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Trabajo Fin de Máster Presencia y acumulación de microorganismos potencialmente patógenos en el mejillón cebra de aguas superficiales de Aragón Autor Jesús Abadias Ullod Director/es Pilar Goñi Cepero Mª Peña Ormad Melero Escuela de Ingeniería y Arquitectura 2013 2 Me gustaría dar las gracias… A Peña y Pili por su apoyo y consejos en todo momento. A mis compañeros de laboratorio por su amabilidad en el trabajo diario y en especial a Noelia, Pilar, Isabel y José por toda su ayuda recibida. A Munia por su disponibilidad y ayuda en mis inicios en este proyecto. Sobre todo a mi familia, en especial a mis padres y hermanos por creer siempre en mí. 3 4 Presencia y acumulación de microorganismos potencialmente patógenos en el mejillón cebra de aguas superficiales de Aragón Resumen Los moluscos bivalvos son animales que se alimentan filtrando el agua de su entorno, de donde extraen el alimento, al que se unen diversos contaminantes químicos y biológicos que se encuentran en las aguas. El mejillón cebra es un molusco bivalvo originario de la región Ponto-cáspica, y que actualmente se ha extendido invadiendo diversas zonas del continente europeo y americano, entre las que se encuentra la cuenca hidrográfica del Ebro. Diversos estudios de investigación muestran como los moluscos acumulan contaminantes presentes en la aguas y como pueden ser utilizados como indicadores de la calidad de dichas aguas. Conscientes del potencial patógeno que en general puede presentar cualquier tipo de molusco por su capacidad para acumular contaminantes peligrosos, se pretende evaluar y definir el riesgo que representan especies invasoras como el mejillón cebra, en aguas de la Comunidad Autónoma de Aragón, al actuar como reservorio de microorganismos patógenos. Los diferentes ensayos realizados en este proyecto se centran en evaluar la presencia y cantidad de las bacterias indicadoras y patógenas, Escherichia coli, Enterococcus sp., Salmonella sp. y Pseudomonas aeruginosa, y protozoos parásitos como Cryptosporidium sp., Giardia duodenalis y amebas de vida libre, tanto en aguas naturales de Aragón como en los mejillones cebra que habitan en ellas. Se ha detectado la presencia Cryptosporidium sp. y amebas de vida libre en el interior del mejillón cebra, así como todas las bacterias estudiadas, confirmando la capacidad que tienen estos organismos bivalvos para retener y concentrar microorganismos patógenos. Los resultados de este proyecto indican sin embargo, que el mejillón cebra es capaz de filtrar y acumular las bacterias presentes en el agua de distinta manera atendiendo al género al que pertenezcan. Los ensayos realizados para evaluar la capacidad de acumulación bacteriana indican que estos organismos son capaces de acumular prácticamente la totalidad de bacterias de Escherichia coli y Enterococcus sp. en 24 horas, cuando todo el agua presente en la muestra objeto de estudio es filtrada por los mejillones cebra, siendo la capacidad acumulativa para E. coli mayor que para Enterococcus sp. Este hecho posiblemente ocurra porque el mayor tamaño de E. coli permite una mayor retención en el filtrado respecto a Enterococcus sp.. Esta mayor acumulación de E. coli, medida a través del agua de estudio, no refleja una mayor concentración interna de dicha bacteria con respecto a Enterococcus sp., debido posiblemente a una distinta metabolización de las bacteria en el interior del mejillón cebra, u otro factor que se desconoce hasta el momento. La gran capacidad que tiene el mejillón cebra para concentrar microorganismos patógenos supone un gran riesgo ambiental y sanitario, ya que pueden aumentar de una forma elevada la concentración de estos microorganismos en el agua, cuando los mejillones, por ciertas causas ambientales o bióticas, los expulsen al agua. 5 6 Índice MEMORIA CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS .................................................. 13 CAPÍTULO 2. EL MEJILLÓN CEBRA COMO ESPECIE ................................... 15 2.1. Biología y ecología .............................................................................................. 15 2.2. Reproducción y ciclo biológico ........................................................................... 16 2.3. Origen en la cuenca hidrográfica del Ebro .......................................................... 17 2.4. Efectos ecológicos y socioeconómicos ................................................................ 18 CAPÍTULO 3. DISEÑO Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ..................... 21 3.1. Metodología analítica en aguas ............................................................................ 21 3.1.1. Parámetros físico-químicos ........................................................................................ 21 3.1.2. Parámetros microbiológicos ...................................................................................... 21 3.2. Metodología analítica microbiológica en Dreissena polymorpha ....................... 23 3.2.1. Obtención del extracto .............................................................................................. 23 3.2.2. Análisis de bacterias .................................................................................................. 23 3.2.3. Análisis de parásitos .................................................................................................. 23 3.3. Muestras de agua superficial y mejillón cebra ..................................................... 25 3.4. Mantenimiento y cría en cautividad del mejillón cebra ....................................... 26 3.4.1. Monitorización de las condiciones del acuario .......................................................... 26 3.4.2. Observación de larvas de Dreissena polymorpha ...................................................... 27 3.5. Presencia de patógenos en el mejillón cebra de aguas superficiales de Aragón .. 28 3.6. Determinación in vitro de la acumulación e infección de bacterias por Dreissena polymorpha ................................................................................................................. 28 3.6.1. Acumulación bacteriana ............................................................................................ 28 3.6.2. Infección bacteriana .................................................................................................. 30 CAPÍTULO 4. RESULTADOS ................................................................................... 33 4.1. Mantenimiento y cría en cautividad del mejillón cebra ....................................... 33 4.1.1. Monitorización de las condiciones del acuario .......................................................... 33 4.1.2. Observación de larvas de Dreissena polymorpha ...................................................... 34 4.2. Detección de patógenos en mejillones cebra de aguas superficiales de Aragón . 35 4.2.1. Parámetros físico-químicos ........................................................................................ 35 4.2.2. Análisis de bacterias .................................................................................................. 35 4.2.3. Análisis de parásitos .................................................................................................. 37 4.3. Acumulación e infección in vitro de bacterias por Dreissena polymorpha ......... 39 4.3.1. Resultados acumulación bacteriana en el mejillón cebra .......................................... 39 4.3.2. Resultados infección bacteriana por el mejillón cebra .............................................. 48 CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES .............................................................................. 55 CAPÍTULO 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................ 59 7 ANEXOS ANEXO I. Terminología científica de estudio ........................................................... 65 ANEXO II. Microorganismos patógenos objeto de estudio. ..................................... 67 II.I. Escherichia coli ................................................................................................... 67 II.II. Enterococcus sp. ................................................................................................. 67 II.III. Salmonella sp. ................................................................................................... 67 II.IV. Pseudomonas aeruginosa ................................................................................. 67 II.V. Cryptosporidium sp. ........................................................................................... 68 II.VI. Giardia duodenalis ........................................................................................... 68 II.VII. Amebas de vida libre ....................................................................................... 68 ANEXO III. Metodología analítica físico-química .................................................... 69 III.I. Oxígeno disuelto ................................................................................................. 69 III.II. Temperatura ...................................................................................................... 69 III.III. pH ..................................................................................................................... 69 III.IV. Conductividad .................................................................................................. 69 III.V. Dureza total ....................................................................................................... 69 III.VI. Dureza de calcio .............................................................................................. 70 ANEXO IV. Metodología analítica microbiológica ................................................... 71 IV.I. Diluciones seriadas ............................................................................................. 71 IV.II. Medios de cultivo .............................................................................................. 71 IV.II.i. Agar McConkey .......................................................................................................... 72 IV.II.ii. Slanetz & Bartley agar .............................................................................................. 72 IV.II.iii. Salmonella-Shigella agar ......................................................................................... 