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DETECCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA EN MUESTRAS MEDIOAMBIENTALES Y BIOLÓGICAS TRABAJO FIN DE MÁSTER Departamento de Química Analítica, Universidad de Zaragoza Grupo de Espectroscopía Analítica y Sensores ISABEL ABAD ÁLVARO Junio 2013 Índice i ÍNDICE RESUMEN 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................1 1.1. INTERÉS, APLICACIÓN Y CONSECUENCIAS DEL USO DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA ...1 1.2. TÉCNICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE NANOPARTÍCULAS ..................................................................................................................2 1.2.1. Identificación y caracterización ..........................................................................2 1.2.2. Técnicas de separación .......................................................................................4 1.2.3. Técnicas de cuantificación ..................................................................................5 1.3. FRACCIONAMIENTO EN FLUJO A TRAVÉS DE CAMPO DE FLUJO ASIMÉTRICO ACOPLADO A UN ESPECTRÓMETRO DE MASAS DE PLASMA DE ACOPLAMIENTO INDUCTIVO (AsFlFFFICP-MS) ...................................................................................................................................6 1.4. PUESTA EN DISOLUCIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS .......................................................9 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 10 3. EXPERIMENTAL ............................................................................................................... 11 3.1. INSTRUMENTACIÓN Y REACTIVOS ................................................................................ 11 3.1.1. Instrumentación .............................................................................................. 11 3.1.2. Aparatos ........................................................................................................... 11 3.1.3. Material ............................................................................................................ 11 3.1.4. Reactivos y estándares .................................................................................... 11 3.2. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS ................................................................................. 12 3.3. PUESTA EN DISOLUCIÓN DE LAS MUESTRAS ................................................................ 14 3.3.1. Digestión ácida ................................................................................................. 14 3.3.2. Solubilización con TMAH ................................................................................. 14 3.4. FRACCIONAMIENTO EN FLUJO MEDIANTE CAMPO DE FLUJO ASIMÉTRICO (AsFlFFF) . 15 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................. 16 Índice ii 4.1. DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA EN CÉLULAS PROCEDENTES DE ENSAYOS DE NANOCITOTOXICIDAD MEDIANTE SOLUBILIZACIÓN CON TMAH Y POSTERIOR ANÁLISIS MEDIANTE AsFlFFF-ICP-MS ................................................. 16 4.1.1. Estudio de las condiciones experimentales para la solubilización con TMAH del material biológico presente en los ensayos de nanocitotoxicidad ........................... 16 4.1.2. Estudio de la estabilidad de las nanopartículas de Ag en las condiciones del ensayo de solubilización con TMAH .......................................................................... 18 4.1.3. Detección de nanopartículas de plata en células mediante AsFlFFF-ICP-MS tras solubilización con TMAH. Condiciones iniciales ........................................................ 24 4.1.4. Optimización de las condiciones de separación de nanopartículas de plata en AsFlFFF. Programa de flujo cruzado .......................................................................... 26 4.1.4.1 Ensayos de optimización sobre células expuestas a nanopartículas de plata ............................................................................................................... 27 4.1.4.2 Ensayos de optimización sobre células de control tras adición de nanopartículas de plata ................................................................................. 30 4.1.5. Calibración del canal frente a estándares de tamaño ..................................... 32 4.1.6. Identificación y caracterización de nanopartículas de plata en los medios solubilizados mediante AsFlFFF-ICP-MS. Análisis mediante TEM de las fracciones recogidas en el AsFlFFF .............................................................................................. 33 4.1.7. Recuperación del canal .................................................................................... 37 4.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PLATA TOTAL EN LAS CÉLULAS MEDIANTE SOLUBILIZACIÓN CON TMAH. VALIDACIÓN DEL PROCEDIMIENTO .................. 38 5. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 40 6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 41 7. ANEXOS ................................................................................................................................ RESUMEN: En este trabajo se ha desarrollado una metodología analítica que ha permitido la identificación y caracterización de nanopartículas de plata en células expuestas a este agente en ensayos de citotoxicidad a través de fraccionamiento en flujo mediante campo de flujo asimétrico (AsFlFFF) acoplado a un espectrómetro de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS). Se ha trabajado con muestras biológicas de cultivos celulares tratados con nanopartículas de plata a concentraciones en las que se observaron efectos sobre la viabilidad celular. La puesta en disolución de las nanopartículas de plata en este tipo de muestras se ha llevado a cabo mediante la digestión/solubilización con hidróxido de tetrametilamonio (TMAH) como alternativa a la puesta en disolución por ataque ácido. El trabajo experimental se ha centrado en el estudio de la estabilidad de las nanopartículas en este medio frente al tiempo y en la optimización de las condiciones de separación de las nanopartículas en AsFlFFF. La caracterización de las nanopartículas solubilizadas se ha realizado mediante calibración externa del sistema AsFlFFF con estándares de tamaño de nanopartículas de plata y comparando los resultados con imágenes tomadas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Los resultados obtenidos permiten confirmar la presencia de nanopartículas en las células del mismo tamaño que las inicialmente puestas en el medio. Por último se ha cuantificado de forma satisfactoria la cantidad de plata total en las células mediante el procedimiento de solubilización encontrado, validándolo frente al ataque ácido convencional. Esta metodología abre el camino a la caracterización de nanopartículas de plata en matrices biológicas complejas, lo que puede aportar información relevante para estudios de toxicidad de estas nanopartículas en entornos biológicos o medioambientales. 