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1 Trabajo Fin de Máster BÚSQUEDA DE FACTORES QUE MODIFICAN LA PENETRANCIA DE MUTACIONES PATOLÓGICAS EN EL DNA MITOCONDRIAL Autor/es Carlos Damián Prieto López Director/es Eduardo Ruiz Pesini María Pilar Bayona Bafaluy Facultad de Veterinaria Facultad de ciencias de la universidad de Zaragoza Año: 2012/13 2 Tabla de contenido 1 Introducción .......................................................................................................................... 4 1.1 Mitocondrias y el sistema OXPHOS ............................................................................... 4 1.2 Sordera asociada a defectos en la síntesis de proteínas del sistema OXPHOS debido a las mutaciones m.1494C>T y m.1555A>G ................................................................................. 5 1.3 Mecanismo patológico descrito para las mutaciones m.1494C>T y m.1555A>G en presencia de aminoglicósidos ................................................................................................... 5 1.4 Sordera no sindrómica asociada a las mutaciones m.1494C>T y m.1555A>G ............. 9 1.5 Proteína MRPS12 como un posible factor clave en la penetrancia de las mutaciones m.1494C>T e m.1555A>G.......................................................................................................... 9 1.6 Hipótesis ...................................................................................................................... 11 1.7 Objetivos ..................................................................................................................... 11 2 Material y métodos ............................................................................................................. 12 2.1 Estudios bioinformáticos ............................................................................................. 12 2.2 Material ....................................................................................................................... 12 2.2.1 Reactivos ............................................................................................................. 12 2.2.2 Kits comerciales ................................................................................................... 13 2.2.3 Plásmidos ............................................................................................................ 14 2.2.4 Primers ................................................................................................................ 16 2.2.5 Marcadores de pesos moleculares empleados ................................................... 17 2.3 Cultivos celulares ......................................................................................................... 17 2.3.1 Cultivos celulares bacterianos ............................................................................. 17 2.3.2 Cultivos celulares eucariotas ............................................................................... 19 2.4 Transfección celular .................................................................................................... 21 2.5 Extracción, manipulación y análisis de ácidos nucleicos ............................................. 23 2.5.1 Extracción de RNA total de cultivos celulares en monocapa .............................. 23 2.5.2 Extracción de DNA nuclear de cultivos celulares en monocapa ......................... 24 2.5.3 Extracción y purificación de DNA plasmídico ...................................................... 24 2.5.4 Purificación de DNA a partir de geles de agarosa ............................................... 24 2.5.5 Cuantificación de DNA ......................................................................................... 25 2.5.6 Secuenciación automática del DNA .................................................................... 25 2.6 Programas de PCR empleados .................................................................................... 25 3 2.6.1 PCR de colonia (PCR de colonia) .......................................................................... 25 2.6.2 Amplificación de DNA por PCR utilizando como molde cDNA ............................ 26 2.7 Técnicas de manipulación de plásmidos ..................................................................... 27 2.7.1 Clonación de los productos de PCR en un vector plasmídico ............................. 27 2.7.2 Mutagénesis dirigida ........................................................................................... 29 2.7.3 Digestión de vectores plasmídicos ...................................................................... 29 2.7.4 Ligación de un determinado inserto en el vector de elección ............................ 30 3 Resultados ........................................................................................................................... 31 3.1 La mutación patológica humana m.1494C>T está fijada en la familia Cercopithecidae 31 3.2 El nucleótido 1494 es importante para la función del 12SrRNA ................................. 32 3.3 Una sustitución en la proteína MRPS12:R68L podría compensar la mutación patológica m.1494C>T en macacos ......................................................................................... 33 3.4 Las células Cercopithecidae son resistentes a los aminoglicósidos ............................ 35 3.5 MRPS12 podría ser un factor modificante que explique la incompleta penetrancia de la mutación patológica humana m.1494C>T y la ausencia del fenotipo patológico en MN ... 38 3.6 Estudio del aminoácido 68 de la proteína MRPS12 como factor que modifica el efecto de la mutación m.1494C>T ..................................................................................................... 39 3.1 Perspectivas futuras .................................................................................................... 42 4 Discusión de los resultados ................................................................................................. 43 4.1 MRPS12:68L como posible mutación compensatoria de m.1494C>T ........................ 43 4.2 Teorías para explicar el origen de la mutación patológica m.1494C>T y su posible mutación compensatoria MRPS12:R68L ................................................................................. 44 4.3 MRPs como mutaciones compensatorias de otras mutaciones patológicas en el mtrRNA 46 5 Conclusiones........................................................................................................................ 