73 IV.II.iv. Agar Cetrimida ......................................................................................................... 74 IV.III. Métodos de siembra ......................................................................................... 74 IV.III.i. Método de filtración por membrana ........................................................................ 74 IV.III.ii. Método de siembra en superficie ............................................................................ 75 IV.IV. Incubación ....................................................................................................... 75 IV.V. Recuento bacteriano .......................................................................................... 75 IV.VI. Procedimiento experimental de fortificación bacteriana de muestras ............. 76 ANEXO V. Resultados ................................................................................................. 79 V.I. Resultados de parámetros físico-químicos de control en el acuario .................... 79 V.II. Imágenes de los resultados de acumulación bacteriana ..................................... 82 V.II.i. Escherichia coli ........................................................................................................... 82 V.II.ii. Enterococcus sp. ........................................................................................................ 82 V.II.iii. Salmonella sp. ........................................................................................................... 83 8 9 En la mayoría de los hábitats se fija a sustratos duros como rocas, rejas metálicas, cascos de embarcaciones e incluso sobre estructuras duras de otros animales como valvas pertenecientes a otros mejillones cebra. Suele formar grandes colonias, llegando a alcanzar densidades de miles de individuos por metro cuadrado. Es una especie filtradora de seston (partículas en suspensión, inertes o vivas), que se alimenta principalmente de fitoplancton, zooplancton de pequeño tamaño y restos de materia orgánica que obtiene del agua que le rodea. Un individuo adulto es capaz de filtrar hasta 2,5 litros de agua al día (Claudi y Mackie, 1994), pero hay una enorme variabilidad en las tasas de filtración según otros autores (Ackerman, 1999; Baldwin et al., 2002), las cuales pueden derivar de distintos factores abióticos y bióticos. El tamaño de partículas que puede filtrar y retener el mejillón cebra es de hasta 0,7 μm, mostrando preferencia por partículas de mayor tamaño entre 15 y 40 μm (Claudi y Mackie, 1994). Las características propias de la especie que la definen como una de las invasoras más proliferas son su elevada capacidad reproductora y su gran plasticidad fisiológica, que le han permitido sobrevivir y reproducirse en un gran abanico de condiciones ambientales y de hábitat. Los factores abióticos más limitantes para el crecimiento de la especie son el pH del agua, la temperatura y la concentración de calcio. En la bibliografía aparecen distintos datos sobre los límites de supervivencia de la especie en distintas masas de agua, aunque estos valores están bastante consensuados. El mejillón cebra en estado adulto requiere de un pH superior a 6,5 - 6,8 (McMahon, 1996; Claudie y Mackie, 1994). En cuanto a la temperatura soporta rangos amplios de temperatura, siempre superiores a 0oC, ya que no soportan la congelación, con límites máximos ente 29-31oC. Su rango óptimo de crecimiento se fija entre los 18oC y 20oC. La concentración de calcio mínima requerida para la supervivencia de los individuos se fija entre 12 y 15 mg Ca/l, debido a que necesitan un continuo aporte de este ion para la formación de su concha de carbonato de calcio. 2.2. Reproducción y ciclo biológico Dreissena polymorpha es una especie dioica con ratio 1:1, en cuyo ciclo de vida se diferencian dos etapas o fases de vida, una fase larvaria o planctónica que como su nombre indica se desarrolla en la columna de agua y otra fase adulta o bentónica en la que el mejillón vive anclado a un sustrato. En la Figura 2 se observa el ciclo de vida del mejillón cebra con sus distintas etapas de desarrollo. La reproducción se inicia con la suelta de gametos sexuales al agua por parte de los individuos adultos, y es en este medio donde se produce la fecundación, la cual es externa. Una vez desarrollado el embrión comienzan a diferenciarse las distintas etapas larvarias. Al cabo de unas horas de la fecundación, se produce la transformación del embrión a larva trocófora. Esta larva gracias a los nutrientes presentes en el embrión desarrolla una estructura llamada velum, que es un órgano ciliado que permite el movimiento, formándose así la larva velígera. A partir de este momento la larva va creciendo y desarrollándose, formando las valvas, el pie, el sistema de sifones a partir de los cuales podrá hacer circular el agua para filtrar los nutrientes y los demás órganos necesarios en el individuo adulto (Claudi y Mackie, 1994). En el momento que la larva, en estado pedivelígero, secreta una estructura filamentosa denominada biso, es cuando esta larva se ancla a un sustrato y se fija a él, terminando el desarrollo hacia estado adulto. Al cabo de un mes, se pueden tener individuos que se han adherido al sustrato. 16 Figura 2. Ciclo reproductivo Dreissena polymorpha (Palau et al., 2004). El factor principal y detonante del comienzo de la época reproductiva es la temperatura. Los individuos de esta especie inician la reproducción cuando llega la época primaveral y el agua alcanza una temperatura entre los 12oC y 15oC (Claudi y Mackie, 1994; Palau et al., 2004). El máximo de esta actividad reproductora, así como los rangos de temperatura de inicio de la reproducción pueden variar según poblaciones. El mejillón cebra realiza la reproducción durante dos o extraordinariamente tres periodos a lo largo del año, liberando los gametos durante un periodo comprendido entre 6 y 8 semanas. La primera suelta de gametos es la de mayor entidad (Borcherding, 1991) y normalmente tiene lugar en primavera (Abril-Mayo) (Claudi y Mackie, 1994). En lugares cálidos esta fase reproductiva puede durar hasta 5 meses. 2.3. Origen en la cuenca hidrográfica del Ebro Dreissena polymorpha se ha definido como especie exótica invasora y está catalogada dentro de las 100 especies exóticas invasoras más dañinas por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN, 2000). Toda especie invasora tiene alguna característica específica que le permite formar en este grupo (EEI), y por tanto la capacidad de invadir nuevos hábitats y ecosistemas. Según diversos estudios el mejillón cebra es originario de la región Ponto-cáspica y fue descrito por Pallas en el río Ural en 1771 por primera vez. Pronto se descubrieron ejemplares en el mar Caspio y el mar Negro. La creación de canales y vías de navegación y comunicación fluvial, junto con el tráfico de embarcaciones produjeron su expansión desde dicha zona hacia el resto de Europa. La introducción de la especie en el continente Norteamericano se produjo mucho más tarde, citada alrededor de 1985-1986, seguramente se produjo a través de aguas de lastre de barcos europeos transoceánicos. 17 En nuestro país se detectó por primera vez el mejillón cebra en el río Llobregat, Barcelona, en 1982. Se trató de una pequeña población que no prosperó debido a las fuertes crecidas que tuvieron lugar en invierno de ese mismo año (Ruiz Altaba, 1992). A partir del año 2001 se habla de esta especie como especie exótica invasora en el tramo inferior del río Ebro (Ruiz Altaba et al., 2001). Esta tardía invasión en la península Ibérica pudo darse por un aislamiento geográfico ocasionado por los Pirineos (Rajagopal et al., 2009). Se barajan varias hipótesis acerca del vector de entrada del mejillón cebra en el río Ebro, pero casi todos los focos apuntan a un mal uso de las prácticas recreativas acuáticas, siendo las barcas de uso deportivo o los peces utilizados como cebo en la pesca deportiva, introducidos de otros países, como el principal foco de invasión de esta especie de mejillón. Desde ese momento ha ido colonizando gran parte de la cuenca del Ebro y otras cuencas hidrográficas de la península Ibérica. 2.4. Efectos ecológicos y socioeconómicos El impacto que tienen estas especies invasoras no solo repercute en la biodiversidad, sino también en el campo económico. La intensidad y magnitud de las alteraciones provocadas dependen de la especie invasora, pero en gran medida del ecosistema receptor y de las condiciones ambientales de este. No siempre las modificaciones o alteraciones provocadas por estas especies son negativas, ya que alguna de ellas puede tener efectos neutros o benignos. Los principales efectos ecológicos y socioeconómicos ocasionados por Dreissena polymorpha son: -Disminución de la disponibilidad de alimento y oxígeno para otras especies autóctonas, que puede ocasionar la disminución de sus poblaciones o incluso su desaparición. -Competencia por el sustrato con otras especies autóctonas e incluso utilización de ciertas especies acuáticas, como cangrejos o grandes bivalvos, como base de anclaje para sus conchas. -Aumento espectacular de macrófitos en las masas de agua, debido que la alta capacidad de filtración de fitoplancton por parte de Dreissena polymorpha provoca una clarificación del agua y un aumento de la luz y los nutrientes disponibles para los macrófitos (Palau et al., 2004). Estos cambios en la columna de agua también pueden afectar a comunidades como el zooplancton y los peces. -Afectación de numerosas infraestructuras como tuberías y zonas de captación de agua para actividades urbanas y agrícolas debido a su capacidad para formar agregados de cientos o miles de individuos. -Daños en embarcaciones y sistemas de navegación. -Disminución de las actividades recreativas acuáticas, debido a un mayor control para la prevención de nuevas invasiones. -Gastos derivados de la prevención y erradicación de afectaciones producidas por la invasión de esta especie. 