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Trabajo Fin de Máster Estudio de los receptores NOD1 y NOD2 y su implicación en la fisiología intestinal: Alteraciones de su expresión mediada por TLRs y en patologías inflamatorias intestinales crónicas Elena Layunta Hernández Ana Isabel Alcalde Herrero José Emilio Mesonero Gutiérrez Facultad de Veterinaria de Zaragoza 2013 2 ÍNDICE RESUMEN …………………………………………………………………………… 4 I. INTRODUCCIÓN ….…………………….………………………………………… 6 I.1. EL INTESTINO DELGADO ……………………………………………… 6 1.1. Anatomía y fisiología 1.2. Barrera intestinal I.2. LOS RECEPTORES DE RECONOCIMIENTO DE PATRONES (PRR) … 8 2.1. Receptores tipo Toll (TLR) 2.2. Receptores tipo NOD (NLR) 2.2.1. NOD1 2.2.2. NOD2 I.3. LAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS INTESTINALES ………… 13 3.1. Sintomatología I.4. LA SEROTONINA ………………………………………………………… 14 4.1. Síntesis y metabolismo 4.2. El transportador de serotonina (SERT) 4.3. Sistema serotoninérgico intestinal 4.4. Implicación del sistema serotoninérgico en la actividad intestinal II. OBJETIVOS ……………………………………………………………………….. 18 III. MATERIAL Y MÉTODOS ………………………………………………………. 19 III.1. Línea celular Caco-2 ……………………………………………………… 19 III.2. Extracción de muestras intestinales de ratones ...………………………… 21 III.3. Cuantificación de proteínas ...………….....……………………………… 22 III.4. Estudios de transporte de 5-HT ……………..…………..………………… 23 III.5. Análisis de expresión proteica: western blot …………………………… 25 III.6. Extracción de ARN, transcripción reversa, PCR y PCR en tiempo real … 27 3 IV. RESULTADOS ……………….………………………………………………… 30 IV.1. Análisis preliminar de la expresión molecular Del ARNm y de la proteína de los receptores NOD1 y NOD2 en la línea celular epitelial intestinal humana Caco-2 …………………………. 30 IV.2. Estudio del efecto de la activación de NOD1 o NOD2 sobre la actividad de SERT en células Caco-2 ………………………………………… 32 2.1. Tratamiento con el agonista de NOD1 2.2. Tratamiento con el agonista de NOD2 IV.3. Efecto de la activación del TLR2 sobre la expresión génica de NOD1 y NOD2 en células Caco-2 ……………………….……………………. 34 3.1. Expresión de NOD1 3.2. Expresión de NOD2 IV.4. Análisis de la expresión de NOD1 y NOD2 en intestino delgado y colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- o TLR2,4-/- ………………………………. 36 4.1. Análisis de la expresión de NOD1 4.2. Análisis de la expresión de NOD2 V. DISCUSIÓN ………...…………………………………………………………… 41 V.1. Efecto de la activación de NOD1 y NOD2 sobre la actividad de SERT … 41 V.2. Efecto de los TLRs sobre la expresión de NOD1 y NOD2 ………………. 42 2.1. Análisis de la expresión de NOD1 en intestino delgado y colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- o TLR2,4-/- 2.2. Análisis de la expresión de NOD2 en intestino delgado y colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- o TLR2,4-/- VI. CONCLUSIONES ……..………………………………………………………… 46 VII. REFERENCIAS BIBLIGRÁFICAS …………………………………………… 47 4 RESUMEN El sistema inmunológico, constituido por la inmunidad adquirida y la innata, tiene una gran importancia en el tracto gastrointestinal, donde actúa de forma coordinada para diferenciar entre agentes propios o necesarios y microorganismos nocivos. El sistema inmune innato es una primera línea de defensa, donde una serie de receptores (TLRs y NODs) reconocen patrones moleculares asociados a microorganismos patógenos, que facilitan el inicio de una respuesta defensiva. En patologías inflamatorias intestinales crónicas, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, se ha observado la existencia de modificaciones en la expresión de los receptores NOD que alteran el sistema inmune innato. El sistema serotoninérgico intestinal, en el que la serotonina (5HT) actúa como un neuromodulador que comunica los sistemas nervioso e inmune, y que regula una gran variedad de funciones gastrointestinales, también se ha visto alterado en este tipo de patologías. Así, la disponibilidad extracelular de 5-HT se encuentra aumentada y podría actuar como sustancia proinflamatoria. El transportador de serotonina (SERT) es el responsable de regular la disponibilidad de 5-HT. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la relación existente entre el sistema serotoninérgico y los receptores NOD, así como la modulación de la expresión de los NODs mediada por los TLRs, ya que todos estos sistemas se encuentran alterados en situaciones inflamatorias, pero se desconoce si existe conexión entre ambos. Utilizando la línea celular Caco-2 para realizar estudios de transporte de 5-HT, hemos observado que la activación de NOD1 y NOD2 induce una alteración en la funcionalidad de SERT, y por tanto del sistema serotoninérgico intestinal. Así, la activación de NOD2 inhibe SERT, mientras que NOD1 parece tener un efecto dual inhibiendo SERT a corto plazo, y activándolo a largo plazo. En lo que se refiere a la interacción entre TLRs y NODs, se ha observado que la activación de TLR2 aumenta la expresión de NOD1 y NOD2. Este hecho ha sido corroborado con el estudio de la expresión de los receptores NOD en ratones transgénicos deficientes para diferentes TLR. Así, en ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- se ha observado como la expresión de ARNm y proteica de NOD1 y NOD2 se encuentra alterada, tanto en intestino delgado, como en colon, aunque no siempre en el mismo sentido. En consecuencia, este trabajo muestra que existe clara interrelación entre SERT y los receptores NOD, que a su vez también interaccionan con los receptores TLR, constituyendo entre todos ellos un complejo sistema que modula la respuesta inflamatoria, en el que muchas otras moléculas están también implicadas. 