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FACULTAD DE VETERINARIA, UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Influencia de la adición de taninos enológicos en el color del vino Teresa Serrano Armand DATOS PERSONALES: - Serrano Armand, Teresa - D.N.I.: 17763608H - Dirección: C/ Brazal Zapateros nº6, 50016, Zaragoza - Correo electrónico: [email protected] ÍNDICE 1. RESUMEN / ABSTRACT………..…………………………………………….1 2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………3 2.1. TANINOS……………………………………………………………………………….3 2.2. ESTADO DEL ARTE………………………………..………………………….6 3. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS………………………………………………7 4. METODOLOGÍA………………………………………………………………….9 4.1. IDENTIFICACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LAS PRINCIPALES ACTIVIDADES TÉCNICAS……………………………………………………………..9 4.1.1. ELABORACIÓN DE VINO TINTO………………………………………………………10 4.1.2. ANÁLISIS DE COLOR Y DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS……………….15 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………17 5.1. ELABORACIÓN DE VINO TINTO…………………………………………….17 5.2. ANÁLISIS DE COLOR Y DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS…….22 6. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS.…………………………………….29 7. IDENTIFICACIÓN DE LAS APORTACIONES QUE EN MATERIA DE APRENDIZAJE, HAN SUPUESTO LA REALIZACIÓN DE ESTA ASIGNATURA…………………………………………………………………..33 8. EVALUACIÓN DE LA ASIGNATURA Y SUGERENCIAS DE MEJORA………………………………………………………………………..33 9. BIBLIOGRAFÍA.…………………………………………………………………34 10. ANEXO……………………………..……..…………………………..37 1. RESUMEN Los taninos son importantes componentes de la calidad del vino, ya que contribuyen tanto a la percepción en boca como a la estabilización del color con el tiempo. A su vez, el color es sin lugar a dudas uno de los aspectos organolépticos más importantes de un vino. Es por ello que la adición de taninos enológicos para mejorar las características de los vinos tintos es una práctica muy extendida en bodegas durante la elaboración de vinos tintos. Sin embargo, son muy pocos los estudios realizados en este campo y así mismo existe controversia en las opiniones de diferentes autores en cuanto a si esta adición es efectiva o no. El objetivo de este proyecto es determinar la influencia de la adición de taninos enológicos de Quebracho y de uva en el color del vino tinto. Para ello se elaboraron vinos a partir de uvas de las variedades tempranillo y garnacha procedentes de la D.O. Rioja. De cada vino se prepararon dos controles, dos muestras con tanino de Quebracho añadido en la fase pre-fermentativa y dos muestras con tanino de Quebracho y tanino de uva añadidos en la fase pre-fermentativa y post-fermentativa respectivamente. Se realizaron análisis de color y de compuestos fenólicos: intensidad de color, índice de polifenoles totales y concentración de taninos y antocianos totales en distintas etapas de la vinificación: al finalizar la fermentación alcohólica, al finalizar la fermentación maloláctica y tras la adición de SO2. Los datos fueron estudiados mediante análisis de varianza (ANOVA). Los resultados indican que la adición combinada de tanino de Quebracho y tanino de uva afecta positivamente a la intensidad del color. No obstante la adición única de tanino de Quebracho en las cantidades recomendadas por el fabricante no contribuye a la mejora de la intensidad de color. Esto sugiere que adición de taninos enológicos puede estar en muchos casos injustificada. 2 ABSTRACT Tannins are an important component of wine quality since they not only contribute to the mouth’s perception, but also to the long-term color stability. At the same time, the color is undoubtedly one of the most important sensory aspects of wine. That is why the addition of enological tannins to improve the characteristics of red wines is a widespread practice in wineries during the winemaking. However, there are few studies in this field and also there is controversy of opinions between authors of the field regarding whether this addition is effective or not. The purpose of this project is to determine the influence of the addition of enological tannins of Quebracho and grape on red wine color. This wine is produced from grapes of the variety Tempranillo and Garnacha from the D.O. Rioja (Spain). From each wine, two controls, two samples with quebracho tannin added in the pre-fermentation stage and two samples with quebracho tannin and grape tannin added in the pre-fermentation and post-fermentation respectively, were prepared. Analyzes of color and phenolic compounds were performed: color intensity, total phenolic compounds index and concentration of total tannins and anthocyanins at different stages of winemaking: firstly, once the alcoholic fermentation has been finished, secondly, once the malolactic fermentation has been completed, and finally, after adding SO2. The obtained results were studied in depth using an analysis of variance and concludes that the combined addition of quebracho tannin and grape tannin positively affect the wine color intensity. Nonetheless, only adding quebracho tannin (in the amounts recommended by the manufacturer) does not contribute to the improvement of color intensity. This could mean that the addition process of oenological tannins may be sometimes unwarranted. 