18 -Capacidad de retener compuestos contaminantes para las aguas y metales pesados (Carrasco et al., 2008), que luego pueden introducir en la cadena trófica. - Capacidad de introducir en la invasión de una nueva masa de agua, distintas especies que le acompañan, siendo parásitas o simbiontes habituales de su lugar de origen. Un claro ejemplo es el caso de Phyllodistomum folium (Peribáñez et al., 2006) un helminto trematodo que se desarrolla en el mejillón cebra y en fase adulta causa una enfermedad urinaria a algunos peces. -Posible utilización en la industria de tratamiento de aguas como bioacumulador de contaminantes y agente clarificador de aguas (Elliott et al., 2008). - Transmisión de enfermedades (objeto de estudio de este Trabajo Fin de Máster), ya que tienen una alta capacidad de filtración y retención de partículas extremadamente pequeñas (de hasta 0,7 μm) en aguas naturales (Claudi y Mackie, 1994) y son capaces de acumular y concentrar microorganismos patógenos humanos, tanto protozoos y hongos patógenos (Graczyk et al. 2001; 2003; 2004) y bacterias como Escherichia coli (Selegean et al., 2001). Esto le convierte en un posible transmisor de enfermedades, ya que son capaces de acumular microorganismos patógenos, pudiéndolos expulsar más tarde a otro hábitat diferente. 19 20 CAPÍTULO 3. DISEÑO Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 3.1. Metodología analítica en aguas 3.1.1. Parámetros físico-químicos La Tabla 1 muestra los parámetros físico-químicos analizados en las muestras de agua de este trabajo de investigación, así como la instrumentación y la metodología utilizada para ello. Tabla 1. Métodos e instrumentos utilizados en la experimentación para la caracterización físicoquímica de las muestras de agua. Parámetro Método normalizado Metodología Instrumental Marca y Modelo Rango de medida Error Oxígeno disuelto 5814:1990 (UNE - EN ISO) Medida de oxígeno disuelto y temperatura HANNA Instruments HI 9146N 0,00-45,00 ppm 1,5% Temperatura 0-50oC ± 0’2 oC pH SM 4500-HB (Standard Methods) pH-metría CRISON GLP 21 1-14 ± 0’02 Conductividad 27888:1994 (UNE - EN ISO) Conductimetría CRISON Basic 30 0,01 – 19999 µS/cm ± 0’02 µS/cm Dureza total 77040:2002 (UNE - EN ISO) Valoración - - - Dureza de Calcio SM 3500-Ca B (Standard Methods) Valoración - - - Los parámetros analizados y la metodología analítica están descritos de forma detallada en el ANEXO III. 3.1.2. Parámetros microbiológicos Los parámetros microbiológicos objeto de estudio en las aguas analizadas son la identificación y cuantificación de distintas bacterias indicadoras de contaminación fecal y ambiental, en concreto: Escherichia coli, Enterococcus sp., Salmonella sp. y Pseudomonas aeruginosa. La descripción detallada de dichas bacterias aparece en el ANEXO II. 21 Los equipos de laboratorio utilizados en el análisis microbiológico de las aguas, son los mostrados en la Tabla 2. Todo el material de vidrio utilizado se esteriliza en autoclave a 121oC y 1 bar de presión durante 15 minutos. Tabla 2. Equipos de laboratorio utilizados en los análisis microbiológicos. Instrumento Marca Modelo Función Estufas de cultivo J.P. Selecta INCUDIGIT 36 L Cultivo bacteriológico Baño termostático J.P. Selecta PRECISTEM 20 L Mantenimiento del agar en estado líquido Autoclave J.P. Selecta 437-P Esterilización del material Rampa de filtración Millipore Sistema Microfil Análisis microbiológico Mechero bunsen Crear condiciones estériles Agitador Vortex Velp Scientifica ZX3 Mezcla de soluciones en tubos En la Tabla 3 se muestran los procedimientos analíticos, los medios de cultivo, los métodos de siembra y el tiempo y la temperatura de incubación de los distintos indicadores bacterianos de contaminación utilizados en las aguas analizadas durante este proyecto. Tabla 3. Indicadores bacterianos de contaminación en las aguas. Indicador bacteriano Procedimientos analíticos Medio de cultivo Métodos de siembra Tiempo y temperatura de incubación Escherichia coli UNE-EN ISO 9308-1:2000 y 9215.C [Clesceri et al., 2005] McConkey Agar (Scharlau) Filtración por membrana y siembra en superficie 24 horas a 42oC Enterococcus sp. UNE-EN ISO 7899-2:2001 y 9215.C [Clesceri et al., 2005] Slanetz & Bartley Agar (Scharlau) Filtración por membrana y siembra en superficie 48 horas a 37oC Salmonella sp. 9215.C [Clesceri et al., 2005] SalmonellaShigella Agar (Scharlau) Filtración por membrana y siembra en superficie 48 horas a 37oC Pseudomonas aeruginosa UNE-EN ISO 16266:2006 y 9215.C [Clesceri et al., 2005] Cetrimide Agar (Scharlau) Filtración por membrana y siembra en superficie 48 horas a 37oC Los resultados obtenidos se expresan en UFC/100 mL ó UFC/mL. La descripción de las diluciones seriadas pertinentes, los medios de cultivo, los métodos de siembra, la incubación y el recuento de bacterias se encuentra de forma detallada en el ANEXO IV. 22 3.2. Metodología analítica microbiológica en Dreissena polymorpha 3.2.1. Obtención del extracto El análisis de la contaminación microbiológica en el mejillón cebra se realiza a partir de del extracto homogeneizado del tejido interno del mismo. El procedimiento consiste en la extracción del tejido del molusco, junto con el agua retenida en su interior, con la ayuda de unas pinzas metálicas y un bisturí. Se anota el peso del tejido junto con el peso del medio acuoso interno de los mejillones y se homogeneíza mecánicamente en un recipiente de porcelana. Al homogeneizado se le añade una cantidad determinada de PBS (Phosphate buffered saline) ó tampón fosfato salino, el cual viene esterilizado (Scharlau). Se anota la cantidad de PBS añadida. De esta manera se obtiene el extracto deseado, el cual se divide en alícuotas para el análisis de los distintos patógenos. Las valvas y el biso del mejillón se desechan y no se analizan debido a que su dureza imposibilita su homogeneización como extracto. 3.2.2. Análisis de bacterias A partir del extracto de mejillón obtenido se analiza la cantidad de bacterias presentes en el interior de este molusco. Las bacterias estudiadas en el tejido interior del mejillón cebra son Escherichia coli, Enterococcus sp., Salmonella sp. y Pseudomonas aeruginosa. Se trabaja utilizando el extracto como si fuese agua, es decir, utilizando el mismo material y toda la metodología de cultivo utilizada en el apartado 3.1.2. y descrita detalladamente en el ANEXO IV. Los resultados se obtienen en UFC/mL de extracto, pero se expresan en UFC/gramo de mejillón cebra, en los que el peso de mejillón cebra es la suma del tejido y el agua retenida en su interior. Para ello se calculan los gramos de mejillón cebra (tejido + agua intersticial) presentes en cada mililitro de extracto. La densidad del tejido interior del mejillón se considera 1 gramo/mL, debido al gran porcentaje de agua presente en el tejido de los moluscos. Los equipos de laboratorio utilizados en los análisis microbiológicos en Dreissena polymorpha son los mostrados en la Tabla 2 del apartado 3.1.2. Todo el material de vidrio y metálico utilizado se esteriliza en autoclave a 121oC y 1 bar de presión durante 15 minutos. 3.2.3. Análisis de parásitos La analítica llevada a cabo permite evaluar la presencia o ausencia de ciertos parásitos en el interior del mejillón cebra. El estudio se realiza, igual que el análisis bacteriológico, a partir del extracto de mejillón cebra. Los parásitos a evaluar son Giardia, Cryptosporidium y amebas de vida libre (la descripción de dichos protozoos parásitos aparece de forma detallada en el ANEXO II). A diferencia del análisis de bacterias que evalúan la presencia y el número de las mismas, los análisis parasitológicos de este proyecto se realizan solamente para detectar la presencia de dichos organismos. 23 Toda la analítica se realiza en condiciones estériles y de seguridad para evitar una posible contaminación. El microscopio óptico utilizado para evaluar la presencia de estos parásitos es un Zeiss Axiostar Plus. Giardia duodenalis: El análisis de detección este protozoo parásito consiste en la visualización del extracto de mejillón cebra con el microscopio óptico. Se toman 20 µL de la muestra del extracto preparado y se ponen en un portaobjetos. En cada portaobjetos se pueden poner dos réplicas, a las cuales se depositará encima un cubreobjetos. Cryptosporidium sp.: El estudio de la presencia de este organismo parásito se realiza mediante la detección de sus ooquistes con la tinción de Ziehl-Neelsen modificada (Henriksen y Pohlenz, 1981). Este método de tinción consiste en depositar sobre un portaobjetos 20 µL del extracto obtenido y dejarlo secar al aire. Se fija la preparación con metanol durante 10 minutos. Seguidamente se cubren las preparaciones con papel de filtro y se añade fucsina básica fenicada por encima. Se deja actuar la fucsina durante 20 minutos y se realiza un lavado con agua destilada. Se decolora con H2SO4 al 7% durante 1 o 2 minutos y se vuelve a lavar con agua destilada. Por último se cubren las preparaciones con una solución contracolorante (azul de metileno), y después de un minuto se lava con agua destilada y se deja secar el portaobjetos en disposición vertical. Una vez listas las preparaciones con la tinción de Zielh-Neelsen modificada, estas se observan con el microscopio óptico. Amebas de vida libre (AVL): Para detectar la presencia de amebas de vida libre (AVL) en el extracto de mejillón se prepara un medio adecuado para el crecimiento y desarrollo de estas amebas. El medio escogido es un medio sólido de consistencia, agar no nutritivo, Scharlau (12-15 g/L de agua destilada). Una vez depositado este medio de consistencia en una placa de petri, se añaden 150 µL de una suspensión concentrada de Escherichia coli, la cual se extiende uniformemente por la superficie del agar con la ayuda del asa de Digralsky, y que sirve de nutriente para el crecimiento de las amebas. Esta suspensión concentrada se prepara en un tubo con agua destilada al 0,9 % NaCl, en el cual se inocula Escherichia coli con una turbidez aproximadamente 1 en la escala de MacFarland. En la Figura 3 se observa la preparación del medio nutritivo para las amebas. Seguidamente se añaden 20 µL del extracto de mejillón cebra en el centro de la placa de petri con el medio de cultivo preparado. Se preparan varias placas inoculadas con el extracto de mejillón cebra. Estas placas se sellan con una película de plástico autosellante y moldeable (Parafilm) y se incuban a 30oC durante un periodo de 48 horas a 15 días. 24 Figura 3. 1, suspensión concentrada de E.coli. 2, inóculo de 150 µL de la suspensión bacteriana concentrada. 3, extensión uniforme del concentrado bacteriano sobre la superficie del agar. Una vez pasado el tiempo de incubación, se prepara el montaje para el visualizado de las amebas al microscopio. Para ello se añade 1 mL de PBS (Scharlau) a cada placa de petri mediante una pipeta automática y con el asa de Digralsky se sueltan las amebas de la superficie del agar. Una vez realizado este paso, se capta el líquido que queda sobre la base del agar, y se centrifuga (centrifugadora Hettich Universal II) a 6000 rpm durante 10 minutos. Se recogen 20 µL de la base del sobrenadante (varias réplicas), se disponen en un portaobjetos y se cubren con el cubreobjetos pertinente. Por último se visualizan las preparaciones con el microscopio óptico. 