución en autoclave. Aparte, se disolvió 134 g de base de nitrógeno de levadura (YNB, Sigma), con sulfato de amonio, y sin aminoácidos, en 1 L de agua. Se calentó ligeramente para disolver y se esterilizó por filtración. Por otro lado, se fundió el sorbitol-agar y se dejó enfriar a 60 ºC. Después, se agregaron las siguientes soluciones precalentadas a 45-50 ºC: 100 ml D-glucosa al 20 % (p/v), 100 ml de YNB y 2 ml de biotina (Sigma) a una concentración de 0,2 g/L (previamente esterilizada por filtración). Por último, se añadieron 10 ml de la solución acuosa (previamente esterilizada por filtración) de los siguientes aminoácidos: ácido L-glutámico, L-metionina, Llisina, L-leucina y L-isoleucina (500 mg/L, Sigma). 3.3.2 Expresión y purificación de GzmA en Escherichia coli 3.3.2.1 Inducción con IPTG Para la expresión de GzmA se utilizó la cepa de E. coli BL21 transformada con el plásmido pET21a+ que contenía un inserto de la pro-GzmA de ratón. El primer día se realizó un primer pre-cultivo inoculando 20 μl del stock de esta bacteria (congelada en 30 % de glicerol) en 10 ml de LB con 100 μl/ml de ampicilina (Sigma) y se incubaron a 37 °C durante 12 h con agitación constante. Transcurrido este tiempo, se añadieron los 10 ml del primer cultivo a 40 ml de Materiales y Métodos 109 medio LB suplementado con 100 μg/ml de ampicilina. Se incubó a 37 °C toda la noche con agitación constante. Al día siguiente se añadieron los 50 ml del precultivo a un matraz Erlenmeyer de 2 L, que contenía 450 ml de medio LB y se incubó a 37 °C con agitación constante, hasta que el cultivo alcanzó una densidad óptica a 600 nm (DO600nm) entre 0.6 y 0.8. Una vez alcanzada la densidad óptica deseada, se separó 1 ml de cultivo, que fue utilizado como referencia inicial de la sobreexpresión de la proteína. Seguidamente se añadió IPTG (MP Biomedicals) a una concentración final de 1 mM y se incubó a 37 °C con agitación constante durante 3 h. Transcurrido ese tiempo, en primer lugar se reservó 1 ml del medio de cultivo para posteriormente constatar la sobreexpresión de la proteína en un gel de poliacrilamida. Después, se centrifugó el cultivo a 8.000 xg durante 15 min y se eliminó el sobrenadante. Se lavó el pellet con 10-15 ml de PBS y se centrifugó nuevamente a 8.000 xg durante otros 15 min. Se eliminó el sobrenadante y se pasó el pellet a un tubo para centrífuga cónico de 50 ml. Por último, se congeló a -20 °C para su posterior uso. 3.3.2.2 Obtención de cuerpos de inclusión Para la purificación de GzmA, se descongeló el pellet bacteriano obtenido en el paso anterior, y se resuspendió en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, DTT 2 mM, lisozima 2 mg/ml (Sigma-Aldrich), DNAasa 1 mg/ml (SigmaAldrich), inhibidor de proteasa 1 X y Triton X al 0,5 % (Sigma). Por cada gramo de pellet celular descongelado se utilizó 1 ml de tampón de lisis. La mezcla se colocó en un agitador vertical a 4 °C durante 2 h. Después se lisaron las células mediante disrupción mecánica por sonicación. Para ello, se pasó la suspensión a un vaso de precipitado en hielo y se sonicó a ¾ de amplitud y ¾ pulso durante 45 s, se dejó reposar durante 2 min y se repitió el proceso diez veces. Una vez lisadas las células se centrifugó a 50.000 xg durante 15 min a 4 ºC. 3.3.2.3 Solubilización y replegamiento de las proteínas contenidas en los cuerpos de inclusión Los cuerpos de inclusión obtenidos previamente se resuspendieron en tampón de desnaturalización (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, cloruro de Materiales y Métodos 116 Todas las manipulaciones se realizaron en campanas de flujo laminar vertical (Telstar) en condiciones estériles. Los materiales y soluciones no estériles fueron esterilizados en un autoclave durante 21 min a 1 atmosfera de presión y a una temperatura de 121 ºC o filtrados a través de membranas estériles de 0,22 µm (Millipore). Las células se observaron en un microscopio invertido Leica y su recuento se realizó en una cámara de Neubauer. 