47 6 Agradecimientos ................................................................................................................. 47 7 Bibliografía .......................................................................................................................... 48 4 1 Introducción 1.1 Mitocondrias y el sistema OXPHOS Las células eucariotas contienen un núcleo, en donde se encuentran los cromosomas heredados de los padres, y muchos otros orgánulos. Entre ellos están las mitocondrias. En la membrana interna mitocondrial se localiza el sistema de fosforilación oxidativa (sistema OXPHOS) que incluye la cadena de transporte de electrones (ETC) o cadena respiratoria y la ATP sintasa. Este sistema lleva a cabo numerosas funciones fundamentales para la célula, como por ejemplo la generación de un gradiente electroquímico en la cual están implicados los 4 complejos respiratorios mitocondriales y la ATP sintasa (Mitchell, P., 1967) para la producción de la mayor parte de la energía celular en la forma de ATP (Wallace, D. C., 2006). El sistema OXPHOS está compuesto de más de 80 polipéptidos. La mayoría de ellos están codificados en los cromosomas del núcleo (nDNA), son producidos en el citosol y tienen que ser importados al interior mitocondrial. Sin embargo, 13 polipéptidos son codificados en moléculas de DNA que se encuentran en el interior de la mitocondria y que por ello se conocen como DNA mitocondrial (mtDNA). Para la síntesis de estas 13 proteínas, el mtDNA también codifica 22 tRNAs y 2 rRNAs (figura 1) (Wallace, D. C., 2006; Montoya J. et al, 2005; Bindu, L. H. et al, 2008). Figura 1. DNA mitocondrial y los complejos que codifica. A) Esquema del DNA mitocondrial con las subunidades, los rRNAs y los tRNAs que codifica. B) Esquema de las distintas subunidades codificadas por el DNA mitocondrial que forman el sistema OXPHOS. B A 5 Así pues, los ribosomas mitocondriales comparten productos codificados en ambos genomas: el nuclear que codifica para las proteínas ribosomales, y el mitocondrial, que codifica los rRNAs (Sylvester J. E. et al, 2004). Los ribosomas mitocondriales están formados por una subunidad grande, que incluye el rRNA 16S y unas 50 proteínas (MRPL, proteínas de la subunidad grande del ribosoma mitocondrial), y una subunidad pequeña, que incluye el rRNA 12S y unas 29 proteínas (MRPS, proteínas de la subunidad pequeña del ribosoma mitocondrial) (Cavdar E. et al, 2001). De esta manera, mutaciones en genes nucleares o mitocondriales pueden provocar alteraciones de la síntesis mitocondrial de proteínas 1.2 Sordera asociada a defectos en la síntesis de proteínas del sistema OXPHOS debido a las mutaciones m.1494C>T y m.1555A>G Una de las enfermedades debidas a defectos en la síntesis mitocondrial de proteínas es la sordera mitocondrial no sindrómica. En esta enfermedad, las células ciliares de la cóclea son el tejido fundamentalmente afectado. Puede producirse por mutaciones en algunos mttRNAs (Zhao et al, 2004; Li et al, 2004) pero es muy frecuentemente causada por dos mutaciones en el rRNA 12S, las transiciones m.1494C>T y la m.1555A>G (RodríguezBallesteros, M. et al, 2006). Lo llamativo de la sordera mitocondrial no sindrómica causada por estas mutaciones es que, con algunas excepciones (del Castillo, F. J. et al, 2003), todos los miembros relacionados por vía materna que pertenecen a estos pedigríes portan la mutación en homoplasmia (100% de moléculas mutadas) (Zhao et al, 2004; 2005; RodríguezBallesteros, M. et al, 2006; Bindu, L. H. et al, 2008; Wei, Q. et al 2013; Ding, Y. et al., 2013) y sin embargo unos desarrollan la enfermedad y otros no. Esto probablemente se debe a que otros factores son necesarios para modificar la penetrancia de estas mutaciones (Carelli, V., 2003). 1.3 Mecanismo patológico descrito para las mutaciones m.1494C>T y m.1555A>G en presencia de aminoglicósidos Ya desde los informes de los primeros pedigríes con la enfermedad, se observó que muchos individuos con la mutación desarrollaban la sordera después de ser expuestos a aminoglicósidos (Zhao et al, 2004; 2005; Rodríguez-Ballesteros, M. et al, 2006; Bindu, L. H. et al, 2008; Wei, Q. et al 2013; Ding, Y. et al., 2013). Estos compuestos son antibióticos que se utilizan para combatir bacterias y actúan a nivel del centro decodificante del ribosoma bacteriano. 6 Durante la decodificación, una minihélice se forma entre el codón del mRNA y el anticodon del aminoacil-tRNA relacionado. Dos adeninas conservadas del sitio de decodificación A del ribosoma (en E coli son las posiciones Ec.1492A y Ec.1493A mientras que las homologas en mitocondrias de células humanas son m.1557A y m.1558A), que están plegadas hacia afuera en la hélice (estado apagado), son giradas e interaccionan con la minihélice formada por el codón-anticodón relacionado (estado encendido). Este cambio de conformación determina que se continúe con la traducción. Los aminoglicósidos estabilizan el estado encendido aún en ausencia del complejo mRNA-tRNA relacionado, la afinidad de este lugar por tRNAs no relacionados incrementa y no hay una discriminación eficiente, con lo que se producen proteínas con secuencias erróneas (Pacheu-Grau et al, 2010 b). La selectividad de los aminoglicósidos es ampliamente debida a una posición nucleotídica única en el rRNA. Los citoribosomas son insensibles a los aminoglicósidos por la presencia de una c.1645G. La sensibilidad de los ribosomas procariotas se debe a la presencia de una Ec.1408A (posición homologa a la c.1645 del rRNA 18S eucariota) en el rRNA 16S de Escherichia coli, que se corresponde al rRNA 12S mitocondrial (Sven N. Hobbie et al, 2008 a). as bacterias se vuelven resistentes a los aminoglicósidos mutando esta posición al mismo nucleótido presente en eucariotas. Análisis filogenéticos detallados de la secuencia de la subunidad pequeña ribosomal mitocondrial indican que las mitocondrias tienen un origen endosimbiótico a partir de un grupo de bacterias llamadas α–proteobacterias y esto indica que, aunque los ribosomas citosólicos eucariotas son muy distintos a los procariotas, los ribosomas mitocondriales y los bacterianos son bastante similares, lo que se traduce en una similar afinidad por los aminoglicósidos (Pacheu-Grau et al, 2010 a). El rRNA 12S mitocondrial humano tiene una A en la posición equivalente, m.1492A, y es sensible a los aminoglicósidos (figura 2). Las dos mutaciones en el mt-rRNA que han sido asociadas con sordera mitocondrial no sindrómica afectan a posiciones que en bacterias forman un par de bases Watson-Crick (Wcbp) y son importantes para la unión de los aminoglicósidos. El rRNA 12S de tipo salvaje carece de este Wcbp, pero las mutaciones patológicas lo reconstruyen e incrementan su similitud a su homólogo bacteriano (Rodríguez-Ballesteros, M. et al, 2006), incrementando todavía mas la unión de los aminoglicósidos con m.1492A y Su interacción con las adeninas del sitio de decodificación (Ogle, J. M et al, 2002). (Figura 3). 