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MÁSTER DE INICIACIÓN A LA INVESTIGACIÓN EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Curso 2012-2013 PROYECTO FIN DE MÁSTER Termo-inactivación de E. coli, en zumo de manzana, en condiciones anisotérmicas Memoria presentada por Noemí Bervis S. Director: Prof. Santiago Condón Usón D. Santiago Condón Usón, catedrático del área de Tecnología de los Alimentos del Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos, de la Universidad de Zaragoza Certifica: Que el trabajo titulado: “Termo-inactivación de E.coli, en zumo de manzana, en condiciones anisotérmicas”, de la que es autora Dña Noemí Bervis, ha sido realizado bajo su dirección y cumple las condiciones requeridas para su defensa como trabajo fin de Máster de iniciación a la investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Y para que así conste, firmo, en Zaragoza, a 20 de junio de 2013 Fdo: Prof. S. Condón. ÍNDICE ABSTRACT ................................................................................................................ 1 RESUMEN. ................................................................................................................. 2 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 3 1.1 PROBLEMÁTICA DE LOS ZUMOS DE FRUTAS.......................................................... 3 1.2. CONSERVACIÓN DE LOS ALIMENTOS POR CALOR ............................................... 5 1.2.1. CINÉTICA DE INACTIVACIÓN TÉRMICA ............................................................ 5 1.2.2. FACTORES QUE AFECTAN A LA TERMORRESISTENCIA MICROBIANA. ...... 8 1.3. LA PASTERIZACIÓN DE LOS ZUMOS: EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN LA CALIDAD.............................................................................................. 13 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS. .................................................................. 16 3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 17 3.1. SUSPENSIONES MICROBIANAS. ............................................................................. 17 3.2 MEDIOS DE TRATAMIENTO .................................................................................... 20 3.3. TRATAMIENTOS TÉRMICOS.................................................................................... 21 3.4 INCUBACIÓN Y RECUENTO DE SUPERVIVIENTES. ............................................... 23 3.5 DETECCIÓN DE DAÑOS SUBLETALES. ................................................................... 26 3.6 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS. ..................................................... 27 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 29 4.1. TERMORRESISTENCIA DE E. COLI EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS. .............. 29 4.2. INACTIVACIÓN DE E. COLI EN CONDICIONES ANISOTÉRMICAS. ..................... 35 4.3. SENSIBILIZACIÓN DE E. COLI AL CALOR EN ZUMO DE MANZANA. ................ 41 5. CONCLUSIONES: ............................................................................................... 44 6. BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................. 45 1 ABSTRACT It has been demonstrated that apple juice can be a vehicle for transmission of food poisoning, which makes pasteurization recommended before its commercial distribution. Current heat treatments are usually calculated from heat resistance data obtained in isothermal conditions, while the industrial processing is usually based on the application of anisothermal heating. This extrapolation can cause major errors because there is strong evidence that during anisothermal treatments adaptive phenomena and / or sensitization of the cells to heat may occur. The objective of this study was to determine whether the data obtained under isothermal conditions could predict the rates of inactivation at anisothermal conditions and, in case that was not possible, to quantify the differences and to explore the causes. For this study we use the K12 strain from the KEIO collection (BW25113) to facilitate future studies on the mechanisms of death, injury and adaptation to heat. The results obtained allowed us to conclude that the heat resistance parameters deduced from isothermal treatments are not adequate to reliably predict the rate of inactivation in anisothermal conditions. Prediction errors increased with heating rate: the higher the rate the lower the DT value and the greater the apparent z value. The lack of coincidence between the predicted and the experimental values was due to a sensitization of cells to heat as they were resuspended in apple juice. This sensitization was greater the higher the exposure time, and faster and greater the higher the temperature 2 RESUMEN Se ha demostrado que el zumo de manzana puede ser vehículo de transmisión de diversas toxiinfecciones alimentarias, lo que hace recomendable su higienización antes de la distribución comercial. En la actualidad los tratamientos suelen calcularse a partir de datos de termorresistencia obtenidos en laboratorio en condiciones isotérmicas, mientras que el procesado industrial normalmente se basa en la aplicación de calentamientos anisotérmicos. Esta