Repositorio Institucional de Documentos

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA UNIVERSITAT DE LLEIDA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR ENGINYERIA AGRÒNOMA TRABAJO FIN DE MASTER Síntesis de proteína microbiana en el rumen en terneras de cebo: Comparación de dos marcadores (Bases Púricas vs15N) Alumno: Jesús Mora Gil Tutor: Joaquim Balcells Terés Cotutor: Manuel Fondevila Camps Agradecimientos Gracias a todos los que me han prestado su ayuda y apoyo, a los que menciono y a los que no, porque gracias a ellos este Trabajo fin de Master se ha hecho realidad. En primer lugar agradecer al Profesor Joaquim Balcells Teres, del Departament de Producció Animal y a la vez tutor de este trabajo por todas sus explicaciones, sugerencias y confianza en este Trabajo. No menos importante el profesor Daniel Villalba Mata, por su ayuda, especialmente en el trabajo en granja así como el análisis estadístico. Gracias también a Manuel Fondevila, co-tutor del Trabajo por sus consejos e información aportada. A la empresa “Can Sargaire” por la predisposición e ilusión en este proyecto, ofreciendo su granja. A los trabajadores del laboratorio de Nutrició Animal de la Universidad de Lleida, en especial a Anna Ñaco y Dolors Cubiló, por tener paciencia en enseñarme y colaborar cuando faltaban horas. A Xavier Cortès y Pilar Oliva, por el trabajo en granja y en laboratorio. Y finalmente y no por eso menos importante amigos y familia, a mis padres Enric y Carme y mi hermana Meritxell. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL .............................. 1 2. OBJETIVOS.............................................................................................................. 4 3. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA ................................................................................ 6 3.1 El animal rumiante y sus microbios ........................................................................ 7 3.1.1 Bacterias ........................................................................................................... 8 3.1.2 Protozoos ...................................................................................................... 111 3.1.3 Hongos ......................................................................................................... 112 3.2 Cuantificación de la producción de proteína microbiana en el rumen................. 13 3.2.1 Muestreo de la digesta .................................................................................... 13 4. MATERIAL Y METODOS .................................................................................... 19 4.1Animales e instalaciones ........................................................................................ 20 4.2 Alimentos y diseño experimental ......................................................................... 21 4.3 Preparación y administración de los marcadores de flux .................................... 23 4.3.1 Lignina Sulfurico............................................................................................ 24 4.3.2 Iterbio Acetato (Yb-Ac ) ................................................................................ 24 4.4 Preparación y administración de los marcador microbiano .................................. 24 4.5 Procedimiento de muestreo y conservación de las muestras ................................ 26 4.5.1 Alimento ......................................................................................................... 26 4.5.2 Heces .............................................................................................................. 26 4.5.3 Contenido digestivo........................................................................................ 26 4.6 Métodos analíticos ................................................................................................ 27 4.6.1 Principios inmediatos ..................................................................................... 27 4.6.2 Metabolitos ruminales .................................................................................... 27 4.6.3 Iterbio y lignina sulfúrico .............................................................................. 27 4.6.4 Bases púricas .................................................................................................. 28 4.7 Cálculos y análisis estadísticos ............................................................................. 28 4.7.1 Flujos digestivos ............................................................................................. 28 4.7.2 Digestibilidad aparente .................................................................................. 28 4.7.3 Ingestión Voluntaria ....................................................................................... 28 4.7.4 Contribución Microbiana a la digesta duodenal ............................................. 29 4.7.5 Bases Púricas ................................................................................................. 29 4.7.6 Análisis Estadísticos ....................................................................................... 29 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................. 30 6. CONCLUSIONS ..................................................................................................... 43 7. BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................... 45 Índice de Tablas Tabla 1.Bactèrias del rumen.............................................................................................8 Tabla 2.Protozoos del rumen y sustrato asociado............................................................12 Tabla 3.Ingredientes y composición de nutrientes de las raciones..................................23 Tabla 4.Paràmetros productivos......................................................................................32 Tabla 5.Ingestión diaria y digestibilidad.........................................................................34 Tabla 6.Paràmetros ruminales.........................................................................................36 Tabla 7.Proteina microbiana en el abomaso....................................................................38 Tabla 8.N ingerido y flujo abomasal de N, total o microbiano.......................................40 Índice de Figuras Figura 1: Plano de la nave...............................................................................................21 Figura 2: Aspecto del pienso y el RCM..........................................................................22 Figura 3. Protocolo temporal de preparación de alimento...............................................24 Figura 4: Administración de marcadores.........................................................................25 Abreviaturas BP: Bases Púricas PP: Ración pienso y paja RCM: Ración completa mezclada con una forrajera “unifeed” PV: Peso Vivo MS: Materia Seca MO: Materia Orgánica PB: Proteína Bruta EE: Extracto Eterio FB: Fibra Bruta FND: Fibra Neutro Detergente FAD: Fibra