1. INTRODUCCIÓN Introducción 1 1.1 INTERÉS, APLICACIÓN Y CONSECUENCIAS DEL USO DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA La nanociencia y la nanotecnología han experimentado una rápida expansión en las dos últimas décadas, dando lugar al desarrollo y producción de una gran variedad de nanomateriales. Estos nanomateriales sintéticos están incorporándose a un cada vez mayor número de productos industriales, de consumo y alimentos [1]. El interés creciente por los materiales a nanoescala está convirtiendo a las nanopartículas de plata (AgNPs) en el nanomaterial más utilizado actualmente, debido a sus propiedades antimicrobianas [2,3]. Las nanopartículas de plata están siendo utilizadas en diversas aplicaciones de tratamiento de agua [4], pinturas, vendajes y diverso material sanitario, envases para el almacenamiento de comida, etc. [5]. La actividad bactericida de las nanopartículas depende del tamaño y de la forma, siendo las partículas con un tamaño menor a 100 nm las que muestran una actividad antibacteriana óptima, aumentando al disminuir el tamaño de partícula [6]. Una consecuencia del desarrollo de la nanotecnología es la liberación de nanopartículas sintéticas en el medio ambiente [7]. Las principales rutas de exposición humana serían el sistema respiratorio, el sistema gastrointestinal y la piel, los cuales son interfases entre los sistemas internos del cuerpo humano y el medio ambiente externo [8]. La plata en su forma iónica tiene efectos tóxicos para muchos patógenos, incluyendo bacterias, virus y hongos [9]. Debido a la toxicidad relativamente baja sobre los seres humanos, la plata se ha utilizado en un gran número de aplicaciones médicas [10]. Aunque también se hayan empezado a estudiar los posibles efectos tóxicos de las nanopartículas de plata, los mecanismos de toxicidad no están todavía establecidos. Los estudios realizados parecen indicar que la toxicidad puede estar relacionada tanto con las propiedades específicas de las nanopartículas, como debida a los efectos de los iones plata liberados desde las mismas [11]. Existen pruebas que demuestran que las nanopartículas de plata pueden dañar directamente las membranas de las células, interaccionando con ellas y penetrando en el interior de la célula. Los tres mecanismos más comunes de toxicidad propuestos son: (1) absorción de iones plata libres seguidos de una interrupción en la producción de ATP y en la replicación del DNA, (2) generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), y (3) daño directo de las nanopartículas de plata a las membranas celulares [12] (Figura 1). Introducción 2 Fig 1 Diagrama resumen de la interacción de nanopartículas de plata con células bacterianas. AgNPs pueden (1) liberar iones plata y generas ROS; (2) interaccionar con proteínas de la membrana afectando a su función correcta; (3) acumularse en la membrana celular afectando a la permeabilidad de la membrana; y (4) entrar en la célula donde pueden generar ROS, liberar iones plata, y afectar al DNA. Las ROS generadas también pueden afectar al DNA, a la membrana de la célula, y a las proteínas de membrana; los iones plata liberados afectarán probablemente al DNA y a las proteínas de membrana [12]. 1.2 TÉCNICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE NANOPARTÍCULAS La caracterización y cuantificación de nanopartículas en matrices complejas como biológicas o medioambientales, supone un difícil reto analítico ya que las medidas son altamente dependientes de: (1) el tamaño de la partícula y su naturaleza, (2) la concentración de la muestra y las características fisicoquímicas de la disolución, y (3) los principios fundamentales de la técnica analítica [13]. 1.2.1. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN Las técnicas más comunes para la caracterización de tamaños incluyen técnicas basadas en láser, así como la espectroscopía de correlación de fotones (PCS), técnicas basadas en la microscopía, y técnicas de separación por tamaños [14]. Microscopía electrónica Las técnicas de microscopía electrónica (EM), basadas en la aplicación de un haz de electrones, tienen una alta resolución, lo que les convierte en una opción muy frecuente en la visualización y caracterización de nanomateriales. Las técnicas más destacadas son la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la microscopía electrónica de barrido (SEM) [15]. Las imágenes TEM no sólo proporcionan el tamaño y la forma de las partículas, sino Introducción 3 también la morfología y el estado de agregación. Sin embargo, se requiere que las muestras TEM estén secas y sean de un espesor de unos cientos de nanómetros, por lo que la principal dificultad está en preparar una muestra correcta. En disoluciones, la evaporación del disolvente puede llevar a una coagulación indeseada de las partículas y cambios en las propiedades de la superficie. Para tejidos biológicos y otras muestras complejas, a menudo se necesita fijación química y un proceso de presión [16]. En SEM, el haz de electrones interacciona con la superficie de la muestra, y se detectan los electrones secundarios. Aunque las muestras SEM no necesitan ser tan delgadas como las de TEM, para evitar la acumulación de carga electrostática en la muestra durante la irradiación, la muestra, o al menos la