extrapolación puede ser causa de importantes errores porque existen pruebas fehacientes de que durante los tratamientos anisotérmicos pueden producirse fenómenos de adaptación y/o sensibilización de las células al calor. El objetivo de esta investigación fue determinar si los datos obtenidos en condiciones isotérmicas permitían predecir los ritmos de inactivación en condiciones anisotérmicas y, en caso de no permitirlo, cuantificar las diferencias y explorar las causas. Para el estudio decidimos utilizar la cepa K12 de la colección KEIO (BW25113) para facilitar futuros estudios de los mecanismos de muerte, daño y adaptación al calor. Los resultados nos han permitido concluir que los parámetros de resistencia deducidos de tratamientos isotérmicos no son adecuados para predecir con fiabilidad el ritmo de inactivación en condiciones anisotérmicas. Los errores de predicción aumentaban con el ritmo de calentamiento: cuanto mayor era el ritmo menor era el valor DT y mayor el valor z aparente. La falta de coincidencia entre predichos y experimentales se debía a una sensibilización al calor de las células al ser calentadas en zumo de manzana. Esta sensibilización era tanto mayor cuanto mayor era el tiempo de exposición, y más rápida y mayor cuanto más alta era la temperatura. 3 1. INTRODUCCIÓN En el siglo XXI, las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) siguen constituyendo uno de los principales desafíos para la Salud Pública. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las ETA constituyen uno de los problemas de salud más relevantes, tanto en los países desarrollados, como en los países en vías de desarrollo. Cada año, la OMS recibe informes sobre la aparición de cientos de casos de ETA en todo el mundo, siendo los más frecuentes los ocasionados por alimentos contaminados con agentes biológicos. La OMS estima que cada año se producen 1.500 millones de episodios de diarrea que ocasionan unos 3 millones de muertes en menores de 5 años. Se calcula que, dependiendo de los países, del 15 al 70% de esos casos son causados por alimentos contaminados con microorganismos (WHO, 1997). El tipo de microorganismo implicado en las ETA puede variar ampliamente, así como el tipo de alimento que los vehicula. Hasta hace poco tiempo se suponía que el consumo de zumos de frutas, por su bajo pH, no podían ser causa de toxiinfecciones alimentarias, pero en los últimos años se ha demostrado su indiscutible implicación en algunos brotes. Los zumos de frutas son uno de los alimentos más populares en toda Europa, Estados Unidos y Japón, debido a sus agradables propiedades sensoriales (Komthong, Igura, y Shimoda, 2007). El zumo de manzana es uno de los más consumidos en los países desarrollados, siendo únicamente superado por el del zumo de naranja. 1.1 PROBLEMÁTICA DE LOS ZUMOS DE FRUTAS. Las principales causas de las alteraciones de los zumos son debidas a los microorganismos y a reacciones químicas diversas. Los distintos procesos bioquímicos son catalizados por un gran número de enzimas de constitución que deben ser inactivados para que el alimento no pierda sus propiedades organolépticas originales. Sin embargo, se pueden dar casos en los que la actividad bioquímica este bien controlada, pero que la acción microbiana persista y provoque alteraciones posteriores (Holdsworth, 1987). En el aspecto microbiano las principales alteraciones que tienen 4 lugar en derivados de frutas son las debidas a fermentaciones, causadas en su mayoría por levaduras, aunque también algunas bacterias y mohos pueden originar modificaciones no deseadas en estos productos. En circunstancias especiales pueden producirse también otras alteraciones químicas mediadas por reacciones diversas, pero en los derivados de frutas son las de pardeamiento no enzimático las que más importancia tienen. Estas reacciones producen modificaciones en el color durante el procesado de los zumos y durante su almacenamiento posterior (Mariné, 1982). Esta evolución del color se produce principalmente por reacciones de caramelización, debidas a la degradación del ácido ascórbico, y por reacciones de Maillard, un complejo grupo de reacciones que dan como resultado la formación de compuestos pardos denominados genéricamente melanoidinas. Los zumos de manzana se caracterizan por su acidez y alto contenido en azúcares fermentables, lo que los hace especialmente susceptibles a la acción de mohos y levaduras. En algunos casos también se ha observado la alteración de zumos por el crecimiento de lactobacilos y más recientemente por el de algunos formadores de esporos del género Aliciclobacillus. Hasta hace relativamente poco tiempo se asumía que el bajo pH de los zumos, inferior a 4,5, impedía la multiplicación de los microorganismos patógenos. Sin embargo en los últimos años se ha demostrado la supervivencia de distintas especies patógenas por largos periodos de tiempo. Otro tipo de contaminación biológica son las toxinas producidas por los mohos. A pesar de que el pH ácido de los zumos puede inhibir varios agentes patógenos transmitidos por los alimentos (Kumar et al, 2009.) otros, tales como E. coli O157: H7, pueden sobrevivir en este entorno y producir ETA. Por ejemplo, el consumo de zumo de manzana se ha