7 Figura2. Representación de 12S rRNA. En círculo se señala la zona de decodificación A con la diferente numeración de nucleótidos según si el ribosoma es mitocondrial humano, de bacteria E coli o un ribosoma citosólico. Se señala la posición 1492A (mitocondria humana) y 1408A (E coli) como las posiciones homologas a 1645G (ribosoma citosólico). Los aminoglicósidos se unirán a esa posición si hay una adenina. Se señala la posición mitocondrial humana 1494/1555 carente de un Wcbp mientras que la posición homologa de E coli 1410/1490 forma un Wcbp y permite la unión de los aminoglicósidos. Las posiciones 1492 y 1493 de E coli pertenecen a las adeninas del sitio de decodificación. En el caso de la secuencia mitocondrial humana son las posiciones 1557 y 1558. 8 Figura 3. Esquema del funcionamiento de la mutación m.1494C>T o la m.1555A>G. A) Forma silvestre de la zona de decodificación A del ribosoma mitocondrial humano. Los aminoglicósidos tienen afinidad por la adenina de la posición 1492 pero la ausencia de un Wcbp entre las posiciones 1494-1555 dificulta su adhesión al sitio de decodificación y ello permite una correcta selección de tRNA. B) mutación m.1494C>T de la zona de decodificación A del ribosoma mitocondrial humano. El conjunto de Wcbp formado entre las posiciones 14941555 junto a m.1492A facilita la adhesión de aminoglicósidos. Los aminoglicósidos interaccionan con las adeninas del sitio de decodificación y estabilizan el estado encendido y por ello no hay una buena discriminación de tRNA. Esto conlleva a una traducción errónea de las proteínas. Hay casos donde no se requiere aminoglicósidos para generar el fenotipo patológico u se requiere de otros posibles factores adicionales. En círculo rojo se señala las adeninas del sitio de decodificación. En un rectángulo verde se señala la ausencia de Wcbp1494/1555. En rectángulo naranja se señala la presencia de Wcbp1494/1555. Los “tRNAs rojos” son los tRNAs erróneos para un codón dado. Los “tRNAs verdes” es el tRNA correcto para un codón determinado. A B 9 1.4 Sordera no sindrómica asociada a las mutaciones m.1494C>T y m.1555A>G Hasta ahora se ha explicado el efecto de estas mutaciones con los aminoglicósidos pero se sigue sin saber porque las mutaciones por si solas pueden generar un fenotipo patológico o por qué en los pedigríes analizados hasta la fecha la mutación m.1555A>G genera más fenotipos patológicos que la mutación m.1494C>T. Una explicación plausible podría ser que la interacción C-G (mutación 1555) genera 3 puentes de hidrogeno en la interacción 14941555 mientras que la interacción U-A (mutación 1494) solo genera 2. Esto hace que la estructura del sitio de decodificación formada en el primer caso pueda ser menos flexible dificultando el giro de las adeninas del sitio de decodificación A del estado apagado al estado encendido y haciendo más difícil su interacción con la minihélice codón-anticodón. Como consecuencia, se permitiría una selección menos eficaz de los tRNAs y generaría un mayor número de errores en la traducción y con ello un mayor número de proteínas malformadas. Por esta teoría, la mutación 1494 no sería tan severa y se cometerían menos errores en la traducción (Sven N Hobbie et al, 2008 b). Aunque se dan casos de sordera no sindrómica, los estudios hasta la fecha demuestran que las mutaciones C4194T o la m.1555A>G en general no son definitivas para el desarrollo de la perdida de la capacidad auditiva, pero su asociación con otros factores como factores ambientales, genes nucleares (Zhao, H. et al, 2005; Rodríguez-Ballesteros, M. et al, 2006; Bindu, L. H. et al, 2008) o polimorfismos mitocondriales (Pacheu-Grau et al, 2011; Wei, Q. et al 2013; Ding, Y. et al., 2013), polimorfismos en las proteínas que interaccionan con rRNAs (James E. Sylvester et al, 2004) pueden ser la clave para explicar los distintos grados de penetrancia entre los individuos que padecen dichas mutaciones (Carelli, V., 2003). 1.5 Proteína MRPS12 como un posible factor clave en la penetrancia de las mutaciones m.1494C>T e m.1555A>G En estudios previos se vio que la mutación patológica humana m.1555A>G era la forma silvestre de los orangutanes de Bornean y Sumatran ya que ninguno de dichos animales sufría de ningún tipo de sordera sin síndrome aparente. Esto hizo pensar que ciertas especies podrían haber desarrollado sistemas de reparación de mutaciones de tal forma que 16 2.2.4 Primers Los distintos primers empleados durante el proyecto master se recogen en la siguiente tabla (tabla 3). primers secuencia(5'->3') Utilidad Tamaño del fragmento amplificado (pb) h R68L (F) CTGTGCACGTTTACCCT CAAGCCGAAG Mutagénesis en secuencia MRPS12 humana 736 143B, 739 Macaca nemestrina h R68L (R) GGCTTCTTCGGCTTGA GGGTAAACGTC Mutagénesis en secuencia MRPS12 humana m L68R (F) CTGTCCACGTTCACCC GCAAGCCCAA Mutagénesis en secuencia MRPS12 macaco 736 143B, 739 Macaca nemestrina m L68R (R) GGCTTCTTGGGCTTGC GGGTGAACGT Mutagénesis en secuencia MRPS12 macaco MRPS12 (F) GTTTAAACGCCACCAT GTCCTGGTCTG Amplificar secuencia MRPS12 y clonar en MRPS12 736 143B, 739 Macaca nemestrina MRPS12 (R) GTTTAAACTGTTTATTA AAACCCC Amplificar secuencia MRPS12 y clonar en MRPS12 MRPS12 483(R) AGCTGCGGCCGGCTTT CCG Amplificar secuencia MRPS12 y clonar en MRPS12 187 143B y Macaca nemestrina (con MRPS12(F)) SV40 (F) AGACTGTGAGGACTG AGG Detección de vector de inmortalización de COS 298 SV40 (R) TTGGTACAGACCTGT GGC Detección de vector de inmortalización de COS KanR (F) TTGGCTCGCGATAATG TCG Detección de resistencia a kanamicina de células COS 174 KanR (R) CTTGATGGTCGGAAG AGGC Detección de resistencia a kanamicina de células COS pWPI (F) TTTCAGGTGTCGTGAG GA Comprobar el clonaje direccional en el vector pWPI Con MRPS12 483(R): 212 Con MRPS12 (R):  761 143B  764 Macaca nemestrina Tabla 3: Primers usados durante el desarrollo de este trabajo. 