Ácido Detergente AA: Aminoácido CMD: Crecimiento medio diario MODI: Materia Orgánica Digerible Ingerible MSI: Materia Seca Ingerida BAL: Bacterias Asociadas a la fase Líquida BAS: Bacterias Asociadas a la fase Sólida 1 1. INTRODUCCIÓN Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL 2 Los animales rumiantes tienen la capacidad de aprovechar recursos alimenticios abundantes como lo son los forrajes y otros alimentos ricos en carbohidratos estructurales a los cuales el sistema enzimático de los animales superiores no les permite acceder. No obstante estas especies han desarrollado un sistema de compartimientos de fermentación en los cuales se dan las condiciones optimas para facilitar el crecimiento de las poblaciones microbianas simbióticas (bacterias, hongos y protozoos) que si son capaces de utilizar-los. Dichas poblaciones fermentan los carbohidratos estructurales (Hemicelulosa, celulosa y pectinas) y producen como producto final de la fermentación (productos de excreción) ácidos grasos volátiles (AGV) que constituyen la principal fuente de energía para las especies rumiantes. De forma colateral, en este proceso de fermentación, la proteína es fermentada también a péptidos, aminoácidos y finalmente a amoniaco que constituye a su vez la fuente de N fundamental para el crecimiento de la micro biota ruminal. La masa microbiana que se produce en el rumen, como excedente de este proceso de fermentación, constituye la principal fuente de aminoácidos absorbida por los rumiantes. Así en cualquier tipo de ración la proteína microbiana sintetizada en el rumen constituye más del 50 % de la proteína absorbida en el intestino delgado. A pesar de la importancia que ello supone la proteína microbiana es cuantificada con escasa precisión (Webster, 1996) y ello es así dada la complejidad y escasa precisión de la metodología utilizada. Por ello los resultados se caracterizan por una elevada variabilidad. Para la cuantificación del N de origen microbiano se precisa de una muestra digestiva post-ruminal (abomaso o duodeno) para determinar la proporción de proteína microbiana en el quimo. Este muestreo se puede realizar a partir de diferentes tipos de cánulas o post-mortem. Si se pretende además cuantificar el flujo total de proteína microbiana es necesario utilizar marcadores de flujo que permiten reconstruir el flujo total a partir de unas muestras parciales del quimo. En el primer 9 Streptococus bovis Utilizanlípidos Anaerovibrio lipolytica Succionomas amylololytica Butyrivibrio fibrisolvens Prevotella ruminicola Treponema bryantii Utilizanazucares Treponema bryantii Eubacterium spp. Lactobacillus ruminus Fusocillus spp Lactobacillus vitulinus Micrococcus spp. Utilizanácidos Megaspharea elsdenii Productoras de CH4 Methanobrevibacter ruminatium Selenomonas ruminantium Metanobacteriu formicicus Methanomicrobium mobile 3.1.1.1 Bacterias Celulíticas: Son aquellas responsables de la degradación de los carbohidratos estructurales que constituyen de la pared celular y dentro de este grupo, algunas especies se especializado en la fermentación de la celulosa: Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens (Dehority, 1993), o de la hemicelulosa: Butyrivibrio fibrisolvens, Prevotella ruminicola y Ruminococcus spp (Fondevila & Dehority, 1994). Este tipo de especies muestran una mayor especialización sobre el sustrato que las bacterias que fermentan carbohidratos solubles. Se estima que a pH inferiores de 6 se reduce el crecimiento de las bacterias celulíticas y resulta ser 0 a pH ≤ 5.6. Por tanto, dietas elevadas en carbohidratos no estructurales, provocan un descenso de pH y reducen el nivel y la eficiencia de fermentación de la fibra. 10 Las bacterias celulíticas son mayoritarias en dietas con altos % en carbohidratos estructurales y sus enzimas, las celulasas permiten la degradación de la fibra en disacáridos y componentes más simples (Yokoyama & Johnson, 1988). Estas poblaciones tienen capacidad y preferencia por el amoníaco como fuente de N y las cadenas de carbohidratos ramificados, procedentes de la des-aminación de ciertos aminoácidos, actúan como factores de crecimiento. 3.1.1.2 Bacterias amilolíticas Las bacterias amilolíticas tienen la capacidad de producir α-amilasa, enzimas extracelulares capaces de degradar el almidón (Yokohama & Johnson, 1988).Los títulos de estas bacterias incrementan en raciones con altos porcentajes de almidón, raciones ricas en granos de cereal es y el tipo de fermentación será más resistente a cambios bruscos de pH. La concentración de especies amilolíticas es mayor que las celulíticas (Orskov & Ryle, 1998) y se asocian con producciones elevadas de ácido láctico, ya sea porque son sus productoras o porque limitan a su absorción. 3.1.1.3 Bacterias Proteolíticas La gran mayoría de especies bacterianas tienen actividad proteolítica aunque se considera que dicha actividad es predominante en: Prevotella ruminicola, Butyrivbrio y Ruminobacter amylophylus. Estas bacterias utilizan péptidos y aminoácidos que son degradados y desaminados hasta ácidos carboxílicos y amoníaco. Finalmente este amoníaco se utiliza para la síntesis proteica con una alta eficiencia (mayor de 0.7; ARC, 1984). La actividad proteolítica es dependiente de la pared bacteriana y la mayoría de proteasas son peri-plasmàticas. Es necesario el contacto físico entre ambos enzima y sustrato y un 75% de la actividad depende de la microbiota adherida al sustrato. 3.1.1.4 Bacterias metànogenicas Son las bacterias capaces de producir metano, pertenecen al grupo Archaebacterias (Stewart et al., 1980) y su función consiste en unir hidrogenions H2+con CO2, con un coste energético energía. A pesar del coste que supone este proceso, permite el mantenimiento de otros microorganismos y/o actividades como la fermentación de la celulosa al controlar el potencial redox y el pH del medio. 11 Las especies mejor adaptadas a las condiciones ruminales són las siguientes: Methanosarcina, Methanomicrobium, Methanobrevibacter, Methanobacterium. 3.1.2 Protozoos Los protozoos son inferiores en número a las bacterias, entre 105 y 106 células/ml, pero por su dimensión pueden representar más del 40% de la masa microbiana total del rumen (Orpin, 1984) La mayoría de los protozoos del rumen son anaerobios estrictos y básicamente constituyen dos grupos taxonómicos: Holòtroficos del orden Trichostomatia y Entodinomorfs del orden Entodiniomorphida. Los Trichostomatia, metabólicamente, utilizan principalmente carbohidratos solubles, y por tanto, aumentaran su número en dietas como las utilizados en el cebo intensivo de terneros (Jouany, 1989).Por contra los protozoos Entodiniomorphida se multiplican en un ambiente propio de una alimentación rica en forrajes (Orpin, 1984). Los protozoos tienen actividad proteolítica, aminopectidasa y desaminasa. Esta actividad puede triplicar la actividad proteolítica de las bacterias. No tienen capacidad ureasa y no pueden usar el N amoniacal para la formación de proteína propia. Los protozoos participan en la degradación de los carbohidratos estructurales, favoreciendo la acción de las bacterias sobre estos sustratos (Orpin, 1984). Al tener capacidad de captar y secuestrar carbohidratos solubles, los protozoos evitan o tamponan cambios bruscos de pH y por tanto mantienen la actividad de la microbiota celulítica. Hay raciones tan ricas en carbohidratos no estructurales (concentrados) que pueden provocar una disminución brusca del pH provocando la defaunación del medio y limitando las acciones tamponadoras de los ciliados en el medio. Los protozoos pueden aportar un 20-29% de proteína microbiana al flujo intestinal. 