Repositorio Institucional de Documentos

Trabajo Fin de Máster Análisis comparativo de los métodos utilizados para la evaluación de la calidad de la planta de encina (Quercus ilex subsp. ballota (Desf.) Samp.) micorrizada con trufa negra (Tuber melanosporum Vittad.) Autor Antonio C. Andrés Alpuente Directores Sergio Sánchez Duran Javier A. Aguirre De Juana Escuela Politécnica Superior de Huesca 2013 AGRADECIMIENTOS Al Doctor Juan José Barriuso Vargas por darme la oportunidad de trabajar en su equipo y por su disposición en toda esta andadura trufícola. Al Doctor Sergio Sánchez Durán y al Doctor Javier Aguirre de Juana, Directores de este proyecto, por su ejemplo constante de buen humor, trabajo, complicidad y esfuerzo. A mis compañeros de trabajo, Laura, Sandra, Karina, Vittus, Nacho, María y Pablo. A la Doctora Cristine Fischer por su disposición en aleccionarme en su metodología. A los viveristas que han participado en este proyecto con sus plantas. A mis amigos. Manu, con quien siempre me meto en algún “fregao” y siempre salimos victoriosos. A Afif por los mail urgentes precongreso y por su complicidad investigadora. A Jorge Málaga por esos ratos deportivos y festivos. A la Escuela de Movera por su disposición a colaborar con mis estudios. A mi familia por estar siempre ahí, para lo que haga falta. ÍNDICE RESUMEN / ABSTRACT / RIASSUNTO / RESUME Pág. 1.- INTRODUCCIÓN 1 1.1.- La Trufa 1 1.1.1.- Taxonomía y morfología 1 1.1.2.- Ciclo biológico 9 1.1.3.- El cultivo de la trufa 10 1.2.- La planta micorrizada y la evaluación de su calidad 13 1.2.1.- La calidad forestal de la planta y su caracterización 16 1.2.2.- Posibles contaminantes en vivero 20 1.2.3.- Situación actual de la evaluación de planta micorrizada por T. melanosporum en Europa 24 2.- OBJETIVOS 33 3.- MATERIAL Y MÉTODOS 35 3.1.- Diseño experimental 35 3.2.- Selección de viveros y muestreo de lotes 35 3.3.- Preparación de muestras y mediciones biométricas 38 3.4.- Procesos comunes a todos los métodos aplicados 41 3.5.- Evaluación de la planta de acuerdo a cada metodología 44 3.6.- Diseño del análisis estadístico 48 4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51 4.1.- Aptitud forestal y biométrica 51 4.2.- Aptitud micorrícica 56 4.2.1.- Porcentajes de micorrización de T. melanosporum 56 4.2.2.- Aptitud hongos contaminantes 62 4.3.- Análisis del tiempo invertido en determinar el porcentaje de micorrización según los métodos estudiados 63 4.4.- Discusión de los diferentes métodos 64 4.4.1.- Metodología CEAM-Valencia Reyna et al. (1997) 64 4.4.2.- Metodología INRA-ANVAR Chevalier et al. (1972) 65 4.4.3.- Metodología Universidad de Perugia Bencivenga et al. (1987) 66 4.4.4.- Metodología INIA-Aragón Palazón et al. (1999) 67 4.4.5.- Metodología Universidad de Lérida Fischer y Colinas (1996) 68 4.4.6.- Discusión general sobre los métodos utilizados 69 5.- CONCLUSIONES 71 6.- BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA 73 ANEJO: Descripción de los principales métodos 79 1. Metodología CEAM-Valencia, Reyna et al. (1997) 80 2. Metodología INRA-ANVAR, Chevalier et al. (1972) 85 3. Metodología Universidad de Perugia, Bencivenga et al. (1995) 89 4. Metodología INIA-Aragón, Palazón et al. (1999) 98 5. Metodología Universidad de Lérida, Fischer y Colinas (1996) 102 RESUMEN Análisis comparativo de los métodos utilizados para la evaluación de la calidad de la planta de encina (Quercus ilex subsp. ballota (Desf.) Samp.) micorrizada con trufa negra (Tuber melanosporum Vittad.) La calidad de partida de la planta micorrizada con Tuber melanosporum Vittad. es uno de los factores principales que determinan el éxito o el fracaso de una plantación trufera. Asegurar ciertos niveles de calidad implica proteger al agricultor, el cual mantendrá dichas plantas durante gran cantidad de años en el campo si la evolución de la plantación es favorable. El flujo de este tipo de material entre los diferentes países de la UE e incluso de otros continentes aumenta cada vez con mayor rapidez, motivo por el cual debe trabajarse en la obtención de un método de certificación común. Existen 5 métodos más habituales, documentados y publicados para efectuar dicho control, 3 de ellos se emplean en diferentes regiones españolas y los otros dos en Francia e Italia. Todos ellos se basan en el establecimiento de un porcentaje de micorrización, aunque éste es calculado de diferente modo en cada uno de ellos. Alguno además, da una estimación del número total de micorrizas de la planta. La mayor parte de ellos son destructivos. Se evaluaron 12 plantas por lote, de 5 lotes pertenecientes a 2 viveros, empleando con cada una de ellas los 5 métodos de control de calidad antes mencionados. Además se midieron diferentes parámetros dasonómicos implicados en la calidad forestal del material vegetal y otros como el tiempo de análisis que requiere cada método. Se encontró una fuerte correlación entre los porcentajes de micorrización que proporciona cada método pero no en su capacidad de valorar la aptitud de cada uno de los lotes. Se proporciona una discusión sobre las ventajas e inconvenientes de cada uno de ellos y sobre las características que debería poseer una nueva metodología de control de planta micorrizada con trufa negra. Palabras clave Tuber melanosporum, Quercus ilex, micorrización, viveros, certificación ABSTRACT Comparative analysis of the methods used for the evaluation of the quality of oaks (Quercus ilex subsp. ballota (Desf.) Samp.) mycorrhized with the black truffle (Tuber melanosporum Vittad.) Quality of plants mycorrhized with Tuber melanosporum Vittad. is one of the main factor involved in the success or failure of the truffle crop. Thus, acceptable quality level of those plants will be important for the farmer who keeps truffle crop for so many years. Mycorrhized plants flow has grown fast between European countries and even countries from different continents, for this reason an evaluation method shared for all of them is needed. Five evaluation methods are published and the most common; three of them are performed in Spain and the other two in France and Italy. All of them are based in the percentage of mycorrhization, but is evaluated differently in every method and one method estimates the total number of mycorrhizas. Most of them are destructive. Twelve plants for each batch and five batches from two nurseries were evaluated by the five methods above mentioned. Moreover, several biometric indicators of the forest quality were also analyzed as the time required for every method. We found a strong correlation between the percentages of mycorrhizal provided by each method but not in their ability to assess the suitability of each batch. We discuss the advantages and disadvantages for every method and which characteristic must have a new evaluation method for black truffle mycorrhized plants. Keywords Quercus ilex, Tuber melanosporum, certification, nurseries, mycorrhization RIASSUNTO Analisi comparativo dei metodi utilizzati per la valutazione della qualitá della pianta di quercia (Quercus ilex L. subsp. ballota) micorrizati con tartufo nero (Tuber melanosporum Vittad.) La qualità della pianta micorrizata con Tuber melanosporum Vittad. é uno dei fattori principali che determinano il successo o il fallimento di una piantagione di tartufo. Garantire determinati livelli di qualità significa proteggere l'agricoltore, che manterrá le piante nel campo per molti anni se l'evoluzione della piantagione è favorevole. Il flusso di questo tipo di materiale tra i diversi paesi dell'UE e anche altri continenti aumenta sempre più rapidamente, ragione per cui é necessario lavorare per ottenere un metodo di certificazione comune. Existono 5 metodi più abituali documentat e pubblicati per effettuare tale controllo, 3 di essi sono utilizzati in diverse regioni della Spagna e gli altre due in Francia e in Italia. Tutti si basano sullo stabilire una percentuale di micorrizazione, anche se questa è calcolata in modi diversi in ciascuno di essi. Qualcuno di essi dà una stima del numero totale di micorrize della pianta. La maggior parte di loro sono distruttivi. Sono state analizzate 12 piante per ogni lotto di 5 lotti appartenenti a 2 vivai. Per ogni pianta sono stati impiegati i 5 suddetti metodi di controllo di qualità. Inoltre sono stati misurati i diversi parametri biometrici coinvolti nella qualità forestale del materiale vegetale ed altri come il tempo di analisi richiesto da ciascun metodo. Si é trovata una forte correlazione tra le percentuali di micorrizazione che fornisce ogni metodo ma non nella capacità di valutare ciascuno dei lotti. Si fornisce una discussione sui vantaggi e gli svantaggi di ciascuno di metodi e sulle caratteristiche che dovrebbe avere una nuova metodologia per il controllo della pianta micorrizata con tartufo nero. Parole chiave Quercus ilex, Tuber melanosporum, certificazione, vivai, micorrizazione 6 Fig.-6 Morfología y anatomia de lãs ectomicorrizas de T. melanosporum: a. Ápices micorrizados b. Manto pseudoparenquimático c. cistidios. La morfología externa de las ectomicorrizas no sólo depende del hongo sino también de la planta simbionte, la cual gobierna caracteres como tamaño y tipo de ramificación, como puede observarse en las figuras 7, 8 y 9. El aspecto morfológico y el color de las micorrizas también varían según las épocas del año, teniendo cada hongo un periodo más o menos favorable para su observación según Giraud (1988). El mismo autor define el periodo de octubre a mayo como el más favorable para observar las micorrizas de T. melanosporum. La evolución mensual del número de ápices viejos de T. melanosporum es mucho más estable. En verano, las plantas tienen menor número de micorrizas, pero no hay ningún mes concreto en que se haya observado una mayor presencia de ápices viejos de trufa negra a b a c 7 Fig.-7 Micorrizas de T. melanosporum sobre Quercus ilex Fig.-8 Micorrizas de T. melanosporum sobre Corylus avellana. Fuente: www.deemy.de 8 Fig.-9 Micorrizas de T. melanosporum sobre Pinus halepensis. Fuente: Dominguez 2002 Fig.-10 Detalle del manto de una micorriza de T. melanosporum vista con microscopio de fluorescencia. 9 1.1.2 Ciclo biológico En el trascurso del cultivo de cualquier organismo es importante conocer su ciclo biológico (Fig.-11). Además en este caso, todavía quedan ciertas incógnitas que poco a poco, gracias al avance de los estudios en el campo de la biología molecular y la genética, están siendo resueltas (Riccioni et al. 2008). Fig.-11 Ciclo biológico de T. melanosporum (Modificado de Kües y Martin, 2011). Para primavera, por causas todavía desconocidas, la espora germina emitiendo una hifa fina que pronto ramificará en busca de los ápices radiculares de algún árbol susceptible de ser infectado. En este proceso contribuye la flora microbiológica asociada al carpóforo (Rivera, 2009). El hongo se introduce entre las células formando la micorriza y empieza a emitir un nuevo micelio que ocupará todo el suelo que rodea al ápice infectado, pudiendo entrar en nuevos ápices. Este proceso se va repitiendo a 10 lo largo de los años de vida de la plantación siendo aparentemente necesarios unos 5 años para alcanzar la biomasa suficiente para entrar en producción (Palazón et al. 2007). En torno al mes de mayo se produce la unión de hifas sexualmente compatibles, hecho que hasta hace poco aún estaba en duda, pues la escasa variabilidad genética encontrada en la especie hacía sospechar que era homotálica, es decir, tenía la capacidad de autofecundarse (Riccioni et al. 2008). Hoy en día se conocen los genes implicados en la compatibilidad sexual en esta especie, incluso puede saberse a qué tipo pertenecen micorrizas concretas (Rubini et al. 2011). A partir del engrosamiento de esta unión se formará la trufa. Antes se pensaba que los primordios se independizaban del ápice y comenzaba una fase saprofítica, pero de nuevo otro estudio demostró que la conexión entre la trufa y el árbol dura hasta su maduración (Zeller et al. 2008). Durante esta fase la trufa pasará de un peso de entre 0,001g o 0,05g (Fig.-12) a varias decenas de gramos. A medida que va creciendo irá emitiendo distintos tipos de aromas que atraerán a animales e insectos los cuales se alimentarán de ella produciendo el proceso de dispersión y cerrando el ciclo (Olivier et al. 2002). Fig.- 12 Primordios de T. melanosporum. En esta imagen se puede apreciar su color rojizo. Fueron recogidos el mes de agosto. Este periodo dura unos ocho meses, desde la aparición de los primordios hasta que madura la trufa, siendo bastante importante en esta fase la humedad del suelo, ya que en años malos para la trufa, las lluvias de finales de verano han sido beneficiosas para la posterior cosecha (Reyna, 2011). La maduración es muy escalonada y dura de noviembre a marzo. 1.1.3 El cultivo de la trufa La trufa puede encontrarse en la naturaleza de dos maneras distintas: De forma silvestre o cultivada. 