relacionado con al menos 10 brotes toxiinfecciosos por E. coli O157: H7 entre 1995 y 2005 en los Estados Unidos (Molina et al., 2005 y Vojdani et al., 2008). Otros autores (Cody et al., 1999) afirman que el consumo de zumos de fruta contaminados ha estado implicado en los últimos diez años en al menos 28 toxiinfecciones. De estas 28, un 40%, se han asociado con Salmonella spp, y el 30% aproximadamente, con Escherichia coli enteropatógenos, especialmente E. coli O157: H7. Estas toxiinfecciones han hecho dudar de la seguridad de los zumos de fruta no pasteurizados, lo que llevo a la “Food and Drug Administration (FDA)” norteamericana a emitir una serie de regulaciones para el procesado de zumos de frutas, que incluía la 5 exigencia de un tratamiento tecnológico capaz de garantizar 5 ciclos de inactivación del microorganismo patógeno más termorresistente de entre los que habitualmente contaminan estos productos (FDA, 2001). En la actualidad, los tratamientos térmicos (pasteurización por calor) se consideran la tecnología más efectiva para eliminar las células vegetativas patógenas que contaminan los zumos. 1.2. CONSERVACIÓN DE LOS ALIMENTOS POR CALOR Los métodos tradicionales de conservación, tales como la congelación, pueden mostrar cierta actividad bactericida, sin embargo no se consideran como métodos de elección para la higienización de los alimentos puesto que su eficacia letal es imprevisible. El calor tiene muchas ventajas frente a estos métodos ya que no solo inactiva microorganismos, sino que lo hace de una forma previsible. Esta circunstancia abre la posibilidad de calcular los tratamientos para conseguir el nivel de inactivación deseado. Los parámetros críticos de los tratamientos térmicos son el tiempo y la temperatura, que además interactúan, de manera que es posible calcular tratamientos de eficacia letal equivalente a distintas temperaturas. Además, esta interacción hace posible optimizar los tratamientos térmicos maximizando su eficacia bactericida y minimizando sus efectos sobre la calidad. 1.2.1. CINÉTICA DE INACTIVACIÓN TÉRMICA En los estudios realizados por Bigelow y Esty (1920) se concluyó que a intervalos iguales de tiempo, a temperatura constante, se destruye un porcentaje fijo de la población microbiana; es decir, que el número de microorganismos supervivientes frente a un tratamiento térmico es una función exponencial del tiempo. Por lo tanto, si en lugar de representar el número de microorganismos frente al tiempo de tratamiento representamos su logaritmo obtendremos una gráfica con perfil recto, denominada grafica de supervivencia 6 A partir de la gráfica de supervivencia puede deducirse el valor DT, o tiempo de reducción decimal, definido como el tiempo en minutos a la temperatura ¨t¨ que es preciso tratar a la población microbiana para reducir el recuento un ciclo logarítmico; o lo que es lo mismo, para que la gráfica de supervivencia atraviese un ciclo logarítmico. Matemáticamente DT es el inverso negativo de la pendiente de la gráfica de supervivencia. Figura.1 Efecto del tiempo de tratamiento en la supervivencia microbiana al calor: graficas de supervivencia. Gould (1989) explica la cinética exponencial de inactivación microbiana por el calor basándose en principios termodinámicos; según él, la cinética de muerte sería una simple extensión de las ecuaciones de Arrhenius. Para admitir esta hipótesis es preciso admitir que la inactivación térmica de los microorganismos es un fenómeno del tipo todo/nada y que la muerte es consecuencia de la alteración de una única molécula clave. Esta teoría también asume que todas las células muestran la misma termorresistencia y que la muerte es un fenómeno probabilístico debido a una distribución de energía de tipo Boltzman en las moléculas del medio de tratamiento. Otros autores (Withell, 1942), atribuyen esta cinética a la existencia de una distribución de resistencia entre las células de la población, sobre las que el calor actuaria de manera similar y uniforme. En cualquier caso, admitiendo esta cinética, el efecto de esterilización puede calcularse mediante la ecuación. Ft = DT * (log Nolog Nt) Donde,  Ft: Tiempo de tratamiento a una temperatura “t” 13 área rayada correspondería al porcentaje de la población que ha sufrido daños subletales. Es muy frecuente el uso de un medio selectivo basado en la adición de la concentración máxima no inhibitoria de cloruro sódico (NaCl) que impide la reparación de los daños en la membrana citoplasmática. Comparando los recuentos en los medios selectivos y no selectivos se puede detectar y cuantificar la presencia de células dañadas. De modo similar se pueden añadir al medio de recuperación sustancias como ácidos, bases, o algunos iones inorgánicos para detectar daños en otras estructuras. Figura 2. Efecto del medio de recuperación en la inactivación microbiana. Células recuperadas en medio no selectivo (▄) y en uno selectivo (▲). El área rayada representa la parte de la población que ha sufrido un daño subletal (Sacado de Cebrián, 2009). 