17 2.2.5 Marcadores de pesos moleculares empleados Los distintos marcadores de pesos moleculares empleados en electroforesis se recogen en la siguiente tabla (tabla 4). Marcador de pesos moleculares Fragmentos (pb) Low mass ladder 2000, 1200, 800,400, 200,100 Lambda/Hind III 23130, 9140, 6557, 2322,2027 High mass ladder 10000, 6000, 4000, 3000, 2000,1000 Tabla 4. Marcadores de peso molecular empleados 2.3 Cultivos celulares 2.3.1 Cultivos celulares bacterianos 2.3.1.1 Cepas bacterianas Las bacterias empleadas en este trabajo se prepararon en el laboratorio del grupo GENOXPHOS a partir de una cepa Subcloning Efficiency™ DH5α™ E.coli. Se trata de una cepa bacteriana usada en las aplicaciones de clonaje cotidianas. Fueron suministradas por InvitrogenTM 2.3.1.2 Medios de cultivo bacterianos Las cepas bacterianas usadas en este estudio se cultivaron en medio líquido LB (LuriaBertani) con antibiótico. Las placas de LB-agar se prepararon con LB y agar añadiendo ampicilina a una concentración final de 100 μg/ml. 2.3.1.3 Transformación de bacterias competentes En primer lugar, se descongeló en hielo una alícuota de 50 μl de las bacterias competentes (almacenadas a -80ºC), para cada transformación a realizar. Una vez descongeladas, se añadieron 2 μl de la ligación (provenientes de un volumen total de 10 μl), mezclando suavemente con la punta de la pipeta. A continuación se incubaron en baño de hielo y 18 cámara fría, durante 30 minutos. Tras la incubación, se realizó el shock térmico a 42ºC durante 45 segundos, sin agitación. Rápidamente, se transfirieron los viales al baño de hielo y se incubaron durante 2 minutos. Una vez realizado el shock, se añadieron 250 μl de medio LB sin antibiótico a temperatura ambiente en cada vial. Seguidamente, se incubaron a 37ºC durante 1 hora a 225 rpm (revoluciones por minuto), en agitación horizontal. Por último se sembró la totalidad del volumen de cada vial de transformación en placas de LB agar conteniendo el antibiótico conveniente para la selección y se incubaron en estufa a 37ºC durante toda la noche. 2.3.1.4 Siembra de bacterias en placas de LB-agar y en medio LB Para seleccionar aquellas colonias que expresasen el plásmido transformado previamente, se utilizaron placas de LB-agar conteniendo el antibiótico deseado y atemperadas a 37ºC durante 30 minutos. Se sembró la totalidad del volumen de cada vial de transformación, en placas de LB-agar conteniendo el antibiótico adecuado, con la ayuda de un asa de siembra de metacrilato, esterilizada previamente a la llama con etanol al 70%. Finalmente, se introdujeron las placas de forma invertida, en el incubador a 37ºC, donde se mantuvieron durante 16-18 horas. La siembra de bacterias en medio LB líquido, se realizó partiendo de una colonia proveniente de una placa de LB-agar o de un glicerol con ayuda de un palillo estéril. Las bacterias se incubaron a 37ºC, en agitación (225 rpm) dejándolas crecer durante toda la noche. 2.3.1.5 Incubación del DNA plasmídico Las colonias seleccionadas se inocularon, con ayuda de un palillo estéril, en cinco mililitros de medio LB con el antibiótico apropiado y se dejaron incubar a 37ºC con agitación durante toda la noche. Al día siguiente, se purificó el plásmido y se comprobó por digestión, visualizándolo mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa. 2.3.1.6 Conservación de las colonias de interés Las colonias de interés, partiendo del cultivo líquido fresco, se congelaron en glicerol como agente crioprotector. Se hicieron alícuotas de 0,8 ml de bacterias en medio LB y 0,2 ml de glicerol al 75%. Los criotubos se conservaron y almacenaron a -20ºC ó -80ºC. La descongelación de las cepas para su uso posterior, se realizó en hielo. Sin permitir la completa descongelación del criovial, se raspó con ayuda de un palillo o una punta amarilla 19 estéril, un poco su superficie. Seguidamente se inocularon 5 ml de LB líquido con el antibiótico correspondiente. A continuación, se incubaron a 37ºC en agitación, durante 1618 horas. 2.3.2 Cultivos celulares eucariotas 2.3.2.1 Líneas celulares eucariotas Las líneas celulares empleadas en este proyecto fueron: una línea de células inmortalizadas de Cercopithecus aethiops (COS-1), línea celular 143B procedente de una línea celular derivada de osteosarcoma humano (143B) y una línea procedente de un explante primario de Macaca Nemestrina (NM). Todas estas líneas fueron obtenidas de la facultad de veterinaria de Zaragoza. 2.3.2.2 Medios de cultivo Para el crecimiento de las distintas líneas fibroblásticas de ratón usadas en este trabajo, se utilizó un medio de cultivo preparado a partir de medio comercial DMEM (GIBCOTM) rico en glucosa (4,5 g/l), con piruvato de sodio (0,11 g/l) y glutamina (584 mg/l), suplementado con suero fetal bovino (SFB)(Invitrogen) al 5% (143B), y 10% (Macaca nemestrina y COS) el cual aporta proteínas y factores de crecimiento. 2.3.2.3 Siembra y mantenimiento celular Las células se sembraron en placas de Petri, aptas para cultivo celular, de 40, 60, 100 y mm de diámetro, en función de las necesidades, a una densidad entre 10000-1000000 células /ml de medio de cultivo, a las que se les añadieron 0.2 ml de medio de cultivo/cm2 de superficie de la placa. Los cultivos se mantuvieron durante su crecimiento en un incubador a 37ºC, en una atmósfera húmeda conteniendo un 5% de CO2, cambiándoles el medio periódicamente cada 2 ó 3 días. Cuando los cultivos celulares se sometieron a la acción de ciertos compuestos químicos, como inhibidores de la cadena de transporte electrónico o antioxidantes. El medio se renovó cada 24h. Debido a que las líneas celulares usadas en este trabajo son todas adherentes y crecen en monocapa, la resiembra se realizó por tripsinización, cuando éstas alcanzaron la confluencia en la placa de cultivo. Para ello, tras eliminar el medio de cultivo por succión, las células se 20 lavaron con PBS (GIBCOTM), con el fin de eliminar las proteínas del suero que inhiben la acción de la tripsina. A continuación, una vez eliminado el PBS de la placa, se añadió 0,033 ml/cm2 de una mezcla de 0.05% de tripsina (SIGMA) y 0,02% de EDTA en PBS (esterilizada mediante filtros de 0,22 μm de tamaño de poro StericupTM de Millipore)), y se incubó durante 2-3 minutos a 37ºC. Transcurrido este tiempo, se comprobó que las células se hubieran despegado y se añadió un volumen adecuado de PBS suplementado con 10% de SFB, para recoger las células en suspensión y pasarlas a un tubo Falcon de 15 ml para su posterior centrifugación (1750 rpm, 5 minutos). El pellet celular se resuspendió en el volumen adecuado de medio de cultivo para su división, contaje o congelación inmediata. Todos los medios usados para lavar, tripsinizar, centrifugar y cultivar las células, se precalentaron a 37ºC, en un baño de agua. 2.3.2.4 Congelación y descongelación celular Las células a congelar se dejaron crecer hasta un 