5 ABSTRACT The immune system, consisting of innate and acquired immunity, has a great importance in the gastrointestinal tract, in which it acts in a coordinated way to differentiate between necessary or own agents, and harmful microorganisms. The innate immune system is a first defense barrier, which includes some receptors (TLR and NOD) that recognize molecular patterns associated with pathogen microorganisms to assist a defense response. In chronic inflammatory bowel diseases, such as Crohn’s disease and ulcerative colitis, changes for NOD receptors and alteration of the innate immune system have been demonstrated. Serotonergic intestinal system, which communicates nervous an immune systems by 5-HT and regulates a wide variety of gastrointestinal functions, has also been shown to be altered in these pathologies. In fact, 5-HT extracellular availability has been shown to be increased and 5-HT may act as a proinflammatory factor. Serotonin transporter (SERT) regulates 5-HT availability. The aim of this work has been to analyze the relationship between serotoninergic system and NOD receptors, and the regulation of the expression of NODs mediated by TLRs, since these systems are modified in inflammatory conditions, but it is unknown whether there is a link between both. Caco-2 cell line has been used to analyze the 5-HT transport after activation of NOD1 and NOD2 receptors. This activation causes an alteration in SERT function and therefore, in the intestinal serotoninergic system. Thus, NOD2 activation inhibits SERT while NOD1 seems to have a dual effect; thus NOD1 inhibits SERT in a short term activation and activates SERT in a long term activation. In relation to TLRs-NODs interaction, the results have also shown that TLR2 increases NOD1 and NOD2 expression, suggesting the existence of an interrelationship between these receptors involved in innate immunity. This fact has been confirmed by the study of NOD receptors expression in deficient transgenic mice for different TLRs. Thus, in TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- mice, mRNA and protein expression of NOD2 and NOD1 resulted altered, in both small intestine and colon, although not always in the same direction. In consequence, this research work shows that there is a clear relationship between SERT and NOD receptors, and that NODs also interact with TLR receptors, thus establishing a complex system that modulates de inflammatory response, in which many other molecules may also be involved. 6 I. INTRODUCCIÓN I.1 EL INTESTINO DELGADO 1.1. Anatomía y fisiología El tracto gastrointestinal es un tubo continuo que se extiende desde la boca hasta el ano, en el que los principales órganos son la boca, gran parte de la faringe, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso. Como órganos accesorios del tracto gastrointestinal nos encontramos con los dientes, la lengua, las glándulas salivales, el hígado, la vesícula biliar y el páncreas [1]. El intestino delgado es una estructura tubular, que se continúa en su extremo proximal con el estómago y en su extremo distal con el colon, y que se divide en tres regiones: el duodeno, el yeyuno, y el íleon [2]. Histológicamente existe una estructura común para todo el tracto gastrointestinal, compuesta por cuatro capas concéntricas, que desde el interior de la luz del tubo hacia el exterior se describen de la siguiente manera [3]: • Mucosa: se encuentra en contacto directo con la luz, y presenta pliegues circulares, vellosidades y microvellosidades. Estos pliegues incrementan enormemente la superficie de revestimiento, optimizando el proceso de absorción de nutrientes. La capa mucosa está formada, a su vez, por tres capas concéntricas: el epitelio, la lámina propia y la muscularis mucosae. La capa epitelial está constituida por un epitelio cilíndrico simple con varios tipos de células: los enterocitos que son las células absortivas (digieren y absorben nutrientes), las células enteroendocrinas, las células de Paneth y las caliciformes. La lámina propia, formada por tejido conectivo, contiene glándulas, vasos sanguíneos y una gran variedad celular con función defensiva y de comunicación. Por último, se encuentra una fina capa de células musculares lisas, la muscularis mucosae, que separa la mucosa de la submucosa. • Submucosa: capa gruesa de tejido conectivo que sostiene físicamente a la mucosa. Presenta glándulas de secreción, vasos sanguíneos, y células del sistema inmunitario. • Muscular: formada por dos capas de músculo liso: la externa, más gruesa, con fibras longitudinales y la interna, más fina, de fibras circulares. Es la encargada de la ejecución de las ondas peristálticas con diferentes patrones de movimiento para el mezclado y avance del contenido del tracto. 7 • Serosa: es la capa más externa. Está formada por una capa de células epiteliales planas (mesotelio), y una capa de tejido conectivo elástico. Excepto en la mayor parte del duodeno, la serosa cubre por completo al intestino delgado. Esta gran complejidad tisular le permiten al intestino desarrollar funciones tales como: la actividad digestiva, la actividad motora, la absorción de nutrientes, la secreción de agua y electrolitos y la actividad inmune, todas ellas perfectamente coordinadas gracias a la interconexión del sistema nervioso, el sistema inmunitario y el sistema endocrino propios del intestino [4]. 1.2. Barrera Intestinal La pared intestinal constituye una barrera anatómica e inmunológica fundamental entre la luz y el compartimento interno intestinal ya que se encuentra en continuo contacto con los contenidos de la luz intestinal que puede incluir entre otros, agentes externos, tanto beneficiosos como patógenos. Por ello, la principal función de la barrera intestinal es permitir un eficiente transporte de nutrientes a través del epitelio, mientras se excluye el paso de moléculas y agentes potencialmente nocivos [5]. Para garantizar la integridad de esta barrera intestinal, el organismo presenta una serie de mecanismos de defensa que se pueden clasificar en mecanismos no inmunológicos y mecanismos inmunológicos. Los mecanismos no inmunológicos están formados principalmente por células epiteliales que forman parte de la estructura de la mucosa que recubre todo el tubo digestivo, con las uniones estrechas que las mantienen unidas y sellan los espacios intercelulares. Entre estas células epiteliales se encuentran los enterocitos, que son células polarizadas, con un borde basal y un borde apical en cepillo orientado a la luz intestinal. Además, presenta otros componentes como el glucocáliz, que crea una red de mucopolisacárido y glicoproteína, la cual retiene el moco producido por las células caliciformes y protege al epitelio. Las células de Paneth también forman parte del epitelio, y producen y secretan defensinas para controlar la población intestinal de microorganismos. El intestino, en su cara interna, hacia la luz, está en continuo contacto con una abundante y diversa población de microorganismos, denominada microbiota, con la cual 8 interactúa gracias a una actividad inmunológica muy desarrollada. Los mecanismos inmunológicos trabajan de forma coordinada entre sí y permiten diferenciar entre agentes propios beneficiosos o necesarios, y microorganismos nocivos externos. Podemos distinguir dos grandes mecanismos defensivos en el intestino; la inmunidad