11 La trufa silvestre, recolectada en quejigares, encinares, etc. contribuye con un mayor porcentaje a la producción total, pero está disminuyendo debido al escaso mantenimiento de los bosques, a la recolección furtiva con útiles inadecuados y al cambio climático (Reyna, 2011). La trufa procedente de plantaciones de árboles micorrizados va en aumento y, aunque hace poco tiempo que comenzó a cultivarse en España (40 años), muchas de ellas ya han entrado en producción (De Miguel, 2005). El cultivo de trufas mediante la plantación de especies forestales (encinas, robles, etc) previamente micorrizadas, se llama truficultura. Actualmente se realizan plantaciones en aquellas comarcas donde ya hay trufa natural en sus montes y también en otras zonas que presentan condiciones de suelos y clima favorables para el desarrollo del hongo. La truficultura se apoya en tres pilares: - Suelo y clima propicio - Planta bien adaptada al medio y bien micorrizada por la trufa - Prestar los apoyos necesarios al cultivo De modo general, una plantación requiere de un estudio previo del terreno -suelos calcáreos de textura favorableen climas mediterráneos-continentales, con 400-800 mm de precipitación anual, parte de ella en periodo estival, con una altitud entre 7001300 msnm (Reyna, 2011). Además es importante que el cultivo precedente no sea forestal, ya que para evitar la competencia de otros hongos ectomicorrícicos en la plantación (Reyna et al. 2006). Realizar la plantación requiere una preparación previa de la parcela, cerciorarnos en adquirir una buena planta, no solo de aspecto sino de calidad de micorrización. Una vez realizada la plantación los dos o tres primeros años nos cuidaremos de sacar la planta adelante con escardas, algún riego en verano y el trabajo de las calles entre hileras con cultivador durante la primavera y el inicio del verano. Suelen emplearse protectores forestales para evitar daños por heladas o por animales. En previsión del tamaño final de los árboles y para facilitar las labores se recomienda emplear un marco de 6x6 m como mínimo. El trabajo de las calles suele finalizar hacia el cuarto-sexto año cuando empiezan a aparecer los quemados (zona desprovista de vegetación herbácea por la acción alelopática del hongo) (Fig.- 13). La poda puede iniciarse hacia el tercer año. Si el riego en producción no va a ser posible puede ser interesante no podar salvo pequeñas intervenciones en árboles muy determinados. La producción suele iniciarse entre el sexto y el décimo año. El riego y su correcto manejo son fundamentales para 12 una producción regular y conseguir una buena rentabilidad de la plantación, principalmente en años de sequía estival. La apertura de pozos en el quemado enterrando una mezcla de materia orgánica con esporas o no, con o sin diferentes componentes que la puedan mejorar, parece fundamental a día de hoy para aumentar de forma importante la producción de trufas así como su calidad. El papel de las micorrizas en un ecosistema forestal es vital y debe contemplarse tanto desde la perspectiva del árbol como de la del hongo; en las truferas apenas se puede intervenir de forma directa sobre el micelio o las micorrizas, sin embargo, de forma indirecta sí se puede hacer a través del árbol (Sánchez, 2012). El periodo productivo de la plantación se desconoce, pero mantener la producción durante 25 años parece muy razonable (35 desde que se inicia la plantación), incluso más años con intervenciones de aclareos, podas, etc. La truficultura en España tiene un corto recorrido todavía, con toda seguridad se irán conociendo nuevos apoyos y técnicas para mejorar los rendimientos. Hoy día puede hablarse de producciones medias de 20-30 kg/ha en plantaciones adultas y un precio medio de 550 €/kg (Oliach et al. 2010). Fig.-13 Plantación de Quercus ilex micorrizada con T. melanosporum de 9 años de edad, en Sarrión (Teruel). Pueden observarse los quemados alrededor de las encinas. 13 1.2 La planta micorrizada y la evaluación de su calidad Con el conocimiento de la existencia de hongos ectomicorrícicos en las plantas de muchos ecosistemas naturales, llegó el reconocimiento de que la simbiosis podría manipularse para reforzar la productividad en programas de reforestación y cultivo de especies fúngicas. Se han desarrollado técnicas especiales que permiten a los hongos seleccionados colonizar plantas, previamente a la plantación en campo. La aplicación de estas técnicas ha facilitado la mejora de los resultados en cultivos forestales en muchas partes del mundo, particularmente en lugares con ausencia de fuentes naturales de inóculo de micorrización (Wilde, 1944; Shemakhanova, 1962; Stoeckeler y Slabauch, 1965; Mikola, 1969, 1973; Hacskaylo y Vosso, 1971). Durante estos años creció el interés en la posibilidad de recolectar cuerpos de fructificación de hongos ectomicorrícicos comestibles que se han usado como inóculo comercial para complementar tanto la dieta como los ingresos. Moser (1958) en Austria, Takacs (1967) en Argentina y Theodorou y Bowen (1973) en Australia, fueron pioneros en el uso de inóculo de hongos que eran fisiológica y ecológicamente apropiados para el lugar de plantación, con vistas a mejorar la actuación en los cultivos. La producción controlada de planta micorrizada con T. melanosporum, es una de las bases sobre las que se sustenta la truficultura de hoy en día. Desde que a finales de los años 60, la labor conjunta entre la Universidad y el IPLA de Turín con el INRA de Clermont-Ferrand, (Chevalier y Grente, 1973), permitió el establecimiento de un método seguro para la producción de plantas micorrizadas con dicho ascomiceto, han sido muchos los años transcurridos sin que los detalles de dicha metodología hayan visto la luz, por motivos evidentes de estrategia empresarial. Sin embargo, durante ese periodo, se han producido diversas modificaciones referentes a los contenedores, al tipo de substrato y al método de inoculación empleado, intentando una mayor seguridad y eficacia en la micorrización. Según Cocina et al. (2013), actualmente en España, se conocen un mínimo de 27 empresas viveristas especializadas en planta micorrizada, localizadas en su mayor parte en la provincia de Teruel (Tabla 1). El abastecimiento de plantones micorrizados con trufa negra, para las necesidades actuales de las nuevas plantaciones, está más que asegurado; sin embargo, las previsiones indican una progresiva reconversión de los cultivos de secano de zonas potencialmente truferas, hacia la forestación con frondosas micorrizadas. Las principales razones de esta reconversión son dos; por una parte, las ayudas 14 tradicionales de la Política Agraria Comunitaria (PAC) tienen un horizonte limitado y, en segundo lugar, las Comunidades Autónomas y las Administraciones Locales están apostando cada día con más fuerza por esta actividad, abriendo líneas de ayudas económicas bastante importantes, para proporcionar alternativas y colaborar en la diversificación agraria y en la forestación. En España, la aparición en el mercado de plantas micorrizadas no se produjo hasta finales de los años 80, utilizando envases en bolsa de plástico, con tierra esterilizada, e inoculando mediante una suspensión esporal, bien sobre semilla o sobre plántula. Los métodos de producción han ido mejorándose y adaptándose a los requerimientos de calidad, tanto de la planta como de la micorrización propiamente dicha; sin embargo, las técnicas utilizadas siguen manteniéndose en secreto, constituyendo uno de los principales valores de las empresas dedicadas a estos fines, que guardan celosamente su experiencia adquirida, protegida en ocasiones por patentes industriales, siendo normal, por ello, que el resultado final esté marcado con un precio en torno a los 6-8 euros/planta. Algo muy importante que ofrecen la mayoría de los viveros productores, de una cierta entidad, es el asesoramiento en el desarrollo de su proyecto trufero que integra el tipo de plantación adecuada, el seguimiento de la misma, los cuidados culturales y en ocasiones, hasta la recolección y comercialización de su producción. En este momento es posible obtener en vivero distintas especies arbóreas micorrizadas por la especie de hongo micorrícico deseado, para cubrir las necesidades de cada área, aunque el 95% de la producción es de encinas micorrizadas con T. melanosporum. A la hora de establecer una plantación, lo más habitual es recurrir a viveristas especializados que faciliten las plantas micorrizadas. El viverista asume plenamente la responsabilidad de que la especie está convenientemente micorrizada en las raíces de las plantas jóvenes para que en un futuro pueda ser productora de trufas. Cuando se realiza la plantación de un plantón micorrizado con T. melanosporum en el terreno comienza una dura batalla contra los hongos nativos del suelo en el que se instala, en su mayoría, más adaptados a las condiciones de la zona (Sourzat, 2004). Es muy importante que el material de partida para realizar la plantación sea de la mejor calidad, sobre todo en cuanto a porcentaje de ápices micorrizados por la trufa negra puesto que se evita en gran medida que puedan ser ocupados por otros hongos micorrícicos existentes pudiendo disminuir las futuras producciones de trufa. 15 Tabla 1 Viveros productores de planta micorrizada con Tuber sp en España (Modificado de Cocina et al. 2013). Se indica, además del contacto, si producen plantas micorrizadas con especies de géneros diferentes a Tuber. Nombre del vivero Contacto Otras Especies El Origen de la Trufa (Andalucía) www.elorigendelatrufa.com No Aragotruf S.L. (Aragón) www.plantastruferas.com No Cultivos Forestales y Micológicos (Aragón) www.cultivosforestales.com Si Hermanos Salvador Redón(Aragón) [email protected] No Inotruf, S.L. (Aragón) www.inotruf.com No Miguel Santafé Bertolín e Hijos (Aragón) Teléfono: + 34 978 78 04 29 No Trufico (Aragón) [email protected] No Turoltrufa (Aragón) http://turoltrufa.com No Viveros Daniel Bertolín (Aragón) www.trufasdanielbertolin.com No Viveros Hermanos Tolsá S.C. (Aragón) Teléfono: +34 659 887 561 No Vivero José Igual (Aragón) [email protected] No Viveros José Rozalén (Aragón) www.trufasrozalen.es No Viveros y Trufas La Incosa (Aragón) Teléfono: +34 978 72 80 12 No VITRUF (Castilla-La Mancha) www.vitruf.com No MICONATUR S.L (Castilla-La Mancha) www.campodetrufas.com Si Aire Puro de Urbión, S.L.L. (Castilla y León) www.airepurodeurbion.com No Viveros Encitruf (Castilla y León) www.encitruf.es No Viveros Forestales Santa Ana (Castilla y León) www.viverosforestalessantaana.com No Viveros Fuenteamarga (Castilla y León) http://viverosfuenteamarga.com/ Si Viveros Tuber (Castilla y León) [email protected] No Micología Forestal & Aplicada (Catalunya) www.micofora.com Si Viveros Alto Palancia (Com. Valenciana) www.planta-trufa-viveros-alto-palancia.es No Viver-truficultura (Com. Valenciana) www.viver-truficultura.com No Hifas da Terra (Galicia) www.hifasdaterra.com Si Thader Biotechnology S.L. (Murcia) www.thaderbiotechnology.es Si Viveros Alharabe (Murcia) www.viverosalharabe.com Si Viveros VEPLAM (La Rioja) www.sotoencameros.org No La planta de vivero debe cumplir los parámetros de calidad forestal y presentar un grado óptimo de micorrización por la especie inoculada, así como estar desprovista de otros tipos de micorrizas, aunque en ocasiones se producen contaminaciones por hongos típicos de viveros. A continuación se detallan todos estos parámetros. 22 Fig.- 17 Micorriza de Trichophaea woolhopeia y detalle del manto característico. Foto: Sánchez 2012. Contaminantes del géneroTuber La detección de micorrizas de otras especies del género Tuber no es muy frecuente pero cuando sucede implica descartar el lote entero ya que su venta puede considerarse como un fraude. En el caso de aparición de otros Tuber en la planta inoculada es más probable que se deba a un error del viverista en la identificación de los carpóforos empleados como inóculo, que a una insuficiente desinfección del sustrato. Teniendo en cuenta que un gramo de trufa madura puede albergar entre 5 y 20 millones de esporas (Bernal, 2008), cualquier error, aunque el carpóforo sea pequeño, puede repartir la contaminación por todo un vivero. Principalmente la confusión puede darse con T. brumale, y menos frecuentemente con T. aestivum. T. brumale es una especie similar a T. melanosporum y las épocas de fructificación de ambas se solapan. Aunque sus esporas poseen caracteres diferentes sólo los observadores experimentados son capaces de distinguirlas, lo cual es determinante a la hora de preparar un inóculo adecuado para producir la planta micorrizada. Los carpóforos son el mejor modo de diferenciarlas, pero deben encontrarse en buen estado de conservación y madurez (Fig.- 18): el peridio de T. brumale no es adherente y las venas de su gleba son más anchas y de un aspecto más grisáceo que las de T. melanosporum (Montecchi y Sarasini, 2000; Riousset et al. 2001). Sus micorrizas son 23 difícilmente diferenciables si son jóvenes y aún no han formado cistidios, ya que ambas poseen mantos con células epidermoides. El hecho de que en alguna ocasión hayan sido detectadas en planta de vivero (A. De Miguel, com. pers.) y su presencia en cierta cantidad de plantaciones como ha podido comprobarse en algunos trabajos (De Miguel y Sáez, 2005; Sánchez, 2008; Águeda et al. 2010; Sánchez, 2012), justifica la necesidad de controlar adecuadamente la planta para asegurar su ausencia. Fig.- 18 Carpóforos de Tuber melanosporum (izquierda y derecha) y T. brumale (centro), el primero podría confundirse con un carpóforo inmaduro de T. brumale. El caso de T. aestivum es menos problemático en vivero porque la posibilidad de confusión entre carpóforos es muy baja, incluso al no solaparse las épocas de fructificación es menos probable su aparición en un lote de trufa que se pretenda emplear para micorrizar planta. En cuanto a las micorrizas, T. aestivum es la que mejor se diferencia del resto, principalmente por su manto con células angulares y sus cistidios indivisos, largos y sinuosos (Agerer y Rambold, 2004-2013). Se debe comentar algunos aspectos relacionados con otra especie del género, T. indicum, que aún no ha sido detectada en España pero cada vez es más importante estar alerta por su posible entrada. T. indicum es una especie asiática extremadamente similar a T. melanosporum en multitud de aspectos: • Morfológicamente: sus micorrizas son idénticas y sus carpóforos muy parecidos, solamente se encuentran diferencias claras en la ornamentación de sus esporas (Riousset et al. 2001). Por este motivo, a nivel de control de planta de vivero, no puede asegurarse por morfología si se trata de una o de otra especie. • Genéticamente: ambas especies están muy cercanas. Incluso algunos autores se preguntan si podrían llegar a darse hibridaciones entre ellas (Murat et al. 2008). • Biogeográficamente: T. indicum posee un amplísimo rango de hábitats en los que puede fructificar y algunos de ellos coinciden con los de T. melanosporum (Yang, 1999; Wang et al. 2007), comportándose por tanto como especies vicariantes. 