superficie de ésta, debe ser conductora, por lo que muchas veces hay que recubrir la muestra con una capa de material conductor, con el riesgo de que se pierda parte de la información de la superficie [17]. Además, la resolución suele ser inferior a la que se alcanza por TEM, lo que puede limitar el estudio de algunos nanomateriales en función de su tamaño. Espectroscopía de energía dispersiva de rayos-X (EDS) La espectroscopía de energía dispersiva de rayos-X (EDS) es un método analítico de gran importancia para la determinación elemental. Normalmente, se combina con TEM o SEM para dar una distribución elemental de las nanopartículas. Para muestras complejas, es una herramienta muy útil para identificar la existencia de nanopartículas de un elemento determinado [18]. Absorción UV-Vis Las propiedades ópticas de las nanopartículas difieren de las del metal, por lo que el UV-Vis ofrece la posibilidad de caracterizar NPs. Normalmente, la longitud de onda del máximo de absorción en un espectro de UV-Vis se asocia al tamaño promedio de partícula. Se sabe que las AgNPs tienen un pico de resonancia de plasmón de superficie localizado en la región del UV-Vis. La banda de plasmones de superficie surge de la existencia de electrones libres en la banda de conducción debido al pequeño tamaño de partícula. Esta banda de absorción se sitúa cerca de los 400 nm en el caso de las AgNPs libres. El desplazamiento de la banda depende del tamaño de la partícula y del entorno químico. Una característica única de estas partículas metálicas sintetizadas es que un cambio en la absorbancia o en la longitud de onda, da una medida del tamaño y forma de la partícula. Para AgNPs libres la disminución en la absorbancia se puede utilizar como una medida de disolución. Por su parte, un desplazamiento a longitudes 2. OBJETIVOS Objetivos 10 El proyecto desarrollado en este Trabajo Fin de Máster (TFM) forma parte de una de las líneas de investigación del Grupo de Espectroscopía Analítica y Sensores (GEAS): “Nanotecnología y Nanociencia Medioambiental Analítica”. Este trabajo se encuadra dentro de un proyecto en el que ha colaborado el Grupo Nutrigenomics de la Universidad Rovira i Virgili en Tarragona. Este grupo se ha encargado de realizar los distintos ensayos de citotoxicidad con nanopartículas de plata y de suministrar las distintas muestras con las que se ha trabajado a lo largo de este proyecto. El objetivo principal del presente TFM se centra en el desarrollo de una metodología analítica que permita la identificación y caracterización de nanopartículas de plata expuestas a este agente en ensayos de toxicidad. Para ello, se han de conseguir los siguientes objetivos parciales: 1. Establecer una estrategia alternativa al ataque ácido mediante la digestión/solubilización de las muestras utilizando hidróxido de tetrametilamonio (TMAH). Validar el procedimiento comparando los resultados obtenidos con el ataque ácido para la cuantificación de plata total. 2. Estudiar la estabilidad de las AgNPs en el medio de solubilización y frente al tiempo. 3. Desarrollar un procedimiento basado en el uso de la técnica de separación AsFlFFF acoplada a UV-Vis e ICP-MS para la identificación de las especies de plata puestas en disolución. 4. Caracterizar por tamaños mediante AsFlFFF las nanopartículas solubilizadas, haciendo uso de estándares de tamaño de AgNPs. Comparación de los resultados con Microscopía de transmisión electrónica (TEM). 3. EXPERIMENTAL Experimental 11 3.1 INSTRUMENTACIÓN Y REACTIVOS 3.1.1. INSTRUMENTACIÓN  Equipo de Fraccionamiento en Flujo mediante Campo de Flujo Asimétrico (AsFlFFF). (Postnova Analytics, Landsberg, Germany).  Espectrómetro ICP-MS Perkin Elmer SCIEX Elan DRC-e (Perkin Elmer, Toronto, Canada).  Espectrómetro Molecular UV-Vis Diode Array (Shimadzu, Duisburg, Germany).  Espectrómetro Molecular UV-Vis Diode-Array 8452 A (Hewlett-Packard, California, USA).  Microscopio Electrónico de Trasmisión (TEM) INCA 200 X-Sight Oxford Instruments.  Balanza Analítica GH-200 (AND, California, USA).  Micropipetas 5-50 µL (Biohit, Helsinki, Finlandia).  Micropipetas 100-1000 µL y 1000-4000 µL (Rainin, California, USA). 3.1.2. APARATOS  Agitador orbital analógico Reax 2 (Heidolph, Schwabach, Alemania).  Baño de Ultrasonidos Ultrasons-P (Selecta, Barcelona, España).  Placa agitadora Rotamax 120 (Heidolph, Schwabach, Alemania). 3.1.3. MATERIAL  Tubos tipo Falcon de polipropileno de 50 mL y de 15 mL (cónico).  Tubos Eppendorf de polipropileno de 1,5 mL. Estos tubos se dejaron en un baño de HNO3 al 1 % (v/v) durante al menos 24 horas. Posteriormente se lavaron con agua ultrapura y se dejaron secar en estufa a una temperatura de unos 60 °C, dejándose enfriar antes de su utilización.  Frascos para cultivos celulares.  Filtros de membrana de nylon con tamaño de poro de 0,20 µm.  Filtros para jeringa de poliamida con tamaño de poro de 0,45 µm.  Membranas de poliétersulfona (PES) con tamaño de poro de 1 y 4 kDa para el sistema de AsFlFFF.  Cubetas de cuarzo de volumen reducido para EAM-UV-Vis. 3.1.4. REACTIVOS Y ESTÁNDARES Se utilizó agua ultrapura (Milli-Q Advantage, Molsheim, Francia) para la preparación de disoluciones. Experimental 12 Las disoluciones de plata (I) se prepararon a partir de una disolución de estándar comercial 1 (disolución estándar de Ag 1,000 ± 0,002 g·L-1 AA, Panreac, Barcelona, España). Las disoluciones de nanopartículas de plata (AgNPs) correspondientes se prepararon a partir de estándares comerciales de distintos tamaños y concentraciones:  AgNPs 10 nm, 100 mg·L-1 (PlasmaChem, Berlín, Alemania).  AgNPs 20 nm, 7 mg·L-1 (BBInternational, Cardiff, UK).  AgNPs 40 nm, 20 mg·L-1 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA).  AgNPs 60 nm, 20 mg·L-1 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA). Se emplearon también disoluciones de Colargol (Laboratorios Argenol, España) preparadas a partir del polvo comercial. Además se utilizó: HNO3 69,0-70,0 % (Baker Instra Analyzed for Trace Metals Analysis, J.T. Baker, Holanda); HCl 36,5-38,0% (Baker Instra Analyzed for Trace Metals Analysis, J.T. Baker, Holanda); hidróxido de tetrametilamonio (TMAH) (Alfa Aesar - 25% w/w aq. soln., electronic grade, Karlsruhe, Alemania); L-cisteína (Aldrich, St. Louis, USA); Triton™ X-100 (Aldrich, St. Louis, USA); dodecil sulfato sódico (SDS) (electrophoresis purity reagent, BioRad, California, USA). Todas las disoluciones de estándares se prepararon por pesada. Las muestras se sonicaron durante 1 min justo antes de cada medida. 