innata y la inmunidad adquirida. • Inmunidad innata: forma la primera línea de defensa frente a agentes nocivos. Produce una respuesta rápida y está mediada por la actividad epitelial y por la de los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y células fagocíticas que por un lado fagocitan y destruyen patógenos, y por otro, liberan mediadores inflamatorios y citocinas como TNFα e IL-1β. Todo ello inicia la activación de la respuesta inmune adquirida y en consecuencia la inflamación. • Inmunidad adquirida: es específica contra el antígeno y genera memoria inmunológica, produciendo una defensa duradera en el tiempo. Su respuesta se fundamenta en la acción de los linfocitos B y T. Los linfocitos B son células productoras de inmunoglobulinas que neutralizan a los antígenos, a nivel sistémico IgG e IgM, y a nivel intestinal IgA [6]. Cabe señalar la gran importancia de la inmunidad innata en el intestino, ya que permite establecer una correcta relación con las bacterias comensales del mismo. Además, ante una situación patológica, constituye la primera línea de defensa activa, que junto con la inmunidad adquirida, puede finalizar en un proceso inflamatorio. Para realizar esta función, la mucosa intestinal cuenta con una serie de receptores llamados receptores de reconocimiento de patrones (Pattern Recognition Receptors, PRRs), mediante los cuales puede discernir los agentes nocivos de los que no lo son. Existen básicamente dos tipos de PRRs, los receptores tipo Toll (Toll-like receptors, TLRs) y los tipo NOD (Nucleotidebinding Oligomerization Domain receptors, NLR). Estos receptores reconocen fragmentos de los microorganismos patógenos llamados patrones moleculares asociados a patógenos (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs) [7]. I.2. LOS RECEPTORES DE RECONOCIMIENTO DE PATRONES (PRR) El fundamento de la respuesta innata es el reconocimiento inespecífico de patógenos, a la vez que mantiene la tolerancia de los “elementos propios”. Por este motivo, la inmunidad innata debe ser capaz de reconocer un gran número de patógenos mediante un número restringido de receptores [7]. 9 Los receptores PRRs son capaces de reconocer unos fragmentos de microorganismos patógenos que no se encuentran en las células eucariotas y que están sometidos a pocas mutaciones, ya que son esenciales para la vida de los mismos, los PAMPs. Estos PAMPs incluyen componentes de la pared bacteriana, como el lipopolisacárido (LPS), los peptidoglicanos o los ácidos teicoicos, así como otros componentes de hongos, levaduras y protozoos. Tal como anteriormente se ha indicado, existen dos grandes grupos de PRRs: los NLRs y los TLRs. Los NLRs son receptores citosólicos que participan en la regulación del proceso inflamatorio al percibir patógenos intracelulares. Los TLRs en su mayoría son receptores transmembrana, muy conservados filogenéticamente, esenciales para la inmunidad innata y para la activación de la inmunidad adquirida [8]. 2.1. Receptores tipo Toll (TLR) La familia de los TLRs presenta una estructura glicoproteica transmembranal tipo I, que en base a su considerable homología en la región citoplasmática pertenecen a la superfamilia de los receptores de interleucina 1 (IL-1R). Presentan dos regiones, una extracelular con repeticiones ricas en leucina (LRR), y un dominio citoplasmático, denominado dominio TIR [9]. En la mayoría de los mamíferos se han identificado entre 10 y 15 TLRs [10]. En la especie humana, hasta la actualidad, se han reconocido 11 subtipos, que han sido subdivididos en cinco subfamilias de acuerdo a su localización en el cromosoma, estructura genómica y secuencia de aminoácidos: TLR2, TLR3, TLR4, TLR5 y TLR9 [11]. Los TLRs también han sido agrupados para su estudio en dos categorías: la que reconoce PAMPs de tipo bacteriano (TLR1, 2, 4, 5 y 6), localizados principalmente en la superficie celular, y la que reconoce virus (TLR3, 7, 8 y 9) que requiere la internalización de los PAMPs a compartimentos endosomales [12]. TLR2 tiene como función principal el reconocimiento de diferentes productos bacterianos, como por ejemplo lipoproteínas de bacterias Gram negativas, peptidoglicano y ácidos lipoteicoico de bacterias Gram positivas [13-15]. El reconocimiento de una amplia gama de productos microbianos es debido a la formación de heterodímeros en la membrana plasmática con varias proteínas que son o bien estructuralmente relacionadas con TLR2, como TLR1 y TLR6, o no relacionadas, como la dectina-1 [13]. 16 dominios transmembrana, con los grupos amino y carboxi-terminal intracelulares. La expresión del transportador SERT presenta una amplia distribución, aunque su estudio se ha focalizado principalmente en el sistema nervioso central y el tracto gastrointestinal. 4.3. Sistema serotoninergico intestinal El sistema serotoninérgico intestinal presenta tres pilares de gran importancia: 1. Las células enterocromafines del epitelio intestinal, que son las encargadas de la síntesis y liberación de 5-HT (tanto por el borde apical como basal) previa estimulación. Esta síntesis y liberación constituyen el mecanismo denominado “ON” del sistema serotoninérgico. 2. Los receptores de serotonina, constituidos por 14 tipos diferentes agrupados en 7 familias. Estos receptores reconocen específicamente a la 5-HT y son los responsables de desencadenar los efectos intracelulares de la serotonina. Los receptores de 5-HT se encuentran distribuidos por todo el organismo, y sobre todo en el tracto gastrointestinal. 3. Los enterocitos del epitelio intestinal, encargados de la recaptación e internalización de la serotonina al interior celular a través de SERT, tanto en la membrana apical como en la membrana basolateral de las células. Con la internalización de 5-HT se favorece la terminación de la actividad serotoninérgica, por ello este sistema constituye el sistema “OFF”. El efecto que la 5-HT pueda desarrollar en el organismo depende fundamentalmente de su disponibilidad, que a su vez depende de la actividad de los sistemas “ON y OFF”. 4.4. Implicación del sistema serotoninérgico en la actividad intestinal La 5-HT es un neuromodulador que envía información desde la luz intestinal a los plexos nerviosos, la musculatura y el epitelio intestinal. Su liberación se produce tanto a la lámina propia como a la luz intestinal debido a la estimulación química y/o mecánica [46]. De esta forma, la 5-HT produce diferentes efectos dependiendo de la concentración de la misma y del receptor al que se una [47]. 