24 La calidad organoléptica es quizás la mayor diferencia entre las dos especies (D. Blanco, com. pers.) lo cual hace que el precio de venta de T. indicum esté del orden de 10 veces por debajo del de la trufa negra. Sin embargo, su demanda es enorme lo cual ha dado pie al establecimiento de plantaciones de árboles micorrizados con esta especie en China (Geng et al. 2009). La importación en fresco de carpóforos de T. indicum ha provocado ya su entrada en, al menos, una plantación en Italia destinada a producir T. melanosporum, en la cual se han localizado ectomicorrizas de esta especie (Murat et al. 2008) y en otra plantación de EEUU donde, además, ha llegado a fructificar (Bonito et al. 2011). No se ha localizado más información al respecto pero la posibilidad de que esté presente en alguna plantación española y francesa es tan alta que justifica la realización de prospecciones en viveros comerciales para evitar su entrada y en campo para comprobar su ausencia. 1.2.3 Situación actual de la evaluación de planta micorrizada por T. melanosporum en Europa La evaluación sobre la calidad de la planta se realiza por planta y por lote de plantas. Un lote es un conjunto de plantas que tienen una misma procedencia de la semilla, que se siembran a la vez, se inoculan con el mismo material y reciben las mismas prácticas de cultivo (Palazón et al. 1997) (aproximadamente cada lote contiene 1000 plantas). Los métodos usados actualmente para evaluar el estado de micorrización de plantas son los siguientes: Chevalier et al. (1972) INRA-ANVAR (Francia) Bencivenga et al. (1987) UNIVERSIDAD DE PERUGIA (Italia) Fischer y Colinas (1996) UNIVERSIDAD DE LERIDA (España) Reyna et al. (1997) CEAM-VALENCIA (España) Palazón et al. (1999) INIA-ARAGON (España) A continuación, se resume cómo se realiza la certificación de plantas micorrizadas en los países productores principales: España, Francia e Italia. 25 España La producción de planta micorrizada con trufa negra en nuestro país carece, en el momento actual, de una normativa legal que regule su producción y certifique su calidad a nivel de toda España. En diferentes reuniones coordinadas por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) se propusieron varias metodologías para la evaluación y control de la planta de Quercus, especialmente Q. ilex, micorrizada con T. melanosporum (Fischer y Colinas, 1996; Palazón et al. 1997, 1999; Reyna, 1997; Reyna et al. 2000). Dichas propuestas presentaban aspectos comunes, como la necesidad de establecer un control de los factores de producción, tales como las semillas, los sustratos, el agua de riego, los contenedores, el inóculo (Palazón et al. 1999; Reyna et al. 2000) y diferían fundamentalmente en el tipo de muestreo y en los umbrales mínimos admisibles de micorrizas y de los posibles contaminantes. Esta situación no es exclusiva de España, pues situaciones parecidas se dan en países como Italia y Francia, sin que se pueda establecer un criterio preferente que destaque sobre los demás. No obstante, en la Reunión del Grupo Europeo Tuber (GET) celebrada en Graus (España) en 2002, se instó a los diferentes países integrantes a elaborar un protocolo europeo de certificación único, protocolo GET, que pueda servir de referencia y que permita contrastarlo con los utilizados en la actualidad por los controladores actuales. En cualquier caso, la situación actual en España viene condicionada por la existencia de Gobiernos Autonómicos, en los que cada uno en particular posee competencias para establecer las normas de calidad y de certificación de las plantas producidas dentro de su territorio, e incluso para delegar dicha misión a Instituciones o Entidades locales (Universidad, Patronatos, etc.). Es esperable y deseable que, con el paso del tiempo, puedan unificarse las normas y establecer algún tipo de control obligatorio por parte del Estado, que garantice la ausencia de micorrizas invasoras, dentro de nuestro entorno ecológico, con atención especial hacia las especies de Tuber asiáticas, principalmente T. indicum. Ante la situación actual sobre la evaluación de la calidad de planta micorrizada, se ha considerado que este trabajo debería aportar información importante para futuras decisiones en base a la unificación de criterios. A este respecto, el día 5 de junio de 2012 se constituyo en Madrid el grupo de Trabajo, del que el autor forma parte integrante, denominado de Micología-Micorrizas por un 26 mandato legal como acuerdo del Comité de Mejora y Conservación de Recursos Genéticos Forestales (en adelante CMCRGF) que es el órgano de Coordinación entre Estado y CCAA en la materia. Estableciéndose en el mismo que el camino a seguir del Grupo de Trabajo será el siguiente: Elevación de un informe al Comité Nacional de Directores para posteriormente pasar a la Conferencia Sectorial como pasos previos a su tramitación como norma con el rango de RD. Volviendo a la situación actual en España, las comunidades autónomas en las que se evalúa planta micorrizada son: Aragón (Huesca y Teruel), Cataluña, Castilla y León, Comunidad Valenciana, Castilla La Mancha, Navarra, Andalucía, Galicia y Murcia. Huesca El Centro de Investigación y Experimentación en Truficultura de Graus (Diputación de Huesca) emite un informe escrito de valoración de lotes de planta del vivero en particular a analizar (Fig.-19). Los análisis se realizan únicamente a los lotes previamente seleccionados por el comprador y como requisito imprescindible para que sea concedida la subvención de establecimiento de nuevas plantaciones truferas de la Diputación de Huesca. El método de análisis corresponde al de Palazón et al. (1999) INIA-ARAGON. Fig.-19 Certificado emitido por el CIET (Huesca) declarando la idoneidad del lote para truficultura. 27 Teruel La micorrización está controlada por los Servicios Agropecuarios de la Diputación Provincial de Teruel. Los viveros de Teruel están suscritos al convenio para la producción de planta trufera existente entre la Diputación Provincial de Teruel y los viveristas provinciales. Según este convenio dicha Diputación controla, anualmente, la producción de planta de los viveros, certificando la calidad de la misma en las etiquetas numeradas con las que los plantones salen a la venta (Fig.-20). Dichas etiquetas dan fe de que se trata de plantones micorrizados por trufa negra (T. melanosporum). El método de análisis corresponde al de Palazón et al. (1999) INIAARAGON. Fig.-20 Etiqueta que garantiza el control de planta micorrizada por la Diputación Provincial de Teruel Cataluña La Universidad de Lérida y el Centro Tecnológico y Forestal de Cataluña evalúa el grado de micorrización de diferentes lotes de toda España, informando sobre los resultados a los compradores de planta micorrizada para que ellos usen o no esos datos en la compra. El método empleado de análisis es el de Fischer y Colinas (1996). Castilla León El departamento de Investigación Forestal de Valonsadero (Soria), emitía un informe escrito de valoración de lotes de planta del vivero en particular a analizar. Empleaban el método de Fischer y Colinas (1996) de la Universidad de Lérida. Comunidad Valenciana Se emite un informe escrito de valoración por CEAM (Centro de Estudios Ambientales del Mediterráneo) y la Universidad Politécnica de Valencia de lotes de planta del vivero en particular a analizar. Analizan y evalúan la planta por el método de Reyna et al. (1997) de la Universidad de Valencia. 28 Castilla La Mancha El Departamento de Biología de la Universidad de Alcalá de Henares y el Centro Nacional de Recursos Genéticos Forestales El Serranillo (Guadalajara) utilizan el método de Fischer y Colinas (1996) para evaluar planta micorrizada. Navarra La Facultad de Biología de la Universidad de Navarra, emplea un método propio de evaluación modificado de Brundett (2008). Andalucía No existe ninguna entidad que evalúe la planta. Evaluación por el método de Palazón et al. (1999) por los propios viveristas. Galicia No existe ninguna entidad que evalúe la planta. Evaluación de la planta por el método de Fischer y Colinas (1996) en el Departamento de Investigación Forestal de Valonsadero (Soria). Murcia El Centro Nacional de Recursos Genéticos Forestales El Serranillo (Guadalajara) evalúa sus plantas de viveros de Murcia por el método de Fischer y Colinas (1996). Francia Los viveristas franceses disponen de un servicio de certificación del INRA (Institut National de la Recherche Agronomique) que proporciona a sus clientes la garantía de que las plantas están bien inoculadas. El CTIFL (Centre technique interprofessionnel des fruits et légumes) supervisa la producción y las plántulas micorrizadas con trufa identificable con un etiquetado específico (Fig.-21). 29 Fig.-21 Etiquetado especifico para definir la calidad de planta micorrizada en Francia El control comprende tres fases distintas durante la temporada de crecimiento y una auditoría de cumplimiento de la instalación. Control de las trufas para la inoculación en planta Identificación individual de todas las trufas con examen microscópico de la especie a inocular y estado de madurez de la espora, llevado a cabo por un agente del Ctifl. El objetivo es asegurar la especie inoculada y evitar el riesgo de "T. indicum" o "T. brumale." Control de calidad forestal: este control lo realiza el viverista según normativa comunitaria. Ver tabla 4. Tabla 4 Medidas establecidas en Francia para altura y diámetro de cuello en plantas micorrizadas Edad planta (años) 1 1 2 2 2 Especies Alt. mínima Dtro. mínimo Alt. mínima. Alt. máxima Dtro. mínimo Quercus pubescens. 12 cm 4 mm 12 cm 60 cm 4 mm Quercus ilex 15 cm 4 mm 15 cm 60 cm 4 mm Quercus robur 20 cm 6 mm 20 cm 60 cm 6 mm Corylus avellana 20 cm 5 mm 20 cm 60 cm 5 mm 30 El vivero tiene una clasificación previa antes de la aprobación de un agente del CTIFL y se compromete a presentar al mercado y controlar las plantas que cumplen con los criterios de calidad definidos. Control de las plantas inoculadas: para plantas con uno o dos años y excepcionalmente plantas de tres años. Un agente del CTIFL realiza el muestreo aleatorio tomando 10 plantas por lote (1000 plantas) y se evalúa cada lote por el método de Chevalier. Los lotes de un año mal micorrizados (valores inferiores a 2,5) se pueden mantener y se vuelve a hacer el control al año siguiente. Si no lo pasa se destruyen los lotes. Al final de la temporada, un agente de CTIFL hace una visita al vivero para comprobar la presencia de partidas rechazadas y garantizar que los lotes aceptados son los que se vendieron. Los lotes rechazados se destruyen en presencia del agente. Italia La planta producida es controlada y certificada por la Universidad de L’Aquila, departamento de Ciencias ambientales o La Universidad de Perugia, Departamento de Biología Aplicada. Éstas realizan el control y la certificación de la planta micorrizada de varios viveros italianos y algunos franceses, emitiendo un certificado de validez del lote (Fig.-22). La metodología utilizada está constituida por un método de observación y conteo de micorrizas (Bencivenga et al. 1987) y un método biomolecular. La plantas micorrizadas van acompañadas siempre, de un pasaporte fitosanitario según normas CE (generos Quercus, Pinus o Populus) y una Certificación forestal Lex 269-73 (generos Quercus, Pinus, Populus o Tilia). 31 Fig.-22 Certificado emitido por la Universidad de Perugia declarando la idoneidad del lote para truficultura 38 3.3 Preparación de las muestras y mediciones biométricas Partimos de una planta en cepellón en la cual sus raíces se han adaptado al volumen del recipiente que la contiene, bien entramadas en el sustrato. Dado que cada una de las 120 plantas debía ser analizada por los cinco métodos, los análisis se ordenaron de modo que un método no interfiriese con el siguiente. La mayoría de los métodos usados en este trabajo para evaluar las plantas son destructivos, esto es, la planta se somete a una limpieza rigurosa a nivel de sistema radicular para poder manipularla y evaluarla según cada metodología aplicada. Sólo el método de CEAM-Valencia (Reyna et al. 1997), propone analizar un pequeño volumen del cepellón de la planta. En este sentido esta metodología ha sido elegida como la primera a emplear, tomando cilindros muestra de cada planta, para así poder posteriormente realizar una limpieza adecuada del sistema radicular de todas las plantas y someterlas al resto de metodologías. Primeramente las plantas son etiquetadas con un código indicando el vivero al que pertenecen, al lote y el número de planta como se indica en la figura 26. Fig.-26 Plantas procedentes de los dos viveros etiquetadas sobre la base del cuello. 39 Como se ha indicado en primer lugar, se extrae el cilindro de sustrato correspondiente al método de Reyna et al. (1997) de todas las plantas. Todos los cilindros se conservan a -20ºC debidamente etiquetados hasta su análisis. Acto seguido se realiza un lavado grosero (Fig.-27) de cada planta con objeto de asegurar la mínima perdida de micorrizas. En un cubo con agua se introducen las plantas para ablandar el sustrato que rodea a las raíces y así de manera más sencilla ir eliminado la mayor parte del mismo, para posteriormente realizar un lavado más preciso. Fig.-27 Plantas sometidas a un lavado grosero para eliminar la mayor parte de sustrato. Antes de proteger individualmente cada planta en una bolsa de plástico, se realizan las primeras mediciones para poder evaluar la calidad forestal de cada una. Estas mediciones según RD son el diámetro de la zona basal del tronco y la longitud de la parte aérea (Fig.