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Abstract
Apo2L/TRAIL es un ligando mortal inductor de apoptosis vía extrínseca. Entre otras funciones, TRAIL, junto con FasL, son secretados asociados a exosomas y regulan la respuesta inmune. El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en el papel de TRAIL en los procesos de regulación del sistema inmune. Se analizó la expresión de este ligando mortal así como su secreción y la contribución de TRAIL expresado en superficie o secretado a la capacidad citotóxica de linfocitos T normales activados obtenidos a partir de sangre periférica antes y después de ser reestimulados, comparándolo con la expresión y secreción en células tumorales de estirpe hematológica. También se analizó el efecto que tiene la inhibición de la proteína VCP (valosin-containing protein) implicada en la secreción de exosomas en células de origen tumoral mediante el uso de un inhibidor específico, DeBQ. Por último, se generaron líneas celulares tumorales de estirpe hematológica provenientes de mieloma múltiple resistentes a TRAIL para profundizar en el estudio de los mecanismos de resistencia que las células tumorales desarrollan frente a este ligando mortal. Se vieron diferencias entre los patrones de expresión de TRAIL en superficie e intracelular entre la línea celular tumoral Jurkat y los linfocitos T normales activados (blastos T) así como entre las subpoblaciones de blastos T CD4+ y CD8+. Se observó que la contribución principal de los ligandos mortales a la citotoxicidad de los blastos T se realiza a través de su secreción asociada a exosomas, sin apenas contribución de los ligandos mortales de superficie. Por último se vio que el inhibidor de la proteína VCP DeBQ utilizado a dosis subtóxica fue capaz de inhibir la expresión de TRAIL en superficie en la línea celular tumoral Jurkat pero no en blastos T, indicando que el DeBQ podría inhibir los mecanismos de transporte de TRAIL a superficie. Finalmente, se vio que uno de los mecanismos de adquisición de resistencia a TRAIL en líneas hematológicas provenientes de mieloma múltiple fue la disminución de la expresión de DR5 (receptor pro-apoptótico de TRAIL) en superficie. Villalba Mouco, Vanessa; Martínez Lostao, Luis; Anel Bernal, Alberto
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1 UNIVERSIDADDEZARAGOZA FACULTADDECIENCIAS DepartamentodeBioquímica,BiologíaMolecularyCelular ProyectoMáster: ESTUDIODELAEXPRESIÓN,SECRECIÓNYMECANISMOS INDUCTORESDEAPOPTOSISDELOSLIGANDOSMORTALES ENCELULASHEMATOLÓGICAS Presentadopor: VanessaVillalbaMouco Directores: Dr.LuisMartinezLostao Dr.AlbertoAnelBernal
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3 UNIVERSIDADDEZARAGOZA DepartamentodeBioquímicayBiologíaMolecularyCelular D.LuisMartínezLostao,DoctorenMedicinayCirugíayProfesordelDepartamentode BioquímicayBiologíaMolecularyCelulardelaUniversidaddeZaragoza,yD.AlbertoAnel Bernal,DoctorenCienciasQuímicasyCatedráticodelDepartamentodeBioquímicay BiologíaMolecularyCelulardelaUniversidaddeZaragoza, CERTIFICAN: QueelProyectoMáster“ESTUDIODELAEXPRESIÓN,SECRECIÓNYMECANISMOS INDUCTORESDEAPOPTOSISDELOSLIGANDOSMORTALESENCELULASHEMATOLÓGICAS“,ha sidorealizadoporlaGraduadaenBiologíaVanessaVillalbaMoucoenelDepartamento deBioquímicayBiologíaMolecularyCelulardelaFacultaddeCienciasdelaUniversidad deZaragozabajosudirección,yquereúneasujuicio,lascondicionesrequeridaspara optaraltítulodeMásterenBiologíaMolecularyCelular. Zaragoza,Juniode2013 Fdo:D.LuisMartínezLostaoFdo:D.AlbertoAnelBernal
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i ÍNDICE 1.ANTECEDENTESYOBJETIVOS………………………………………………………………………………………1 2.INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………….3 2.1APOPTOSIS……………………………………………………………………………………………………….……….3 2.1.1Víaintrínsecadelaapoptosis………………………………………………………………………….…….4 2.1.2Víaextrínsecadelaapoptosis……………………………………………………………………….……...4 2.2TRAIL(Apo2L).……………………………………………………………………………………………….………….5 2.2.1TRAILysusreceptores…………………………………………………………………………….…………….6 2.2.2VíadeseñalizacióndeTRAIL……………………………………………………………………..…………..6 2.2.3FuncionesbiológicasdeTRAIL………………………………………………………………….……………9 2.2.3.1TRAILyregulacióninmune…………………………………………………………………….………….9 2.2.3.2TRAILyenfermedadesautoinmunes…………………………………………………….…….…..10 2.2.3.3TRAILeinmunovigilanciatumoral……………………………………………………….…….…….11 2.3MECANISMOSDESECRECIÓNDELIGANDOSMORTALES………………………….…….….……11 2.4EXOSOMASYVCP………………………………………………………………………………..…………...…….13 3MATERIALYMÉTODOS……………………………………………………………………………………..…….….16 3.1CULTIVOSCELULARES………………………………………………………………………………..……..…….16 3.1.1Líneascelulares……………………………………………………………………………………..……..…….16 3.1.1.1Congelaciónydescongelacióndecélulas…………………………………………………..…….16 3.1.1.2Determinacióndelaviabilidadcelular……………………………………………………………..17 3.1.2.GeneracióndelíneasresistentesaTRAIL……………………………………………………………17 3.1.3Aislamientodelinfocitosdesangreperiférica(PBLs)ygeneracióndeblastosT….18 3.1.3.1Ficoll………….…………………………………………………………………………………..……………....18 3.1.3.2GeneracióndeblastosT………………………………………………………………………………….18
ii 3.2ANÁLISISDELAEXPRESIÓNDETRAILENSUPERFICIEYTOTAL……………………….….……19 3.2.1ExpresióndeTRAILensuperficiemediantecitometríadeflujo……………….….………19 3.2.2ExpresióndeTRAILintracelularmediantecitometríadeflujo……………….….….……..20 3.3ENSAYOSDECITOTOXICIDAD………………………………………………………………….………….…..20 3.3.1CitotoxicidaddeblastosTsobrecélulasdiana………………………………………….….……..20 3.3.2CitotoxicidaddelossobrenadantesdeblastosT………………………………………..……….22 3.3.3Análisisdelamuertecelular.Citometríadeflujo………………………………………………..23 3.4ESTUDIODELAACCIÓNDELDeBQSOBREJURKAT,PBLsyBLASTOST…………………….24 3.4.1Determinacióndelaproliferacióncelular…………………………………………………………..24 3.4.2AnálisisdelaexpresióndeTRAILenlalíneacelularJurkatyenblastosT pretratadosconDeBQ……………………………………………………………………….……………………………25 3.5ANÁLISISESTADÍSTICO…………………………………………………………………………..……………….25 4RESULTADOS……………………………………………………………………………………………………………….27 4.1EXPRESIÓNDETRAILENLALÍNEACELULARJURKAT…………………………………….…………27 4.2EXPRESIÓNDETRAILENPBLs………………………………………………………………………………….28 4.3EXPRESIÓNDETRAILENLASSUBPOBLACIONESDEBLASTOSTCD4YBLASTOSTCD8. ……………………………………………………………………………………………………………………………………….29 4.4CITOTOXICIDADDELOSBLASTOSTYDESUSSOBRENADANTES…………………………….31 4.4.1CitotoxicidaddelosblastosTsininhibirlaexocitosisgranularylasecreciónde ligandosmortales(FasLyTRAIL)asociadosaexosomas………………………………………………….32 4.4.1.1CitotoxicidaddelosblastosT…………………………………………………………………………..32 4.4.1.2CitotoxicidaddelsobrenadantedelosblastosT..…………………………………………….33 4.4.2CitotoxicidaddelosblastosTinhibiendolaexocitosisgranularylasecreciónde ligandosmortales(FasLyTRAIL)asociadosaexosomas………………………………………………….33 4.4.2.1CitotoxicidaddelosblastosT…………………………………………………………………………..33 4.4.2.2CitotoxicidaddelsobrenadantedelosblastosT..…………………………………………….34
iii 4.5ESTUDIODELOSMECANISMOSDEACCIÓNDELDeBQENJURKAT,PBLsY BLASTOST…………….………………………………………..……………………………………………………..………35 4.6ANÁLISISDELAEXPRESIÓNDETRAILENCÉLULASJURKATYENBLASTOST PRETRATADOSAUNADOSISSUBTÓXICADEDeBQ………………………………………………………...38 4.7GENERACIÓNDESUBLÍNEASRESISTENTESATRAIL…………………………………………………39 4.7.1SublíneacelularH929resistenteaTRAIL..…………………………………………………………..39 4.7.1SublíneacelularMM1SresistenteaTRAIL..………………………………………………………..41 5DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………………………………….43 6CONCLUSIONES………………………………….……………………………………………………….………………50 7REFERENCIAS…………………………………………………………………..………………………………………….51