70-80% de confluencia en placa de 100 mm, se tripsinizaron y se recogieron por centrifugación. El pellet celular obtenido, se resuspendió en 1ml de medio de congelación (DMEM con 10% de SFB y 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO, SIGMA), como agente crioprotector) pasándolo a un tubo criogénico resistente a N2 líquido, convenientemente etiquetado. La suspensión celular se congeló lentamente (descenso de aproximadamente 1ºC/min). Para ello los criotubos se llevaron rápidamente a un congelador a -80ºC, donde se almacenaron durante al menos un día en una caja de congelación con isopropanol, para favorecer que la congelación fuese paulatina y uniforme. Al día siguiente, se pasaron a un contenedor de N2 líquido donde pueden mantenerse durante largos períodos de tiempo (años) sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a temperaturas tan bajas como -80ºC es posible aunque se detecta deterioro de las células a las pocas semanas o meses. La descongelación de los criotubos almacenados se realizó rápidamente, diluyendo la el agente preservante (DMSO) con la mayor rapidez. Una vez que las células se adhirieron a la placa, se cambió el medio de cultivo para eliminar cualquier traza de DMSO que pudiese quedar y afectar negativamente a las células 21 Nº de cél/ml = nº de células totales contadas x 10.000 x 2 (dilución)/4 (nº de cuadrantes contados) 2.3.2.5 Contaje celular Las células se tripsinizaron, se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en un volumen adecuado de medio de cultivo tomándose una alícuota de 50 μl en un tubo eppendorf. Dicha alícuota se diluyó a la mitad con una solución del colorante Azul Tripán 0.4% en NaCl 0,15 M, dicha molécula coloreada de gran peso molecular, sólo es capaz de entrar en la célula si la membrana plasmática se encuentra dañada, permitiendo distinguir entre la células vivas y las muertas. Para el recuento celular, tras colocar un cubreobjetos de cristal sobre la cámara de Neubauer, se depositó con la ayuda de una micropipeta, una gota de la mezcla de las células y el colorante, de modo que por capilaridad el líquido entre por el espacio que queda entre el cubreobjetos y la cámara. Finalmente, se contaron las células blancas presentes en los cuatro cuadrantes y se calculó la densidad celular (nº de células/ml de medio de cultivo) de la suspensión celular inicial, utilizando la siguiente fórmula: 2.4 Transfección celular La generación de distintas líneas celulares que expresan una determinada proteína de manera estable o transitoria, se llevó a cabo mediante la técnica de transfección celular. Para ello, se utilizó un reactivo comercial FUGENE®HP (Invitrogen). El proceso consta de varias etapas que se llevaron a cabo en distintos días, tal y como se detalla a continuación: - Día 1: El primer día del ensayo se llevó a cabo la transfección de la línea celular empaquetadora, 293T, con tres vectores plasmídicos distintos. Dos de ellos portan información para la generación de la envuelta (pMD2G), la cápside y la polimerasa (psPAX2) del virus y el tercero (pWPI o pWPXLd) contiene clonado el gen que deseamos expresar, mediante el sistema de infección lentiviral, en la línea celular de elección. 22 La transfección química de la línea 293T se realizó utilizando el sistema FUGENE, (Roche), formado por una mezcla de lípidos y otros componentes disueltos en etanol al 80%. El día anterior a la transfección, se sembraron las células 293T en placa de 6 pocillos a una densidad adecuada para alcanzar entre el 60 y el 80% de confluencia, y se procedió tal y como se indica en las instrucciones del fabricante. Se utilizan tres vectores; 3,5 μg de plásmido pMD2G, 6,55 μg de psPAX2 y 10 μg del que contiene el gen que se desea expresar. Se añade FUGENE:DNA con relación 3:1. Es decir, se añaden 60 µl de FUGENE en 940 µl de un medio libre de aditivos ya que hay 20 µg de DNA en total -Día 2: Este segundo día se sembraron también las células que iban a ser infectadas con los virus producidos por 293T en las 48-72 h posteriores a la transfección inicial. Para ello, se sembraron en placas de 100 mm de diámetro de 6 pocillos (en función del experimento) a una densidad celular adecuada para tener una confluencia del 70% el día de la infección. - Día 3: Transcurridas 24 horas tras la transfección de la línea celular 293T con los vectores lentivirales, se pueden recoger los lentivirus empaquetados que se encuentran en el medio de cultivo. A las 48 horas se puede recoger de nuevo el medio, que contendrá una menor cantidad de lentivirus. El medio de las células 293T se centrifugó a 1500 – 2000 rpm durante 5 minutos y se filtró a través de un filtro de 0.45 μm de tamaño de poro para evitar la contaminación de las células a infectar con células productoras de virus. A continuación, se añadió polibreno a una concentración final de 8 μg/ml, para aumentar la eficiencia de la infección, y se vertió la mezcla sobre la placa de células a transfectar. - Día 5: El medio de las células infectadas durante dos días consecutivos, se cambió a medio de selección. Esto además permite eliminar los restos de polibreno, que puede resultarles tóxico. 23 2.5 Extracción, manipulación y análisis de ácidos nucleicos 2.5.1 Extracción de RNA total de cultivos celulares en monocapa Las células se lisaron directamente sobre la placa de cultivo por la adición de TRIzol®. Se partió de una placa de 100 mm expandida hasta un 90% de confluencia, el medio de cultivo fue retirado por succión y se añadieron 2 ml de TRIzol®, resuspendiendo varias veces el lisado celular con ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio estéril a fin de maximizar la ruptura y disgregación celular. El homogeneizado se recogió en dos tubos eppendorf, que se preservaron en baño de hielo. El homogeneizado se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir la disociación de los complejos formados entre proteínas y ácidos nucleicos. Se añadió un volumen de 0.2 ml de cloroformo por mililitro de TRIzol® añadido para iniciar la extracción. Se agitó vigorosamente dejándose estabilizar a temperatura ambiente durante 3 minutos y se centrifugó a 12.000 g durante 15 minutos a 4ºC. Se observó la aparición de dos fases, siendo la superior (acuosa) la que contiene el RNA recogiéndose ésta en un nuevo tubo eppendorf. A la fase acuosa se le añadieron 0.5 ml de alcohol isopropílico por mililitro de TRIzol® empleado, para precipitar el RNA, incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos y centrifugando posteriormente a 12.000 g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se retiró con cuidado para evitar arrastrar el RNA precipitado depositado en el fondo del tubo. El precipitado se lavó dos veces con un mililitro de etanol al 75% en agua DEPC (dietilpirocarbonato, compuesto capaz de eliminar la actividad de las RNAsas) cada vez agitándolo suavemente con ayuda de un agitador vórtex y centrifugando a 9000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se eliminó con ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio estéril y se dejó secar al aire a temperatura ambiente protegido. Finalmente el precipitado de RNA se redisolvió en 50 µl de agua DEPC y se incubó a 60ºC durante 10 minutos para garantizar la correcta redisolución. Las muestras se cuantificaron empleando un espectrofotómetro Nanovue™ y se almacenaron hasta su procesamiento a -80. 