3.6.1 Líneas celulares En este estudio se trabajó con la línea celular MC-38, línea derivada de un adenocarcinoma de colon que se indujo químicamente mediante la inyección subcutánea de dimetilhidracina (DMH) en ratones hembra C57BL/6 (595). Esta fue cedida amablemente a nuestro laboratorio por el Dr. Pedro Berraondo López (Centro de Investigación médica aplicada (CIMA), Universidad de Navarra). También se trabajó con una sublínea de células RAW 264.7, una línea celular modelo que actúa como un precursor para la formación de OCs, y que responde a estímulos osteoclastogénicos, incluidos RANKL y TNF-α (596). 3.6.2 Mantenimiento de los cultivos celulares La línea celular CM-38 se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Lonza) suplementado con 10 % (v/v) de suero fetal bovino (SFB) y los antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) (Sigma). De forma rutinaria el cultivo se realizó en frascos de cultivo de 25 o 75 cm2, con tapón con filtro (Thermo Scientific), en un volumen de 5 y 15 ml respectivamente. Para el mantenimiento las células se sembraron habitualmente a una densidad inicial de 5x104 cel/ml. Para hacer los experimentos la densidad celular inicial dependió del tipo de experimento y los objetivos que se perseguían. La línea celular RAW 264.7 se cultivó en DMEM suplementado con Lglutamina 4 mM (Sigma), bicarbonato de sodio 1,5 mg/ml (PanReac), glucosa Materiales y Métodos 117 4,5 mg/ml (PanReac), piruvato de sodio 1,0 mM (Sigma), 10 % (v/v) de FBS y 2 mM de los antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml). Las células se cultivaron en un incubador con regulación de flujo de CO2 a 37 ºC, en aire saturado de humedad y con un 5 % de CO2. Una vez alcanzada la densidad de saturación en estas condiciones, se establecieron subcultivos derivados de los iniciales. Para ello, las células MC-38 se despegaron mediante incubación con tripsina/EDTA (Sigma), a 37 ºC durante 5 min. Transcurrido ese tiempo se añadieron 5 ml de medio con suero para inactivar la tripsina, se transfirieron las células a tubos de fondo cónico y se centrifugaron durante 5 min a 300 xg (20 ºC). Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en medio fresco. A continuación se determinó el número de células y su viabilidad (tinción por exclusión con azul Trypan, Sigma) con ayuda de una cámara de Neubauer y un microscopio óptico, y se volvieron a sembrar en el volumen de medio fresco necesario para lograr las densidades celulares iniciales requeridas según los diferentes experimentos. En el caso de la línea RAW 264.7, se eliminó el medio gastado, se agregó medio fresco y se despegaron las células usando un raspador de células (Thermo Scientific). Inmediatamente se agregó 0.01 ml de la suspensión celular a 0.09 ml de medio fresco en un tubo de microcentrífuga. Se contaron las células usando un hemocitómetro, se calculó la concentración celular y se sembraron a las densidades celulares requeridas para realizar los experimentos posteriores. 3.6.3 Congelación y descongelación de células Las líneas celulares se almacenaron congeladas en nitrógeno líquido, según el siguiente procedimiento: las células se cultivaron hasta alcanzar su densidad de saturación, se contaron, se centrifugaron a 300 xg durante 5 min y, tras eliminar el sobrenadante, se resuspendieron en su medio de cultivo habitual con un 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma) a una densidad celular de 5-10 x 106 cel/ml. Rápidamente se hicieron alícuotas en criotubos estériles y se Materiales y Métodos 118 congelaron a -80 ºC durante 24-72 h. Finalmente, se trasladaron a un contenedor de nitrógeno líquido, hasta el momento de su utilización. La descongelación se realizó mediante la adición gradual de medio de cultivo atemperado a las células. A continuación, la suspensión se centrifugó durante 5 min a 300 xg y luego se resuspendieron las