1 1.ANTECEDENTESYOBJETIVOS Losligandosmortalesestánimplicadosenlaregulacióndelsistemainmune.La principalcontribuciónenestosprocesossedebealligandomortalFasL/CD95Lmientras queelpapeldeTRAILnoestácompletamenteclarificado. EnnuestrogruposedemostróqueFasL(Martinez‐Lorenzoetal.,1996)yTRAIL (Martinez‐Lorenzoetal.,1998)seencuentranpreformadosintracelularmenteenlalínea celularJurkatyenloslinfocitosTnormalesactivados,yquesonsecretadosalexterior traslareactivacióndeestascélulasatravésdesuTCR.Estosligandosmortalesse secretabanmayoritariamenteasociadosaexosomasdeentre100‐200nmmanteniendo intactosupotencialcitotóxico(Martinez‐Lorenzoetal.,1999).Finalmenteseobservóque estosexosomasqueconteníanFasLyTRAILseencontrabanalmacenadosenlinfocitosT normalesactivados,dentrodeunoscompartimentosdenominadoscuerpos multivesiculares(MVB)(Monleónetal.,2001). Nuestrogrupotambiénharealizadounanálisisproteómicodelosexosomas liberadosporlascélulastumoralesJurkatydeloslinfocitosTnormalesactivados(Bosque, 2005)dondesehanencontradodiferenciasenelcontenidoproteicodeambos.Unade lasproteínasdiferencialesencontradasencélulasJurkatynoenlinfocitosTnormales activadoshasidoVCP(p97)(datosnopublicados).VCP,entreotrasmuchasfunciones, pareceestarimplicadaeneltráficovesicularylapresenciadeestaproteínaenlos exosomasdecélulasJurkat(ynodelinfocitosTnormalesactivados)hacesospecharque podríaestarinterviniendoenlasecrecióndeéstosencélulastumoralesynoencélulas normales. Porotraparte,comoyaessabido,elmecanismodeaccióndeTRAILesla induccióndelaapoptosisatravésdelavíaextrínsecatraslauniónasusreceptorespro‐ apoptóticosDR4yDR5enlascélulasdiana.TRAILescapazdeinducirlaapoptosisen diferentestiposcelularestumoraleshumanosperonoencélulassanasloquehacede estamoléculaunprometedoragenteantitumoral.Sinembargo,diversoscánceres humanossonresistentesalaaccióncitotóxicadeTRAIL.
2 ElpresentetrabajopretendeprofundizarenelpapeldeTRAILenlosprocesosde regulacióndelsistemainmuneparalocualsevaacomenzarporanalizarlaexpresiónde esteligandomortalasícomosusecreciónylacontribucióndeTRAILexpresadoen superficieosecretadoalacapacidadcitotóxicadelinfocitosTnormalesactivados obtenidosapartirdesangreperiféricaantesydespuésdeserreestimulados comparándoloconlaexpresiónysecreciónencélulastumoralesdeestirpehematológica. Tambiénsepretendeprofundizarenelestudiodelosmecanismosderesistenciaa lainduccióndeapoptosismediadaporTRAIL,paraloqueseintentarángenerarlíneas celularesdeestirpehematológicaresistentesaesteligandomortalparaanalizarcuáles sonalgunosdeesosmecanismosencélulastumoralessanguíneas. Losobjetivosdelpresenteestudioson: 1. AnalizarlaexpresiónensuperficieeintracelulardeTRAILenlinfocitosTnormales activadosobtenidosapartirdesangreperiféricaycompararsuexpresiónenlalínea celulartumoralJurkat. 2. AnalizarinvitroelpapeldeTRAILenlamuertecelularinducidaporloslinfocitosT normalesactivadostrassersometidosareactivación. 3. AnalizarinvitroelpapeldelaproteínaVCP(p97)enelmecanismodesecreciónde exosomasenlinfocitosTnormalesactivadosobtenidosapartirdesangreperiféricay enlalíneacelulartumoralJurkatmedianteelusodeDeBQ,uninhibidorespecíficode VCP(p97). 4. GenerarlíneascelulareshematológicasresistentesaTRAILmediantecultivo mantenidoenpresenciadeesteligandomortal. 5. AnalizarlosmecanismosmolecularesderesistenciaaTRAILenlaslíneascelulares hematológicasresistentesgeneradas.
9 2.2.3FuncionesbiológicasdeTRAIL SonvariaslasfuncionesbiológicasenlasqueselehaatribuidounpapelaTRAIL.A continuaciónsevanacomentaralgunasdeellasrelacionadasprincipalmenteconel sistemainmunitario. 2.2.3.1TRAILyregulacióninmune TRAILtieneunimportantepapelenlaregulacióndelarespuestainmuneyde hecho,esteligandomortalseexpresaenunaampliavariedaddecélulasinmunes dependiendosuexpresióndelestadodeactivacióndeestascélulas.Laexpresiónde Apo2L/TRAILesbajaenlasuperficiedePBLshumanosreciénextraídosperosuexpresión aumentaclaramenteduranteelprocesodegeneracióndeblastosT(célulasTactivadas) (Martinez‐Lorenzoetal.,1998).AunqueloslinfocitosTCD4+yTCD8+noactivados expresanDR4yDR5,ambossonresistentesalaapoptosismediadaporTRAIL.Sin embargo,siestoslinfocitosseactivanporIL‐2sevuelvensusceptiblesaTRAIL(Wendling etal.,2000;Mirandolaetal.,2004). TRAILestáimplicadoenlamuertecelularinducidaporactivación(AICD)delos linfocitosT(Martinez‐Lorenzoetal.,1998).LaAICDdeloslinfocitosTgeneradospor expansiónclonalesunmecanismoimplicadoenlahomeostasisdetodarespuesta inmunenormal.Esteprocesoesdependientedelaaccióndelosligandosmortales, especialmenteFasL(Dheinetal.,1995),perotambiénTRAILjuegaunpapelimportante enlaAICD.LaimplicacióndeTRAILenlaAICDfuesugeridaporMarstersycolaboradores (Marstersetal.,1996)quienesdemostraronquerAPO‐2Linducelamuertedelos linfocitosTperiféricossolodespuésdequeéstoshubiesensidosensibilizadosen presenciadeIL‐2.EstoessimilaralosrequerimientosdelainduccióndeAICDatravésde Fas/FasL,sugiriendoquesóloloslinfocitosTreactivadossonsensiblesalaeliminaciónpor apoptosis(Peteretal.,1997). EnpresenciadeIL‐2,launióndeApo2L/TRAILyFasLasuscorrespondientes receptoresinducelainhibicióndelaproliferacióndelinfocitosTactivadosmediadapor estainterleucina,envezdelamuertecelular(Bosqueetal.,2005).Elefectode
10 Apo2L/TRAILparecemenospotentequeeldeFasLcuandoseanalizanlaspoblacionesde linfocitosTactivadosdemaneraconjunta.Encambio,siseanalizanporseparado(CD4+y CD8+)seobservacomoApo2L/TRAILinhibeelcrecimientodelinfocitosTmediadoporIL‐ 2preferentementeenlasubpoblacióndeCD8+,induciendounarrestodelciclocelular enlafaseG2/M(Bosqueetal.,2005). TambiénsehadescritoinvivoqueTRAILjuegaunpapelimportanteenla homeostasisdelaslinfocitosTCD8+.Encondicionesnormales,laexpansióndelinfocitos TCD8+ocurregraciasalaayudadeloslinfocitosTCD4+.Comoconsecuenciadeesta primeraexpansióndelinfocitosT,segeneraunapoblacióndecélulasTCD8+memoria,la cualescapazdellevaracabounasegundaexpansiónclonalunavezsonreestimuladassin necesidaddelacooperacióndeloslinfocitosTCD4+.Sinembargo,loslinfocitosTCD8+ expandidosenausenciadelaayudadeloslinfocitosTCD4+sonincapacesdellevara cabounasegundaexpasiónclonalyloslinfocitosTCD8+dememoriaasígenerados muerentrassuactivaciónporunmecanismodependientedeTRAIL(Janssenetal.,2005; Schoenbargeretal.,2011) 2.2.3.2TRAILyenfermedadesautoinmunes Lasenfermedadesautoinmunessegenerandebidoalreconocimientoinapropiado deautoantígenosopordefectosenlaregulacióndelarespuestainmune.Losmayores protagonistasenestetipodeenfermedadessonloslinfocitosTautorreactivoslocuales soncapacesdeatacaralaspropiascélulasdelorganismoycausanunarespuestainmune patológicaenausenciadeinfección.LaseñalizaciónvíaTRAILpareceestarimplicadaen unaampliavariedaddeenfermedadesautoinmunesypuedesercapazdemodularlas enfermedadesautoinmunes.ApesardequelosratonesknockoutdeTRAILoTRAIL‐Rno desarrollanenfermedadesautoinmunesespontáneassíquesonmássusceptiblesa enfermedadesautoinmunesexperimentalmenteinducidas(Lamhamedi‐Cherradietal., 2003). Porotraparte,sehademostradoqueTRAILescapazdeinhibirenfermedades autoinmunesenvariosmodelosanimales(Anel&Martinez‐Lostao,2011).Enestos estudios,TRAILactúainhibiendolainflamación,inhibiendolaprogresióndelciclocelular
