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Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección. Mónica Jurado García Master en Biología Molecular y Celular 12/13 Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 2 ÍNDICE ANTECEDENTES Y OBJETIVOS.....................................................................4 INTRODUCCIÓN ...............................................................................................5 1 Historia..................................................................................................................5 2 Mycobacterium tuberculosis..............................................................................6 2.1 Taxonomía.........................................................................................6 2.2 Características...................................................................................7 3 Mecanismo frente al estrés oxidativo..............................................................8 3.1 Mecanismos de mantenimiento intracelular estado tiol-redox............9 3.2 Micotiol…………………………………………………………………….10 3.3 Micorredoxinas.................................................................................11 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................12 1 Material biológico, medios y condiciones de cultivo....................................12 1.1 Medios de cultivo.............................................................................12 1.2 Condiciones de cultivo.....................................................................13 1.3 Conservación de cepas....................................................................13 1.4 Plásmido..........................................................................................14 2 Extracción de plásmidos..................................................................................14 2.1 Mini-Preparación..............................................................................14 2.2 Cuantificación ..................................................................................15 3 Técnica generales de DNA.............................................................................15 3.1 PCR.................................................................................................15 3.1.1 Comprobación del BAC……………...………………………………..16 3.1.2 Obtención de productos de amplificación sobre el plásmido pKD4…………………………………………………………………………..17 3.1.3 Comprobación del intercambio alélico en E.coli……………………20 3.2 Electroforesis de DNA en gel de agarosa........................................21 4 Electrotransformación......................................................................................22 4.1 Electrotransformación del plásmido pKD46……………………………..22 4.2 Electrotransformación de los sustratos de intercambio alélico en bacterias que expresan la recombinasa de pKD46………………….…….23 4.3 Siembra en placa……………………………………………………….….24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................25 1 Comprobación de la presencia de los genes mrx en los BACs de E.coli, y electrotransformación del plásmido pKD46.................................................26 Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 3 2 Amplificación del gen de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4 con los extremos con los extremos correspondientes a los genes mrx, para obtener los sustratos de intercambio alélico…….…………...………...31 3 Introducción del sustrato de intercambio alélico en las células competentes que contienen el BAC y el plásmido pKD46..........................34 4 Selección de las bacterias en las que el sustrato de intercambio alélico ha recombinado con el BAC……………………………………….……………37 CONCLUSIONES Y PERSPESTIVAS FUTURAS...........................................38 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................40 Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 4 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Entre las enfermedades infecciosas que causan la muerte de 15 millones de personas al año, siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados y subdesarrollados, nos encontramos con Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que es el agente causal de la tuberculosis (TB), de la cual están infectados un tercio de la población mundial y sigue siendo la principal causa de muerte por un solo agente infeccioso, llegando a cifras de 1,7 millones de muertes al año. De los individuos infectados de tuberculosis, entre el 5-10% la desarrollaran de forma activa, mientras que los individuos restantes pueden controlar pero no eliminar la infección. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), durante su ciclo patogénico, se encuentra expuesto a numerosos factores de estrés redox, los mecanismos que utiliza para detectar este estrés y para mantener la homeostasis redox son fundamentales para el éxito de Mtb, e incluso se cree que todos estos mecanismos son importantes en la transición de la fase de latencia a la reactivación. Ante el estrés redox emplean una serie de mecanismo y vías para la supervivencia, tales como el sistema tiorredoxina y las vías de micotiol, en estas ultimas entrarían las micorredoxinas, recientemente identificadas y caracterizadas en Corynebacterium glutamicum (Messens et al, 2009), una nueva clase de oxidoreductasas también presentes en Mtb, estas enzimas utilizan el micotiol para reducir disulfuros en la célula. El objetivo de este trabajo es el estudio de la micorredoxinas, construyendo los sustratos de intercambio alélico necesarios para construir mutantes Knock-out de los genes mrx1 (Rv3198A), mrx2 (Rv3053c), y mrx3 (Rv0508). Los mutantes previos se realizaran en BACs de E.coli, para en un futuro llevarlos a Mtb, pudiéndose utilizar para ensayar la actividad de nuevos fármacos antituberculosis en desarrollo y orientar estos procesos hacia fármacos más activos. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 5 INTRODUCCIÓN 1 Historia En pocas enfermedades es posible documentar la estrecha relación de la misma con la historia de la propia humanidad, como es el caso de la Tuberculosis. Hay evidencias paleopatológicas en restos neolíticos precolombinos, así como en momias egipcias que datan aproximadamente de año 2400 a.E. A lo largo de la historia se le han dado diversos nombres a esta enfermedad, tales como tisis, mal de Pott, mal del Rey o plaga blanca. Esta aceptada la teoría de que Mycobacterium tuberculosis se origino por la evolución de microorganismos primitivos dentro del propio genero. En algún momento de esta evolución tuvo reservorio en animales, dando lugar a Mycobacterium bovis, y coincidiendo con la domesticación de los animales, surgiría el reservorio en humanos, por la mutación de M.bovis. En la Grecia clásica, Hipócrates de Cos le dio nombre a esta enfermedad, denominándola “Tisis”, describiendo el cuadro clínico de dicha enfermedad, en su “Tratado sobre las enfermedades”. Más tarde en la Edad Media y en el Renacimiento, aumenta la incidencia de tuberculosis, llamándose en estos momentos “el mal de Rey”, llegando a alcanzar su máxima incidencia en el siglo XVIII, donde Benjamis Marten publica “A New Theory of Consumptions more specially of a Phthisis or Consumption of the Lungs”, en la propone la teoría de que el causante de la tuberculosis debe ser algún tipo de ser vivo minúsculo capaz de sobrevivir en nuestro cuerpo. Algún tiempo más tarde, Robert Koch (1843-1910) detalla en su publicación Die Aetiologie der Tuberculose, que Mycobacterium es el único causante de la tuberculosis en todas sus variantes. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 6 En 1921, Albert Calmette y Camille Guérin producen la vacuna contra la tuberculosis (BCG), empleando una variante atenuada del Mycobacterium bovis. A partir de 1944, donde se descubrió la estreptomicina, producida por el hongo Streptomyces griseus capaz de inhibir el crecimiento del Mycobacterium, surgieron nuevos fármacos antituberculosis: ácido para-amino salicílico (PAS) en 1946, isoniazida (INH) en 1952, pirazinamida (PAZ) en 1954, etambutol (EMB) en 1962 y rifampicina (RIF) en 1967. Llegando a conseguirse que la tuberculosis fuera una enfermedad tratable y curable. Se creyó durante años que la tuberculosis estaba controlada y prácticamente erradicada, pero la pandemia del SIDA cambio esta idea, ya que con el SIDA se debilita el sistema inmunitario, haciendo que enfermedades que no son mortales en ese momento lo vuelvan a ser, como es el caso de la tuberculosis. Esto obligó en 1993 a la OMS (Organización Mundial de la Salud) a declarar la tuberculosis como “urgencia mundial”. Actualmente, el tratamiento consiste en dos meses de administración de rifampicina, isoniazida, pirazinamida y etambutol, seguidos de cuatro meses con rifampicina e isoniazida. 2 Mycobacterium tuberculosis 2.1 Taxonomía Pertenece al dominio Bacteria, de la clase Actinobacteria, del orden Actinomycetales, del suborden Corynebacterineae, agrupándose en el complejo de Mycobacterium tuberculosis, que comprende varias especies como M.bovis, M.tuberculosis, M.caprae, entre otras. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 7 Fig. 1. Taxonomía de Mycobacterium tuberculosis. 2.2 Características Son bacilos de tamaño 2-5 µm de longitud y 0,2-0,5 µm de anchura, posee un elevado contenido en G+C (65,6%) en su genoma, se caracteriza por ser intracelular obligado, aerobio estricto, con actividad catalasa y nitrato reductasa, inmóvil y no-esporulado, capacidad de acumular niacina y reducir los nitratos a nitritos. La transmisión es por vía aérea. Se clasifican como micobacterias de crecimiento lento, ya que posee un tiempo de duplicación de 24 horas y debe transcurrir un periodo de 3 a 4 semanas para visualizar una colonia en medio sólido. La envoltura que poseen les proporciona protección y soporte, con mecanismos que permiten el intercambio de sustancias con el ambiente, las micobacterias son biológicamente similares a las bacterias Gram + pero tienen algunos aspectos distintos. La diferencia erradica, en que aunque ambos poseen peptidoglicanos, las moléculas asociadas a este polímero suelen ser lipídicas en lugar de proteicas y lipopolisacaridos como sucede en micobacterias. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 8 Fig. 2. Estructura de la envuelta de Mycobacterias. Además la primera barrera con la que se encuentra ante un estrés oxidativo es la pared celular y la membrana, por ello veremos de qué partes se compone. La envoltura se divide en dos partes principales;  La pared celular, los lípidos constituyen el 20% del peso seco de la bacteria, y esta dividido en cuatro capas, las más interna esta compuesta por peptidoglicano, dando forma y rigidez, por encima de está, hay tres capas compuestas por complejos péptidos, polisacáridos y lípidos, en una matriz homogénea. La membrana plasmática, la principal diferencia con otras membranas, es que los derivados de fosfolípidos están altamente glicosilados dando lugar a moléculas como el lipoarabinomanano (LAM), importante en la patogénesis de la tuberculosis. 3 Mecanismo frente al estrés oxidativo Las bacterias ante situaciones de extrema toxicidad, hace que se desencadene los sistemas de estrés celular, produciendo una respuesta para deshacerse de esos compuestos tóxicos o estados (metales, las especies reactivas de oxígeno (ROS), las especies reactivas de nitrógeno (RNS), de pH ácido, falta de nutrientes, y la hipoxia). Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 9 La exposición de las micobacterias al estrés oxidativo provoca cambios en el metabolismo y la fisiología que no sólo ayudan a sobrevivir dentro del hospedador, sino que también permiten que se exprese factores de virulencia que en última instancia conducen a la patogénesis de la enfermedad. Fig. 3. Estrés redox al que se ve sometido una micobacteria. El nivel de estrés redox en el microambiente que rodea Mycobacterium tuberculosis, juega un papel importante en la determinación de si los bacilos entran en el estado constante no-replicativo o el estado replicativo. 3.1 Mecanismo de mantenimiento intracelular estado tiol-redox Para la función de varias proteínas, los enlaces disulfuro entre cisteínas apareadas juega un papel muy importante, ya sea mediante la estabilización de la conformación o el funcionamiento como un modulo de detección redox. Para mantener un entorno de reducción en el citoplasma y resistir la formación no especifica inter e intramolecular de enlaces disulfuro, las bacterias gastan una energía considerable. En el caso de las micobacterias, es vital mantener un pool óptimo de tiol, porque hacen frente con frecuencia al estrés oxidoreductivo generado por el sistema inmune del hospedador. Este tiol presente en las micobacterias, mantiene la reducción intracelular, con unas concentraciones milimolares de múltiples buffers de tiol. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 16 La mezcla de reacción debe contener: − 5 µl de Buffer (Bioline), que contiene 15 mM de MgSO 4 y desoxirribonucleótidos (dNTP) 25 mM. − 0,5 µl de cada uno de los oligonucleótidos 25 µM. − 0,25 µl de Taq Polymerase (Roche). − ≤ 100 ng de DNA molde − H 2 O miliQ hasta alcanzar un volumen final de 17.75 µl. Todos los componentes de esta mezcla se mantienen en hielo. Es necesario, además, incluir un control negativo (sustituyendo el DNA molde por agua) para poder detectar contaminaciones por otros DNA si las hubiera, y un control positivo, para confirmar que la PCR tiene lugar correctamente. La reacción de PCR se utilizó para diversas aplicaciones que se detallan a continuación. 