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1 TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DPTO. DE PRODUCCIÓN ANIMAL Y CIENCIA DE LOS ALIMENTOS FACULTAD DE VETERINARIAUNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Caracterización de las Proteínas de la Membrana del Glóbulo Graso de Vaca y Oveja y de sus Hidrolizados Fco Javier Fraguas Lasheras Trabajo Fin de Máster Tutora: Lourdes Sánchez Paniagua. Máster Universitario en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Curso 2012/2013. 3 En este trabajo han contribuido más personas de las que figuran en la portada, que, aún sin ser autores su participación ha sido determinante. En primer lugar a mis jefas Lourdes y Dolores, por acogerme en su grupo, enseñarme y darme el apoyo que he necesitado todo este tiempo (la palabra “jefas” está puesta como halago). Quiero agradecer a Miguel que siempre ha estado, está y estará en su despacho para cualquier duda que pueda tener el día de mañana. Mandar un muchas gracias a Saidu, Dani R., Mercedes, José Antonio y a los exiliados Dani V. y Cristina, me han echado una mano decolorando innumerables geles, y han contribuido, con los demás becarios del Área y mis amigos de mis pueblos, a hacerme trabajar de buen humor. AGRADECIMIENTOS En último lugar, sin más ni menos importancia que a los demás, mostraré mi agradecimiento a mis padres; por enseñarme que el trabajo es la única forma de hacer las cosas, a mi hermana y también a Amaia porque siempre han confiado en mí. Quiero compartir con todos ellos los éxitos que deriven de este trabajo. Este trabajo ha sido financiado por el proyecto AGL2010-20835 Estudio de las proteínas con actividad defensiva presentes en el lactosuero y en la membrana del glóbulo graso de la leche de vaca y oveja para su utilización en alimentos funcionales Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras I. Resumen 4 I. Resumen 6 ÍNDICE 1. Resumen 6 2. Summary 6 II. Introducción 7 1. Interés del estudio 7 2. Composición y biosíntesis de la leche 8 3. La fracción grasa de la leche 9 a. Membrana del glóbulo graso de la leche (MFGM) 9 b. Proteínas de la MFGM 10 1. La butirofilina 10 2. Otras proteínas de la MFGM 11 c. Métodos de aislamiento de las proteínas de la MFGM 13 4. Producción y aprovechamiento del buttermilk 15 III. Objetivos del estudio 15 IV. Materiales y Métodos 16 1. Obtención de las proteínas de la MFGM 17 a. Preparación de las muestras 17 b. Fase de lavado 18 c. Fase de extracción 18 d. Fase de optimización 19 2. Caracterización de las proteínas de la MFGM por electroforesis 20 a. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) 1. SDS-PAGE en Phast System 20 2. SDS-PAGE en Miniprotean Biorad 20 b. Electroforesis en dos dimensiones (2D) 21 1. Primera dimensión: Isoelectroenfoque 21 2. Segunda dimensión: SDS-PAGE 22 3. Obtención de anticuerpos frente a butirofilina y evaluación de estos a. Inmunización 23 b. Obtención de los antisueros 23 c. Titulación de los antisueros: ELISA no competitivo indirecto d. Determinación de la concentración de butirofilina por ELISA competitivo 24 e. Western-blotting 25 4. Digestión gástrica in vitro 26 a. Hidrólisis con pepsina 26 b. Determinación de proteína por BCA 28 c. Determinación del grado de hidrólisis (DH) mediante TNBS 5. Ensayo de actividad antimicrobiana 29 V. Resultados y Discusión 29 1. Caracterización de las proteínas de la MFGM 32 2. Obtención y caracterización de anticuerpos policlonales frente a la butirofilina 37 a. Determinación de la concentración de butirofilina bovina mediante ELISA competitivo 39 3. Digestión gástrica y caracterización cualitativa y cuantitativa de los hidrolizados de buttermilk (BM) y butterserum (BS) 40 Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras I. Resumen 5 a. Digestión gástrica de los buttermilk obtenidos a partir de nata cruda de vaca y oveja 40 b. Digestión de los buttermilk comerciales 42 1. Digestión de α-BM 43 2. Digestión de β-BM 44 3. Digestión de W-BM 45 4. Digestión de M-BM 47 c. Análisis por Western-blotting de los hidrolizados de BM de vaca 4. Ensayo antibacteriano de un hidrolizado de BM de vaca 49 VI. Conclusiones 52 VII. Bibliográficas 53 Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras I. Resumen 6 I. RESUMEN Y SUMMARY La leche contiene componentes bioactivos, entre ellos diversas proteínas, para los que se han identificado varias actividades de interés para la salud humana. En este trabajo se ha abordado el estudio de las proteínas de la membrana del glóbulo graso de la leche (MFGM), a las que se atribuyen propiedades tecnológicas y biológicas. Debido a su baja concentración y a su localización, estas proteínas son difíciles de aislar, por ello, en este Trabajo Fin de Máster, se han estudiado varias estrategias de extracción para diferentes muestras lácteas, como nata de oveja y de vaca, y sueros de mantequilla de vaca (buttermilk) comerciales en polvo. Además, se han analizado los extractos obtenidos por SDS-PAGE tanto para caracterizarlos, como para aislar alguna de las proteínas mayoritarias, en concreto la butirofilina, y producir anticuerpos policlonales frente a ella. Utilizando estos anticuerpos se ha puesto a punto un ELISA competitivo y se ha estimado el contenido de butirofilina en buttermilk obtenido de nata cruda de vaca y en los buttermilk comerciales. Con el fin de completar el estudio de caracterización, los extractos enriquecidos en proteínas de la MFGM se han sometido a electroforesis en dos dimensiones, habiéndose identificado algunos spots por técnicas proteómicas. Asimismo, los buttermilk se han sometido a un proceso de digestión gástrica in vitro y se han caracterizado los hidrolizados por electroforesis y se ha determinado el grado de hidrólisis por un método colorimétrico. Por último, se han realizado unos experimentos preliminares para evaluar la actividad antibacteriana de los hidrolizados frente a Cronobacter sakazakii, con resultados muy prometedores, ya que se ha observado inhibición del crecimiento. I.1. Resumen Milk contains many bioactive components, among them several proteins, having been identified many beneficial activities for them. In this work, proteins of the milk fat globule membrane (MFGM) have been studied due to the interest of their technological and biological properties. The proteins of the MFGM are present in very low concentration, and some are integrated in the membrane; both conditions make their extraction very difficult. Therefore, in this Final Master’s Project different strategies of extraction have been assayed for several samples, such as sheep’s and cow’s cream, and commercial cow’s buttermilks. The extracts obtained enriched in MFGM proteins were I.2. Summary Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras I. Resumen 7 analyzed by SDS-PAGE, in order to characterize them and also to isolate the butyrophilin, one of the major proteins, and produce polyclonal antibodies against it. Those antibodies have been used to develop a competitive ELISA to estimate the butyrophilin content in buttermilk obtained from raw cow’s and sheep’s cream and in commercial buttermilks. Milk samples enriched in MFGM proteins were studied in twodimensional electrophoresis in order to complete their characterization, some spots being identified by proteomic techniques. The buttermilks were subjected to in vitro gastric digestion with pepsin, and the hydrolysates were characterized by electrophoresis and their hydrolysis degree was estimated by a colorimetric method. Finally, some preliminary experiments have been carried out in order to evaluate the antibacterial activity