11 ylaproliferacióndeloslinfocitosTautorreactivos,oinhibiendolaproduccióndecitocinas y/oanticuerpos. 2.2.3.3TRAILeinmunovigilanciatumoral DesdesuprimeradescripciónseobservóqueTRAILinducíaapoptosisenuna ampliavariedaddecélulastumoralesperonoencélulasnormales,porloqueseconvirtió enunpotencialagenteantitumoral(Ashkenazietal.,1999).Dentrodelaterapia antitumoralbasadaenTRAILseempleandosprincipalesaproximaciones:1)usodeTRAIL recombinante;y2)usodeanticuerposagonistasdereceptoresproapoptóticosdeTRAIL (PARAs)(Ashkenazi,2008). Respectoasupapelantitumoralinvivo,estudiosenratonessugierenquelavíade Apo2L/TRAILtieneunpapelenlainmunovigilanciatumoral.Losratonesdeficientesen,ya seaTRAILoenmDR5(elúnicoreceptorortólogoderatóndeDR4yDR5humano) muestranunamayorsusceptibilidadalatumorogénesis(Jonhstoneetal.,2008).Muchos tumoresdesarrollandiversosmecanismosparaescapardelavigilanciaantitumoral medianteunprocesoconocidocomoinmunoselecciónoinmunoedición.Lascondiciones inflamatoriasquesegenerandurantetumorogénesispuedeinducirlaexpresióndeTRAIL porpartedelascélulasinmunesquesoncapacesdeinfiltrarseeneltumor(Cretneyetal., 2002),ejerciendotalvezunapresióninmunoselectivamaligna.Porestemotivo,es necesarioidentificarquetumorespuedensersensiblesalusodeterapiasbasadasen TRAIL,mediantelaidentificacióndebiomarcadorescelularespredictivos(Yangetal., 2010). 2.3.MECANISMOSDESECRECIÓNDELOSLIGANDOSMORTALES DurantelosestudiosdelaimplicacióndelosligandosmortalesenlaAICDse observóquelasecrecióndeFasLyTRAILsolublesqueseencuentranpreformadosse producetraslareestimulacióndeblastosTatravésdesuTCR(Martinez‐Lorenzoetal., 1996;Martinez‐Lorenzoetal.,1999).TantoFasLcomoTRAILsonliberadosalmediocomo proteínascompletas(sinproteolizar)yasociadosamicrovesículasde100‐200nmde diámetro(Martinez‐Lorenzoetal.,1999)(Figura2).
12 Figura2.Representaciónesquemáticadelasecrecióndelosligandosmortales(FasLyTRAIL)asociadosa exosomas(sg.AnelA.&Martinez‐LostaoL.RecentPatentsonInflamm.&AllergyDrugDiscov.(2011)). Estasmicrovesículassonliberadasalmediotraslareactivaciónycontienenun mayorvalorcitotóxicoquelasformasproteolizadas,sugiriendoquelaproteólisisactúa comounmecanismoderegulaciónnegativa(Martinez‐Lorenzoetal.,1999). Lasmicrovesículaspreformadasestánlocalizadasenunprincipiodentrode cuerposmultivesiculares(Martinez‐Lorenzoetal.,1999),similaresalasquese encuentranenlascélulaspresentadorasdeantígenos(APC),querecibenelnombrede exosomasyquecontienenlasproteínasdemembranacorrectamenteorientadas.El hechodequecontenganFasLyTRAILposicionadocorrectamenteindicaquetieneun procesodeformaciónsimilaraldelosexosomasquecontienenMHCIIdelascélulasAPC. Pocotiempodespuésdelareestimulación,loscuerposmultivesicularesmigran hacialamembranaplasmáticadelacélulaconlacualsefusionan,liberandolosexosomas internosintactos.Elmecanismodesecrecióndelosligandosmortalesunidosa microvesículasesmáseficienteyrápidoquelasformassolublesporsísolas.Estoes debidoaquelasmicrovesículascontienenunamenormovilidadquelasformassolubles
13 porloquesemantienelaconcentraciónlocalydeestemodoselimitalaacciónde inducirlamuertedemaneraautocrinayparacrinaalascélulasvecinasdurantela regulacióndelarespuestainmune(Martinez‐Lorenzoetal.,1999;Monleónetal.,2001). Porotraparte,enelcasodeFasLsehadescritolaexistenciadedistintas metaloproteasascapacesdeprocesarFasLexpresadoenlasuperficiededistintostipos celularesgenerandounaformasolubledeFasL(Mitsiadesetal.,1998,Kayagakietal., 1995).SinembargoelpapeldeestaformasolubledeFasLescontrovertido.Mientrasque enalgunoscasossehareportadoquelaformasolubledeFasLgeneradaescitotóxica (Powelletal.,1999),enotroscasosparecequeestaformasolublesuponeunmecanismo deregulaciónnegativadelacapacidadpro‐apoptóticadeFasLasociadoamembrana (Schneideretal.,1998;Tanakaetal.,1998). EnloreferenteaTRAILydadaslassimilitudesquemuestraendistintosaspectos conFasL,sepiensaquedebeexistirunametaloproteasaquepuedacortarTRAIL expresadoenlasuperficiecelularsinembargoporelmomentonosehaidentificadoesa metaloproteasaputativa.Enestesentido,sehadescritoqueadiferenciadeFasL,nose produceunaumentodeTRAILensuperficietraseltratamientoconinhibidoresde metaloproteasas(Marianietal.,1998),loquesuponequeTRAILnoseliberacomouna proteínasolubleencondicionesfisiológicas. 2.4.EXOSOMASYVCP Losexosomassonestructurasesféricasdeentre40y100nmdediámetro.La composiciónlipídicaparecesercomúnaladetodosellos,enriquecidosencolesteroly esfingomielina.Encambiolacomposiciónproteica(citoplasmáticaydemembrana)es variableydependedeltipodecéluladelaqueprocedaydelafunciónquetenga.Sehan descritomásde70proteínasasociadasaestasmicrovesículas,muchasdeellascomunes (entodoslosexosomas),perootrasespecíficasdelascélulasdeprocedencia(Bosque, 2005).Sepostulaquelacomposicióncomúnatodasestasestructuras,tantolipídica comoproteica,podríaactuarcomoseñaldesalidadelacélula;yquelasproteínas exclusivasdeprocedenciapodríadarlesfuncionesespecíficas(Stoorvogeletal.,2002), comopuedeserlacomunicacióncelulardurantelarepuestainmune.
14 Losexosomasseencuentranalmacenadosdentrodeuncompartimentocelular denominadocuerpomultivesicular(MVB)quedifieredelrestodecompartimentos,como puedenserlisosomasoendosomas.Elorigendeestecompartimentoesendosomalyla incorporacióndeproteínasprocede,biendelaregióntransdelaparatodeGolgiodel citoplasma(Stoorvogeletal.,2002). Sonmuchoslostiposcelularescapacesdeliberarestasmicrovesículas.Dentrodel sistemainmunitariosehandescritoestasestructurasenotrascélulas;célulasB(Raposo etal.,1996),célulasdendríticas(Zitvogeletal.,1998)ylinfocitosT(Martinez‐Lorenzo, 1999,Monleónetal.,2001).LaliberacióndeFasLyApo2L/TRAILenlasuperficiede microvesículaseselmecanismoprincipaldeaccióndelaAICDdeloslinfocitosT (Martinez‐Lorenzoetal.,1996;Martinez‐Lorenzoetal.,1998). VCPop97esunaATPasadetipoIIAAAquesecaracterizaporpresentardos dominiosATPasaAAAconservados(Neuwaldetal;1999).Esunaproteínaubicua, esencialymuyabundanteenlascélulas(representael1%delaproteínatotalcelular).Se hademostradoquejuegaunpapelimportanteen:1)degradacióndeproteínasde membranayproteínassecretorasmalplegadas;2)reensamblajedelamembranadel AparatodeGolgi;3)transportedemembranas;4)regulacióndelensamblajede miofibrillas;5)divisióncelular;6)formacióndeagregadosproteicosy,7)maduracióndel autofagosoma. Secreequeelampliorangodefuncionesderivadelahabilidaddedesplegar proteínasodesensamblarcomplejosproteicosperosedesconoceelmecanismoconcreto deaccióndep97(Choetal.,2011). Elanálisisproteómicodelosexosomasliberadostraslaactivacióndelascélulas JurkatdeterminóunaltocontenidodelaproteínaVCP.Porelcontrario,VCPnose encontróenelcontenidoproteicodelosexosomasliberadostraslareactivacióndelos blastosT(Datosnopublicados). Porotraparte,sehadesarrolladouninhibidorespecíficodeVPCdenominado DeBQ(Choetal.,2011).SehavistoqueesteinhibidordeVCPejerceunefectocitotóxico
15 diferencialsobrecélulastumorales,deduciendolaimportanciadelaproteínaVCPen tumoresysuusocomoposibledianaenterapiaantitumoral. DadoelpapelquedesempeñaVCPeneltráficovesicularylapresenciadeesta proteínaenlosexosomasdecélulasJurkat(ynodeblastosT)hacesospecharquepodría estarinterviniendoenlasecrecióndeestosencélulastumoralesperonoencélulas normales.
