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V ehiculización de compuestos efectivos frente al virus de la hepatitis C (VHC) Trabajo fin de Máster Rafael Clavería Gimeno 24/06/2013 Directores: Olga Abián Franco Adrián Velázquez Campoy Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Universidad de Zaragoza Máster en Biología Molecular y Celular 2012-2013 Trabajo fin de Máster 2013 1 Índice Introducción…………………………………………………………………………………………….……2 Objetivos………………………………………………………………………………………………….….13 Materiales y métodos…………………………………………………………………………….….…14 Cultivos celulares. Síntesis y naturaleza de las nanopartículas. Monitorización de la entrada de AuNPs por espectroscopía. Monitorización de la entrada y la localización de las AuNPs por microscopía y citometría de flujo. Estudio competencia con Galactosa. Evaluación del metabolismo celular (cell titter). Monitorización de la formación de complejos CDγ-OAV por espectroscopía. Calorimetría isotérmica de titulación (ITC). Docking. Evaluación de la actividad antiviral de los complejos (luminiscencia). Resultados…………………………………………………………………………………………………..27 Estudio de la incorporación de AuNPs en diferentes tipos celulares: Estudio de la incorporación de AuNPs por espectroscopía. Estudio de la incorporación de AuNPs por citometría de flujo y la localización celular de las AuNPs incorporadas por microscopía. Inhibición de la entrada de AuNP-Gal en presencia de galactosa. Estudio de la interacción CDγ-compuestos antivirales y su actividad en cultivo celular: Monitorización de la formación de complejos por espectroscopía. Caracterización de la unión CDγ-OAVs mediante ITC. Docking Efecto de los complejos sobre la replicación de “HCV replicon system cells” y sobre la viabilidad celular. Discusión…………………………………………………………………………………………………….42 Conclusiones……………………………………………………………………………………….………48 Bibliografía………………………………………………………………………………………..………..49 Trabajo fin de Máster 2013 2 INTRODUCCIÓN La hepatitis C es una enfermedad infecciosa hepática producida por un virus, VHC, que afecta a más de 170 millones de personas en todo el mundo. En España tiene una prevalencia del 2% en la población. La principal vía de transmisión es la parenteral, aunque también están descritas la vía sexual y la transmisión vertical (en mujeres inmunodeprimidas) (Esteban, 2008). En la mayor parte de los casos el VHC provoca infecciones hepáticas crónicas, sin manifestaciones clínicas hasta fases tardías, que pueden evolucionar a cirrosis y hepatocarcinoma, siendo necesario un trasplante hepático. La magnitud del problema sanitario y social de esta infección es enorme, ya que conlleva un descenso en la esperanza de vida de los pacientes que la padecen y comporta un elevado coste social y económico cuando progresa hacia los estadios más avanzados de la enfermedad (Lauer, 2001; Hoofnagle, 2002). El hecho de que la regresión espontánea de la enfermedad sea algo excepcional, unido a que la mortalidad relacionada con enfermedades hepáticas es mayor en pacientes con hepatitis C crónica y a la elevada tasa de aparición de cirrosis y hepatocarcinoma en estas personas, hace necesaria la existencia de un tratamiento adecuado para la hepatitis C crónica (Garg, 2009; Sarrazin, 2010). De momento no existe vacuna para prevenir la infección, y el tratamiento más efectivo aunque inespecífico hasta hace poco, se basaba en la administración de interferón α-pegilado y ribavirina, con numerosos efectos secundarios y un bajo nivel de tolerancia en muchos pacientes (Neukam, 2009; Fried 2004). En los últimos años han sido aprobados dos fármacos telaprevir y boceprevir, y aunque se trata de dos fármacos muy efectivos, las resistencias en monoterapia aparecen apenas 10 días después del inicio del tratamiento, con lo que es necesaria su administración junto con el interferón y la ribavirina (Shang, 2013). La efectividad de este tratamiento oscila según el genotipo del virus (hay 6 diferentes), pero está lejos de ser la deseada para la gran mayoría de los casos. Existe, por lo tanto, una necesidad imperiosa de desarrollar nuevos tratamientos más eficaces, mejor tolerados, y aplicables a la mayor parte de los enfermos infectados. Para abordar el problema, en este trabajo se propone la utilización de nanopartículas (NPs) como vehículos portadores de potenciales compuestos antivirales (OAVs), previamente caracterizados en trabajos anteriores. Trabajo fin de Máster 2013 3 La idea es conjugar estos OAVs con ciclodextrinas (CDx) que posteriormente se utilizarán para funcionalizar las nanopartículas con estos complejos. El trabajo descrito a continuación se enmarca dentro de un proyecto FIS que lleva por título “Nanopartículas multifuncionales para el transporte y liberación selectiva de fármacos frente al virus de la hepatitis C (VHC)". El trabajo consta de dos bloques, por un lado, estudiar la captación de las nanopartículas por células en cultivo, y por otro lado, estudiar la interacción entre los compuestos antivirales y las ciclodextrinas y evaluar la actividad antiviral de los mismos antes y después de haberse formado dicho complejo. El siguiente paso natural, en un futuro, sería proceder a la funcionalización de las nanopartículas con los complejos estudiados que hayan resultado tener una actividad antiviral satisfactoria. Nanopartículas (NPs) En Biomedicina las nanopartículas (NP) representan una tecnología prometedora para el transporte y liberación de fármacos. Utilizando las amplias posibilidades de funcionalización que nos ofrece la superficie de las NP se puede pensar en diferentes estrategias de inclusión de fármacos en ellas de forma que los dirijan preferentemente al lugar donde ejercen su acción. Estas NP pueden ser funcionalizadas con diferentes biomoléculas: anticuerpos, péptidos, RNA, DNA y carbohidratos entre otros. Durante esta última década, el uso de NP inorgánicas como sistemas liberadores de fármacos y como marcadores moleculares se ha consolidado como una estrategia válida e interesante (Xu, 2006). Figura 1: Esquema de las posibilidades de tratamiento con AuNPs. Figura 1 Trabajo fin de Máster 2013 4 En este trabajo vamos a utilizar nanopartículas de oro (AuNP), que se están considerando un candidato muy atractivo para la liberación de