17 El sistema serotoninérgico está implicado en la mayor parte de las funciones intestinales. Así, resultados obtenidos en nuestro laboratorio y por otros autores demuestran que la 5-HT está implicada en la absorción de nutrientes [48, 49], la actividad motora [50, 51] y la secreción de agua y electrolitos [52]. La alteración de este sistema, por tanto, produce la afectación de numerosos procesos en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, el papel que desempeña la 5-HT en el desarrollo de patologías inflamatorias crónicas gastrointestinales está siendo muy estudiado. Existen numerosos estudios que confirman la implicación de la 5-HT en la inflamación intestinal crónica [53] sobre todo en la EC y la CU. En estas patologías se produce un aumento en el número de células enterocromafines [44] y disminución en la transcripción de SERT [54], provocando ambas un aumento de la concentración extracelular de 5-HT. Por otro lado, se ha demostrado que la 5-HT modula la respuesta inmune intestinal dada la presencia de receptores de 5-HT en células dendríticas, linfocitos, macrófagos, células endoteliales y células epiteliales entéricas [43, 55, 56]. Toman relevancia los estudios que demuestran la activación de linfocitos por parte de la 5-HT, así como la implicación de la misma en la producción de citocinas proinflamatorias [57]. El papel del sistema serotoninérgico y de los PRRs en la función inmune intestinal está perfectamente documentado, no así, la posible relación establecida entre ellos. Estudios realizados previamente en nuestro laboratorio han demostrado que la activación de determinados TLRs influye en la actividad y expresión de SERT en células epiteliales intestinales [58, 59], además de influir en la producción de citocinas y factores proinflamatorias. Es por ello, que el objetivo de este trabajo es estudiar la implicación de otro tipo de PRRs, los NOD (NOD1 y NOD2) en la actividad y expresión de SERT en las células epiteliales intestinales y además, la relación existente entre NOD1 y NOD2 y algunos TLRs, más concretamente TLR2 y TLR4. 18 II. OBJETIVOS El intestino es un órgano complejo en el que, entre otras muchas, la función inmunológica adquiere gran relevancia al ser un órgano que está en continuo contacto con agentes externos. Los TLRs y NODs son receptores de reconocimiento de patógenos (PRR) que detectan determinados fragmentos de microorganismos (PAMP) y activan la respuesta inmune intestinal, manteniendo la homeostasis del mismo. En situaciones de patología inflamatoria crónica, donde actúa el sistema inmune, se produce asimismo una alteración del sistema serotoninérgico intestinal, donde el transportador de serotonina (SERT) juega un papel fundamental como regulador de la disponibilidad extracelular de 5-HT. Ante estos antecedentes, el objetivo general de este trabajo se ha centrado en estudiar la relación existente entre la activación de receptores NOD sobre SERT, utilizando como modelo enterocitario, la línea celular Caco-2, que expresa constitutivamente SERT. Por otro lado, y dado que tanto receptores TLR como NOD pertenecen al grupo de PRRs, se ha pretendido estudiar la interacción entre los TLRs y la expresión de los NODs. Para alcanzar este objetivo general se han planteado los siguientes objetivos parciales: • Determinar la expresión de NOD1 y NOD2 en células Caco-2. • Estudiar el efecto de la activación de NOD1 y NOD2 sobre la actividad transportadora de SERT en células Caco-2. • Estudiar el efecto de la activación de TLR2 sobre la expresión de NOD1 y NOD2 en células Caco-2. • Analizar las modificaciones en la expresión de NOD1 y NOD2 en intestino delgado y colon de ratones deficientes en determinados TLRs (TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/-). 19 III. MATERIAL Y MÉTODOS III.1. Línea celular Caco-2 La línea celular Caco-2, clon TC7, ha sido la utilizada como modelo experimental “in vitro” [60]. Estas células, cuando alcanzan la confluencia celular, desarrollan progresivamente y de forma espontánea una diferenciación morfológica y funcional de tipo enterocitario, con fenotipo absortivo. Para la manipulación de las células y sus medios, se empleó una cabina de flujo laminar recirculante vertical de clase II (TELSTAR AV-100), que protege tanto al manipulador al mismo tiempo que permite unas condiciones de esterilidad adecuadas para la manipulación de los cultivos. Para el recuento celular, se ha utilizado un microscopio de luz invertida (Olympus CK2), que también permite una visión en contraste de fases de las células. Las células fueron mantenidas en cultivo en una estufa de CO2 (Haeraeus BB16), donde se mantiene constante la temperatura (37ºC), una atmósfera humidificada, con un 95% de aire y un 5% de CO2. Todo el material utilizado para la manipulación celular y sus medios ha sido de plástico estéril de un único uso (Sarstedt). El cultivo se inicia a partir de un vial congelado, conservado en nitrógeno líquido, que contiene 1-3x106 células en un volumen de 1,5 ml de medio de cultivo, con un 30% de SFB y un 10% de glicerol. Las células se descongelan a 37ºC, se diluyen en 5 ml de medio de cultivo y se centrifugan a 3.000 rpm durante 5 minutos. Una vez eliminado el sobrenadante, las células son resuspendidas en 5 ml de medio de cultivo y puestas en cultivo, sembradas, en un frasco de 25 cm2. El medio de cultivo utilizado es un Medio Esencial Mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), con alta concentración de glucosa (4,5 g/l), suplementado con un 20% de suero fetal bovino (SFB) previamente descomplementado (30 minutos a 56ºC), 1% de penicilina (10000 UI/ml)-estreptomicina (10 mg/ml), 1% de aminoácidos no esenciales 10 mM, y 2% de L-glutamina 200 mM. . El medio de cultivo se conserva en frigorífico a 4ºC, y previamente a su uso, es calentado a 37ºC en un baño termostático, para evitar un choque térmico sobre las células. Tras la siembra inicial, el medio se cambia a los 3 días y posteriormente diariamente. Antes de iniciar cualquier experimento, las células sufren dos pasajes, acción que se repetía semanalmente para el mantenimiento de la línea celular. Es decir, 20 el tapiz celular es tripsinizado una vez a la semana, cuando las células alcanzan casi el 100% de confluencia en cultivo, y de nuevo son sembradas en otros frascos o soportes de cultivo en función de las necesidades o experimentos a realizar. El protocolo de tripsinización de un frasco de 25 cm2 es el siguiente: 1) Retirar el medio de cultivo y lavar las células 2 veces con 5 ml de PBS. 2) Retirar los 5 ml de PBS y añade 1 ml de una solución tripsina 0,25% / EDTA 1 mM, en PBS. Se deja actuar la tripsina durante 5 minutos a 37ºC en la estufa de cultivo, con el frasco cerrado. 