3.1.1 Comprobación del BAC El objetivo fue verificar que las cepas que se habían seleccionado a partir de la librería de BACs contenían efectivamente los genes de las micorredoxinas. El programa de la PCR es el siguiente: o 1 fase de 10 seg. A 94ºC. o 30 ciclos compuestos por tres fases: 15 s a 94ºC 15s a Tm= 62ºC 50s a 72ºC. o Finaliza -4ºC. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 17 Fig. 6. Representación PCR Primers Secuencia 5’  3’ Tm M1-AD cgggcgtgtcgccacgcc 68ºC M1-BR cgcagcgcttgccgccgg 69ºC M2-AD ctggagccttgtcgggccgc 66ºC M2-BR cggccatgcagcggtatccgcg 68ºC M3-AD ggtggccgctacgggtgcg 67ºC M3-BR gaccggcgcgctacgatgcg 67ºC Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para la comprobación de los BACs. Los oligonucleótidos M1-AD y M1-BR se utilizaron para detectar el gen mrx1, los oligonucleótidos M2-AD y M2-BR se utilizaron para detectar el gen mrx2, y los oligonucleótidos M3-AD y M3-BR se utilizaron para detectar el gen mrx3. 3.1.2 Obtención de productos de amplificación sobre el plásmido pKD4 Se utilizó para amplificar el gen de resistencia a Kanamicina, con los oligos P1 y P2 y con los extremos de mrx1, mrx2 y mrx3. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 18 Fig. 7. Los fragmentos que se van a amplificar en cada caso, el que lleva solo p1 y p2 se utilizará como control negativo. Las condiciones de la reacción fueron las mismas que en el apartado 3.1.1. El programa de la PCR es el siguiente: o 1 fase de 1 min. a 94ºC. o 30 ciclos compuestos por tres fases: 15 s a 94ºC 15s a Tm= 58ºC 50s a 72ºC. o Finaliza -4ºC. Fig. 8. Representación de PCR. Después se realizó una purificación de lo obtenido, con el High Pure PCR Product Purification Kit (Roche). Una vez purificado siguiendo los pasos indicados en el protocolo de Roche, lo guardo a -20ºC. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 19 Los oligos utilizados: Primers Secuencia 5’  3’ Tm M1-D ctgccgagccgccacaccgcccgggtcgtcgccgcgctaggttagcgtgt cgtgtaggctggagctgcttc 68ºC M1-R cccgcgtgatcatcgaatcgtgggcagcgtgcgaatgaaagtccacgtcg catatgaatatcctccttagt 69ºC M2-D Gttgccagatcctgtcagattcccgatttccgcaaaggagcggtacgccc gtgtaggctggagctgcttc 66ºC M2-R Gccccgcgatatccatggcaccgcaatcttccttatctatgtctgccgcg catatgaatatcctccttagt 68ºC M3-D tcgcgccttgttgctgccgtccggccagcacccgtcagcgactggcgccc gtgtaggctggagctgcttc 67ºC M3-R cggcagcaccacctggccagctccctcgactaccccagtaaaactggtgt catatgaatatcctccttagt 67ºC P1 gtgtaggctggagctgcttc 65ºC P2 catagtgaatatcctccttagt 65ºC Tabla 3. Oligonucleótidos usados para amplificar a pKD4. En los oligonucleótidos M1-D, M2-D, y M3-D se destaca en negrita la secuencia correspondiente a la región P1. En los oligonucleótidos M1-R, M2-R y M3-R se destaca en negrita la secuencia correspondiente a la región P2. Los oligonucleótidos M1-D y M1-R se utilizaron para amplificar el gen de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4 proporcionándole los extremos correspondientes al gen mrx1. De modo similar, los oligonucleótidos M2-D y M2-R, y los oligonucleótidos M3-D y M3-R se utilizaron para hacer la misma amplificación proporcionando extremos correspondientes a los genes mrx2 y mrx3 respectivamente. Los oligonucleótidos P1 y P2 se utilizaron para amplificar el gen de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4 sin proporcionarle secuencias adicionales. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 20 3.1.3 Verificación del intercambio alélico en E. coli Se utilizó con el objetivo de verificar si en las colonias que crecieron en placa LB con antibióticos Kanamicina (50 mg/ml) + Cloranfenicol (1mg/ml) contenían efectivamente el BAC en el que se había realizado el intercambio alélico en los genes de micorredoxinas. En esta ocasión, las condiciones fueron las siguientes: − 2 µl de Buffer (Bioline), que contiene 15 mM de MgSO 4 y desoxirribonucleótidos (dNTP) 25 mM. − 0,15 µl de cada uno de los oligonucleótidos 25 µM. − 0,075 µl de Taq Polymerase (Roche). − DNA molde a partir de picado en colonia con un palillo. − H 2 O miliQ hasta alcanzar un volumen final de 7.625 µl. El programa de la PCR es el siguiente: o 1 fase de 10 min. a 94ºC. o 30 ciclos compuestos por tres fases: 15 s a 94ºC 15s a Tm= 58ºC 50s a 72ºC. o Finaliza -4ºC. Fig. 9. Representación de PCR. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 21 Primers Secuencia 5’  3’ Tm Tn5-A cgcttgggtggagaggctattc 60ºC Tn5-B ccgctcagaagaactcgtcaag 58ºC Tn5-C cccaaccttaccagagggcgcccc 68ºC Tn5-D ctcccgattcgcagcgcatcgcc 68ºC Tabla 4. Oligonucleótidos para comprobar la deleción del gen. Estos se combinaron con los oligonucleótidos mostrados en las Tablas 2 y 3 para verificar la presencia del intercambio alélico en los genes de micorredoxinas. 3.2 Electroforesis de DNA en gel de agarosa Esta técnica permite separar, identificar y aislar fragmentos de DNA que migran en una matriz de agarosa bajo la acción de un campo eléctrico. El DNA, de carga negativa a pH=8, se desplaza por los poros de agarosa hacia el polo positivo, dependiendo su movilidad de la longitud y conformación del DNA, de la concentración de agarosa y de la corriente aplicada. La elección del contenido en agarosa del gel dependerá del rango de longitudes de los fragmentos que se quieran separar. La visualización de los fragmentos de DNA amplificados o digeridos con enzimas de restricción, cuyos tamaños varían entre 0,4 kb y 5kb, se realiza migrando las muestras en un gel de agarosa 0,8% -1,2% (p/v) preparado en tampón TBE 0,5x (Tris base 45mM, ácido bórico 45 mM, EDTA 0,1 mM, pH=8,0). Durante la preparación del gel, se añade bromuro de etidio, un agente intercalante del DNA que permitirá su posterior detección con luz UV (260nm), a una concentración de 0,5 µg/ml. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 22 Cada una de las muestras se mezcla en primer lugar con un buffer de carga (azul de bromofenol 0,25%, sacarosa 10% en tampón TE), que la dota de mayor densidad, facilitando su carga en los pocillos del gel. Con objeto de asignar el tamaño a cada banda, es necesario incorporar un marcador de peso molecular, en este caso el DNA del fago digerido con PstI. La migración se realiza en tampón TBE 0,5x a un voltaje de 90-100 voltios durante 30-45 min. 4 Electrotransformación 4.1 Electrotransformación del plásmido pKD46 En primer lugar, se prepararon células competentes de las cepas que contenían los BACs Rv092, Rv280, y Rv308 para introducirles el plásmido pKD46. Para preparar células electrocompetentes: - Se parte de 3 tubos con medio de cultivo LB con Cloranfenicol (1mg/ml), pre-incubados a 37ºC, que se inocularon con cultivos previos de las cepas de E. coli que contenían los BACs Rv092, Rv280, y Rv308, respectivamente. - Estos cultivos se incubaron hasta alcanzar una DO a 600nm de 0,5-0,6 momento en el cual se detuvo el crecimiento mediante la incubación en hielo del cultivo durante 10 min. (A partir de este momento respetar la cadena de frío). - Las células se centrifugan y lavan dos veces con H 2 O estéril y una vez con glicerol al 10%. - Tras esto se centrifugan nuevamente y se resuspenden en 1 ml de glicerol 10% y se reparten en 4 alícuotas de 50 µl que se almacenan a - 80ºC. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 23 Para llevar a cabo la electrotransformación de las células con el plásmido pKD46: - Se mezcla la alícuota de células electrocompetentes con 50 µl de H 2 O milli-Q estéril. - Se adicionan 1 µl de DNA plasmídico. - Se pone la mezcla en cubetas de 0,2cm (Bio-Rad) preenfriadas a 4ºC. - Se les da un pulso (2,5kV, 25µF, 200Ω) en un GenePulser XcellTM (BioRad). - Las células se recogen en 900 µl de LB y se incuban 1 hora a 30ºC para que expresen la resistencia al antibiótico. - Se siembran las distintas diluciones en placas petri con LB agar y los antibióticos ampicilina y cloranfenicol. 4.2 Electrotransformación de los sustratos de intercambio alélico en bacterias que expresan la recombinasa de pKD46 En esta técnica, las bacterias que contienen uno de los BACs y el plásmido pKD46 se tratan con arabinosa para que expresen la recombinasa. Los cultivos se incuban en la estufa de 30ºC ya que pKD46 es termosensible. Para preparar células electrocompetentes: - Se parte de 100 ml de medio liquido LB con cloranfenicol (10mg/ml), con Ampicilina (100 µg/ml) y L-Arabinosa 0.2%, incubación a 30ºC durante 2 horas, posteriormente añadimos 5ml del cultivo de E.coli con el BAC correspondiente y con el plásmido pKD46. - Este cultivo se incuba a 30ºC hasta alcanzar una DO a 600nm de 0,5-0,6 momento en el cual se para el crecimiento mediante la incubación en hielo del cultivo durante 20 min. (A partir de este momento respetar la cadena de frío). - Las células se centrifugan y lavan dos veces con H 2 O estéril y una vez con glicerol al 10%. - Tras esto se centrifugan nuevamente y se resuspenden en 1 ml de glicerol 10% y se reparten en 4 alícuotas de 200 µl que se almacenan a - 80ºC. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 24 Para llevar a cabo la electrotransformación de las células que llevan uno de los BACs y el plásmido pKD46 con los sustratos de intercambio alélico, se siguió este protocolo: - Se mezcla: 150 µl BAC Rv092 + 5,27 µl pKD4 con los extremos de mrx1. 150 µl BAC Rv092 + 8,70 µl pKD4 control negativo. 150 µl BAC Rv280 + 4,09 µl pKD4 con los extremos de mrx2. 150 µl BAC Rv280 + 8,70 µl pKD4 control negativo. 150 µl BAC Rv308 + 4,65 µl pKD4 con los extremos de mrx3. 150 µl BAC Rv308 + 8,70 µl pKD4 control negativo. - Se pone la mezcla en cubetas de 0,2cm (Bio-Rad) preenfriadas a 4ºC. - Se les da un pulso (2,5kV, 25µF, 200Ω) en un GenePulser XcellTM (BioRad). - Las células se recogen en 900 µl de LB y se incuban 1 hora a 30ºC para que se lleve acabo la recombinación y se exprese la resistencia al antibiótico. - Se siembran en placa las distintas diluciones en placas petri con LB agar y el antibiótico correspondiente. 4.3 Siembra en placa Tras las 1 hora de incubación a 30ºC, se plaquean las células transformadas en medio sólido LB con el antibiótico correspondiente, Kanamicina (50mg/ml) y cloranfenicol (10mg/ml). En el caso de los controles se siembran en placa 100 µl del inóculo sin diluir. Como el proceso de recombinación homóloga se produce con una frecuencia muy baja, se siembra en placa todo el volumen, dividiéndose en 2 partes iguales y empleándose cada una de las partes para inocular una placa. También se preparan diluciones 10 -1 y 10 -2 del control positivo como de control negativo. Las placas se incuban a 37ºC, durante aproximadamente 2 días, hasta que aparecen las colonias de bacterias transformadas . Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se están realizando muchos estudios a nivel de estrés redox en la clase Actinobacteria, más concretamente en el género Mycobacterium, que presenta enfermedades virulentas para el hombre y animales, por ello el reciente descubrimiento de la micorredoxinas, esta planteando un reto importante para poder conocer mejor los mecanismos de los que se vale la bacteria para sobrevivir, y de alguna manera buscar su punto débil para poder combatirla. En este estudio hemos trabajado con cepas de E.coli DH10β que contenían los BACs Rv092, Rv280, y Rv308, cada uno de ellos conteniendo un gen de una micorredoxina de M. tuberculosis (Mrx1, Mrx2 ó Mrx3, respectivamente). El trabajo se puede dividir en varios pasos: 1. Comprobación de la presencia de los genes mrx en los BACs de E.coli, y electrotransformación del plásmido pKD46. 2. Amplificación del gen de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4 con los extremos con los extremos correspondientes a los genes mrx, para obtener los sustratos de intercambio alélico. 3. Introducción del sustrato de intercambio alélico en las células competentes que contienen el BAC y el plásmido pKD46. 4. Selección de las bacterias en las que el sustrato de intercambio alélico ha recombinado con el BAC. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 32 Para diseñar estos oligonucleótidos, de nuevo se utilizaron las secuencias de los tres genes mrx de M. tuberculosis que se obtuvieron de la base de datos Tuberculist (http://tuberculist.epfl.ch/). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 3 (sección Materiales y métodos). Para cada uno de los tres genes mrx de M. tuberculosis, en el diseño de los oligonucleótidos se siguieron estas pautas: 1) se seleccionaron 50 nucleótidos situados inmediatamente delante del codón de inicio de la traducción (para el oligonucleótido directo) y otros 50 nucleótidos situados después del codón de finalización de la traducción (para el oligonucleótido reverso). 2) a estas secuencias, se añadieron las secuencias correspondientes de las regiones P1 y P2, añadiéndose la región P1 al extremo 3’ de la secuencia del oligonucleótido directo, y la región P2 al extremo 3’ de la secuencia del oligonucleótido reverso. Las regiones P1 y P2 están presentes en el plásmido pKD4, que se va a utilizar como molde en la reacción de amplificación, y se encuentran flanqueando el gen de resistencia a la kanamicina. Con cada uno de estos tres pares de oligonucleótidos, se amplificó la región P1-gen de resistencia a kanamicina-P2 a partir del plásmido pKD4. Estos productos de PCR contienen en sus extremos 50 nucleótidos correspondientes a cada uno de los tres genes mrx de M. tuberculosis. Además, se realizó una amplificación adicional utilizando los oligonucleótidos que contienen solamente la secuencia de las regiones P1 y P2, sobre el mismo plásmido pKD4. En este caso, el producto de PCR contiene únicamente la región P1-gen de resistencia a kanamicina-P2, sin ningún nucleótido adicional en sus extremos. Este producto se utilizará como control negativo en las etapas posteriores de este trabajo. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 33 El resultado de las reacciones de PCR se observa en la siguiente figura: En todos los casos pudimos verificar que la amplificación del gen de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4 se había producido correctamente, porque se obtuvo un producto de 1577 pb. Los productos de amplificación se purificaron con el High Pure PCR Product Purification Kit (Roche), para ser utilizados en la etapa siguiente de este trabajo. Estos productos de amplificación serán los que se utilizarán posteriormente para llevar a cabo la recombinación homóloga y así reemplazar los genes mrx que están presentes en los BACs por una copia del gen de resistencia a la kanamicina. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 34 3. Introducción del sustrato de intercambio alélico en las células competentes que contienen el BAC y el plásmido pKD46. Una vez que se habían obtenido los sustratos de intercambio alélico para los tres genes mrx a partir del plásmido pKD4 (etapa 2), procedimos a introducir estos sustratos en las tres cepas de E. coli que contienen los BACs con los genes mrx de M. tuberculosis en las que a su vez habíamos introducido el plásmido pKD46, que contiene el gen de la recombinasa inducible por arabinosa (etapa 1). En primer lugar, cuantificamos la concentración de los productos de PCR, obteniendo estos valores: Producto PCR Concentración(ng/ml) 260/280 260/230 pKD4(Mrx1) 94,8 1,85 1,70 pKD4(Mrx2) 122,1 1,82 1,80 pKD4(Mrx3) 107,5 1,80 1,42 pKD4(P1P2) 57,5 1,83 1,75 Tabla 5. Datos obtenidos en el Nanodrop. Realizamos la electrotransformación de las tres cepas en las que se indujo la expresión de la recombinasa utilizando L-arabinosa. En la transformación se utilizaron un total de 8 µg de DNA de los productos de PCR obtenido sobre el plásmido pKD4. Para cada cepa se hicieron dos electrotransformaciones, utilizando en cada caso un producto diferente, que fueron: a) el producto de amplificación que contiene los extremos idénticos a las regiones que flanquean el gen mrx concreto que está presente en el BAC que posee la cepa. En este caso, es de esperar que se produzca la recombinación entre las regiones de 50 nucleótidos que flanquean el producto de PCR y las secuencias presentes en el BAC, dando como resultado neto la sustitución de la región codificante del gen mrx en el BAC por la secuencia codificante del gen de resistencia a kanamicina. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 35 Cuando esto suceda, dará lugar a la aparición de colonias resistentes a cloranfenicol y kanamicina. b) el producto de amplificación obtenido con los oligonucleóticos P1 y P2, como control negativo de la recombinación. En este caso, no se debería producir la recombinación, ya que no existen secuencias idénticas entre el producto de PCR y el BAC. Sin embargo, es probable que aparezcan algunas colonias resistentes a cloranfenicol y kanamicina (aunque en número menor a las obtenidas en el caso anterior), debidas a fenómenos de recombinación ilegítima. El resultado de estas electrotransformaciones se muestra en las figuras 19 y 20. Fig. 19. Placas de LB (Km+Cm), para Rv092∆mrx1::Km(pKD4) a la derecha, y a la izquierda la placa con su control negativo. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 36 Fig. 20. Placas de LB (Km+Cm), para Rv280∆mrx2::Km(pKD4) y Rv308∆mrx3::Km(pKD4), en esta ocasión se muestran las placas correspondientes a una dilución 10 -4 , debido al elevado número de colonias que se obtuvieron. En los resultados en placa en el caso de Rv092∆mrx1::Km(pKD4), se observa que el número de colonias que crecen en las placas de la electrotransformación realizada con el producto de PCR que lleva los extremos específicos del gen mrx1 es unas 10 veces superior a las colonias que crece en la placa de control negativo, solo lo pongo imagen en el caso de Rv092∆mrx1::Km(pKD4), porque era la que mejor se observaba. Las de Rv280∆mrx2::Km(pKD4) y Rv308∆mrx3::Km(pKD4),tuve que hacer diluciones para poder observar colonias aisladas. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 37 4. Selección de las bacterias en las que el sustrato de intercambio alélico ha recombinado con el BAC. La etapa final de este trabajo ha consistido en la caracterización de las bacterias recombinantes obtenidas en la etapa anterior. Esto se ha llevado a cabo mediante la técnica de PCR en la que los oligonucleótidos utilizados en las etapas anteriores del trabajo se han combinado con oligonucleótidos específicos del gen de resistencia a la kanamicina. De esta forma se ha verificado la sustitución de la secuencia codificante de los genes mrx1, mrx2 y mrx3, en los BACs Rv092, Rv280 y Rv308 respectivamente, por el gen de resistencia a kanamicina. Como observamos en la imagen, cada dos bandas es una colonia, amplificada con ambos juegos de oligos, se identifican claramente 3 colonias que amplificaron la resistencia a kanamicina, en el lugar donde debería estar el BAC de E.coli. Así que podemos concluir que por los menos 3 colonias de las seleccionadas llevaron acabo la recombinación homologa, siendo delecionado el gen mrx y sustituido por la resistencia a kanamicina. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 38 CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS Las micorredoxinas forman parte de un mecanismo fundamental para la supervivencia del bacilo, ya que le proporciona una regulación, que le permite lucha en condiciones de estrés oxidativo, que es lo que se encuentra durante la infección. Pero como todo mecanismo esta compuesto de muchos más componentes, del que las micorredoxinas forman parte pero aun se desconoce el papel que juegan todas las micorredoxinas, ya que por ahora se ha estudiado a fondo Mrx1 que parece ser muy importante en estrés redox, pero Mrx2, aun esta por determinar si realmente actúa como una micorredoxina o que papel tiene, y parece que incluso hay indicios de que puede ser un gen esencial para la célula, lo que complicaría, el bloquearlo en micobacterias, porque la bacteria no seria capaz de crecer. En el Mrx3 se sabe que esta, pero también quedan muchos estudios por realizar, porque se desconoce en que parte actúa esta micorredoxina, si esta dentro del mecanismo que hemos explicado, o actúa de manera independiente. En este trabajo hemos construido tres BACs recombinantes, en los que hemos sustituido respectivamente uno de los tres genes mrx que codifican micorredoxinas de M. tuberculosis, por un gen de resistencia a kanamicina. La etapa siguiente consistirá en amplificar estas regiones y trasladarlas directamente a Mycobacterium tuberculosis, con el objetivo de conseguir tres mutantes defectivos, cada uno de ellos, en uno de los genes que codifican micorredoxinas. Una vez que se consigan estos mutantes, se estudiará su fenotipo, en concreto su capacidad de respuesta frente al estrés oxidativo, y su capacidad para sobrevivir en el interior de células eucariotas. Con todo esto, se evaluará su posible utilidad como dianas para nuevos fármacos. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 39 En el caso de que alguno de estos genes pudiera ser esencial, como parece ser el caso de mrx2, está prevista una estrategia de análisis genético basada en la expresión condicional de los genes clonados en plásmido con promotores inducibles, que pueda verificar, en caso de que así sea, el carácter esencial de alguno de ellos. Queda aun mucho camino por recorrer en el estudio del mecanismo contra el estrés oxidativo que utilizan las micobacterias, porque seguramente hay componentes que desconocemos y que puede dar un vuelco a todo que tenemos estudiado hasta ahora. Aunque esto sin duda abre un abanico para la creación de posibles fármacos diana, porque como se ha mencionado anteriormente, la biosíntesis de MSH es única en Actinobacterias, y al estar ausente en humanos, es una vía que se podría usar para diseñar nuevas estrategias de control de esta enfermedad. Aproximaciones al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos en relación con los procesos de infección: Micobacterias, respuesta al estrés oxidativo. _______________________________________________________________________________________________ Mónica Jurado García 40 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Tortora, G., Funke, B., Case, C., Introducción a la Microbiología. 2007 [2] WHO. Global tuberculosis control 2012. Epidemiology, Strategy, Financing. World Health Organization. 2012. [3] Bhat, S.A., et al., The mechanism of redox sensing in Mycobacterium tuberculosis. Free Radic Biol Med. 2012 Oct 15;53(8):1625-41. 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