24 2.5.2 Extracción de DNA nuclear de cultivos celulares en monocapa Una vez recogidos los pellet de células, estos se resuspendieron en 250ml de TE pH 7.5 (Tris 10Mm/ EDTA 1mM). Después se añadieron 1,25 µl de proteinasa K (20 mg/ml), 5 µl ribonucleasa (10 mg/ml) y 5 µl de dodecilsulfato sódico (SDS) (20%) y se incubaron 3 horas con agitación a 50ºC con el objetivo principal de romper las membranas celulares y liberar el contenido celular interno. Después se realizaron dos extracciones; la primera con 375 µl de una mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) que luego se centrifugó a 14.000rpm durante 5 minutos. Esto formó un sistema de dos fases con un sólido blanco en el límite de las dos fases. Se pasó la fase acuosa (la de arriba) a otro tubo y se realizó otra extracción con 250 µl de una mezcla cloroformo:alcohol isoamilico (24:1). Le siguió una centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos y se volvió a extraer la fase acuosa a otro tubo. El objetivo de estas extracciones era separar y limpiar el DNA de proteínas unidas al DNA. Posteriormente se precipito el DNA de la solución acuosa añadiendo 375 µl de isopropanol. Esta solución se mezcló por inversión y se dejó 15 minutos a -20ºC. Una vez que se obtuvo el DNA precipitado, se centrifugo 14.000 rpm durante 5 minutos, se lavó con 500 µl de etanol (75%) y se volvió a centrifugar de nuevo con las mismas condiciones (14.000 rpm, 5 minutos). El producto se resuspendió en 100 µl de Tris-HCl 10mM pH 8 y se guardó a - 20ºC. 2.5.3 Extracción y purificación de DNA plasmídico Aquellas colonias de las que se deseara extraer el DNA plasmídico se picaron y se crecieron en un tubo eppendorf en un volumen de 4 ml de LB (100 µg/ml ampicilina) a 37ºC con agitación durante toda la noche para el día siguiente extraer plásmido usando el kit comercial GenEluteTM Plasmid Miniprep kit (SIGMA). 2.5.4 Purificación de DNA a partir de geles de agarosa Para purificar productos de digestión de DNA a partir de geles de agarosa, éstos se cargaron en geles del 0.5 al 2% de agarosa en función del tamaño del fragmento a purificar. Tras desarrollarse la electroforesis, el fragmento de DNA se visualizó bajo luz UV y se recortó la banda de agarosa que lo contenía con ayuda de un bisturí estéril. El DNA se purificó utilizando el kit comercial “GenEluteTMGel Extraction Kit” (SIGMA) (ver Tabla 1 de esta misma sección), siguiendo las instrucciones del fabricante del mismo. 25 2.5.5 Cuantificación de DNA Para determinar la concentración y pureza del DNA en nuestras preparaciones, se empleó un espectrofotómetro NanoVue™. La relación de las absorbancias obtenida a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) da idea del grado de pureza de la preparación, considerándose una buena pureza cuando se obtienen relaciones de A260/A280  1.8 para DNA. Para realizar las medidas, se depositaron 2 µl de la disolución de DNA en el pedestal del aparato y tras la medida, se obtuvo directamente tanto la concentración como la relación de absorbancias. 2.5.6 Secuenciación automática del DNA La secuenciación de los fragmentos de DNA clonados en el vector pCR®2.1, se realizó en el Servicio de Secuenciación de DNA de la empresa Secugen S.L. Para cada reacción de secuenciación se requerían 15 µL de DNA plasmídico, a una concentración de 100 ng/ µL. Como oligonucleótidos cebadores de las reacciones de secuenciación se utilizaron los específicos del vector (M13 F y M13 R, en el caso del vector pCR®2.1), provistos por el propio servicio de secuenciación y el primer pWPI en el caso del vector pWPI con el inserto clonado. En este caso se añade un volumen de 1,5 µl de primer pWPI 5mM. Los resultados de la secuenciación se analizaron en un PC usando el programa Codoncode Aligner v3.7.1. 2.6 Programas de PCR empleados 2.6.1 PCR de colonia (PCR de colonia) Con objeto de determinar la presencia de un determinado inserto en un plásmido expresado por una colonia bacteriana tras un proceso de transformación, se realiza la técnica de PCR de colonia o PCR de colonia. Con un palillo estéril, se procede a inocular bacterias de cada colonia susceptible de presentar el inserto en 50 µl de medio LB en un tubo eppendorf de 1,5 mL, con el antibiótico para el que presente resistencia el vector de interés. Los tubos se incubarán a 37ºC y con agitación de 700 rpm (revoluciones por minuto) durante 30 minutos. 32 Figura 5. Línea de evolución de los primates. El número de debajo de cada línea indica el tiempo (en miles de años) en el que se generan nuevas familias de primates. En rojo se marca aquella familia que tiene la variante patológica humana m1494T como forma silvestre. En azul se marca la familia de primates que, además de tener la forma m1494T como forma silvestre, tienen un cambio en el aminoácido 68 de la proteína MRPS12. En otras palabras, la familia Papionini tiene la forma MRPS12:68L mientras que el resto tienen la forma MRPS12:68R. 3.2 El nucleótido 1494 es importante para la función del 12SrRNA La mutación 1494 es patológica, sin embargo parece que la selección negativa y la presión selectiva no están actuando sobre la familia Cercopithecidae, puesto que no ha sido eliminada de la población. Una causa puede ser que porque los efectos fenotípicos solo se manifestaran en etapas post-reproductivas. Sin embargo, en humanos hay individuos que sí que sufrían el fenotipo de la enfermedad a etapas tempranas a su enfermedad. Una posibilidad podría ser que la mutación fuese patológica solo en hombres por lo que, al ser transmitida por la mujer, no hubiese selección negativa. Sin embargo, en los pedigríes se puede observar que las mujeres también están afectadas (Zhao et al, 2004; RodríguezBallesteros et al, 2006; Zhu et al, 2009; Wei, Q. et al, 2013) Esto indica que dicho fenotipo podría estar bajo presión selectiva pero, ¿está esta mutación sufriendo selección negativa? 