of the hydrolysates from buttermilk against Cronobacter sakazakii, those experiments giving promising results as growth inhibition was observed. II. INTRODUCCIÓN En las últimas décadas se ha generado un gran interés por conocer con mayor profundidad los componentes bioactivos de la leche con el fin de poder utilizarlos eventualmente como ingredientes de alimentos que posean no sólo un valor nutritivo, sino también un valor funcional. Entre estos componentes bioactivos existe un grupo de factores protectores frente a agentes causantes de infecciones. De hecho, los recién nacidos alimentados con lactancia natural tienen, en general, menor incidencia de procesos gastrointestinales que los alimentados con leches de fórmula, debido posiblemente a la acción de los oligosacáridos y las glicoproteínas de la leche materna (1). Aunque se han estudiado extensamente algunas de las proteínas solubles del lactosuero con actividad antibacteriana, como la lactoferrina, todavía quedan muchos aspectos por conocer acerca de algunas proteínas minoritarias, como las proteínas de la membrana del glóbulo graso (MFGM, del inglés milk fat globule membrane) para algunas de las cuales también se ha propuesto una actividad frente a agentes patógenos. Por ello, en este Trabajo Fin de Master (TFM) nos planteamos la puesta a punto de herramientas para el estudio de estas proteínas, pues debido a su actividad biológica podrían aportar un valor añadido a ciertos productos. II.1 Interés del estudio Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras II. Introducción 8 La MFGM es una fuente importante de proteínas bioactivas. Está organizada en tres capas y es una compleja mezcla de proteínas, lípidos neutros y lípidos polares, como los fosfolípidos y los glicoesfingolípidos (2). Además de participar en la estructura y la protección de la grasa del glóbulo, algunos estudios han propuesto para dichas proteínas una actividad antitumoral en líneas celulares establecidas, así como una actividad antibacteriana y antiviral (3, 4). La leche es un líquido secretado por la glándula mamaria de las hembras de los mamíferos tras el nacimiento de sus crías, destinada a la alimentación de éstas en su primera etapa de la vida. Este líquido consiste en una emulsión formada por glóbulos grasos en una solución de sales minerales, azúcares, proteínas del lactosuero, en la que se encuentran las caseínas en una suspensión coloidal. II.2 Composición y biosíntesis de la leche La leche es un fluido complejo cuya composición y propiedades físicas varían de una especie a otra, incluso dentro de una especie las diferentes razas tienen distinta composición de la leche y ésta también varía a lo largo del periodo de lactación, en función de las necesidades de las crías. El constituyente mayoritario de la leche es el agua y contiene cantidades variables de lípidos, proteínas y carbohidratos, que se sintetizan en la glándula mamaria en mayor o menor grado según las especies. También se encuentran en la leche pequeñas cantidades de minerales, vitaminas y otros componentes lipo e hidrosolubles que proceden directamente del plasma sanguíneo, proteínas sanguíneas e intermediarios de la síntesis mamaria (5). Tabla 1: Composición de la leche de vaca y oveja según Park et al. (34) La leche es sintetizada en la glándula mamaria, y más concretamente en los alveolos mamarios. Por la sangre circulan los metabolitos que van a constituir las biomoléculas de la leche, que son absorbidos por las células basales, las cuales separan el lumen de los conductos sanguíneos y linfáticos. Tras la absorción de los metabolitos se producen los componentes de la leche en el retículo endoplasmático. Por último el Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras II. Introducción 9 aparato de Golgi se encarga del transporte desde la fase acuosa de la célula al lumen, la liberación de la biomolécula se produce por fusión del aparato de Golgi con la membrana plasmática apical, tras lo cual se vierten los componentes de la fase acuosa al lumen. La fase lipídica también se sintetiza en el retículo endoplasmático y se agrupa en el citoplasma en forma de gotitas. Las gotitas se mueven hacia la membrana plasmática apical y pasan al lumen por pinocitosis. En este proceso las gotitas adquieren una capa de membrana plasmática que las recubre, que constituye la MFGM. En el lumen alveolar se completa la síntesis de lactosa y la glicosilación y fosforilación de las proteínas (5). La leche de la mayoría de los mamíferos contiene entre un 3 y un 7% de grasa, la cual está distribuida en forma de diminutos glóbulos de grasa que forman una emulsión. Los glóbulos grasos de la leche consisten básicamente en un núcleo de triglicéridos, rodeado de la MFGM. II.3 La fracción grasa de la leche II.3.a Membrana del glóbulo graso de la leche (MFGM) La MFGM se compone de proteínas, fosfolípidos, lípidos neutros, enzimas y otros componentes minoritarios, siendo una importante fuente de proteínas bioactivas. Dicha membrana, que procede del proceso de pinocitosis como se ha explicado anteriormente, actúa como un agente emulsificante natural, previniendo la coalescencia de los glóbulos grasos y protegiendo a la grasa de la degradación enzimática. La MFGM se ve muy afectada por los tratamientos tecnológicos de la leche, tales como el tratamiento con calor, el frío, la homogeneización, la evaporación o la liofilización (6). Se ha demostrado que algunas proteínas y lípidos de la MFGM poseen propiedades funcionales y beneficiosas para la salud (7). Además, en este TFM también se han analizado los productos de hidrólisis de estas proteínas, puesto que hay estudios previos en los que se ha demostrado que ciertas actividades biológicas de las proteínas lácteas, como la antibacteriana, antivírica o antitumoral, se incrementan en los péptidos derivados de ellas respecto a las proteínas íntegras, como para la lactoferrina (8). La MFGM está formada por tres capas diferentes; desde el núcleo del glóbulo graso hacia el exterior se encuentra, una primera monocapa lipídica originaria del Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 16 El esquema que sigue este apartado se corresponde con los objetivos de este TFM, primero se expondrán los métodos para la extracción y caracterización de las fracciones enriquecidas en las proteínas de la MFGM, después los métodos para la obtención y evaluación de un antisuero policlonal obtenido en conejo frente a la butirofilina y por último, los métodos para llevar a cabo la hidrólisis de los diferentes productos derivados de los buttermilk, así como para la caracterización y evaluación de la actividad de estos hidrolizados. El proceso para la obtención de las proteínas de la MFGM se compone de dos etapas básicas: lavado y extracción por precipitación. Si las muestras iban a ser sometidas a una electroforesis en 2D (2DE) se incluía una tercera etapa de precipitación con solventes orgánicos a -20ºC. IV.1 Obtención de las proteínas de la MFGM IV.1.a Preparación de las muestras En este TFM se utilizaron dos tipos de derivados lácteos enriquecidos en proteínas de la MFGM: productos comerciales en polvo derivados de suero de mantequilla de vaca o buttermilk y otros procedentes de nata de leche cruda de vaca y oveja. La preparación de la muestra fue diferente en función de su naturaleza. • Los buttermilk comerciales se disolvieron a razón de 1 g en 10 ml de agua miliQ, a 37ºC durante 2 horas, dejándose en agitación 2 horas más a temperatura ambiente. Tras esta etapa permanecieron a 4°C, generalmente durante una noche, hasta la siguiente etapa. Previamente a la fase de