células en 5 ml de medio suplementado con 10 % de SFB. 3.6.4 Contaje y determinación de la viabilidad celular Para determinar la viabilidad celular se utilizó la tinción por exclusión con azul Trypan (Sigma). Las células muertas, que han perdido la integridad de su membrana, son permeables a este colorante y adquieren una tonalidad azulada, mientras que en las células vivas y/o apoptóticas, que todavía mantienen su membrana plasmática intacta, no ocurre esto. Para el recuento celular se tomó una alícuota de 50 µl de la suspensión celular, y se mezcló con el mismo volumen de una solución estéril al 0,4 % de azul Tripán en NaCl 0,15 M. Esta mezcla se depositó sobre la cámara Neubauer y se procedió a su recuento en un microscopio. La viabilidad celular se evaluó considerando el porcentaje de células no coloreadas (viables) respecto al número total de células. Todos los experimentos con las líneas celulares utilizadas se realizaron partiendo de una viabilidad celular de al menos un 85 %. 3.6.5 Inactivación del complemento en el suero fetal bovino El suero añadido al medio de cultivo siempre se decomplementó para evitar así la lisis de las células por el sistema del complemento. Para ello, el suero se incubó durante 30 min a 56 ºC en baño térmico y transcurrido este tiempo se centrifugó 15 min a 2.000 xg. El sobrenadante se recogió en un tubo de fondo cónico y se congeló hasta su posterior uso. 3.6.6 Generación de OCs a partir de diferentes precursores Las células de la médula ósea se aislaron de los huesos largos de las extremidades posteriores de ratones de entre 3-4 semanas de edad. Se Materiales y Métodos 119 incubaron las células extraídas de la médula durante 2 h a 37 ºC, para eliminar las células adherentes. Posteriormente, se cultivaron 5x105 cel/pocillo de células mononucleares no adherentes en medio α-MEM suplementado con antibióticos y 10 % de SFB, inactivado por calor. Seguidamente, las células se trataron con las concentraciones requeridas de GzmA activa, controles positivos o solo medio (control negativo). El 50 % del medio fue reemplazado en días alternos, hasta el día 6. Para generar unidades formadoras de colonias de granulocitos/monocitos (CFU-GM), se cultivaron 5x104 células no adherentes de médula ósea de ratón, aisladas de ratones wt o TNF-α-/- de 3-4 semanas (Charles Rivers, Maine). Se cultivaron en presencia de metilcelulosa (Sigma) y GM-CSF recombinante (2 ng/ml) (Peprotech), en placas de 35 mm durante 4 días. Después, las células fueron disociadas y se sembraron 104 cel/pocillo (en placas de 96 pocillos) para el ensayo de formación de OCs (589). Para evitar la contaminación con células accesorias, durante la diferenciación de OCs a partir de precursores de la médula ósea, en algunos experimentos se utilizaron células RAW 264.7 como fuente de precursores de OCs. En este caso, una vez que las células alcanzaron la confluencia, se cultivaron a la densidad requerida en placas de 96 pocillos y se les añadieron los estímulos necesarios durante 5-6 días. Para la medición de la formación de OCs, en los diferentes tipos celulares precursores de OCs, se utilizó el ensayo de la actividad de la fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP, del inglés “Tartrate Resistant Acid Phosphatase”). Para ello, las células se fijaron con formalina al 3 % durante 10 min y se incubaron con el kit para la tinción de células TRAP+ (Sigma Chemical Inc. St Louis, MO) durante 1 h. Posteriormente, las células se contra tiñeron con una solución de hematoxilina. Se contaron y midieron el número de OCs multinucleados desarrollados por pocillo, considerando como osteoclastos a las células positivas para TRAP, que tenían más de tres núcleos por célula (589). Como control positivo, las células fueron estimuladas con 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-D3) (Calbiochem), RANKL (50 ng/ml) (Biotech) y/o M-CSF (25 ng/ml) (Peprotech). Materiales y Métodos 