1.3. LA PASTERIZACIÓN DE LOS ZUMOS: EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN LA CALIDAD Los métodos de conservación tradicionales basados en tratamientos térmicos (escaldado, pasteurización o esterilización) conllevan en muchas ocasiones, como ya se ha comentado, una disminución de la calidad nutricional y organoléptica del alimento. Este aspecto, unido al hecho de que el consumidor demanda alimentos cada vez más frescos y naturales, que además de tener una vida útil prolongada mantengan sus cualidades nutricionales y sensoriales, ha llevado a perfeccionar los tratamientos térmicos existentes, ya que cuanto más intenso es el tratamiento térmico aplicado mayores son los cambios indeseables ocasionados. Por ello, cuando se establecen los 14 tratamientos térmicos más adecuados para un determinado producto se busca siempre un compromiso entre su calidad microbiológica, organoléptica y nutritiva. Desde el punto de vista de la calidad nutricional cabe destacar que, como consecuencia del tratamiento térmico, se pierden vitaminas termolábiles, como la vitamina C, además de otros compuestos como antocianos y compuestos fenólicos (Klopotek et al., 2005). Klopotek y col. (2005) encontraron una disminución de la capacidad antioxidante total de la fruta como consecuencia del calentamiento. Por otro lado, el uso de temperaturas elevadas favorece las reacciones de pardeamiento no enzimático (Anese et al., 2002) dando lugar a compuestos altamente reactivos que pueden reaccionar con algunas vitaminas, oxidándolas, y producir complejos oscuros que modifican el color, aroma y sabor de la fruta. Existen referencias de la degradación aerobia de la vitamina C en las cuales, si se aplica calor, se produce el ácido 2,3dicetogulónico, a partir del cual se producen descarboxilaciones y deshidrataciones formándose finalmente ácido furoico. Este compuesto interviene en la reacción de Maillard, o puede intervenir en condensaciones con otras moléculas de su misma naturaleza dando complejos oscuros; por ejemplo, en zumos donde no se ha eliminado bien el oxígeno. En la degradación anaerobia de la vitamina C en medios muy ácidos el calor produce el ácido 2-cetogulónico, a partir del cual se produce el furfural, un intermediario de las reacciones de pardeamiento no enzimático, que oscurece el producto. En los zumos, a pesar de estar bien envasados, si hay un pH muy ácido se pueden dar colores oscuros y producirse abombamientos de los envases, ya que se desprende CO2 en la secuencia de reacciones. Otro parámetro de calidad importante que puede verse modificado por el tratamiento térmico es la viscosidad del zumo. Esta propiedad reológica depende de la cantidad de sólidos totales, la cantidad de sólidos solubles, el tamaño de partícula y la temperatura (Ahmed et al., 2004). El tratamiento térmico puede afectar a estos parámetros, por ejemplo modificando la fracción de pectina soluble presente en la fruta, que cambia la viscosidad del producto (Dutta et al., 2006). Por otra parte, durante el almacenamiento en refrigeración, la actividad residual de los enzimas de constitución también puede influir en el comportamiento reológico del producto. Los tratamientos térmicos se consideran un método tradicional y efectivo de pasteurización de los alimentos. La USFDA reconoce la eficacia de pasteurización 15 térmica para la higienización y conservación de los zumo de fruta refrigerados (Donahue, Canitez, y Bushway, 2004, Federal Register [FR], 2001). Sin embargo, los efectos indeseados del calor sobre la calidad de los zumos han llevado a la Tecnología de los Alimentos a realizar un enorme esfuerzo para el desarrollo de métodos alternativos de conservación e higienización de los alimentos. Por una parte, se intentan mejorar en lo posible los actuales tratamientos térmicos buscando métodos más eficientes de calentamiento, como los microondas, el calentamiento óhmico, etc, y por otra a buscar nuevas tecnologías físicas, no-térmicas, de inactivación microbiana, tales como las altas presiones, los pulsos eléctricos, etcétera También se intentan combinar diversas tecnologías que permitan reducir la intensidad de los tratamientos y, de esta forma, sus efectos sobre la pérdida de calidad (por ejemplo la adición de ácidos permite reducir la temperatura y el tiempo de esterilización de algunos alimentos). Estos procesos combinados pueden diseñarse tomando como base tanto las tecnologías tradicionales como las nuevas tecnologías. Por ejemplo, se ha sugerido la combinación de altas presiones hidrostáticas (APH) (Balasubramaniam y col., 2001; Roberts y Hoover, 1996), pulsos eléctricos de alta intensidad (PEAV) (Liu y Col., 1997, Smith y Col.2002; Elez-Martínez et al., 2004), ultrasonidos (Pagan y Col., 1998, 1999) e irradiación (Hausam y Col., 2002; Outtara y Col., 2002; Niemira,2001) con pH ácido y calor. También se ha recomendado su combinación con antimicrobianos (Morgan y Col., 2000, Masschalck y Col., 2001; Arce-Garcia y Col., 2002), e incluso la combinación de varias de estas nuevas tecnologías: ultrasonidos y altas presiones (Raso y Col., 1998a y b, Pagan y Col., 1998); ultrasonidos y pulsos eléctricos (Jin y Col., 1998), altas presiones y pulsos eléctricos (Knorr, 2001), etcétera. De todas estas combinaciones de las nuevas tecnologías parece que su combinación con el calor es la que normalmente resulta más efectiva y de más fácil transferencia al sector industrial. Los mecanismos a través de los cuales las combinaciones de tecnologías aumentan su eficacia bactericida son diversos, y en muchos casos todavía no bien conocidos. Sin embargo, en muchos casos la complementariedad entre tecnologías se basa en la aparición de daños subletales; en otras palabras: en muchos casos una de las tecnologías daña estructuras celulares, lo que sensibiliza a las bacterias a la otra tecnología. De ahí el interés en conocer la cinéticas de daño y reparación celular de las distintas tecnologías. 