-28 y 29). Además se han tomado otras medidas como la longitud del sistema radicular, la esbeltez (Longitud tallo (cm)/diámetro cuello (mm)) y el volumen radicular (ml), que podrían servir para poder hacer algún tipo de análisis comparativo. Sobre una hoja de cálculo, se van introduciendo los datos para su posterior tratamiento en un programa de análisis estadístico. 40 Por otro lado se anotaron posibles alteraciones relacionadas con la planta y su sistema radicular. Una vez realizadas estas mediciones, las plantas son embolsadas individualmente y congeladas en cámara a –20ºC, dado que el número de plantas es alto como para realizar todos los análisis con la planta fresca. Si se mantienen vivas, la micorrización podría variar enormemente entre el primer y el último análisis (8 meses aproximadamente). Así pues, la congelación nos permite analizarlas con una mayor visión de conjunto durante un periodo más extenso sin apenas sufrir alteraciones en sus micorrizas. Fig.-28 Medición del diámetro del cuello de planta con calibre digital. 41 Fig.-29 Medición del sistema aéreo de la planta a partir del cuello. 3.4 Procesos comunes a todos los métodos aplicados Descongelación por lotes de plantas para su evaluación En cubetas, con el tamaño adecuado para cubrir con agua totalmente el sistema radicular de la planta, se dejan descongelar durante un periodo más bien corto (alrededor de 10 minutos). Lavado delicado en bañera de ultrasonidos Se introduce la cubeta que porta la planta o el cilindro de sustrato (método de Reyna et al. (1997) en una baño de ultrasonidos, que es un dispositivo de limpieza que utiliza los ultrasonidos sobre un medio acuoso para intentar separar el sustrato adherido en las raíces de la planta. Se utilizo una solución de Tween 80 al 0,2% para facilitar el proceso de separación aunque resulto bastante ineficaz dado que el entramado de raíces con el sustrato era muy grande. Medición aproximada del volumen radicular de cada planta Una vez limpia la planta, se procede a medir el volumen radicular de cada una con ayuda de una probeta de 500 ml rellenada hasta la división de 450 ml. Se introduce la planta y se mide la variación del volumen que ha tenido lugar al introducir la raíz de la 42 planta hasta la base del cuello (Fig.-30). Después de cada medida se rellena si es necesario al nivel de partida para la nueva lectura. Cuando se encuentran "conglomerados de sustrato con micorrizas" se intentan separar con las pinzas presionando sobre ellos para intentar disgregarlos lo más posible, sin romperlos. Fig.-30 Medición del volumen radicular de una planta en una probeta. 43 Primera observación de la planta. Se evalúa, a simple vista, la calidad forestal, observando el desarrollo del sistema radical, para detectar posibles deformaciones morfológicas (Real Decreto 1220/2011, de 5 de septiembre). Para todas las metodologías, se hace necesario una primera observación de la planta (Fig.-31), un vistazo orientativo con la ayuda de la lupa (microscopio estereoscópico) a 5-45 aumentos, incluso descartativo que permita tener una idea general de la micorrización de la planta (presencia o ausencia de raíces micorrizadas de Tuber melanosporum), si posee contaminantes u otras observaciones interesantes, como la distribución radicular en cantidad y calidad, la ubicación de las micorrizas y posibles fitopatías radicales). Con el microscopio (a 400 aumentos), además, se confirma cada tipo de ectomicorriza presente. Esta primera observación podría descartar sin más análisis las plantas que no son válidas, bien por su pésima calidad forestal o bien por la falta de micorrizas de trufa negra, o exceso de contaminantes. Fig.-31 Primera observación de la planta bajo la lupa o microscopio estereoscópico. 44 3.5 Evaluación de la planta de acuerdo a cada metodología En función de la metodología aplicada a la evaluación de plantas se analizaban un número diferente de plantas por jornada, analizando lote a lote. Nada más sacar las plantas de la cámara a -20º, se meten en pequeñas bañeras de plástico con agua, donde acaban por descongelarse y mantienen sus estructuras hasta que son analizadas (Fig.-32). Como ya se ha comentado, por su carácter menos destructivo se comenzó evaluando plantas por el método de Reyna et al. (1997), extrayendo sólo, un volumen cilíndrico de sustrato con raíces, sin tocar el resto de la planta. Después el método de Chevalier et al. (1972), tras una limpieza de todo su sistema radicular se debe exponer dentro de un recipiente con agua y se observa bajo la lupa, sin cortar ninguna raíz. El siguiente método a emplear es el de Bencivenga et al. (1987) y el de Palazón et al. (1999); por su semejanza a la hora de tomar la muestra de raíces, en los cuales se toman fragmentos que contienen ápices y se realiza el conteo. Y por último el de método de Fischer y Colinas (1996), en el cual todas las raíces del sistema radicular se cortan en fragmentos de 3 mm para analizarlos, haciendo imposible que se pueda evaluar por los otros métodos una vez usado éste. Todas las plantas se analizaron por un mismo método y de nuevo eran congeladas para conservarlas, salvo con el método de Bencivenga et al. (1987) y Palazón et al. (1999) que cada lote era evaluado por las dos metodologías antes de congelar. En la tabla 5 y 6 se detallan los aspectos más importantes de cada método de evaluación, los cuales están recopilados al completo en el anejo de este trabajo. Fig.- 32 Distribución y preparación de una muestra de un lote de plantas para ser analizado. 45 Tabla 5 Resumen de las metodologías aplicadas a la evaluación de planta micorrizada. DESCRIPTORES INRAANVAR (Chevalier et al. 1972) UNIVERSIDAD DE PERUGIA (Bencivenga et al. 1987) UNIVERSIDAD DE LERIDA (Fischer y Colinas 1996) INIA-ARAGON (Palazón et al.1999) CEAM-VALENCIA (Reyna et al.1997) Nº mínimo de raíces tróficas /planta No lo indica (Sistema radicular bien distribuido y uniforme) 400 900 300 No lo indica Nº mínimo de micorrizas de T. melanosporum /planta No lo indica No lo indica 260 No lo indica 250 Conteo ápices No cuenta 400 (50 ápices/raíz (4/sector)) 250 300 (100/sección) Todas las del cilindro Criterios de calidad forestal D.E. (1999/105/CE) L.R. del 6 de julio 2007, n. 10. R.D. 1220/2011, de 5 de septiembre R.D. 1220/2011, de 5 de septiembre R.D. 1220/2011, de 5 de septiembre Numero plantas a muestrear/Lote 1000 10 (1%) 11(1,1%) Lotes<1000= 10 plantas 12(1,2%) 5(0.5%) 12(1.2%) Grado de micorrización o su estimación Media valores lote ≥ 2.5 (Chevalier 1972) Conversión ≥18.75% (Trouvelot, 1986) ≥30% ≥10% ≥30% ≥10% Estima el total del Nº de ápices micorrizados no no Si No Si >250 ápices micorrizados 46 Tabla 5 (cont.) Resumen de las metodologías aplicadas a la evaluación de planta micorrizada. DESCRIPTORES INRAANVAR (Chevalier et al. 1972) UNIVERSIDAD DE PERUGIA (Bencivenga et al. 1987) UNIVERSIDAD DE LERIDA (Fischer y Colinas 1996) INIA-ARAGON (Palazón et al.1999) CEAM-VALENCIA (Reyna et al.1997) % mínimo contaminantes <10% Diferencia de 20 puntos respecto al % de Tm, pero siempre ≤ 15% <25% sobre nº ápices micorrizados >30% <20% del total de micorrizas de la planta <25% sobre el nº ápices micorrizados por Tm % contaminación mínimo por otra Tuber 0% 0% 0% 0% 0% Método destructivo si si si si No Tiempo medio observación/planta (estimación presente trabajo) 5,7 minutos 19,7 minutos 33,9 minutos 15,3 minutos 7,1 minutos Validez de un LOTE (cumplidos los criterios de calidad forestal y 0% otra Tuber) Media valor plantas >2,5 (Media (Trouvelot) > 19%) ≥80% plantas validas Intervalos de confianza Lim. Inferior raíces trof>1800 Todas plantas >%10 micrrz. <50% contaminates limite inferior %Tm >33% limite supr contam < 25% Media ≥ 30% ≥11 plantas micorrizados con más de 100 ápices micor/planta. Región o país de aplicación Francia Italia Cataluña, Castilla León, Galicia, Castilla La Mancha y Murcia Aragón, Andalucía Comunidad Valenciana 47 Tabla 6 Resumen del desarrollo de cada método de evaluación de planta empleado. INRAANVAR (Chevalier et al. 1972) UNIVERSIDAD DE PERUGIA (Bencivenga et al. 1987) UNIVERSIDAD DE LERIDA (Fischer y Colinas, 1996) INIA-ARAGON (Palazón et al.1999) CEAM-VALENCIA (Reyna et al.1997) Labores preparatorias Separación del sustrato de las raíces por medio de un lavado cuidadoso. Criterios de calidad forestal (diámetro de cuello, altura planta, examen del sistema radicular y aéreo según normativa). 1ª observación del sistema radicular de la planta cubierto por agua, bajo lupa (presencia de micorrizas del hongo inoculado y posibles contaminantes, cantidad y proporción de raíces). Identificación y comprobación al microscopio del hongo/s existentes en la planta. Labores preparatorias Separación del sustrato de las raíces por medio de un lavado cuidadoso. Criterios de calidad forestal (diámetro de cuello, altura planta, examen del sistema radicular y aéreo según RD). Observación bajo lupa de la cantidad de micorrizas y posibles contaminantes, estimando en una escala del 0 al 5 la aptitud de la planta. Se utiliza una plantilla que se superpone a la planta y divide en dos sectores el aparato radical, del que se extraen al menos 4 raíces (desde unas ranuras que posee la plantilla) por sector y planta, examinando 50 ápices por cada fragmento de raíz extraído. Anotando los apices micorrizados, los no micorrizados y posibles contaminantes. Se corta el sistema radical en segmentos de 2-3 mm, se colocan sobre una bandeja con una plantilla con cuadrículas de cuatro colores diferentes, se elige uno al azar y se cuentan los apices micorrizados, no micorrizados y posibles contaminantes presentes en ese color de cuadrícula, en un mínimo de 250 ápices radicales. Se divide el sistema radical en tres partes longitudinalmente iguales (sectores). De cada uno de los sectores se extraen raíces al azar y se cuentan 100 ápices de cada, anotando ápices micorrizados, no micorrizados y posibles contaminantes. Se realiza el promedio de los 3 sectores. Se obtiene una muestra del sistema radical de la parte central del cepellón (el 2% del volumen del contenedor) con un sacabocados. La muestra obtenida tras un delicado lavado, se pasa por un tamiz de 1 mm de luz, y se somete al recuento del número de ápices micorrizados, ápices sin micorrizar y micorrizas contaminantes. 54 Fig.- 36 Representación gráfica del intervalo de confianza al 95% del Volumen radial según viveros (izq.); Medias mínimo cuadráticas del Volumen radial según lotes y viveros (dcha). Fig.- 37 Representación gráfica del intervalo de confianza al 95% de la Esbeltez según viveros (izq.); Medias mínimo cuadráticas de la Esbeltez según lotes y viveros (dcha). En la tabla 8 se presenta la matriz de correlaciones de las variables biométricas junto con el porcentaje de micorrización y el tiempo invertido en los análisis. De ella se pueden extraer algunas observaciones:  El porcentaje de micorrización de T. melanosporum encontrado en las plantas se correlaciona significativa y negativamente con el tiempo empleado en su determinación. Probablemente porque ambas variables están relacionadas con el método empleado en las evaluaciones, factor que incluiremos en análisis posteriores. Por otro lado, parece lógico que evaluar planta con una micorrización escasa, requiere una observación más exhaustiva del sistema, conllevando más tiempo de análisis. El 55 porcentaje de micorrización también se correlaciona significativa y positivamente con el diámetro del cuello, plantas con mayor desarrollo del cuello implican plantas mejor nutridas y con sistemas radiculares mejor formados, todo ello puede ser debido a una mayor micorrización (Ceruti, 1974, Honrubia et al. 1992). Estos datos son interesantes para posibles estudios en relación de la biometría con el grado de micorrización.  La esbeltez de la planta se correlaciona positiva y significativamente con la altura del tallo y el volumen radical, mientras que lo hace negativa y significativamente con el diámetro del cuello y la longitud del cepellón, relación lógica por otra parte, puesto que la altura del tallo y el diámetro del cuello se emplean para calcularla.  