120 3.6.7 Generación de macrófagos M1 derivados de la médula ósea (BMDM) Para la obtención de BMDM, se utilizaron ratones de fondo genético C57BL/6 a los que, tras ser sometidos a eutanasia en cámara de CO2, se les extrajeron las extremidades posteriores. Tras eliminar cuidadosamente la piel y el músculo, se lavaron con etanol al 70 % y DMEM, se cortaron asépticamente los extremos de los huesos, para dejar al descubierto la médula ósea y se eluyeron las células inyectando 5 ml de medio DMEM a través de la cavidad ósea. A continuación, esta suspensión se homogenizó y se filtró mediante un filtro ésteril de nylon de 100 µm. Seguidamente se lisaron los eritrocitos y la suspensión se centrifugó a 300 xg durante 5 min. Las células obtenidas se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con Glutamax, 10 % de SFB, 2 mM de penicilina (100 U/ml) y 2 mM de estreptomicina (100 µg/ml) y con 10 % de sobrenadante de la línea X63Ag8653 como fuente de GM-CSF (597). Posteriormente, se ajustó la concentración a 1x106 cel/ml y se sembraron 10 ml en placas de cultivo estériles de 90 mm. Al tercer día, se eliminó el sobrenadante, las placas se lavaron 2 veces con PBS y se les adicionó 10 ml de medio GM-CSF fresco. Este procedimiento se repitió al sexto día. El noveno día, se eliminó nuevamente el sobrenadante, se lavó dos veces con PBS y se adicionaron 3 ml de tripsina por placa. Tras una incubación de 15 min a 37 ºC con 5 % de CO2, se añadieron 5 ml de medio RPMI suplementado con 5 % de SFB, se recogieron las células en tubos estériles de fondo cónico y se centrifugaron durante 5 min a 300 xg. Una vez eliminado el sobrenadante, las células se resuspendieron nuevamente en 10 ml de RPMI suplementado con 5 % de SFB, se contaron, se sembraron 5x104 cel/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano o 2x105 cel/pocillo en placas de 48 pocillos (Costar) y se incubaron a 37 ºC con 5 % de CO2 para ser utilizadas en los experimentos del día siguiente. Al cabo de 10 días, los macrófagos estaban completamente diferenciados, mostrando un fenotipo CD11b+ F4/80+, analizado mediante citometría de flujo. Materiales y Métodos 121 3.6.8 Análisis de la expresión de IL-6 inducida por GzmA extracelular en macrófagos M1 Los macrófagos proinflamatorios M1 se generaron a partir de la médula ósea utilizando el protocolo explicado en el apartado anterior. Al cabo de 7 días, se estimularon con GzmA activa (300 nM) o GzmA inactivada con el inhibidor específico serpinb6b (2,4 µM) y LPS de E. coli (100 ng/ml) (Sigma), como control positivo. Para analizar el papel de la vía NF-kB en la expresión de IL-6 inducida por GzmA, los macrófagos se trataron con el inhibidor específico de NF-kB, Celastrol (Sigma), durante 1 h antes de la adición de GzmA. Los macrófagos se incubaron durante 24 h a 37 ºC y 5 % de CO2, transcurrido ese tiempo se recogieron los sobrenadantes y se cuantificaron los niveles de IL-6 mediante ELISA (ver sección 3.2.3.1). 3.6.9 Activación in vitro de las vías p-STAT3 y NFκB en MC-38 Para llevar a cabo este experimento, las células de la línea MC-38 se sembraron (1x106 cel/pocillos) en DMEM suplementado con 10 % (v/v) SFB, Lglutamina 2 mM y los antibióticos penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml). Cuando las células se adhirieron, se eliminó el medio y se añadió DMEM sin SFB y se cultivaron durante 16 h a 37 ºC al 5 % de CO2. Posteriormente, se retiró el medio a las células y se añadieron los sobrenadantes de macrófagos sin estimular y previamente estimulados con GzmA recombinate de ratón (300 nM) o 100 ng/ml de LPS. Como control positivo se añadieron 50 ng/ml de IL-6 de ratón (Miltenyi). Las células se lisaron 15 min después de la adición de los estímulos (ver sección 3.2.4.1). La concentración de proteínas totales se determinó usando Quick StartTM Bradford Protein Assay (ver sección 3.2.2). Posteriormente se realizó un western-blot utilizando los anticuerpos