16 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS. Se ha demostrado que el zumo de manzana puede ser vehículo de transmisión de diversas toxiinfecciones alimentarias, lo que hace recomendable su higienización antes de la distribución comercial. Los zumos son alimentos especialmente sensibles al calor por lo que es necesario ajustar y optimizar los tratamientos térmicos. En la actualidad los tratamientos suelen calcularse a partir de datos de termorresistencia obtenidos en laboratorio en condiciones isotérmicas, mientras que el procesado industrial normalmente se basa en la aplicación de calentamientos anisotérmicos. Esta extrapolación puede ser causa de importantes errores porque existen pruebas fehacientes de que durante los tratamientos anisotérmicos pueden producirse fenómenos de adaptación y/o sensibilización de las células bacterianas al calor. Por el momento apenas si existen datos en la bibliografía sobre la termoinactivación microbiana en procesos anisotérmicos. Por otra parte, es posible que en algunos casos la simple aplicación del calor no sea suficiente para conseguir las suficientes garantías sanitarias sin afectar de forma irreversible la calidad de los zumos; en estos casos sería posible desarrollar procesos combinados alternativos. De los datos publicados puede deducirse que las combinaciones que incluyen el calor a temperaturas moderadas son las más eficaces, seguramente porque los daños infringidos por el calor, aunque insuficientes para inactivar a las células, las sensibilizan frente a las otras barreras. De ahí la importancia de estudiar los fenómenos de daño y recuperación celular. El objetivo de esta investigación es establecer si los datos obtenidos en condiciones isotérmicas permiten predecir los ritmos de inactivación en condiciones anisotérmicas y, en caso de no permitirlo, cuantificar las diferencias y explorar las causas. Para el estudio decidimos utilizar la cepa K12 de la colección KEIO (BW25113) para facilitar futuros estudios de los mecanismos de muerte, daño y adaptación al calor. 17 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. SUSPENSIONES MICROBIANAS. Para el desarrollo de esta investigación se utilizó la cepa parental de E. coli de la colección KEIO (BW25113). Esta cepa es una variante de E. coli K12 manipulada en laboratorio para la construcción de mutantes. Para preparar las suspensiones de trabajo se inoculaban, a partir de los crioviales almacenados en congelación, placas de agar triptona soja (Biolife, Milan, Italia) enriquecido con un 0,6% (p/v) de extracto de levadura (Biolife)(TSA.YE), por agotamiento en estría, y posteriormente se incubaban a 37ºC durante 24horas. A partir de estas placas se tomaba una colonia que se pasaba a un tubo de precultivo que contenía 7 ml de caldo triptona soja (Biolife) enriquecido con un 0,6% de extracto de levadura (Biolife) (TSB-YE), y se incubaba durante 8 horas a 37ºc en agitación, a 135 r.p,m (agitador mod. Rotabit; Selecta, Abrera, España). Tras la incubación se determinaba la concentración celular por recuento microscópico (Nikon, mod. L-kc, Nippon kogaku KK, Japón) en cámara de Thoma, y se inoculaba la cantidad adecuada (aprox 200 microlitros) del precultivo en 100 ml de TSBYE para alcanzar una concentración inicial de 106 UFC/ml, aproximadamente. Posteriormente se incubaba a 37 ºC durante el tiempo necesario para alcanzar la fase estacionaria de crecimiento. La Fig. 3. Muestra un esquema general de la metodología seguida para la obtención de las suspensiones. Como es bien sabido la acidificación del medio de cultivo, como consecuencia del metabolismo microbiano, puede inducir la expresión de genes de respuesta al stress que pueden modificar la termorresistencia microbiana. Para evitar estas interferencias se mantuvo constante el pH de medio de cultivo mediante el uso de un titrador automático (titrador mod Crison Buret; Crison). 18 Figura. 3 Protocolo de preparación de las suspensiones microbianas (Cebrián, 2009). Para establecer el tiempo adecuado de incubación para alcanzar la fase estacionaria de crecimiento, momento en que los microorganismos muestran su máxima termorresistencia, se elaboró la correspondiente curva de crecimiento en las condiciones experimentales descritas. Para elaborar las curvas de crecimiento se extraían, a intervalos predeterminados de tiempo, muestras de 0,1 ml de los frascos en incubación. Tras realizar las correspondientes diluciones decimales, en agua de peptona (Biolofe) al 0,1 % (p/v), se sembraban por duplicado placas de TSA-EL por homogeneización en masa, que se incubaban durante 18-48 horas a 37 ºC. El número de unidades formadoras de colonias (UFC/ml) se estimaba a partir de la media de los recuentos obtenidos en las dos placas correspondientes a cada dilución, de al menos dos diluciones decimales consecutivas. Las curvas de crecimiento se elaboraron representando el logaritmo del número de UFC/ml frente al tiempo de incubación. La figura 4. Muestra una curva de crecimiento típica en nuestras condiciones experimentales. 