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Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es Trabajo Fin de Máster Efecto de la subnutrición materna periconcepcional sobre los resultados reproductivos de ovejas y la calidad oocitaria de sus corderas Autor Sandra Lobón Ascaso Directores José Alfonso Abecia Martínez Adriana Casao Gascón Facultad de Veterinaria 2013 Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 1 ÍNDICE I – RESUMEN.…………………………………………………......................................6 II – ABSTRACT.………………...………………………………………………………8 III – INTRODUCCIÓN.……………………..………………………………………….9 1. Efectos de la nutrición materna en el establecimiento de la gestación……………………………………………………………………..9 1.1. Efectos sobre el desarrollo folicular………………………..9 1.2. Efectos sobre la calidad del ovocito………………11 1.3. Efectos sobre el funcionamiento luteal y el suministro de progesterona……………………...................................................................11 1.4. Efecto de la nutrición en la calidad y desarrollo embrionario………………………………………………………………....13 2. Efectos de la nutrición materna en la descendencia………………………..14 3. Mecanismos de los efectos nutricionales…………………………………...15 IV – OBJETIVOS…………....……………………………………………...................17 V - MATERIALES Y MÉTODOS………….……………………………....................18 1. Instalaciones……………………………..………………………………….18 2. Animales……………………………………………………………………18 3. Actividades…………………………………………………………………19 3.1. Sincronización del celo………………………………………19 3.2. Diagnóstico de gestación…………………..……………………19 3.3. Parámetros reproductivos…………………………………………20 3.4. Pesaje de los corderos……………………..…………………….20 3.5. Producción in vitro de embriones…………………………………20 3.5.1. Extracción ovocitos……………….……………………20 3.5.2. Maduración……………………………………………….21 3.5.3.Fecundación…………………………………...………….22 3.5.4. Cultivo de embriones………………………...………..…24 3.6. Análisis estadísticos………………………………………………..24 Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 2 VI – RESULTADOS………………………………………………………...................26 1. Experimento 1………………………………………………………………26 2. Experimento 2………………………………………………………………29 VII – DISCUSIÓN………………………………………………..................................32 VIII – CONCLUSIONES………………………………………………………………35 IX – BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………36 Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 3 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1: Resultados reproductivos y productivos (media±E.S.) de ovejas alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 veces (B) las necesidades de mantenimiento 16 días antes de la cubrición y hasta 7 días después de la aparición del celo……………………………………………………………………………………..27 Tabla 2: Número (media±E.S.) (%) y calidad de los ovocitos de corderas de 2 meses de edad, provenientes de madres que fueron alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 (B) veces las necesidades de mantenimiento 16 días antes de la cubrición y hasta 7 días después de la aparición del celo correspondiente a la gestación de las corderas………………………………………………………………………………..28 Tabla 3: Resultados de maduración, FIV y cultivo de embriones procedentes de ovocitos de corderas hijas de madres alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 (B) veces el mantenimiento 16 días antes de la cubrición y hasta 7 días después de la aparición del celo correspondiente a la gestación de las corderas……………………………………28 Tabla 4: Resultados reproductivos y productivos (media±E.S.) de ovejas alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 veces (B) las necesidades de mantenimiento 16 días antes de la cubrición y hasta 15 días después de la aparición del celo……………………………30 Tabla 5: Número (media±E.S.) (%) y calidad de los ovocitos de corderas de 2 meses de edad, provenientes de madres que fueron alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 (B) veces las necesidades de mantenimiento 16 días antes de la cubrición y hasta 15 días después de la aparición del celo correspondiente a la gestación de las corderas………31 Tabla 6: Resultados de maduración, FIV y cultivo de embriones procedentes de ovocitos de corderas hijas de madres alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 (B) veces el mantenimiento 16 días antes de la cubrición y hasta 15 días después de la aparición del celo correspondiente a la gestación de las corderas……………………………………31 Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 4 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Evolución del PV y CC de ovejas alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 veces (B) el mantenimiento, desde la colocación de la esponja (PV1, CC1), en el momento del celo (PV2, CC2) y 7 días después de la aparición del celo (PV3, CC3). a, b: p<0,05…………………………………………………………………………………26 Figura 2: Evolución del PV y CC de ovejas alimentadas para cubrir 1,5 (C) o 0,5 veces (B) el mantenimiento, desde la colocación de la esponja (PV1, CC1), en el momento del celo (PV2, CC2) y 15 días después de la aparición del celo (PV3, CC3). a, b: p<0,05…………………………………………………………………………………29 Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 5 I. RESUMEN Los objetivos de éste trabajo han sido estudiar el efecto de una subnutrición severa en los días previos y posteriores a la concepción sobre los parámetros reproductivos de las ovejas y conocer el posible efecto de esta subnutrición sobre la calidad ovocitaria de las corderas nacidas de dicha concepción. Para ello se realizaron dos experiencias en el Servicio de Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza, con procedimientos aprobados por la Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal. Ochenta (experimento 1) y cuarenta (experimento 2) ovejas de raza Rasa Aragonesa se sincronizaron en celo mediante esponjas vaginales y la administración de 300 UI de eCG durante 14 días y fueron cubiertas a partir de las 36 horas de la retirada de las esponjas (celo=día 0). Desde el momento de la colocación de las esponjas y hasta el día 7 (experimento 1) ó 15 (experimento 2) después de los celos, las ovejas fueron alimentadas en grupo para cubrir 1,5 (grupo Control, C) o 0,5 (grupo Bajo, B) veces sus necesidades de mantenimiento (M). A partir del día 7 (experimento 1) ó del día 15 (experimento 2) las ovejas se reagruparon y fueron sometidas a la dieta 1,5 M hasta los partos. En este momento se registró el peso vivo al nacimiento de los corderos y se pesaron semanalmente hasta el momento del destete, con 40 días de edad. Seis corderas en cada experimento, hijas de ovejas pertenecientes a los dos grupos nutricionales (3 por grupo) fueron sacrificadas a los dos meses de vida, se extrajeron sus ovarios y se recuperaron sus ovocitos, en cada uno de los experimentos. Estos ovocitos, una vez clasificados, se seleccionaron los aptos y se maduraron y fecundaron. De cada animal se registró el número de ovocitos recuperados tanto aptos como no aptos para la maduración. Las tasas de maduración y división se calcularon en función del número de ovocitos aptos y la tasa de fertilización se basó en el número de ovocitos madurados. Las ovejas del lote control mantuvieron su peso vivo (PV) y condición corporal (CC) a lo largo de la experiencia, mientras que las subnutridas experimentaron una pérdida significativa (p<0,05) tanto del PV como CC. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 6 La subnutrición periconcepcional dio lugar a unos resultados reproductivos inferiores al lote control, con diferencias significativas para la prolificidad y fecundidad en el experimento 1 (p<0,05) y con una tendencia a la significación (p=0,10) para la fertilidad y fecundidad en el experimento 2. La duración de la media de la gestación fue similar en ambos lotes, así como la tasa machos/hembras nacidos. El PV medio de los corderos nacidos de las ovejas del lote B fue significativamente (p<0,05) superior que los corderos del lote C, rozándose la significación al comparar los corderos del mismo sexo. Por el contrario, no hubo diferencias en el PV al destete ni en el crecimiento medio diario hasta ese momento. Respecto a la población oocitaria, las corderas hijas del lote B presentaron un mayor número de ovocitos a los dos meses de vida. En conclusión, un nivel de subnutrición del 50% alrededor de la concepción se refleja negativamente sobre el rendimiento reproductivo, viéndose afectados parámetros como la prolificidad, fertilidad y fecundidad. Los corderos nacidos de madres pertenecientes al lote B presentan un PV medio superior. Las corderas nacidas de madres subnutridas presentan una alteración en la cantidad de ovocitos recuperados, siendo superior a las corderas nacidas de ovejas del lote C. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 7 II. ABSTRACT The aim of this work was to determine the effect of a severe undernutrition before and after conception on reproductive parameters of ewes and on the oocyte population of ewe lambs born after undernutrition. Two experiments were carried out at the Servicio de Experimentación Animal of the University of Zaragoza, with protocols approved by the Ethical Committee for Animal Experimentation. Eighty (experiment 1) and forty (experiment 2) Rasa Aragonesa ewes were fed to provide 1.5 (control group, C) or 0.5 (low group, L) times their maintenance requirements, from pessary insertion until 7 (exp. 1) or 15 (exp. 2) days after oestrus (day 0). From that moment to lambing, ewes were fed in group with the 1.5 diet. Six ewe lambs from each experiment were euthanized at 2 months of age and their oocyte quality studied. Diets provoked a significant reduction (p<0.05) of live weight (LW) and body condition in the L group. Undernourished ewes presented a significant (p<0.05) lower litter size and fecundity in experiment 1, and a trend (p=0.10) for fertility and fecundity in experiment 2. Mean pregnancy length was similar in both groups, so that ratio males/females born. Lambs from the L group had a significant higher LW at lambing (p<0.05), although no differences in LW at weaning or mean dairy LW gain were observed. Animals born from L ewes presented more oocytes than from C ewes (p<0.05), although percentages of healthy oocytes were similar. In conclusion, periconceptual maternal undernutrition produced a significant reduction of lamb production. Moreover, lambs from these ewes presented a significant higher LW at lambing and ewe lambs an alteration of oocyte quantity but no quality. These differences could have consequences in the adult life. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 8 III. INTRODUCCIÓN Los efectos de la nutrición sobre el rendimiento reproductivo de la especie ovina han sido estudiados ampliamente y sus conocimientos aplicados a los sistemas de producción animal para mejorar la productividad de las explotaciones. Tanto una alimentación restringida como una excesiva provocan efectos negativos en el rendimiento reproductivo, pudiéndose verse afectada la descendencia. En literatura relativamente antigua de medicina humana (Mellanby, 1933) ya se reconocen los efectos del estado nutricional antes del nacimiento sobre la salud o fisiología en la vida posterior. Los rumiantes han sido objetos de muchos de estos estudios, ya que se crían con frecuencia en áreas de tierra marginales, en los que el aporte de nutrientes al suelo puede ser limitado y los animales criados en estos entornos podrían ser especialmente propensos a padecer deficiencias nutricionales, por lo que es interesante estudiar la subnutrición en este tipo de animales (Rhind, 2004). La subnutrición podríamos definirla como alimentar a los animales por debajo de sus necesidades de mantenimiento (M). En el ovino el nivel clásico en experimentación es de 0,5 M y se compara con grupos 1 M ó 1,5 M. En muy pocos trabajos el umbral de subnutrición es menor a 0,5 M ya que niveles más bajos durante largos periodos de tiempo provocan efectos adversos significativos y además en numerosos países la legislación en materia de experimentación animal no lo permite. En nuestros experimentos el plano de alimentación para el grupo subnutrido es el clásico 0,5 M y el grupo control 1,5 M. Los estudios iniciales de los efectos nutricionales maternos se han centrado generalmente en las etapas tardías de la gestación y en el periodo temprano del neonato (Gunn et al., 1995; Rhind et al., 1998b), ya que son en estas etapas en las que la demanda de nutrientes maternos es mayor para el crecimiento del feto o del neonato. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 15 Influencias nutricionales y endocrinas durante el desarrollo fetal o neonatal, potencialmente, pueden influir en el comportamiento reproductivo de las crías adultas pero también hay evidencia de que los efectos se pueden ejercer en generaciones posteriores, sobre el crecimiento fetal (Lumey, 1992), la fertilidad (Lummaa y CluttonBrock, 2002) y el estado endocrino (Pollard, 1986), es decir la expresión de ciertos genes se pueden modificar no sólo en la generación F1, sino también en la F2 y las generaciones posteriores. Efectos nutricionales en la vida temprana pueden no producir necesariamente efectos perceptibles, pero pueden inducir efectos que se manifiestan en una etapa posterior de desarrollo y / o en la vida adulta. Por ejemplo, Rae et al. (2001) demostraron que las diferencias físicas en el desarrollo fetal del ovario a los 110 días de gestación, cuando las madres eran alimentadas correctamente, fueron inducidas por las restricciones nutricionales maternas aplicadas 3 meses antes. En ese momento, las estructuras ováricas no estaban presentes, por lo que no podrían haber sido directamente afectadas; por otro lado, los tejidos precursores fueron aparentemente susceptibles a las influencias nutricionales. En estudios paralelos, períodos más prolongados de niveles similares de subnutrición materna demostraron una asociación con la reducción de las tasas de ovulación en la descendencia (Rae et al., 2002). Del mismo modo, Gallaher y col. (1998) demostraron que la subnutrición periconcepcional se asocia con perfiles endocrinos alterados, específicamente el patrón de plasma fetal ovino en las concentraciones de IGF-1 y IGFBP-3, en posteriores etapas del desarrollo fetal, con consecuencias para el desarrollo de los órganos reproductivos. 3. MECANISMOS DE LOS EFECTOS NUTRICIONALES Las señales a través de las cuales las crías en desarrollo "leen" el estado nutricional de las madres son poco conocidas y se trata de una especulación en este momento, lo más probable es que muchas señales estén implicadas en diferentes etapas del desarrollo (Rhind et al., 2001, 2003). Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 16 Las señales fisiológicas supuestamente deben: • Estar directa o indirectamente relacionadas con el estado nutricional de la madre. • Ser capaces de alcanzar el órgano diana en las crías en desarrollo (esto puede significar que un factor relevante tiene que cruzar las membranas celulares, incluyendo la barrera sangre-cerebro o la placenta) • Ejercer un efecto, directamente o indirectamente (por ejemplo, a través de diferencias en el hipotálamo, la hipófisis o la función hepática fetal) en las gónadas fetales, modificar la expresión de uno o más de una amplia gama de genes candidatos. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 17 IV. OBJETIVOS Ya que la subnutrición periconcepcional en la especia ovina provoca tasas de fertilidad reducidas, debido, entre otras causas, a una disminución de la calidad de los ovocitos y de la supervivencia embrionaria (Abecia et al., 2006) y que además, se ha demostrado que dicha subnutrición provoca cambios en la vida adulta de las crías, tanto a nivel metabólico (McMillen y Robinson, 2005) como reproductivo (Rhind et al., 1989), los objetivos de este trabajo son: a) Estudiar el efecto de una subnutrición severa en los días previos y posteriores a la concepción sobre los parámetros reproductivos de las ovejas. b) Conocer el posible efecto de esta subnutrición sobre los rendimientos productivos y la calidad ovocitaria de los corderos nacidos. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 18 V. MATERIAL Y MÉTODOS 1. INSTALACIONES Se han realizado dos experimentos durante los meses de noviembre de 2012 a mayo de 2013 en el Servicio de Experimentación Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza (41ºN). Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por la Comisión Ética para la Experimentación animal de la Universidad de Zaragoza y el manejo de los animales estuvo de acuerdo a la normativa española de Protección de los Animales Utilizados para Experimentación y otros Fines Científicos (RD 1201/05), que a su vez sigue la Directiva 86/609 de la Unión Europea con el mismo nombre. 