12 Tabla 2. Protozoos del rumen y sustrato asociados. (Van Soest, 1994) Género Especie Sustrato Holótroficos Isotricha Almidón y azucares Dasytricha Almidón y azucares Entodinomorfos Entodinia Almidón Epidinium Almidón y hemicel·lulosa Ophryoscolex Almidón Diplodinium Eudiplodinium Polyplastron 3.1.3 Hongos Los hongos fueron descubiertos en el sistema digestivo por Orpin (1975) y posteriormente se clasificaron los géneros más característicos: Neocallimastrix, Caecomyces, Pyromyces, Orpinomyces, (Van Soest, 1994). Todos estos hongos son anaerobios asociados a la fase solida del contenido ruminal y esta situación les permite sobrevivir a pesar de su baja tasa de regeneración. Pueden llegar a representar hasta un 85% de la población ruminal y tienen la capacidad de fermentar tanto los carbohidratos estructurales como los no estructurales Participan activamente en la digestión de las paredes celulares y las zoosporas son atraídas por quimiotaxis hacia las zonas lignificadas, desarrollando una red filosa que penetra en las paredes ligno-celulòsicas, rompiendo así las estructuras lignificadas y favoreciendo la posterior actuación de las enzimas bacterianas (Van Soest, 1994). Podemos resumir a pesar de no ser imprescindibles para el funcionamiento del rumen, sí facilitan la degradación de las estructuras 13 lignificadas y actuar en las enzimas bacterianas. Algunas especies de hongos son capaces de degradar el almidón por efecto de la α-amilasa. La población ruminal de hongos también contribuye en la degradación de la proteína, a pesar de que su grado de fermentación es menor que el de las bacterias. Como excepción con otras poblaciones, los hongos se adaptan a los cambios bruscos del tipo de carbohidratos y a las variaciones de pH. En vacuno lechero variaciones de un 80% de concentrado a un 100% de forraje no se reflejaron en la población fúngica. 3.2 Cuantificación de la producción de proteína microbiana en el rumen La proteína microbiana sintetizada en el rumen constituye una fracción importante del total de aminoácidos absorbidos en el duodeno, siendo siempre el componente mayoritario o incluso alcanzando la totalidad de la proteína absorbida (AFRC, 1992). Su cuantificación está condicionada por diferentes factores limitantes que pasaremos a describir a continuación. 3.2.1 Muestreo de quimo duodenal 3.2.1.1 Cánulas: Esta es la forma más común para obtener muestras de muestrear el contenido digestivo y se trata, básicamente, de un sistema tubular mediante el cual nos permite muestrear el contenido digestivo. Distinguimos diversos tipos de cánulas, las cánulas de re-entrada que permiten la recolección de toda la digesta y por tanto su cuantificación y muestreo directo. El inconveniente de este sistema de canulación es su implantación quirúrgica, que provoca interferencias físicas sobre el peristaltismo o por afectación indirecta del sistema nervioso, a parte, también genera espacios muertos en los cuales el quimo alimentario no circula o lo hace de forma deficiente, lo que provoca que aumenten los tiempos de retención. 14 La alternativa son las cánulas tipo “T” o simples que dejan un orificio permanente en el animal y que permiten recoger muestras puntuales de la digesta post-ruminal, normalmente se sitúan entre el abomaso y el duodeno, son menos agresivas con el animal, pero su uso está ligado con la utilización de marcadores de flujo para reconstruir el flujo total a partir de muestras puntuales. Tanto en el caso de cánulas de reentrada como con las cánulas simples tipo “T” la implantación quirúrgica limita el número de animales experimentales. 3.2.1.2 Sacrificio. La obtención de muestras detrás el sacrificio del animal permite muestrear el contenido digestivo (u obtener la totalidad del contenido, i.e. abomaso) a diferentes niveles de forma simultánea, es una prueba simple, económica y se puede usar un número amplio de animales. 3.2.2 Marcadores de Flujo Los marcadores de flujo digestivo permiten reconstruir, a partir de muestras puntuales la totalidad del flujo en un espacio de tiempo (día/hora/minuto) que ha pasado por un tramo concreto (duodeno, abomaso). Se trabaja con sustancias que tengan características específicas, la primera es que sean indigestibles y no se puedan absorber en el tracto digestivo, así que, la cantidad subministrada ha de coincidir con la excretada o la que pasa (por unidad de tiempo) por un tramo concreto. Los marcadores además tienen que ser inertes, no deben alterar las enzimas digestivas ni reaccionar con el resto de componentes de la digesta. Por último cabe considerar que sea una sustancia de determinación simple y que su procedimiento analítico esté perfectamente definido. Una sustancia que cumpla íntegramente todas estas características no existe y en la existente podemos encontrar descritas ventajas y desventajas de cada sustancia utilizada como marcador de flujo. (De Vega, 1991). 15 3.2.2.1 Marcadores únicos Utilizar un marcador único ha sido el proceso más común y se han utilizado sustancias de diferente naturaleza, bolas de vidrio o plásticos en sus inicios, tintes etc. No obstante, las sustancias más utilizadas son aquellas cuya cinética sea similar a la de la digesta. Entre estas sustancias y por su importancia cabe destacar el Cr2O3, el procedimiento se basa en subministrar el marcador un tiempo suficiente, previo al muestreo (que variará en función de la especie) 48-72 h en animales mono gástricos (i.e cerdos, aves) mientras que alcanzar el equilibrio marcador-digesta en rumiantes se alargará hasta periodos de 7-10 días. Si asumimos que el marcador indigestible se encuentra en equilibrio en el tracto digestivo entonces la ingestión de marcador (I) ha de ser igual a su excreción (E) : I = E o: I (g/día) = Flujo [en un tramo] x Concentración del marcador en ese tramo. Y por tanto el flujo conociendo, i) la concentración en las muestras y ii) la ingestión diaria de marcador, puede ser estimado: (Beever et.al, 1978). Flujo (g/día) = I/ ([c] marcador en el tramo). En marcadores de este tipo, (Cr2O3)se ha demostrado que puede haber recuperaciones incompletas del marcador relacionadas, bien con acumulaciones en ciertos tramos del digestivo, o bien con una sub/sobreestimación en el proceso analítico de cuantificación en el alimento o en el contenido digestivo. El óxido de cromo es una marcador de fase única, no obstante sabemos que el contenido digestivo puede fluir en formas más diversas constituyendo diferentes fases “cinéticas”. En este sentido seria impracticable utilizar un marcador para cada una de las fases teóricas para que reflejase mejor su comportamiento cinético, por ello se ha llegado a un compromiso entre precisión y aplicabilidad con un sistema de doble marcado. Considerando con ello que existen dos fases mayoritarias, una sólida o particulada y la otra líquida. En este caso de debe usar un marcador para cada fase. Dentro del primer grupo podemos citar el óxido de cromo, acetato de Iterbio y de Europio. Mientras que en el segundo grupo como marcadores de fase líquida distinguimos el Cromo o el cobalto-EDTA como principales marcadores. 