3.2. DESCRIPCIÓN DE LAS MUESTRAS  Descripción del Colargol El Colargol, fue proporcionado por el fabricante (Laboratorios Argenol, España) como un polvo granulado. El Colargol es también conocido como plata coloidal. Este producto está descrito en la farmacopea europea como un fuerte antiséptico. Su contenido en plata está entre el 68-70% (m/m), en su mayor parte en forma de nanopartículas de 14-17 nm de diámetro. El resto del contenido del producto es materia orgánica procedente del proceso de la síntesis de las nanopartículas. Esta materia orgánica son proteínas, fundamentalmente caseínas, con un porcentaje de Ag (I) en esta matriz proteica inferior al 0,5%. Experimental 13 La disolución inicial de Colargol de 1000 mg·L-1 se preparó a partir del producto original (sólido) y disolviéndolo en un volumen adecuado de agua ultrapura. El resto de disoluciones se prepararon mediante la dilución correspondiente.  Descripción de las muestras de cultivos celulares Las muestras objeto de estudio son células pertenecientes a la línea celular de hepatoma humano HepG2. Estas células se someten a dos tipos de ensayo: cultivo con nanopartículas de plata (AgNPs) adicionadas como Colargol y cultivo con plata en forma iónica (Ag (I)) adicionada como AgNO3, a distintas dosis en ambos casos. Las concentraciones a las que se trabaja corresponden a niveles que afectan a la viabilidad celular. El medio de cultivo empleado es el DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium) suplementado con suero fetal bovino (FBS), aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina, glutamina y HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico). Los medios de cultivo fueron retirados tras 24 horas de incubación, dejando únicamente las células en los frascos, y congelándolas inmediatamente a -20 °C. En el caso en el que se adiciona la plata en forma de AgNPs, éstas proceden del Colargol. Los ensayos desarrollados con HepG2 se corresponden con:  Células incubadas + Colargol 15 mg·L-1 (equivalente a una concentración de 10,2 mg·L-1 de AgNPs. La masa adicionada se corresponde con 102 μg). Sin efecto sobre la viabilidad celular.  Células incubadas + Colargol 30 mg·L-1 (equivalente a una concentración de 20,4 mg·L-1 de AgNPs. La masa adicionada se corresponde con 204 μg). Efecto sobre la viabilidad celular del 50%.  Células incubadas + Colargol 50 mg·L-1 (equivalente a una concentración de 34 mg·L-1 de AgNPs. La masa adicionada se corresponde con 340 μg). Efecto sobre la viabilidad celular próxima al 90%. Por su parte, en las células cultivadas con la plata en forma de Ag (I), ésta se adiciona como nitrato de plata (AgNO3). Los ensayos desarrollados con HepG2 se corresponden con: Experimental 14  Células incubadas + AgNO3 0,5 mg·L-1 (equivalente a una concentración de 0,32 mg·L-1 de Ag (I). La masa adicionada se corresponde con 3,2 μg). Sin efecto sobre la viabilidad celular.  Células incubadas + AgNO3 2 mg·L-1 (equivalente a una concentración de 1,27 mg·L-1 de Ag(I). La masa adicionada se corresponde con 12,7 μg). Efecto sobre la viabilidad celular del 50%.  Células incubadas + AgNO3 4 mg·L-1 (equivalente a una concentración de 2,54 mg·L-1 de Ag(I). La masa adicionada se corresponde con 25,4 μg). Efecto sobre la viabilidad celular del 90%. Asimismo se cuenta con cultivos celulares de control, en los que no se ha añadido plata al medio en ninguna de sus formas. 3.3. PUESTA EN DISOLUCIÓN DE LAS MUESTRAS Para la puesta en disolución de las muestras se siguieron dos estrategias: digestión ácida y solubilización mediante TMAH. 3.3.1. DIGESTIÓN ÁCIDA Se llevó a cabo un ataque ácido para la determinación del contenido total de plata presente en las distintas muestras de células. Para ello se añaden 10 mL de una disolución de ataque compuesta por HNO3:HCl (7:3) en cada uno de los frascos de cultivo que contienen las células y se dejan 18 h en ligera agitación (50 rpm) en una plaza agitadora. Transcurrido este tiempo se recoge la disolución de ataque en HCl 3% hasta 50 mL. Para la cuantificación por ICP-MS se hace una dilución previa a la medida igualmente en HCl 3%. 3.3.2. SOLUBILIZACIÓN CON TMAH Para la solubilización de las muestras con TMAH, los cultivos celulares se ponen en presencia de 4 mL de TMAH (25%w/w) y 1 mL de Triton X-100 0,25 %, de manera que la proporción de éste en el medio de solubilización sea 0,05 %. A continuación, se deja en agitación durante 4 horas para que tenga lugar el proceso de solubilización. Experimental 15 Transcurrido este tiempo, se toman 2 mL del medio solubilizado y se diluyen hasta los 8 mL con Triton X-100 al 0,05 %. El medio final en que se encuentran las células solubilizadas es TMAH 5 % y Triton X-100 0,05 %. 3.4. FRACCIONAMIENTO EN FLUJO MEDIANTE CAMPO DE FLUJO ASIMÉTRICO (AsFlFFF) Se utiliza un sistema AsFlFFF AF 2000. El canal trapezoidal era de 27,5 cm de largo y entre 2 a 0,5 cm de ancho. El espaciador utilizado en todas las medidas tenía 350 µm de espesor. Se utilizaron membranas de ultrafiltración de polietersulfona (PES) de 1 y 4 kDa como pared de acumulación. La fase móvil empleada se corresponde con una disolución de SDS 0,01 % (m/v) preparada en agua ultrapura y ajustada a pH=8. Esta fase móvil fue desgasificada antes de su uso a través de un desgasificador online de vacío. Se estudiaron distintos programas de crossflow para conseguir una correcta separación. En la Tabla 1 se resume el programa óptimo encontrado. Se usó un loop de inyección de muestra de 100 µL. Tabla 1 Método de inyección y de crossflow utilizado para las medidas de fraccionamiento en flujo mediante campo asimétrico (AsFlFFF) con un flujo a la salida del detector de 1,0 mL·min-1. Programa de separación de nanopartículas de plata Etapa del programa Tiempo (min) Crossflow,Vc, mL·min-1 Inyección/focalización 5 Flujo de Inyección, 0.2 mL·min-1 4 Separación 5 Constante 2.5 20 Caída lineal 2.5 a 0 5 Constante 0 El eluyente se dirige desde el canal hasta un detector UV-Vis de diodos que recoge la señal entre 200 y 650 nm; y hasta un espectrómetro ICP-MS colocado en línea. La resonancia plasmón de las AgNPs fue utilizada para su detección online a través del detector UV-Vis. Se registró un espectro completo del eluyente cada 2 s. Para la detección elemental, se acopló el sistema AsFlFFF a un espectrómetro de masas ICP. El flujo de salida del sistema se dirigía directamente al nebulizador del espectrómetro (un nebulizador concéntrico de vidrio slurry con una cámara ciclónica de spray). La adquisición de datos por ICP-MS se realizó utilizando 20 barridos y un "dwell time" de 50 ms [23]. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y Discusión 16 4.1. DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA EN CÉLULAS PROCEDENTES DE ENSAYOS DE NAOCITOTOXICIDAD MEDIANTE SOLUBILIZACIÓN CON TMAH Y POSTERIOR ANÁLISIS MEDIANTE AsFlFFF-ICP-MS. Uno de los principales objetivos del presente trabajo se centra en la detección y caracterización de nanopartículas de plata en células. Para poder realizar el análisis mediante AsFlFFF-ICP-MS, hay que conseguir previamente una correcta solubilización de las muestras. Las muestras con las que aquí se trabaja son cultivos celulares tratados con plata. Más allá de llevar a cabo una digestión ácida que permita determinar el contenido de plata total, se busca realizar una solubilización de las células que permita especiar entre las distintas formas de plata presentes. La identificación y caracterización de AgNPs en células sometidas a ensayos de citotoxicidad con nanopartículas, resulta ser una tarea complicada. Las AgNPs pueden haber sufrido distintos procesos en el interior de las células que dificulten su identificación. Por una parte, las AgNPs pueden liberar iones plata que contribuyan a los mecanismos de toxicidad. La liberación de iones desde las NPs puede depender de una gran variedad de factores, entre los que se encuentra el tamaño de las NPs [34]. Una menor liberación de Ag (I) podría estar relacionada con una alta velocidad de aglomeración de las AgNPs en el medio celular. Partículas más grandes, aglomerados, con un área de superficie reactiva menor, mostrarían una liberación de iones reducida, en comparación con partículas menores, de mayor área de superficie reactiva [35]. La aglomeración puede afectar a la capacidad de las AgNPs para interaccionar con las células. Las nanopartículas se pueden asociar a la membrana celular, lo que favorece que las células puedan internalizar algunas de esas partículas [36]. El análisis TEM de la distribución de partículas de plata en dos líneas celulares (A549 y HepG2) mostró la presencia de AgNPs en el interior de este tipo de células [37]. Asimismo el proceso de solubilización también es complicado. Las nanopartículas se pueden asociar a restos sin solubilizar y no permitir una correcta separación de las mismas [33]. 4.1.1. Estudio de las condiciones experimentales para la solubilización con TMAH del material biológico presente en los estudios de citotoxicidad. En una primera aproximación para realizar la solubilización de las células, se toma como punto de partida el procedimiento óptimo obtenido durante ensayos de solubilización Resultados y Discusión 23 las AgNPs parece que el tensoactivo evita su oxidación, impidiendo su transformación a Ag (I) y su posterior precipitación en el medio básico. Es necesario comprobar si en estas condiciones de estabilización, únicamente con Triton X-100 0,05 % en presencia de TMAH, se puede llevar a cabo la identificación de AgNPs en el equipo de AsFlFFF. Para ello, se deja Colargol en agitación en este medio (TMAH y triton 0,05%) y se inyectan distintas fracciones diluidas con Triton X-100 a distintos tiempos (t0, t1h y t4h) (Figura 12). 0 5 10 15 20 25 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 Abs / r.u. t / min Fig 12 Fractogramas de AgNPs en el medio de solubilización (TMAH 5 %, Triton x-100 0,05%). La señal de color negro es la obtenida a t0. La roja y la azul se corresponden con t1h y t4h respectivamente. Integrando los picos correspondientes a las AgNPs (pico con máximo a 7-8 min) se obtienen los resultados que se muestran en la Tabla 2. Se ha considerado el área a t0 como 100 % para evaluar el efecto en términos relativos del tiempo sobre la integridad de las AgNPs. Tabla 2 Diferencias de señal obtenidas en los ensayos llevados a cabo a t1h y t4h respecto a la señal a t0. t Área % señal % diferencia señal respecto t0 0 61091,2515 100,0 1 h 42425,8001 69,4 30,6 4 h 34156,5984 55,9 44,1 Resultados y Discusión 24 Atendiendo a los resultados se observa que en las condiciones de medida, un aumento en el tiempo de solubilización en presencia de TMAH y Triton conduce a una reducción en el área del pico correspondiente a las AgNPs, tal y como se había observado en el ensayo anterior con la señal de absorbancia. En este caso, y tras 4 horas, la señal se ha reducido en un 44%. Este es el medio finalmente elegido para llevar a cabo la solubilización de las células. Realmente se trata de una solución de compromiso. Un aumento en el tiempo de solubilización conlleva una pérdida de AgNPs por disolución de las mismas. En cambio, un tiempo menor puede llevar a una solubilización incompleta del medio biológico objeto de estudio. En la bibliografía se utilizan tiempos mayores para la solubilización de muestras biológicas complejas (como tejidos) del orden de 12 o 24 h [38]. Estos tiempos son excesivamente largos para poder mantener la presencia de AgNPs en el medio, por lo que se opta por un tiempo en el que en principio se permita la completa disolución de la muestra biológica, pero asegurando que al menos un porcentaje significativo sigue estando en la forma elemental como NPs. A través de posteriores ensayos de cuantificación de la plata se confirma que 4 horas son suficientes para la solubilización completa de las células. Además, esto queda validado por comparación de resultados tras ataque ácido como se discute en el apartado 4.2. 