3) Con unos ligeros golpes laterales en el frasco se despega el tapiz celular y se separan inicialmente las células del plástico de cultivo. Se añaden 5 ml de medio de cultivo con 20% de SFB para neutralizar la tripsina, y con ayuda de una pipeta de 5 ml se homogeniza el contenido para individualizar las células con movimientos aspiración y expulsión. La suspensión celular se centrifuga a 3000 rpm durante 5 minutos y el pellet celular es resuspendido en 5 ml de medio de cultivo nuevo. 4) Se toma una pequeña muestra de la suspensión celular para realizar el recuento de células utilizando una cámara de Neubauer. La muestra se diluye 1/3 en azul de tripán (dilución 1/3), que permite al mismo tiempo estimar el número de células viables de las no viables. Con la ayuda del microscopio y la cámara de Neubauer, se realiza el recuento de las células en una superficie de 1 mm2 y se calcula el número de células por ml de suspensión celular. 5) Conocida la densidad celular, se procede al cálculo del volumen de suspensión necesario para la siembra, teniendo en cuenta que la densidad celular de siembra normalmente fue de 1,2 x 106 células/cm2. De esta manera en frascos de 25 y 75 cm2, se siembran 300.000 y 900.000 células, respectivamente. En otros soportes, como por ejemplo, en placas de 24 pocillos, cuya superficie de cultivo es de 2 cm2, la densidad de siembra fue mayor (40.000 células/pocillo). 6) Las placas y frascos fueron depositados en la estufa de cultivo para permitir la adhesión de las células al plástico y el inicio de la división celular. El medio fue cambiado a las 72 h de la siembra, y luego diariamente. 21 III.2 Extracción de muestras intestinales de ratones Los ratones utilizados fueron C57BL10 controles y KO (knock out) para los TLR2 (TLR2-/-), TLR4 (TLR4-/-) o TLR2 y 4 (TLR2,4-/-), cedidos por el Dr Julian Pardo, del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Los ratones fueron mantenidos en ciclos de 12 h de luz y oscuridad, a una temperatura constante de 22ºC, en atmósfera controlada, con libre acceso al agua y a una dieta estándar de comida, en las instalaciones del animalario del CITA (Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón). Los ratones de 10-12 semanas de vida fueron sacrificados por dislocación cervical, y se procedió a la extracción del intestino delgado y el colon. El protocolo de manejo y uso de estos animales de laboratorio ha seguido la normativa de experimentación animal (Real Decreto 53/2013) y cuenta con el visto bueno del Comité Ético para la experimentación animal de la Universidad de Zaragoza. Las muestras destinadas a una posterior extracción de ARN se pesaron hasta una cantidad de 15 mg, y se mantuvieron en una solución de RNA-later durante 24 h a 4ºC. Pasado este periodo de tiempo, las muestras fueron extraídas de la solución y almacenadas a -20ºC hasta su uso. Las muestras de tejido destinadas a la cuantificación de la expresión proteica por la técnica de western blot, fueron troceadas y congeladas de inmediato en una solución de isopentano en hielo seco. A partir del intestino delgado también se realizaron extracciones de mucosa intestinal, mediante raspado de la misma con un porta esmerilado. La mucosa extraída fue igualmente congelada. Todas las muestras fueron posteriormente almacenadas hasta su uso en un congelador a -80ºC hasta su uso. Para el estudio de la expresión proteica por western blot, las muestras fueron previamente homogenizadas con la ayuda de un ultra-turrax (Yellow Line DI 25 basic) en una solución de Tris-Manitol cuya composición se indica en la siguiente tabla: COMPONENTES Volúmenes (ml) TRIS 2 mM 0,250 Manitol 50 mM 2,500 Azida de sodio 0,025 PMSF 0,025 Benzamidina 0,025 Inhibidor de proteasas 2,000 Agua destilada 20,175 Volumen Final 25,000 ml 22 III.3. Cuantificación de proteínas Se realizó la medición del contenido proteico en muestras de células en cultivo y en muestras de homogenados de intestino delgado y colon de ratón. La determinación de la concentración proteica se realizó mediante el método de Bradford [61]. Este método colorimétrico consiste en añadir un reactivo (colorante azul brillante de Coomassie G250 en solución ácida) que forma un complejo coloreado con las proteínas. Ello permite la valoración cuantitativa de proteínas mediante la medida de absorbancia a una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotómetro. Este valor obtenido es proporcional a la concentración de proteínas en la muestra, según la ley de LambertBeer. La relación entre absorbancia y concentración de proteínas se establece experimentalmente mediante el análisis de distintas concentraciones conocidas y crecientes de una proteína de referencia (recta patrón), en nuestro caso la albúmina sérica bovina (BSA, 1 mg/ml), a las que se les aplica, de forma paralela a las muestras problema, el mismo método analítico. Para la realización de la recta patrón de concentraciones proteicas, se prepararon 5 tubos por duplicado con cantidades de proteínas conocidas de BSA con los siguientes volúmenes, utilizando NaOH o TrisManitol como solución diluyente en función del tipo de proteínas que se querían analizar: Componentes Volúmenes (en μl) para un volumen final de 15 μl BSA (1 mg/ml) 0 2 5 10 15 NaOH 0,1 N o Tris-Manitol 15 13 10 5 0 Para medir la proteína de nuestra suspensión de células en cultivo, se extraen 10 μl de cada pocillo en el caso de los estudios de transporte, y 2 μl por triplicado en el caso de muestras de tejido de ratones. A todos los tubos (muestras y patrones), se le añade 1 ml. de reactivo de Bradford (Bio-Rad) y se deja reaccionar 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se mide la absorbancia en un espectrofotómetro a 595 nm y se calcula su concentración teniendo en cuenta los volúmenes y diluciones indicadas. 