3 2. INTRODUCCIÓN 2.1. TANINOS Los taninos del vino son un importante componente de la calidad del mismo, ya que contribuyen tanto a la percepción en boca como a la estabilización del color en el tiempo (Malien-Aubert, Dangles & Amiot, 2002; Singleton, 1988; Somers, 2003; Vidal et al., 2004). Los taninos del vino proceden principalmente de las semillas y los hollejos de la uva transferidos al vino durante su elaboración. Por ello, aquellos vinos cuyo mosto apenas está en contacto con dichas partes de la uva, como los blancos y rosados, tienen bajas concentraciones de taninos, mientras que los tintos elaborados en contacto con los hollejos, periodo que varía desde días a semanas, tienen concentraciones variables de taninos. Los taninos de las semillas y de los hollejos son comúnmente llamados “taninos condensados” (Haslam, 1998). Los monómeros más abundantes son la catequina, epicatequina, galocatequina y epigalocatequina y podrían considerarse como los precursores de los taninos. La condensación de los monómeros es condición indispensable para que estos compuestos presentes las características químicas y organolépticas de los taninos (deben tener un peso molecular superior a 500 Dalton, lo que corresponde a la condensación de al menos dos monómeros), puesto que los monómeros y los polímeros de más de 10 monómeros no tienen características tánicas. Durante la maduración de la uva, la disminución de la astringencia es debida al aumento de la polimerización. Sus propiedades tánicas dependen de los grupos sustituidos en los monómeros; los principales son los procianidoles, derivados de la catequina y epicatequina, y los prodelfinidoles, constituidos de galocatequina y epigalocatequina; estos últimos se localizan exclusivamente en los taninos del hollejo (Usseglio-Tomasset, 1998). Las principales propiedades de los taninos son: - Son compuestos sólidos, de sabor áspero y astringente. - Se disuelven bien en alcohol, en agua y en líquidos alcohólicos, y por lo tanto en mosto y vino. 4 - En los mostos y vinos se encuentran en estado coloidal, y sus micelas poseen de forma natural cargas eléctricas negativas. - Con las sales de hierro dan compuestos de color negro-azulado. En los vinos producen la quiebra azul. - Forman con la gelatina un flóculo o grumo insoluble en el agua, alcohol y en los mostos y vinos, que tiende a caer con las lías, debido a la diferencia de carga que tienen. - Protegen de la oxidación, ya que, como precipitan proteínas, afectan también a su carga enzimática, dado que los taninos se combinan con la apoenzima (que siempre es una proteína) e inhiben la actividad enzimática. - Se combinan también con polímeros de tipo celulosa y pectina. - Las moléculas elementales de los taninos son incoloras o de color amarillo pálido, y con la condensación evolucionan hacia la tonalidad amarillo-marrón, que incluso llega al ocre (Usseglio-Tomasset, 1998). La concentración de taninos en los hollejos de la uva varía considerablemente con el clima, el suelo, así como por el tipo de variedad de la uva y prácticas vitivinícolas (Downey, Dokoozlian & Kistic, 2006). Aunque las diferentes variedades de uva tengan cierta concentración de taninos en el hollejo, se ha observado que el vino producido no siempre tiene un nivel similar de taninos (Adams & Scholz, 2007; Hanlin & Downey, 2009; Harbertson et al., 2009). Para compensar esto, se añaden frecuentemente taninos exógenos durante el proceso de elaboración del vino tinto tanto en forma de semillas como de extractos liofilizados (Kovac, Alonso, Bourzeix & Revilla, 1992; Kovac, Alonso & Revilla, 1995; Main and Morris, 2007; Parker et al., 2007). Los taninos comerciales están disponibles en un gran número de formas, los más comunes son los conocidos como “oenotaninos” o “taninos enológicos” y generalmente se encuentran en forma de extracto liofilizado. Sin embargo, la adición de taninos también puede realizarse mediante chips o virutas de roble y mediante el envejecimiento en barriles de roble. Los taninos derivados de barriles, chips y virutas no son taninos condensados como los que se encuentran en las semillas y hollejos, sino más bien taninos hidrolizables (Haslam, 1998; Mayer, Gabler, Riester & Korger, 1967). 5 Los preparados comerciales de taninos hidrolizables se obtienen a partir de una amplia variedad de materiales vegetales incluyendo la corteza de árbol de Quebracho de América del Sur (Schinopsis balansae y Schinopsis lorentziil), la Acacia Australina (Acacia mearnsii) y las bellotas del género Quercus (Rautio, Bergvall, Karonen & Salminen, 2007). Numerosas especies como Acer, Acacia y Quercus contienen tanto taninos hidrolizables como condensados (Bate-Smith, 1977; Ishimaru, Nonaka & Nishioka, 1987; Mueller-Harvey, Hartley & Reed, 1987). Algunos taninos enológicos extraídos de una sola especie son relativamente puros, mientras que otros son mezclas de un gran número de especies y pueden incluir tanto taninos hidrolizables como condensados (Obreque-Slíer, Peña-Neira, López-Solís, Ramírez-Escudero & ZamoraMarín, 2009). Es pues necesario, distinguir entre los diferentes taninos en función de su origen botánico, ya que este condiciona su composición química y por lo tanto su utilidad. En la tabla 1 se muestra la composición de diferentes taninos enológicos en función de su origen (Zamora, 2003). Procianidinas Tanino Gálico Tanino Elágico Tipo de tanino Roble 1 2 680 Elágico Castaño 2 2 230 Elágico Agallas Trazas 780 0 Gálico Hollejos de uva 230 0 0 Condensado Semillas de uva 630 0 0 Condensado Quebracho 45 0 14 Condensado/Elágico Mirobálano 3 148 85 Gálico/Elágico TABLA 1. COMPOSICIÓN DE LOS TANINOS ENOLÓGICOS EN FUNCIÓN DE SU ORIGEN. (ADAPTADO DE RIBÉREAUR-GAYON ET AL., 1999) El interés de su aplicación en vinos tintos es fundamentalmente debido a la posibilidad de incrementar el cuerpo del vino y preservar su color. El efecto del color depende del tanino utilizado. Así cuando se trate de taninos condensados, al ser estos de similar naturaleza que las procianidinas naturales de la uva y del vino, pueden participar facilitando las combinaciones antociano-tanino y por tanto contribuir a la estabilización del color. Por otra parte, los taninos gálicos y taninos elágicos protegen a los antocianos de la oxidación, ya que ellos mismos pueden actuar regulando los fenómenos de oxidorreducción. 