16 3.2.3 Marcadores microbianos Una vez se ha podido muestrear el quimo en el tracto duodeno-abomasal, el siguiente paso, que caracteriza este procedimiento, es diferenciar la proteína de origen microbiano de la que no lo es. La parte no microbiana está compuesta a la vez por la proteína dietética que ha sido capaz de pasar ilesa la fermentación del rumen y una fracción endógena constituida fundamentalmente por células de descamación del rumen y restos de las enzimas digestivos. Por tanto, una sustancia que pueda ser considerada y definida como marcador microbiano ha de estar ausente en ambas fracciones, la dietética y la endógena. En este sentido cabe destacar que, mientras en el quimo duodenal hay gran cantidad de residuos endógenos, estos residuos son prácticamente ausentes cuando la cánula se sitúa a nivel del abomaso. Las sustancias que puedan ser consideradas como marcadores microbiano han de ser, además, biológicamente estables, innocuas, tener una distribución homogénea y ser de fácil determinación analítica. Una vez más, como sucedía con los marcadores de flujo se debe remarcar que no ha sido descrito ningún marcador que cumpla a la perfección todas las definiciones. Finalmente podemos distinguir dos tipos de sustancias marcadores de la población microbiana, aquellas que naturalmente forman parte de las células microbianas, como es el caso del ácido Di-amino-pimélico (DAPA), y que se clasifican como marcadores internos o naturales y aquellas de origen isotópico. 3.2.3.1 Marcadores Internos a) Bases púricas: La elevada concentración de ácidos nucleicos (AN) en las células microbianas y la rápida degradación de los AN de origen dietético en el rumen posibilitan usar estos compuestos como marcadores microbianos. Inicialmente las determinaciones se realizaban sobre el total de ácidos nucleicos (McAllan &Smith, 1973), posteriormente solo ARN y últimamente sobre las bases puricas (BP: adenina y guanina, Martin-Orue et al 1986). 17 La gran ventaja de los AN como marcadores microbianos es su distribución homogénea entre todas las poblaciones microbianas, no obstante cuando los valores derivados de estas sustancias (las BP) se comparan contra aquellos valores obtenidos con otros marcadores (Pérez et al., 1997) parece que existe una cierta sobreestimación, que se explica con la presencia de AN capaces de pasar ilesos la fermentación en el rumen. No siempre este proceso ha sido demostrado (Mota et al., 2008) y no existe la certeza de cuál es el valor real (cuando comparamos los valores derivados de dos marcadores) ya que no hay un valor de referencia suficientemente valido. Un aspecto crítico del uso de las BP como marcador microbiano es la variabilidad de la composición (BP o la relación BP/N) que se han descrito dentro de las poblaciones extraídas del rumen (Martín-Orue et al 1986), la relación de BP/N en las bacterias aisladas de la fracción sólida (BAS) puede ser la mitad que la obtenida en aquellas aisladas en la fracción líquida (BAL Martín-Orúe et al.,1997) y similar a la aislada a partir las de los extractos protozoarios (Robinson, 1996; Vicente et al.,2004) El ritmo de crecimiento, el tipo de sustrato, el plano de alimentación, el momento del muestreo son factores que pueden afectar también la relación de BP/N de las poblaciones microbianas. 3.2.3.2 Isotópicos o externos La utilización de estas sustancias como marcadores microbianos se basa en su administración en forma inorgánica, de forma que el isótopo puede ser incorporado en las estructures proteicas microbianas y así poder diferenciarlas de aquellas estructures dietéticas o endógenas, que por ser inertes no pueden realizar este proceso de incorporación. Podemos diferenciar entre isótopos radioactivos, como el 35S y el 32P, y aquellos no radioactivos o fríos como lo es el 15N.La relación entre la actividad radioactiva (35S, 32P) o el enriquecimiento (15N) determinada en los microorganismos y el quimo nos permite cuantificar la contribución de la proteína microbiana (marcada) a la total del quimo. Sólo cuando el isotopo se haya equilibrado en los compartimientos microbianos del rumen [48-96 h Pérez et al., (1996), ello implica que se ha incorporado de forma homogénea todas las poblaciones microbianas], podemos proceder al procedimiento de cuantificación. Normalmente los isotópicos son considerados los 18 marcadores de referencia. Por contra son extremadamente caros tanto en lo que refiere a su compra como en su utilización y análisis. El 15N es un isotopo es estable y por tanto no es necesario el uso de instalaciones o personal especializado. Es el más práctico en el ámbito de la alimentación, ya que, al encontrarlo en forma de diferentes sales amonio [(15NH42SO4)] o cloruro [(15NH42Cl)] se puede distribuir junto al alimento o por infusión ruminal. Su escasa presencia en condiciones naturales (0,3663%, AIEA) facilita su utilización como marcador microbiano, y se encuentra validado y referenciado en la en la bibliografía existente (Carro & Miller, 1999; Vicente et al, 2004; Mota et al, 2005; Belanche et.al, 2008). Las ventajas y desventajas son las que le corresponden como isotopo y ya han sido comentadas anteriormente. 25 es la proporción de átomos de N que poseen un neutrón más, ello permite distinguir-lo analíticamente siendo totalmente inocuo. El isotopo fue administrado en forma de cloruro de amonio (15NH4Cl) con un enriquecimiento del 10% a una dosis experimental de 2 mg 15N/g N ingerido (Perez et al. 1986). El cloruro de amonio se administro mezclado con con el alimento siguiendo el siguente protocolo, La dosis calculada se mezcló inicialmente (en el laboratorio con 1 kg de alimento, PP o RCM) posteriormente en granja la pre-mezcla se volvió a mezclar con 30 kg de materia fresca del alimento previo a su suministro. El isotopo se administró cinco días (120 h) previos al sacrificio. Para ello se considero que 72 h son suficientes para que el isotopo se equilibrase en el “pool” microbiano de N ruminal (Perez et al. 1986, comprobar). El nivel de enriquecimiento natural (background) se determinó en 2 de las terneras, (1/lote), escogidas al azar que no habían tenido contacto con el isotopo. El protocolo de administración de los diferentes marcadores se presenta esquematizado en la figura 4, al final de la prueba experimental de los días 110 a 120 de la prueba (d110d120). Adaptación del animal a los marcadores externos Recogida de heces Figura 4: Administración de marcadores y muestreos correspondientes al final del período experimental 1 1 1 1 1 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Día Yb Yb Yb Yb/N15 Yb Yb/N15 Yb/N15 Yb/N15 Yb/N15 Yb/N15 Recogida heces Recogida heces Recogida heces Recogida heces Recogida heces Recogida heces 26 4.5 Procedimiento de muestreo y conservación de las muestras 4.5.1 Alimento Durante la administración del marcador (d110-d120) se recogió durante su elaboración una muestra de RCM y una muestra de pienso. La paja se muestreó una vez a la semana cuando se renovó la bala (400 kg). Las muestras se identificaron y almacenaron en bolsas de plástico a -20ºC para su posterior análisis. 