3.3. Muestras de agua superficial y mejillón cebra Las muestras de agua, así como los ejemplares de Dreissena polymorpha fueron tomados de la Acequia Rimer (Caspe), adyacente al río Guadalope junto a su desembocadura en río Ebro. La toma de muestras se realizó en 2 épocas diferentes del año, otoño (27 de Noviembre) y primavera (24 de Abril). El grupo de Calidad y Tratamiento de Aguas, perteneciente al departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente de la Universidad de Zaragoza tiene autorización del INAGA para la recogida y tenencia de ejemplares vivos y muertos de mejillón cebra para investigación. Se recogió un gran número de ejemplares de Dreissena polymorpha y gran cantidad de agua circundante de la acequia Rimer. Esto se debe a que se necesita gran cantidad de muestra para llevar a cabo toda la experimentación del presente proyecto. Durante la duración de todo el procedimiento experimental se desinfectó rigurosamente con hipoclorito de sodio (NaClO) todos los equipos, muestras y material utilizados y que estuvieron en contacto con el agua (natural y utilizada en laboratorio) y con individuos de Dreissena polymorpha, para evitar un desarrollo mayor de la invasión de esta especie en cualquier zona. 1 3 2 25 32 CAPÍTULO 4. RESULTADOS 4.1. Mantenimiento y cría en cautividad del mejillón cebra 4.1.1. Monitorización de las condiciones del acuario En el periodo de duración de la experimentación de este proyecto se han mantenido en el acuario instalado en el laboratorio, las condiciones físico-químicas principales para el crecimiento y reproducción del mejillón cebra en unos rangos óptimos. En la Tabla 5 se muestran los valores mínimos y máximos, a lo largo de la duración experimental de esta parte del proyecto (27 Noviembre 2012 - 30 Mayo 2013), de los distintos parámetros físico-químicos controlados en el agua del acuario. Tabla 5. Valores mínimos y máximos de los parámetros físico-químicos controlados en el agua del acuario. [O 2 ] (mg O 2 /l) Tª (oC) pH Conductividad (µS/cm) Dureza (mg CaCO3/l) Calcio (mg Ca/l) Valor mínimo 7,21 18,5 7,4 1715 760 208,5 Valor máximo 8,26 23,8 8,41 2380 1010 332,6 Las gráficas con los valores de cada uno de los parámetros físico-químicos de control a lo largo del periodo de experimentación se encuentran en el ANEXO V de este mismo proyecto. Los valores de oxígeno disuelto en el agua del acuario tienen un mínimo en 7,21 mg O2/l y un máximo en 8,26 mg O2/l, lo que indica según la Tabla 4, presente en el capítulo 3.4 de este proyecto sobre rangos de preferencia orientativos del mejillón cebra, un crecimiento medio-alto de los individuos de este bivalvo. Las bombas de aire permiten introducir oxígeno continuo necesario para la vida en el agua. En los valores de la temperatura en el agua del acuario, se observa un mantenimiento en la temperatura entre los 18,5oC y los 23,8 oC, lo que indica según la Tabla 4 un potencial de crecimiento alto del mejillón cebra en el agua. El rango de valores de pH en el agua del acuario, para el crecimiento y cría del mejillón cebra en cautividad, se mantiene entre los valores 7,4 y 8,41. Tomando como referencia la Tabla 4, los valores medidos se mantienen en el rango de crecimiento alto para este parámetro del mejillón cebra, a excepción de dos valores (7,4 y 7,49) que se desvían ligeramente y producirían un crecimiento medio en estos individuos. Cuando el valor de pH tiende a disminuir por debajo de 7,5, se adiciona Ca(OH)2 en el acuario, para el aumento del pH del agua, además de producir un aumento de Calcio en el mismo medio, que es importante para el desarrollo de los individuos de Dreissena polymorpha. 33 Los resultados de conductividad en el agua del acuario para la cría y mantenimiento del mejillón cebra varían en un rango amplio, entre 1715 y 2380 µS/cm. Según la referencia de los rangos óptimos de crecimiento y colonización del mejillón cebra expuestos en la Tabla 4, los valores obtenidos en el agua del acuario son óptimos para el crecimiento de estos moluscos bivalvos. Los valores altos de conductividad se deben principalmente a que se introducen aguas naturales en el acuario, y estas tienen gran concentración de iones disueltos, lo que provoca una alta conductividad de la misma. La Dureza del agua y la concentración de calcio en la misma, es suficientemente elevada para un desarrollo y crecimiento óptimo de los individuos de esta especie, según los valores de referencia de la Tabla 4. Los resultados de la concentración de calcio en el acuario que se muestran en la Tabla 5 no disminuyen de 208,5 mg Ca/l, un valor suficiente para el desarrollo óptimo y crecimiento del mejillón cebra. 4.1.2. Observación de larvas de Dreissena polymorpha Se han observado larvas de mejillón cebra en el agua del acuario. En la Figura 7 se observa una fotografía tomada a través del microscopio, en la que se pueden ver larvas de Dreissena polymorpha con la típica cruz de malta que les caracteriza. Figura 7. Larvas de Dreissena polymorpha (400x) presentes en el agua del acuario. El mantenimiento de los individuos de mejillón cebra en el acuario ha sido correcto. Se han mantenido correctamente los factores principales que controlan su crecimiento y colonización dentro de unos rangos alto-óptimos. Esto ha permitido escasas muertes de individuos de mejillón. Aunque se ha conseguido un correcto mantenimiento para el crecimiento de los individuos, no se ha conseguido la cría en cautividad de los mismos. Se han observado larvas de los mismos, pero estas quizás no sean lo suficientemente numerosas para que siga proliferando la población, ya que el porcentaje de mortalidad acumulada de las mismas desde la eclosión hasta la colonización del sustrato es muy elevada, 98 % (O’Neill, 1996). Además las épocas de reproducción y de suelta de gametos están marcadas al principio de la primavera y final de verano principalmente, lo que indica hasta la finalización de este trabajo ausencia de visualización de individuos adultos. Las condiciones ambientales favorables proporcionadas en el acuario, pueden adelantar sobre la época primaveral la suelta de gametos y eclosión de huevos, aunque los ritmos circadianos instalados en el mejillón (ya que se han recogido de aguas naturales) provoquen el efecto contrario, y se produzca poca reproducción hasta la 34 fecha, que junto con una alta mortalidad larvaria, impida la visualización de nuevos individuos adultos de mejillón cebra. 4.2. Detección de patógenos en mejillones cebra de aguas superficiales de Aragón 4.2.1. Parámetros físico-químicos En la Tabla 6 se muestran los resultados de los parámetros físico-químicos analizados en las aguas superficiales de la acequia Rimer de Caspe. Los resultados corresponden a los dos días de muestreo realizado en épocas del año diferente. Tabla 6. Resultados de parámetros físico-químicos del agua de la acequia Rimer (Caspe), en dos épocas distintas del año. Los resultados obtenidos de la medición de los parámetros físico-químicos de las aguas de la acequia Rimer de Caspe indican, según la Tabla 4 de rangos de preferencia orientativos del mejillón cebra a distintos parámetros, unos valores altos-óptimos de estas aguas para el crecimiento y colonización del mejillón cebra. La única excepción es la temperatura, la cual no es la idónea para el crecimiento y colonización de estos individuos, ya que las épocas del año en las que se ha hecho los análisis, no son las de reproducción óptima y mayor crecimiento, pero en las que el mejillón cebra sobrevive sin ningún problema. 4.2.2. Análisis de bacterias En la Tabla 7 y en la Tabla 8 se muestran los valores de los análisis de bacterias realizados en las aguas superficiales de la acequia Rimer de Caspe y en los mejillones presentes en las mismas. Parámetro Valor (27/11/2012) Valor (24/4/2013) [0 2 ] 7,71 mg O 2 /L 9,13 mg O 2 /L Tª agua 11,2 oC 16,2 oC Tª aire 10,0 oC 14 oC pH 7,85 7,99 Conductividad 1852 µS/cm 2420 µS/cm Dureza total 1230 mg CaCO 3 /L 1320mg CaCO 3 /L Dureza de calcio 710 mg CaCO 3 /L 790 mg CaCO 3 /L Calcio 284,57 mg Ca/L 316,63mg Ca/L 35 Tabla 7. Resultados analítica bacteriana. 27 Noviembre 2012. Parámetro Valor (aguas) Valor (Dreissena polymorpha) Escherichia coli 2,61·104 UFC/100ml 7,13·104 UFC/g mejillón Enterococcus sp. 9,1·101 UFC/100mL 3,42·102 UFC/g mejillón Salmonella sp. 8·101 UFC/100mL 2,85·102 UFC/g mejillón Pseudomonas aeruginosa 5,8·104 UFC/100mL 6,02 ·104 UFC/g mejillón Tabla 8. Resultados analítica bacteriana. 24 Abril 2013. Parámetro Valor (aguas) Valor (Dreissena polymorpha) Escherichia coli 2,37·103 UFC/100mL 6,9·103 UFC/g mejillón Enterococcus sp. 9,3·101 UFC/100mL 9,3·101 UFC/g mejillón Salmonella sp. 9,1·101 UFC/100mL 1,55·102 UFC/g mejillón Pseudomonas aeruginosa 2,14·104 UFC/100mL 8,98·103 UFC/g mejillón Se observa que las bacterias presentes en el agua en una concentración elevada, como son E.coli y Pseudomonas aeruginosa, también están presentes en gran concentración en el interior del mejillón cebra. Los resultados también muestran que las bacterias presentes en las aguas naturales en una menor concentración, como son Enterococcus sp. y Salmonella sp., están en una concentración baja en el interior del mejillón cebra. Esto indica una cierta correlación entre los valores de contaminación bacteriana en aguas superficiales y el tejido interno del mejillón cebra, lo que puede suponer un indicio para la utilización de estos moluscos bivalvos como indicadores de la calidad microbiológica de las aguas naturales en la cuenca del Ebro. En la Figura 8 se muestra un gráfico estadístico de correlación linear con origen en (0,0) de los valores de contaminación bacteriana en aguas y contaminación bacteriana en el interior del mejillón cebra (sin hacer diferenciación en el tipo de bacteria). 