19 Figura. 4 Curva de crecimiento de E. coli Bw25113 en TSB.YE. Temperatura de incubación 37 ºC. Las curvas de crecimiento se ajustaron, para obtener los parámetros cinéticos, con la ecuación de Gompertz, Dónde: Nt: número microorganismos al tiempo t (UFC/ml) N0: recuento inicial (UFC/ml) C: log del recuento en la fase estacionaria – log N0 (ciclos de incremento en el recuento) M: tiempo al cual el cultivo alcanza su máxima velocidad de crecimiento (horas) B: velocidad de crecimiento relativo en el punto M (horas-1) El ajuste se realizó con la herramienta solver del programa Microsoft Office Excel 2002 (Microsoft Co., Redmond, Washington, E.E.U.U). La figura 5. ilustra el ajuste de los puntos a la curva calculada y la Tabla 1 los parámetros deducidos del modelo.       MtB e teCNNLog    0 0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 Tiempo (h) Log UFC/ml 20 Tabla 1. Parámetros cinéticos de crecimiento de E. coli. Figura. 5 Curva de crecimiento de E. coli modelizada con la ecuación de Gompertz. 3.2 MEDIOS DE TRATAMIENTO Con objeto de dar una aplicación práctica inmediata a los resultados, los experimentos se realizaron en zumo de manzana comercial (Auchan lote.L27512) adquirido en un centro comercial de Zaragoza. La composición del zumo, indicada en la etiqueta, se incluye en la Tabla. 2. El zumo tenía un pH de 3.35. Tabla. 2. Composición del zumo de manzana Valor energético 182 KJ (43kcal) 455 KJ (107 Kcal) %(p/v) Proteína 0,2g 0,5g 1% Hidratos de carbono 10,5g 26,3 9% azucares 10,3g 25,8 52% Cuando se consideró conveniente se realizaron experimentos en tampón Mcllvaine de pH 3,3 para establecer el efecto de los componentes del zumo en la termorresistencia de E. coli. Los tampones se prepararon mezclando soluciones 0,1M de ácido cítrico N 4,33473105 C 4,8247472 M 2,75971904 B 0,66270307 21 (Panreac, Castellar del Valles, España) y 0,2 M de fosfato disódico (Panreac) en la proporciones adecuadas, según el protocolo descrito por Johnson y Lindsay (1939). Una vez preparados los tampones se comprobó su pH (pHmetro mod. Basic 20+, Crison) y, cuando fue necesario, se corrigió hasta el valor deseado añadiendo los volúmenes necesarios de las soluciones de ácido cítrico o fosfato disódico. 3.3. TRATAMIENTOS TÉRMICOS. Las determinaciones de resistencia al calor se realizaron en un termoresistómetro TRSC (Condón y col., 1993) adaptado para la aplicación de rampas de calentamiento en condiciones controladas (Conesa y col., 2009). Como se puede observar en el esquema (figura. 6) y en la fotografía (fig. 7.) este equipo consta de una cámara cilíndrica de tratamiento de acero inoxidable y 400 ml de capacidad, cerrada por la parte superior con una tapa enroscable, también de acero inoxidable. Unidos a la tapa se hallan la resistencia eléctrica -utilizada para el calentamiento del medio-, el sistema de agitación, el sistema de extracción de muestras –controlado mediante una válvula solenoide-, una sonda termopar, un deflector –para mejorar la turbulenciay el sistema de presurización. El equipo también posee un dispositivo para la inoculación del cultivo –cerrado con un septum de cromatografía-, situado en la parte inferior de la cámara. Durante las determinaciones la presión y la temperatura se controlan, respectivamente, con un manoreductor y un circuito electrónico conectado a la sonda termopar sumergida en el vaso de tratamiento (sonda mod. Thermometer 639K, Crison). El mismo sistema electrónico controla la apertura –tiempode la válvula solenoide, permitiendo la recogida de muestras del interior del termoresistómetro. 22 Figura. 6 Esquema del Termoresistómetro TR-SC. Antes y después de cada sesión de trabajo se esterilizaban (5 minutos; 130ºC) tanto el equipo como el medio de tratamiento. Una vez estabilizada la temperatura de tratamiento, se inyectaban 0,2 ml de la suspensión microbiana con una jeringuilla (CR700-200 Hamilton Co., Reno, Nevada, E. E. U. U.) previamente desinfectada y, a intervalos predeterminados de tiempo, se extraían muestras de 0,2 ml directamente en placas de Petri estériles, a las que inmediatamente se añadía el medio de recuperación estéril, fundido y a 45ºC. Las placas se homogeneizaban y posteriormente se incubaban. Figura. 7 Termoresistómetro utilizado para las determinaciones de resistencia al calor. 29 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En esta investigación hemos determinado la resistencia al calor en condiciones isotérmicas de calentamiento de E. coli suspendida en zumo de manzana. A partir de las gráficas de supervivencia hemos establecido las cinéticas de muerte y de daño celular y calculado los parámetros de termorresistencia. Posteriormente hemos aplicado tratamientos anisotérmicos con distintos ritmos de calentamiento y, a partir de las curvas de inactivación, hemos deducido los valores DT y z aparentes. Comparando los parámetros de resistencia obtenidos con ambos métodos hemos observado una falta de acuerdo cuyas causas hemos explorado. 