lavado, las muestras se centrifugaron a 4200 g durante 25 min a 4ºC, obteniendo una fase líquida blanquecina superior y una fase sólida, blanca y granular en la parte inferior, continuándose los experimentos con esta última fase. La muestra M-BM, tras la centrifugación dio lugar a una fase grasa por encima de la fase líquida y el precipitado obtenido fue más denso que en las otras muestras. • La grasa de oveja y vaca se obtuvieron de leche cruda suministrada por la quesería Villacorona (El Burgo de Ebro, Zaragoza) tras una centrifugación a 2000 g durante 15 min (4ºC). • El buttermilk se obtuvo mediante el batido, con una batidora Moulinex de tipo doméstico, a partir de nata cruda de vaca previamente lavada, produciéndose Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 17 primero el montado de la nata y después, la inversión de fases que dio lugar a la mantequilla lo que provocó la liberación del buttermilk, que se congeló a -20°C hasta su uso. • La mantequilla obtenida a la vez que el buttermilk en el proceso de batido anteriormente descrito, se sometió a un calentamiento de 40ºC durante 1 hora. Mediante este proceso se generó aceite de mantequilla y se liberó el resto de membranas que habían quedado atrapadas en los gránulos de la mantequilla en un líquido denominado butterserum (BS), que se separó por decantación de la mantequilla. El BS se combinó en algunos casos con el BM y tras centrifugar a 40.000 g durante 1 hora a 4ºC se obtuvo un precipitado pardo que contenía la MFGM. IV.1.b Fase de lavado Esta operación tiene como fundamento eliminar las impurezas de naturaleza proteica, fundamentalmente las caseínas y proteínas del lactosuero, que quedan en la muestra de partida, bien sea grasa de leche o buttermilk en polvo. En primer lugar, se lavó la muestra (grasa en caso de leche o precipitado en el caso de los buttermilk comerciales) con 3 volúmenes de una solución al 0,9% de cloruro sódico (155 mM) a 4ºC durante 40 min. Tras el lavado se centrifugó a 2700 g durante 12 min a 4ºC. Después de la operación de centrifugación: • Para la NO y NV: se obtuvo grasa en la zona superior del tubo quedando la solución de lavado en la zona inferior. Se decantó la fase inferior y se continuó con la superior. • Para la α-BM, β-BM, W-BM y M-BM: se obtuvo un precipitado blanco con el que se continuó tras desechar el sobrenadante. Tras este primer lavado se repitió la operación, realizando el segundo lavado con 5 volúmenes de agua mili-Q. IV.1.c Fase de extracción Las muestras de NO y NV que contenían la MFGM con su estructura íntegra, se llevaron a congelación a -20ºC durante 5 min y se sometieron a una vigorosa agitación en vortex con unos 5 ml de una solución de citrato de sodio al 2% y etanol al 5%. Tras Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 18 este proceso se obtuvo un líquido blanco espumoso y una grasa más moldeable. De una mezcla de estas dos fases se tomó 1 ml, al que se añadió 1 ml de una solución de Tritón X-100 al 2% o SDS al 2%, dejándose en ultrasonidos durante 15 min. Después se centrifugaron las muestras a 10.000 g durante 10 min a 4ºC, obteniéndose un precipitado blanquecino y un sobrenadante. Los precipitados se disolvieron en los siguientes tampones: • Tampón de electroforesis del Phast System: Tris-HCl 10 mM, pH 8, con EDTA 1 mM cuando las muestras se iban a analizar por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) • Tampón de rehidratación para isoelectroenfoque: 4% CHAPS, urea 7 M, tiourea 2 M y 2% de tampón IPG (GE Healthcare Europe, Freiburg Alemania). Posteriormente, se observó que al tratar las muestras sin la etapa de congelación y sin la solución de citrato-etanol se obtenía un mayor rendimiento. Tras esta experiencia se omitieron los pasos de congelación-agitación con citrato y etanol, y al tratar las muestras con ultrasonidos se utilizó SDS al 2%. Los BM comerciales contenían muchas impurezas para realizar una electroforesis en 2D por lo que hubo que aplicar una última etapa de optimización. IV.1.d Fase de optimización Esta fase se realizó mediante una precipitación con acetona o cloroformo y/o ácido tricloroacético (TCA) en acetona, para la eliminación de contaminantes que pudieran interferir en la visualización de las proteínas de la MFGM. En el caso de la utilización de la solución de acetona y TCA, se utilizaba una muestra líquida, que podía estar constituida por: • Los sobrenadantes obtenidos tras centrifugar (10.000 g, 15 min, 4ºC) las muestras sometidas a ultrasonidos con detergente. • Los precipitados disueltos en el tampón de rehidratación bajo ultrasonidos durante 1 hora. Generalmente, los volúmenes finales fueron de unos 100 µl, salvo para α-BM y M-BM que fueron de 300 µl. A las muestras se les añadió el triple de volumen de acetona o de TCA al 10% en acetona a -20ºC, manteniendo las muestras a dicha temperatura durante al menos 2-3 horas. Tras este tiempo, se observó una suspensión inferior blanca con forma de ovillo de lana, esta mezcla se centrifugó a 10.000 g durante 10 min a 4ºC. La fase grasa Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 19 superior se eliminó junto con la fase líquida intermedia que cubría un precipitado blanco que se conservó. Este precipitado se lavó con acetona para retirar los restos de TCA y se secó al aire o con corriente de nitrógeno. Después, se disolvió el precipitado, bien en el tampón de Phast System (cuando se iba a hacer una SDS-PAGE) o bien en la solución de rehidratación del isoelectroenfoque (cuando se iba a hacer una 2DE), bajo ultrasonidos durante al menos una hora. Tras esta etapa de ultrasonidos, se centrifugó a 10.000 g durante 10 min quedando tres fases: una fase inferior formada por un precipitado e impurezas de naturaleza micelar, una fase intermedia que contenía las proteínas de la MFGM y una fase superior formada por grasa libre. Tras la centrifugación, se dejaron los viales eppendorf en nevera al menos durante 30 min y se tomó el sobrenadante intermedio para realizar la electroforesis en 2D. Para este objetivo se han utilizado dos tipos de electroforesis, una SDS-PAGE y una electroforesis en dos dimensiones (2DE) con isoelectroenfoque en la primera dimensión y SDS-PAGE en la segunda dimensión. La primera caracterización que se realizó con SDS-PAGE tenía como objetivo seleccionar los mejores métodos de extracción de las proteínas de la MFGM y/o comparar las muestras entre sí. La electroforesis en 2D se realizó con el fin de obtener una caracterización más completa de la muestra, puesto que las proteínas se identificaban así por el peso molecular y por el punto isoeléctrico. IV.2 Caracterización de las proteínas de la MFGM por electroforesis IV.2.a Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Es una técnica de separación electroforética de proteínas por peso molecular, y en este trabajo se ha realizado en geles de poliacrilamida de diferentes porcentajes, con SDS y en condiciones reductoras con mercaptoetanol. Esta técnica se llevó a cabo en dos equipos diferentes: • Phast System (Amersham Biosciences, actualmente GE Healthcare) • Miniprotean Biorad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 20 Esta electroforesis se realizó preparando las muestras en la siguiente mezcla: IV.2.a.1 SDS-PAGE en Phast System • 30-50 µl de la muestra de proteínas • 20-40 µl de tampón de electroforesis (Tris-HCL 50 mM, pH 8, 1 mM EDTA) • 5-10 µl de SDS al 25% • 2,5-5 µl de mercaptoetanol Esta mezcla se sometió a 100°C durante 2 min, y mediante un peine se aplicó un volumen de 1 µl de muestra en el gel. Todas las electroforesis fueron realizadas en geles de 7,5% de poliacrilamida. Las