4.5.2 Heces Cuatro días antes del sacrificio (d116-d120, Figura 4) se recogieron muestras de heces de los animales correspondientes al estudio de cinética de marcadores. El muestreo se realizaba en el mismo momento de la administración del Yb por el método de estimulación rectal y para evitar contaminaciones se almacenaban (-20º C).en recipientes de plástico estériles de 50 ml. 4.5.3 Contenido digestivo Al final del ensayo (d120), fueron transportados (7:00 h, por lotes experimentales) al matadero (INDELE S.A. Alcoletge, Segrià Lleida) donde fueron sacrificados (10.30 h) sin haber sido sometidos a ayuno previo y así optimizar la representatividad del muestreo digestivo. El protocolo de sacrificio fue el convencional (bala captiva) y en la cadena de despiece los aparato digestivo fueron etiquetados, seccionados y separados de la canal (20 minutos tres el sacrificio) para proceder en la sala de vísceras al muestreo del rumem (parcial) y abomaso (total). 4.5.3.1 Digesta abomasal Tras identificar el aparato digestivo, se disecó el abomaso y se muestreó su contenido por vaciado del órgano. Las muestras se refrigeraron inmediatamente (0ºC) en el matadero y llevadas al laboratorio para congelar (-20ºC) y liofilizar-las posteriormente. 4.5.3.2 Digesta ruminal Tras del muestreo abomasal se procedió al rumen. Tras la apertura del compartimento se procedió a homogeneizar el contenido dentro de la propia víscera. Una vez homogeneizado el contenido se extrajo (500 ml) contenido ruminal que fue rápidamente refrigerado in-situ (0º) y transportadas al laboratorio para su muestreo y 27 extracción de bacterias ruminales. A la entrada al laboratorio el líquido ruminal fue muestreado, obteniéndose sendas muestras para el análisis de amoniaco (NH3) y ácidos grados volátiles (AGV). En el primer caso, dos ml de contenido ruminal se acidificaron con 2 mL de 0.2 N HCl, y se congeló (-20 ºC) hasta su análisis. Las muestras para analítica de AGV, 2 mL de contenido ruminal, fueron mezclados con 1 mL de una solución conservante que contenía cloruro de mercurio (2 g/L), ácido ortofosfórico (20 ml/l ) y ácido 4-metilvalerico (2 g/l, utilizado como patrón interno) en agua destilada. El resto de contenido ruminal fue filtrado a través de una doble capa de gasa quirúrgica, el filtrado fue centrifugado en primera instancia a baja intensidad (500g: 7 min,) para descartar el precipitado (detritus alimentario), posteriormente en una segunda fase el sobrenadante se sometió a una centrifugación a alta intensidad (18.000g: 25 min,) recogiendo en este caso el precipitado que contenía las bacterias ruminales (BAL). El precipitado o “pellet” bacteriano se congeló (-20ºC) hasta su posterior análisis. 4.6 Métodos analíticos 4.6.1 Principios inmediatos MS de alimentos y heces se determinó por secado en estufa (100ºC) hasta peso constante. En el caso de bacterias y quimo se determinó por liofilización. MO ,PB, FB, EE se analizaron según AOAC (2004). La FND, FAD y LS se analizaron segúnVan Soest et al., (1991).. 4.6.2 Parámetros ruminales La determinación en el contenido ruminal se realizó en el caso del NH3 por colorimetría según Chaney and Marbach (1962) y los AGV por cromatografía de gases según Jouany (1982). La abundancia isotópica se determinó por un espectrofotometría de masas (VG PRISM II, IRMS conectado a un catalizador DUMAS-style N analyser EA 1108, Carlo Erba, Milan, Italy), el enriquecimiento isotópico corrigiendo por la abundancia natural determinada en los animales que no recibieron el isotopo. 4.6.3 Iterbio El Iterbio se determinó según el procedimiento descrito por Vega &Poppi, (1997), así 0.2 g de las muestras (pienso, heces y quimo) previamente molidas (0,1mm) se digirieron en (15 ml en una proporción 4/1 de HNO3 y HClO4 diluidos ambos al 70%) 28 durante 12 h. Después de este período la digestión continuó en un baño de arena (100ºC) incrementado progresivamente la temperatura (100º C/hora) hasta llegar a los 400ª C. Se consideró que la digestión de la MO había sido completa cuando la muestra alcanzó un aspecto totalmente transparente (volumen residual ≈ 5 ml). Finalizada la digestión la muestra se filtró (Whatman 0.1 mm) y se diluyo hasta 25 ml para ser analizada por espectrometría de absorción atómica. 4.6.4 Bases púricas: El análisis de las Bases púricas, tanto en el rumen como en el abomaso se analizaron a por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) a partir del método propuesto por Balcells et al. (1992). 4.7 Cálculos y análisis estadísticos 4.7.1 Flujos digestivos: Flujo abomasal (Fa) de MS, MO, Fibra, N y NM se determinaron a partir de la cantidad de Yb administrado (QIt) dividido por la concentración [Yb] del marcador en cada uno de los sustratos (MS, MO, Fibra, N y NM) en el quimo. i.e: Flujo (MS) = Q/[Yb (MS)]. Para realizar los cálculos se asume que la recuperación de Yb en abomaso es total. 4.7.2 Digestibilidad aparente La digestibilidad aparente de los diferentes componentes de la digesta (MS, MO, Fibra, N) se determinó a partir de las concentraciones de la lignina sulfúrico en el alimento [Mi] en relación a la concentración del marcador en heces [Mf] a partir de la siguiente ecuación: Digestibilidad Aparente (MS) = 1 – ([Mi] MS/ [Mf] MS) 4.7.3 Ingestión Voluntaria: La ingestión voluntaria se calculó en función de: (i) excreción fecal de MS (EFMS): 29 EFMS = QYt/ [Ybf], siendo QYt = la cantidad de Yb administrada y [Mf] = la concentración del marcador (Yb) en heces. (ii) la digestibilidad fue calculada en base la concentración en heces y alimento de LS: Digestibilidad MS = 1 – ([LSi] MSI/ [LSf]MSFecal); Finalmente la Ingestión Voluntaria (IV) se calculó en base a: MSI=MSE (Yb)/ (1-Digestibilidad MS (LS)) 4.7.4 Contribución Microbiana a la digesta duodenal: El origen del N en la digesta post-ruminal o abomasal fue determinado utilizando dos marcadores microbianos: interno, las bases puricas y uno isotópico, el 15N. La proporción de proteína Microbiana se determinó a partir del enriquecimiento de15N (E) determinado en el N abomasal (EDigesta) y a las bacterias (ELAB) MN/Ndigesta=E-Ndigesta/E-NLAB El enriquecimiento isotópico se calculó por diferencia en la tasa (15N/14N) entre las muestras obtenidas tras (120 h) la administración del isotopo y las obtenidas en los animales que no tuvieron contacto con él. 4.7.5 Bases Púricas: De forma similar al modelo utilizado para el 15N la proporción de N microbiano en el N duodenal se estimo a partir de la concentración de BP (mmol)/N(g), en el quimo (o digesta duodenal) [BP quimo] en relación a la concentración obtenida en las bacterias ([BP] Bacterias) según la siguiente relación: NM/N digestivo= ([BP quimo])/ ([BP] Bacterias): Para estos cálculos se asume que las bases púricas en el abomaso son de origen exclusivamente microbiano. 