diferentes fármacos en sus lugares de acción terapéutica (Paciotti 2004, Paciotti 2006). Las moléculas que portan pueden ser desde pequeñas moléculas de fármaco hasta biomoléculas de gran tamaño como proteínas, DNA o RNA. Las AuNPs tienen unas propiedades físico-químicas únicas para el transporte y liberación de fármacos. Primero, el core de oro es inerte y no es tóxico (Connor 2005); segundo, son baratas de fabricar, fáciles de sintetizar y funcionalizar; y tercero, su tamaño oscila entre 1-150 nm. Estos sistemas de liberación de fármacos proporcionan ventajas sobre el fármaco libre al mejorar la solubilidad, su estabilidad in vivo, su biodistribución o mejorando en algún caso su farmacocinética desfavorable. Incluso, dada la alta carga de fármaco que pueden llevar estos sistemas, se pueden utilizar como reservorios para una liberación controlada del fármaco, manteniendo el nivel del mismo dentro de la ventana terapéutica (Gibson 2007). Típicamente, los preparados químicos en solución de las AuNPs se llevan a cabo en presencia de agentes estabilizantes tiol (“capping molecules” o moléculas terminadoras de cadena) dado que la química del tiol es el método más popular por el que los ligandos se unen a la superficie de oro. Este “capping” o terminación conduce a la estabilización y limitación impidiendo el crecimiento descontrolado y la agregación de las AuNPs. (Mandal 2005). Por lo tanto, en un procedimiento de una sola etapa, sin necesidad de altas temperaturas de reacción, es posible obtener AuNPs monodispersas con grupos químicos en la superficie diferentes según la funcionalidad de la “capping molecule” seleccionada. Para la aumentar la vehiculización de estas nanopartículas al hígado se puede recubrir su superficie de pequeñas moléculas como glucosa y otros azúcares (Barrientos, 2003; De la Fuente, 2006). En este trabajo compararemos la entrada de dos tipos diferentes de nanopartículas, unas con su superficie bloqueada con Tris (AuNPTris) y otros funcionalizadas con galactosa (AuNPGal). Trabajo fin de Máster 2013 5 Virus de la hepatitis C (VHC) Estructura y genoma del VHC El virus de la hepatitis C es un virus envuelto perteneciente a la familia Flaviviridae, género Hepacivirus, con genoma de ARN monocatenario de polaridad positiva. La partícula vírica tiene un tamaño de 40-70 nm de diámetro, de simetría helicoidal y presenta una envoltura lipídica de doble capa, que envuelve la nucleocápsida. Su genoma de 9,6 kb, está constituido por dos regiones no codificantes (NCR) en cada uno de los extremos, y un único marco de lectura (ORF) que da lugar a una poliproteína de unos 3000 aminoácidos. Una vez es procesada la poliproteína, se obtienen tres proteínas estructurales (core, E1 y E2) y siete proteínas no estructurales (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). (Figura 2) Figura 2.- Estructura del genoma del virus de la hepatitis C (VHC). La poliproteína es segmentada por las proteasas virales y del hospedador para dar origen a las proteínas virales estructurales (core, E1 y E2) y las proteínas no estructurales NS2 a NS5B. El extremo 5’-NCR del genoma está muy conservado entre los distintos genotipos aislados del virus y presenta un lugar interno de entrada del ribosoma (IRES), que es esencial para la traducción independiente de Cap. Está compuesto por 4 dominios, que se designan de I a IV siendo los dominios I y II, esenciales para la replicación. Trabajo fin de Máster 2013 6 El extremo 3’-NCR consta de una región corta variable (poli U/UC con unos 80 nucleótidos) y una región casi invariable de 98 nucleótidos llamada cola X. Los elementos conservados son también esenciales para la replicación in vitro e in vivo. A continuación se explican brevemente las funciones de las proteínas virales que constituyen el genoma del virus: • Proteína core: es la que forma la nucleocápsida. Podría tener un papel importante en la replicación y en la morfogénesis de VHC. Interacciona con gotas lipídicas, y esto podría afectar al metabolismo de los lípidos, ocasionando el desarrollo de esteatosis hepática, frecuente en pacientes con Hepatitis C. • Proteínas de envuelta E1 y E2: están glicosiladas y forman un complejo no covalente que sería la unidad que forma la envoltura. Junto al core son los principales componentes de la partícula vírica. Estas dos proteínas se anclan a la envoltura lipídica que rodea la nucleocápsida e interaccionan con los glucosaminoglucanos de la membrana celular, participando en la unión inicial del virus al hepatocito, que es su principal célula diana. Los dominios transmembrana de E1 y E2, localizados en el extremo C-terminal, están implicados en la heterodimerización y tienen propiedades de retención del retículo endoplásmico. • Proteína p7: es un polipéptido de 63 aminoácidos esencial para la infección productiva in vivo. Forma oligómeros y tiene actividad de canal catiónico, por lo que es muy posible que pertenezca a la familia de las viroporinas, con un papel muy importante en la maduración y liberación del virus. Podría ser una buena diana antiviral. • NS2-3: es una cisteín-proteasa que corta entre las proteínas NS2 y NS3 durante el procesamiento de la poliproteína. Es esencial para que haya replicación in vitro e in vivo. La actividad catalítica reside en la mitad C-terminal de NS2 y el tercio N-terminal de NS3. Como todas las proteínas de VHC, se asocia con membranas intracelulares. Trabajo fin de Máster 2013 7 • NS4B: es una proteína de 27 kD que induce la formación de la red membranosa, pero su función no se conoce muy bien. La red membranosa (también llamada complejo replicativo) es una estructura que se forma durante la replicación del virus, compuesta por membranas del retículo endoplásmico y gotas lipídicas, donde el ARN viral se amplifica. • NS5A: es una fosfoproteína que puede encontrarse en dos formas, basalmente fosforilada o hiperfosforilada. Probablemente el estado de fosforilación modula la eficiencia de la replicación. • NS5B: es la ARN polimerasa-ARN dependiente (RdRp), es otra de las principales dianas antivirales. • NS3/4A: NS3 es una proteína fundamental para el ciclo de replicación del virus. Presenta un dominio con actividad serínproteasa y otro que actúa como helicasa. El dominio