36 Figura 8. Correlación linear entre la concentración de bacterias presentes en el agua de la acequia Rimer de Caspe y en los mejillones cebra que habitan en ella. Se observa una R2 = 0,668 para los datos analíticos obtenidos en las dos fechas de muestreo. Esto indica ausencia de correlación lineal entre la concentración de bacterias en el agua y la concentración de bacterias en el interior del mejillón cebra. Esta mala correlación puede deberse a que la acumulación de las distintas bacterias no se realice de la misma forma. Según bibliografía, los distintos tamaños y forma de las bacterias pueden afectar al hecho de que el mejillón cebra acumule más bacterias de una especie que de otra. Las bacterias de más tamaño se acumularían mejor que las de menor tamaño, (Frischer et al., 1996). Lo que se puede observar en los datos analizados es, que no hay una correlación perfecta que pueda garantizar que el mejillón cebra es un buen indicador de la calidad bacteriana del agua en cuanto a la concentración conjunta de las bacterias. Para obtener unos resultados más exactos de correlación entre la concentración bacteriana en las aguas naturales y en el interior del mejillón cebra harán falta estudios posteriores. Además, esto permitiría correlacionar la concentración de una bacteria determinada en el agua y en el mejillón, y quizás, obtener resultados para utilizar el mejillón cebra como indicador bacteriano del agua. 4.2.3. Análisis de parásitos Las observaciones realizadas al microscopio de las distintas preparaciones revelan la presencia de ooquistes de Cryptosporidium sp. y amebas de vida libre en el tejido de los individuos de Dreissena polymorpha recogidos en las aguas superficiales de la acequia Rimer de Caspe. En la Figura 9 se observan ooquistes de Cryptosporidium sp. teñidos mediante la tinción de Ziehl-Neelsen modificada. y = 0,629x R² = 0,668 0,00E+00 1,00E+04 2,00E+04 3,00E+04 4,00E+04 5,00E+04 6,00E+04 7,00E+04 0,00E+00 1,00E+04 2,00E+04 3,00E+04 4,00E+04 5,00E+04 6,00E+04 7,00E+04 8,00E+04 UFC / 100 ml UFC / g mejillón 37 Figura 9. Ooquistes de Cryptosporidium sp. a 1000x después de la tinción de Ziehl-Neelsen modificada. En la Figura 10 se observan dos fotos distintas de amebas de vida libre captadas con el microscopio óptico. En las imágenes se puede observar bien definida la célula y la vacuola pulsátil de la ameba. Figura 10. Amebas de vida libre a 1000 En las preparaciones microscópicas de extracto de mejillón cebra no se ha observado ninguna forma de vida, trofozoíto o quiste, del parásito Giardia sp. Estos resultados indican la peligrosidad del mejillón cebra como reservorio de distintos protozoos parásitos en aguas superficiales de la Comunidad Autónoma de Aragón. 38 4.3. Acumulación e infección in vitro de bacterias por Dreissena polymorpha 4.3.1. Resultados acumulación bacteriana en el mejillón cebra Escherichia coli (105 UFC/ml): La contaminación por Escherichia coli presente en los mejillones cebra del acuario se muestra en la Tabla 9. Tabla 9. UFC de E.coli en los mejillones cebra tomados del acuario para la experimentación. Parámetro Valor (Dreissena polymorpha) Escherichia coli 6,13·102 UFC/g mejillón En la Figura 11 se muestran los datos de Escherichia coli (UFC/ml) en el agua de experimentación a distintos tiempos, en el experimento estudio (realizado con mejillones cebra) y el experimento control (realizado sin mejillones cebra), con una concentración inicial de 105 UFC/ml. Se puede observar como los mejillones cebra expuestos a una gran concentración de bacterias en agua (experimento estudio), son capaces de retener en 24 horas la mayoría de las bacterias (E.coli) que contaminan el agua. En el experimento control se mantiene prácticamente constante la concentración de E.coli a lo largo de las 24 horas, sin grandes cambios, lo que indica que no hay ningún otro factor diferente a la presencia de mejillones cebra que provoque la disminución de bacterias en el agua. Figura 11. Gráfico de acumulación de E.coli en mejillones cebra, en un agua con concentración inicial 105 UFC E.coli /ml. 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Experimento estudio 4,01E+05 2,16E+05 9,55E+04 2,55E+04 1,02E+04 Experimento control 3,61E+05 3,84E+05 6,12E+05 4,58E+05 5,15E+05 0,00E+00 1,00E+05 2,00E+05 3,00E+05 4,00E+05 5,00E+05 6,00E+05 7,00E+05 UFC / ml Acumulación E.coli 39 En la Tabla 10 se detallan los resultados de acumulación de bacterias a las 24 horas de experimento estudio. Por un lado se observa el valor de contaminación bacteriana en el mejillón cebra a partir del extracto del mismo. Por otro lado se calcula la cantidad de bacterias que tendría que haber en el tejido de mejillón cebra en relación a la disminución de las mismas en el agua, es decir se divide las UFC acumuladas (en 1 litro de experimentación) por los gramos de tejido de mejillón y luego se añaden las bacterias que había inicialmente en los mejillones de la pecera, que como son mínimas no modifican los resultados. Tabla 10. Datos de valores acumulativos de E.coli, medidos a través del agua de experimentación con una concentración inicial 105/ml y a través del extracto de mejillón cebra. Parámetro Valor (según datos del agua) a las 24 horas experimentación Valor (extracto mejillón cebra) a las 24 horas experimentación UFC acumuladas/ml 3,91·105UFC/ml UFC acumuladas 3,91·108UFC Masa tejido mejillón 3,71 g 3,71 g UFC acumuladas/g mejillón 1,05·108UFC/g mejillón 2,08·105UFC/g mejillón UFC/g mejillón (acumuladas +iniciales) 1,05·108UFC/g mejillón 2,09·105UFC/g mejillón Aplicando las ecuaciones [1] y [2], se obtienen los porcentajes de acumulación bacteriana, gracias los datos obtenidos en la Tabla 10. [1] [2] Se alcanza un gran porcentaje de acumulación de Escherichia coli a las 24 horas por parte de los 4 mejillones utilizados en el experimento. En Tabla 10 se observa una diferencia alta de valores de UFC de E.coli acumuladas en el mejillón cebra, medidos a través del agua del ensayo y medidos a través del extracto de mejillón cebra a las 24 horas de experimentación. El análisis del extracto de mejillón cebra muestra un valor de contaminación menor al que realmente se ha acumulado (calculado con la cantidad de bacterias desaparecidas del agua). Esta diferencia se puede generar por distintas causas. En primer lugar, la eliminación del biso y de las valvas del mejillón en la preparación del extracto de mejillón cebra, puede haberse llevado consigo gran cantidad de bacterias retenidas en estas estructuras. Según un estudio de análisis bacteriano en el mejillón cebra, los extractos obtenidos homogeneizando el mejillón cebra con concha dan valores superiores a los extractos en los que solo se homogeniza tejido blando (Selegean et al., 2001). Otro factor que puede producir la disminución de las bacterias es la metabolización de las mismas por el mejillón cebra, ya que pueden servir de alimento directo para estos organismos (Frischer et al., 1996). Pueden existir otros factores no conocidos que influyan en el hecho de que el extracto de mejillón no nos proporciona un dato exacto de las bacterias de E.coli acumuladas. 40 Escherichia coli (103 UFC/ml): En la Figura 12 se muestra los datos de Escherichia coli (UFC/ml) en el agua de experimentación a distintos tiempos, en el experimento estudio y el experimento control, con una concentración inicial de 103 UFC/ml. En el experimento control se mantiene prácticamente constante la concentración de E.coli a lo largo de las 24 horas, sin grandes cambios, lo que indica que no hay ningún otro factor diferente a la presencia de mejillones cebra que provoque la disminución de bacterias en el agua. Figura 12. Gráfico de acumulación de E.coli en mejillones cebra, en un agua con concentración inicial 103 UFC E.coli /ml. En la Tabla 11 se dan los resultados de acumulación de bacterias a las 24 horas de experimento, mostrando los datos obtenidos del agua y los datos obtenidos del extracto de mejillón. Tabla 11. Datos de valores acumulativos de E.coli, medidos a través del agua de experimentación con una concentración inicial 103/ml y a través del extracto de mejillón cebra. Aplicando las ecuaciones [1] y [2], se obtienen los porcentajes de acumulación bacteriana, gracias los datos obtenidos en la Tabla 11. Parámetro Valor (según datos del agua) a las 24 horas experimentación Valor (extracto mejillón cebra) a las 24 horas experimentación UFC acumuladas/ml 3,78·103UFC/ml UFC acumuladas 3,78·106UFC Masa tejido mejillón 4,236 g 4,236 g UFC acumuladas/g mejillón 8,92·105UFC/g mejillón 2,33·104UFC/g mejillón UFC/g mejillón (acumuladas +iniciales) 8,93·105UFC/g mejillón 2,39·104UFC/g mejillón 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Experimento estudio 3,85E+03 1,72E+03 1,22E+03 6,20E+02 7,00E+01 Experimento control 3,44E+03 3,05E+03 3,25E+03 3,67E+03 3,22E+03 0,00E+00 5,00E+02 1,00E+03 1,50E+03 2,00E+03 2,50E+03 3,00E+03 3,50E+03 4,00E+03 4,50E+03 UFC / ml Acumulación E.coli 41 4.3.2. Resultados infección bacteriana por el mejillón cebra Escherichia coli (105 UFC/ml): La gráfica de infección bacteriana, a lo largo de 24 horas, de un agua estéril por 2 mejillones cebra que previamente han sido expuestos a una concentración de E.coli de 105/ml, se muestra en la Figura 17. Figura 17. Gráfico de infección de E.coli en un agua estéril por mejillones cebra previamente expuestos a una concentración de E.coli de 105/ml. Se observa un aumento pequeño de la concentración de Escherichia coli en el agua a partir de las 5 horas de depuración en un agua estéril. El aumento más pronunciado de infección bacteriana del agua se alcanza de las 10 a las 24 horas. En la Tabla 16 se muestran los resultados de infección de E.coli medidos a través del agua de experimentación a las 24 horas. Tabla 16. Resultados de infección de E.coli por mejillones cebra expuestos a una concentración inicial 105 UFC E.coli/ml, medidos a través del agua de experimentación. Parámetro Valor (según datos del agua) a las 24 horas de experimentación UFC infección/ml 4,06·103UFC/ml UFC infección 4,06·106UFC Masa tejido mejillón 1,691 g UFC infectadas/g mejillón 2,4·106UFC/g mejillón Según los datos de contaminación en el agua, los mejillones cebra son capaces de infectar 2,4·106UFC de E.coli/g mejillón en 1 litro de agua en 24 horas, los cuales son unos valores altos de contaminación, pero muy inferiores a los 1,05·108UFC de E.coli/g mejillón (Tabla 10) en 1 litro de agua acumulados a las 24 horas de ensayo en el experimento de acumulación bacteriana del que proceden estos mejillones cebra. 