4.1.3. Detección de nanopartículas de plata en células mediante AsFlFFF-ICP-MS tras solubilización con TMAH. Condiciones iniciales. Una vez que se han encontrado las condiciones adecuadas para la estabilidad de las nanopartículas de plata en el medio de solubilización, se realiza un ensayo con uno de los cultivos celulares de los que se dispone. En este caso se realiza el ensayo con las células cultivadas con una dosis de 50 mg·L-1 de Colargol. Estas células son solubilizadas según el procedimiento descrito anteriormente. Para realizar la identificación de AgNPs se acopla el AsFlFFF al ICP-MS. De esta manera, se utiliza el AsFlFFF como método de separación por tamaños, y la absorción UV-Vis y el ICPMS como técnicas de detección. El contenido de plata de las especies eluídas es monitorizada por el ICP-MS; mientras que la señal del detector de UV-Vis da información adicional relacionada con su naturaleza: nanopartículas de plata que muestran un máximo a 405 nm. La señal que se registra a 254 nm se relaciona con materia orgánica presente en la muestra. El programa de separación aplicado para la separación de las nanopartículas de plata se describe en la Tabla 3. Este programa permite la caracterización de AgNPs con un tamaño entre 1 y 100 nm y ha sido optimizado por nuestro grupo de investigación [23]. Resultados y Discusión 25 Tabla 3 Método de inyección y de crossflow utilizado inicialmente para las medidas de fraccionamiento en flujo mediante campo asimétrico (AsFlFFF) con un flujo a la salida del detector de 1,0 mL·min-1. Programa de separación de nanopartículas de plata Etapa del programa Tiempo, min Crossflow, Vc, mL·min-1 Inyección/focalización 5 Flujo de Inyección, 0.2 mL·min-1 1 Separación 20 Constante 0.325 5 Caída lineal 0.325 a 0 5 Constante 0 En la Figura 13 se muestran las señales de UV-Vis a 254 nm y 405 nm, junto con la señal ICP-MS de las células solubilizadas. Asimismo, se refleja el espectro UV-Vis en el tiempo del máximo de los picos observados a 405 nm. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 20000 40000 60000 80000 100000 Abs / r.u. t / min 0,0 0,5 1,0 Crossflow / mL·min-1 30000 40000 50000 0 20000 40000 60000 80000 100000 Abs / r.u.  / nm Fig 13 Fractograma células cultivadas con una dosis de 50 mg·L-1 de Colargol. En azul se refleja la señal de 107Ag obtenida en ICP-MS. Las señales en negro y rojo hacen referencia a las señales obtenidas en UV-Vis a 254 nm y 405 nm, respectivamente. En la parte superior de la figura, se muestra el espectro UV-Vis en el tiempo máximo de los picos observados en la señal de 405 nm. La línea rosa se refiere al máximo del pico a los 6 min y la naranja a 6,86 min. En verde se muestra el programa de flujo cruzado aplicado en el AsFlFFF. De la señal de ICP-MS se observa la presencia de un pico de plata al principio del fractograma, sin resolver del void peak, asociado a la señal obtenida a 254 nm. Este pico puede estar relacionado con Ag (I) asociada a materia orgánica de la muestra. El espectro UV-Vis para los máximos del fractograma a 405 nm confirman la presencia de nanopartículas de plata en las células solubilizadas. Sin embargo, la separación no es del todo correcta. Los dos picos que aparecen al principio del fractograma no están resueltos. Resultados y Discusión 26 Se ha de optimizar un programa de flujo cruzado que permita separar estas AgNPs del resto de especies que contienen plata en el medio de solubilización. 4.1.4. Optimización de las condiciones de separación de nanopartículas de plata en AsFlFFF. Programa de flujo cruzado. El tiempo de retención (tr) de las especies se puede relacionar con variables experimentales a través de la teoría de FFF. Si se establece una relación lineal entre el parámetro de retención experimental R (tiempo de elución correspondiente al void peak (t0) dividido por el tiempo de retención para una partícula dada (tr)) y λ (parámetro de retención teórico y que depende de las propiedades de la especie que se eluye), de manera que R = 6 λ (válido para valores λ<0,02), entonces el tr se puede expresar como: donde w es la anchura del espaciador, Di el coeficiente de difusión de la sustancia i, Vc el caudal del flujo cruzado (crossflow), y Vout el caudal de salida del canal. Cuanto menor es el tamaño de una especie, mayor es su coeficiente de difusión, y por tanto menor es el tiempo de retención de la misma. Es necesario entonces adecuar el crossflow al tamaño (coeficiente de difusión) de las especies que se quiere separar. Para una sustancia dada y con w fija, el tiempo de retención depende de la relación Vc/Vout. Valores más altos de Vc llevan a mayores tiempos de retención, por lo que el crossflow se debe fijar para tener buenas separaciones en tiempos razonables. Asimismo, la anchura de los picos obtenidos también se debería tener en cuenta para una separación óptima. De la teoría se deriva una ecuación simplificada para la anchura de un pico de un compuesto retenido: donde A es el área de la pared del canal poroso. Por tanto, de la ecuación anterior se deduce que para una relación Vc/Vout dada, se deben aplicar valores más altos de crossflow para obtener picos lo más estrechos posible. Desde un punto de vista experimental, Vout está normalmente limitado por la presión dentro del canal, por lo que la relación Vc/Vout se debe estudiar para la configuración de cada sistema. Un aumento en la relación Vc/Vout lleva a mayores tiempos de retención y mejor resolución [23]. Resultados y Discusión 27 La optimización de las condiciones de separación de AgNPs en AsFlFFF se lleva a cabo mediante diferentes ensayos. Estos ensayos se realizan en el medio de solubilización empleado, inyectando 100 µL de las muestras en el equipo de AsFlFFF y con una membrana PES 1 kDa. En este caso se utiliza como sistema de detección únicamente el detector de UVVis. Se realizaron ensayos sobre muestras de células y sobre nanopartículas de plata tal y como se describe a continuación. 