4.7.6 Análisis Estadísticos Los datos fueron analizados en un diseño donde los animales estaban jerarquizados al tratamiento. El tratamiento fue el factor fijo mientras que el animal fue el aleatorio según el modelo: Yij = μ + Ti + Aj (i) + Eij 30 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31 Este trabajo se planteó, ya desde sus inicios, desde una perspectiva práctica y la idea consistió en determinar la producción de proteína microbiana en animales en condiciones practicas de producción, es decir: i) no alterados quirúrgicamente (sin cánulas implantadas); ii) sin alterar las condiciones de producción (i.e confinar los animales en jaulas metabólicas), iii) manteniendo el comportamiento de grupo. Cumplir estas tres condiciones experimentales no ha estado exento de dificultades, tal como será descrito en los próximos apartados. 5.1 Ingestión Voluntaria y Digestibilidad La primera dificultad fue la de determinar los valores individuales de IV, dado que las medidas de ingestión (alimento suministrado y rehusado) correspondían al lote (ver Cortés, 2012) y solo tendrían una utilidad orientativa dada la variación individual existente, tanto en los niveles de ingestión como en la ESMR. Los valores de ingestión individual se estimaron a partir de un sistema de doble marcado, el primer marcador, de flujo (Iterbio; Yb) y un segundo de digestibilidad (lignina sulfúrico: LS). En el caso del primero, se administraba una dosis conocida de Yb, que deberíamos detectar en los diferentes tramos del intestino, especialmente en el caso del abomaso y las heces. Conociendo la dosis del marcador administrada (ver apartado 4.3 a Material y Métodos) y la concentración del marcador en las heces es posible calcular el flujo de MS fecal. Conocida la excreción de MS, para el cálculo de la IV individual es necesario además utilizar un segundo marcador que nos permitiera determinar, i) la digestibilidad de la MS ii) Excreción fecal y digestibilidad nos permite obtener los valores de ingestión individual. El segundo marcador fue la lignina sulfúrico, porque su utilización conlleva la mínima alteración sobre los animales experimentales. El Yb se administró en dos dosis diarias (Ap. 4.3), para ello los animales eran conducidos a la manga de manejo donde eran inmovilizados para proceder a la administración de Yb. Esta tarea requirió una cierta docilidad de las terneras, que no todas las terneras mostraron y por esa razón uno de los animales fue descartado para evitar accidentes, este animal era del lote PP así que el número de individuos de ese lote se redujo a 5. En la tabla 4 se presenta la IV por lotes y corresponde a la totalidad del período experimental (120 d.Diciembre 2011-Marzo 2012) 32 Tabla 4: Parámetros productivos registrados a dos lotes de terneras, cruces de (Charoles y Limousine; n =24) alimentadas con una ración convencional basada en pienso y paja “ad libitum” [PP] o una ración completa mezclada (RCM) tipo “unifeed”. Tratamiento Ítem PP (1) RCM(2) ES(3) Sig(4) P< Peso Vivo Inicial (Kg) 230 ,4 234,9 6,25 NS 0,6196 Final (Kg) 374,1 350,4 6,35 * 0,015 GMD, Kg/d 1,205 0,965 0,047 ** 0,0017 Ingestión MS ( Kg MS/d) 6,97 5,75 - - Concentrado (Kg DM /d) 6,50 - - - Paja (Kg MS /d) 0,47 - - - Índice Conversión (Kg/Kg) 5,80 5,96 - - (1)Ración compuesta por pienso y paja “ad libitum” (2) Ración completa mezclada tipo “unifeed”; (3) Significación estadística del efecto tratamiento sobre los valores medios obtenidos. Las terneras que recibieron la ración PP mostraron un mayor nivel de ingestión de MS (P<0.001) que aquellas alimentadas con la ración RCM (6,97 vs 5,75 Kg de MS por PP y RCM respectivamente), y ello se reflejo en un mayor nivel de crecimiento (1,205 vs. 0,965 por PP y RCM, respectivamente [P<0.015]) mayor peso vivo (374 vs 350 Kg por PP y RCM, respectivamente [P<0.015]). En este caso es necesario precisar que los animales fueron distribuidos inicialmente para conseguir el mismo peso inicial (230 vs 234 Kg por PP y RCM, respectivamente [P<0.62]). Cabe destacar que los animales que recibieron la dieta concentrada, mostraron mayores niveles de ganancia media diaria pero no por ello utilizaron la ración de forma más eficiente ya que los IC (GMD/ IV) 33 fueron similares (5.80 vs 5.96 Kg/kg). La relevancia estadística de las diferencias no pudo ser evaluada ya que los datos de ingestión voluntaria eran grupales. En relación a la ración concentrada los animales mostraron un consumo medio diario de paja de 0.32 Kg, que representa un 7 % del consumo total diario de MS, este se sitúa dentro del rango propuesto por FEDNA (2003) para terneras de cebo intensivo y dentro del rango obtenido por aquellos autores que trabajaron en condiciones experimentales similares (Balcells et al 2012; Devant et al 2007). Los niveles individuales de IV registradas durante el período experimental se presentan a la tabla 5, los términos que se muestran son IV de MS e IV de MOD (MODI: MOI x Digestibilidad de la MO]. En general las ingestiones de MS registradas (4.46 vs 5.53 Kg de MS para los animales que ingirieron PP y RCM, respectivamente) fueron inferiores a las registradas por lotes durante la totalidad del período (6,97 vs 5,75 Kg de MS para PP y RCM). Es decir, las estimaciones de los consumos realizadas a partir del sistema de marcadores fue, aproximadamente un 25 % inferior a la registrada por lotes. Dos razones podrían justificar las diferencias existentes, la primera estaría relacionada con una recuperación incompleta del marcador debida a razones metodológicas, básicamente, por una subestimación cuantitativa en el análisis fecal (Vega & Poppi 1997), en una hipotética retención del marcador en ciertos compartimentos cinéticos del digestivo (Mota et al 2008) o la eliminación del marcador (caso del Yb) por otras vías que podrían incluir la orina o el sudor (Mota et al. 2008). Otra posibilidad que debe ser considerada es un descenso en la IV durante el período experimental (días 110-120) debido al estrés inducido por el manejo, confinamiento en la manga y la inmovilización, así como el muestreo fecal. Es necesario considerar que los animales se sometieron dos veces diarias al proceso de muestreo y las terneras eran animales criados en semi-libertat (procedían de la dehesa) y no habían tenido apenas contacto previo con ninguna actividad humana. En este sentido es necesario señalar, i) la estrecha correlación que se obtiene entre los niveles individuales de GMD durante este periodo y el consumo voluntario estimado mediante la técnica de marcadores (r=0,81; P<0,002) y ii) En el periodo de muestreo las ingestiones medias por lote coinciden prácticamente con las ingestiones estimadas con el sistema de marcadores. Por todo ello, es probable que sea el estrés metodológico inducido en los animales la causa más probable entre las diferencias registradas. 