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Infección 0,00E+00 0,00E+00 4,50E+01 6,70E+02 4,06E+03 0,00E+00 5,00E+02 1,00E+03 1,50E+03 2,00E+03 2,50E+03 3,00E+03 3,50E+03 4,00E+03 4,50E+03 UFC / ml Infección E.coli 48 El dato de contaminación por Escherichia coli a las 24 horas de infección en el mejillón cebra es de 7,7·104UFC/g mejillón cebra. Comparando este valor, con el obtenido a partir del extracto de mejillón cebra al final del experimento de acumulación bacteriana (Tabla 10), se observa una disminución de la cantidad de E.coli, lo que muestra una pérdida de bacterias en su interior, relacionada posiblemente con esta infección en el agua estéril. Los resultados muestran que la capacidad de acumulación de E.coli en el mejillón cebra es mucho mayor que su capacidad de liberar dichos contaminantes a un medio acuático estéril. Escherichia coli (103 UFC/ml): En la Figura 18 se muestra la gráfica de infección bacteriana a lo largo de 24 horas de un agua estéril, por mejillones cebra que previamente han sido expuestos a una concentración de E.coli de 103/ml. Figura 18. Gráfico de infección de E.coli en un agua estéril por mejillones cebra previamente expuestos a una concentración de E.coli de 103/ml. Se observa un aumento pequeño de la concentración de Escherichia coli en el agua a partir de las 10 horas de depuración en un agua estéril. El aumento más pronunciado de infección bacteriana del agua se alcanza de las 10 a las 24 horas. La capacidad de infección es más lenta y se tarda más tiempo en infectar el nuevo agua que en el experimento anterior de infección bacteriana (Escherichia coli, 105 UFC/ml), posiblemente porque la concentración de E.coli retenida en el mejillón cebra es mucho menor. En la Tabla 17 se muestran los resultados de infección de E.coli medidos a través del agua de experimentación a las 24 horas. 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Infección 0 0,00E+00 0,00E+00 3,00E+01 6,30E+02 0,00E+00 1,00E+02 2,00E+02 3,00E+02 4,00E+02 5,00E+02 6,00E+02 7,00E+02 UFC / ml Infección E.coli 49 Tabla 17. Resultados de infección de E.coli por mejillones cebra expuestos a una concentración inicial 103 UFC E.coli/ml, medidos a través del agua de experimentación. Los mejillones cebra son capaces de infectar 2,9·105UFC de E.coli/g mejillón en 1 litro de agua en 24 horas (Tabla 17). Estos resultados muestran una alta capacidad de contaminar un nuevo hábitat acuático estéril de dicho contaminante. Aunque esta cantidad de E.coli de infección por gramo de mejillón cebra es menor a la cantidad de dicha bacteria acumulada, 8,93·105UFC/g mejillón (Tabla 11), por los mismos mejillones utilizados en el experimento de acumulación bacteriana. El dato de contaminación por Escherichia coli medido en el extracto de mejillón, a las 24 horas de infección es de 1,88·104UFC/g mejillón cebra, lo que indica una pérdida de bacterias de E.coli en relación a la cantidad de bacterias presentes en el mejillón cebra al final del experimento de acumulación del que proceden (Tabla 11). Al igual que en el ensayo en el que se partía de mejillones que habían sido expuestos a una concentración mayor de E.coli, se observa que la infección de esta bacteria por el mejillón cebra es menor que su capacidad de acumularla. La diferencia entre la cantidad retención de bacterias y la infección de las mismas en este ensayo es mucho menor que en el realizado con una concentración mayor inicial de E.coli (105/ml). Enterococcus sp. (105 UFC/ml): En la Figura 19 se muestra la gráfica de infección bacteriana, a lo largo de 24 horas, de un agua estéril por 2 mejillones cebra que previamente han sido expuestos a una concentración de Enterococcus sp. de 105/ml. Figura 19. Gráfico de infección de Enterococcus sp. en un agua estéril por mejillones cebra previamente expuestos a una concentración de Enterococcus sp. de 105/ml. Parámetro Valor (según datos del agua) UFC infección/ml 6,3·102UFC/ml UFC infección 6,3·105UFC Masa tejido mejillón 2,171 g UFC infectadas/g mejillón 2,9·105UFC/g mejillón 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Infección 0,00E+00 6,50E+01 2,65E+02 1,73E+03 3,91E+03 0,00E+00 5,00E+02 1,00E+03 1,50E+03 2,00E+03 2,50E+03 3,00E+03 3,50E+03 4,00E+03 4,50E+03 UFC / ml Infección Enterococcussp. 50 En el gráfico de la Figura 19 se observa un aumento pequeño de la concentración de Enterococcus sp. hasta las 5 horas de depuración en un agua estéril. El aumento más pronunciado tiene lugar a partir de las 5 horas de experimento. Tabla 18. Resultados de infección de Enterococcus sp. por mejillones cebra expuestos a una concentración inicial 105 UFC Enterococcus sp./ml, medidos a través del agua de experimentación. En la Tabla 18 se muestran los resultados de infección de Enterococcus sp. medidos a través del agua de experimentación a las 24 horas. Si comparamos estos resultados con la infección por E.coli de mejillones expuestos a una misma concentración inicial de bacteria (Tabla 16), prácticamente tienen la misma capacidad de infección, aunque según las gráficas de la Figura 17 y la Figura 19, los enterococos se sueltan antes al agua que E.coli por el mejillón cebra. Esto quizás se produzca porque el menor tamaño de los enterococos, como se ha citado anteriormente, provoque una menor retención interna en el mejillón y por tanto una suelta más rápida de los mismos al agua. El dato de contaminación por Enterococcus sp. medido a través del extracto de mejillón a las 24 horas de infección, es de 1,88·105UFC/g mejillón cebra, lo que indica una pérdida de bacterias de enterococos en relación a la cantidad de bacterias presentes en el mejillón cebra al final del experimento de acumulación del que proceden (Tabla 13). Al igual que en el experimento de Escherichia coli, la capacidad de acumular bacterias de Enteroccocus sp. es mucho mayor que la de infección de los mismos. Enterococcus sp. (103 UFC/ml): La Figura 20 muestra la gráfica de infección bacteriana, a lo largo de 24 horas, de un agua estéril por 2 mejillones cebra que previamente han sido expuestos a una concentración de Enterococcus sp. de 103/ml. Parámetro Valor (según datos del agua) UFC infección/ml 3,91·103UFC/ml UFC infección 3,91·106UFC Masa tejido mejillón 1,5665 g UFC infectadas/g mejillón 2,49·106UFC/g mejillón 51 Figura 20. Gráfico de infección de Enterococcus sp. en un agua estéril por mejillones cebra previamente expuestos a una concentración de Enterococcus sp. de 103/ml. El gráfico de la Figura 20 muestra un inicio de la capacidad de infección de enterococos a partir de las 5-10 horas. En este ensayo se observa que a las 10 horas se produce una infección mayor que a las 10 horas en el experimento realizado con E.coli en las mismas condiciones. Esto significa, al igual que en el ensayo anterior, que los enterococos son expulsados más rápidamente al agua por parte del mejillón cebra que E.coli. En la Tabla 19 se muestran los resultados de infección de Enterococcus sp. medidos a través del agua de experimentación a las 24 horas. Tabla 19. Resultados de infección de Enterococcus sp. por mejillones cebra expuestos a una concentración inicial 103 UFC Enterococcus sp./ml, medidos a través del agua de experimentación. El dato de contaminación por Enterococcus sp. medido a través del extracto de mejillón a las 24 horas de infección, es de 2,85·104UFC/g mejillón cebra, lo que indica una pérdida de bacterias de enterococos en relación a la cantidad de bacterias presentes en el mejillón cebra al final del experimento de acumulación del que proceden (Tabla 14). La capacidad de acumular bacterias de Enteroccocus sp. ha sido mayor que la de infección de los mismos, aunque realmente en la experimentación donde ha habido una diferencia realmente alta entre la capacidad de acumular bacterias y de infectar posteriormente ha sido la llevada a cabo con Escherichia coli. Parámetro Valor (según datos del agua) UFC infección/ml 4,6·102UFC/ml UFC infección 4,6·105UFC Masa tejido mejillón 1,8335 g UFC infectadas/g mejillón 2,51·105UFC/g mejillón 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Infección 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 2,75E+02 4,60E+02 0,00E+00 5,00E+01 1,00E+02 1,50E+02 2,00E+02 2,50E+02 3,00E+02 3,50E+02 4,00E+02 4,50E+02 5,00E+02 UFC / ml Infección Enterococcussp. 52 Salmonella sp. (106 UFC/ml): En la Figura 21 se muestra la gráfica de infección bacteriana, a lo largo de 24 horas, de un agua estéril por 2 mejillones cebra que previamente han sido expuestos a una concentración de Salmonella sp. de 106/ml. Figura 21. Gráfico de infección de Salmonella sp. en un agua estéril por mejillones cebra previamente expuestos a una concentración de Salmonella sp. de 106/ml. La capacidad de infección de Salmonella se puede observar en el gráfico de la Figura 21. La forma de infección se produce similar a la de enterococos, con una suelta de bacterias al agua un poco más temprana que la que se produce con E.coli. En la Tabla 20 se muestran los resultados de infección de Salmonella sp. medidos a través del agua de experimentación a las 24 horas. El número de bacterias de Salmonella de infección en el agua es mucho menor si lo comparamos con los experimentos a unas mismas condiciones de E.coli y Enterococcus sp (Tabla 16 y Tabla 18), debido a la sensibilidad de la mayoría de las cepas de Salmonella fuera de su hábitat, lo que provoca la muerte de las bacterias. Tabla 20. Resultados de infección de Salmonella sp. por mejillones cebra expuestos a una concentración inicial 106 UFC Salmonella sp./ml, medidos a través del agua de experimentación Parámetro Valor (según datos del agua) UFC infección/ml 1,36·102UFC/ml UFC infección 1,36·105UFC Masa tejido mejillón 1,98 g UFC infectadas/g mejillón 6,87·104UFC/g mejillón 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Infección 0,00E+00 0,00E+00 2,40E+01 5,30E+01 1,36E+02 0,00E+00 2,00E+01 4,00E+01 6,00E+01 8,00E+01 1,00E+02 1,20E+02 1,40E+02 1,60E+02 UFC / ml Infección Salmonella sp. 53 Salmonella sp. (104 UFC/ml): En la Figura 22 se muestra la gráfica de infección bacteriana, a lo largo de 24 horas, de un agua estéril por 2 mejillones cebra que previamente han sido expuestos a una concentración de Salmonella sp. de 104/ml. Figura 22. Gráfico de infección de Salmonella sp. en un agua estéril por mejillones cebra previamente expuestos a una concentración de Salmonella sp. de 104/ml. En la Tabla 21 se muestran los resultados de infección de Salmonella sp. medidos a través del agua de experimentación a las 24 horas. Al igual que en el experimento anterior no se puede evaluar correctamente la capacidad de infección por estas bacterias, ya que como se observa en el gráfico de la Figura 22 y en los resultados obtenidos en la Tabla 21 prácticamente no infectan el agua, y esto se produce por la muerte de Salmonella sp. Tabla 21. Resultados de infección de Salmonella sp. por mejillones cebra expuestos a una concentración inicial 104 UFC Salmonella sp./ml, medidos a través del agua de experimentación. En el ANEXO V aparecen imágenes de las colonias bacterianas y su disminución por el proceso de acumulación en los distintos experimentos de este apartado del proyecto. 