6 La adición de tanino al mosto antes o durante la fermentación del vino tinto es una práctica bastante extendida. La adición directa de tanino se hace disolviendo en agua caliente el tanino enológico (ácidos gálico y pirocatéquico), en una concentración de 10 a 30 g/hL, y agregándolo directamente al mosto con remontados (es aconsejable ir adicionándolo poco a poco, a razón de 3-5 g/hL en cada remontado) (Aleixandre, y Álvarez, 2003). 2.2. ESTADO DEL ARTE Hasta la fecha, los taninos enológicos no han recibido mucha atención por parte de los investigadores, a pesar de su amplio uso en la industria. Existen muy pocas publicaciones sobre la eficacia de la adición de taninos al vino y sobre la efectividad de los productos disponibles. Generalmente, los estudios han sido enfocados en la adición prey postfermentación (Bautista-Ortín, Fernandez-Fernandez, López-Roca, & Gómez-Plaza, 2007; Main & Morris, 2007; Parker et al. 2007). En un estudio realizado por Parker et al. en 2007, se añadieron taninos enológicos al vino, tanto antes como después de la fermentación alcohólica y después estudiaron el impacto causado en la composición de fenoles, color y propiedades sensoriales. Los autores añadieron 200 mg/L de oenotaninos (taninos condensados) en diferentes muestras de Shiraz. Tras las determinaciones analíticas los resultados demostraron que no hubo ningún efecto significativo en el color (A420+ A520 y CIElab) y que el único efecto de la adición de taninos fue el incremento de la astringencia (Parker et al. 2007). En otro experimento, 200 mg/L de taninos procedentes de semillas de uva blanca, fueron añadidos post fermentación a un vino Cynthiana y se encontró que no hubo ningún incremento significativo de fenoles totales. Sí que hubo una pequeña variación de color, pero según el autor con poco impacto para usos comerciales (Main & Morris, 2007). En otro estudio (Harbertson, Parpinello, Heymann & Downey, 2011), los taninos exógenos fueron añadidos en cantidades diferentes durante la crianza en barrica de vinos elaborados a partir de uvas de las variedades Merlot y Cabernet Sauvignon cosechadas en el valle de Columbia, Washington, USA. En un primer experimento, añadieron tanino al vino Merlot en las concentraciones recomendadas por el fabricante. El experimento demostró que la cantidad recomendada por el fabricante no era 13 Para desencadenar la fermentación maloláctica, se inocularon bacterias malolácticas heterofermentativas, Viniflora CH16, un cultivo de Oenococcus oeno liofilizado. Se pesaron 0,24 gramos del cultivo granulado, y se disolvió en 25 ml de vino (se tomó el vino control TE 2). A continuación se inoculó 1 ml de esta mezcla en cada muestra. El control de la fermentación maloláctica se lleva a cabo mediante la técnica de cromatografía de papel o con determinaciones espectrofotométricas de ácido málico antes y después de la fermentación maloláctica. En nuestro caso, se hizo un seguimiento de la fermentación maloláctica por observación de burbujeo y se hizo la confirmación en laboratorio. Se requirió de colaboración externa para realizar dicho análisis. T1.4. Preparacion del vino final: Una vez terminada la fermentación maloláctica, se adicionó sulfuroso a todas las muestras. La aplicación de este producto, no es sólo por su acción antiséptica, sino también por su alto poder reductor. Algunas levaduras son muy sensibles al SO2, otras pueden resistirlo. Las bacterias del vino, no lo toleran y son eliminadas totalmente. En vinos tintos, la presencia de 80 mg de SO2 por litro, son suficientes para inhibir el crecimiento de las bacterias malolácticas (García-Barceló, J., 1990). Se adicionó 1 ml de sulfuroso con una concentración de 30mg/L por cada litro de muestra. T2: Análisis químicos: Se realizaron diversas técnicas analíticas para conocer la evolución de los vinos en las distintas etapas de su elaboración:  pH: La concentración de iones hidrógeno se expresa como pH. Se mide utilizando un pH-metro y un electrodo de vidrio. El pH-metro se calibra con soluciones tampón estándar y los valores de pH de la muestra se determinan introduciendo el electrodo en el vino sin diluir (Zoecklein et al., 2001)  Acidez total: 14 10 mL de vino se valoran con la solución de NaOH (0,1 N) utilizando el pHmetro para localizar el punto final de la valoración a pH 7.  Acidez volátil: La acidez se determina experimentalmente según el método García-Tena. Se toman 11 mL de vino, se vierten en un matraz y este se ajusta en un aparato de destilación. La determinación se efectúa mediante la separación de los ácidos volátiles con arrastre de vapor de agua y rectificación de los vapores. Posteriormente estos ácidos son valorados con NaOH (0,02M) en presencia de fenolftaleína como indicador.  Nitrógeno fácilmente asimilable (FAN): Se toman 50 ml de mosto o vino que se ajustan a pH 8,5 con NaOH (1N). Se añade una solución de formaldehido ajustada a pH 8,5 y se lleva a la mezcla a pH 8,5 con NaOH (0,1 N), usando una bureta para medir el volumen gastado. La concentración de nitrógeno fermentable se calcula con la siguiente fórmula: N fermentable (mg/L)=(mL de NaOH 0,1N gastados) x 28. (Zoecklein et al., 2001).  