34 Tabla 5. Ingestión diaria de materia seca (MSI), materia orgánica digestible (MODI) y digestibilidad aparente y ruminal registradas en terneras cruzadas (Charoles y Limousine; n =12) alimentadas “ad libitum” con una ración basada en pienso y paja [PP] o una ración completa mezclada (RCM) tipo “unifeed”. PP RCM Pienso(1) Paja ES(2) P(2)< Sig Ingestión (g/d) MSI 4.46 5.53 4.14 0.32 0.323 0.04 * MODI 3.62 4.60 0.281 0.03 * Digestibilidad Aparente MS 0.87 0.91 - - 0.011 0.03 * Digestibilidad Ruminal MS 0.67 0.77 - - 0.043 0.18 NS (1) Consumo individual de pienso y paja asumiendo que la relación de ingestión de ambos refleja la registrada en los lotes. (2) Error estándar residual y significación del efecto tratamiento. Es difícil contrastar los consumos obtenidos con el lote RCM con otros autores que hayan utilizado metodología similar durante el cebo, es cierto que los datos en vacuno lechero son abundantes pero tiene un escaso sentido validar o comparar los resultados obtenidos con animales en fases productivas diferentes. Sí podemos contrastar los datos registrados en las terneras que consumían la ración la ración PP, cuyos consumos en MS equivaldrían a un rango entre 1.5-1.7 % del PV (ingestión de MS/ PV animal). Dichos valore, no difiere de forma relevante de las recomendaciones existentes para terneras de este tipo en condiciones de explotación intensiva (2%, ARC 1980) y ambos estarían dentro del rango descrito en ensayos de características similares [1.3-2.3 %; Devant et al. 2007; Martin Orue et al. 1997; Pereira et al 2007]. Los crecimientos (GMD) obtenidos en ambos grupos de terneras estarían dentro del rango descrito para esta especie y condiciones de producción intensiva. Una amplia 41 al. 1997; Balcells et al. 2012, Vicente et al 2004). Estos bajos niveles de síntesis reflejan las condiciones de fermentación inherentes a este tipo de raciones, compuestas mayoritariamente por hidratos de carbono no-estructurales (i.e almidón) (> 90 % de la MS ingerida). El impacto de este tipo de raciones es variable, pero en general se induce una fermentación propiònica más que a nivel energético es más eficiente pero que se caracteriza por una rápida y elevada producción de AGV, especialmente lactato. Ambos factores reducen y limitan las condiciones de fermentación reduciendo los niveles síntesis microbiana (ARC, 1984). Al administrar una ración más forrajera, la RCM inducimos, probablemente, un tipo de fermentación celulítica, más equilibrada que permite mejorar los procesos de síntesis en el rumen. En relación a la eficiencia de síntesis microbiana g NM/Kg MODI los valores obtenidos se situarían en los noveles más bajos de los que podemos encontrar en el bibliografía existente (ARC, 1984; AFRC 1992, INRA 1978) como correspondería a raciones con un elevado nivel de carbohidratos no estructurales, obteniendo mayores niveles de eficiencia al incrementar la contribución de forrajes en la ración (Tabla 8). 5.5 Marcadores microbianos: Valoración. La utilización de ambos marcadores microbianos dio lugar a valores de de NM y eficiencia de síntesis desiguales, los valores estimados a partir del 15N fueron ligeramente superiores a los valores obtenidos a partir de las bases puricas (Tabla 7 y 8) sin embargo es difícil establecer cuál de ellos es el valor real dado que no existen un patrón fijo de referencia. En principio, dentro de cada ración la proporción o contribución de NM a la digesta abomasal no difirió entre marcadores microbianos (P>0.05) así los valores estimados para RCM fueron de 67,8 y 62.7 % SE 4.00 y para PP de 53.2 y 52.9 % SE 4.38 (utilizando 15N y BP, respectivamente). Sin embargo, cuando ambas raciones fueron comparadas, la contribución del NM a la digesta abomasal estimadas con el isótopo mostraron diferencias significativas entre raciones, así la proporción de NM fue mayor (P<0.05) en los animales que habían ingerido RCM que aquellos alimentados con PP (67.8 vs 53.2 % SE 4.36; P<0.01). Cuando se utilizaron las BP como referencia, aunque las diferencias numéricas entre raciones se mantuvieron (62.7 vs 52.9, SE 7.16 P>0.05) las diferencias estadísticas no alcanzaron, en este caso, significación estadísticas dada la mayor variación residual registrada con las BP. 42 A partir de nuestros resultados no se puede afirmar que las bases púricas tiendan a sobre-estimar la contribución microbiana al flujo duodenal por la presencia en el quimo de purinas by-pass, sino al contrario de las BP se derivaron menores estimaciones coincidiendo con trabajos recientes en los que se han comparado ambos marcadores (Belanche 2012; Belanche et al 2013). Sin embargo, la mayor precisión en el marcado isotópico de la proteína microbiana permite evidenciar diferencias entre tratamientos que quedan enmascarados por la variación residual con las bases puricas. Por ello a partir de nuestros resultados y para la metodología que se describe en el presente trabajo el marcado isotópico sería la técnica más precisa y por tanto la de elección. 43 6. CONCLUSIONES 44 A partir de los resultados obtenidos podemos extraer las conclusiones que se plantean a continuación. 1) Cuando dos grupos de terneras de características similares son alimentadas “ad libitum” con dos raciones, la primera una ración convencional, basada en concentrado más paja de cereales, la segunda una ración forrajera tipo “unifeed”. Los ritmos de crecimiento fueron superiores en el lote que recibió la ración convencional (1205g/d) que los que recibieron la forrajera (965 g/d), no obstante los primeros no utilizaron la ración de una manera más eficiente ya que el índice de transformación de la materia seca fueron similares (5.96 y 5.80 respectivamente) 2) Las digestibilidad aparente de la MS estimada a partir de la concentración de lignina sulfúrico en el alimento y las heces fueron siempre superiores en la ración forrajera tipo “unifeed” probablemente las diferencies registradas podrían estar relacionadas en una reducción en la digestibilidad de la fibra en la ración convencional. 3) El tipo de ración no modifico la composición química de las bacterias aisladas del líquido ruminal, no obstante la proporción de N microbiano presente en el abomaso fue siempre superior en la ración forrajera que en la ración convencional. 4) La eficiencia de síntesis microbiana (g N microbiano/Kg MOD en el rumen) registrada con la ración convencional fue baja (19.33g N microbiano/kg MODR) como corresponde a este tipo de raciones. Los niveles de eficiencia de síntesis mejoraron en aquellos animales que recibieron la ración más forrajera (24.45g N microbiano/kg MODR). 5) Los valores de producción y síntesis de proteína microbiana en el rumen estimados a partir de las bases púricas como marcador microbiano no defirieron de las estimadas a partir del 15N. A pesar de ello el isótopo mostró una mayor precisión en las estimaciones, 45 7. BIBLIOGRAFIA 46  AFRC (1992) Nutritive Requirements of Ruminat Animals: Protein Technical Committee on Responses to Nutrients. AFRC Report nº9. Nutr. Abstract. Rev. (Serie B). 62, 787-835  ARC (1984) The nutrients requirements of ruminal livestock. Supp. Nº1[C.A.B., editor]  Askar ART (2004) Alimentación de corderos con cebada en grano y suplemento proteico a libre elección: digestión ruminal y rendimientos productivos.Tesis Doctoral, Zaragoza  Balcells, J.;. Guada, J. A.; Castrillo, C.; Gasa J.