La altura del tallo se correlaciona positiva y significativamente con el volumen radial, mientras que lo hace negativa y significativamente con la longitud del cepellón. La longitud del cepellón se correlaciona negativa y significativamente con el volumen radial. Por diversas causas, morfológicas, el volumen del contenedor, el sustrato o la capacidad de autorepicado, entre otras, las plantas que tienen longitudes altas de raíces tienen menos raíces tróficas y por lo tanto menor volumen exploratorio para conseguir nutrientes y menor capacidad para ser susceptible de ser micorrizada. El componente de heterogeneidad propia de cada planta es un factor importante en la cantidad y calidad del sistema radicular respecto a la proporción de raíces tróficas que posee. Tabla 8 Matriz de correlaciones entre las variables biométricas de las plantas, su porcentaje de micorrización y el tiempo empleado en su determinación. “r” es el momento-producto de Pearson; “p” es el nivel de significación y “n” es el número de observaciones. Variables Micorrización (%) Tiempo Altura Tallo (cm) Longitud cepellón (cm) Diámetro cuello (cm) Volumen radial Esbeltez Micorrización (%) r 1 -0,212 0,029 0,046 0,152 -0,021 -0,045 p <0,001 0,478 0,258 <0,001 0,610 0,267 N 120 600 600 600 600 600 600 Tiempo r 1 0,005 -0,013 0,004 0,003 0,004 p 0,908 0,757 0,930 0,951 0,920 N 120 600 600 600 600 600 Altura Tallo (cm) r 1 -0,111 0,058 0,310 0,875 p 0,006 0,157 <0,001 <0,001 N 120 600 600 600 600 Longitud cepellón (cm) r 1 0,076 -0,104 -0,137 p 0,062 0,011 0,001 N 120 600 600 600 Diámetro cuello (cm) r 1 0,031 -0,404 p 0,446 <0,001 N 120 600 600 Volumen radial r 1 0,277 p <0,001 N 120 600 Esbeltez r 1 p N 120 56 4.2 Aptitud micorrícica 4.2.1 Porcentajes de micorrización de Tuber melanosporum Los porcentajes de micorrización de T. melanosporum medios obtenidos para cada lote se muestran en la tabla 9. Dejando de lado, de momento, el método con el que se han evaluado, puede observarse que la micorrización en general de los lotes parece bastante aceptable, pues únicamente nueve evaluaciones de 50 han estado por debajo del 20% de micorrización, que es un valor promedio entre los porcentajes de micorrización mínimos requeridos por los diferentes métodos empleados, y solamente el promedio de uno de los lotes se encontró por debajo de ese valor (V1L2). La tabla 10 muestra que el porcentaje de micorrización, promediado para los cinco métodos, es significativamente diferente según el vivero que produce la planta, siendo mayor en el Vivero 2 que en el Vivero 1. Aun así, el modelo planteado explica muy poco (3.0%: R2aj=0.030; 4,5%: R2aj=0.045 si tenemos en cuenta el diámetro del cuello como covariable) de la variabilidad de las observaciones, puesto que son muchas las variables que condicionan una buena micorrización (manejo cultural, inoculo, sustrato, estado de la planta…) (Palazón 2012). Tabla 9 Promedios por lote de los porcentajes de micorrización de T. melanosporum calculados para cada método y en global. Las medias inferiores al 20 por ciento aparecen sombreadas. Número de plantas Reyna et al. (1997) Chevalier et al. (1972) Bencivenga et al. (1987) Fischer y Colinas (1996) Palazón et al. (1999) Media lotes V1 L1 12 38,3 27,2 17,4 19,8 23,3 25,2 V1 L2 12 30,0 16,8 15,6 6,1 19,3 17,6 V1 L3 12 46,7 30,3 32,6 29,6 36,1 35,0 V1 L4 12 31,1 32,7 12,9 17,9 30,7 25,1 V1 L5 12 46,4 37,0 24,3 19,2 34,9 32,4 V2 L6 12 46,3 41,5 33,3 34,6 55,7 42,3 V2 L7 12 26,8 28,2 30,7 26,5 43,7 31,2 V2 L8 12 39,1 33,3 24,3 22,9 35,4 31,0 V2 L9 12 47,0 31,5 24,3 27,5 35,4 33,2 V2 L10 12 29,7 36,5 26,1 21,8 34,8 29,8 57 Tabla 10 Medias mínimo cuadráticas del porcentaje de micorrización según viveros. (1) Test de comparación de medias mediante ANOVA de un factor: vivero; (2) Test de comparación de medias mediante ANCOVA de un factor: vivero, y como covariable se utilizó el diámetro del cuello estimando un promedio de 3,9176 mm. SEM: error estándar de la media. Variables Vivero Probabilidad V1 V2 R2aj SEM TEC Micorrización (%) (1) 27.04 33.47 0.030 1.50 <0.001 Micorrización (%) (2) 27.35 33.16 0.045 1.50 <0.001 Los resultados de aptitud en cuanto a micorrización en función del método empleado para evaluarla, para cada uno de los 10 lotes seleccionados, así como el porcentaje de micorrización medio de cada uno, se muestra en la tabla 11. La prueba Q de Cochran confirma la falta de relación entre el método empleado en la evaluación y la aptitud del lote que se evalúa (valor Q = 13,684 y p = 0.008). El consenso entre métodos únicamente sucede en los lotes con mayor cantidad de micorrización (lotes 1 y 8, con un 42.3% y 33.8% de micorrización media respectivamente) y menor (lote 7, 18.9%). En los otros 7 lotes el resultado difiere en función del método aplicado en la evaluación. El método más permisivo parece ser el de Chevalier et al. (1972) con 9 de 10 lotes aptos y el menos el de con 3. Tabla 11 Aptitud del lote según los métodos estudiados para ser aceptado o rechazado para su distribución como planta micorrizada. Porcentaje medio de micorrización de cada lote. Lote Micorrización (%) Reyna et al. (1997) Chevalier et al. (1972) Bencivenga et al. (1987) (Palazón et al. (1999) Fischer y Colinas (1996) 1 40,26 si si si si si 2 31,00 no si si si si 3 30,00 no si no no si 4 33,00 si si no si si 5 30,00 si si no no si 6 24,00 si si no no no 7 16,00 no no no no no 8 34,00 si si si si si 9 25,00 no si no no si 10 31,00 si si no no si TOTAL 6 9 3 4 8 58 Los lotes de planta micorrizada con T. melanosporum producidos en los viveros europeos, en función de la zona en la que pretendan ser plantados, pueden ser sometidos a los cinco diferentes métodos de evaluación que han sido estudiados en el presente trabajo y, a la vista de los resultados obtenidos, la obtención del permiso de venta depende del método aplicado. Este hecho provoca la necesidad imperiosa de llegar a un acuerdo entre todos los organismos certificadores. Todos los métodos son capaces de aceptar o rechazar cierto lote cuando éste tiene una micorrización excelente o muy pobre, respectivamente. Sin embargo la mayor parte de la producción parece encontrarse en unas condiciones de micorrización medias, precisamente en el intervalo de falta de consenso entre los métodos. El estudio de correlación entre métodos en cuanto al porcentaje de micorrización obtenido para cada planta (Tabla 12) muestra la existencia de correlación significativa y positiva entre todos los métodos entre sí, a excepción del método de Reyna et al. (1997) que sólo está correlacionado con el de Bencivenga et al. (1987). El mayor coeficiente de correlación se encontró entre el método de Palazón et al. (1999) y el de Fischer y Colinas (1996): 0.662 y el menor entre Chevalier et al. (1972) y Bencivenga et al. (1987): 0.399. Tabla 12 Matriz de correlaciones entre los métodos que evalúan la calidad de planta micorrizada, sobre el porcentaje de micorrización de las plantas. “r”: producto-momento de Pearson; “p”: significación; y “N”: número de observaciones. Correlaciones significativas sombreadas. Métodos Fischer y Colinas (1996) Bencivenga et al. (1987) Chevalier et al. (1972) Palazón et al. (1999) Reyna et al. (1997) Fischer y Colinas (1996) r 1 0,554 0,593 0,662 0,147 p <0,001 <0,001 <0,001 0,108 N 120 120 120 120 120 Bencivenga et al. (1987) r 1 0,399 0,610 0,215 p <0,001 <0,001 0,019 N 120 120 120 120 Chevalier et al. (1972) r 1 0,594 0,114 p <0,001 0,214 N 120 120 120 Palazón et al. (1999) r 1 0,162 p 0,078 N 120 120 Reyna et al. (1997) r 1 p N 120 Existen diferencias significativas entre las estimaciones del porcentaje de micorrización obtenida por cada método (Fig.- 38 y Tabla 13): R2aj= 0,104; SEM= 2.19; 59 p= <0.001. Éstos aparecen agrupados en tres grupos homogéneos: Fischer y Colinas (1996) y Bencivenga et al. (1987), con el menor porcentaje de micorrización, Chevalier et al. (1972) con un porcentaje medio y Palazón et al. (1999) y Reyna et al. (1997) que estiman los porcentajes de micorrización más altos. Según Gógán (2011) todos los métodos tienden a sobreestimar el porcentaje de micorrización real de las plantas, por lo que Fischer y Colinas (1996) y Bencivenga et al. (1987), que obtienen los valores de micorrización más bajos, podrían ser los que proporcionen un valor más fiable en cuanto a este parámetro. Ambos métodos usan plantillas, por lo que es muy probable que el rastreo del sistema radical que efectúan sea más homogéneo que en los otros tres casos, en los que bien por ser un tanto subjetivos (Chevalier et al. 1972 y Palazón et al. 1999) o por tomar la muestra de raíz en una zona muy concreta (Reyna et al. 1997) quizás con mayor concentración de micorrizas que otras, la micorrización podría sobreestimarse en mayor grado. Los porcentajes de micorrización calculados para cada planta con cada método están correlacionados entre sí, con la única excepción del método de Reyna et al. (1997), el cual muestrea únicamente una zona concreta de la raíz aunque, junto con el método de Fischer y Colinas (1996), es el único capaz de estimar el número total de ápices de cada planta y además es el único no destructivo, con lo que es muy útil en investigación para realizar monitorizaciones individualizadas de plantas. Fig.- 38 Representación gráfica del porcentaje de micorrización (intervalo de confianza, α = 0.05) obtenido por los cinco métodos evaluado. Se incluyen las pruebas para cada método y los resultados del test de Tukey de la tabla 13. 60 Tabla 13 Medias mínimo cuadráticas del porcentaje de micorrización según el método empleado en su determinación. Test de comparación de medias ANCOVA de un factor fijo: método (1), y como covariable el diámetro del cuello (2) evaluado como promedio en un valor de 3,9176 mm. Diferentes letras evidencian diferencias significativas entre los métodos contrastadas mediante el test post hoc de Tukey. SEM: error estándar de la media. Variables Métodos Probabilidad Fischer y Colinas (1996) Bencivenga et al. (1987) Chevalier et al. (1972) Palazón et al. (1999) Reyna et al. (1997). R2aj SEM M Micorrización (%) (1) 22.60a 24.13a 31.49b 34.93bc 38.14c 0.104 2.19 <0.001 Micorrización (%) (2) 22.60a 24.13a 31.49b 34.93bc 38.14c 0.126 2.19 <0.001 En la figura 39, representamos el intervalo de confianza (95%) del porcentaje de micorrización obtenido a través de los distintos métodos y según el vivero donde se han obtenido las plantas. A la vista de los intervalos generados se puede afirmar que cada vivero tiene lotes de plantas significativamente distintos en cuanto a resultados del porcentaje de micorrización. Fig.- 39 Representación gráfica del intervalo de confianza (α = 0,05) del porcentaje de micorrización obtenido a través de los distintos métodos en cada uno de los viveros. Además, cada método evalúa el porcentaje de micorrización diferenciando los lotes de cada vivero, excepto cuando evaluamos con el método de Reyna et al.(1997) que no detecta la diferencias entre lotes de un vivero y otro. Esta evidencia muestra que no es 61 cierto, ya que un vivero micorriza mejor que el otro y que así se demuestra empleando los otros métodos. De este modo afirmamos que el vivero influye significativamente en el porcentaje de micorrización detectado a través de métodos cuyos resultados también son significativamente distintos, pudiéndose observar tres conjuntos diferenciados entre ellos. La interacción entre los viveros y los métodos empleados en la determinación del porcentaje de micorrización no es significativa (Tabla 14). De nuevo aunque se han conseguido ver ciertos efectos significativos, éstos apenas consiguen explicar la variabilidad detectada en el porcentaje de micorrización. Los métodos por si mismos explican un 10,4% esta variabilidad, subiendo hasta el 12,6% si se añade el diámetro del cuello de la planta como covariable. Si añadimos la variabilidad del vivero se aumenta hasta el 14,2% (Tabla14) subiendo hasta el 15,7% al añadir el diámetro del cuello. Con todo ello se ha demostrado la clara influencia del método empleado y el vivero sobre el porcentaje de micorrización resultante, pero el ruido que ejerce la heterogeneidad de cada planta es enorme. En España, el uso de bellota certificada procedente de una misma localización no evita esta variabilidad inherente al empleo de semilla como material de reproducción. Algo que se intenta solucionar en otros países con el empleo de clones adaptados a los diferentes medios. Tabla 14 Medias mínimo cuadráticas del porcentaje de micorrización según los métodos usados para calcularlo y los diferentes viveros. Resultados del ANCOVA (Modelo General Lineal) de acuerdo a los métodos (M) y a los viveros (V) y su interacción (MxV) (1). Diferentes letras evidencian diferencias significativas entre los métodos, contrastadas mediante el test post-hoc de Tukey. Como covariable se incluye el diámetro del cuello (2) evaluado como promedio en un valor estimado de 3.9176 mm. SEM: error estándar de la media. Variables Métodos Viveros Fischer y Colinas (1996) Bencivenga et al. (1987) Chevalier et al. (1972) Palazón et al. (1999) Reyna et al. (1997). V1 V2 Micorrización (%) (1) 22.60a 24.13a 31.49b 34.93bc 38.14c 27.04 33.47 Micorrización (%) (2) 22.60a 24.13a 31.49b 34.93bc 38.14c 27.35 33.16 Variables Probabilidad R2aj SEM M V M × V Micorrización (%) (1) 0.142 2.17 <0.001 <0.001 0.056 Micorrización (%) (2) 0.157 2.16 <0.001 <0.001 0.052 62 4.2.2 Aptitud hongos contaminantes La ausencia de hongos contaminantes en las plantas micorrizadas es un factor importante en la calidad de las mismas, puesto que puede perjudicar al crecimiento del hongo inoculado. Aún así, como estipulan las diferentes metodologías, hay una cierta tolerancia a la presencia de algunos de ellos, siempre que no pertenezcan al género Tuber, lo cual se podría considerar un fraude. En algunas plantas de los lotes correspondientes al vivero 1 (Tabla.-15) se encontraron ectomicorrizas contaminantes. Principalmente se detectó Sphaerosporella brunnea, el hongo contaminante más frecuente en vivero de planta micorrizada con especies de trufa (Donnini et al. 1997). Las plantas en las que este hongo esta presente suelen tener una colonización por el hongo inoculado, más baja que el resto. Aunque al llevar la planta a campo estas ectomicorrizas desaparecen por ser menos competitivas en esas condiciones (Sánchez, 2012). También se detectaron otros hongos ectomicorrícicos que no pudieron ser identificados. Para el resto de lotes, los del vivero 2, se observa que carecen de contaminantes. En ningún caso se observaron ectomicorrizas de especies del género Tuber distintas de T. melanosporum. Es significativo que empleando ciertos métodos de evaluación, como el de Reyna et al, no se haya observado la presencia de ningún contaminante. Mientras que con los otros métodos sobre todo con el método de Fischer y Colinas (1998), Bencivenga et al. (1987) o Palazón et al. (1999), que son más exhaustivos con la visión conjunta de todo su sistema radicular, seamos capaces de apreciar la presencia de contaminantes. Tabla 15 Resultados sobre la presencia de contaminantes en las plantas analizadas en algunas plantas de los lotes del vivero 1. AC/TA: Ápices contaminados/Ápices muestreados. %: porcentaje estimado de contaminaciones. L (Lote), P (Planta). 63 La contaminación en ningún caso, no ha sido un factor para eliminar algún lote, los porcentajes establecidos de contaminantes para cada método no descartan estos lotes por estos motivos. 