16 3.MATERIALYMÉTODOS: 3.1.CULTIVOSCELULARES 3.1.1Líneascelulares Paralarealizacióndeesteestudioseutilizaronlaslíneascelularestumorales humanas:1)Jurkat(leucemiaagudadecélulasT);2)H929(MielomaMúltiple);y3)MM1S (MielomaMúltiple). LosmediosdecultivoempleadosfueronRPMI1640(Gibco)suplementadoal5% consuerofetalbovino(SFB),conL‐glutamina2mMyconlosantibióticospenicilina(100 U/mL)yestreptomicina(100mg/mL)paralalíneacelularJurkat,yelmismomediopero suplementadoal10%consuerofetalbovinoparalaslíneascelularesMM1SyH929.Este mediosuplementadosedenominómediocompleto. Laslíneascelularessecultivaronaunadensidadde1,5‐2x105células/mL,enel casodeJurkat,ya2,5‐3x105enelcasodeH929yMM1S,enunincubador termostatizado(HeraeusCell)a37ºCenairesaturadodehumedadconun5%deCO2. Todaslasmanipulacionescelularesserealizaronencondicionesestérilesbajocampana deflujolaminarvertical(Telstar). 3.1.1.1Congelaciónydescongelacióndecélulas Laslíneascelularessealmacenaroncongeladasennitrógenolíquido.Paraellose centrifugaron6x106célulasa1.200rpmdurante5minutos.Despuésseeliminóel sobrenadanteylascélulasseresuspendieronen500μLdemediocompletoconun10% dedimetilsulfóxido(DMSO)ysetrasvasólasuspensióncelularavialesestérilesde congelación(Nunc).Losvialessecongelarona‐80ºCdurantelasprimeras24‐72horasy luegosetrasladaronauncontenedordenitrógenolíquidodondesealmacenaronhasta suutilización. Paraladescongelacióndelascélulas,sedejóatemperarelvialdecongelaciónbajo campanadeflujolaminar,seleañadió1mLdemediocompletoysetrasvasóauntubo Falcon quecontenía10mLdelmismomedio.Lascélulassecentrifugarondurante5
17 minutosa1.200rpm,sedecantóelsobrenadante,elpellet seresuspendióen5mLde mediocompletoysetrasvasóaunfrascodecultivoqueseincubóa37ºCenairesaturado dehumedadconun5%deCO2.Enlosdíassucesivossecontrolóladensidadde crecimientocelularhastaestablecerladensidadnormaldemantenimiento(1,5‐2x105 células/mLenJurkaty2,5‐3x105células/mLenH929yMM1S). 3.1.1.2Determinacióndelaviabilidadcelular ParadeterminarlaviabilidadcelularserealizólatinciónconazulTrypan,colorante quetiñeelinteriordelascélulasmuertas,lascualeshanperdidosuintegridadde membrana.Paraelcontajesemezclaron50μLdesuspensióncelulary50μLdesolución azuldeTrypan(azulTrypanal0,4%enNaCl0,15M).Estamezclasedepositósobreun hemocitómetroyserealizóelcontajecelularconunmicroscopioóptico(Optiphot, Nikon). Laviabilidadcelularseevaluóconsiderandoelporcentajedecélulasnoteñidas (viables)respectoalnúmerototaldecélulas. Ladensidadcelularsedeterminóatravésdelasiguientefórmula: DC:Densidadcelular 104:Ajustedeltamañodelacámara Factordedilución:2,almezclar50ml+50ml. 3.1.2GeneracióndelíneasresistentesaTRAIL SeintentarongenerarsublíneascelularesresistentesaTRAILapartirdelaslíneas celularesH929yMM1S.Paraello,sesembraronambaslíneascelularesauna concentraciónde3x105cel/mLenplacasde6pocillosyselesfueañadiendodosis crecientesdeTRAIL,empezandoconunaconcentraciónsubtóxicade200ng/mLenelcaso deH929yde100ng/mLenelcasodeMM1S.Laseleccióndecélulasvivasserealizópor
18 centrifugaciónabajavelocidad(600rpm)yunavezobtenidas,sevolvieronacultivaren presenciadeTRAILalasconcentracionesanteriormentemencionadas. 3.1.3Aislamientodelinfocitosdesangreperiférica(PBLs)ygeneracióndeblastosT Seaislaronlinfocitosprocedentesdesangreperiférica(PBLs:PeriphericalBlood Cells)mediantecentrifugaciónengradientedeFicolldesangretotalheparinizadade donantessanosobtenidadelHospitalLozanoBlesa. 3.1.3.1Ficoll LatécnicadeFicoll‐Hypaqueesunmétododecentrifugaciónporgradientede densidadparasepararlinfocitosdelrestodecélulassanguíneas. Lasangretotalrecibidasediluyóenproporción1:1entampónPBS(tampón fosfatosalino:NaCl,K2HPO4,KH2PO4),sedepositósuavementesobreelreactivoFicoll‐ Hypaque(GHHealthcare)enunaproporción2:1(sangrediluida:Ficoll‐Hypaque)yse centrifugóa1.200rpmsinfrenoatemperaturaambientedurante20minutos. Posteriormente,serecolectólacapadePBLsyselavaroncontampónPBSpara eliminarplaquetasyrestosdeFicoll‐Hypaque.Traslavarlascélulasseresuspendieronen RPMI1640con10%deSFBdecomplementado(sometidoaunbañode56ºdurante30 minutosparainactivarelcomplemento).Estemediosedenominómediocompleto decomplementado. Setomóunaalícuotaparadeterminarlaconcentraciónyviabilidadcelular mediantetinciónconazulTrypan. 3.1.3.2.GeneracióndeBlastosT ApartirdelosPBLssegeneraronlinfocitosTactivados(blastosT).Paraello,los PBLssecultivaronaunadensidadde2x106células/mLcon5μg/mLde fitohematoaglutinina(PHA)enRPMI1640completoal10%deSFBdecomplementado durante24horas.Luego,seeliminólaPHAlavandolascélulasconmediocompleto decomplementadoylascélulassepusieronencultivoaunadensidadde2x106células/mL enmediocompletodecomplementadoalqueseleañadieron30UI/mLdeinterleucina2
25 termostatizadoa37ºCdurante24h.Transcurridoestetiemposeañadióacadapocillo10 μldeunadisolucióndeMTT(5mg/ml).Lascélulasseincubaron3horasa37ºCenelcaso delalíneacelularJurkatodurantetodalanocheenelcasodelosblastosT.Transcurrido estetiempoloscristalesdeformazánformadossedisolvieronañadiendoacadapocillo 100μldeisopropanolyagitandoenunaplacavibradora.Semidiólaabsorbanciadelos pocillosa550nmenunlectordeplacas(MR5000,Dynatech)frentealosblancos apropiados(mediodecultivosometidoalmismoprocedimientoqueloscultivos celulares).Losresultadossepresentaroncomoporcentajedecrecimientodelascélulas expuestasalasdistintasconcentracionesdeDeBQfrentealcontrol,constituidoporlos cultivossinDeBQ. 3.4.2AnálisisdelaexpresióndeTRAILenlalíneacelularJurkatyenblastosT pretratadosconDeBQ. TrascalcularladosissubletaldeDeBQparalalíneacelularJurkatylosblastosT,se analizólaexpresióndeTRAIL(extracelularytotal)paraestudiarelposibleefectodeDeBQ enlainhibicióndeltráficovesicular.Paraelloserealizóelanálisisdelaexpresiónde TRAILmediantecitometríadeflujocomosedescribeenelapartado2. 3.5.ANALISISESTADÍSTICO Paratodoslosestudiosdecomparaciónentrevariablescuantitativashasido aplicadoeltestdelatdeStudent.Losdatosquesemuestrancorrespondealamedia± errorestándartípico(SEM). Entodosloscasos,sehaconsideradocomosignificativamenteestadísticounvalor dep<0,05.LosdatosestadísticoshansidoanalizadosusandoelsoftwareSPSSfor WindowsRelease15.0(SPSSInc.). EnlaFigura4 semuestraunesquemarepresentandoelprocedimiento metodológicocompletodelosexperimentosrealizadosenblastosTenelpresente trabajo.