33 La posición 1494C esta conservada en 292 de 316 especies de mamíferos examinados y además, empleando ConSurf tool (http://consurf.tau.ac.il) para calcular el índice de conservación (CI) con escala de 1 a 9 siendo 9 el máximo grado de conservación y teniendo en cuenta la topología del árbol filogenético, se obtuvo un CI= 9/9 indicando que la posición está completamente conservada. Esto indica que la posición 1494 es importante y que la selección negativa está actuando en mamíferos. 3.3 Una sustitución en la proteína MRPS12:R68L podría compensar la mutación patológica m.1494C>T en macacos Si es verdad que la selección negativa está actuando en la posición 1494 de los mamíferos, ¿Por qué la mutación 1494T no ha sido eliminada de la familia Cercopithecidae? Las mutaciones compensatorias se han considerado una posible explicación para la fijación de mutaciones patológicas codificadas por el mtDNA (Azevedo et al, 2009). Las mutaciones compensatorias suelen aparecer en el mismo gen en el que se encuentra la mutación patológica (Kondrashov et al, 2002) por lo que se analizó el sitio de decodificación del gen 12SrRNA pero en este caso no se vio que la mutación 1494T fuese compensada por un cambio de base en la posición 1555G y así evitar la formación del enlace entre las posiciones 1494 y 1555 (figura 6) Figura 6. Representación del sitio de decodificación 12SrRNA de humano normal, humano con la mutación. El nucleótido mutado 1494 está en amarillo. En rojo se encuentran los nucleótidos diferentes entre la familia Cercopithecoidea y Homo sapiens. 34 La proteína mitocondrial ribosomal S12 (MRPS12) es un componente crítico del sitio de decodificación (Vila-Sanjurjo et al, 2007) y se han descrito mutaciones compensatorias entre proteínas ribosomales y variantes de rRNA (O’ Connor et al, 1991). Por ello se compararon las secuencias de MRPS12 entre humano y uno de los miembros del grupo Cercopithecidae Macaca Mulatta y se observó que había varios aminoácidos diferentes en la secuencia. Pues los aminoácidos 64C, 68R, 101T, 106Q y 107I de la proteína humana corresponden con 64S, 68L, 101N, 106H y 107V en Macaca Mulatta. Después hubo que confirmar la importancia de estos aminoácidos y para ello se empleó el consurf tool dando mayor importancia a aquellos aminoácidos más conservados entre especies. Los resultados (empleando la escala CI= 1-9) fueron: 64C=5, 68R=9, 101T=1, 106Q=7 y 107I=4 indicando que el aminoácido 68R estaba conservado en todas las especies de primates menos en el grupo de Papionini que tienen una Leucina en esa posición (figura 7). Figura 7. Secuencias de la proteína MRPS12 de varios mamíferos. Solo se señalan los aminoácidos 44, 58, 64, 67, 68, 84, 101, 106, 107 y 125. En amarillo se señalan las secuencias a comparar de humano y macaco. En azul se encuentran los aminoácidos que coinciden entre humano y macaco. Aquellos aminoácidos en los que se diferencian las secuencias de humano y Macaco están marcados en rojo (Macaca mulatta y Macaca nemestrina). Macaca mulatta y Macaca nemestrina se diferencian solo en el aminoácido 107. Para comprobar si este aminoácido, que se encuentra muy conservado, juega un papel importante en la mutación 1494, este se localizó en la estructura cristalina de un ribosoma bacteriano (Thermus termophilus) donde se vió que el aminoácido 68 está localizado a unos 6 Å de distancia del nucleótido m.1494, mucho más cerca que el resto de aminoácidos polimórficos, los cuales se encuentran mucho más alejados (figura 8A). Tambien se sabe que mutaciones en el aminoácido 68 confieren resistencia a Escherichia Coli a el error inducido por aminoglicósidos (Agarwal et al, 2011). 35 Figura 8. Interacción entre la zona codificante del rRNA mitocondrial y RPS12. A) Se puede apreciar que, de entre todos los aminoácidos de la proteína ribosomal S12 diferentes entre humano y macaco (en rojo), el aminoácido 68 es el más próximo a región 1555 (verde) y 1494 (rojo) por lo que se piensa que un cambio en este aminoácido tendrá mayores consecuencias que en los demás. B) Se puede apreciar que, de entre todos los aminoácidos polimórficos de la proteína ribosomal S12 humana (en rojo), el aminoácido 68 es el más próximo a región 1555 (verde) y 1494 (rojo). 3.4 Las células Cercopithecidae son resistentes a los aminoglicósidos Puesto que la proteína MRPS12:68L puede jugar un papel muy importante en el sitio de decodificación A del ribosoma se quiso analizar el efecto de los aminoglicósidos en las células Cercopithecidae. Para ello, se obtuvieron fibroblastos primarios de la piel de Macaca Nemestrina (MN) (macaque, tribu Papionini) y una línea de células inmortalizadas (COS-1) de Cercopithecus aethiops (grivet, tribu Cercopithecini) y se confirmó mediante secuenciación que tenían una timina en la posición 1494 (figura 9). A B 36 Figura 9. Secuenciación de la posición 1494 en MN y COS-1. La flecha negra señala la posición 1494 donde hay una T. La secuencia de comparación es la del Homo sapiens mutada. Después se confirmó la presencia del aminoácido leucina (en MN) y arginina (en COS-1) en la posición 68 de MRPS12 (figura 10). Tambien se encontraron otros aminoácidos distintos entre COS-1 y MN (S29A, V107I y T124K). Figura 10. Parte de la secuenciación de MRPS12 de MN y COS-1. En MN hay una leucina mientras que en COS1, (al igual que en homo sapiens) hay una arginina en la posición 68. 37 Para analizar el comportamiento de las células de MN, estas se cultivaron con aminoglicósidos en concentración de 2 y 4 mg/ml y el crecimiento fue similar en medios con o sin antibiótico (figura 12). No se pudieron analizar las células de COS-1 porque habían sido previamente inmortalizadas con el vector p652(pMKSV40/8-4) que contiene un gen de resistencia a aminoglicósidos. No obstante, se emplearon 2 parejas de primers para amplificar los genes SV40 (control que se encuentra en el vector de inmortalización) y el de kanamicina. Empleando diferentes temperaturas de hibridación de primers no se logró amplificar el gen de kanamicina mientras que sí que hubo amplificación cuando se emplearon los primers SV40 (figura 11) Figura 11. Geles de electroforesis de la línea celular COS-1. Amplificación, en DNA de las células COS-1, de las regiones SV40 y Kan del vector p652pMKSV40 8-4 empleado en su inmortalización. Se indican las diferentes temperaturas de hibridación utilizadas. No hubo amplificación del gen de resistencia a kanamicina. Visto que no