4.3 Análisis del tiempo invertido en determinar el porcentaje de micorrización según los métodos estudiados En la tabla 16 y en la figura 40, se puede apreciar el tiempo medio necesario para analizar una planta por las diferentes metodologías. El tiempo invertido en la evaluación de cada lote (tiempo por planta mas número de plantas a evaluar), por su repercusión económica, es un factor con una gran importancia. Tabla 16 Medias y desviación estándar del tiempo empleado para la determinación del porcentaje de micorrización de las plantas estudiadas según los métodos para la evaluación de la calidad de planta micorrizada. Letras distintas evidencian diferencias significativas conforme al test de la U de Mann-Whitney (p<0.05). Variables Métodos Chevalier et al. (1972) Reyna et al. (1997). Palazón et al. (1999) Bencivenga et al. (1987) Fischer y Colinas (1996) Tiempo (min) 5,68 ± 1,13a 7,18 ± 1,08b 15,25 ± 2,02c 19,72 ± 1,87d 33,90 ± 3,30e Ordenando los métodos, de menor a mayor, según el tiempo empleado en la determinación del porcentaje de micorrización se observa una muy alta correlación con el tiempo (Rho de Spearman: 0,939; p < 0,001). Esto induce a pensar que los propios métodos suponen una ordenación del tiempo empleado, de modo que este es significativamente distinto según el método empleado (Estadístico de J-T tipificado = 27,410; p < 0,001). El método más rápido para analizar plantas micorrizadas es el de Chevalier et al (1972), ya que consiste en analizarla de manera general y subjetiva, siempre y cuando se posea una cierta experiencia y conocimiento de hongos ectomicorrícicos. El método que conlleva más tiempo para analizar una planta es el de Fischer y Colinas (1996), puesto que requiere de una serie de labores preparatorias y de observación mucho más elaboradas. Una observación interesante en referencia al tiempo de análisis, sería el empleado utilizado en la limpieza del sistema radicular de la planta. A veces el sustrato utilizado por el viverista puede complicarlo; esto es, una planta en un sustrato con componente principal de turba negra, hace casi imposible una limpieza exhaustiva, ni siquiera un 70 capaz con el método de Reyna et al. (1972) de evaluar en muy poco tiempo y de manera bastante exacta la validez de la planta. En todos los casos los equipos (lupa y microscopio óptico) deben ser de la mayor calidad posible, puesto que el trabajo del analista será más eficiente y con menor error de estimación. El mejor método está por determinar todavía, pero debe ser sencillo de realizar, en tiempo y medios, además de efectivo en sus análisis y, a poder ser, no destructivo. En vías de llegar a un acuerdo entre todos los organismos certificadores, quizás la mejor opción sea combinar dos métodos correlacionados. Esto es, usar el método de Chevalier et al. (1972) siempre que no haya dudas sobre la presencia de contaminantes y su grado de micorrización sea alto. En el resto de casos emplear un método sencillo como el de Palazón et al. (1996) para asegurar que el porcentaje es adecuado. En cuanto a este porcentaje “adecuado”, sería necesario consensuarlo con el apoyo de resultados en campo para justificar estos niveles. Dada la similitud de las ectomicorrizas de T. melanosporum y T. indicum en todos sus estadios y la de T. melanosporum y T. brumale cuando son jóvenes y no han desarrollado cistidios aún, un método nuevo debe incorporar análisis moleculares rutinarios que garanticen la ausencia de sus micorrizas en los lotes. Principalmente en el caso de T. indicum, su presencia, además de fraudulenta, podría suponer un grave riesgo ecológico para el resto de Tuber europeas por tratarse de una especie alóctona, como ya se detalló en la introducción. En su momento se propuso controlar todo el inóculo que emplean los viveros, como se hace en Francia, pero en nuestro país, el gran número de empresas en el sector y el secretismo ligado a los métodos de inoculación dificulta ese tipo de acciones. Además debe tenerse en cuenta que la pretensión es certificar el producto final, es decir, la planta micorrizada. Las especies involucradas ya pueden identificarse molecularmente a nivel de carpóforo y de micorrizas. Algunas técnicas moleculares ya están puestas a punto: empleo de cebadores de PCR específicos (Paolocci et al. 1997, Mabru et al. 2001; Suz et al. 2006), PCR-RFLP (Pérez-Collazos et al. 2009) o PCR a Tiempo Real (Sánchez, 2012; Parladé et al. 2013). Pero aún no está claro qué técnica elegir, por su fiabilidad y su facilidad de aplicación en análisis rutinarios a gran escala, ni el modo en que deben muestrearse las plantas, es decir, cuántos ápices seleccionar, en qué zonas de la raíz, o incluso, si la mejor opción sería estudiar el micelio extraradical presente en el propio sustrato (Suz et al. 2006; Parladé et al. 2013). 71 1. Conclusiones 1. Los métodos de Fischer y Colinas (1996) y Bencivenga et al. (1995) valoran los lotes con porcentajes de micorrización significativamente menores que el resto y conllevan mayor tiempo de análisis. 2. El método de Reyna et al. valora a las plantas con porcentaje de micorrización mas altos, no correlacionados con ninguno de los otros cuatro métodos que, a su vez, si se correlacionan entre sí. 3. Sólo cuando los lotes son de muy buena o muy mala calidad de micorrización todos los métodos de evaluación coinciden al valorar su aptitud. Lo que implica la clara necesidad de llegar a un acuerdo en la unificación de criterios para la evaluación de planta micorrizada en Europa. 4. El diámetro del cuello de la encina está correlacionado con el porcentaje de micorrización, por lo que podría ser un parámetro a tener en cuenta en la evaluación de la calidad de micorrización además de la calidad forestal. 72 73 6. Bibliografía y Webgrafia Agerer R, Rambold G (2004–2013) [first posted on 2004-06-01; most recent update: 2011-01-10]. DEEMY–An Information System for Characterization and Determination of Ectomycorrhizae. www.deemy.de – München, Germany Baciarelli F, Donnini D, Di Massimo G, Bencivenga M (2009) Università di Perugia: 20 anni di controllo e certificazione di piante tartufigene. Perugia Bencivenga M, Calandra R, Granetti B (1990) Ricerche sui terreni e sulla flora delle tartufaie naturali di Tuber melanosporum Vitt. dell'Italia centrale. In: Atti del II Congresso internazionale sul tartufo. Spoleto, 24 - 27 novembre 1988. Comunità Montana dei Monti Martani e del Serano. Ed., Spoleto: 337-374 Bencivenga M, Donnini D, Tanfulli M, Guiducci M (1995) Tecnica di campionamento delle radici e degli apici per la valutazione delle piante micorrizate. Micol. Ital., 2: 35-47 Bernal J (2011) Cultivo in vitro y descripción morfológica del hongo Tuber melanosporum Vittad. Trabajo Fin de Carrera Ingeniero Agrónomo (inédito) Universidad de Zaragoza. 85 pp Boletín Oficial de la Región de Emilia-Romagna (2012) – PARTE segunda - N. 43 Bonet A (2004) Secondary succession of semi-arid Mediterranean old-fields in southeastern Spain: insights for conservation and restoration of degraded lands. Journal of Arid Environments 56: 213-233 Bonito G, Trappe J, Donovan S, Vilgalys R (2011) The Asian black truffle Tuber indicum can form ectomycorrhizas with North American host plants and complete its life cycle in non-native soils. Fungal ecology, 4(1): 83-93 Boyer JN, Duba SE, South DB (1987) Emergence timing affects root-collar diameter and mortality in loblolly pine seedbeds. New Forests 1(2):135-140 Cartié G, Palazón C, Barriuso J, Delgado I (1996) Efecto de parasitismo CD; p. 199 (8 pp) Ceruti A (1960) Elaphomycetales et Tuberales. Iconographie Mycologica Bresadola Suppl. II, Trento. 100 páginas Cocina L, Barriuso J, Martín M, Sánchez S (2013) A review of nurseries producing mycorrhizal plants in Spain and the world. I Congreso Internacional de Truficultura, Teruel 2013 Chavasse CGR (1980) Planting stock quality: a review of factors affecting performance. New Zealand J. of Forestry Sci., 25: 144-171 74 Chevalier G, Grente J (1978) Application pratique de la symbiose ectomycorhiziennne. Production a grande échelle de plantes mycorhizes par la truffe (Tuber melanosporum Vittad. ). Mushroom science, 10:483-505 De Miguel AM, Sáez R (2005) Algunas micorrizas competidoras de plantaciones truferas. Publicaciones de Biología, Universidad de Navarra, Serie Botánica, 16: 1-18 Del Campo AD, Navarro RM (2004) Calidad de lotes comerciales de encina (Quercus ilex L. subsp. ballota (Desf.) Samp.). Evaluación de su respuesta en campo. Cuadernos de la S.E.C.F. 17: 35-42 Di Massimo G, García-Montero LG, Manjón JL, Díez J (1996) Hongos micorrícicos competidores de Tuber nigrum Bull (= T. melanosporum Vittad.), presentes en ecosistemas naturales y viveros del centro de España. Boletín de la Sociedad Micológica de Madrid, 21: 189-199 Donnini D, Bencivenga M, Calandra R, Tanfulli M (1997) Influenza della reazione del substrato sulla micorrizazione di Ostrya carpinifolia Scop. con Tuber melanosporum Vitt. e Sphaerosporella brunnea (A. e S.) Svrcek e Kubicka. Micologia Italiana, 3:17-22 Fischer C, Colinas C (1996) Methodology for certification of Quercus ilex seedlings inoculated with Tuber melanosporum for commercial application. 1st International Conference on Mycorrhizae. Berkeley (California), USA August, 1996 Folk RS, Grossnickle SC (1997c) Determining field performance potential with the use of limiting environmental conditions. New Forests 13: 121-138 Fontana A (1971) Il micelio di T. Melanosporum Vitt. in coltura pura. Allionia, 17: 19-23 Geng LY, Wang XH, Yu FQ, Deng XJ, Tian XF, Shi XF, Xie XD, Liu PG, Shen Y (2009) Mycorrhizal synthesis of Tuber indicum with two indigenous hosts, Castanea mollissima and Pinus armandii. Mycorrhiza, 19(7): 461-467 Giraud M (1988) Prevélèment et analyse de mycorhizes. CTIFL. La Truffe. Pp. 49-63 FNPT. Julliet, 1988 - nº 10 Congrès de la trufficulture. Saintes, 27-28, Novembre, 1987. Ed. Charles PARRA Gógán A (2011) Studies on cultivation possibilities of summer truffle (Tuber aestivum Vittad.) and smooth black truffle (Tuber macrosporum Vittad.) in Hungary. PHD THESIS. Páginas 6 y 7 Gonzalez B, Cavero R, De Miguel A (2005) Diversidad florística en la zonas truferas de Navarra. IV Congreso forestal español (CD de actas). Zaragoza, 26-30 de septiembre Grossnickle SC, Folk RS (1993) Stock quality assessment: forescasting survival and performance on a reforestation site. Tree Planters’ Notes, 44: 113-121 75 Hacskaylo E, Vosso JA (1971) Inoculation of Pinus caribaea with ectomycorrhizal fungi in Puerto Rico. Forest Science 17, 239-241 Honrubia M, Torres P, Díaz G, Cano A (1992) Manual para micorrizar plantas en viveros forestales. Proyecto LUCDEME VIII ICONA Kües U, Martin F (2011) On the road to understanding truffles in the underground. Fungal Genetics and Biology, 48: 555–560 Meotto F, Carraturo P, Dana M (1992) Valutazione in pieno campo e in serra della competitività di Sphaerosporella brunnea con Tuber magnatum. L' Informatore Agrario, 48:73-78 Meotto F, Carraturo P (1988) Ectomicorrizia di Sphaerosporella brunnea (A. & S.) Svrcek & Kubicka in piantine tartufigene. Allionia, 28: 109-116 Mexal JG, Landis TD (1990) Target seedling concepts: height and diameter. En: Target Seedling Mikola P (1969) Mycorrhizal fungi of exotic forest plantations. Karstenia 10, 169-176 Montecchi A, Sarasini M (2000) Funghi ipogei d’Europa. Associazione Micologica Bresadola Trento. 714 páginas Montgomery DC (2001). Design and Analysis of Experiments. New York (USA), John Wiley & Sons, Inc Moser M (1958) Die künstliche Mykorrhizaimpfiíng an Forstpflanzen. I. Erfehrungen bei der Reinkultur von Mykorrhizapilzen. Forstwissenschqftlich Centralblatt 77, 32-40 Murat C, ZampierI E, Vizzini A, Bonfante P (2008). Is the Perigord black truffle threatened by an invasive species? We dread it and it has happened! New Phytologist, 178: 699-702 Navarro RM, Del Campo A, Alejano R, Álvarez l (1998) Caracterización de calidad final de planta de encina (Quercus ilex L), alcornoque (Q. suber L), algarrobo (Ceratonia siliqua L), acebuche (Olea europeaea L. var. sylvestris), en cinco viveros de Andalucía Navarro RM, Del Campo AD (2005) Evaluación de la calidad de lotes comerciales de encina (Quercus ilex L. subs. ballota (Desf.) y acebuche (Olea europaea var. sylvestris Brot.): tres años de ensayos. IV Congreso Forestal Español, Zaragoza, 26-30 Sep. Vol. abstracts + CD; p. 199 (8 pp) Oliach D, Bonet JA, Ficher C, Olivera A, Martínez J, Colinas C (2008) Estado actual de la trufa y la truficultura. Dossier Tècnic 26 Palazón C, Delgado I, Cartié G, Barriuso J, Esteban H (1999) Propuesta de un método de evaluación y control de calidad de planta (Quercus ssp.) micorrizada con Tuber melanosporum Vitt., para la obtención, en España, de la etiqueta de 76 certificación. 5.º Congreso Internacional Science et culture de la Truffe. Aix-enProvence (Francia) Palazón C, Delgado I, Cartié G, Barriuso J (1997) Metodología del análisis de planta micorrizada con Tuber melanosporum Vitt. Reunión sobre truficultura. Zaragoza, 1997 Palenzona M, Rebaudengo E, Tocci A, Zambonelli A (1987) Valutazione dello stato di micorrizazione in piantine tartufigene. Proposta di un metodo. Ministero Agricoltura e Foreste: pp. 14 Peñuelas J (1993) «Calidad de la planta forestal para el plan de reforestación de tierras agrícolas». Montes, 33:84-97 Poorter H, Bühler J, Van Dusschoten D, Climent J, Postma JA (2012). Pot size matters: a meta-analysis of the effects of roothing volume on plant growth Rausher T, Agerer R, Chevalier G (1995) Ektomykorrhizen von Tuber melanosporum, Tuber mesentericum und Tuber rufum (Tuberales) an Corylus avellana. Nova Hedwigia Reyna S (2007) Truficultura. Fundamentos y técnicas. Ed. Mundiprensa. 