C-terminal presenta actividad ARN helicasa/NTPasa, desenrollando el molde de RNA durante la replicación del genoma y el dominio N-terminal posee actividad serina-proteasa, implicado en el procesamiento de la región codificadora de proteínas no estructurales. Una proteína viral accesoria, NS4A, actúa como cofactor de NS3 y regula alostéricamente la actividad enzimática uniéndose a la proteasa en la región N-terminal, provocando un cambio conformacional que reorganiza y reestructura el dominio N-terminal de NS3. Dicho cambio conformacional sitúa los tres residuos catalíticos (Asp81His57-Ser139) en la configuración óptima, de modo que la eficiencia catalítica aumenta enormemente, provocando que el sitio activo de NS3 esté muy expuesto al solvente (Manzanares, 2011). Además se ha identificado un marco de lectura alternativo en la región codificante de la proteína core, llamado ARF, en el genotipo 1a, que tiene el potencial de codificar una proteína de hasta 160 aminoácidos denominada ARFP o proteína F. En pacientes con Hepatitis C se han detectado anticuerpos y linfocitos T específicos de la proteína F, lo que sugiere que esta proteína se expresa durante la Trabajo fin de Máster 2013 8 infección del virus. Sin embargo, no es necesaria para la replicación in vivo o in vitro. Todavía se desconoce su función. Ciclo de replicación del VHC El virus puede circular en varias formas, es capaz de unirse a lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de muy baja densidad (VLDL), lo cual le facilita la entrada a la célula, utilizando los receptores para estas lipoproteínas (Agnello, 1999) o circular como virión (unido a inmunoglobulinas o libre). El VHC infecta únicamente a humanos y chimpancés, siendo los hepatocitos su principal célula diana. Pero, también puede infectar a linfocitos B, células dendríticas y otros tipos celulares, a través de diferentes receptores como CD81 (presente en la superficie de muchas células, incluidas los hepatocitos), el receptor LDL (LDLR) o el receptor de fagocito clase B tipo I (SR-BI). Figura 3: Dibujo de como se produce la infección y la replicación del VHC en el interior celular. Tanto CD81 como SR-BI son capaces de unir a E2, y son necesarios pero no suficientes para la entrada de VHC, lo que sugiere que se requieren otros factores específicos de hepatocitos para la entrada del virus. La claudina-1 se ha identificado como co-receptor, siendo esencial para la entrada de VHC en los hepatocitos y convierte a determinadas células no hepáticas, Trabajo fin de Máster 2013 15 bien distribuidas para que crezcan uniformemente en la base del frasco. Se incuban a 37 ºC en atmósfera de CO 2 . Obtención de células para la realización de los ensayos Tanto para los ensayos de monitorización de la entrada de AuNPs como para los estudios de determinación de la actividad antiviral de los complejos CDγOAVs, el medio empleado fue DMEN Completo con o sin G418, según el tipo celular y sin RF para que no hubiera interferencias en las medidas de absorbancia y fluorescencia. Una vez que tenemos las células desprendidas (descrito en el apartado anterior) se diluyen 5 veces el volumen de tripsina con DMEN y se centrifugan 5 minutos a 0,5 rcf. A continuación se elimina el sobrenadante y se resuspende el pellet en medio fresco DMEN sin RF hasta llevarlo a 40 ml y se procede a medir la concentración (Scepter ® Millipore) que debe de ser en torno a 7x10 4 celulas/mL. Para asegurarnos de la buena ejecución del ensayo, es necesario asegurarnos de que las células que estamos sembrando son viables, por lo que confirmamos la viabilidad celular por citometría (Muse Cell Analyzer), disponemos en un eppendorf 40 µL de nuestra suspensión celular con 160 µL del reactivo (Muse Count & Viability Kit) y lo introducimos en el citómetro. Esta suspensión de células se siembra en placas de 96 pocillos (100µl por pocillo, unas 7000 células) utilizando una pipeta multicanal, si se mide luminiscencia (Bright-Glo™ Luciferase Assay System de Promega) o citotoxicidad (Cell Titer 96® AQ ueous de Promega) las placas de 96 pocillos serán blancas o transparentes respectivamente. Se incuban durante 72 h a 37ºC en atmósfera 5% CO 2 . Síntesis y naturaleza de las AuNPs Las AuNPs se sintetizan mediante la reducción de una sal de oro con un agente reductor (NBH 4 o citrato) en presencia de un agente de recubrimiento orgánico (Templeton, 1999; De la Fuente 2005). La sal de oro se reducirá a oro (0) y se formará una cobertura orgánica de enlaces covalentes oro-tiol, o por interacciones iónicas. La purificación de las AuNPs se realizará mediante diálisis o filtración por centrifugado. A estas AuNPs se les incorporará un marcador de fluorescencia (TAMRA) que posibilite su seguimiento y otros azúcares para mejorar la biocompatibilidad Trabajo fin de Máster 2013 16 (Barrientos, 2003). Se dispuso de dos tipos de AuNPs diferentes: bloqueadas con TRIS, AuNPs TRIS, y funcionalizadas con galactosa, AuNPs GAL. Las AuNPs utilizadas en este trabajo fueron proporcionadas por Valeria Grazú del grupo de Jesús Martínez de la Fuente del Instituto de Nanociencia de Aragón (INA). La metodología detallada para la síntesis de las AuNPs está recogida en la bibliografía proporcionada. Figura 7.- Esquema-resumen de los pasos de la síntesis de AuNPs Monitorización de la entrada de las AuNPs por espectroscopía Preparación de las diluciones de AuNPs El primer paso es esterilizar las AuNPs, esto lo hacemos a través de un sistema de filtrado empleando un filtro de 0,22 µm de tamaño de poro y una jeringuillar de 1ml, todo ello en campana de flujo laminar y depositando las AuNPs resultantes en un eppendorf estéril y opaco para que la luz no afecte a la fluorescencia de las AuNPs. Tras la esterilización, el siguiente paso es determinar la concentración de las AuNPs estériles. La determinación de la concentración se realizó por espectroscopía utilizando el equipo Nanovue plus, que presenta la ventaja de que necesita una cantidad mínima de muestra, unos 4 µl. Para la determinación de la concentración se midió la absorbancia a 520nm, λ a la que se conoce el coeficiente de extinción molar (ε o ) de las AuNPs (ε o = 2,7.10 8 l/cm.M). Aplicando la ley de Beer-Lambert determinamos la concentración. Trabajo