Grado de alcohol probable: El “grado alcohólico volumétrico en potencia” o más comúnmente “grado probable” se define como el número de volúmenes de alcoholo puro, a la temperatura de 20ºC, que puede obtenerse por la fermentación total de los azúcares contenidos en 100 volúmenes del producto considerado a dicha temperatura (Reglamento CE nº 1493/99). La determinación del grado probable se lleva a cabo a partir de las determinaciones físicas de la riqueza en azúcares del mosto. Para ello se emplean medidas areométricas y refractométricas, debido a que los azúcares aumentan tanto la densidad como el índice de refracción de las soluciones, de forma proporcional a su concentración.  Grado alcohólico: Se determina por destilación simple del vino previamente neutralizado con sosa hasta pH cercano a 7. Se mide la densidad del destilado por aerometría. 15  Azúcares reductores: Se pone en un erlenmeyer 10 mL de solución de cobre y se añaden 5 mL de solución de Seignette. Se pasan 2 mL de la muestra a través de un cartucho de poligel. Se hace hervir 2 minutos y se enfría. A continuación se añade: 10 mL de solución KI, 10 mL de solución de sulfúrico y 10 mL de indicador de almidón. Se valora con tiosulfato. La diferencia en mL del gasto de tiosulfato de la muestra y del blanco representa directamente el contenido en azúcares reductores expresado en g/L.  Ácido málico: Se realiza por cromatografía de papel. En un papel cromatográfico, se impregna la línea base con ácido málico (patrón) y las muestras de vino. Se sumerge el papel en un recipiente con el solvente cromatográfico por la línea base. Cuando el solvente ha ascendido hasta cerca del borde superior, se saca el cromatpgrama y se deja secar. Una vez seco, se interpretan los resultados observando las manchas amarillas (ácidos) sobre el fondo azul. La identificación del ácido se hace por comparación con el ácido patrón (Zoecklein et al., 2001).  Dióxido de azufre: La cantidad de anhídrido sulfuroso se mide utilizando el aparato Rankine. Se introducen en un matraz 10 mL de muestra y 5mL de ácido fosfórico. En el matraz corazón se ponen 2 mL de agua oxigenada y dos gotas de indicador. Neutralizar con NaOH hasta conseguir un color verde oliva. Conectar el vacío durante 15 minutos. Retirar y valorar con NaOH 0,01M. VNaOH x NNaOH= meq SO2 De la misma forma, pero calentando, se analiza el anhídrido sulfuroso combinado (García-Barceló, 1990). 4.1.2. ANÁLISIS DEL COLOR Y DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS El esquema de las tareas elaboradas en esta etapa, es el siguiente: 16  Color o intensidad colorante: En una cubeta de 1mm de camino óptico, se miden las absorbancias a 420 nm, 520 nm y 620 nm. El resultado se multiplica por 10 para referirlo a la cubeta estándar de 10 mm de camino óptico (Glories, 1984). La intensidad colorante, que nos dará una idea de cuánto color posee el vino, será la suma de cada uno de los componentes:  Compuestos fenólicos totales: El índice de polifenoles totales (IPT) da una idea general de la concentración global de un vino en estos compuestos. Para el vino tinto se diluye previamente por un factor 100 con agua destilada. Se determina la absorbancia a 280 nm en una cubeta de cuarzo de 10 mm de camino óptico y el resultado se multiplica por el factor de dilución. (Ribéreau-Gayon, J., 1970).  Antocianos: La técnica utilizada para su determinación es el método por decoloración con ácido sulfuroso (Ribéreau-Gayon, 1965). Se prepara la siguiente disolución: 1 mL de vino, 1 mL de HCL concentrado al 1% de etanol y 20 mL de disolución al 2% de HCL concentrado en agua. En dos tubos de ensayo se vierten 10 mL de la disolución anterior. A uno de los tubos se le añaden 4 ml de agua destilada y al otro se le añaden 4 mL de disolución de bisulfito de sodio al 15%. MOSTO •IPT (I280) FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA •TANINOS •ANTOCIANOS •IPT (I280) •COLOR (420+520+620) FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA •TANINOS •ANTOCIANOS •IPT (I280) •COLOR (420+520+620) VINO FINAL •TANINOS •ANTOCIANOS •IPT (I280) •COLOR (420+520+620) 17 Se tapan cuidadosamente los tubos, se agitan y al cabo de 20 minutos se miden las absorbancias a 520 nm en la cubeta de 10 mm. Antocianos totales (mg/L)= (A1-A2)x875  Taninos: Se determinan por la técnica descrita por Ribéreau-Gayon, J. en 1966. Se preparan dos tubos de vidrio a los que se le añade: 2 mL de vino diluido 1:50, 1mL de agua destilada y 6 mL de HCL 12 N. Los tubos se protegen de la luz y uno de ellos se mete a baño María durante 30 minutos. El otro se mantiene a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se sacan del baño y se enfrían. Posteriormente se añade 1 ml de etanol a ambos tubos, se agita y se lee la absorbancia a 550 nm en cubeta de 1cm. Taninos totales (g/L) = (A1-A2)x19,33 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. ELABORACIÓN DE VINO TINTO Como se indicó anteriormente, en esta fase del proyecto, se realizaron análisis para conocer la evolución de los vinos en las distintas etapas de su elaboración. A continuación se muestran los resultados de dichos análisis.  Mosto: TABLA 2. MEDIAS DE LOS RESULTADOS DE LAS ANALÍTICAS REALIZADAS A LOS MOSTOS. TE1 TE2 M pH 4,00 ± 0,01 4,31 ± 0,01 3,53 ± 0,05 Acidez total (g/L) 3,76 ± 0,19 2,66 ± 0,27 4,65 ± 0,11 18 FAN (mg/L) 154,00 352,80 95,20* Densidad (g/L) 1095,00 1104,00 1102,00 Te 1, Tempranillo de Corugo; Te 2, Tempranillo de Igea; M, mezcla de Tempranillo y Garnacha. * Sólo disponible 46 ml de mosto para realizar la determinación.  