26 Figura4.EsquemageneraldelprocedimientocompletoempleadoenlosensayosrealizadosenblastosT. Marcaje TRAIL por citometría de flujo CITOTOXICIDAD DE BLASTOS FRENTE A JURKAT Centrifugación en gradiente de Ficoll Generación de Blastos T (PHA más IL-2/48h/6dias) Reestimulación con PMA e IONOMICINA SOBRENADANTE BLASTOS T Marcaje CTG CITOTOXICIDAD DEL SOBRENADANTE FRENTE A JURKAT
27 4.RESULTADOS: 4.1EXPRESIÓNDETRAILENLALÍNEACELULARJURKAT SeestudióelpatróndeexpresióndeTRAILenlalíneacelularJurkatencondiciones basalesytraslaestimulaciónconPHAdurante5minutos(5min),1hora(1h)y7horas (7h).Traslostiemposdeestimulaciónindicados,laPHAseeliminólavandolascélulas3 vecesconPBSytrascurrida1hora,serealizóelmarcajetalycomoseindicaen MaterialesyMétodosparaanalizarlaexpresióndeTRAILmediantecitometríadeflujo. Losdatossemuestranenunidadesarbitrarias(UA)defluorescenciaysonlos obtenidostrasrestaralafluorescenciamediadelmarcajedeTRAIL(fluorescencia específica),lafluorescenciamediadelmarcajedelcontroldeisotipo(fluorescencia inespecífica). LaexpresiónbasaldeTRAILensuperficiefuede1,02UAyaumentóhasta3,93UA alestimulardurante5minconPHAincrementándosehasta4,52UAtras1hde estimulaciónparavolveradescendera2,90UAalas7hdeestimulación(Figura5y6). MEDIA ±SEM Superficie sinPHA 1,02 ±0,32 PHA5min 3,93 ±0,84 PHA1h 4,52 ±1,17 PHA7h 2,90 ±1,32 Total sinPHA 5,28 ±1,62 PHA5min 9,68 ±1,72 PHA1h 8,47 ±2,82 PHA7h 3,05 ±2,13 0 2 4 6 8 10 12 sin PHA PHA 5 min PHA 1 h PHA 7 h Fluorescencia media (U.A.) Expresión de TRAIL (Jurkat) TRAIL superficie TRAIL total * * n = 6 * Figura5.GráficaquerepresentaelpromediodelaexpresióndeTRAILensuperficie(blanco)yla expresióndeTRAILtotal(gris)enlalíneacelularJurkat,estimuladaadistintostiemposconPHA(sin estimular,estimulaciónde5min,de1hyde7h).Enlatabladeladerechasemuestranlosdatos numéricosdelagráfica(mediadelporcentaje±SEM).*p<0,05.
28 ElnivelbasaldeexpresióndeTRAILtotal(sumadelaexpresióndesuperficieyla intracelular)fuede5,28UAaumentandoa9,68tras5mindeestimulaciónconPHA manteniéndoseenvaloressimilares(8,47UA)cuandoseestimulódurante1h.Trasuna estimulaciónde7h,seobservaunamarcadadisminucióndelafluorescencia,pordebajo delosnivelesbasales,alcanzandounvalorde3,05UA. 4.2EXPRESIÓNDETRAILENPBLs SeanalizólaexpresióndeTRAILenPBLsreciénaisladodesangreperiférica.La expresióndeTRAILtantoensuperficiecomototalenPBLsfuemínimatalycomosehabía descritopreviamente(Martinez‐Lorenzoetal.,1998;Jeremiasetal.,1998).Solamente enlosblastosTgeneradosapartirdeestosPBLsaumentalaexpresióndeTRAIL fundamentalmenteanivelintracelular(Figura7). control IgG TRAIL sin PHA TRAIL PHA 5 min. TRAIL PHA 1 h. TRAIL PHA 7 h. Expresión de TRAIL (superficie) Expresión de TRAIL (total) TRAIL Counts Figura6.ExpresióndeTRAILensuperficieytotalenlalíneacelulartumoralJurkat analizadomediantecitometríadeflujoadistintostiemposdeestimulaciónconPHA(sin estimular,estimulaciónde5min,de1hyde7h).Histogramascorrespondientesaun experimentorepresentativo.
29 4.3EXPRESIÓNDETRAILENLASSUBPOBLACIONESDEBLASTOSTCD4YBLASTOSTCD8 ElanálisisdelaexpresióndeTRAILenblastosTserealizóenlassubpoblacionesde linfocitosT,CD4+yCD8+. LaexpresiónbasalensuperficiedeTRAILenblastosTCD4+fuede0,25UA aumentandohastaunvalormáximo1,48UAa5minconelestímulodePHAparavolvera descendera0,70UAtras1hdeestimulación(Figura8). Encambio,losnivelestotalesdelaexpresióndeTRAILexperimentaronun aumentoprogresivosiendode1,23UAenblastosTCD4+sinestimular,de1,60UAtras serestimuladosdurante5minyde2,55UAtras1hdeestimulaciónconPHA(Figura8). Figura7.ExpresióncomparadadeTRAILensuperficieytotaldePBLsydeblastosT, analizadomediantecitometríadeflujoadistintostiemposdeestimulaciónconPHA(sin estimular,estimulaciónde5min). control IgG TRAIL sin PHA (PBLs) TRAIL PHA 5 min. (PBLs) TRAIL PHA sin PHA (blastos T) TRAIL PHA 5 min. (blastos T) TRAIL Counts TRAIL Counts Expresión de TRAIL (superficie) Expresión de TRAIL (total)
30 LaexpresióndeTRAILenblastosTCD8+siguióunpatróndistintoaldeblastosT CD4+(Figura9).ElmayorvalordeexpresióndeTRAILensuperficiesedioenlasblastosT CD8+sinestimular,siendode0,28UA,descendiendoavaloresnegativos(‐0,2UAtras 5mindeestimulación),oprácticamentenulos(0,05UAtras1hdeestimulación).En cambio,laexpresióndeTRAILtotalfuemáximaalos5mindeestimulaciónconPHA alcanzandounvalorde1,83UAdescendiendoa1,05UAtras1hdeestimulación(Figura 9). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 sin PHA PHA 5 min PHA 1h Fluorescencia media (U.A.) Expresión de TRAIL (blastos T CD4+) TRAIL superficie TRAIL total n = 4 MEDIA ±SEM Superficie sinPHA 0,25 ±0,30 PHA5min 1,48 ±0,54 PHA1h 0,70 ±0,43 Total sinPHA 1,23 ±0,87 PHA5min 1,60 ±0,64 PHA1h 2,55 ±1,27 Figura8.Gráficaquerepresentael promediodelaexpresióndeTRAILensuperficie(blanco)yla expresióndeTRAILtotal(gris)enlasubpoblacióndeblastosTCD4+,estimuladosadistintos tiemposconPHA(sinestimular,estimulaciónde5minyde1h).Enlatabladeladerechase muestranlosdatosnuméricosdelagráfica(media±SEM). MEDIA ±SEM Superficie sinPHA 0,28 ±0,59 PHA5min ‐0,20 ±0,64 PHA1h 0,05 ±0,36 Total sinPHA 0,60 ±0,32 PHA5min 1,83 ±1,30 PHA1h 1,05 ±0,71 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 sin PHA PHA 5 min PHA 1h Fluorescencia media (U.A.) Expresión de TRAIL (blastos T CD8+) TRAIL superficie TRAIL total n = 4 Figura9.GráficaquerepresentaelpromediodelaexpresióndeTRAILen superficie(blanco)yla expresióndeTRAILtotal(gris)enlasubpoblacióndeblastosTCD8+,estimuladosadistintos tiemposconPHA(sinestimular,estimulaciónde5minyde1h).Enlatabladeladerechase muestranlosdatosnuméricosdelagráfica(media±SEM).