fin de Máster 2013 17 Una vez tenemos la concentración de cada tipo de AuNPs calculamos los volúmenes que necesitamos para preparar una disolución madre de 200 mg/mL de AuNP TRIS/GAL con DMEM completo con o sin G418 (según tipo celular) y sin RF. Después procedemos a la preparación de las demás por diluciones seriadas 1:2, teniendo la consideración de que hay que corregir la proporción de DPBS que lleva la disolución madre, por lo que las diluciones se hacen con DMEM + %DPBS (similar al volumen de AuNPs adicionado, puesto que las AuNPs van suspendidas en DPBS). Realización del ensayo En este ensayo vamos se utilizaron los tres tipos celulares: HeLa, Lunet y HuH5-2 con el fin de ver si existían diferencias en los niveles de internalización de las AuNPs en función del tipo celular. En la placa se sembraron aproximadamente 7000 cell/pocillo de los distintos tipos celulares. Una vez preparadas las disoluciones de los dos tipos de AuNPs añadimos 100 µl de la disolución pertinente a cada pocillo de la placa, tal y como indica el siguiente esquema: AuNPs (µg/ml) HeLa Control Sin cells Lunet Control Sin cells Huh5 - 2 Co ntrol Sin cells 200 AuNP 100 TRIS 50 0 200 AuNP 100 GAL 50 0 Figura 8.- Esquema de la disposición de las diferentes disoluciones en la placa tras el sembrado de las células para la ejecución del ensayo de monitorización de la entrada de AuNPs. Determinación de la entrada de AuNPs Las AuNPs están marcadas con TAMRA, un grupo fluorescente cuyo espectro de absorción presenta un pico a 520 nm. En consecuencia, para la monitorización de la entrada de las AuNPs en las células vamos a determinar la concentración de AuNPs presentes en el sobrenadante a diferentes tiempos: 0h, 24h, 48h y 72h. Trabajo fin de Máster 2013 18 Se determinaron los espectros de absorción (300-800nm, tomando medidas cada 2 nm) de las muestras a los diferentes tiempos utilizando el Lector MultiModal de Microplacas Synergy HT de Biotek (software Gen5™ Data Analysis). Con la finalidad de minimizar errores y evitar problemas asociados al desplazamiento de la línea base, no se determinó la concentración a partir de la absorbancia a una longitud de onda concreta, λ=520nm, sino a partir de la diferencia de absorbancia entre el pico y la línea base (para lo que se utilizó la absorbancia a λ=800nm). Una vez calculadas las diferencia de absorbancia entre el máximo del pico y la línea base para todas las muestras, y con el objetivo de minimizar posibles errores experimentales en el pipeteo, preparación de disoluciones… realizamos un ajuste por mínimos cuadrados a partir de los valores obtenidos de los diferentes controles (triplicados) a tiempo 0h, que nos permita establecer la pendiente de la curva de absorbancia frente a concentración teórica de AuNPs. Esto nos permite conocer la concentración real de AuNPs que había en la placa a la hora de comenzar el ensayo. Tras aplicar esta corrección, el descenso en la diferencia de absorbancia a tiempos cada vez mayores se asocia a un descenso en la concentración de AuNPs en el sobrenadante, y por lo tanto, a la internalización de las mismas en las células. Todas estas medidas se corrigen en base al ajuste por mínimos cuadrados y se comparan con el valor a tiempo 0 para determinar el porcentaje de AuNPs internalizadas. Una vez conocida la concentración de AuNPs a un tiempo “t” también podemos cuantificar la cantidad de AuNPs internalizadas en base a la diferencia con respecto al mismo valor a tiempo 0h. Al conocer el volumen de la muestra y el número aproximado de células (7000 células/pocillo) podemos hacer una estimación de la cantidad de AuNPs internalizadas por célula. Por último, con el fin de dar solidez y significación estadística a los datos obtenidos, es necesario calcular el error cometido en el tratamiento de los datos, puesto que al hacer triplicados de todas la muestras y utilizar el valor de la media para el tratamiento de datos posterior, va a llevar asociada una desviación y un error que es fundamental conocer. Todo el tratamiento de datos, la estimación del error y el diseño de gráficos se ha realizado utilizando el programa Origin7 (Scientific Graphing and Analysis software). Trabajo fin de Máster 2013 19 Monitorización de la entrada y la localización de las AuNPs por microscopía y citometría de flujo. Con el objetivo de validar el método descrito en el apartado anterior para seguir la internalización de las AuNPs en las células, monitorizamos el mismo proceso por citometría de flujo y microscopía confocal. La citometría de flujo permite determinar la fluorescencia que presentan las células como resultado de las AuNPs internalizadas, lo que nos permite observar y cuantificar la entrada de las AuNPs en las células. Por otro lado, la microscopía confocal nos proporciona la posibilidad de ver in situ la localización de las AuNPs en el interior de las células, gracias a la fluorescencia del TAMRA (tetrametilrodamina) que poseen las AuNPs, lo que resulta una prueba irrefutable de la internalización de las mismas en las células. En el caso de ambas técnicas, el primer paso es proceder a la incubación de las células (utilizaremos los 3 tipos celulares mencionados en el apartado cultivos celulares) con las AuNPs, para lo cual será necesario preparar una disolución de AuNPs en medio DMEM completo sin RF y con o sin G418 según el tipo celular. Las disoluciones preparadas tienen una concentración de AuNPs de 0,95 nM y 2 nM. En el caso del ensayo de microscopía se añaden 300 µl de cada disolución en los pocillos correspondientes (placas de 24 pocillos), en el ensayo de citometría se añaden 1000µl de las disoluciones correspondientes en cada pocillo(placas de 12 pocillos) de acuerdo con el esquema que se presenta a continuación: A continuación se incuban a 37ºC, 5%CO 2 , 95% de aire y 1 atm de presión, durante el tiempo correspondiente, en este caso vamos a analizar la entrada a los 30 min, 4 h y 24 h. Figura 9.