2. ANIMALES -Experimento 1: 80 ovejas adultas de raza Rasa Aragonesa, con un PV medio (±D.S.) inicial de 58,0 ± 0,6 kg y una CC media (±D.S.) (Russell et al., 1969) de 3,00 ± 0,02. -Experimento 2: 40 ovejas de la misma raza con un PV medio (±D.S.) de 66,0 ± 0,6 kg y una CC media (±D.S.) de 3,25 ± 0,02  Grupos experimentales de ovejas Según la alimentación recibida desde la colocación de las esponjas hasta el día 7 (experimento 1) ó el día 15 después de las cubriciones (DIA 0) (experimento 2), las ovejas se dividieron en 2 grupos experimentales con la mitad del número de animales en cada grupo: • Grupo Control (C, n= 40/ n=20): Fueron alimentadas para cubrir 1,5 veces sus necesidades de mantenimiento (1,5 M). • Grupo Bajo (B, n= 40/n=20): Fueron alimentadas para cubrir 0,5 veces sus necesidades de mantenimiento (0,5 M). Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 19 La dieta C consistió en 0,7 kg de pellets y 0,85 kg de paja de cebada por oveja y día, proporcionando 3,0 Mcal de EM y 12% de PB. La dieta B consistió en 0,25 kg de pellets y 0,30 kg de paja de cebada por oveja y día (1,0 Mcal de EM y 11,5% PB). La composición de los pellets fue cebada (65%), soja (30%) y suplemento mineral (5%). A partir del día 7 (exp. 1) ó del día 15 (exp. 2) las ovejas se reagruparon y fueron sometidas a la dieta 1,5 M hasta los partos. Se utilizaron 8 machos enteros de la misma raza que se mantuvieron separados hasta el momento de la cubrición, 36 horas después de retirar las esponjas. Seis corderas en cada experimento, hijas de las ovejas pertenecientes a ambos grupos nutricionales (3 por grupo) se sacrificaron a los 2 meses de vida, se extrajeron sus ovarios y sus ovocitos fueron recuperados, madurados y fertilizados. 3. ACTIVIDADES 3.1. Sincronización del celo Las ovejas fueron sincronizadas en celo mediante esponjas vaginales (Sincropart, CEVA Salud Animal, Barcelona), durante 14 días. A la retirada de las esponjas se administraron 300 UI de eCG.. Las cubriciones se iniciaron a partir de las 36 horas de la retirada de las esponjas. Visualmente se comprobó que todas las ovejas eran cubiertas al menos una vez.. Se tomaron los PV y CC de las ovejas en el momento de la colocación de las esponjas, a la retirada y a los 7 ó 15 días tras las cubriciones (exp 1 y 2, resp.). 3.2. - Diagnóstico de gestación Aproximadamente 40 días tras la introducción de los machos, se realizaron ecografías transrectales con el fin de diagnosticar las gestaciones. Las hembras que se diagnosticaron como negativas fueron nuevamente ecografiadas 2 semanas después para evitar posibles falsos negativos. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 20 El ecógrafo utilizado fue del tipo real-time B-mode scanner (Aloka SSD 500; Aloka Co., Tokyo, Japón), unido a una sonda transrrectal de 7,5 MHz. 3.3. Parámetros reproductivos Tras los partos se calcularon los porcentajes de fertilidad (número de ovejas paridas/número de ovejas del lote), la prolificidad (número de corderos/parto) y la fecundidad (número de corderos/oveja). También se calculó la duración de la gestación (días) y el ratio machos/hembras nacidos. 3.4. Pesaje de los corderos En el momento de las pariciones se tomaron los pesos de los corderos nacidos y su sexo; desde este momento fueron registrados los pesos semanalmente hasta el momento del destete, con 40 días de edad. Se calcularon los crecimientos medios desde el nacimiento hasta el destete. 3.5. Producción in vitro de embriones En ambos experimentos, a los 2 meses de edad, 6 corderas, hijas de ovejas pertenecientes a los dos grupos nutricionales (3 por grupo) fueron sacrificadas mediante un eutanásico (T-60, MSD) y sus ovarios extraídos con el fin de recoger sus ovocitos y fecundarlos in vitro. 