668 pp Riccioni C, Belfiori B, Rubini A, Passeri V, Arcioni S, Paolocci F (2008) Tuber melanosporum outcrosses: analysis of the genetic diversity within and among its natural populations under this new scenario. New Phytologist, 180: 466–478 Riousset L, Chevalier G, Bardet, MC (2001) Truffes d’Europe et de Chine. Ed. INRA, Paris, 181 páginas Ritchie, GA (1984) Assessing seedling quality, pp. 243-259. In: Duryea, M. L. and Landis, T. D. (Eds.): Forest Nursery Manual: Production of Bareroot Seedlings. Martinus Nijhoff Dr. W. Junk Publishers. The Hague Rivera CS (2009) Caracterización, descontaminación y conservación de Tuber melanosporum (trufa negra) y Tuber aestivum (trufa de verano). Tesis Doctoral, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza. 371 pp Rose RW, Royo A, Pardos M (1998) La planta ideal: revision del concepto, parametros definitorios e implementacion practica. Investigacion. Agraria.: Sistemas. Recursos. Forestales. Vol. 7 (1 y 2) Sánchez S (2012) Ectomicorrizas en el cultivo de trufa negra: ecología, diversidad y gestión. Doctoral dissertation. Universidad de Zaragoza Scagel R, Bowden R, Madill M, Kooistra C (1993) Provincial seedling stock type selection and ordering guidelines. British Columbia. Min. of Forests. SD404.P76. 76 pp Shemakhanova NM (1962) Mycotrophy of Woody Plants. US Department of Commerce Translation TT66-51073 (1967), Washington, DC, USA. 77 Smith SE, Read DJ (2008) Mycorrhizal symbiosis. Academic press. 787 pag Sourzat P (2004) Questions d´ecologie apliqués à la trufficulture. Lycée professionnel agricole et viticole de Cahors - Le Montat, Cahors - Le Montat SPSS (2012) IBM SPSS Advanced Statistics 21. New York (USA), IBM Corporation Steel R, Torrie J (1980) Principles and procedures of statistics: A biometrical approach McGraw-Hill (New York) xxi, 633 p Stoeckeler, JH Slabauch PE (1965) Conifer Nursery Practice in the Prairie Plains. US Department of Agriculture Handbook No. 279, USA Takacs EA (1967) Producción de cultivos puros de hongos micorrizógenos en el Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Castelar. IDIA Supplement of Forestry 4, 83 Theodorou C, Bowen GD (1973) Inoculation of seeds and soil with basidiospores of mycorrhizal fungi. Soil Biology cmd Biochemistry 5, 765-771 Thompson B (1985) Seedling morphological evaluation. What can you tell by looking. En: Evaluating seedling quality: principles, procedures and predictive abilities of major test. Duryea, M., ed. Forest Research Laboratory. Oregon State University, pp. 59-69 Trouvelot A, Kough JL, Gianinazzi-Pearson V (1986) Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherches et méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. Dans: Aspects physiologiques et génétiques des mycorhizes, Dijon, 1985. INRA (éd.), pp. 217-221 Wilde SA (1944) Mycorrhizae and silviculture. Journal of Forestry 42, 290 Yang C (1999) Truffles in southwest China. Actes du V Congrès International: Sciencie et culture de la truffe. Marzo de 1999. Aix-enProvence. pp: 248-249 Wang Y, Peigui L, Chen J, Hung-Tao H (2007) China - a newly emerging truffleproducing nation. Actes du colloque: La culture de la truffe dans le monde. BriveLa Gaillarde. pp: 35-44 Zambonelli A, Salomoni S, Pisi A (1993) Caratterizzazione anatomo-morfologica delle micorrize di Tuber spp. su Quercus pubescens Willd. Micol Ital 3:73-90 Zambonelli A, Brazanti B (1987) Competizione fra di funghi ectomicorrizici Tuber albidum e Laccaria laccata. Micol ital 3: 159-164 78 DEEMY An Information System for Characterization and Determination of EctoMycorrhizae. Recuperado el día 20 julio de 2013 de http://www.deemy.de/Determinacion de ectomicorrizas FLORA IBERICA. Recuperado el día 4 de Abril de 2012 de http// www. floraiberica.es/PHP/generos_lista.php ÍNDICE FUNGORUM Recuperado el día 24 de Mayo de 2012 de http://www.indexfungorum.org MYCORRHIZAL ASSOCIATIONS:The Web Resource Section 11. RESOURCES Recuperado el día 3 julio de 2013 de http://mycorrhizas.info/resource.html PEPINIERES BEAUCAMP Recuperado el día 30 de Marzo de 2012 de http://www. pepinieres-beaucamp.fr/Certification-de-l-arbre-truffier SCIENCEDIRECT Recuperado el día 18 de Enero de 2013 de http://www.sciencedirect.com telephora terrestres SYNDICAT NATIONAL DES PÉPINIÉRISTES PRODUISANT DES PLANTS À VOCATION TRUFFIÈRE Recuperado el día 20 de Abril de 2012 de http://www.pepinieristes-truffiers.com 79 ANEJO: Descripción de los principales métodos En las siguientes páginas se exponen los cinco métodos de evaluación de planta micorrizada por T. melanosporum empleados en el presente trabajo, tal y como aparecen detallados en las publicaciones originales - Reyna et al. (1997) CEAM-Valencia - Chevalier et al. (1972) INRA-ANVAR - Bencivenga et al. (1987) Universidad de Perugia - Palazón et al. (1999) INIA-Aragón - Fischer y Colinas (1996) Universidad de Lérida 86 Valor estimado en una escala del 0-5 para evaluar cada planta. Realizado mediante la observación directa de su sistema radicular (Fig.- 48). 0 ninguna micorriza 1 plantas muy poco micorrizadas 2 pocas micorrizas 3 bastante micorrizadas 4 bien micorrizadas 5 muy bien micorrizadas Fig.- 48 Sistema radicular limpio y sumergido en agua para su posterior observación con la lupa. La diferencia entre cada grado no es uniforme y no se puede corresponder esta notación a un porcentaje (Giraud, 1988), aunque Trouvelot et al. (1986) realizo una tabla con valores estimatorios en tanto por ciento (Tabla 19). 87 Tabla 19 Sistema de evaluación y conversión a porcentaje de Trouvelot et al. (1986). % medio Valores Chevalier 0 ninguna micorriza 0% 0 0 1 plantas muy poco micorrizadas 1 - 5% 3% 1 2 pocas micorrizas 6 - 25% 15% 2 3 bastantes micorrizas 26-50% 38% 3 4 bien micorrizadas 51-75% 63% 4 5 muy bien micorrizadas 76-100% 88% 5 Las plantas que tienen una nota de micorrización inferior a 3 son rechazadas. Si alguna planta del lote es portadora de micorrizas de Tuber no inoculadas serán rechazadas La importación en fresco de trufas de origen asiático ha sido la causa de que esta certificación descrita deba ir acompañada de otra nueva etiqueta del Ministerio francés, implicado en la lucha contra el fraude comercial, en la que se explicite la ausencia de micorrizas del tipo descrito, particularmente T. Indicum y T. himalayense. Para la evaluación del lote, se hallará el promedio de todas las notas individuales: -Si el promedio es mayor que o igual a 2,5 se acepta el lote. -Si el promedio es de menos de 2,5 se rechazara el lote. Control de lotes rechazados Los lotes de un año rechazados con micorrización insuficiente se puede mantener en vivero y realizar un control al año siguiente. Los lotes de dos años o contaminados se destruyen en presencia del agente del CTILF. El CTIFL emite etiquetas numeradas para lotes conformes (Fig.- 49) y el viverista deberá incorporar a cada planta del lote conforme la etiqueta previa a la venta. Al final de la temporada, un agente de Ctifl hace una visita al vivero para comprobar que los lotes rechazados no han sido vendidos y garantizar que los lotes aceptados se vendieron. 88 El INRA, Controla la micorrización sobre una muestra estadísticamente representativa dentro de la norma ISO 9001. Fig.- 49 Ejemplo de etiqueta expedida por el INRA. 89 3. Metodología Universidad de Perugia (Italia) Bencivenga et al. (1995) Desarrollada por varios centros de investigación italianos, esta metodología se basa en el conteo de ápices micorrizados en distintos sectores del aparato radical de las plantas, aconsejando muestrear el 1% de las plantas de cada lote, del que se extraen al menos 4 raíces por sector y planta, examinando 50 ápices por cada fragmento de raíz. En el caso de que las plantas presenten una micorrización heterogénea, con gran variabilidad entre las mismas, se aconseja muestrear el 3-5% de los lotes. No se hace referencia en este método a exclusiones o rechazo del lote por la aparición de micorrizas contaminantes, siempre que se mantenga un diferencial de 20 puntos porcentuales entre las micorrizas de Tuber y las contaminantes. El método se realiza en tres fases: 1. Individualizar la micorriza del genero Tuber y su identificación a nivel de especie. 2. Evaluar el grado de micorrización de cada planta de la muestra del lote. 3. Evaluar el grado de micorrización del lote de plantas. 1. Identificación de la micorriza La presencia y la identificación de las micorrizas se constatan con las siguientes operaciones: a. Se extrae la planta del contenedor y se lava delicadamente su sistema radicular procurando de reducir al mínimo la perdida de ápices micorrizados. b. Se examina a la lupa todo su sistema radicular con el fin de individualizar y localizar la presencia de micorrizas del genero Tuber y de otras formas diferenciables por caracteres morfológicos y biométricos. c. Se efectúa entonces el análisis microscópico de las diversas formas de micorrizas encontradas para proceder a la identificación de las especies presentes. 2. Evaluación del grado de micorrización de una planta Constatada la presencia de las micorrizas del tipo de trufa buscado se procede sobre cada planta de la muestra a la evaluación cuali-cuantitativa. 90 a. Se individualiza el sistema radicular, considerándolo desde el cuello de la planta hasta su extremidad radical, dos sectores de igual longitud: uno próximo y el otro distal, sin considerar la eventual presencia de raíces largas y aisladas (Fig.-50). Fig.-50 El sistema radicular de la planta se divide en dos partes iguales, como se aprecia en el dibujo. b. Se tomaran, de puntos diferentes y distantes entre ellos, al menos 4 porciones de raíces de la mitad próxima del sistema radicular y 4 porciones de la mitad distal (Fig.- 51). 91 Fig.-51 Planta preparada y situada bajo una plantilla, desde la cual extraemos porción de raíz para su posterior observación c. A partir de la parte próxima al cuello de cada porción de raíces, se cuentan sin ninguna exclusión, los primeros 50 ápices radiculares en cada fragmento, separándolos en: Ápices micorrizados de la especie de trufa buscada. Ápices micorrizados de otra especie fúngica. Ápices no micorrizados. d. Se calculan, para cada sector y para la planta entera, el porcentaje de los ápices micorrizados de la especie de trufa buscada, de los ápices micorrizados de otras especies fúngicas y de aquellos no micorrizados, referidos al total de ápices contados. Los datos analíticos se apuntan en la tabla 20. Nota 1 Los resultados de la elaboración estadística de los datos relativos a los porcentajes de ápices micorrizados de los sistemas radiculares de 5 muestras de plantas para cada una de las diez especies simbiontes utilizadas en truficultura (Quercus pubescens, Q. robur, Q. cerris, Q. ilex, Corylus avellana, Ostrya carpinifolia, Tilia cordata, Populus alba, Salix caprea, Pinus pinea ) han revelado que (Bencivenga et al. 1995): 92 1) Los porcentajes de ápices micorrizados descubiertos separadamente de la parte próxima y la distal del sistema radicular no están suficientemente correlacionados entre ellos. 2) Existe una correlación positiva muy estrecha entre el porcentaje de micorrizas encontradas en los primeros 50 ápices y aquellos encontrados en los primeros 100 ápices radicales contenidos en cada raíz muestreada. 3) Existe una evidente disformidad entre los porcentajes de micorrizas encontrados en las diversas raíces de una misma planta micorrizada; la disformidad es tanto más elevada cuando más bajo es el grado de micorrización de la planta. 4) Del punto de vista estadístico, en presencia de una fuerte heterogeneidad de los porcentajes de micorrización, al fin de contener el error de evaluación dentro del límite del 5% con el 95% de probabilidad, se necesitaría analizar al menos la mitad de los ápices radicales de la planta. A razón de estas observaciones ha sido decidido someter a análisis sólo los primeros 50 ápices. En atención al número de las porciones de raíces sometidas a control, para reducir el costo de los análisis y hacer el método más rápido, se ha tenido oportuno de tomar 8 fragmentos de raíces (4 en la parte próxima y 4 en la distal). Los análisis de estos fragmentos nos aprovisionan de datos próximos a la realidad en las plantas con una buena micorrización. Cuando se revelan porcentajes de micorrización muy diferentes en los fragmentos de raíces del mismo sector, se sugiere al analista de aumentar el número de los fragmentos hasta 12-16 para reducir dentro de límites aceptables los errores de evaluación. 2.a. Criterio para la definición de la validez de una planta micorrizada Una planta, puede ser considerada válida para truficultura, si presenta todos estos requisitos: a. Porcentaje de ápices micorrizados de hongos diferentes a la trufa inoculada no superior a 15%. b. Porcentaje de ápices micorrizados de hongos diferentes a la trufa inoculada no superior a 15%. c. Diferencia entre el porcentaje de los ápices micorrizados de la trufa inoculada y porcentaje de ápices micorrizados de otros hongos igual o superior a 20%. 93 d. Características bio-morfológicas de estado vegetativo, desarrollo del sistema aéreo y radical y sanidad según normas de la CEE para la producción viveristica forestal. 3 Evaluación del grado de micorrización de un lote de plantas La evaluación se efectúa sobre un lote homogéneo de plantas. Un lote homogéneo puede definirse cuando es constituido con plantas de la misma especie y edad, obtenidas con iguales métodos de propagación, inoculadas con el mismo método, en un intervalo de tiempo no superior a 10 días, con la misma especie de Tuber, y cultivada (con la misma técnica) en el mismo ambiente de cultivo. Una mayor homogeneidad podrá ser obtenida eliminando, del lote, las eventuales plantas con el sistema aéreo dañado de parásitos o que presentan desarrollo deforme respecto al resto o que no se pueden considerar validas según el perfil viverístico. 