-Esquema de la disposición de las disoluciones ensayadas en la incubación de las células con AuNPs. Trabajo fin de Máster 2013 20 Se incuban a 37ºC, 5%CO 2 , 95% de aire y 1 atm de presión, durante el tiempo al que se quiera estudiar la entrada, en este caso vamos a analizar la entrada a los 30 min, 4 h y 24 h. En el caso de la citometría de flujo, después de la incubación de las células con las nanopartículas se realizan una serie de lavados con 500 µl de DPBS en 3 ocasiones, se levantan las células de los pocillos donde estaban adheridas utilizando tripsina, siguiendo el protocolo descrito en el apartado cultivos celulares, y se introducen en el citómetro de flujo que nos proporcionará datos de la fluorescencia que presentan las células fruto de la entrada de AuNPs. Puesto que las AuNPs poseen un marcador fluorescente (TAMRA), no es necesario ningún tipo de marcaje. En cambio, el ensayo de microscopía sí necesita de un marcaje de actina. Tras la incubación se pasan los cubres a una placa nueva y se lleva a cabo el marcaje de la Phalloidina. Se realizan 3 lavados de las células con 500 µl/pocillo de DPBS previamente, antes de la adición de la adición de 500 µl/pocillo de una disolución de PFA () al 3% con la que se incuban las células durante 15 min. Se repiten los lavados con DPBS y un último con 500 µl de DPBS + 10µl de NH 4 Cl. A continuación las células se incuban durante una hora con Phalloidina-A488, diluida 1/200 en una solución de DPBS con BSA 1% y Sap 0,1%. Se lava primero con esta misma solución sin Phalloidina, en segundo lugar con DPBS con BSA 1%, y por último, con agua destilada. Finalmente las células ya marcadas se tiñen con DAPI y DRAQ5, utilizando mowiol como medio de montaje y se visualizan al microscopio confocal, pudiéndose distinguir y localizar las AuNPs en el interior de las células. Las concentraciones de AuNPs con las que trabajamos en este ensayo, unido a la variabilidad interindividual de cada célula en la internalización de las nanopartículas, no permite llevar a cabo una determinación cuantitativa de las AuNPs internalizadas mediante esta técnica de microscopía. Estudio de la competencia con galactosa Los ensayos para analizar la posible competencia de la galactosa con las AuNPs a la hora de su internalización en la célula son similares a los realizados para la monitorización de la entrada de las AuNPs por espectroscopía. La única salvedad es que el medio utilizado para preparar la disolución madre a partir de la cual se realizan las diluciones seriadas contiene una Trabajo fin de Máster 2013 21 concentración de galactosa 400mM (DMEM completo sin RF, con o sin G418 según el tipo celular y 400mM de galactosa). Las diluciones seriadas se hacen en proporción 1:4 utilizando el mismo medio sin galactosa, de tal forma que vamos a obtener concentraciones de galactosa de 400mM, 100mM, 25mM y 0mM (control). La galactosa utilizada para este ensayo es galactosa comercial de Sigma. En este ensayo la concentración de AuNPs va a ser similar para todos los pocillos, 100 µg/ml, puesto que queremos evaluar el efecto de la galactosa en la internalización de las AuNPs. Utilizaremos también como control una columna sin células que permita determinar los niveles de internalización (permite fijar el 0% de internalización, o lo que es lo mismo el 100% de AuNPs en el sobrenadante). Una vez preparadas las diferentes disoluciones, añadimos 100 µl de la disolución correspondiente a cada pocillo, tal y como indica el esquema recogido a continuación: Galactosa (mM) HeLa Control Sin cells Lunet Control Sin cells Huh5 - 2 Control Sin cells 400/200* AuNP 100 TRIS 25 (100 µg/ml) 0 400/200* AuNP 100 GAL 2 5 (100 µg/ml) 0 Figura 10.- Esquema de la disposición de las diferentes disoluciones en la placa tras el sembrado de las células para la ejecución del ensayo de monitorización de la entrada de AuNPs en competencia con galactosa. * En un segundo experimento se utilizó como máximo una concentración de 200mM de galactosa, porque en el primero se demostró que una concentración de 400mM de galactosa resultaba tóxica para las células en los tres tipos celulares diferentes. El seguimiento de la internalización fue similar al explicado anteriormente en el apartado monitorización de la internalización de AuNPs, se tomaron medidas a tiempos 0h, 24h, 48h y 72h, y se procedió a un análisis y procesamiento similar de los datos obtenidos. Trabajo fin de Máster 2013 22 Evaluación del metabolismo celular (Cell titter) Para estudiar la citotoxicidad, tanto de las AuNPs como de los complejos CDγ-OAVs, se determinaron los niveles del metabolismo celular de los cultivos tras 72h mediante el kit Cell Titer 96®AQ ueous de Promega. Se trata de un método colorimétrico que contiene sales de tetrazolio, MTS (2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carbo-anilida). Este método está basado en la escisión de la sal de tetrazolio a formazán en aquellas células metabólicamente activas gracias a la succinato-tetrazolio reductasa (Technical Bulletin CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay). El formazán es un producto coloreado, que puede cuantificarse mediante absorbancia a 490nm en un Lector Multi-Modal de Microplacas Synergy HT de Biotek (software Gen5™ Data Analysis) que informa del número de células metabólicamente activas con respecto a un blanco no tratado. Transcurridas las 72h de incubación, se añade a cada pocillo 20 µl de Cell Titer 96®AQ ueous (1:4) en DMEN completo con o sin G418 (según tipo celular) sin RF, y se incuban 3h a 37ºC, 5% CO 2 y 1 atm de presión. Transcurrido este tiempo se procede a medir la absorbancia a 490nm y 800nm (λ a la que no absorbe). La diferencia de estos valores de absorbancia es la que se compara con el blanco para determinar el porcentaje de metabolismo celular de nuestro cultivo, a fin de determinar la citotoxicidad del elemento estudiado. Monitorización de la formación de complejos CDγ-OAVs por espectroscopía Valoramos la posibilidad de seguir la formación de los complejos CDγ-OAVs por espectroscopía analizando los posibles desplazamientos y modificaciones que pudieran sufrir los picos característicos de los espectros de los diferentes OAVs al interaccionar con la CDγ. Todas las medidas y espectros descritos a continuación se realizaron con el equipo Cary 100Bio UV-Visible Spectophotometer Varian. En primer lugar, se estudiaron los espectros (250-800 nm) de los OAVs a diferentes concentraciones con el fin de ajustar el rango de concentración dentro del cual se podía estudiar las modificaciones del espectro de