Vinos al acabar la fermentación alcohólica: TABLA 3. MEDIAS DE LOS RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS TRAS LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. pH Acidez total (g/L) Acidez volátil (g/L) Azúcares reductores (g/L) Grado alcohólico Te 1 3,77 ± 0,04 9,52 ± 0,21 3,68 ± 0,13 1,80 ± 0,14 8,00 ± 1,70 Te 1+Q 3,86 ± 0,01 6,90 ± 0,32 2,36 ± 0,08 1,75 ± 0,21 6,80 ± 2,26 Te 1+Q+U 3,93 ± 0,02 5,10 ± 0,42 0,22 ± 0,00 1,80 ± 1,27 10,70 ± 1,70 Te 2 4,10 ± 0,04 3,56 ± 0,16 0,42 ± 0,03 2,05 ± 0,07 11,20 ± 0,28 Te 2+Q 4,16 ± 0,02 3,64 ± 0,37 0,40 ± 0,00 2,15 ± 0,35 13,75 ± 1,06 Te 2+Q+U 4,13 ± 0,02 3,34 ± 0,05 0,46 ± 0,03 1,05 ± 0,21 12,80 ± 0,99 M 3,34 ± 0,01 6,24 ± 0,13 0,35 ± 0,03 2,25 ± 0,07 11,70 ± 0,28 M+Q 3,31 ± 0,03 6,86 ± 0,27 0,46 ± 0,08 2,00 ± 0,28 12,80 ± 0,14 M+Q+u 3,32 ± 0,01 6,60 ± 0,21 0,46 ± 0,03 1,35 ± 1,20 12,70 ± 0,28 Te 1, Tempranillo de Corugo; Te1+Q, Tempranillo de Corugo + tanino de Quebracho; Te1+Q+U, Tempranillo de Corugo + tanino de Quebracho+ tanino de uva. Te 2, Tempranillo de Igea; Te 2+Q, Tempranillo de Igea+ tanino de Quebracho; Te 2+Q+U, Tempranillo de Igea+ tanino de Quebracho+ tanino de uva. M, mezcla de Tempranillo y Garnacha; M+Q , mezcla de Tempranillo y Garnacha+ tanino de Quebracho; M+Q+U , mezcla de Tempranillo y Garnacha+ tanino de Quebracho+ tanino de uva. La medición del pH en vino o mosto, tiene un marcado interés, pues este dato es importante por su efecto sobre: microorganismos, matiz de color, sabor, potencial redox, relación entre el dióxido de azufre libre y combinado, quiebras debidas al fosfato y al hierro, etc. El valor de pH de los mostos destinados a los vinos de mesa, oscila entre 2,7 y 3,8, dependiente principalmente del grado de madurez de la uva de que preceden. A su vez, la medición de la acidez total es también interesante, ya que en el vino se hallan los ácidos procedentes del mosto, además de muchos más, formados durante el proceso de fermentación, como son: acético, propiónico, láctico, succínico, pirúvico, glicólico, galacturónico, fumárico y otros. 19 Por otra parte, la determinación precisa de la acidez volátil en los vinos es de gran importancia en la industria enológica. Si los valores de la acidez volátil son elevados, indica que el vino ha sufrido la acción de microorganismos, principalmente bacterias del genero Acetobacter. Cantidades de 0,3-0,8 g/L, expresados en ácido acético, pueden considerarse normales. Como podemos observar en las tablas, las muestras de vino obtenidas a partir del Tempranillo de Corugo (Te 1) se han picado; ya que muestran unos valores de acidez total muy elevados, llegando incluso a 9 g/L de ácido tartárico y un valor de acidez volátil, por encima de 2 g/L, indicando así una clara contaminación por bacterias acéticas. Esta alteración se confirmó también por el aroma de acetato de etilo claramente percibido en la nariz al catar estas muestras. En la gráfica 1 se muestra dicha información de una forma más visual. GRÁFICA 1. ACIDEZ EN MUESTRAS DE VINO DE TEMPRANILLO DE CORUGO (TE 1) TRAS FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. Es interesante destacar que en esta etapa del proceso, la única muestra que no presenta signos de contaminación, es aquella a la que se añadieron los dos tipos de taninos utilizados en este estudio (Te1+Q+U). Esto confirma la acción antiséptica de los taninos: las glucoproteínas de las membranas de las bacterias son sensibles a la acción del tanino (Alexandre, J.L. y Álvarez, I., 2003). En nuestro caso parece actuar 3,765 9,52 3,6783 3,855 6,8975 2,3607 3,925 5,1 0,2196 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% pH Acidez total (g/L) Acidez volátil (g/L) Te 1+Q+U Te 1+Q Control 20 retrasando el crecimiento bacteriano, ya que en las etapas posteriores todas las muestras presentan signos de picado.  Fermentación maloláctica: La fermentación maloláctica constituye una verdadera desacidificación biológica del vino. Cuanto más rico es el vino en ácido málico, y por lo tanto más ácido, más fuerte es la desacidificación y más marcado es el suavizamiento del vino. Por efecto de la fermentación maloláctica los vinos tintos se hacen más suaves, armoniosos y maduros, ya que los taninos que contienen no ligan gustativamente con una acidez elevada. TABLA 2. MEDIAS DE LOS RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS TRAS LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA. pH Acidez total (g/L) Te 1 3,70 ± 0,07 11,38 ± 3,10 Te 1+Q 3,82 ± 0,05 7,26 ± 1,41 Te 1+Q+U 3,85 ± 0,15 8,72 ± 6,07 Te 2 3,96 ± 0,04 4,56 ± 0,61 Te 2+Q 4,05 ± 0,03 3,62 ± 0,08 Te 2+Q+U 3,98 ± 0,01 3,77 ± 0,03 M 3,29 ± 0,06 6,28 ± 0,08 M+Q 3,31 ± 0,01 6,41 ± 0,05 M+Q+u 3,32 ± 0,03 6,36 ± 0,08 Te 1, Tempranillo de Corugo; Te1+Q, Tempranillo de Corugo + tanino de Quebracho; Te1+Q+U, Tempranillo de Corugo + tanino de Quebracho+ tanino de uva. Te 2, Tempranillo de Igea; Te 2+Q, Tempranillo de Igea+ tanino de Quebracho; Te 2+Q+U, Tempranillo de Igea+ tanino de Quebracho+ tanino de uva. M, mezcla de Tempranillo y Garnacha; M+Q , mezcla de Tempranillo y Garnacha+ tanino de Quebracho; M+Q+U , mezcla de Tempranillo y Garnacha+ tanino de Quebracho+ tanino de uva. Sin embargo, en este caso podemos observar que no hay grandes cambios ni en el pH ni en la acidez total, exceptuando los vinos picados. En las gráficas 2 y 3 se muestra la evolución del pH y la acidez total de las muestras desde el final de la fermentación alcohólica hasta el final de la fermentación maloláctica. 21 GRÁFICA 2. EVOLUCIÓN PH. GRÁFICA 3. EVOLUCIÓN ACIDEZ TOTAL. Se ve claramente que el pH disminuye ligeramente o permanece prácticamente constante en todas las muestras. En cuanto a la acidez total, se aprecia un gran incremento en las muestras picadas, aquellas procedentes de Tempranillo de Corugo (Te 1). También se observa un aumento de la acidez total en la muestra control del Tempranillo de Igea (Te 2), que indica un inicio de la producción de acético, confirmado también por el aroma que desprende. En el resto de muestras, la acidez total apenas varía o disminuye ligeramente. Esto nos indica, que la fermentación maloláctica apenas ha tenido lugar en esta fase. Con los análisis de ácido málico realizados, expuestos en la tabla 5, podemos afirmar con casi toda seguridad, que la fermentación maloláctica tuvo lugar de forma simultánea con la fermentación alcohólica. TABLA 3. DETERMINACIÓN DE ÁCIDO MÁLICO Antes FML Después FML TE 1a 0,058 0,059 TE 2b 0,067 0,014 Ma + Q 0,974 0,045 Te 1a, Tempranillo de Corugo, réplica a; Te 2b, Tempranillo de Igea, réplica b; Ma +Q, mezcla de Tempranillo y Garnacha + tanino de quebracho, réplica a.  