había resultados en la amplificación, se cultivaron las lineas celulares COS-1 y una línea derivada del osteosarcoma humano (143B) en medio con aminoglicósidos. El crecimiento de las células COS-1 no estaba afectado por geneticina al contrario que la línea 143B, aunque no se haya podido amplificar el gen de resistencia a aminoglicósidos. Los aminoglicósidos no tienen un efecto importante en los ribosomas mitocondriales de las células de MN al contrario de lo que se ha visto previamente en otros estudios con líneas celulares de linfoblastos inmortalizados y de cíbridos 143B, las cuales albergan la mutación 38 m.1494C>T muestran un mayor tiempo de crecimiento cuando se les añade aminoglicósidos (2mg/ml) al medio (Zhao et al, 2004; 2005). Un resultado similar ocurre con estas líneas celulares cuando albergan la mutación m.1555A>G al ser cultivadas en el mismo medio (Pacheu-Grau et al, 2011). Estos resultados muestran que es muy probable que la mutación esté compensada en la familia Papionini. 3.5 MRPS12 podría ser un factor modificante que explique la incompleta penetrancia de la mutación patológica humana m.1494C>T y la ausencia del fenotipo patológico en MN Los resultados previos sugieren que la variante de la proteína MRPS12 puede ser un posible factor modificante que podría explicar la incompleta penetrancia de la mutación m.1494C>T. Por ello se buscó variantes en la secuencia de la proteína humana y se encontraron 9 (3 de ellos en la secuencia de importe a la mitocondria : rs143032757, G5S; rs33988199, H8R; y rs150096976, R23W y 6 en la proteína madura: rs147007310, R44G; rs143630390, L58P; rs111688400, T67S; rs147184696, R68C; rs140018981, R84W; y rs143918075, V125I). Para confirmar la importancia de los aminoácidos R44, L58, T67, R68, R84, V125 se estimó el CI empleando el programa consurftool y se obtuvieron valores de 1, 7, 7, 9, 9 y 7 Figura 12. Crecimiento de células de Macaca nemestrina en medio con galactosa, paromomicina y geneticina. A) imágenes de las líneas celulares. B) cuantificación del crecimiento considerando 100% o crecimiento normal el cultivo celular sin antibiótico. El crecimiento celular apenas está afectado por la presencia de paromomicina. 39 respectivamente, y se localizaron estos aminoácidos en una estructura cristalina del ribosoma de una bacteria (Thermus thermophilus) (Figura 8B). El aminoácido 68, como se ha mencionado previamente, está muy conservado y es el más cercano al nucleótido m.1494 (a menos de 6 Å), el resto de posiciones polimórficas están lejos de m.1494. Las posiciones equivalentes a RPS12 68 y 125 en Escherichia coli confieren resistencia a aminoglicósidos (Agarwal et al, 2009). Además, mutaciones en la proteína MRPS12 podrían ser causas de sordera autosómica dominante (Shah et al, 2001). 3.6 Estudio del aminoácido 68 de la proteína MRPS12 como factor que modifica el efecto de la mutación m.1494C>T Para estudiar el posible papel de los polimorfismos de MRPS12, expresamos la proteína silvestre y la proteína con variantes en el aminoácido de la posición RPS12 68 en las líneas celulares humana (143B) y de macaco (MN) (m.1494C y m.1494T respectivamente). La proteína MRPS12 se clonó a partir de cDNA derivado de las líneas celulares. Para evitar la senescencia de la línea NM, esta se inmortalizó utilizando el vector pLOX-Ttag-IresTK (MNLOX). Se ha descrito que la localización de los mRNAs codificantes de proteínas mitocondriales en la proximidad de la mitocondria está mediada por las secuencias 3’UTR . En el caso de la proteína MRS12 las señales responsables de la localización se encuentran en los primeros 154 nt de la secuencia 3’UTR ( Russo A. et al, 2008.) Se clonó por tanto la secuencia codificante de la proteína MRS12 junto con su secuencia 3’UTR completa en cada caso (figura 13). 40 Figura 13. Geles de electroforesis de 143B y MN. A) Producto de PCR (730pb) del cDNA de 143B y Macaco nemestrina. B) Colonias de PCR de colonia de 143B después de la ligación y transformación C) Colonias de PCR sucia de Macaco nemestrina después de ligación y transformación. Las colonias enviadas a secuenciar. Las secuencias obtenidas se correspondieron con los transcritos consenso humano (MRPS12201 ENST00000308018) y de macaco (ENSMMUT00000016525) recopilados en la base de datos ENSEMBL. Mediante mutagénesis dirigida se introdujeron las mutaciones R68L y L68R respectivamente. El producto se volvió a transformar en bacterias y los plásmidos se enviaron a secuenciar (figura 14). Figura 14. Mutagénesis dirigida. A) colonias candidatas enviadas a secuenciar. B) nucleótido mutado en 143B (arriba) en comparación con la secuencia de 143B inicial (abajo). C) nucleótido mutado en MN (arriba) en comparación con la secuencia de 143B inicial (abajo). 41 Las distintas variantes de la proteína MRS12 se transfirieron al vector de expresión lentiviral pWPI para su sobre-expresión en las líneas celulares humana y macaco respectivamente. Para ello los productos de ligación del vector se volvieron a transformar en bacterias y su plásmido se envió a secuenciar (figura 15). Se generaron así las líneas celulares 143BMRS12, (143B WT), 143BMRS12 (R68L) (143B mutada), MN LOX-MRS12 (MN WT), MN LOX-MRS12(L68R) (MN mutada) (Tabla 10). Figura 15. Clonaje de los de las secuencias WT y mutada de 143B y MN en pWPI. PCR de colonia de las bacterias que aceptaron el producto de ligación:A) 143B (WT). B) 143B (mutada). C) MN (WT).D) MN (mutada). Tabla 10. Líneas celulares creadas. Se resumen las características más significativas de cada línea celular. Nombre línea celular Variante del gen MT-RNR1 Tipo MRPS12 sobreexpresada 143B pWPXLd (control -) 1494C - Macaco pWPXLd (control-) 1494T - 143BMRS12 1494C MRPS12:68R 143BMRS12(R68L) 1494C MRPS12:68L MN LOX-MRS12 1494T MRPS12:68L MN LOX-MRS12(L68R) 1494T MRPS12:68R 48 7 Bibliografía (1) Agarwal D, Gregory ST, O'Connor M. Error-prone and error-restrictive mutations affecting ribosomal protein S12. J Mol Biol 2011 Jul 1;410(1):1-9. (2) Azevedo L, Carneiro J, van Asch B, Moleirinho A, Pereira F, Amorim A. Epistatic interactions modulate the evolution of mammalian mitochondrial respiratory complex components. BMC Genomics 2009 Jun 13;10:266-2164-10-266. (3) Bindu LH, Reddy PP. Genetics of aminoglycoside-induced and prelingual non-syndromic mitochondrial hearing impairment: a review. Int J Audiol 2008 Nov;47(11):702-707. (4) Carelli V, Giordano C, d'Amati G. Pathogenic expression of homoplasmic mtDNA mutations needs a complex nuclear-mitochondrial interaction. 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