absorción y no dieran unos niveles de absorbancia exagerados o mínimos que lo impidiera. Se valoraron Trabajo fin de Máster 2013 23 rangos de concentración de los OAVs desde 0,01-1 mM, variando dentro de este rango entre unos compuestos y otros. Después de estudiar el espectro de los diferentes OAVs y determinar el rango de concentraciones a utilizar, se procedió a la formación de los compuestos. Para ello, se dispusieron en un eppendorf 100 µl de una disolución 10mM de CDγ con el volumen correspondiente de OAVs 20mM para dejarlo a la concentración final deseada, después se midieron los espectros a tiempo 0h, 2h, 24h permitiendo analizar la formación del complejo y la interacción de los dos elementos. Durante el tiempo entre las diferentes medidas las muestras permanecieron en agitación en un roller a temperatura ambiente. Los espectros obtenidos se compararon con el espectro del OAV en ausencia de CDγ previamente caracterizado. Calorimetría isotérmica de titulación (ITC) La Calorimetría Isoterma de Titulación es una técnica termodinámica que permite estudiar el calor de interacción entre dos moléculas. Al unirse o disociarse dos moléculas, se libera o se absorbe calor. La medida de este calor hace posible la determinación de las constantes de unión, la estequiometría de reacción y un perfil termodinámico de la reacción que incluye la variación de entalpía (∆H) y de entropía (∆S). En este trabajo se caracterizó el proceso de unión de las CDx y los diferentes compuestos inhibidores de la replicación del VHC, OAVs, adicionando de forma secuencial alícuotas de CDγ 1,8 mM a la celda de reacción que contiene 120µM de un tipo de OAV. El equipo utilizado fue el VP-ITC MicroCal. Los volúmenes adicionados en cada uno de los compartimentos del ITC para el estudio de la interacción de todos los OAVs fueron los siguientes: Celda Jeringa Lavado PBS 2194 µL 453,5 µL 2194 µL DMSO - 1,5 µL 6,6 µL OAVs (20mM) 6,6 µL - - CDγ (10mM) - 45 µL - Tabla 1: Volúmenes utilizados en los ensayos de ITC Trabajo fin de Máster 2013 24 El lavado debe tener la misma composición a excepción de los elementos que participan en la interacción. En el transcurso de la titulación, el calor disminuye o incrementa dependiendo de que la reacción de asociación macromolecular sea endotérmica o exotérmica. La medición directa observable en un experimento de ITC, es la entrada de potencia térmica dependiente del tiempo que se requiere para mantener temperaturas iguales en las celdas de referencia y de muestra. La celda de referencia contiene agua o buffer careciendo de la macromolécula. Durante la inyección de titulante hacia la celda de muestra, se mide el calor liberado o absorbido en la formación del complejo respecto a la celda de referencia. (Pierce, 1999; Freire, 1990). En el termograma obtenido, cada pico equivale a una inyección de OAVs y es proporcional a la cantidad de calor que interviene en la formación del complejo CDx-OAVs. Las medidas se llevaron a cabo en un Auto-iTC200 Isothermal Titration Calorimetry (MicroCal, GE Healthcare). Docking Las predicciones por docking de la unión de los diferentes OAVs a la CDγ se hicieron utilizando el programa CycloPredict, disponible online en el sitio web (http://interactions.cyclodextrin.net/web). Este sistema evalúa las diferentes posiciones del ligando y la CDγ y determina cual es la interacción más probable y de mínima energía. El programa va girando las moléculas en todas las dimensiones del espacio y cada 0,2 Å analiza los parámetros energéticos de esa interacción teniendo en cuenta múltiples variables como: la naturaleza de los diferentes átomos de las moléculas, las cargas, la movilidad de los enlaces, los parámetros de solvatación, las fuerzas de van del Waals, las fuerzas electrostáticas… Se extrajeron las formulas moleculares de los distintos OAVs de la base de datos PubChem y se enfrentaron a la CDγ mediante CycloPredict. Trabajo fin de Máster 2013 31 Estudio de la incorporación de AuNPs por citometría de flujo y su localización celular por microscopía confocal. A fin de validar el método anterior y verificar la posibilidad de monitorizar la internalización de las AuNPs por espectroscopía, así como también refrendar los resultados obtenidos por este método, se estudió el mismo fenómeno por citometría de flujo. Se compararon los niveles de entrada de ambos tipos de nanopartículas en los 3 tipos celulares. En primer lugar se evaluó la entrada en células Lunet tras 4 horas de incubación con las AuNPs obteniéndose los siguientes resultados: Figura 16: Gráficos de citometría de flujo con células lunet tras incubación durante 4 horas con ambos tipos de AuNPs con respecto a células no incubadas y entre ellas. Figura 17: Imagen de microscopía confocal de células lunet tras incubación de 4 horas con AuNPs. Trabajo fin de Máster 2013 32 Figura 18: Imagen de una célula lunet que ha incorporado AuNPs. Reconstrucción de ortogonal de un stack en Z de 10 planos diferentes. En segundo lugar, se siguió la entrada de AuNPs en células HeLa tras 4 horas de incubación, las muestras también se tiñeron y se observaron al microscopio. Las gráficas e imágenes resultantes se muestran a continuación. Figura 19: Gráficos de citometría de flujo con células HeLa tras incubación durante 4 horas con ambos tipos de AuNPs con respecto a células no incubadas y entre ellas. Trabajo fin de Máster 2013 33 Figura 20.- Imágenes de microscopia confocal de células HeLa tratadas com AuNPs e incubadas durante 4 h. Trabajo fin de Máster 2013 34 AuGalHeLa AuTrisHeLa AuGalLunet AuTrisLunet AuGalHuh AuTrisHuh 0 20 40 60 80 100 AuNP en sobrenadante (ug/mL) Tipo de Au y celula tras 24h de cultivo en presencia de Galactosa Au Tiempo cero Por último, se realizaron ensayos con células Huh5-2 para investigar la entrada de AuNPs. Las siguientes imágenes corresponden a dichos ensayos. Figura 21.