Vino final: 3 3,2 3,4 3,6 3,8 4 4,2 4,4 FA FML Te 1 Te 1+Q Te 1+Q+U Te 2 Te 2+Q Te 2+Q+U M M+Q M+Q+u 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 FA FML Te 1 Te 1+Q Te 1+Q+U Te 2 Te 2+Q Te 2+Q+U M M+Q M+Q+u 22 Como quedó expuesto en el apartado de metodología, una vez transcurrida la fermentación maloláctica, se procedió al embotellado final y se añadió sulfuroso, dando lugar así al vino final. Tras las determinaciones pertinentes se verificó que el contenido de sulfuroso total en los vinos, estaba dentro de los límites establecidos, 160 mg/L (Flanzy, C., 2003). TABLA 4.MEDIAS DE LOS RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS AL VINO FINAL. pH Acidez total (g/L) Sulfuroso (mg/L) Libre Combinado Total Te 1 3,67 ± 0,04 14,63 ± 1,59 6,40 ± 9,05 115,20 ± 31,68 121,60 ± 40,73 Te 1+Q 3,89 ± 0,20 9,11 ± 7,37 17,60 ± 6,79 94,40 ± 70,14 112,00 ± 76,93 Te 1+Q+U 3,64 ± 0,05 17,33 ± 1,59 28,80 ± 9,05 124,80 ± 36,20 153,60 ± 45,25 Te 2 3,94 ± 0,11 7,16 ± 0,27 6,40 ± 0,00 6,40 ± 2,26 12,80 ± 2,26 Te 2+Q 4,14 ± 0,05 3,64 ± 0,05 8,00 ± 2,26 4,80 ± 2,26 12,80 ± 0,00 Te 2+Q+U 4,06 ± 0,01 3,75 ± 0,11 12,80 ± 9,05 5,60 ± 3,39 18,40 ± 5,66 M 3,38 ± 0,01 5,93 ± 0,00 5,60 ± 5,66 16,00 ± 9,05 21,60 ± 14,71 M+Q 3,36 ± 0,01 6,15 ± 0,00 3,20 ± 0,00 9,60 ± 9,05 12,80 ± 9,05 M+Q+u 3,39 ± 0,00 6,08 ± 0,11 12,80 ± 9,05 17,60 ± 11,31 30,40 ± 20,36 Te 1, Tempranillo de Corugo; Te1+Q, Tempranillo de Corugo + tanino de Quebracho; Te1+Q+U, Tempranillo de Corugo + tanino de Quebracho+ tanino de uva. Te 2, Tempranillo de Igea; Te 2+Q, Tempranillo de Igea+ tanino de Quebracho; Te 2+Q+U, Tempranillo de Igea+ tanino de Quebracho+ tanino de uva. M, mezcla de Tempranillo y Garnacha; M+Q , mezcla de Tempranillo y Garnacha+ tanino de Quebracho; M+Q+U , mezcla de Tempranillo y Garnacha+ tanino de Quebracho+ tanino de uva. 5.2. ANÁLISIS DEL COLOR Y DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Un aspecto que presenta una importancia capital para la elaboración de vinos de calidad es el grado de maduración de la uva. En este sentido es necesario señalar que el proceso de maduración influye no solo sobre la concentración de azúcares y de ácidos en las bayas, sino que también ejerce un gran efecto sobre las moléculas responsables del color y sobre otros muchos aspectos que condicionan en definitiva, la calidad del vino (Zamora, 2003). 29 6. CONCLUSIONES El color del vino es uno de los aspectos más importantes del vino, ya que condiciona al consumidor sobre la calidad de este. Consiguientemente el aumento del color produce un aumento en la calidad, pero también puede dar lugar a un aumento en los beneficios de la empresa. Los resultados obtenidos en el presente estudio nos conducen a afirmar que sólo la adición de taninos de Quebracho en combinación con tanino de uva, tienen un efecto positivo en el color del vino, aumentando la intensidad de éste frente al control y frente a la muestra con tanino de Quebracho, sin embargo, no se apreciaron ningunas diferencias significativas en el índice de polifenoles totales o la concentración de taninos y antocianos. Esto podría ser interesante, ya que la adición no modifica la composición de compuestos fenólicos pero sí proporciona una estabilidad en el color. Cabe destacar que las adiciones se llevaron a cabo en las concentraciones recomendadas por el fabricante, pero no se tuvieron en cuenta los posibles cambios organolépticos producidos como fruto de dicha combinación, tales como el aumento de la dureza y astringencia del vino. Por otro lado, también podemos concluir, que la adición única de tanino de Quebracho en las concentraciones recomendadas por el fabricante, no tiene ningún efecto significativo en el color del vino. Por lo que la práctica, tan extendida, de añadir tanino exógeno sin un estudio previo con el objeto de mejorar las características del vino, es inútil y con un coste económico elevado para la empresa. En el ensayo realizado en el vino procedente del Tempranillo de Corugo (Te 1), no se observó ninguna diferencia significativa en la intensidad de color en la fase final de la elaboración del vino (una vez añadido SO2), sin embargo si se produjo una diferencia significativa en la concentración de antocianos en esta etapa. No obstante, si se produjeron diferencias significativas tras la fermentación maloláctica en intensidad de color, índice de polifenoles totales y concentración de taninos. Este diferencia de resultados en ambas etapas, puede deberse al cambio desigual de pH debido al picado del vino. Hemos de tener en cuenta que los antocianos presentan un equilibrio en función del pH entre formas químicas diferentes, lo que condiciona enormemente su color. Como podemos observar en la gráfica 7, el resto de las muestras siguen una 30 evolución más o menos similar respecto a las otras muestras de la misma naturaleza. Por ello, podría decirse que este ensayo no es concluyente, ya que al estropearse el vino por la acción de bacterias acéticas, existen variaciones que están fuera de nuestro alcance, y por lo tanto no comparables. GRÁFICA 7. EVOLUCIÓN DEL pH Al mismo tiempo, cabe recordar que los taninos tienen un efecto antiséptico. En nuestro caso, queda reflejado en la gráfica 1 que parece haber un retraso del crecimiento bacteriano en la muestra en la que se adicionó tanino de Quebracho y tanino de uva. Por otra parte, parece que la acción antiséptica más estable a lo largo del proceso fue la adición únicamente de tanino de quebracho (gráfica 8). Por consiguiente, sería interesante abrir una nueva vía de investigación para corroborar la capacidad antiséptica de estos taninos. GRÁFICA 8. EVOLUCIÓN pH Y ACIDEZ TOTAL. 