3.a. Modalidad de muestreo En lotes homogéneos, constituidos por más de 1000 plantas, el muestreo debe ser efectuado tomando al menos el 1% de las plantas; en lotes de dimensiones inferiores el muestreo deberá ser obligatoriamente compuesto de al menos 10 ejemplares. Las plantas que constituyan la muestrea de análisis van a ser elegidas por el analista o por medio de una plantilla de números aleatorios. La plantas a muestrear, en espera del análisis, deberán almacenarse correctamente para conservarlas en su total integridad. Nota 2. Las planta de un lote no tienen el mismo grado de micorrización y a menudo el porcentaje de ápices micorrizados de trufa varía entre limites muy amplios. El análisis estadístico, ejecutado en lotes constituidos de plantas con porcentajes de micorrización muy diferentes entre ellos, ha evidenciado que para contener el error de evaluación del porcentaje medio del lote dentro del 5% independientemente de las dimensiones del lote, es necesario analizar al menos 80 plantas, en el caso de lotes con micorrización homogénea, tales valores medio puede ser obtenido analizando solo 6 plantas (Bencivenga et al. 1995). Por tales motivos se aconseja, en vía preliminar de controlar el 1% de la planta sugiriendo al analista de aumentar hasta el 3-5 % en el caso en que la planta del primer muestreo presente micorrización muy heterogénea al fin de contener el error de evaluación dentro de límites aceptables. 94 3 b. Periodo de la toma y análisis de las muestras La toma de las muestras y los análisis de micorrización deberán ser efectuados, preferentemente en otoño, época en que son visibles las hifas peritróficas, las espínulas y los cistidios que describen la caracterización morfológica de la micorriza de Tuber a nivel de especie. 3 c. Criterios para la definición de la validez de un lote de plantas En base a la experiencia en el examen de numerosas muestras homogéneas de plantas tomadas de partidas experimentales y comerciales y una consideración de orden biológico se ha convenido establecer válido para el fin de la truficultura, un lote homogéneo cuando al menos el 80% de las plantas de la muestra resultan idóneas según los requisitos de acuerdo al punto 2a, habiendo establecido que ninguna planta de la muestra deberá ser carente de micorrizas de la trufa inoculada. Si en el análisis, el lote no resulta válido, la plantas que lo forman pueden ser cultivadas un segundo año. Si en el segundo año el lote sigue siendo no valido, toda la plantas que lo forman no podrán ser certificada como idóneas para truficultura. Los datos analíticos se apuntan en la tabla 21. 3 d. Periodo de validez del análisis del lote Dado que el control conviene efectuarlo en otoño, la distribución de la planta deberá hacerse poco después, en el curso del invierno, o como máximo, en la primavera sucesiva. Con la permanencia de la planta en vivero el estado de micorrización podría modificarse en sentido negativo a causa de contaminaciones de micelios externos. En el caso de que la distribución no se avenga en los tiempos indicados, se deberá ejecutar un nuevo control del lote. 95 Fig.- 52 Modelo a utilizar para la elección de las raíces sometidas a análisis. La medida de la plantilla es de 13 cuadrados de 1 cm de lado x 14 cuadrados de 1 cm de lado. En la figura 52 se expone la plantilla necesaria para extraer fragmentos de raíces y realizar el conte. En la banda coloreada en negro irán abiertas unas ranuras (2 cm x 0,3 cm). Se aconseja de realizar esta plantilla con un folio plastificado no transparente de modo de no condicione la elección de micorrizas mientras se muestrea. Una vez lavado el sistema radicular de la planta, se extiende sobre un papel secante y con cuidado se superpone la plantilla. En cada uno de los dos sectores del aparato radicular se insertan unas tijeras por las ranuras 1, 2 ,3 y 4, cortando las raicillas más próximas al punto central de la ranura. La raíz cortada se extrae con unas pinzas sin mover la plantilla. En el caso que, en un sector, en los puntos indicados 1, 2, 3 y 4 no hubiera raíces se puede proceder a recoger de los puntos 5, 6, 7 y 8 en el mismo sector. También en el caso de querer ampliar la muestra se pueden recoger raíces en los puntos 5, 6, 7, y 8. 102 5. Metodología Universidad de Lérida (España) Fischer y Colinas (1996) Se analizan 12 plantas por lote, cortando el sistema radical en segmentos de 2-3 mm, que se colocan sobre una bandeja con cuadrículas, anotando la proporción de micorrizas de T. melanosporum (PT) y la de contaminantes (PC) en un mínimo de 250 ápices radicales. La novedad del método estriba en la importancia de las proporciones respecto a los porcentajes, que deben alcanzar un mínimo para que no se rechace el lote. La presencia de cualquier micorriza de Tuber distinta de T. melanosporum supone igualmente la exclusión del lote. 1. Identificación del lote Documentación de homogeneidad y garantía fitosanitaria (estándares nacionales) requiere que todas las plantas presenten en común las siguientes condiciones: - Procedencia de la semilla - Fuente y método de inoculación - Fecha de inoculación - Sustrato - Condiciones de vivero 2. Toma de muestras De cada lote se seleccionarán 12 plantas. Este número está basado en la variabilidad entre lotes (Fischer y Colinas, 1996). Selección desarrollada por el agente de control de forma aleatoria para evitar cualquier tipo de desviación y satisfacer los requerimientos de los métodos estadísticos utilizados. Las plantas deben ser transportadas al laboratorio de certificación, refrigeradas y almacenarse a 4ºC hasta que sean examinadas, preferiblemente en un plazo de 2 semanas desde la toma de muestras en vivero. Procedimiento de lavado Las plantas deben ser cuidadosamente extraídas del contenedor con el cepellón completo y sumergidas en un baño de agua para empapar el sustrato. Después, se procederá a eliminar el sustrato de las raíces de las plantas, una por una, en una bandeja de agua con agitaciones suaves para no romper los ápices cambiando el 103 agua frecuentemente y sin aplicar la presión directa de un chorro de agua. Los restos de sustrato que quedan adheridos a las raíces se pueden eliminar con pinzas finas bajo el microscopio esteroscópico. 3. Evaluación de calidad de planta Antes de evaluar los niveles de micorrización es necesario verificar que las plantas cumplen los criterios de calidad (Apéndice 1). Las plantas que no cumplen estos niveles estándar de calidad no serán evaluadas en el meticuloso proceso de conteo de ápices. Los estándares de la Unión Europea establecen que al menos un 95% de plantas de un lote superen los controles de calidad de planta (Peñuelas, 1993). El analista documentará los resultados de calidad de su evaluación en la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2). Primera observación al microscopio estereoscópico El segundo paso en el examen es un primera observación de todo el sistema radical de la planta al microscopio estereoscópico, observando la abundancia de raíces tróficas, el estado micorricico, la presencia, desarrollo y apariencia general de las micorrizas de T. melanosporum, y la presencia de contaminantes. En esta etapa el analista tiene que examinar al microscopio óptico los ápices cuyo estado micorricico sea incierto para facilitar que el conteo posterior. Si se encuentran ápices micorrizados con una especie de Tuber distinta de T. melanosporum el lote deberá ser rechazado. En esta fase se han de cumplir otros tres criterios: a) Un mínimo de 250 raíces tróficas. b) Porcentaje de micorrización con T. melanosporum no claramente inferior al 10%. c) Porcentaje de micorrizas contaminantes no claramente superior al 50%. El analista documentará los resultados de esta evaluación en la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2). Conteo de ápices En las plantas que hayan superado las dos primeras evaluaciones se medirán las proporciones de T. melanosporum (PT) y de contaminantes (PC). El procedimiento es el siguiente: 1) Eliminar el tallo y cortar el sistema radicular de la planta en dos o en cuatro partes iguales en sentido longitudinal, eligiendo aleatoriamente una parte para su análisis. 104 2) Cortar cuidadosamente el sistema radical en segmentos de 2-3 mm y situarlos sobre una cuadricula de 1cm x 1cm, de una plantilla que posee diferentes colores, y ésta, sumergida en una bandeja de análisis con agua (Fig.- 55). 3) Distribuir los segmentos homogéneamente por toda la superficie de la bandeja evitando romper ápices y comenzar el conteo utilizando cuadriculas elegidas aleatoriamente del mismo color. 4) En cada cuadrícula elegida se clasificarán todas las raíces tróficas en las siguientes categorías: No micorrizadas (N), micorrizadas con T. melanosporum (T), micorrizadas con micorrizas contaminantes (C). Los ápices senescentes se considerarán no micorrizados. 5) Continuar el conteo hasta haber observado 250 ápices. El analista documentará los resultados de esta evaluación en la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2). Determinación de las proporciones de cada planta Después de haber examinado 250 ápices se calcularán las siguientes proporciones: Proporción de T. melanosporum (PT)= T/(N+C) Proporción de contaminantes (PC)= C/T T: número de ápices micorrizados con T. melanosporum N: número de ápices no micorrizados C: número de ápices micorrizados con contaminantes El analista debe introducir los datos de la planta en la Hoja de Datos de Planta (Apéndice 2). Determinación de intervalos de confianza de PT y de PC de un lote (Apéndice 3). Después de hacer los cálculos de PT y PC para las primeras 5 plantas, el analista determinará los intervalos de confianza al 95% para los valores de PT y PC del lote. Si los criterios son cumplidos, el lote puede ser certificado sin continuar el muestreo. Si no es así, el analista debe de continuar el análisis hasta que se cumpla el criterio de aceptación o se alcance la decimosegunda planta. Si el lote no cumple los criterios, no podrá ser certificado. Criterio de idoneidad para la truficultura El lote será admitido cuando se cumplan los siguientes criterios: a. No debe haber ninguna planta que no haya cumplido los criterios de calidad. Si una planta no cumple los criterios de calidad, se puede continuar con la evaluación con una muestra más amplia hasta 90 plantas para confirmar la calidad del lote. 105 b. El límite inferior del intervalo de confianza del numero de raíces tróficas del lote debe ser mayor de 1800. c. No debe haber ninguna planta que tenga un PT menor de 0.11 (10%). d. No debe haber ninguna planta que tenga una PC mayor de 1.0 (50%). e. El límite inferior del intervalo de confianza de PC debe ser mayor de 0.50 (33% colonizado por T. melanosporum). f. El límite superior del intervalo de confianza de PC debe ser menor de 0.33 (el nivel de contaminantes en raíces tróficas debe ser inferior al 25%). g. No debe haber ninguna planta con micorrizas de una especie de Tuber distinta de T. melanosporum. h. Si un lote no cumple los criterios e, f y g, el lote no podrá ser admitido. Si un lote cumple los criterios de e, f, y g, pero 1 o 2 plantas no cumplen los criterios a, b, c, o d, el lote puede someterse a una segunda evaluación con una muestra mayor. Si un lote cumple los criterios de e, f y g, pero 3 o más plantas no cumplen los criterios a, b, c o d, el lote no podrá ser admitido. Segunda evaluación de calidad de planta Cuando encontramos una planta inadmisible en una muestra de tan sólo 12 plantas, no podemos garantizar que el lote tenga menos del 5% de plantas en esas condiciones. Por ello necesitamos una muestra de 90 plantas (Steel y Torrie, 1980). Esta segunda evaluación sólo deberá abordarse si PT y PC estimados a partir de la primera muestra son lo suficientemente buenos como para pensar que el lote podría ser admitido. El proceso para la segunda evaluación es similar al primero en el sentido de que cada planta tiene que cumplir los criterios de calidad de planta y la primera observación al microscopio estereoscópico. No es necesario el conteo de ápices de raíz si las plantas cumplen estas dos etapas. El intervalo de confianza dependerá del número de plantas analizadas y del número de plantas rechazadas hasta el momento y se puede hallar en las tablas de intervalos de confianza binomiales con un límite superior del 5% de las plantas rechazadas (Steel y Torrie, 1980). El analista podría obtener intervalos de confianza cada 5 ó 10 plantas después de la planta número 23, que es la primera en que la amplitud del intervalo de confianza puede ser menor que el límite. De esta manera será posible aceptar o rechazar un lote sin necesidad de evaluar la muestra de 90 plantas por completo. 106 Fig.- 55 Planta preparada para poder ser analizada sobre un plantilla requerida por este método. Apéndice 1: Criterio de evaluación de calidad de planta para Quercus ilex en contenedor Según el anexo VII, parte E del Real Decreto 289/2003 sobre comercialización de los materiales forestales de reproducción. Las plantas no se comercializarán si el 95% de cada lote no es de calidad cabal y comercial. No se considerarán de calidad cabal y comercial las plantas que presenten algunos de los siguientes defectos: 1. Heridas distintas de las causadas por la poda o heridas debidas a los daños de arranque. 2. Ausencia de yemas susceptibles de producir un brote apical. 3. Tallos múltiples. 4. Sistema radicular deformado. 5. Signos de desecación, recalentamiento, enmohecimiento, podredumbre o daños causados por organismos nocivos. 107 6. Desequilibrio entre la parte aérea y la parte radical. Una planta que cumple los mínimos de altura y diámetro de cuello debe tener un mínimo de 900 raíces tróficas. 7. Dimensiones por edad: Plantas de 1 año con altura mínima de 8 cm, altura máxima de 30 cm y un diámetro del cuello mínimo de 2mm: Plantas de 2 años con altura mínima de 15 cm, altura máxima de 50 cm y el diámetro del cuello mínimo de 3 mm. Apéndice 2: Determinación de intervalos de confianza de PT y de PC de un lote. 108 Apéndice 2: Hoja de datos de Planta.