- Gráfica de citometría e imágenes de microscopía confocal de células Huh5-2 tras incubación de 4 horas con AuNPs. Inhibición de la internalización de las AuNP-GAL en presencia de galactosa Con el fin de determinar si el mecanismo de entrada de las AuNP-TamraGal a las células es específico a través de sus receptores de galactosa, se procedió a evaluar la entrada de las nanopartículas en las células a una concentración fija de AuNP (100 µg/mL) en presencia de concentraciones crecientes de galactosa (0 mM, 25 mM, 100 mM y 200 mM). Dicha galactosa podría entorpecer la entrada al bloquear los receptores que utilizan las AuNP-Tamra-Gal para entrar a la célula, no siendo así en el caso de las AuNPTamra-Tris. AuGalHeLa AuTrisHeLa AuGalLunet AuTrisLunet AuGalHuh AuTrisHuh 0 20 40 60 80 100 Sin galactosa 25 mM galactosa 100 mM galactosa 200 mM galactosa AuNP en sobrenadante (ug/mL) Tipo de Au y celula tras 48h de cultivo en presencia de Galactosa Au Tiempo cero Trabajo fin de Máster 2013 35 AuGalHeLa AuTrisHeLa AuGalLunet AuTrisLunet AuGalHuh AuTrisHuh 0 20 40 60 80 100 Sin galactosa 25 mM galactosa 100 mM galactosa 200 mM galactosa AuNP en sobrenadante (ug/mL) Tipo de Au y celula tras 72h de cultivo en presencia de Galactosa Au Tiempo cero Figura 22.- Cada una de las gráficas recoge la concentración de AuNPs en el sobrenadante con respecto a la inicial a diferentes tiempos. Recogen datos de los tres tipos celulares y las dos AuNP diferentes con distintas concentraciones de galactosa en el medio de cultivo. Del mismo modo que en el apartado anterior, se descartaron posibles efectos citotóxicos y deletéreos de las concentraciones crecientes de galactosa con el kit Cell Titer 96®AQ ueous. Los resultados obtenidos se recogen en la siguiente gráfica. 0 50 100 150 200 60 65 70 75 80 85 90 95 100 %Metabolismo celular Concentración de AuNPs (ug/ml) Hela AuNPs Gal Hela AuNPs Tris Lunet AuNPs Gal Lunet AuNPs Tris Huh52 AuNPs Gal Huh52 AuNPs Tris Figura 23.- Porcentaje de metabolismo celular de los diferentes tipos celulares incubados con los dos tipos de AuNPs durante 72 h a concentraciones crecientes de galactosa representadas en el eje X. Como referencia para determinar el 100% se utilizaron los blancos de los ensayos que se habían tratado de una forma similar pero sin añadir galactosa. Trabajo fin de Máster 2013 36 Estudio de la interacción CDγ-OAVs y su actividad antiviral en cultivo celular Monitorización de la formación de complejos por espectroscopia Se estudiaron los espectros de 250 a 800nm de los OAVs a diferentes concentraciones en ausencia de CDγ y en presencia de la misma, a distintos tiempos, con la finalidad de ver si era posible evaluar la formación del complejo CDγ-OAVs por absorbancia, estudiando las variaciones y desplazamientos que sufrían los picos característicos del espectro. En este trabajo se evaluó la formación de complejos de 6 compuestos: OAV19, OAV20, OAV27, OAV28, OAV31 y OAV37. 200 300 0 1 2 3 Longitud de onda (nm) Absorbancia (U.A) OAV19-10mMCDxGamma CDGamma CD005OAV CD01OAV CD02OAV CD04OAV t24 CDGamma t24 CD005OAV t24 CD01OAV t24 CD02OAV t24 CD04OAV 200 300 400 0 1 2 3 Absorbancia (U.A) Longitud de onda (nm) OAV20-10mMCDxGamma CDGamma CD001OAV CD005OAV CD01OAV t24 CDGamma t24 CD001OAV t24 CD005OAV t24 CD01OAV 200 300 400 0 1 2 3 4 OAV 28-10mMCDxGamma T0 T2H Absorbancia (U.A) Longitud de onda (nm) Buffer 005OAV 01OAV 02OAV 04OAV 08OAV CDGamma CD005OAV CD01OAV CD02OAV CD04OAV CD08OAV 200 300 400 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 OAV 31-10mMCDxGamma (T0 T2H) Absorbancia (U.A) Longitud de onda (nm) CDGamma CD02OAV CD04OAV CD06OAV CD08OAV CD1OAV CDGamma CD02OAV CD04OAV CD06OAV CD08OAV CD1OAV Figura 24.- Espectros (250-800 nm) de los compuestos OAVs a diferentes concentraciones (0,01-1 mM), en ausencia de CDγ, y en presencia de CDγ transcurridas 2 horas de incubación. Caracterización de la unión CDγ-OAVs mediante ITC Se monitorizó la formación de los complejos de los 6 OAVs estudiados en este trabajo con CDγ mediante calorimetría isotérmica de titulación (ITC). A modo de ejemplo se muestran las curvas de titulación obtenidas y ajustadas de los compuestos: OAV19, OAV28 y OAV37. Trabajo fin de Máster 2013 37 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 -0,35 -0,30 -0,25 -0,20 -0,15 -0,10 -0,10 -0,05 0,00 0 20 40 Time (min) µcal/sec K 3895.88 ±9144.19 DeltaH -740.362 ±1293.02 N 1.65687 ±0.490266 HD -0.119629 ±0.509904 P0 0.120000 ±0 Asyr 1.80000 ±0 V0 0.200700 ±0 Molar Ratio kcal/mole of injectant OAV28 CDxGamma 25ºC 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 -1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0 100 200 K 6257.56 ±268.081 DeltaH -3194.66 ±136.274 N 1.05409 ±0.0254410 HD -0.401719 ±0.087743 P0 0.120000 ±0 Asyr 1.80000 ±0 V0 1.45340 ±0 Time (min) µcal/sec Molar Ratio kcal/mole of injectant OAV19 Figura 25.- Gráficas de ITC correspondientes a los compuestos OAV19 y OAV28 con CDγ. En la Tabla 4 se representan los datos termodinámicos (entalpías de unión y constantes de afinidad) obtenidos una vez realizado el ajuste de las curvas de titulación de los 6 compuestos. Compuesto Ka (M -1) ∆ ∆∆ ∆H (cal/mol) ∆ ∆∆ ∆G (cal/mol) -T∆ ∆∆ ∆S (cal/mol) OAV19 6257,56 -3194,66 -5387,14 -2192,48 OAV20 5540,25 530 -5312,1 -5842,1 OAV27 nd nd nd nd OAV28 3895,88 -740 -5095,1 -4355,1 OAV37 5368,46 -2768,23 -5292,69 -2524,46 Nota: Error relativo Ka: 20-25%; Error relativo ∆H: 5-10%. Tabla 4 .- Datos termodinámicos obtenidos tras el ajuste de la curvas de titulación de los experimentos de ITC de los compuestos OAVs con CDγ. Como ya se ha descrito en materiales y métodos, el ITC nos permite determinar de forma directa parámetros termodinámicos de unión como: K a y ∆H. ∆G se calcula a través de K a (∆G = -RT LnK a ) y -T∆S se calcula mediante la ecuación: ∆G = ∆H – T∆S. Trabajo fin de Máster 2013 38 En la ecuación ∆ ∆∆ ∆G = ∆ ∆∆ ∆H – T∆ ∆∆ ∆S, el término entálpico y entrópico nos proporcionan diferente información, mientras que el término entálpico hace referencia a las interacciones específicas que tienen lugar en el proceso, el término entrópico nos informa de las interacciones no específicas. De esta forma, para un proceso con ∆ ∆∆ ∆G negativo (o sea con energía favorable para que se produzca la interacción), y basándonos en el conocimiento de los parámetros ∆ ∆∆ ∆H o -T∆ ∆∆ ∆S, podremos determinar cuál de los dos es el que más contribuye a su valor negativo y qué tipo de interacciones son las que están dirigiendo la interacción. OAV19 -7000 -6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000 OAV19-CDxGamma cal/mol DGmenosRTLnKa DH menosTDS OAV20 -7000 -6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000 OAV20-CDxGamma cal/mol DGmenosRTLnKa DH menosTDS OAV27 -8000 -7000 -6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 OAV27-CDxGamma cal/mol DGmenosRTLnKa DH menosTDS OAV28 -6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 OAV28-CDxGamma cal/mol DGmenosRTLnKa DH menosTDS OAV37 -6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 OAV37-CDxGamma cal/mol DGmenosRTLnKa DH menosTDS Figura 26.