4.1.4.1. Ensayos de optimización sobre células tratadas con Colargol Los primeros ensayos para llevar a cabo la optimización del programa de separación se realizan sobre la muestra descrita en el apartado 4.1.3. (células cultivadas con una dosis de 50 mg·L-1 de Colargol). Parte del volumen restante de esa muestra que no había sido utilizado en las medidas, se emplea para tratar de encontrar un buen programa de separación. El objetivo es desarrollar un programa que permita separar las AgNPs de la fracción de materia orgánica presente en el medio. Esto requiere de una etapa con elevado crossflow, que permita eluir las especies de menor tamaño, seguida de otra con un crossflow menor que permita la elución de las AgNPs. Se parte de un programa optimizado por el grupo de investigación que se ha utilizado para la identificación de especies de plata asociada a proteínas presentes en medios de cultivo. Este programa permite separar especies de bajo peso molecular (en el rango de 10-100 kDa), para a continuación eluir especies de mayor tamaño sin ninguna separación (etapa en la que se deja de aplicar crossflow). Este programa se muestra en la Tabla 4. Tabla 4 Método de inyección y de crossflow utilizado para las medidas de fraccionamiento en flujo mediante campo asimétrico (AsFlFFF) con un flujo a la salida del detector de 1,0 mL·min-1. Etapa del programa Tiempo, min Crossflow, Vc, mL·min-1 Inyección/focalización 5 Flujo de Inyección, 0.2 mL·min-1 4 Separación 30 Constante 3 1,5 Caída exponencial 3 a 0 10 Constante 0 La Figura 14 muestra el fractograma obtenido al aplicar el programa de la Tabla 4. Resultados y Discusión 28 010 20 30 40 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 Abs / r.u. t / min 0 2 4 Crossflow/ mL·min-1 Fig 14 Fractograma correspondiente al ensayo con células cultivadas con una dosis de 50 mg·L-1 de Colargol al aplicarle el programa de separación descrito en la Tabla 4. Las señales en negro hacen referencia a las señales obtenidas en UV-Vis a 254 nm, las de color rojo a las de 405 nm. Tal y como se ha descrito, el primer pico corresponde a especies de bajo peso molecular y de naturaleza orgánica (elevada señal a 254 nm). El pico con una mayor proporción en la señal a 405 nm indica presencia de AgNPs. Para confirmar la naturaleza de estas dos poblaciones se inyectan con este mismo programa AgNPs y células de control solubilizadas siguiendo el mismo procedimiento, por separado. Los fractogramas obtenidos para esta inyección de AgNPs en el medio de solubilización se muestran en las Figuras 15 y 16. 010 20 30 40 0 1500 3000 4500 6000 7500 9000 10500 12000 Abs / r.u. t / min 0 2 4 Crossflow / mL·min-1 Resultados y Discusión 29 Fig 15 Fractograma correspondiente al ensayo con AgNPs en el medio de solubilización al aplicar el programa de separación descrito en la Tabla 4. Las señales en negro hacen referencia a las señales obtenidas en UV-Vis a 254 nm, las de color rojo a las de 405 nm. 010 20 30 40 0 50000 100000 150000 200000 Abs / r.u. t / min 0 2 4 Crossflow / mL·min-1 Fig 16 Fractograma correspondiente al ensayo con células de control tras someterse al proceso de solubilización al aplicar el programa de separación descrito en la Tabla 4. Las señales en negro hacen referencia a las señales obtenidas en UV-Vis a 254 nm, las de color rojo a las de 405 nm. Comparando ambos fractogramas, podemos observar que el pico a 39,6 min de la Figura 14 corresponde con el pico a 38 min de AgNPs de la figura 15, lo que confirma la naturaleza metálica de dicha fracción. Por su parte, al comparar los picos a 254 nm de la Figura 14 con los que aparecen en la Figura 16 de las células de control, se ve que los picos que aparecen a 5,6 min, 35,9 min y 39,6 min en el primer caso, se corresponden con los de 5,6 min, 35,7 y 39,6 min del segundo, lo que confirma la naturaleza orgánica procedente de las células de dichos picos. El pico que aparece a 7,2 min en la Figura 14 no se observa en la Figura 16, podría estar relacionado con la presencia de nanopartículas de pequeño tamaño asociadas a material orgánico. A pesar de que este programa permite la separación de las AgNPs de la fracción orgánica de menor tamaño, éstas se eluyen al final del fractograma, donde no es posible obtener información acerca del tamaño de las mismas al eluirse en ausencia de crossflow. El hecho además de que otras especies de gran tamaño de naturaleza orgánica, coeluyan en estos tiempos y que también pudieran llevar asociada plata, hace que se busque un programa más adecuado. Resultados y Discusión 30 4.1.4.2. Ensayos de optimización sobre células de control Para estos ensayos de optimización del programa de separación, se utilizaron células de control sobre las que se adicionaron AgNPs (según el procedimiento indicado en 3.3.2.). Tras varios programas (Anexo A2) se obtuvo uno que permitía la separación de las AgNPs del resto de especies presentes en el medio solubilizado (Tabla 1). Los fractogramas que se obtienen para la muestra solubilizada de células de control, para la muestra de células de control con adición posterior de AgNPs y para AgNPs en el medio de solubilización se muestran en la Figura 17. 0 5 10 15 20 25 30 35 0 50000 100000 150000 200000 Abs / r.u. t / min 0 2 4 Crossflow / mL·min-1 010 20 30 0 50000 100000 150000 Abs / r.u. t / min 0 2 4 Crossflow / mL·min-1 (a) (b) Resultados y Discusión 31 010 20 30 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Abs / r.u. t / min 0 1 2 3 4 Crossflow / mL·min-1 Fig 17 Fractogramas correspondientes a los ensayos de células de control solubilizadas (a), células de control solubilizadas con adición posterior de AgNPs (b) y AgNPs en el medio de solubilización (c) al aplicar el programa de separación descrito en la Tabla 7. Las señales en negro hacen referencia a las señales obtenidas en UV-Vis a 254 nm, las de color rojo a las de 405 nm. Para la separación de la muestra (C) se empleó una membrana PES 4 kDa. De los fractogramas anteriores se observa la separación entre las AgNPs adicionadas posteriormente a la muestra de control solubilizada y el material orgánico presente en la muestra debido a la solubilización de las células. La Figura 18 muestra una ampliación de la zona baja de la Figura 17 B en la que se aprecia esto. Con este programa se ha conseguido la separación parcial de las AgNPs debidas al Colargol y del material orgánico debido a la solubilización de las células. El programa descrito en la Tabla 1 se toma como el más adecuado para llevar a cabo la separación de nanopartículas de plata en medios celulares solubilizados. 