condiciones de electroforesis fueron:  Etapa 1:  250 V, 10 mA, 3W Etapa 2:  250 V, 1 mA, 3W 15ºC Etapa 3: 250 V, 10 mA, 3W Para llevar a cabo la electroforesis en este equipo las muestras se disolvieron en el tampón de electroforesis con la siguiente composición: IV.2.a.2 SDS-PAGE en Miniprotean Biorad  3,55 ml de agua mili-Q  1,25 ml de Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8  2,5 ml de glicerol al 30%  2,0 ml de SDS al 10%  0,2 ml de azul de bromofenol A 950 µl de esta solución se le añadieron 50 µl de mercaptoetanol, y esta solución final se mezcló equivolumétricamente con las muestras. El gel estaba compuesto por una zona de stacking gel del 7% de poliacrilamida y otra zona de running gel, del 10%. Para analizar las muestras obtenidas de las hidrólisis se usaron geles comerciales con un gradiente del 4-20 % de poliacrilamida (GE Healthcare). La electroforesis se desarrolló a 100 V hasta que las muestras entraron completamente en la zona de stacking y a 150 V durante el resto de la electroforesis. Estas condiciones se aplicaron cuando se utilizó un solo gel, cuando se realizaron las electroforesis con dos geles se aumentó en un 40% el voltaje. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 21 IV.2.b Electroforesis en dos dimensiones (2D) Este proceso se compone de dos etapas fundamentales: I. Isoelectroenfoque: II. Electroforesis realizada para separar proteínas por su punto isoeléctrico. Para esta prueba se utilizaron tiras comerciales de GE Healthcare de rango de pI de 3-11. SDS-PAGE: Electroforesis que separa proteínas según su tamaño. En esta prueba la muestra se transfirió desde la tira del isoelectroenfoque al gel de poliacrilamida. La muestra se disolvió en el tampón de rehidratación, a 150 µl de muestra se le añadieron 1 mg de DTT y 10 µl de una solución que contenía bromofenol al 0,2% y Tris 0,125 M. De esta mezcla, se distribuyeron 125 µl en forma de minúsculas gotas a lo largo del sarcófago de cerámica donde se iba a llevar a cabo la separación. IV.2.b.1 Primera dimensión: Isoelectroenfoque El gel utilizado en forma de tira de 7 cm con un gradiente de pI de 3-11 se conservaba deshidratado y en congelación, tal como lo suministra la casa comercial. La tira se colocó con el lado del gel boca abajo dentro del sarcófago haciendo contacto con las muestras que se habían depositado en gotitas en toda su longitud. La tira se cubrió con un aceite comercial llamado cover fluid (GE Healthcare) que impide la evaporación de la muestra, y el soporte donde se alojaba el sarcófago se tapó con una cubierta de plástico. El isoelectroenfoque se llevó a cabo en un equipo Multiphor II de la casa Amersham Biosciences. El proceso del isoelectroenfoque se llevó a cabo en dos etapas: A. Rehidratación que tuvo lugar a 20ºC durante 14 horas B. Isoelectroenfoque, que se desarrolló a 50 mA (por cada gel) durante 2 horas Tras el isoelectroenfoque, la tira se sometió a dos etapas de reequilibrado, primero dentro de un tubo que contenía 5 ml de una solución de reequilibrado compuesta por urea 6 M, glicerol al 30%, SDS al 2% y azul de bromofenol con DTT (100 mg en 10 ml), y en segundo lugar se llevó a cabo otra etapa de reequilibrado con la IV.2.b.2 Segunda dimensión: SDS-PAGE Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 22 misma solución anterior (5 ml) pero con iodoacetamida (250 mg en 10 ml). En ambos casos se dejó la tira 15 min en agitación. Tras el reequilibrado se depositó la tira sobre un papel humidificado con agua mili-Q, durante unos 10 min, para que perdiera el exceso de solución de reequilibrado. Después se sumergió en el tampón donde se llevó a cabo la electroforesis, que es una disolución en agua mili-Q de Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, pH 8, con SDS al 0,1%, y se colocó sobre el gel de poliacrilamida (10% ó 12,5%), evitando la formación de burbujas. También se introdujo un cuadradito (de aproximadamente 7 mm) de papel de filtro Whatman 3 mm (Maidstone, Gran Bretaña) impregnado en una solución patrón de pesos moleculares altos, HMW standard, de la casa GE Healthcare. Por último, se selló con agar al 0,5% en el tampón donde se llevó a cabo la electroforesis, dejándose solidificar antes de proceder a la electroforesis. La electroforesis se llevó a cabo a una intensidad de 15 mA hasta que las muestras pasaron de la tira al gel y avanzaron en éste unos milímetros, y a 45 mA hasta el final del proceso. En el caso de realizar la electroforesis con dos geles la intensidad se aumentó en un 40%. Otro de los objetivos de este TFM era la obtención de anticuerpos específicos frente a las proteínas de la MFGM, en concreto frente a la butirofilina, para poder estudiar sus niveles según los tipos de extracción de las MFGM y en las diferentes muestras de buttermilk comerciales. Los anticuerpos también se han utilizado en un Western-blotting para la identificación de la butirofilina en diferentes muestras de hidrolizados. IV.3 Obtención y evaluación de los antisueros frente a butirofilina La obtención y caracterización de los antisueros se ha llevado a cabo en dos etapas: A. Inmunización de los conejos con las proteínas separadas por electroforesis B. Obtención de los antisueros y titulación IV.3.a Inmunización Los procedimientos de inmunización se realizaron bajo el proyecto con licencia PI48/10 aprobado por el Comisión Ética Asesora para la Experimentación Animal de la Universidad de Zaragoza. El cuidado y uso de los animales se llevó a cabo de acuerdo Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 23 con la Normativa española de Protección Animal RD1201/05, de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea 86/609. Se extrajeron varias bandas que correspondían con la butirofilina de un mismo gel de electroforesis, mediante el corte con un bisturí estéril. Estas bandas se trituraron mediante un homogeneizador de vidrio con 0,5 ml de tampón fosfato potásico 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (PBS) estéril y se mantuvieron en congelación hasta su utilización. La inmunización del conejo se realizó según el siguiente protocolo: la muestra que se le inoculó consistía en 0,5 ml de la mezcla obtenida tras triturar las bandas con PBS como se ha descrito, en la primera inmunización mezclándola con 0,5 ml del adyudante de Freund completo (Sigma-Aldrich St. Louis, MI, EE.UU), y en las siguientes inmunizaciones con adyudante de Freund incompleto (Sigma-Aldrich). En ambos casos tras añadir el adyudante al homogeneizado, la emulsión se sometió a ultrasonidos tres veces durante 15 segundos cada vez. La emulsión se inyectó al conejo con una jeringuilla estéril de forma subcutánea, en cinco o seis inoculaciones. A partir de la primera inmunización, cada dos semanas se extrajeron hasta un máximo de 60 ml de sangre mediante una cánula en la vena auricular. A las dos semanas de la extracción se realizó otra inmunización y el ciclo se repitió mensualmente. IV.3.b Obtención de los antisueros La sangre extraída de los conejos se dejó coagular a temperatura ambiente durante varias horas y a continuación se mantuvo una noche a 4°C para una buena retracción del coágulo. Por último, se separó el suero por centrifugación a 1000 g durante 10 min y se congeló a -20°C. IV.3.c Titulación de un antisuero: técnica de ELISA no competitivo indirecto El objetivo de este ensayo es determinar qué dilución del antisuero es la óptima para realizar el ELISA competitivo indirecto, así como evaluar el título de todas las extracciones. Para ello, se recubrieron las placas con 120 μl/pocillo de una solución de 5 μg/ml de las muestras de BM o BS de vaca en tampón carbonato sódico 0,05 M, pH 9,6, y se incubaron a 4ºC durante toda la noche. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 24 Después, se lavaron las placas cinco veces con 300 μl/pocillo de agua destilada. A continuación, las placas se incubaron con 300 μl/pocillo de una solución de ovoalbúmina al 3% (p/v) en tampón fosfato potásico 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (PBS) a temperatura ambiente durante 2 horas, con el objeto de saturar todos los puntos de unión de proteínas de la placa. Después, se lavaron las placas tres veces con agua destilada y se dejaron secar en el caso de que no se fueran a utilizar inmediatamente. Antes de continuar con la siguiente etapa, las placas se lavaron tres veces con PBS conteniendo 0,05% Tween-20 (PBST). Después, se incubaron las placas con 100 μl/pocillo de diferentes diluciones del antisuero frente butirofilina, desde 1/2 hasta 1/215, a 37°C durante 30 min, tras la incubación se lavaron las placas 5 veces con PBST y se incubaron los pocillos con 100 μl/pocillo de una dilución 1/4000 de IgG de cabra anti-IgG de conejo marcadas con peroxidasa (Sigma-Aldrich) en tampón PBS, y se incubaron a 37°C durante 30 min. Tras la incubación con el antisuero se lavaron las placas cinco veces con PBST, se añadieron 100 μl/pocillo de una solución del sustrato comercial (ZEU -Inmunotec, Zaragoza, España) que contiene tetrametilbencidina (TMB) y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. La reacción enzimática se detuvo mediante la adición de 50 μl/pocillo de H2SO4 2 M. Finalmente, se midió la absorbancia de los pocillos a 450 nm en un lector de placas ELISA (Labsystem Multiscan MS, Helsinki, Finlandia) y se representó la relación existente entre la absorbancia y el logaritmo en base 2 de la dilución del suero. IV.3.d Determinación de la concentración de butirofilina por ELISA competitivo Se han realizado dos tipos de ELISA con los anticuerpos obtenidos, un ensayo no competitivo indirecto, y un ensayo competitivo indirecto. Mientras que el primer ensayo tuvo como objetivo demostrar la reactividad del suero, mediante el segundo se pretendía estimar la cantidad de butirofilina en diferentes buttermilk comerciales en polvo y disponer de una técnica para determinar esta proteína en posteriores estudios. Para ello, se realizaron los lavados y las tres primeras etapas como en un ELISA no competitivo: recubrir la placa con BM, incubar con antisuero frente a butirofilina, incubar con antisuero frente a IgG de conejo y revelar con el sustrato. Sólo que en este caso la segunda incubación con el primer antisuero se hizo en competición con Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras IV .Materiales y Métodos 25 diluciones de buttermilk comerciales y diferentes diluciones de BM de vaca como estándares, concretamente, 1/2, 1/5 y 1/10. La otra diferencia de esta técnica, respecto al ELISA no competitivo, es que el blanco se lleva a cabo mediante la incubación del suero frente a la butirofilina sin añadir la muestra de BM. La técnica se calibró incluyendo la curva patrón mediante la diferencia de absorbancia entre el suero incubado sin BM y la medida en las muestras en las que se había incubado el antisuero con las diferentes diluciones de BM. Con esta relación señal de absorbancia-cantidad de butirofilina se interpolaron los valores de absorbancia obtenidos en las medidas de las BM comerciales y se estimó su contenido en butirofilina. IV.3.e Western-blotting Esta técnica permite identificar mediante anticuerpos una proteína en una mezcla proteica sometida a una electroforesis y transferida a una hoja de nitrocelulosa (Biorad). Primero se realizó una SDS-PAGE en el equipo de Biorad como se ha indicado previamente, con la serie de muestras por duplicado. Cuando concluyó la electroforesis, se cortó el gel por la mitad, cada una de las mitades conteniendo la serie completa de muestras, una parte se llevó a tinción con azul de Coomassie y la otra se sometió a la transferencia. Previamente a la finalización de la electroforesis, se cortaron 6 papeles de filtro Whatman 3 mm y uno de nitrocelulosa (Biorad), de tal forma que tuvieran las mismas dimensiones que el gel que se iba a someter a la transferencia y se sumergieron en las siguientes diluciones: • 1 papel Whatman en un tampón Tris-HCl 0,3M pH=10,4 y metanol al 10% • 2 papeles Whatman en un tampón Tris-HCl 25 mM pH=10,4 y metanol al 10% • Papel de nitrocelulosa en agua mili-Q • 3 papeles Whatman en un tampón Tris-HCl 25 mM, glicina 40 mM y metanol al 10% Inmediatamente al terminar la electroforesis, se colocaron en el equipo de transfer (Amersham Biosciences) los papeles, eliminando el exceso de líquido, en el mismo orden que se ha indicado arriba, el gel se situó entre los tres últimos papeles de Whatman y el de nitrocelulosa. La transferencia se llevó a cabo a una intensidad de 52 mA (2,5 mA/cm2 de gel) durante 20 min. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 32 Fig.4: SDS-PAGE en Phast System con geles del 7,5% poliacrilamida en condiciones reductoras; 1: NV homogeneizada; 2: precipitado obtenido con acetona de buttermilk de vaca; 3: α -BM;4: β -BM; 5: MBM; 6: Patrón de alto peso molecular (HMW) Con esta electroforesis se comprueba que la homogeneización provoca una pérdida importante de las proteínas de la MFGM (carrera 1 vs 2). En las muestras de buttermilk comerciales, se observó que en todas ellas se mantienen la mayoría de las proteínas de la membrana del glóbulo graso y especialmente una elevada concentración de butirofilina que se corresponde con una banda entre 53000 y 76000 Da del patrón de pesos moleculares. También se pueden apreciar con bastante nitidez dos bandas de elevado peso molecular que corresponderían con la xantín-oxidasa y la mucina, de aproximadamente 146.000 y 160-200.000, respectivamente. Los dos buttermilk comerciales que presentan más proteínas de la MFGM son el β-BM y el M-BM, aunque también contienen más proteínas contaminantes del lactosuero y caseínas. En la siguiente etapa se intentó mejorar las electroforesis eliminando las impurezas como lípidos, flóculos en suspensión y fosfolípidos, que están presentes en las muestras enriquecidas en proteínas de la MFGM, con el objetivo de analizarlas por electroforesis en 2D. Según las instrucciones del equipo de Biorad se recomendaba una precipitación con acetona, que se comprobó que no era suficientemente eficaz, por lo que se llevó a cabo una precipitación a -18ºC con TCA y acetona. Este procedimiento dio lugar a la formación de un precipitado amarillento que se redisolvió para comprobar la efectividad del procedimiento mediante SDS-PAGE en el equipo de Phast System. Dada la dificultad en la disolución de las proteínas precipitadas, ésta se llevó a cabo con diferentes compuestos como se indica en la Tabla 5 y los resultados obtenidos en la separación se muestran en la electroforesis de la Figura 5. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 33 MUESTRA CARRERA EXTRACCIÓN MUESTRA CARRERA EXTRACCIÓN Nata de oveja 2 Tampón Phast BM vaca ↓acetona y ↓TCA 8 Tampón Phast 3 Urea, CHAPS y DTT 9 Urea, CHAPS y DTT 4 Mezcla 1:1 de 2 y 3 10 Mezcla 1:1 de 8 y 9 Nata de vaca homogeneizada 5 Tampón Phast α-BM ↓CHCl3 y ↓TCA 11 Tampón Phast 6 Urea, CHAPS y DTT 12 Urea, CHAPS y DTT 7 Mezcla 1:1 de 6 y 7 13 Mezcla 1:1 de 11 y 12 Tabla 5: Tratamiento de las diferentes muestras de nata y buttermilk analizadas por electroforesis como se muestra en la Figura 5. Fig. 5: SDS-PAGE en el equipo de Biorad con geles del 10% de poliacrilamida en condiciones reductoras Con esta electroforesis se aprecia que la mejor condición de extracción para las muestras tras la precipitación con TCA es mediante la disolución en tampón de electroforesis del Phast (carreras 2-10), salvo para el α-BM (carreras 11-13). Por otra parte, la muestra en la que más proteínas se han conseguido disolver es el precipitado de BM de vaca (carrera 8). Se planteó un experimento que contemplara varias posibilidades en cada etapa después del lavado para seleccionar el método de extracción más efectivo. Partiendo de una nata lavada de vaca o de oveja, se obtuvieron 24 muestras diferentes; en función de si la nata se sometía a congelación, a agitación para obtener un BM, y de qué fracción se trataba, si la líquida o la sólida del BM. El esquema utilizado fue el siguiente: Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 34 Después, cada fase (A1, A2, A3, B1, B2, y B3) fueron sometidas a un tratamiento con Triton X-100 al 2% con ultrasonidos, y centrifugación. Por lo que se obtuvieron seis muestras, tres muestras A, obtenidas de nata no congelada y tres muestras B, procedentes de nata congelada. Los precipitados y sobrenadantes (Sb) obtenidos se disolvieron en diferentes medios. Las muestras se han denominado con una letra (A o B) y un código de dos cifras, la primera cifra en función de si se agitaba la nata y se trabajaba con la fase líquida o sólida, o si no se agitaba la nata (1, 2 y 3). La segunda cifra indica si ha habido precipitación y el medio de disolución como sigue: (1) muestra disuelta en el tampón del Phast; (2) muestra precipitada con TCA en acetona y disuelta en el tampón del Phast; (3) muestra precipitada con TCA en acetona y disuelta en el tampón de rehidratación. Fig. 6: SDS-PAGE en Biorad con geles del 10% de poliacrilamida en condiciones reductoras de las diferentes muestras obtenidas de nata de oveja La comparación de los perfiles electroforéticos de las diferentes muestras indica que los sobrenadantes (Sb) todavía contienen proteínas de la MFGM disueltas. Las muestras que más proteínas presentaron fueron las que no habían sido agitadas, el grupo Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 35 A3, más concretamente la disuelta en el tampón de electroforesis del Phast, la A31, y el sobrenadante de esta extracción, el (Sb3) también ha sido el sobrenadante que más bandas contenía. De las natas que se sometieron a agitación aparecen más proteínas en la fase sólida A2, y dentro de este grupo en la A21. Se puede concluir que las etapas de agitación y precipitación con TCA hacen que se pierdan proteínas. Las muestras apenas se diferenciaban entre sí por el aspecto de sus precipitados, salvo aquellas que no fueron precipitadas con TCA/acetona que presentaban un color pardo, que se perdía tras la precipitación con TCA, supuestamente debido a que perdían su contenido en fosfolípidos tras este proceso. En la Figura 6 se ha adjuntado una parte de la electroforesis de las muestras congeladas, la correspondiente a la nata no agitada (Sb3, B31, B32, B33). Al comparar todas las A3 con las B3 se observó que las muestras no congeladas contenían más proteínas que las congeladas-descongeladas. En la última etapa de la optimización de un método para la extracción de las proteínas de la MFGM se llevó a cabo una comparación entre un método a menor escala (partiendo de 10 ml de nata) y a mayor escala (partiendo de 30 ml de nata) con la NO y la NV. En este proceso la fase de extracción con detergente y su posterior centrifugación se hizo con toda la cantidad de muestra inicial en vez de con alicuotas de 1 ml como se había hecho trabajando a menor escala. Como se aprecia en la electroforesis de la Figura 7 se ve que el método a mayor escala permite obtener un perfil similar de proteínas de la MFGM que el método a menor escala. Fig. 7: SDS-PAGE en el equipo de Biorad con geles del 10% de policrilamida en condiciones reductoras; 1: estándares de alto peso molecular ;2 y 3: extracto de proteínas de la MFGM de NO a pequeña escala, precipitado y sobrenadante tras incubar con detergente y ultrasonidos (US); 4 y 5: extracto de proteínas de la MFGM de NV a pequeña escala, precipitado y sobrenadante tras incubar con detergente y US; 6 y 7: extracto de proteínas de la MFGM de NO a mayor escala, precipitado y sobrenadante tras incubar con detergente y US; 8 y 9; extracto de proteínas de la MFGM de NV a mayor escala, precipitado y sobrenadante tras incubar con detergente y US. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 36 Tras una primera caracterización de las proteínas de la MFGM por SDS-PAGE, se realizaron también electroforesis en 2D de las diferentes muestras de buttermilk para poder identificar los spots por técnicas de proteómica y comparar los mapas obtenidos entre sí. a b Fig. 8: Electroforesis 2D en un gel de poliacrilamida al 12% de buttermilk de NO (8.a) que se corresponde con la muestra de la carrera 3 de la Fig.3 y de un buttermilk de NV (8.b). La electroforesis de la Figura 8.a fue la primera 2DE óptima que se obtuvo en este trabajo, la mancha o spot, señalada con un círculo blanco se identificó mediante análisis por MALDI-TOF y huella peptídica como la lactaderina. En la electroforesis de la Figura 8.b se observó una mayor diversidad de spots que en la de oveja, por lo que se enviaron a analizar los spots que aparecen señalados en la imagen, identificándose con la butirofilina (1), la lactaderina (2) y la adipofilina (3). El resultado de estas electroforesis indicó que el porcentaje de poliacrilamida utilizado podía mejorarse, puesto que las proteínas de la MFGM que pretendíamos caracterizar quedaban en una posición superior, muy cerca de la tira de isoelectroenfoque. Tras esta experiencia se redujo el porcentaje de poliacrilamida al 10% para todas las 2DE. a b Fig. 9: Electroforesis en 2D de un buttermilk obtenido de N.O en un gel de poliacrilamida al 12,5% (9.a) y en un gel al 10% (9.b.) La comparación de las dos electroforesis nos indicó que se pueden apreciar mejor las diferencias entre las proteínas con un menor porcentaje de poliacrilamida al Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 37 haber un menor efecto de tamiz molecular. Se localizaron dos grupos de spots, recuadrados en blanco, en la zona de peso molecular próximo a 53 kDa y pI próximo al de la lactaderina (pI 6,42). Por encima de éste spot, se encuentra el correspondiente a la butirofilina, rodeado en negro, a una altura de unos 66 kDa y con un pI de 4,5. También se han rodeado en blanco una serie de spots de un peso molecular de unos 170 kDa y con un pI algo inferior a 4,5 que se podrían corresponder con la mucina, como se indica en el trabajo de Dewettinck et al. (7). Se realizó también una caracterización en 2D de muestras de BM comerciales. a b Fig.10: Electroforesis en 2D de α -BM (10.a) y de W-BM (10.b) en gel de poliacrilamida al 12,5%. En esta electroforesis podemos apreciar que los perfiles electroforéticos de los buttermilk comerciales son similares entre sí. En la Figura10.a aparecen rodeados en negro una serie de spots que por su peso molecular y pI (unos 66 kDa y 4,5, respectivamente) se corresponderían con la butirofilina. Más abajo, y de forma más difusa aparecen una serie de manchas que por su peso molecular y posición en el intervalo de puntos isoeléctricos (53 kDa y 6,4) se podrían identificar como lactaderina, estas manchas aparecen recuadradas en blanco. El resto de spots no se pueden llegar a identificar tan fácilmente como los anteriormente citados, no obstante, y basándonos en la electroforesis en 2D del trabajo Dewettinck et al. (7), la mancha rodeada en blanco con un pI inferior a 4,5 bien podría tratarse de la PAS III, de 100 kDa. Para las demás BM comerciales, la β-BM y la M-BM, los resultados de las 2D realizadas (imágenes no incluidas) indican que se debería utilizar algún kit comercial para eliminar de forma más efectiva las interferencias puesto que aparecía un defecto; denominado steacking horizontal, que consiste en que los spots forman bandas continuas en el plano horizontal en vez de puntos definidos. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 38 El primer ensayo que se realizó con los antisueros obtenidos del conejo inmunizado con butirofilina fue evaluar su reactividad frente a diferentes fracciones obtenidas de la MFGM. Mediante un ensayo ELISA no competitivo se analizaron los antisueros de la primera (S1) y segunda extracción (S2) frente al buttermilk y butterserum de vaca. V. 2 Obtención y caracterización de anticuerpos policlonales frente a la butirofilina Fig. 11: ELISA directo en el que se enfrentan el antisuero frente a butirofilina bovina de dos extracciones diferentes (S1 y S2) con la fracción de buttermilk de vaca. (11.a) y con la fracción de butterserum de vaca (11.b). Los antisueros de las dos extracciones mostraron reactividad frente a las fracciones enriquecidas en proteínas de la MFGM, buttermilk y butterserum, indicando que se había producido una respuesta inmune frente a la butirofilina. Además, la señal de absorbancia obtenida para las dos fracciones resultó coherente con el contenido en proteínas de la MFGM, puesto que el BM es la fracción que más butirofilina contiene, mientras que la otra fracción utilizada resulta ser una fracción enriquecida en lactaderina, pero con menor cantidad de butirofilina, como parecen indicar las electroforesis realizadas. Por otra parte, también se aprecia que la reactividad de la primera y segunda extracción es bastante similar. El siguiente paso fue realizar la titulación de los antisueros obtenidos de diferentes extracciones haciendo reaccionar diluciones seriadas de los antisueros con BM. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 39 Fig. 12: Curva de titulación de los antisueros específicos frente a la butirofilina bovina procedentes de la primera, tercera y cuarta extracción frente al BM de vaca. Se realizaron diluciones seriadas desde la dilución 1/2 hasta la dilución 1/214, y también se incluyeron los sueros sin diluir. Hasta la dilución 1/28 se ve que la señal de absorbancia producida por el suero de la tercera extracción es superior a la del suero de la primera extracción. En ambos sueros a partir de la dilución 1/24 hasta 1/27 hay un descenso lineal en la señal, cosa que no ocurre para el suero de la cuarta extracción para el que la señal denota saturación durante las primeras seis diluciones. Para establecer las condiciones óptimas para el ELISA competitivo que se realizó posteriormente para la cuantificación de butirofilina, necesitábamos conocer cuál era la dilución con una señal de absorbancia de entre 1,5 y 2, que nos permitiera tener un amplio intervalo de respuesta. Según la curva de titulación obtenida para el suero de la primera extracción es la dilución 1/24 mientras que para la segunda extracción es 1/25 y para la cuarta extracción la 1/29, siendo éste por tanto el antisuero con el mayor título. V.2.a Determinación de la concentración de butirofilina bovina mediante ELISA competitivo Dado que en este trabajo no se ha procedido al aislamiento y purificación de la butirofilina, aunque sí es un objetivo que se está llevando a cabo por otros miembros del grupo de investigación, asumimos una concentración para la butirofilina en el BM de vaca, según datos obtenidos de la bibliografía. Determinamos la concentración de proteína del BM por el método del BCA siendo de 0,155 mg/ml. En el BM la concentración de las proteínas de la MFGM es cinco veces superior a la del lactosuero, por lo que en nuestro BM tendríamos alrededor de 0,023 mg/ml de proteína de la MFGM. Se ha considereado que la burtirofilina se encuentra en una proporción de Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 40 alrededor del 35% según cita Fong et al (34). Nuestro BM utilizado como estándar contendría alrededor de 8,138 µg/ml de butirofilina. En la Figura 13 se presenta el ensayo realizado para la determinación de butirofilina en diferentes buttermilks donde figura la calibración y las medidas interpoladas: Fig. 13: Calibrado del ELISA competitivo indirecto para la determinación de butirofilina utilizando BM de vaca como estándar a las diluciones 1/2, 1/5, y 1/10. Determinación de butirofilina en muestras de buttermilk comerciales. Para determinar la concentración de butirofilina, se tuvo en cuenta la dilución de las muestras, 1/100 para el α-BM, el M-BM y el β-BM y 1/50 para el W-BM y para el β-BM, los resultados se recogen en la siguiente tabla: PRODUCTO Conc. butirofilina ± SD [µg/ml] Conc. proteica muestra [mg/ml] % Respecto a la proteína total BMv 8,14 0,155 5,25 α−BM 92,93 ± 1,20 46,00 0,20 β-BM 65,79 ± 12,48 39,54 0,17 M-BM 172,06 ± 20,14 64,73 0,27 W-BM 66,44 ± 17,84 43,52 0,15 Tabla 6: Resultados del ELISA competitivo indirecto para la determinación de butirofilina en las BM comerciales, resultados de las medidas realizadas por triplicado. Con estos resultados se aprecia que las BM comerciales tienen una mayor concentración de butirofilina que la BM de vaca, no obstante, en la relación butirofilina/proteínas la BM de vaca tiene una mayor proporción que las muestras comerciales. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 41 V.3 Digestión gástrica de buttermilk y butterserum: caracterización cualitativa y cuantitativa de los hidrolizados V.3.a Digestión gástrica de los buttermilk obtenidos a partir de nata cruda de vaca y oveja Partiendo de nata cruda de vaca y oveja, se obtuvieron el buttermilk (BM) y el butterserum (BS), como se ha descrito en el apartado de Materiales y Métodos. Para realizar la digestión con pepsina el BM se concentró dos veces por ultrafiltración y el BS se hidrolizó tal y como se había obtenido. A ambas muestras se le adicionaron 16 mg de pepsina y se hizo una digestión durante 4 horas, extrayendo muestras a tiempos determinados. Cuando terminó la hidrólisis se llevó a cabo una electroforesis de todas las muestras extraídas: Fig. 14: SDS-PAGE realizada en el equipo de Biorad en gel de poliacrilamida en gradiente 4-20% de los hidrolizados con pepsina de buttermik (BM) y butterserum (BS) de vaca En la Figura 14 se aprecia como durante la digestión con pepsina van desapareciendo las bandas de mayor peso molecular y van apareciendo bandas correspondientes a proteínas más ligeras y péptidos. En el BS de vaca se ve durante los 60 primeros minutos cómo las proteínas más pesadas (recuadradas en blanco) van desapareciendo y se van generando péptidos por debajo de unos 17 kDa (rodeado con un círculo negro en la carrera de 60 min). Aunque antes de la primera hora de hidrólisis ya aparecía una banda en dicha posición, fue a los 60 min cuando alcanzó su máxima concentración. En las tres últimas horas de hidrólisis las bandas de mayor peso molecular de la muestra ya habían desaparecido por completo, la pepsina, recuadrada en negro se observa de forma tenue a la altura de su peso molecular, de 35 kDa, El control del enzima indica que su concentración se mantiene constante a lo largo del proceso. Durante el proceso de hidrólisis, a partir de la tercera carrera correspondiente a los 60 Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 48 En esta electroforesis, en la mitad superior del gel sólo se puede apreciar que la lactaderina soporta todo el proceso sin apenas degradarse, la