23 III.4. Estudios de transporte de 5-HT Esta técnica permite determinar la funcionalidad del transportador SERT mediante la medida de la captación celular de 5-HT, y estudiar las alteraciones que se puedan producir en el transporte de 5-HT en función de los diferentes tratamientos a los que fueron sometidas las células. Los experimentos se realizaron sobre células Caco-2/TC7 cultivadas en placas de 24 pocillos con una superficie de 2 cm2/pocillo. Para evitar interferencias en nuestros estudios con posibles elementos presentes en el SFB (factores de crecimiento, hormonas, etc.), las células fueron incubadas con medio de cultivo DMEM sin SFB durante 6 ó 24 horas, en función del experimento. Se realizaron experimentos tratando las células con el agonista de NOD1 (C12iE-DAP) a concentraciones de 0,1, 1 y 10 µg/ml o el agonista de NOD2 (N-GlycolylMDP) a concentraciones de 1, 10 y 50 µg/ml, utilizando tres periodos de tratamiento: • Tratamiento de 24 horas en DMEM sin SFB. • Tratamiento de 6 horas en DMEM sin SFB • Tratamiento de 30 minutos, directamente en el Tampón I o medio de lavado. Para la realización de los experimentos de transporte se prepararon tres medios o tampones: el Tampón I (medio de lavado), el Tampón II (medio de incubación o transporte), y el Tampón III (solución stop). El tampón I se prepara según los volúmenes y concentraciones indicados en la siguiente tabla, para un volumen final de 1 litro, a partir de una serie de soluciones madre preparadas previamente. Soluciones madre Volumen solución madre (ml) Concentración final (mM) NaCl 1 M 137,0 137,0 KCl 1 M 4,7 4,7 KH 2 PO 4 0,5 M 2,4 1,2 MgSO 4 0,2 M 6,0 1,2 CaCl 2 0,1 M 25,0 2,5 Hepes-Tris. pH 7,2 0,1 M 100,0 10,0 H 2 O destilada c.s.p. (1000 ml) 24 Los tampones II y III se preparan a partir del tampón I, en función del volumen requerido por el experimento, necesitando 0,5 ml/pocillo del tampón II y 2 ml/pocillo del tampón III. Para ello, al volumen requerido del tampón I para la preparación del resto de tampones, se le agrega: glutamina 4 mM, BSA 0,1 mg/ml y ácido ascórbico 1 mM. En este punto, se separan los volúmenes necesarios para el tampón II y III. Al tampón III se le añade 5-HT para una concentración final de 20 µM, mientras que al tampón II se le añade 5-HT para una concentración final de 0,2 µM. Por último, al tampón II, o medio de transporte, se le añade [3H]-5-HT a la concentración de 1,5 µCi/ml (actividad específica 20-30 Ci/mmol). Los tampones I y II se mantienen a 37ºC y el tampón III se enfría a 4ºC, para facilitar su acción de detener el transporte. Tras el periodo de tratamiento celular en ausencia de suero y en presencia de los agonistas de NOD1 y NOD2, las células fueron incubadas con el tampón I (1 ml/pocillo) durante 30 minutos, también en presencia del correspondiente tratamiento en la estufa a 37ºC. Pasados los 30 minutos las células fueron lavadas de nuevo con 2 ml de tampón I. A continuación se inicia el transporte propiamente dicho, añadiendo 0,5 ml de tampón II, a 37ºC, y manteniendo las células en estas condiciones durante 6 minutos. Transcurrido este periodo de tiempo, se detiene la reacción de transporte mediante el lavado de las células con 1 ml de tampón III a 4ºC, por dos veces. Tras el último lavado, se añade 0,5 ml de NaOH 0.1 N al tapiz celular, y se incuba durante 24 horas a 4ºC para romper la membrana celular y poder liberar el contenido de la misma. Posteriormente, se homogeneíza el tapiz, y se toman muestras para la medida de la radiactividad incorporada a las células durante el tiempo de transporte, y para calcular la concentración de proteínas. La medida del transporte se realiza midiendo los valores de radioactividad (cpm) del medio de incubación y del homogenado celular. Para ello, sobre las muestras radioactivas se añade 1,5 ml de líquido de centelleo (GE Healthcare), y se procede a la lectura de los cpm de [3H] en un contador beta (Beckman). Para el cálculo del sustrato acumulado en las células durante los 6 minutos de incubación, se utilizó la siguiente ecuación: pmol 5-HT / mg proteína = proteina mg x cpmM HT][5 x Vm x cpmC − 25 Donde: - cmpC: son las cpm de los 200 µl del homogenado celular - Vm: es el volumen del medio de incubación radioactivo (5 µl) - [5-HT]: es la concenctración del sustrato en µM (0,2 µM) - cmpM: son las cpm de los 5 µl del medio de incubación - mg proteína: mg de proteína de los 200 µl de nuestro homogenado celular III.5. Análisis de expresión proteica: western blot El estudio de la expresión de los receptores NOD1 y NOD2 en las muestras intestinales de ratones se ha realizado utilizando la técnica de western blot, mediante la que las proteínas son separadas por su tamaño por electroforesis en un gel de poliacrilamida con SDS (electroforesis SDS-PAGE), transferidas a una membrana de PVDF, y detectadas mediante el uso de un anticuerpo específico (inmunodetección). Para la preparación de los geles de acrilamida se ha utilizado el sistema de minigeles de BioRad. El gel era preparado según la composición que se muestra en la siguiente tabla, de manera que el que el gel separador tiene una concentración de acrilamida del 8%, y el gel concentrador del 3%: GEL SEPARADOR (8%) GEL CONCENTRADOR (3%) Agua miliQ 4680 µl 4240 µl TRIS 1,5 M pH 8,8 2500 µl -- TRIS 0,5 M pH 6,8 -- 1900 µl Acrilamida stock (30 %) 2670 µl 1250 µl SDS 20% 50 µl 40 µl Amonio Persulfato 10% 100 µl 70 µl Temed 15 µl 4 µl Las muestras utilizadas han sido de homogenado celular de tejido intestinal de ratones y de células Caco-2, cuya concentración de proteínas fue determinada por el método de Bradford. En cada pocillo se cargaban 100 µg de proteína. Las proteínas eran previamente desnaturalizadas utilizando un tampón que contiene Tris, SDS, glicerol y azul de bromofenol, e incubándolas durante 1 minuto a 100ºC. 32 IV.2. Estudio del efecto de la activación de NOD1 o NOD2 sobre la actividad de SERT en células Caco-2 2.1.- Tratamiento con el agonista de NOD1: C12-iE-DAP El estudio se realizó planteando el análisis de la actividad transportadora de SERT (captación de 5-HT) en células Caco-2, en función de la activación de NOD1 a diferentes tiempos (30 min, 6 h y 1 d) y concentraciones de tratamiento (0,1, 1 y 10 µg/ml). Los resultados muestran que el tratamiento de las células con C12-iE-DAP (DAP), agonista específico de NOD1, produce un efecto inhibidor de la captación de 5HT, especialmente significativo a altas concentraciones (1 y 10 µg/ml) y a 30 min. Sin embargo, a 1 día de tratamiento y a todas las concentraciones ensayadas, se produce un efecto inverso, resultando un aumento de la captación celular de 5-HT (Figura 3). Estos resultados sugieren un efecto dual de la activación de NOD1 sobre la actividad de SERT. Curiosamente, los resultados obtenidos a 6 h de tratamiento parecen indicar que la activación de NOD1 no afecta la actividad de SERT, lo cual podría indicar un tránsito en la dualidad de efecto entre corto (30 min) y largo plazo (1 d). Figura 3. Efecto del tratamiento de las células Caco-2 durante 30 min, 6 h y 1 d con DAP a diferentes concentraciones (0,1, 1 y 10 µg/ml) sobre la captación de 5-HT, medida tras 6 minutos de incubación con 5-HT. **p<0,01 y ***p<0,001 en comparación al control. ** *** *** *** *** 30 min 0 20 40 60 80 100 120 140 5-HT uptake (% of Control) 6 horas 1día C 0,1 1 10 C 0,1 1 10 C 0,1 1 10 DAP DAP DAP 33 2.2.