31 Como conclusión final, queda demostrado el aumento de la intensidad del color en vino tinto, adicionando de forma combinada tanino de Quebracho y tanino de uva en la fase pre-fermentativa y en la fase post-fermentativa, respectivamente. CONCLUSIONS The wine color is one of the most important aspects of wine, because it affects the consumer about its quality. Accordingly color enhancing produces an increase in the quality, but also can result in an increase in profits of the company. The results obtained in the present study lead us to say that only Quebracho tannin addition in combination with grape tannins have a positive effect on the color of wine, increasing its intensity versus the control and the sample with only quebracho tannin. However, no significant differences were observed in the total polyphenol index or in the concentration of total tannins and anthocyanins. This might be interesting, since the addition does not modify the phenolic composition but provides color stability. Note that the additions were carried out at concentrations recommended by the manufacturer, but any possible sensory changes produced, such as increased hardness and wine astringency were not taken into account. On the other hand, we can also conclude that the unique addition of quebracho tannin in concentrations recommended by the manufacturer does not have any significant effect on wine color. So widespread practice of adding exogenous tannin without a prior study in order to improve the characteristics of the wine is useless and has a high economic cost to the company. In the trial conducted in the wine from the Tempranillo Corugo (Te 1), no significant difference in the intensity of color in the final phase of wine making (once added SO2 ) was showed. However there was a significant difference in anthocyanin concentration at this stage. Nevertheless, there were significant differences after malolactic fermentation in color intensity, total polyphenol index and concentration of total tannins. This 32 difference results in both stages may be caused by the unequal pH change due the wine turned sour. Just keep in mind that anthocyanins have a pH-dependent equilibrium between different chemical forms which greatly affects its color (Zamora, 2003). As seen in Graph 7, the rest of the samples follow a roughly similar evolution compared to the other samples of the same nature. So it could be said that this test is not conclusive because of the damage in the wine by the action of acetic acid bacteria, there are variations that are beyond our control, and therefore not comparable. At the same time remember that tannins have an antiseptic effect. In our case, is reflected in Figure 1 that appears to be a delay of bacterial growth in the sample that was added quebracho tannin and grape tannin. Moreover, it seems that the more stable antiseptic action along the process was the addition of only quebracho tannin (Graph 8). Therefore it would be interesting to open a new research pathway to corroborate these tannins antiseptic ability. As a final conclusion it is demonstrated an increase of color intensity in red wine adding both tannin in combination: quebracho tannin and grape tannin in the pre - fermentation and post -fermentation phase, respectively. 33 7. IDENTIFICACIÓN DE LAS APORTACIONES QUE EN MATERIA DE APRENDIZAJE, HAN SUPUESTO LA REALIZACIÓN DE ESTA ASIGNATURA 1. Capacidad de autogestión del tiempo de trabajo: debido a mi situación personal (participación en el programa Erasmus en el segundo cuatrimestre) he tenido que gestionar y sacar el máximo partido al tiempo disponible para la realización de la parte técnica de este proyecto, puesto que tenía que compatibilizar las horas de laboratorio con clase, trabajos, exámenes, etc. 2. Capacidad de trabajo en un laboratorio: las horas empleadas en el laboratorio me han ayudado a trabajar con seguridad y soltura. 3. Aprendizaje en cuanto a búsqueda de documentos científico-técnicos y capacidad de síntesis se refiere: Como en cualquier trabajo de investigación, he tenido que recurrir a bibliotecas y a numerosas bases de datos, leyendo, comprendiendo y extrayendo lo relevante para este trabajo. Con ello, mi comprensión de textos científicos ha mejorado notablemente. 4. Mejora en la estructuración, desarrollo y expresión en textos escritos. Un trabajo de este calibre, requiere una buena estructuración. Con la ayuda de mi tutora he aprendido la importancia de una buena estructura y de escribir únicamente la información relevante a la hora de elaborar un proyecto. Considero además, que mi expresión escrita al elaborar textos científicos también se ha visto mejorada. 5. Aumento de mi seguridad personal como futura científica y tecnóloga de alimentos: ahora sé con total certeza, que si en el futuro tengo que realizar un trabajo de investigación ya sea en la universidad o en una empresa, podré afrontarlo sin problemas. 8. EVALUACIÓN DE LA ASIGNATURA Y SUGERENCIAS DE MEJORA Considero esta asignatura necesaria y sobre todo muy positiva para el alumno. Como he expuesto en el apartado anterior, la realización de este trabajo me ha aportado seguridad en mi misma como profesional y a la vez, me ha hecho una persona más competente. Sin embargo, sugiero un aumento de los ECTS de esta asignatura, ya que no se corresponden con las horas reales de trabajo. 