banda de 53 kDa no desaparece, mientras que la butirofilina, que no se ve al principio del proceso aparece a las 2 horas y prácticamente no desaparece, esto puede ser debido a que se ha liberado de la xantin-oxidasa (7) con la que podría interaccionar debido al tratamiento térmico que sufren las muestras comerciales. Por otra parte, el perfil de proteínas de bajo peso molecular y péptidos, se mantiene bastante constante a lo largo de todo el proceso de hidrólisis. La determinación de aminas libres mediante reacción con el TNBS de estos hidrolizados sigue la forma de las BM α y β, el grado de hidrólisis aumenta con el tiempo, y es mayor especialmente en las 3-4 primeras horas del proceso. Fig. 25: Niveles de aminas primarias libres a lo largo del tiempo en el proceso de hidrólisis por pepsina del W-BM de vaca diluido 1/10. Para comparar todas las BM se calculó la relación mg NH3/g proteína de la muestra, tras lo que se representó este nuevo valor frente al tiempo. Fig. 26: Comparación del grado de hidrólisis de las diferentes muestras de BM Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 49 En esta representación se aprecia que el BM más hidrolizable es el de vaca, que comparándolo con el resto de muestras presenta un grado de hidrólisis mayor y también una proteólisis más rápida. De los BM comerciales los que sufren una mayor hidrólisis son la β-BM y la WBM, mientras que la MBM y la α-BM presentan un grado de hidrólisis inferior a las anteriores muestras. V.3.d Análisis por Western-Blotting del hidrolizado de buttermilk de vaca El BM de vaca hidrolizado con pepsina se analizó por Western-blotting utilizando el antisuero policlonal de la cuarta extracción frente a butirofilina: Fig. 27: Western-blotting del hidrolizado de BM de vaca utilizando antisuero frente a butirofilina. En esta imagen se ha incluido la hoja de nitrocelulosa revelada y la parte del gel no transferido correspondiente al patrón de pesos moleculares teñida con azul de Coomassie. En la nitrocelulosa se aprecia una mancha correspondiente con la banda de la butirofilina, sólo visible a los 0, 30 y 60 min de hidrólisis, perdiendo intensidad conforme avanza el proceso de digestión. Esta técnica nos confirma los resultados vistos anteriormente en las electroforesis. El ensayo antibacteriano se ha realizado con Cronobacter sakazakii, un patógeno emergente de gran interés en los últimos años, dado que ha causado serios problemas por su aparición en las leches en polvo infantiles. En el grupo de investigación se están realizando ensayos con algunas proteínas lácteas, que han demostrado tener una actividad antibacteriana frente a este patógeno. V.4 Efecto antibacteriano del hidrolizado de 4 horas de buttermilk de vaca Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 50 Durante la realización de este ensayo, se midió la turbidez de las muestras con el fin de comprobar que se producía crecimiento bacteriano a lo largo del tiempo, mostrándose los resultados en la Figura 28. Todas las muestras a tiempo 0 tienen una turbidez similar, lo cual indica que la siembra de la suspensión bacteriana se ha hecho correctamente, y que en todos los pocillos tenemos una cantidad similar o equivalente de microorganismos. A las 4 horas ocurre lo mismo, pero los valores son superiores a los anteriores, lo que indica que se ha producido crecimiento de las bacterias. A las 8 horas sólo el valor de la muestra control es superior a los valores de los tiempos anteriores, mientras que la turbidez de las muestras con diferentes concentraciones del hidrolizado es menor que la del control en todos los casos. Esto último parece indicar que el hidrolizado inhibe el crecimiento de la bacteria. Fig. 28: Evolución del valor medio de turbidez (absorbancia a 640 nm) de la suspensión de C. sakazakii incubada con el hidrolizado de BM de vaca de 4 horas a diferentes tiempos y porcentajes. Tras realizar el recuento, teniendo en cuenta las diluciones realizadas, se representa las UFC/ml en función del tiempo y la concentración del hidrolizado: Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas V.Resultados y Discusión 51 Fig. 29: Representación del log UFC/ml de de la suspensión de C. sakazakii incubada con el hidrolizado de BM de vaca de 4 horas a diferentes tiempos y porcentajes. Los resultados indican que la población control aumentó con la incubación, especialmente a las 8 horas, aumentando casi dos unidades logarítmicas. De las diferentes muestras de hidrolizado sólo la concentración del 40% permitió el crecimiento bacteriano a las 4 horas, mientras que a las 8 horas hubo crecimiento bacteriano para los hidrolizados del 40, 60 y 80%. Para la concentración del 100% del hidrolizado no se obtuvo crecimiento bacteriano ni a 4 ni a 8 horas. Analizando estos resultados parece que existe una relación inversamente proporcional entre el crecimiento bacteriano y la concentración del hidrolizado. Durante el tratamiento a las 8 horas, para un 40% de hidrolizado sólo ha crecido el 13% de bacterias respecto al control, para el 60% hay una reducción de una vigésima parte respecto al crecimiento en la muestra del 40%. Por último, para un 80% de hidrolizado apenas crece un 0,11% de las bacterias con respecto al control de muestra. Estos resultados, aunque preliminares, son muy prometedores e indican que la hidrólisis con pepsina genera péptidos en las proteínas de la MFGM que pueden tener un gran interés por sus propiedades antibacterianas. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas VI.Conclusiones 52 1. De los métodos utilizados para la extracción de las proteínas de la membrana del glóbulo graso se ha visto que la extracción con detergentes y ultrasonidos es la más eficaz y rápida. La caracterización las proteínas de la MFGM en 2DE requiere una fase de precitación con acetona y TCA a -20ºC. VI. CONCLUSIONES 2. Los perfiles electroforéticos en SDS-PAGE de los buttermilk obtenidos de los leche de vaca y oveja cruda indican que se conservan la mayoría de las proteínas de la MFGM. Los perfiles obtenidos en las electroforesis 2D de todos los buttermilk analizados han permitido identificar las proteínas butirofilina, lactaderina y adipofilina por técnicas proteómicas. 3. Se han obtenido anticuerpos policlonales frente a la butirofilina bovina y se ha puesto a punto un método de ELISA competitivo para la determinación de su concentración. Mediante esta técnica se ha comprobado que los diferentes tipos de buttermilk comerciales en polvo obtenidos de leche de vaca son una buena materia prima para aislar la butirofilina y otras proteínas de la MFGM. 4. Se han obtenido hidrolizados con pepsina de los buttermilk de nata y oveja de leche cruda y de los buttermilk comerciales. Se ha analizado su perfil electroforético a lo largo del tiempo de hidrólisis y se ha observado que la lactaderina es una proteína más resistente a las condiciones de hidrólisis que la butirofilina. 5. Los experimentos preliminares que se han realizado para evaluar la actividad antibacteriana del hidrolizados del buttermilk de leche de vaca cruda obtenido a las 4 horas frente al patógeno emergente C. sakazakii indican una inhibición del crecimiento a concentraciones del 40, 60 y 80%, mientras que para el 100% no se ha apreciado crecimiento bacteriano a las 4 y 8 horas de incubación. Trabajo Fin de Master Fco Javier Fraguas Lasheras VII.Bibliografía 53 (1) Gopal, P.K. y Gill, H.S. (2000). Oligosaccaharides and glycoconjugates in bovine milk and colostrum. Brit. J. Nutr., 84, S69-S74. VII. BIBLIOGRAFIA (2) Fong, B.Y. y Norris, C.S. (2009). 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