- Tratamiento con el agonista de NOD2: n-glycolyl-MDP De manera similar a lo indicado en el apartado anterior, también se realizó el estudio de la actividad de SERT, tratando las células con n-glicolil-muramil dipéptido (MDP), agonista específico de NOD2, a distintas concentraciones (1, 10 y 50 µg/ml) y periodos de tratamiento (30 min, 6 h y 1 d). Los resultados muestran que el tratamiento durante 30 min y 6 h produjo una inhibición significativa del transportador SERT a todas las concentraciones empleadas. En el caso de tratamiento a 1 d el efecto fue sólo significativo cuando se llevó a cabo con la concentración más alta del agonista (50 µg/ml) (Figura 4). Este resultado parece indicar que la activación de NOD2 inhibe la actividad de SERT en células Caco-2, a corto y medio plazo. Figura 4. Efecto del tratamiento de las células Caco-2 durante 30 min, 6 h y 1 d con MDP a diferentes concentraciones (1, 10 y 50 µg/ml) sobre la captación de 5-HT, medida tras 6 minutos de incubación con 5-HT. **p<0,01 y ***p<0,001 en comparación al control. ***** *** *** *** *** *** 0 20 40 60 80 100 5-HT uptake (% of Control) 30 min 6 horas 1día C 1 10 50 MDP C 1 10 50 MDP C 1 10 50 MDP 34 IV.3. Efecto de la activación del TLR2 sobre la expresión génica de NOD1 y NOD2 en células Caco-2 Debido a que, tanto los receptores NOD1 y NOD2 como los TLRs, forman parte del grupo de receptores PRRs que participan activamente en la respuesta a la microbiota luminal que lleva a cabo el epitelio intestinal mediante la inmunidad innata, otro objetivo planteado en este trabajo fue estudiar la posible interacción entre el TLR2 y los receptores NOD1 y NOD2. Para ello se utilizaron también las células Caco-2, en las que previamente se había determinado la expresión de TLR2. En estas células se activó TLR2 en sus dos formas heterodiméricas, TLR2/1 y TLR2/6, utilizando el agonista de TLR2/1, Pam3CSK4, y el agonista de TLR2/6, Pam2CSK3, y realizándose el tratamiento durante un periodo de 1 día. 3.1.- Expresión de NOD1 Para poder demostrar la relación existente entre TLR2 y NOD1, realizamos un tratamiento a diferentes concentraciones de los agonistas de TLR2/1 y de TLR2/6 y se analizó las posibles modificaciones en la expresión de ARNm de NOD1. Los resultados mostraron que solo altas concentraciones de los agonistas de TLR2/1 y TLR2/6, 10 µg/ml y 100 ng/ml, respectivamente, produjeron un pequeño aumento significativo de la expresión de NOD1 (Figura 5). Figura 5. Efecto del tratamiento de las células Caco-2 con el agonista de TLR2/1 y de TLR2/6 durante 1 d, a diferentes concentraciones (5 y 10 µg/ml, 50 y 100 ng/ml, respectivamente) sobre la expresión de ARNm de NOD1. *p<0.05 comparado con el control. ** TLR2-1 TLR2-6 C 5 10 50 100 0.0 0.5 1.0 1.5 Valor de ARNm de NOD1 relativo 35 3.2.- Expresión de NOD2 En el estudio de la expresión de NOD2 tras la activación de TLR2/1 y TLR2/6 con los agonistas específicos indicados, en las mismas condiciones utilizadas en el estudio sobre NOD1 se obtuvieron resultados diferentes (Figura 6). Por un lado la activación de TLR2/1 no indujo ninguna alteración sobre la expresión de NOD2. Sin embargo, altas concentraciones (100 ng/ml) de Pam2CSK3, agonista de TLR2/6, indujeron un fuerte incremento (superior a 2 veces) de la expresión de NOD2. Figura 6. Efecto del tratamiento de las células Caco-2 con el agonista de TLR2/1 y de TLR2/6 durante 1 dís a diferentes concentraciones (5 y 10 µg/ml, 50 y 100 ng/ml respectivamente) sobre la expresión de ARNm de NOD2. ***p<0.001 comparado con el control. En conjunto, estos resultados sobre la interacción de TLR2 con los receptores NOD parecen sugerir una cierta especificidad de TLR2 sobre la regulación de la expresión de NOD1 y NOD2, aumentando su expresión cuando TLR2 es activado. Sin embargo, existe una clara diferencia en función del heterodímero activado (TLR2/1 o TLR2/6) y del receptor NOD afectado. Así, NOD1 incrementa su expresión ligeramente por la activación de ambos heterodímeros, mientras que NOD2 solo se ve incrementado por la activación de TLR2/6. C 5 10 50 100 0.00 0.75 1.50 2.25 3.00 Valor de ARNm de NOD2 relativo *** TLR2-1 TLR2-6 36 IV.4. Análisis de la expresión de NOD1 y NOD2 en intestino delgado y colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- o TLR2,4-/- Quedando demostrado en el punto anterior la posible modulación de la expresión de los receptores NOD mediada por TLR2, y con el fin de profundizar más en este aspecto, se analizó cuál era el grado de expresión molecular de los receptores NOD en intestino delgado y colon de ratones que no expresan (knockout, KO) los receptores TLR2 (TLR2-/-), TLR4 (TLR4-/-) y TLR2 y 4 (TLR2,4-/-). Para ello, se procedió a medir el nivel de expresión del ARNm de NOD1 y NOD2 mediante la técnica qRT-PCR, y el nivel de expresión proteica de estos receptores NOD1 y NOD2 mediante western blot, ambas técnicas descritas en el apartado de Material y Métodos. 4.1.- Análisis de la expresión de NOD1 El grado de expresión del ARNm de NOD1 en intestino delgado de ratones TLR2-/- y TLR2,4-/- fue mayor que en ratones control, siendo especialmente significativo en TLR2,4-/-. Sin embargo, en ausencia única de TLR4 no hubo modificación del nivel de expresión de ARNm de NOD1 (Figura 7). Este dato parece sugerir que la ausencia de expresión del TLR4 podría contribuir al incremento de las alteraciones de expresión de ARNm de NOD1 generadas por la ausencia de expresión de TLR2. Figura 7. Expresión de ARNm de NOD1 en intestino delgado en de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- determinada por qRT-PCR. *p<0.05, **p<0.01 comparado con el control. ** CTLR2-/- TLR4-/- TLR2,4-/- 0 1 2 3 Valor de ARNm relativo NOD1 intestino delgado * 37 Contrariamente a los resultados obtenidos en intestino delgado, el grado de expresión de ARNm de NOD1 en colon de ratones TLR4-/- o TLR2,4-/- fue menor que en ratones control, siendo esta disminución significativa solo en el caso de TLR4-/- (Figura 8). En colon de ratones TLR2-/- no se detectó diferencia en la expresión de NOD1 respecto al control. Figura 8. Expresión de ARNm de NOD1 en colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- determinada