34 9. BIBLIOGRAFÍA 1. Adams, D.O., & Scholz, R.C., 2007. Tannins – the problem of extraction. In 13thAustralian Wine industry technical conference (pp. 160-164). Adelaide: the Australian Wine industry technical conference Inc. 2. Aleixandre, J. L., Álvarez. I., 2003. Tecnología enológica. Ed. Síntesis. 3. Bate-Smith, E.C., 1977. Astringent tannins of Acer species. Phytochemistry, 16 (9), 1421-1426. 4. Bautista-Ortín, A. B., Fernandez-Fernandez, J.I., López-Roca, J.M., & Gómez-Plaza, E., 2007. The effects of enological practices in anthocyanins, phenolic compounds and wine colour and their dependence on grape characteristics. Journal of Food Composition and Analysis, 20(7), 546-552. 5. Downey, M. O., Dokoozlian, N. K., & Kistic, M.P., 2006. Cultural practice and environmental impacts on the flavonoid composition of grapes and wine: A review of recent research. 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Zamora Marín, F., 2003. Elaboración y crianza del vino tinto: Aspectos científicos y prácticos. Ediciones Mundi-Prensa. 34. Zoecklein, B.W., Fugelsang, K.C., Gump, B.H., Nury, F.S., 2001. Análisis y producción de vino. Editorial Acribia, S.A., Zaragoza, España. 37 10. ANEXO I Tabla 7. ANOVA Tempranillo de Corugo (Te 1) Muestra Origen de las variaciones Suma de cuadrados gl Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Az FA Entre grupos 0,003 2 0,002 0,003 0,997 9,552 Dentro de los grupos 1,685 3 0,562 Total 1,688 5 pH FA Entre grupos 0,026 2 0,013 22,057 0,016 9,552 Dentro de los grupos 0,002 3 0,001 Total 0,027 5 At FA Entre grupos 19,763 2 9,882 90,240 0,002 9,552 Dentro de los grupos 0,329 3 0,110 Total 20,092 5 Av FA Entre grupos 12,189 2 6,094 802,853 0,000 9,552 Dentro de los grupos 0,023 3 0,008 Total 12,211 5 Alc FA Entre grupos 15,960 2 7,980 2,200 0,258 9,552 Dentro de los grupos 10,880 3 3,627 Total 26,840 5 Tan FA Entre grupos 0,135 2 0,068 0,259 0,787 9,552 Dentro de los grupos 0,784 3 0,261 Total 0,919 5 Ant FA Entre grupos 21175,911 2 10587,956 2,738 0,211 9,552 Dentro de los grupos 11602,664 3 3867,555 Total 32778,576 5 IPT FA Entre grupos 160,843 2 80,422 1,647 0,329 9,552 38 Muestra Origen de las variaciones Suma de cuadrados gl Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Dentro de los grupos 146,530 3 48,843 Total 307,373 5 Col FA Entre grupos 1,173 2 0,586 0,202 0,827 9,552 Dentro de los grupos 8,693 3 2,898 Total 9,866 5 pH FML Entre grupos 0,023 2 0,012 1,192 0,416 9,552 Dentro de los grupos 0,030 3 0,010 Total 0,053 5 At FML Entre grupos 17,496 2 8,748 0,541 0,630 9,552 Dentro de los grupos 48,473 3 16,158 Total 65,968 5 Tan FML Entre grupos 1,050 2 0,525 11,489 0,039 9,552 Dentro de los grupos 0,137 3 0,046 Total 1,187 5 Ant FML Entre grupos 24320,333 2 12160,167 4,421 0,128 9,552 Dentro de los grupos 8251,523 3 2750,508 Total 32571,857 5 IPT FML Entre grupos 612,063 2 306,032 36,360 0,008 9,552 Dentro de los grupos 25,250 3 8,417 Total 637,313 5 Col FML Entre grupos 33,405 2 16,702 23,517 0,015 9,552 Dentro de los grupos 2,131 3 0,710 Total 35,535 5 pH FINAL Entre grupos 0,078 2 0,039 2,717 0,212 9,552 Dentro de los grupos 0,043 3 0,014 Total 0,121 5 45 Muestra Origen de las variaciones Suma de cuadrados gl Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Dentro de los grupos 19025,781 3 6341,927 Total 43198,094 5 IPT FA Entre grupos 128,143 2 64,072 1,335 0,385 9,552 Dentro de los grupos 144,005 3 48,002 Total 272,148 5 Col FA Entre grupos 12,273 2 6,136 4,288 0,132 9,552 Dentro de los grupos 4,293 3 1,431 Total 16,566 5 pH FML Entre grupos 0,001 2 0,001 0,386 0,709 9,552 Dentro de los grupos 0,005 3 0,002 Total 0,006 5 At FML Entre grupos 0,017 2 0,009 1,682 0,324 9,552 Dentro de los grupos 0,015 3 0,005 Total 0,033 5 Tan FML Entre grupos 0,495 2 0,247 6,860 0,076 9,552 Dentro de los grupos 0,108 3 0,036 Total 0,603 5 Ant FML Entre grupos 8324,130 2 4162,065 3,790 0,151 9,552 Dentro de los grupos 3294,102 3 1098,034 46 Muestra Origen de las variaciones Suma de cuadrados gl Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Total 11618,232 5 IPT FML Entre grupos 112,443 2 56,222 2,547 0,226 9,552 Dentro de los grupos 66,230 3 22,077 Total 178,673 5 Col FML Entre grupos 6,714 2 3,357 1,847 0,300 9,552 Dentro de los grupos 5,453 3 1,818 Total 12,167 5 pH FINAL Entre grupos 0,001 2 0,001 18,500 0,021 9,552 Dentro de los grupos 0,000 3 0,000 Total 0,001 5 At FINAL Entre grupos 0,052 2 0,026 7,000 0,074 9,552 Dentro de los grupos 0,011 3 0,004 Total 0,064 5 Tan FINAL Entre grupos 0,147 2 0,074 1,594 0,338 9,552 Dentro de los grupos 0,139 3 0,046 Total 0,286 5 Ant FINAL Entre grupos 2403,297 2 1201,648 1,729 0,317 9,552 Dentro de los grupos 2084,414 3 694,805 Total 4487,711 5 IPT FINAL Entre grupos 67,170 2 33,585 4,537 0,124 9,552 47 Muestra Origen de las variaciones Suma de cuadrados gl Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Dentro de los grupos 22,205 3 7,402 Total 89,375 5 Col FINAL Entre grupos 57,299 2 28,650 14,547 0,029 9,552 Dentro de los grupos 5,908 3 1,969 Total 63,208 5 SO2 L FINAL Entre grupos 99,840 2 49,920 1,315 0,389 9,552 Dentro de los grupos 113,920 3 37,973 Total 213,760 5 SO2 C FINAL Entre grupos 71,680 2 35,840 0,368 0,719 9,552 Dentro de los grupos 291,840 3 97,280 Total 363,520 5 SO2 T FINAL Entre grupos 309,760 2 154,880 0,652 0,582 9,552 Dentro de los grupos 712,960 3 237,653 Total 1022,720 5 FA, Fermentación alcohólica; FML, Fermentación maloláctica. Az, azúcares reductores; At, Acidez total; Av, acidez volátil; Alc, grado alcohólico; Tan, taninos; Ant, antocianos; IPT, índice de polifenoles totales; Col, color; SO2 L, SO2 libre; SO2 C, SO2 combinado; SO2 T, SO2 total 48