3.5.1. Extracción de ovocitos Los ovarios se transportan al laboratorio en una solución de PBS a 30-35º C en el menor tiempo posible para proceder a la extracción de los ovocitos. Los medios de maduración, fecundación y cultivo embrionario son medios que utilizan sistema tampón basado en el bicarbonato (PBS), y por tanto precisan un tiempo de estabilización de 4 horas en la estufa de CO2 al 5%, que es donde tiene lugar la producción de los embriones. Cuando se sacan de la estufa para evaluar su desarrollo o cambiarlos de medio los pocillos son cubiertos con aceite mineral para evitar variaciones de pH. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 21 Antes de la ovulación, el ovocito inmaduro se encuentra en el interior de un folículo preovulatorio, rodeado de líquido folicular y células de la granulosa. Para extraer los ovocitos se debe romper este folículo y lo que se recupera es un ovocito inmaduro rodeado de un número variable de capas de células del cumulus. A este conjunto de ovocito y células del cumulus se le denomina complejo cumulus-oocito (COC). Existen diferentes técnicas para su extracción, en este caso se ha realizado la técnica de Slicing que consiste en colocar los ovarios en una placa de Petri cubiertos parcialmente con el medio de manejo, se sujetan con unas pinzas y se raya toda la superficie del ovario con una hoja de bisturí. Una vez extraídos, los COCs se clasifican en función de su morfología, ya que no todos son aptos para su maduración. En la especie ovina se habla generalmente de tres tipos de COCs, descritos por Wani et al. (2000), según su morfología y presencia de células del cumulus: 1. Buenos (good): COCs con tres o más capas compactas de células del cumulus y citoplasma homogéneo. 2. Normales (fair): COCs con una o dos capas de células del cumulus, o varias capas incompletas y citoplasma homogéneo. 3. Malos (poor): ovocitos con pocas o ninguna célula del cumulus. Se contabilizaron el número de ovocitos de cada clase encontrados. 3.5.2. Maduración Los COCs de los grupos 1 y 2 se seleccionan para su maduración. Estos ovocitos se encuentran detenidos en la profase de la primera división meiótica, por lo que es necesario que se produzca la maduración nuclear y citoplasmática para que el ovocito alcance la competencia y pueda ser fecundado. Para ello se añade compuestos necesarios para que los procesos que se dan en el folículo dominante tengan lugar en la placa de cultivo: • Medio base TMC-199: aporta nutrientes (sales, glucosa y otros azucares, vitaminas y aminoácidos). Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 22 • Suero de oveja en celo (ESS): A un 10% de concentración, se añade para incrementar el rendimiento del proceso. • Hormonas: FSH (5-10µg/ml) y LH (4-10µg/ml), indispensables para la correcta maduración. • Otros: Cisteamina (100 µM) un potente antioxidante que además promueve la maduración citoplasmática y mejora el posterior desarrollo embrionario incrementando el porcentaje de blastocitos obtenidos al final del cultivo. Piruvato sódico (0,3mM), los ovocitos lo utilizan como principal fuente de energía. Estos compuestos añadidos al medio permiten la reanudación de la meiosis y la maduración citoplasmática. Tras la reanudación de la meiosis se produce la extrusión del primer corpúsculo polar entre 16 y 24 horas tras el comienzo de la maduración. La presencia de este corpúsculo polar es la señal de que el ovocito ha madurado y está listo para su fecundación. De los COCs buenos y normales que se pusieron en el medio de maduración, se contabilizaron el número de ellos que llegan a madurar. 3.5.3. Fecundación Los ovocitos que han alcanzado la metafase II ya están listos para la fecundación. Se simula la ovulación liberando los ovocitos maduros de las células del cumulus mediante un suave pipeteo y traspasándolos a un medio de fecundación similar al que se encuentra en los oviductos, donde se cocultivarán con los espermatozoides. Estos espermatozoides hay que seleccionarlos y capacitarlos antes de introducirlos al medio. La selección de los espermatozoides tiene dos objetivos: por un lado, seleccionan los espermatozoides vivos, con su membrana intacta y una buena motilidad; por otro lado, los espermatozoides se separan del plasma seminal, ya que contiene proteínas que inhiben la capacitación y se resuspenden en un medio de cultivo rico en compuestos capacitantes. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 23 Utilizamos el método de swim-up para la selección espermática que consiste en colocar el semen ovino en el fondo de un tubo y cubrirlo con un medio de cultivo de fecundación sin que se mezclen las fases. Tras una incubación de entre 25 minutos y 1 hora, los espermatozoides con buena motilidad progresiva habrán ascendido a la fase superior, lo que permite recoger una muestra con elevada calidad y motilidad para realizar la fecundación in vitro. Una vez seleccionados los espermatozoides, la fecundación se realiza mediante la coincubación de los gametos en el medio de fecundación. Utilizamos el medio TCM199 que además de nutrientes contiene una serie de iones como el bicarbonato, el calcio o el sodio que intervienen en los procesos de capacitación. Además, para facilitar el proceso a estos medios añadimos una serie de sustancias: • Suero de oveja en celo (10%): Mantiene la viabilidad espermática y aumenta la salida de colesterol de las membranas, lo que favorece el inicio de la capacitación. • Heparina (1,5-50 UI): Promueve la capacitación. • Hipotaurina (10µM): Agente protector frente a la peroxidación. • Lactato de calcio (2,9 mM): Indispensable para la capacitación. Una vez que se ha producido la capacitación, los espermatozoides son capaces de unirse a la zona pelúcida del ovocito y posteriormente se produce la reacción acrosómica. Esta reacción permite al espermatozoide atravesar la zona pelúcida. Una vez que alcanza el espacio perivitelino del ovocito, se fusiona con la membrana plasmática de éste y se produce la fecundación. El conjunto de estos procesos se lleva a cabo durante un periodo de tiempo de varias horas. Partiendo de los ovocitos que han madurado previamente, se contabilizaron el número de ellos que fueron fecundados. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 24 3.5.4 Cultivo de embriones Tras la fusión de ambos pronúcleos, el zigoto sufre una serie de divisiones mitóticas. La primera división ocurre a 22-36 horas tras la fecundación, da lugar a un embrión de 2 células. La siguiente división ocurre pocas horas después. En este proceso se contabilizaron después de 48 horas de la fecundación los que llegaron a dividirse. Posteriormente, los que han llegado a blastocisto respecto a los embriones ya divididos y respecto a los ovocitos aptos para la maduración. 3.6. Análisis estadístico Se utilizó la prueba Chi cuadrado para la comparación de porcentajes y el ANOVA para las variables continuas. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 31 VII. DISCUSIÓN En este trabajo se han realizado dos experimentos: el experimento 1, sometiendo a las ovejas a una subnutrición 16 días antes de la cubrición hasta 7 días después de la aparición del celo, y el experimento 2, subnutrición 16 días antes de la cubrición hasta 15 días después de la aparición del celo. Ambos experimentos fueron llevados a cabo bajo la misma metodología, variando únicamente el periodo de subnutrición. Los resultados obtenidos del estudio de la población oocitaria de las corderas nacidas han sido, al menos, inesperados y de difícil discusión, al no haber mucha literatura sobre el tema. Del mismo modo, al menos sorprendentes son los superiores pesos al nacimiento mostrados por los corderos procedentes de ovejas subnutridas en el momento de la concepción de dichos corderos. En ambos experimentos las ovejas control mantuvieron su PV y su CC a lo largo del experiencia, mientras que el lote bajo experimentó una pérdida significativa tanto del PV como de la CC. En cuanto a los resultados reproductivos son inferiores en el lote B en ambos experimentos, especialmente en el experimento 1. En éste se observaron diferencias significativas en la prolificidad y fecundidad, y en el experimento 2 hubo una tendencia (p= 0,10) para la fertilidad y la fecundidad. Estos resultados son coincidentes con los descritos en la bibliografía y revisados por nuestro grupo (Abecia et al., 2006), y pueden deberse tanto a un efecto negativo de la subnutrición sobre la tasa de ovulación y la supervivencia embrionaria, dando lugar a un descenso en el número de ovejas paridas y en el número de corderos nacidos por parto. Respecto a