0 h 2 h 5 h 10 h 24 h Infección 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 5,00E+00 1,20E+01 0,00E+00 2,00E+00 4,00E+00 6,00E+00 8,00E+00 1,00E+01 1,20E+01 1,40E+01 UFC / ml Infección Salmonella sp. Parámetro Valor (según datos del agua) UFC infección/ml 1,2·101UFC/ml UFC infección 1,2·104UFC Masa tejido mejillón 2,186 g UFC infectadas/g mejillón 5,49·103UFC/g mejillón 54 CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES Con los resultados obtenidos en el experimento de mantenimiento y cría en cautividad del mejillón cebra, se concluye que:  Es posible un correcto mantenimiento del mejillón cebra bajo condiciones de laboratorio, controlando los principales factores que influyen en su crecimiento.  Se debería alargar la experimentación de la cría de mejillón cebra en meses propicios para su reproducción y observar si este hecho influye en el aumento del número de larvas en el acuario y la observación de nuevo individuos adultos de Dreissena polymorpha. De la experimentación realizada sobre los mejillones cebra y el agua superficial de la acequia Rimer de Caspe se puede concluir que:  La presencia de protozoos parásitos, como Cryptosporidium y amebas de vida libre, y diversas bacterias patógenas retenidas en el interior de los mejillones cebra que habitan en aguas naturales puede suponer un riesgo sanitario importante para la comunidad autónoma de Aragón. Estos organismos bivalvos pueden ir concentrando dichos patógenos y expulsarlos en un momento concreto cuando este organismo muera o por causas ambientales que favorezcan este proceso, ocasionando un aumento brusco de patógenos en el agua, sobre todo en épocas de sequía donde el caudal del agua disminuye considerablemente.  El movimiento de estos bivalvos, como especie invasora que son, gracias a su adhesión a embarcaciones o arrastrados en aguas de lastre de distintos barcos, puede ocasionar la introducción de los patógenos acumulados en aguas donde no existían dichos microorganismos, provocando así una nueva contaminación y posibles efectos ecológicos y económicos en el nuevo hábitat.  La cantidad de bacterias presentes en los mejillones cebra y en las aguas naturales circundantes muestran una cierta correlación, que puede suponer la base para un estudio sobre de la utilización de estos moluscos bivalvos como indicadores de la calidad microbiológica de las aguas naturales en la cuenca del Ebro, pero es insuficiente para verificarlo estadísticamente. Los resultados obtenidos según el estadístico realizado muestran que el mejillón cebra no es un buen indicador de la contaminación de bacterias en el agua, porque no hay una buena correlación entre la concentración bacteriana en el agua natural y en el tejido interno del mejillón. Como se ha observado la diferencia en la capacidad de acumulación por parte del mejillón cebra para diferentes bacterias, puede influir en la mala correlación del estadístico. Sería idóneo realizar más experimentos para determinar de manera exacta la posible utilización de estos organismos filtradores como bioindicadores de la calidad bacteriana del agua. 55 Del estudio de evaluación de la capacidad de acumulación e infección bacteriana por mejillones cebra (Dreissena polymorpha) se concluye que:  Los mejillones cebra son capaces de acumular la casi totalidad de bacterias de Escherichia coli y Enterococcus sp. en 24 horas, en un agua que tiene similares condiciones a las aguas naturales contaminadas de la Comunidad Autónoma de Aragón donde habita el mejillón cebra. Esta acumulación es casi total cuando todo el agua presente en la muestra objeto de estudio es filtrada por los mejillones cebra del estudio.  La capacidad de acumulación de Escherichia coli por el mejillón cebra ha sido mayor que la de Enterococcus sp. en todos los experimentos realizados. Este hecho se debe al mayor tamaño que presentan las bacterias de E.coli, lo que permite una mayor retención de las mismas en el agua, respecto a los enterococos.  Aunque se produzca una mayor acumulación de E.coli en los mejillones respecto a los enterococos, en el mejillón cebra al cabo de 24 de experimentación no se refleja lo mismo, ya que presentan una menor concentración de Escherichia coli en sus tejidos, que como se ha explicado, posiblemente ocurra por una mayor metabolización de dicha bacteria, u otro factor que no se tenga controlado.  La variación de la concentración bacteriana de E.coli en el agua de experimentación no produce prácticamente variación en el porcentaje de acumulación de dicha bacteria por el mejillón cebra. Por otro lado, a una mayor concentración de Enterococcus sp. en el agua, los mejillones son capaces de acumular un menor porcentaje total de dicha bacteria que cuando la concentración es menor en el agua (diferencia del 9%), pero acumulan un porcentaje similar por cada gramo de mejillón (diferencia del 2,7 %). Esto quizás indique que si aumenta mucho la concentración de enterococos en el agua, puede producirse una saturación en la acumulación y no se retengan de manera tan eficiente las mismas, provocando una disminución en el porcentaje de acumulación.  La capacidad de acumulación e infección de Salmonella sp. en el agua por parte del mejillón cebra, no se pudo evaluar debido a la gran sensibilidad de la cepa utilizada que muere fuera de su hábitat común (tracto digestivo de humano o animales superiores).  La capacidad de infección de E.coli y Enterococcus sp. en un agua estéril por parte del mejillón cebra es similar al cabo de 24 horas, aunque no así la forma de realizarlo. Mientras que el inicio de infección elevada por E.coli sucede de las 10 a las 24 horas de experimento, con enterococos tiene lugar a partir de las 5 ó 10 horas de experimento. Esta diferencia posiblemente se produzca porque el menor tamaño de los enterococos, como se ha citado anteriormente, provoque una menor retención interna en el mejillón y por tanto una suelta más rápida de los mismos al agua.  En todos los experimentos realizados la capacidad de acumular bacterias en aguas contaminadas por parte del mejillón cebra ha sido superior a su capacidad de infección en aguas estériles, lo que indica la buena funcionalidad de dicho organismo filtrador, que es la de retener partículas para su alimentación. 56 Como conclusión final, citar la peligrosidad que supone la presencia del mejillón cebra en aguas contaminadas con diversos patógenos, y en concreto las aguas naturales estudiadas, ya que el mejillón cebra es capaz de concentrar gran cantidad de patógenos humanos. Por último, citar que la gran capacidad que tienen estos organismos para acumular patógenos en aguas contaminadas, junto con la gran función de los mismos para clarificarlas, podría ser el inicio de estudios para la utilización de estos bivalvos filtradores en la industria de tratamiento de aguas urbanas, donde la concentración de microorganismos patógenos es elevada, o como filtros verdes en aguas naturales contaminadas. Este posible uso sería quizás solamente adecuado para aquellos hábitats colonizados en gran medida por el mejillón cebra, para que este bivalvo, gracias a la movilidad de sus larvas, no provocara una nueva invasión biológica. 57 64 ANEXO I. Terminología científica de estudio Bacteria: Es uno de los tres dominios de clasificación taxonómica en los que se dividen los seres vivos y está formado por microorganismos unicelulares sin núcleo. Tienen forma en coco, bacilo o en espiral, variando su tamaño de 5-10 µm de largo por 0,1-0,2 µm de ancho, aunque hay bacterias que pueden alcanzar mayores tamaños. Son sus formas principalmente las que permiten su diferenciación y clasificación. La mayoría de las bacterias se dividen en dos grandes grupos de clasificación basados en la respuesta de tinción de su pared bacteriana. Las gram-positivas tienen una gruesa capa homogénea de peptidoglicano que envuelve externamente a la membrana plasmática. Las gram-negativas tienen una pared de peptidoglicano fina envuelta por dos membranas lipídicas. Grupo parafilético: Conjunto de especies que comparten un antepasado común, aunque no a todos los descendientes de este. Grupo polifilético: Conjunto de especies que no comparten un antepasado común de manera reciente. Microorganismo: Agentes y organismos de diámetro menor de un milímetro que no pueden ser vistos claramente al ojo humano y deben ser examinados con un microscopio. Parásito: Organismo que entrelaza una relación simbiótica con su hospedador (otro organismo), del cual obtiene algún beneficio, principalmente depende metabólicamente de él. El parásito no provoca necesariamente una variación del estado saludable del hospedador. Patógeno: Cualquier organismo o agente que causa enfermedad en un hospedador. Protista: Grupo polifilético de organismos eucariontes, que actualmente forman uno de los reinos de clasificación de los seres vivos. La mayoría son unicelulares y carecen de nivel de organización de tejido, y esto es principalmente lo que los diferencia de hongos, plantas y animales. Protozoo: Organismo eucariota unicelular o acelular, que en conjunto forman un grupo parafilético dentro del reino protista. En realidad son los protistas quimiorganotróficos. Presentan orgánulos que tienen un papel funcional de órganos. Los protozoos varían mucho en tamaño, desde pocas micras hasta un tamaño cercano al milímetro. También presentan gran variedad de formas, tipos de nutrición y ciclos vitales. 