31 EnlaFigura10semuestranloshistogramasdelmarcajedeTRAILensuperficiey totaldeambassubpoblacionesdeblastosTcorrespondientesaunexperimento representativo. 4.4CITOTOXIDADDELOSBLASTOSTYDESUSSOBRENADANTES. SeanalizólacapacidadcitotóxicadelosblastostotalesreestimuladosconPMAe inomicinafrenteacélulasdiana(líneacelularJurkat)inhibiendoysininhibirlos mecanismosdeexocitosisgranularysecrecióndeligandosmortalesasociadosa exosomas. Además,lossobrenadantesderivadosdelareestimulacióndeblastosfueron recolectadosyseenfrentaronantelamismalíneacelularparaevaluartambiénsu capacidadcitotóxica. Expresión de TRAIL (superficie) Expresión de TRAIL (total) TRAIL Counts Blastos T CD8+ control IgG TRAIL sin PHA TRAIL PHA 5 min. TRAIL PHA 1 h. Expresión de TRAIL (superficie) Expresión de TRAIL (total) BlastosT CD4+ TRAIL Counts Figura10.ExpresióndeTRAILensuperficieytotaldeblastosTCD8+analizadomediantecitometría deflujoadistintostiemposdeestimulaciónconPHA(sinestimular,estimulaciónde5miny estimulaciónde1h).Histogramascorrespondientesaunexperimentorepresentativo.
32 4.4.1CitotoxicidaddelosblastosTsininhibirlaexocitosisgranularylasecreciónde ligandosmortales(FasLyTRAIL)asociadosaexosomas. 4.4.1.1CitotoxicidaddelosblastosT Cuandonoseinhibelaexocitosisgranularnilasecrecióndeligandosmortales asociadosaexosomasseobservaque,tantolosblastosnoreactivadoscomoreactivados soncapacesdeinducirlamuertedelascélulasJurkat,aunquelareactivaciónconPMAe ionomicinaaumentalacapacidadcitotóxicadelosblastosTsiendoelporcentajede célulasdianamuertasAnnVpositivasaproximadamentedeldoblecuandoéstasse enfrentanablastosTreactivados(Figura11). 1,73 86,6 2,73 8,61 0,32 72,4 3,46 23,8 0,40 39,9 3,03 56,7 0,40 67,0 2,79 29,0 0,45 45,1 2,43 52,1 Anexina V 7-AAD Jurkat Blastos T sin reactivar : Jurkat (5:1) Blastos T reactivados : Jurkat (5:1) Blastos T sin reactivar : Jurkat (10:1) Blastos T reactivados : Jurkat (10:1) 11,79 9,13 26,50 22,90 20,75 18,85 0 5 10 15 20 25 30 Células anexina V + (%) Sobrenadante blastos T sobre Jurkat (sin inhibición exocitosis granular) n = 1 Figura31.EfectocitotóxicodelosblastosTfrentealalíneacelularJurkatanalizadomediantecitometríade flujosininhibirlaexocitosisgranular(perforinaygranzimas)ylasecrecióndeligandosmortalesasociadosa exosomas(arriba).CitotoxicidaddelsobrenadantedelosblastosTencélulasJurkatmedidoenporcentaje decélulasAnn‐Vpositivas(abajo).LosblastosTnofueronreestimulados(sinactivar)obiense reestimularondurante2hconPMAeionomicina(activados).Porunaparteseanalizólacapacidad citotóxicadelosblastosfrentealascélulasdiana(Jurkat)unavezhansidosecretadoslosligandosmortales asociadosaexosomas.Porotraparteseanalizóelpotencialcitotóxicodelsobrenadanteenelquese encontrabanlosligandosmortalesasociadosaexosomas.RIK(RIK2,anti‐TRAIL);NOK(NOK1,anti‐FasL).
33 4.4.1.2CitotoxicidaddelsobrenadantedelosblastosT Losdatossemuestrancomo“citotoxicidadespecíficadelsobrenadanteactivado”, valorcalculadoapartirdelarestadelporcentajedecélulasanexinaspositivasdel sobrenadanteprocedentedelosblastosTreestimuladosmenoselporcentajedecélulas anexinaspositivasdelsobrenadanteprocedentedelosblastosTnoreestimulados. ElsobrenadanteobtenidotraslareestimulacióndelosblastosT(sobrenadante activado)resultóserelmáscitotóxico(17,37%decitotoxicidadespecífica). CuandoelsobrenadanteactivadofuepreincubadoconRIK2(anticuerpoanti‐ TRAIL)yNOK1(anticuerpoanti‐FasL)sucapacidadcitotóxicadescendió(21%yun33% respectivamente),siendoestedescensoaúnmayorcuandoelsobrenadantesepreincubó conambosanticuerpos,llegándoseenestecasoaun44%debloqueo. ElsobrenadanteprocedentedeblastosTsinreactivarnofuecitotóxicoencélulas Jurkat. 4.4.2CitotoxicidaddelosblastosTinhibiendolaexocitosisgranularysecreciónde ligandosmortalesasociadosaexosomas. 4.4.2.1CitotoxicidaddelosblastosT Enestecaso,lamuertedelascélulasdiana(Jurkat)desciendedrásticamentetanto enlosblastosTnoreactivadoscomoenlosblastosTreactivadosconPMAeionomicina observándosevaloressimilaresalamuertebasaldelascélulasJurkat(Figura12).
34 4.4.2.2CitotoxicidaddelsobrenadantedelosblastosT ApesardelagrandiferenciaobservadaenlacapacidadcitotóxicadelosblastosT enlosquenoseinhibelaexocitosisgranularnilasecrecióndeexosomasylosquesíse inhibe,elcomportamientodelossobrenadantesobtenidospreviamente,fuelógicamente similar.Denuevo,elsobrenadantederivadodelareestimulacióndelosblastosT (sobrenadanteactivado)resultóserelmáscitotóxico(16%decitotoxicidadespecífica)y denuevolapreincubaciónconlosanticuerposRIK2,NOK1oambosredujolacapacidad citotóxicadelsobrenadanteactivado(bloqueodel27%,51%y58%delamuerte, respectivamente).Finalmente,elsobrenadanteprocedentedeblastosTsinreactivarno fuecitotóxicoencélulasJurkat(Figura12). 3,30 88,5 5,79 2,42 1,96 83,5 9,27 5,30 1,90 89,5 5,23 3,36 4,51 82,2 9,76 3,57 2,62 90,2 4,31 2,89 Anexina-V 7-AAD Jurkat Blastos T sin reactivar : Jurkat (5:1) Blastos T reactivados : Jurkat (5:1) Blastos T sin reactivar : Jurkat (10:1) Blastos T reactivados : Jurkat (10:1) 13,80 10,20 26,20 21,90 18,00 16,90 0 5 10 15 20 25 30 Células anexina V + (%) Sobrenadante blastos T sobre Jurkat (con inhibición exocitosis granular) n = 1 Figura12.EfectocitotóxicodelosblastosTfrentealalíneacelularJurkatanalizadomediantecitometríade flujo.Inhibiciónlaexocitosisgranular(perforinaygranzimas)ylasecrecióndeligandosmortalesasociados aexosomas(arriba).CitotoxicidaddelsobrenadantedelosblastosTencélulasJurkatmedidoenporcentaje decélulasAnn‐Vpositivas(abajo).LosblastosTnofueronreestimulados(sinactivar)ofueron reestimuladosdurante2hconPMAeionomicina(activados).Porunaparteseanalizólacapacidad citotóxicadelosblastosfrentealascélulasdiana(Jurkat)unavezhansidosecretadoslosligandosmortales asociadosaexosomaseinhibiendolosmecanismosdeexocitosisgranularporlaaccióndelEGTA.Porotra parteseanalizóelpotencialcitotóxicodelsobrenadanteenelqueseencontrabanlosligandosmortales asociadosaexosomas.RIK(RIK2,anti‐TRAIL);NOK(NOK1,anti‐FasL).