(1993) Rumen digestion and urinary excretion of purine derivatives in response to urea supplementation of sodium-treated straw fed to sheep. British Journal Nutrition, 69, 721-732. 1993  Balcells J, Aris A, Serrano A, Seradj AR, Crespo J, Devant M. (2012) Effects of an extract of plant flavonoids (Bioflavex(R)) on rumen fermentation and performance in heifers fed high-concentrate diets. J Anim Sci. 2012 (DOI)  Beauchemin, K. A., Yang, W. Z., and Rode, L. M. (2001). Effects of barley grain processing on the site and extent of digestion of beef feedlot finishing diets. Journal of Animal Science 79, 1925-1936.  Beever DE, Harrison DG, Thomson DJ, Cammell SB & Osbourn DF (1974) A method for the estimation of dietary and microbial protein in duodenal digesta of ruminats. Br. J. Nutr. 32, 99-112  Belanche A (2008).Estudio del ecosistema ruminal y la producción de proteína microbiana mediante PCR a Tiempo Real (Tesis Doctoral)  Ben-Ghedalia D (1981) Fate of digesta ribonucleic acid in small intestine of sheep. J Dairy Sci 64.  Carro MD (2001) La determinación de la síntesi de proteína microbiana en el rumen: comparación entre marcadores microbianos (revisión) Investigación Agraria: Producción y Sanidad Animal.  Carro MS & Miller EL (2002) Comparison of microbial markers (15N and purine bases) and bacterial isolates for the estimation of rumen microbial protein synthesis. Anim Science 75  Chaney, A. L., and Marbach, E. P. (1962). Modified reagents for determination of urea and ammonia. Clinical chemistry 8, 130-132 47  Cortés, X. (2012). Comparació de dues dietes en vedells d’engreix: dieta convencional (pinso i palla) vs unifeed. Treball de fi de grau (Ciència i Salut Animal). ETSEA, Universitat de Lleida.  Czerkawsky JM (1986) An introduction to rumen studies. Pregamon Press Ltd, Oxford, England  Dalton Henrique Pereira, 2006. Intake and total and partial digestibility of nutrients, ruminal pH and ammonia concentration and microbial efficiency in beef cattle fed with diets containing sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) silage and concentrate in different ratios.  Dalton H. Pereira, 2007. Nutrient intake and digestibility and ruminal parameters in beef cattle fed diets containing Brachiaria brizantha silage and concentrate at different ratios.  Dehority BA (1993) Microbial ecology of cell Wall fermentation. In Forage cell wall Structure and Digestibility pag 425-454.  Devant, M., Anglada, A., and Bach, A. (2007). Effects of plant extract supplementation on rumen fermentation and metabolism in young Holstein bulls consuming high levels of concentrate. Animal Feed Science and Technology 137, 46-57.  Faichney, G. J.(1975). The use of markers to partition digestion within the gastrointestinal tract of ruminants. A: Digestion and metabolism in the ruminant Eds: Mac Donald, I. W. i Warner, A. C.I. Armidale University of New England Publishing Unit.  FEDNA, 2003. Tablas FEDNA de composición y valor nutritivo de los alimentos para la fabricación de piensos compuestos. 2ª ed. De Blas, C., Mateos, G.G., Rebollar, P.G. (Eds.), Fundación Española para el Desarrollo de la Nutrición Animal, Madrid, Spain.  Jouany JP, Demeyer D & GRain J (1988) Effects of defaunating the rumen. Anim Feed Sci Tech, 21.  Jouany, J. P. (1982). Volatile fatty acid and alcohol determination in digestive contents, silage juices, bacterial cultures and anaerobic fermentor contents. Sci Aliments 2, 131-144. 48  Marthen L. Mullik, Dennis P.Poppi i Stuart R. Mc clennan, 2009 Quantification of the Efficiency of Rumen Microbial Protein Synthesis in Steers Fed Green Tropical Grass.  Mc Allan AB & Smith RH (1973a) Degradation of nucleic acid in rumen. Br.J. Nutr, 29.  Merry, R. J., McAllan, A. B. (1983). A comparison of the chemical composition of mixed bacteria harvested from the líquid and solid fractions of rumen digesta. British Journal of Nutrition, 50, 701-709.  Minato, H., Miyagawa, E., Suto, T., (1990): Techniques for analysis of rumen microbial ecosystems. A: S.Hoshino; R.Onodera; H.Minato; H.Itabashi, (eds.) The rumen ecosystem: the microbial metabolism and its regulation.  Mota et. Al (2005). Metabolismo de las bases púricas: estudio de su digestibilidad intestinal y factores que modifican su tasa de excreción renal. Tesis Doctoral.  Mota, M; Balcells, J. Ozdemir Baber, NH, Bölüktepe, S.(2008) Predicting rumen microbial outflow from urinary excretion of purine derivatives in goats. Animal. 2, 44-51, 2008  Olubobokun, J. A., Craig, A. M. & Nipper, W. A. (1988). Characteristics of protozoal and bacterial fractions from microorganisms associated with ruminal fluid or particles. J. Anim. Sci.66, 2701-2710.  Orpin CG (1984) The role of ciliate protozoa and fungui in the digestion of plant cell walls. Anim. Feed Sci. Tech 10.  Overton, T. T., Camernon, J. P., Elliott, J. P., Clarck, J. H. & Nelson, D. R. (1995). Ruminal fermentation and passage of nutrients to the duodenum of lactating cows fed mixtures of corn and barley. J. Dairy Sci. 78, 1981-1998  Pérez JF, Balcells J, Guada JA & Castrillo C (1997a) Rumen microbial production estimated either from urinary purine derivatives excretion or from direct measurements of 15N and purines bases as microbial markers: effect of protein source and rumen bacteria isolated. Animal Science 65, 225-236.  Pérez JF, Balcells J, Guada JA & Castrillo C (1997b) Rumen microbial production estimated either from urinary purine derivatives excretion or from direct measurements of 15N and purines bases as microbial markers: effect of protein source and rumen bacteria isolated. Animal Science 65, 225-236. 49  Satter, L. D. & Roffler, R. E. (1975). Nitrogen requirement and utilization in dairy cattle. J. Dairy Sci. 58:1219-1237.  S.M. Mart´ın-Oru´e, J. Balcells ), F. Zakraoui, C. Castrillo, 1997. Quantification and chemical composition of mixed bacteria harvested from solid fractions of rumen digesta: effect of detachment procedure.Anim. Feed. Sci. Tech 71  S.Martin-Orue, S.M.; Balcells J.; Zakraoui, F.; Castrillo, C.(1998) Quantification and chemical composition of mixed bacteria harvested from solid fractions of rumen digesta: effect of detachment procedure.. Animal Feed Science and Technology. 71, 269-282 .1998  Van Soest PJ (1994). Nutritional Ecology of the Rumiant; Second ed: Cornell University Press.  Vega A & Poppi DP (1997). Extend of digestion and rumen condition as factor affexting passage of liquid and digesta particles in sheep. J. Agric. Sci. 114  Vicente F, Guada JA, Balcells J & Castrillo C (2004) Microbial contribution to duodenal purine flow in fattening cattle fed concentrate diets estimated by purine N labeling (15N) of different microbial fractions. Animal Science 78.  Yang, W. Z., Beauchemin, K. A., Farr, B. I. & Rode, L. M. (1997). Comparison of barley, hull-less barley and corn in the concentrate of dairy cows. J. Dairy Sci. 80, 2885-2895.  Yokoyama, M. T. & Johnson, K. A. (1988). Microbiología del rumen e intestino. A: El ruminate, fisiología digestiva y nutrición. Ed. Church, C,D. Editorial Acribial. Zaragoza, Espanya.