correspondientes para visualizar y cuantificar la expresión de p-STAT3, NFκB e IkBα. La cuantificación se realizó por densitometría, con la ayuda del software ImageJ (ver sección 3.2.4.4). Materiales y Métodos 122 3.7 Determinación de la correlación entre GZMA e inflamación en muestras de CCR humano Se utilizaron datos de expresión génica de un conjunto de 98 tejidos tumorales de pacientes con CCR (proyecto Colonomics: www.colonomics.org, NCBI BioProject PRJNA188519). Brevemente, el RNA extraído de cada muestra se hibridó en chips Affymetrix Genoma Humano U219 y se analizó bajo el protocolo estándar (598). Tanto los datos sin procesar como los normalizados están disponibles en la base de datos Omnibus de expresión génica (GEO) a través del número de acceso GSE44076. Todos los pacientes estaban en estadio II, MSS, tratados con cirugía radical y no recibieron quimioterapia adyuvante. Fueron reclutados en el Hospital Universitario de Bellvitge (España) entre el año 1998 y 2002, dieron su consentimiento informado por escrito y el Comité de Ética del hospital aprobó el protocolo con la referencia PR074 / 11. Los datos transcriptómicos se usaron para explorar genes cuya expresión estaba asociada con la expresión de GZMA y GZMB. La correlación de Spearman se calculó para generar una lista de genes clasificados y ordenados por su nivel de co-expresión con ambos genes. Posteriormente, se utilizó el algoritmo GSEA (del inglés, “Gene Set Enrichment analysis) (599) en estas listas clasificadas para identificar el enriquecimiento en vías celulares y funciones específicas. La correlación de Spearman se calculó para evaluar si existe una relación entre la puntuación inflamatoria y la expresión GZMA/GZMB. El mismo análisis se realizó estratificando las muestras según la clasificación CMSs de las mismas. Los modelos de regresión lineal también se ajustaron para calcular los valores de R2 y p en cada caso. Para validar estos resultados, se descargó un conjunto de datos de expresión génica del repositorio de GEO (GSE39582), la cual comprendía 566 muestras humanas de CCR con características clínico-patológicas distintas. Esta base de datos incluye pacientes en estadio 0 a IV, tanto con MSI como MSS, y que recibieron diferentes tratamientos (331). Finalmente, los tumores se Materiales y Métodos 123 clasificaron en los cuatro subtipos moleculares de consenso, CMS1 a CMS4, usando el paquete clasificador R de CMSs (333). 3.8 Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism. La diferencia entre las medias de las muestras no pareadas se realizó utilizando el ANOVA de dos vías o el ANOVA de una vía con la prueba posterior de Bonferroni o la prueba t-student no pareada. Las curvas de supervivencia se compararon utilizando la prueba de log rank y la prueba de Gehan-Wilcoxon. La incidencia de tumores se analizó utilizando una prueba exacta de Fisher. Los resultados se dan como el intervalo de confianza (p), y se consideran significativos cuando p <0.05. Las réplicas biológicas se consideran como el número de ratones individuales. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bibliografía 220 252. Benedetti G, Miossec P. Interleukin 17 contributes to the chronicity of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. European journal of immunology. 2014;44(2):339-47. 253. Gaffen SL. The role of interleukin-17 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Current rheumatology reports. 2009;11(5):365-70. 254. Suurmond J, Dorjee AL, Boon MR, Knol EF, Huizinga TW, Toes RE, et al. Mast cells are the main interleukin 17-positive cells in anticitrullinated protein antibody-positive and -negative rheumatoid arthritis and osteoarthritis synovium. Arthritis research & therapy. 2011;13(5):R150. 255. Cooles FA, Isaacs JD, Anderson AE. Treg cells in rheumatoid arthritis: an update. Current rheumatology reports. 2013;15(9):352. 256. 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