41 4.7.2SublíneacelularMM1SresistenteaTRAIL. EnelcasodelalíneaMM1S,eltratamientocomenzóconunadosisde100ng/mL yaquemostrabaunamayorsensibilidadaTRAILquelalíneacelularH929.Enestecaso,a pesardeobservarseundescensopaulatinodelasensibilidadaTRAILnosealcanzóuna resistenciatotaladichadosis(Figura22). 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 7 9 1114171821232528303235 % células muertas (Tripán) días MM.1S CONTROL TRAIL 100 ng/mL ** * Determinación de TRAIL-Rs MM.1S Figura22. Porcentajedecelularmuertasdeterminado porTrypan delasublínea MM1SsegúneldíadetratamientoconTRAIL(día0:dosisde100ng/mL). Figura21.ExpresióndelosreceptoresTRAIL(proapoptóticos:DR4yDR5;receptoresseñuelo: DcR1yDcR2)enlalíneaparentalH929adía0,líneaparentaladía25(célulassintratar)yenla sublíneaH929resistenteaTRAILadía25,analizadomediantecitometríadeflujo. control IgG TRAIL-Rs día 0 TRAIL-Rs día 25 (H929 sin tratar) TRAIL-Rs día 25 (H929 tratadas con TRAIL) TRAIL-Rs Counts TRAIL-R1 (DR4) TRAIL-R2 (DR5) TRAIL-R3 (DcR1) TRAIL-R4 (DcR2) H929
42 LosresultadosenelanálisisdelaexpresióndelosdistintosreceptoresdeTRAIL obtenidosmediantecitometríadeflujo,siguieronunpatrónsimilaralobtenidoenla sublíneaH929observándoseunadisminuciónconsiderabledelosnivelesdeDR5enla sublínearesistenteaTRAIL,encomparaciónconlosdelalíneaparentaladía25,una discretadisminucióndelaexpresióndelreceptorDR4enlalíneaparentalrespectoala sublínearesistenteyunadisminucióndeDcR1tantoenlalíneaparentalcomoenla sublínearesistente(Figura23). Figura23.ExpresióndelosreceptoresTRAIL(proapoptóticos:DR4yDR5;receptoresseñuelo:DcR1 yDcR2) enlalíneaparentalMM1Sadía0,líneaparentaladía25(célulassintratar)yenlasublíneaMM1S resistenteaTRAILadía25,analizadomediantecitometríadeflujo. MM.1S control IgG TRAIL-Rs día 0 TRAIL-Rs día 25 (H929 sin tratar) TRAIL-Rs día 25 (H929 tratadas con TRAIL) TRAIL-Rs Counts TRAIL-R1 (DR4) TRAIL-R2 (DR5) TRAIL-R3 (DcR1) TRAIL-R4 (DcR2)
43 5.DISCUSIÓN Enelpresentetrabajosehanestudiadodistintosaspectosdelaexpresióny secrecióndelligandomortalTRAILencélulashematológicashumanas.Sehaestudiadoel patróndeexpresióndeTRAILencondicionesbasalesytraslaestimulaciónconPHAa distintostiempostrasloscuales,laPHAseeliminóytrascurrida1hora,serealizóel análisisdelaexpresióndeTRAIL.Paraello,sehanempleadocélulastumoralescomoesel casodelalíneacelulartumoralJurkatasícomocélulasnormalescomosonlosblastosT obtenidosapartirdelinfocitosdesangreperiféricadedonantessanos. EnloreferentealaexpresióndeTRAIL,sehaanalizadolaexpresióndiferencialde esteligandoenlasuperficiedelacélulayenelinteriordelamismamediantecitometría deflujo.EnlascélulasJurkat,laexpresiónbasaldeTRAILessobretodointracelularya quelamayorpartedelafluorescenciaespecíficaseobservaenelmarcajetotal(TRAIL total=extracelular+intracelular)mientrasqueapenasseobservafluorescencia específicaenelmarcajedesuperficie.Además,sehaobservaunarelacióndirectaentrela estimulaciónconPHAyelaumentoenlaexpresióndeTRAIL.Esteaumentodela expresiónesrápidoeneltiempoyaqueseobservatras5minutosdeestimulacióny mantenido(apenasdisminuyesilaestimulaciónesde1hora),yesprincipalmentea expensasdeunaumentodelaexpresiónintracelular. Altratarsedeunalíneatumoral,lascélulasJurkatsecomportancomolinfocitosT yaactivados(blastosT)poresonoesnecesariaunareestimulacióndeestascélulaspara vercambiosenlosnivelesdeexpresióndeTRAIL. CuandolaestimulaciónconPHAsellevaacaboduranteuntiempomás prolongado(7horasenestecaso),TRAILintracelularsepierdeperoencambioTRAILde superficiepermanece,ysuniveldeexpresiónesmayorqueenelestadobasal.Comoya sehamencionado,lascélulasJurkatapenasexpresanTRAILensuperficieencondiciones basales,perocuandosonestimuladasconPHA,losnivelesdeTRAILensuperficie aumentanpermaneciendomásomenosconstanteseneltiempo.
44 EnestudiospreviosrealizadospornuestrogruposeobservómedianteWestern blotquelaexpresióndeTRAILencélulasJurkatdescendíaenpequeñaproporcióntras1 horaysobretodoseproducíaunmarcadodescensotras7horasdeestimulaciónconPHA sugiriendoqueTRAILerasecretadoalmediojuntoaFasLporestascélulastrassu estimulación(Martinez‐Lorenzoetal.,1998,Monleonetal.,2000). EnelpresentetrabajosehaanalizadoademáslaexpresióndeTRAILtras5 minutosdeestimulaciónconPHAylosdatosobtenidosmediantecitometríadeflujo estándeacuerdoconlosobtenidosanteriormentesugiriendotambiénqueTRAILes sintetizadodenovotraslaestimulaciónconPHAparaserposteriormentesecretado (Figura24). Figura24.ModelopropuestodelaexpresióndeTRAILenlalíneacelulartumoralJurkatadistintostiempos deestimulaciónconPHA(sinestimulación,5min,1horay7hdeestimulación)Traslostiemposde estimulaciónindicados,laPHAseeliminólavandolascélulas3vecesconPBS.Trascurrido1hora,seanalizó laexpresióndeTRAILmediantecitometríadeflujo. TambiénsehaanalizadolaexpresióndeTRAILencélulashematológicassanas, PBLsyblastosT.LosPBLsreciénaisladosdesangreperiféricanoexpresanTRAILnianivel extracelularniintracelularynoseproduceningúnaumentotraslaestimulaciónconPHA durante5minutos.SóloenlosblastosTgeneradosapartirdelosPBLsseobservaun claroincrementodeexpresióndeTRAILsiendoéstecasiexclusivamenteaexpensasde unaexpresiónintracelular.EstádescritoqueloslinfocitosTnaivenoexpresanTRAIL sin PHA PHA 1 h. PHA 5 min. PHA 7 h. Expresión de TRAIL (Jurkat) (+1h) (+1h) (+1h)
45 (Martinez‐Lorenzoetal.,1998;Jeremiasetal.,1998)yqueelaumentoenlaexpresiónde TRAILsoloseproducetrasactivarlacélulaT(Ehrlichetal.,2003;Kayagakietal.,1999; Martinez‐Lorenzoetal.,1998). Losdatosobtenidosmediantecitometríadeflujoenelpresentetrabajoestánen consonanciaconlodescritopreviamente.AdiferenciadeloobservadoencélulasJurkat, enlosblastosTapenasseobservaunincrementodelaexpresióndeTRAILtrasla reestimulaciónconPHAdurante5minutos. TambiénsehaanalizadolaexpresióndeTRAILenlasdosprincipales subpoblacionesdeblastosT,CD4+yCD8+.ElcomportamientodelosblastosTCD4+fue distintoalobtenidoenlascélulasJurkat,peseaqueéstassonlinfocitosTtumorales CD4+.MientrasquelosnivelesdeTRAILensuperficiesiguieronunpatrónsimilaraldelas célulasJurkat,losnivelesdeTRAILintracelulartras5minutosdeestimulaciónson prácticamentenulosyaqueelvalordeTRAILtotalcorresponderíacasiíntegramentealde superficiesiendoelvalormáximodeexpresióndeTRAILextracelularregistradoenlos blastosTCD4+.CuandolosblastosTCD4+sereestimulanduranteunahora,losnivelesde TRAIL,fundamentalmenteintracelular,vuelvenaaumentarloquesugiereunasíntesisde novodeTRAIL. EnelcasodelosblastosTCD8+,elniveldeexpresiónbasalfueinferioraldelos blastosTCD4+.ApenasseobservóexpresióndeTRAILensuperficie.Encambio,anivel intracelularseobservóuncomportamientosimilaralobservadopreviamenteencélulas Jurkat,aunqueenestecasoconunacinéticamásrápidayaqueeldescensodeTRAIL intracelularseproduceyatras1horadeestimulaciónconPHA. Enresumen,apesardelavariabilidadobservadaenlosexperimentosrealizados conlosblastosT,sepuedeobservarundiferentecomportamientoentrelas subpoblacionesCD4+yCD8+.LosdatosobtenidossugierenqueenlosblastosTCD4+se produceunaumentodelaexpresióndeTRAILfundamentalmenteextracelularseguidade unasíntesisdenovodeTRAILintracelular.EncambioenlosblastosTCD8+seproduce unasíntesisdenovointracelularrápidatraslaestimulaciónconPHAparaluegoser tambiénrápidamentesecretado(Figura25).Estasdiferenciasobservadasentreambas