por qRT-PCR. *p<0,05 comparado con el control. Tras la obtención de estos resultados, se procedió a realizar el estudio de la expresión molecular de la proteína del receptor NOD1, mediante western blot, en intestino delgado y colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/-. En intestino delgado se analizaron dos tipos de muestras: muestras con tejido intestinal entero y muestras procedentes únicamente de raspado de mucosa intestinal. Los resultados muestran que, tanto en tejido entero como en mucosa, se produjo un aumento en la expresión proteica del receptor NOD1 en ratones TLR2-/- y TLR4-/-; siendo sólo significativo en mucosa de ratones TLR2-/-. En el caso de tejido completo, hubo una mayor expresión en ausencia de TLR4. Sin embargo, tanto en tejido entero como en raspado de mucosa de ratones TLR2,4-/-, los niveles de expresión de NOD1 se mantuvieron similares al control, si bien en ausencia individual (TLR2-/- y TLR4-/-) se produce un aumento de la expresión (Figuras 9 y 10). * CTLR2-/- TLR4-/- TLR2,4-/- 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Valor de ARNm relativo NOD1 colon 38 Figura 9. Expresión proteica del receptor de NOD1 en muestras de intestino delgado de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/-. Figura 10. Expresión proteica del receptor de NOD1 en muestras de raspado de mucosa del intestino delgado de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/-.*p<0,05 comparado con el control. 4.2. Análisis de la expresión de NOD2 Al igual que con el receptor NOD1, el objetivo de este apartado era conocer el grado de expresión del receptor NOD2 en intestino delgado y colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- siguiendo la misma metodología utilizada anteriormente. El grado de expresión de ARNm de NOD2 en intestino delgado de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- aumentó respecto al control, siendo especialmente significativo TLR4-/- y TLR2,4 (Figura 11). 0 200 400 600 800 NOD1/Actina CTLR2-/- TLR4-/- TLR2,4-/- CTLR2-/- TLR4-/- TLR2,4-/- 0 100 200 300 400 NOD1/Actina * 39 Figura 11. Expresión de ARNm de NOD2 en intestino delgado de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- determinada por qRT-PCR.*p<0,05 y **p<0,01 comparado con el control. Por el contrario, en el colon, el nivel de expresión de ARNm de NOD2 es mayor en ratones TLR2-/-, mientras que en ratones TLR4-/- y TLR2,4-/- no se observaron cambios significativos (Figura 12). Figura 12. Expresión de ARNm de NOD2 en colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- determinada por qRT-PCR. *p<0,05 comparado con el control. ** ** CTLR2-/- TLR4-/- TLR2,4-/- 0 1 2 3 4 Valor de ARNm relativo NOD2 intestino delgado * * CTLR2-/- TLR4-/- TLR2,4-/- 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Valor de ARNm relativo NOD2 colon 40 Una vez obtenido el grado de expresión de ARNm de NOD2 en intestino y colon de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- se procedió a realizar el estudio del receptor NOD2 en intestino delgado de estos mismos ratones, por western blot. En este estudio, como se puede observar, la disponibilidad de muestras fue menor y no se pudo analizar el colon, por no disponer de material suficiente. Asimismo, no se dispuso de intestino delgado completo de ratones TLR2,4-/-. En tejido completo (Figura 13) parece producirse un aumento en la expresión proteica del receptor NOD2 en TLR2-/-, TLR4-/-. También en la mucosa la expresión del receptor de NOD2 pareció aumentar en TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- (Figura 14). Figura 13. Expresión proteica del receptor NOD2 en tejido entero del intestino delgado de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- determinada por western blot. Figura 14. Expresión proteica del receptor NOD2 en raspado de mucosa del intestino delgado de ratones TLR2-/-, TLR4-/- y TLR2,4-/- determinada por western blot. 0 250 500 750 1000 NOD2/Actina CTLR2-/- TLR4-/- 0 500 1000 1500 NOD2/Actina CTLR2-/- TLR4-/- TLR2,4-/- 41 V. DISCUSIÓN El trabajo desarrollado y presentado en la memoria muestra dos partes diferenciadas con un factor común: el análisis de los receptores NOD1 y NOD2 en el intestino. En la primera parte del trabajo se aborda la influencia de la activación de NOD1 y NOD2 sobre la actividad del transportador SERT. En la segunda parte se ha analizado la modulación de la expresión intestinal de NOD1 y NOD2 en función de la expresión de diversos TLRs. Por ello, la discusión va a incluir estos dos apartados, realizando al final un análisis global de todos los resultados en el entorno de la fisiopatología intestinal. V.1. Efecto de la activación de NOD1 y NOD2 sobre la actividad de SERT. La serotonina (5-HT) es un neuromodulador muy ligado a la actividad intestinal y a su sistema inmunológico. El transportador SERT es responsable en parte de regular la disponibilidad extracelular de 5-HT, lo cual determina la magnitud y duración de la respuesta serotoninérgica. Numerosos estudios han demostrado que la serotonina está aumentada en situaciones inflamatorias provocando, además, proliferación de linfocitos [64], secreción de interleucinas proinflamatorias [65] e inhibiendo la apoptosis de las células inmunológicas [66]. Asimismo, resultados obtenidos en nuestro laboratorio demuestran que en situación proinflamatoria la actividad de SERT está inhibida [59] y que la IL-10, citocina antiinflamatoria, estimula la actividad de SERT [67]. Recientes estudios muestran que pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales crónicas presentan un aumento en el nivel de 5-HT [68] [44]. Dada la clara participación del sistema serotoninérgico en la actividad inmunológica intestinal, se consideró conveniente analizar su relación con los receptores ligados al sistema inmune innato NOD1 y NOD2, pertenecientes a la familia de proteínas receptoras tipo NLR. Estos receptores intracelulares, que se localizan en células epiteliales e inmunológicas, responden a componentes de la microbiota, en concreto, NOD1 y NOD2 detectan muropéptidos derivados de peptidoglicanos, principales componentes de la pared celular de bacterias Gram-positivas. Estudios anteriores desarrollados en nuestro laboratorio demostraron que la activación de diversos TLRs, receptores también ligados a la actividad inmune innata intestinal, provocan una inhibición en el transportador SERT y por lo tanto pueden 48 20. Pasare, C. and R. 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