4.1. TERMORRESISTENCIA DE E. COLI EN CONDICIONES ISOTÉRMICAS. La figura 13 muestra las gráficas de supervivencia de E.coli tratada a 56, 58, 60, 62 y 64ºC en zumo de manzana tras la recuperación de los supervivientes en medios no selectivos (TSAYE) y selectivos (TSAYE-SC y TSAYE-DO). Cada punto en la figura representa la media de tres determinaciones realizadas con suspensiones diferentes en días distintos. Las barras de error representan la desviación estándar de la media. Como se observa en la figura ocasionalmente se produjeron desviaciones de la linealidad, mayoritariamente en forma de perfiles sigmoideos y, menos frecuentemente, de hombros. Los perfiles sigmoideos suelen asociarse a fenómenos de adaptación microbiana al estrés durante el propio tratamiento; mientras que los hombros suelen achacarse a fenómenos de daño y recuperación celular. Según algunos autores, durante los primeros momentos del calentamiento los daños infringidos a la célula son fácilmente reparables por lo que el número de supervivientes disminuye lentamente; sin embargo, a medida que se prolonga el tratamiento se supera la capacidad de reparación celular y empieza el curso exponencial de inactivación (Gould.G., 1989; Mackey B.M., 1982). Sin embargo, en nuestras gráficas, estos perfiles no parecían estar relacionados con unas condiciones concretas de tratamiento o recuperación, ni eran en general especialmente marcados por lo que decidimos, para un análisis más simple de los datos, ajustarlas con el modelo cinético tradicional, asumiendo un curso de inactivación exponencial 30 Figura. 13 Gráficas de supervivencia al calor de E. coli: a diferentes temperaturas. Medio de tratamiento: zumo de manzana. Medios de recuperación: TSAYE, ( ), TSAYE-SC, ( ), TSA+DO ( ). A partir del ajuste de las curvas de supervivencia obtuvimos los parámetros de resistencia del microorganismo en las diferentes condiciones experimentales. Los datos se presentan ordenados en las Tablas 4, 5 y 6. En las tablas, además del valor DT 31 estimado para cada réplica se incluye el valor medio con su desviación estándar y el coeficiente de determinación (R2) de las regresiones, para ilustrar la bondad de los ajustes. En el peor de los casos obtuvimos un valor R2 de 0,86, que no es inhabitual en la bibliografía, y en la mayoría de las ocasiones fue superior a 0,95. Tabla. 4. Tiempos de reducción decimal a distintas temperaturas de E. coli suspendido en zumo de manzana y recuperado en un medio no selectivo. Las gráficas de supervivencia se ajustaron asumiendo una cinética exponencial. Medio recuperación Tª tratamiento DT DT - DS R2 TSA +YE 56ºc 27,624 26,7678 0,8675 0,9803 25,889 0,9837 26,789 0,9751 58ºC 7,942 8,4166 0,4413 0,8981 8,493 0,9303 8,814 0,9112 60ºC 0,758 0,7865 0,0262 0,9587 0,790 0,9689 0,810 0,9701 62ºC 0,606 0,6434 0,0336 0,971 0,672 0,9888 0,651 0,9891 64ºC 0,232 0,2349 0,0054 0,9809 0,231 0,9433 0,241 0,9818 32 Tabla. 5 Tiempos de reducción decimal a distintas temperaturas de E. coli suspendido en zumo de manzana y recuperado en un medio con la concentración máxima no inhibitoria de cloruro sódico. Las gráficas de supervivencia se ajustaron asumiendo una cinética exponencial. Medio recuperación Tª tratamiento DT DT - DS R2 Selectivo con SC 56ºC 5,3590 5,4293 0,0771 0,9025 5,4171 0,8664 5,5118 0,9116 58ºC 2,2706 2,2707 0,0276 0,9401 2,2431 0,9322 2,2984 0,9381 60ºC 1,9821 2,0997 0,1063 0,9363 2,1281 0,9278 2,1890 0,9410 62ºC 0,3882 0,3485 0,0316 0,9423 0,3921 0,9097 0,4018 0,9141 64ºC 0,3209 0,3940 0,0070 0,8719 0,3831 0,8970 0,3416 0,9010 33 Tabla. 6. Tiempos de reducción decimal a distintas temperaturas de E. coli suspendido en zumo de manzana y recuperado en un medio con la concentración máxima no inhibitoria de desoxicolato sódico. Las gráficas de supervivencia se ajustaron asumiendo una cinética exponencial. Medio recuperación Tª tratamiento DT DT - DS R2 Selectivo con DO 56ºC 6,0277 5,7548 0,2366 0,9474 5,6053 0,9683 5,6314 0,9718 58ºC 1,9197 1,9744 0,0673 0,9292 2,0496 0,952 1,9541 0,9712 60ºC 0,4124 0,4105 0,0394 0,8974 0,3702 0,859 0,4490 0,9010 62ºC 0,2831 0,2499 0,0340 0,9683 0,2150 0,9658 0,2516 0,9691 64ºC 0,0675 0,0679 0,0190 0,9352 0,0872 0,9992 0,0491 0,9526 Con los valores medios incluidos en las tablas 4, 5 y 6 construimos las correspondientes gráficas de termodestrucción (Figura 14), representado los logaritmos de los tiempos de reducción decimal frente a las temperaturas de tratamiento y, a partir de ellas, calculamos los valores z. 34 Figura 14. Gráficas de termodestrucción de E. coli Bw2511 tratada en zumo de manzana y recuperada en medios no selectivos (TSAYE) y selectivos (TSAYE-SC y TSAYE-DO). . TSA+ YE ( ), TSA+ NaCl ( ), TSA+DO ( ). El valor z de E. coli Bw2511 resultó ser, en las condiciones habituales de tratamiento (calentamientos isotérmicos) y recuperación de supervivientes (TSAYE) de 4,6 ºC, muy semejante al obtenidos por otros autores en condiciones de tratamiento semejantes (Mackey, 2000). Además, como se observa en la figura 14, los valores z obtenidos en las diferentes condiciones de recuperación no difirieron significativamente (p>0.05). Esta observación es importante porque indica que la termodependencia de las reacciones