los parámetros productivos, en ambos experimentos se observó un aumento del peso medio al nacimiento de los corderos procedentes de ovejas subnutridas en el momento de la concepción, siendo significativo en el experimento 1, hecho que se inicialmente podría explicar debido a la mayor prolificidad del lote control. Es decir, al haber mayor número partos múltiples en el lote C, el peso medio podría ser menor que en el lote B, donde hay una mayor cantidad de partos sencillos, que habitualmente dan corderos al nacimiento con pesos superiores. Sin embargo este hecho no pudo ser Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 32 constatado. En el experimento 2 también se observó un peso medio al nacimiento superior, rozando la significación (p=0,10), y el peso de hembras (p=0,16) mientras que el de machos es muy similar, esto podría deberse a que hay mayor número de hembras aunque la relación machos/hembras no fue significativa. Estos resultados coinciden con los observados por Jaquiery et al. (2012), que muestran un mayor PV al nacimiento especialmente en machos procedentes de ovejas subnutridas en el momento de la concepción explicándose por diferencias significativas en el porcentaje de grasa corporal encontrado en estos animales. En ambos experimentos no hubo diferencias en el peso al destete ni en el crecimiento medio diario hasta ese momento, hecho también coincidente con lo relatado por Jaquiery et al. (2012). En cuanto a la población oocitaria de las corderas hijas de ambos grupos también encontramos diferencias comparando los dos experimentos. En ambos experimentos las corderas hijas del lote B presentaron un mayor número de ovocitos a los dos meses de vida. Aunque en el experimento 1 no hubo diferencias en cuanto a los porcentajes de calidad, en el experimento 2 sí que las hubo, siendo mayores en el lote B. La dieta materna previa a la concepción puede afectar a la calidad del ovocito, como ha sido descrito previamente (Adamiak et al., 2005, Camboine et al., 2007, Hunter et al., 2005). Este efecto sobre los ovocitos afecta a la calidad del embrión y potencialmente al desarrollo del feto y la salud del adulto, lo que plantea la posibilidad de efectos en ovocitos en la próxima generación. Se ha descrito que una restricción alimentaria de la oveja al principio y hasta mediada la gestación produce un descenso en la tasa de ovulación de la descendencia femenina (Rae et al., 2002). Este hecho puede iniciarse ya in utero, ya que se ha demostrado que una restricción al 50% de los nutrientes, como la que hemos realizado en nuestros experimentos, aumenta la proporción de lesiones oxidativas a nivel del DNA de las oogonias recuperadas de fetos de corderas a mitad de su gestación, en comparación con fetos gestados por ovejas alimentadas según necesidades (Murdoch et al., 2006). Una vez madurados y fertilizados in vitro estos ovocitos, también se observaron diferencias entre experimentos: en el experimento 1 hubo un mayor porcentaje de ovocitos madurados en el grupo B, mientras que en el experimento 2 fue al contrario, dándose un mayor porcentaje de madurados en el grupo C, habiendo además un mayor porcentaje de ovocitos que llegan a la división a las 48 horas. Así, aumentar el periodo Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 33 de subnutrición incrementa el número de ovocitos para madurar en el grupo B pero en porcentaje maduran menos que en el grupo C. Master en iniciación a la investigación en Ciencias Veterinarias 34 VIII CONCLUSIONES 1. Un nivel de subnutrición del 50% alrededor de la concepción en la especie ovina tiene consecuencias negativas sobre el rendimiento reproductivo, viéndose afectados parámetros como la fertilidad, la prolificidad y la fecundidad. 2. Los corderos nacidos de ovejas subnutridas alrededor de la concepción presentan un mayor peso vivo al nacimiento, sin diferencias por sexos. 3. Las corderas nacidas de ovejas subnutridas alrededor de su concepción presentan una alteración en la cantidad de ovocitos recuperados, siendo su número superior en comparación con las corderas hijas de madres control. 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