010 20 30 0 10000 20000 30000 Abs / r.u. t / min Fig 18 Fractograma ampliado correspondientes a células de control solubilizadas con adición de AgNPs (Fig. 17 B). (c) Resultados y Discusión 32 4.1.5. Calibración del canal frente a estándares de tamaño. El tr de las especies que se eluyen a través del canal de FFF se puede relacionar con su tamaño, tal y como se ha discutido en la sección 4.1.4. Las partículas más pequeñas, con mayor coeficiente de difusión, se eluyen antes que las más grandes. Se realiza una calibración del sistema AsFlFFF frente al tamaño de distintos estándares de AgNPs. Estos estándares van desde los 20 a los 45 nm (Figura 19). Estos estándares se disuelven en la fase móvil empleada (SDS 0,01 %, pH=8) y se inyectan en el sistema aplicando el programa de elución optimizado (Tabla 1). 0 2 4 6 8 10 0 2000 4000 6000 8000 10000 Abs / r.u. t / min Fig 19 Fractogramas de los estándares de AgNPs utilizados para la calibración de tamaños en fase móvil. La señal negra hace referencia a AgNPs de 20 nm, la roja a AgNPs de 30 nm y la azul a AgNPs de 45 nm. Los programas se pararon antes de su finalización completa tras la aparición del máximo correspondiente a cada uno de los tamaños. Se establece una relación lineal entre el logaritmo del factor de retención R (R = t0/tr) y el logaritmo del diámetro (d) en nanómetros de las nanopartículas [19]. La relación encontrada es: log R = -0,9665 log d + 0,9341 (r2 = 0,9986). De acuerdo a esta relación se puede establecer el tamaño de las nanopartículas eluídas a través del canal en experimentos posteriores. Resultados y Discusión 39 de los picos correspondientes al patrón (de concentración conocida) y a la muestra se puede cuantificar la cantidad de plata presente en los cultivos celulares solubilizados (Tabla 6). Tabla 6 Cantidades de plata encontradas tras realizar la solubilización con TMAH. Muestra Concentración de plata, µg Células + Colargol 30 mg·L-1 77,2 ± 9,9 Células + AgNO3 dosis 4 mg·L-1 7,4 ± 1,1 Las cantidades de Ag obtenidas por ataque ácido en estos mismos cultivos se muestran en la Tabla 7. Tabla 7 Cantidades de plata encontradas en las muestras tras ataque ácido. Muestra Concentración de plata, µg Células + Colargol 30 mg·L-1 75 ± 1 Células + AgNO3 4 mg·L-1 6,76 ± 0,04 Aplicando un test t con un nivel de confianza del 95 % se puede afirmar que el procedimiento de solubilización con TMAH da similares resultados a los obtenidos mediante un ataque ácido de los medios celulares. No se encuentran diferencias significativas entre ambos métodos. Esto confirma que el procedimiento de solubilización con TMAH permite la puesta en disolución de la plata presente en las muestras de células de forma completa y sin pérdidas significativas por procesos de precipitación. Este procedimiento permite por tanto la cuantificación de plata total en este tipo de medio biológico permitiendo de forma simultánea la identificación de formas metálicas de plata. 5. CONCLUSIONES Conclusiones 40 Las principales conclusiones del presente trabajo pueden resumirse en los siguientes puntos: 1. Se ha desarrollado una metodología de puesta en disolución de plata para medios celulares que permite su cuantificación, además de la identificación de la presencia de nanopartículas mediante el empleo de un agente de solubilización como es el TMAH. 2. Esta metodología se ha aplicado a la cuantificación de plata en muestras reales procedentes de medios celulares cultivados con distintas formas de plata (como plata iónica y nanopartículas), validándose mediante la comparación de los resultados obtenidos con aquellos procedentes de la aplicación de un ataque ácido. 3. Se ha desarrollado una estrategia global de caracterización de nanopartículas de plata en medios celulares por AsFlFFF como técnica de separación y UV-Vis e ICP-MS como técnicas de detección. La caracterización de nanopartículas se ha confirmado con imágenes TEM. 4. Con los resultados obtenidos, se puede afirmar que al adicionar la plata sobre cultivos celulares en forma de AgNPs, éstas o bien se quedan adheridas sobre las paredes celulares o la atraviesan como NP, y una vez dentro liberarían Ag (I). Esta metodología abre el camino a la caracterización e identificación de nanopartículas de plata en matrices biológicas complejas, lo que puede aportar información relevante para estudios de toxicidad de estas nanopartículas en entornos biológicos o medioambientales. 6. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 41 1. Woodrow Wilson International Center for Scholars. Nanotechnology consumer product inventory. Available at http://www.nanotechproject.org/inventories/consumer/. Project of Emerging Nanotechnologies, Washington, DC. 2. Hansen S.F., Michelson E.S., Kamper A., Borling P., Stuer-Lauridsen F., Baun A. Categorization framework to aid exposure assessment of nanomaterials in consumer products. Ecotoxicology (2008), 17:438-447. 3. 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ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE LAS NANOPARTÍCULAS DE Ag EN LAS CONDICIONES DEL ENSAYO DE SOLUBILIZACIÓN CON TMAH Y CISTEÍNA En las figuras 1, 2, 3 se muestran los espectros de UV-Vis obtenidos a lo largo del tiempo al poner en contacto las AgNPs del Colargol con 4 mL de TMAH y cisteína en distintas proporciones (0,002 %, 0,02 % y 0,1 %). 1. Colargol + 4 mL TMAH + cisteína 0,002 % En este ensayo se deja Colargol en agitación en presencia de 4 mL de TMAH y cisteína 0,002 %. En los ensayos anteriores en los que se empleaba cisteína 0,1 %, la cisteína estaba en gran exceso respecto a la cantidad de plata (relación molar Ag:cisteína 1:88). En este caso la relación molar entre Ag y cisteína es 1:3,5. En la Figura 1 se muestra el espectro obtenido a través de EAM-UV-Vis. Fig 1 Espectro de absorción de Colargol (5 mg·L-1) frente al tiempo. Ensayo en presencia de TMAH 5 %, cisteína 0,002 %. 2. Colargol + 4 mL TMAH + cisteína 0,02 % En este ensayo se deja Colargol en agitación en presencia de 4 mL de TMAH y cisteína 0,02 %. La relación molar entre plata y cisteína es 1:35. El espectro completo se puede ver en la Figura 2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 300 350 400 450 500 550 Absorbancia λ (nm) Abs to Abs t45' Abs t90' Abs t120' Abs t150' Abs t180'