46 subpoblacionespodríanreflejarsudiferentefunciónenlarespuestainmunefisiológica. LoslinfocitosTCD4+,ejercenunafunciónfundamentalmentecolaboradorayde regulacióndelarespuestainmune(usandoparaelloentreotrosmecanismoslasecreción deligandosmortalescomoTRAIL),mientrasqueloslinfocitosTCD8+ejercenunafunción fundamentalmentecitotóxica,entrecuyosmecanismosefectoresseencuentrala secrecióndeligandosmortalescomoTRAIL.Porello,resultalógicoquemientraslos blastosTCD4+requierenunasecreciónrápidayunasíntesismásprolongadadeTRAIL comounodesusmecanismosreguladoresenórganoslinfoidessecundarios,enelcasode losblastosTCD8+estasíntesisparecemásrápidaperosusecrecióndebesermáslenta yaqueTRAILseráempleadoenfasesposteriorescomomecanismocitotóxicoenelpunto deinfección(Aneletal.,2007). Figura25.ModelopropuestodelaexpresióndeTRAILenblastosTCD4+yblastosTCD8+adistintos tiemposdeestimulaciónconPHA(sinestimulación,5min,1horay7hdeestimulación)Traslostiemposde estimulaciónindicados,laPHAseeliminólavandolascélulas3vecesconPBS.Trascurrido1hora,seanalizó laexpresióndeTRAILmediantecitometríadeflujo. ParaprofundizarenelestudiodelasecrecióndeTRAILenblastosT,sehan realizadoensayosdecitotoxicidadsobrelalíneacelulartumoralJurkatempleandotanto sin PHA PHA 1 h. PHA 5 min. Expresión de TRAIL (blastos T CD4+) sin PHA PHA 5 min. PHA 1 h. Expresión de TRAIL (blastos T CD8+) (+1h) (+1h) (+1h) (+1h)
47 lospropiosblastosTcomolossobrenadantesobtenidosapartirdeellostrasla reactivaciónconPMAeionomicina. Losdatosobtenidoscorroboranqueelprincipalmecanismocitotóxicodelos blastosTeseldelaexocitosisgranular(sistemadeperforinaygranzimas)yqueeste mecanismoseincrementatraslareactivacióndelosblastosT.Cuandolaexocitosis granularseveinhibidaporlaaccióndeEGTA,lamuertedelascélulasdiana(Jurkat) prácticamentenoaumentarespectoalamuertedebasal,indicandoquelosligandos mortalesdesuperficie(FasLyTRAIL)apenasintervienenenlaactividadcitotóxicaejercida directamenteporlosblastosT,debidosobretodoaquelamayorpartedelosligandos mortaleshansidosecretadosalexteriorpreviamenteasociadosaexosomas. Comosehadescritopreviamente,lareactivacióndelosblastosT (fundamentalmentelosblastosTCD8+)conllevalasecrecióndeligandosmortalescomo TRAIL.Cuandoseanalizalacapacidadcitotóxicadelossobrenadantesobtenidosapartir delosblastosTreactivadosseobservaqueéstospresentanactividadcitotóxicafrentea lascélulasJurkat.Además,nohubodiferenciasentrelatoxicidaddelsobrenadantedelos blastosTenpresenciaoausenciadeEGTAyaquelossobrenadantessehabíanrecogido traslaactivaciónyenpresenciadeCa2+extracelular. Paradeterminarelpapelrelativoqueejercecadaunodelosligandosmortales (FasLyTRAIL)sepreincubaronlossobrenadantesconanticuerposbloqueantesdeambos ligandos.Seobservóqueambosligandosintervienenenlaactividadcitotóxicadelos sobrenandantesdadoqueelmayorporcentajedeinhibiciónseobtuvopreicubandoel sobrenandanteconambosanticuerposbloqueantes,peroqueelquemayorcitotoxidad ejercíasobrelascélulasJurkatfueFasL. ElcompuestoDeBQsehadescritoqueentreotrosefectos,escapazdeinhibirla proteínaVCP(valosin‐containingprotein),unaATPasaimplicadaeneltráficovesicular(Ye etal.,2001),entreotrasfunciones.Además,sehadescritoqueDeBQ(inhibidor específicodeVCP)tieneunefectocitotóxicosobretumores(Chouetal.,2011).Enel presentetrabajosehanrealizadoensayosdosis‐respuestaparaanalizarlacapacidad citotóxicaqueejerceelDeBQsobrecélulasJurkat,PBLsyblastosTconelobjetivode
48 encontrarunadosissubtóxicaparaanalizarposteriormentelacapacidaddelDeBQde interferirenlosmecanismosdeliberacióndeexosomas. EnloreferentealacapacidadcitotóxicadelDeBQ,seobservaquealadosisde6 µMelefectoesestadísticamentemayorenlalíneatumoralJurkatquesobrelosPBLs. SehadescritoquelaproteínaVCPestáimplicadaenlaprogresiónen determinadostiposdecáncer(Yamamotoetal.,2003)demodoqueesposiblequela inhibicióndeestaproteínaporelDeBQafectedemaneradiferencialalascélulas tumorales.LamuerteinducidaporelDeBQdeberíaestarasociadaconapoptosispor estrésenelretículoendoplasmáticoaunqueestonoestádemostrado experimentalmente. EncuantoalefectodelDeBQenlosmecanismosdesecrecióndeexosomas,se observóqueelpretratamientodelascélulasJurkatconDeBQnomodificólaexpresión totaldeTRAIL.Sinembargo,laexpresiónextracelulardeTRAILfueprácticamente inexistente,loquesugiereque,mientraslacapacidaddesíntesisdeTRAILintracelularno sevioafectada,laexposicióndeTRAILensuperficieprocedentedelafusióndelcuerpo multivesicular,conlamembranaexternanoseestaríaproduciendoenlascélulasJurkat (Bossi&Griffiths,1999;Martinez‐Lorenzoetal.,1999).Porotraparte,ladisminuciónen losnivelesdeTRAILintracelularconformeaumentaeltiempodeestimulaciónpuedeser debidoamecanismosdedegradacióncelularobienaquelasecrecióndeexosomasde TRAILnoseveafectada. Sinembargo,enlosblastosTnosepuedeafirmarqueseestéproduciendouna inhibicióndelasecreciónyaquetrasunahoradeestimulaciónconPHA,seguidadeuna horadeincubaciónsinPHA,elniveldeexpresióndeTRAILintracelularvuelveadisminuir aexpensasdelTRAILdesuperficie,elcualaumentaligeramente.Estosdatosmuestranun efectodiferencialdelainhibicióndeVCPentrelascélulastumoralesylosblastosT normales,dandovalidezfisiológicaaloobservadoenelanálisisproteómicodescrito.
49 Finalmente,paraestudiarlosmecanismosapoptóticosinducidosporTRAIL,sehan comenzadoagenerarlíneascelularesdeestirpehematológicaresistentesaesteligando mortalparaanalizarcuálessonlosmecanismosderesistenciaaTRAIL.Enlasdos sublineasgeneradasapartirdelaslíneasprovenientesdemielomamúltiple,H929y MM1S.Sehaobservadoqueelreceptorpro‐apoptóticoDR5disminuyerespectoaambas líneasparentalesmientrasqueelreceptorpro‐apoptóticoDR4novaríasuexpresiónen lassublineasresistentes.SehadescritoqueDR5es,delosdosreceptorespro‐ apoptóticos,eselquetrasmitemáseficientementelaseñalapoptótica(Gomez‐Benitoet al.,2007).Enestesentido,losdatosparecenindicarquelascélulasH929yMM1Sen respuestaalapresenciacontinuadeTRAILreducenlaexpresióndelprincipalreceptor capazdeinducirsumuertemientrasquemantienenlaexpresióndelreceptorconmenor capacidadpro‐apoptotica.
50 6.CONCLUSIONES. Alavistadelosresultadosexpuestos,lasconclusionesdelpresentetrabajosonlas siguientes: 1. ExistendiferenciasentrelospatronesdeexpresióndeTRAIL,ensuperficieo intracelular,entrelalíneahematológicatumoralJurkatylinfocitosTactivados (blastosT)provenientesdedonantessanosasícomoentrelassubpoblacionesde blastosTCD4+yCD8+. 2. ElmecanismocitotóxicodirectoprincipaldelosblastosTeseldelaexocitosis granularsinapenascontribucióndelosligandosmortalesdesuperficie. 3. LacontribuciónprincipaldelosligandosmortalesalacitotoxicidaddelosblastosTse realizaatravésdesusecreciónasociadaaexosomas.Dentrodelosligandosmortales secretados,elmáscitotóxicoesFasL. 4. ElinhibidordeVCPDeBQesmástóxicosobrelaleucemiaJurkatquesobrelos linfocitosnormalesadeterminadasconcentraciones. 5. ElcompuestoDeBQaunadosissubtóxicaescapazdeinhibirlaexpresióndeTRAILen superficieenlalíneacelulartumoralJurkatperonoenblastosT. 6. UnodelosmecanismosderesistenciageneradosanteTRAILenlaslíneascelularesde mielomaMM1SyH929esladisminucióndelosnivelesdeDR5ensusuperficie celular.