que conducen a los daños de la membrana citoplasmática, la membrana externa y la muerte celular es la misma, de lo cual podría deducirse que estos fenómenos están directamente relacionados. Aunque esta afirmación pueda parecer una obviedad, lo cierto es que a día de hoy todavía no se ha establecido una relación directa 35 entre los fenómenos de daño térmico en las envolturas celulares y la muerte microbiana por el calor. Desde un punto de vista aplicativo estos resultados también tienen interés. Como hemos afirmado en la introducción, muchos procesos combinados se basan en que los daños subletales producidos por unas tecnologías pueden sensibilizar a los supervivientes frente a otras. A este respecto nuestros datos indican que las eventuales ventajas de un proceso combinado que incluya tratamientos térmicos se mantendrán cualquiera que sea la temperatura de tratamiento, obviamente dentro del rango de temperaturas capaces de producir daños subletales. Por ejemplo, como se desprende de la figura 14 si un proceso combinado que incluye el calor se basa en que la otra tecnología inactiva a las células cuyas envolturas se encuentran dañadas térmicamente, la combinación será igual de ventajosa si se aplica a 64 o a 57 ºC. A ambas temperaturas el proceso combinado permitiría reducir el tiempo de tratamiento, respecto del térmico a la misma temperatura, unas diez veces. 4.2. INACTIVACIÓN DE E. COLI EN CONDICIONES ANISOTÉRMICAS. La idea de estimar la termorresistencia en condiciones anisotérmicas es antigua. En los años 70 el planteamiento era que a partir de un único experimento sería posible calcular los valores DT y z mediante cálculos matemáticos sencillos (Reichert et al., 1988). A finales de los años 70 y durante los 80 comenzó a estudiarse la inactivación de células vegetativas en los procesos de pasteurización siguiendo los mismos criterios que hasta entonces se utilizaron para el estudio de la inactivación de esporos en los procesos de esterilización. Este nuevo enfoque permitió observar desviaciones del orden logarítmico de destrucción mucho más marcados y frecuentes y, a partir de estas observaciones, se llegó a demostrar que las células vegetativas podían adaptarse al calor durante el propio tratamiento (Splittstoesser, 1991; Scholte, 1995; Alwazeer y col 2002). En la actualidad se están estudiando los mecanismos moleculares de estos procesos de adaptación. Por tanto, a día de hoy la duda es: ¿Son adecuados los tratamientos anisotérmicos de pasteurización aplicados en la industria, que mayoritariamente se han calculado a partir de datos obtenidos en laboratorio en condiciones isotérmicas. 36 Para contestar a esta pregunta diseñamos unos experimentos consistentes en someter a E. coli a tratamientos anisotérmicos con distintos ritmos de calentamiento. Para calcular adecuadamente los tiempos de muestreo asumimos que los parámetros de resistencia no se veían afectados por el ritmo de calentamiento, circunstancia en la que la inactivación alcanzada sería la suma de la eficacia letal acumulada para cada tiempo. Los resultados obtenidos en estos experimentos se muestran en la figura 18. Cada una de las gráficas de la figura incluye la curva de inactivación teórica, calculada a partir de los datos de termorresistencia en condiciones isotérmicas, en color azul, y los datos obtenidos experimentalmente en dos réplicas independientes. Para cada ritmo de calentamiento se incluyen los resultados obtenidos incubando los supervivientes en un medio no selectivo y en medios selectivos con cloruro sódico y Desoxicolato 37 38 Figura 18. Gráficas de inactivación térmica de E.coli sometida a tratamientos anisotérmicos con distintos ritmos de calentamiento y recuperadas en distintos medios: Curva teórica ( ), Valores experimentales ( ) ( ). Como se observa en las gráficas de la figura 18 existe un ligero desajuste entre los valores predichos y los obtenidos experimentalmente cuando el ritmo de calentamiento era de 2 ºC/min. Estos desajustes parecían ir aumentando al acelerar el ritmo de calentamiento. Con objeto de poder cuantificar la magnitud de los cambios decidimos ajustar las curvas de inactivación con la ecuación propuesta por López et al. (1994b). Utilizando la herramienta solver de Excel ajustamos los datos experimentales a la ecuación considerando como variables un valor DT de referencia (en nuestro caso el D56) y el valor z. El programa combina ambos valores dando como resultado aquellos que minimizan la suma de los cuadrados de las desviaciones entre teóricos y experimentales. Los resultados de los ajustes se muestran en las tablas 7, 8 y 9. Tabla 7. Valores D56 y z estimados a partir de la curvas de inactivación en condiciones anisotérmicas con la ecuación de López et al (1994b). Los resultados experimentales se obtuvieron cultivando los supervivientes en TSAYE. Ritmo calentamiento (ºC/min) D56 (min) Z (ºC) 1,94 5,21 4,22 1,96 5,08 4,024 5,39 5,44 7,509 5,38 3,92 8,34 7,41 1,03 9,57 7,45 1,1 9,36 45 6. BIBLIOGRAFÍA.  Anese, et al., 2002). Effect of equivalent thermal treatments on the color and the antioxidant activity of tomato purees. Journal of Food Science 67 (9): 3442-3446.  Ahmed, et al., (2004). 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