- Representación gráfica de los parámetros termodinámicos de unión de los complejos CDγ-OAvs estudiados. En ellas se representa ∆G (verde), ∆H (rojo) y -T∆S (azul) en cal/mol. Trabajo fin de Máster 2013 39 Docking Utilizando el programa informático Cyclo Predict se evaluó las posibles posiciones en las que pudieran interaccionar el ligando y la CDγ. Se determinó la interacción más probable y de mínima energía. La tabla presentada a continuación recoge los resultados de dichas predicciones para los 6 OAVs estudiados en este trabajo. Compuesto ∆ ∆∆ ∆G(kcal/mol) Superficie interacción OAV19 -3,86 539,60 OAV20 -4,57 438,62 OAV27 -3,48 679,34 OAV28 -2,92 493,53 OAV31 -2,26 607,41 OAV37 nd nd nd Tabla 5.- Datos de ∆G y la superficie de interacción de la interacción más probable de los OAVs-CDγ según el programa Cyclo Predict, acompañados de una predicción gráfica de la interacción. *La interacción del OAV37 no se pudo predecir al no disponer de su fórmula química en la base de datos PubChem. Determinación de la actividad antiviral y citotoxicidad de los complejos OAVsCDγ a través de estudios celulares de replicación viral. Después de realizar los ensayos en los que se procedía a la incubación de las células (Huh 5-2) durante 72h a concentraciones crecientes de compuesto y de CDγ, se determinó la actividad luciferasa, proporcional a la tasa de la replicación del virus, con el fin de determinar la actividad antiviral de los diferentes OAVs a concentraciones crecientes de CDγ. También se analizó el metabolismo celular a las 72h con el fin de descartar posibles efectos citotóxicos de los compuestos y la Trabajo fin de Máster 2013 40 posibilidad de que la inhibición de la tasa de replicación viral fuera debida a una escasa supervivencia celular. Los valores obtenidos de la actividad luciferasa y metabolismo celular de los 6 OAVs en estudio, se representan en función de la concentración de compuesto. A modo de ejemplo, se muestran a continuación las gráficas que recogen los datos de la actividad antiviral de los compuestos OAV20 y OAV28. Figura 27.- Izquierda: Representación de la actividad luciferasa y del metabolismo celular respecto al cultivo no tratado, a concentraciones crecientes de diferentes compuestos OAVs sin CDγ (Negro) y en presencia de 50 µM de CDγ (Rojo), 100 µM de CDγ (Verde) y 200 µM de CDγ (Azul). Los porcentajes están calculados respecto a los controles no tratados. Las medidas se realizaron en experimentos repetidos por triplicado. Derecha: Representación de la actividad luciferasa en escala logarítmica. Mediante el ajuste de las curvas representadas en las gráficas anteriores se pueden determinar los valores EC50 y LC50 para los OAVs en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de cicldextrina. Estos valores aparecen recogidos en la Tabla 6. 1 10 100 0 20 40 60 80 100 OAV20 OAV20 CD γ50 OAV20 CD γ100 OAV20 CD γ 200 %Actividad de la replicación viral Concentración OAV20(uM) 0 20 40 60 80 100 0 1,82 3,75 7,5 15 30 60 120 0 20 40 60 80 100 OAV28 OAV28 CD γ 50mM OAV28 CD γ 100mM OAV28 CD γ 200mM % Actividad de replicación viral Concentración OAV (uM) 1 10 100 0 20 40 60 80 100 120 %Actividad de la replicación viral Concentración OAV28(uM) OAV28 OAV28CD50 OAV28CD100 OAV28CD200 0 20 40 60 80 100 0 1,82 3,75 7,5 15 30 60 120 0 20 40 60 80 100 OAV20 OAV20 CD γ 50mM OAV20 CD γ 100mM OAV20 CD γ 200mM % Actividad de replicación viral Concentración OAV (uM) Trabajo fin de Máster 2013 47 Figura 28: Esquema explicativo del margen terapéutico. Estos complejos se utilizarán posteriormente para unirlos a nanopartículas, combinando ambas partes de este trabajo, en la búsqueda de un tratamiento completamente eficaz para la hepatitis C que a día de hoy no existe. Trabajo fin de Máster 2013 48 CONCLUSIONES • Se ha validado un método para monitorizar la incorporación de AuNPs a las células mediante espectroscopía. • Las AuNP funcionalizadas con galactosa tienen una entrada menor que las AuNP bloqueadas con Tris, aunque se localizan en el interior celular, mientras que las no modificadas se adsorben a la superficie de la membrana plasmática. • No se ha podido determinar si la galactosa en el medio de cultivo compite con las nanopartículas modificadas con galactosa, ni el mecanismo por el que se produce su internalización. • Ha sido posible caracterizar la unión de los compuestos (OAVs) con actividad frente a la proteasa NS3 del VHC a CDγ mediante ITC y Docking, determinándose su constante de afinidad y parámetros termodinámicos. • Se ha conseguido mejorar la eficacia antiviral de los compuestos estudiados mediante la formación de complejos con ciclodextrinas. • En algún caso concreto, hemos sido capaces de rescatar algún compuesto que presentaba actividad antiviral in vitro, pero no en cultivo celular, mediante la formación de estos complejos. Trabajo fin de Máster 2013 49 BIBLIOGRAFIA Abian O, Neira JL, Velazquez-Campoy A. Thermodynamics of zinc binding to hepatitis C virus NS3 protease: a folding by binding event. Proteins. 2009;77(3):624-36. Abian O, Vega S, Neira JL, Velazquez-Campoy A. Conformational stability of hepatitis C virus NS3 protease. Biophys J. 2010;99(11):3811-20. Agnello V, Abel G, Elfahal M, Knight GB, Zhang QX. Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96(22):12766-71. Barrientos AG, de la Fuente JM, Rojas TC, Fernández A, Penadés S. Gold glyconanoparticles: synthetic polyvalent ligands mimicking glycocalyx-like surfaces as tools for glycobiological studies. Chemistry. 2003;9(9):1909-21. Bartenschlager R, Cosset FL, Lohmann V. Hepatitis C virus replication cycle. J Hepatol. 2010;53(3):583-5. Bartenschlager R. Hepatitis C virus replicons: potential role for drug development. Nat Rev Drug Discov. 2002;1(11):911-6. 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