65 66 ANEXO II. Microorganismos patógenos objeto de estudio. II.I. Escherichia coli Bacteria aerobia gram-negativa, de la familia de las enterobacterias. Tiene forma de bacilo con un tamaño de 1,1 a 6 µm. Son bacterias capaces de fermentar azúcares, mediante una fermentación ácido mixta. Residen en el colon de los seres humanos y de otros animales de sangre caliente, así como en aguas contaminadas y en cualquier otro medio que favorezca su aparición. Suele utilizarse en el análisis de aguas para determinar si existe contaminación fecal y ambiental. Si la bacteria no adquiere elementos genéticos virulentos, actúa de forma natural en el tracto digestivo de distintos animales formando parte de la flora intestinal. Algunas cepas virulentas producen gastroenteritis, infecciones de las vías urinarias y otras afecciones en seres humanos y distintos mamíferos. II.II. Enterococcus sp. Género de microorganismos bacterianos que engloba a bacterias aerobias facultativas. Se trata de bacterias gran-positivas, que tienen un tamaño entre 0,6 y 2,5 µm. Su forma es esférica dando lugar a los denominados cocos formando parejas o cadenas cortas de ellos. Ciertas especies de este género son comensales del tracto digestivo de los seres humanos. Enterococcus sp. puede producir diferentes infecciones en seres humanos, que van desde la meningitis, hasta infecciones urinarias o en la sangre. II.III. Salmonella sp. Genero de bacterias aerobias facultativas, gram-negativas, de la familia de las enterobacterias. Tienen forma de bacilo con un tamaño de 0,5 a 3 µm y son capaces de producir SH2. El hábitat natural de estas bacterias es el tracto digestivo terminal de distintos animales y de los seres humanos. Cuando aparecen en el medio ambiente su origen ha sido fecal. Existen especies y cepas de este género de bacterias que no son virulentas. Las especies virulentas de este género producen distintas infecciones como la salmonelosis o las fiebres tifoideas. II.IV. Pseudomonas aeruginosa Bacteria con forma de bacilos rectos o ligeramente curvados, con medidas de 0’5 a 5 µm, que se desplazan mediante uno o varios flagelos polares. Son bacterias aerobias y gramnegativas. Su metabolismo se basa en una respiración aerobia, utilizando O2 como aceptor final de electrones. Son patógenos oportunistas muy importantes de animales y plantas, infectando a personas bajas de defensas, invadiendo zonas de quemaduras, produciendo infecciones de las vías urinarias y respiratorias. El genoma de Pseudomonas aeruginosa tiene un número inusualmente alto de genes para el catabolismo, el transporte de nutrientes y 67 regulación del metabolismo, lo que explica su habilidad para crecer en infinidad de ambientes y su gran resistencia a antibióticos. II.V. Cryptosporidium sp. Grupo de protozoos parásitos que forman un género dentro del filo Amplicomplexa (Protistas). Este género comprende varias especies que pueden provocar infecciones en distintos mamíferos y en humanos. La enfermedad infecciosa que generan en el huésped es la cryptosporidiosis, la cual provoca una diarrea aguda normalmente autolimitada y efectos más severos en personas inmunodeprimidas y en niños. Su ciclo vital consta de una fase de ooquistes, que suelen encontrase en el medio ambiente, principalmente en aguas. Los ooquistes tienen forma esférica u ovoide con un tamaño de 3 a 6 µm. El contacto con agua contaminada o por alimentos contaminados (vía fecal-oral) produce la transmisión de la enfermedad. La desenquistamiento de los ooquistes en el intestino provoca la formación de células infectivas del epitelio gastrointestinal y el comienzo de un ciclo complejo que puede llevar a la infección de otros sistemas como el respiratorio. II.VI. Giardia duodenalis Género de protozoos flagelados del filo Sarcomastigophora (Protistas). Formado por distintas especies parásitas humanas y de otros mamíferos. Una característica que define a estos organismos es la carencia de mitocondrias. Provocan una enfermedad llamada giardiasis, infección ocasionada sobre las microvellosidades del intestino delgado. Provoca distintas reacciones gastrointestinales, como diarrea e incluso en afecciones graves puede destruir células epiteliales que conllevan a una mala absorción de nutrientes. La transmisión de la enfermedad es provocada por la ingestión de alimentos o agua contaminada con quistes de Giardia. Dichos quistes tienen un tamaño aproximado de 15 µm. Una vez los quistes llegan al intestino, se produce el desenquistamiento y desarrollan la forma de vida flagelada e infectiva, los trofozoitos, que tienen un tamaño aproximado de 20 µm. II.VII. Amebas de vida libre Conjunto de protozoos que viven en el ambiente, principalmente en aguas estancadas o con poca movilidad. Las principales características que definen a este grupo son su movimiento mediante pseudópodos, su reproducción por fisión binaria y la presencia de una gran vacuola pulsátil. Como su nombre indica, son organismos de vida libre, capaces de vivir en diferentes ambientes, aunque muchas de ellas generan enfermedades en seres humanos actuando como parásitos oportunistas. Pueden ocasionar enfermedades muy distintas, dependiendo de la especie que se trate. Naegleria sp., Acanthamoeba sp. y Hartmannella sp., son distintos géneros de amebas de vida libre que se han encontrado en aguas y causan infección en humanos. 68 ANEXO III. Metodología analítica físico-química III.I. Oxígeno disuelto El Oxígeno Disuelto (O.D.) se define como la cantidad de oxígeno que está disuelta en el agua. Nos informa de la calidad del agua en cuanto a dar soporte a la vida acuática. Para medir el O.D. se utiliza un medidor de oxígeno disuelto y temperatura. El método utilizado es el 5814:1990 (UNE - EN ISO). Los niveles de oxígeno disuelto se expresan en partes por millón (ppm o mg/l). III.II. Temperatura La temperatura es una magnitud física que nos informa de la cantidad de calor que contiene, en este caso, una masa de agua. Para conocer la temperatura se utiliza igualmente el medidor de oxígeno disuelto y temperatura. Los datos obtenidos se expresan en grados centígrados (oC). III.III. pH El pH es una medida del grado de acidez o alcalinidad de una disolución. El pH se determina con el logaritmo negativo en base diez de la concentración de iones H+. Para cuantificar el pH del agua se utiliza un pH-metro marca CRISON modelo GLP 21. El método utilizado es el 4500-HB del Standard Methods [Clesceri et al., 2005]. III.IV. Conductividad La conductividad es la medida de la capacidad que tiene un agua para transportar la corriente eléctrica. Está relacionada con la presencia de sales en el agua, e indica la concentración de iones en la misma. Para determinar este parámetro se utiliza un conductímetro CRISON modelo Basic 30. El método utilizado es el 27888:1994 (UNE - EN ISO). Los datos obtenidos se expresan en mS/cm o en µS/cm, según la concentración o el rango en el que se trabaja. III.V. Dureza total La dureza total es la medida de cuantificación de la cantidad de iones de Ca2+ y Mg2+ presentes en un agua. Este parámetro se determina mediante valoraciones. El método utilizado es el 77040:2002 (UNE - EN ISO). La dureza total se expresa como el número equivalente de miligramos de carbonato de calcio por litro. 69 III.VI. Dureza de calcio La dureza de calcio es la medida de la cantidad de iones Ca2+ presente en un agua. Este parámetro se determina mediante valoraciones. El método utilizado es el SM 3500-Ca B (Standard Methods) [Clesceri et al., 2005]. La dureza de calcio se expresa como el número equivalente de miligramos de carbonato de calcio por litro. 70 ANEXO IV. Metodología analítica microbiológica IV.I. Diluciones seriadas El volumen de muestra de agua para analizar recomendado por el RD 140/2003 es de 100 ml, aunque en muchas ocasiones debido al alto número de bacterias presentes en las aguas, sería imposible hacer el recuento. Además en la gran mayoría de casos no se conoce el número de bacterias presentes en el agua, motivo por el cual se realizan diluciones de la muestra inicial. Estas diluciones se realizan de la misma manera para los extractos de mejillón cebra obtenidos en los distintos experimentos de este proyecto. A partir del agua natural, agua experimental de laboratorio o extracto de mejillón cebra (dilución 0), se toma 1 ml de la muestra con micropipeta y se transfiere a un tubo con 9 mL de suero fisiológico estéril (0,9 % NaCl). A continuación, se homogeneiza en un vortex, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10 (o dilución -1). Para hacer las diluciones sucesivas, se toma 1 mL de la dilución precedente bien homogeneizada y se lleva a un tubo con 9 mL de suero fisiológico estéril (0,9 % NaCl), todo ello en ambiente de trabajo estéril, proporcionado con un mechero Bunsen. La Figura I refleja de manera gráfica el procedimiento de diluciones decimales seriadas. Figura I. Método de diluciones seriadas. IV.II. Medios de cultivo Los medios de cultivo bacteriano son ambientes artificiales, generalmente formados por un gel o solución que contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento microbiano. El material de vidrio, antes de su uso, se esteriliza en autoclave mediante calor húmedo durante 15 minutos a una temperatura de 121 oC para eliminar cualquier microorganismo o forma esporulada de resistencia y trabajar en condiciones estériles. 71 IV.II.i. Agar McConkey El agar McConkey (Scharlau) es el medio elegido para el análisis de Escherichia coli, cuya composición se muestra en la Tabla I. Este agar se presenta en forma de polvo, y para su preparación se ha de suspender una cantidad precisa del polvo en agua destilada y seguidamente llevar a ebullición. La solución obtenida se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121oC. Tras finalizar el proceso de esterilización, los botes que contienen el agar líquido se colocan en el baño termostático a 50oC y se mantienen hasta su utilización. El rojo neutro es el que marca las colonias fermentadoras de lactosa de color rosado-rojizo, mientras que las no fermentadoras crecen de color blanco. Tabla I . Composición agar McConkey. Figura II. Aspecto colonias E.coli en agar McConkey. IV.II.ii. Slanetz & Bartley agar Para analizar las bacterias del género Enterococcus durante este proyecto se utiliza el agar selectivo Slanetz & Bartley (Scharlau), cuya composición se muestra en la Tabla II. El agar en forma de polvo o granulado y en la cantidad exacta se disuelve en agua destilada y se lleva a ebullición. Después se esteriliza la solución obtenida en autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121oC. Una vez terminado el proceso de enfriamiento a 50oC en el baño termostático, se añade cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 1% (Scharlau) en una proporción de 10 mL por cada litro de medio base. La solución TTC se utiliza como indicador de color, ya que el TTC que es incoloro se reduce por acción del metabolismo de estas bacterias a trifenilformazán (rojo), de forma que los enterococos quedan coloreados con un color rojogranate. Ingredientes Concentración (g/l) Peptonas 20,0 Lactosa 10,0 Sales biliares 1,5 Cloruro de sodio 5,0 Rojo neutro 0,03 Cristal violeta 0,001 Agar 15,0 72 Tabla II . Composición agar Slanetz & Bartley. Figura III. Aspecto colonias Enterococcus sp. en agar Slanetz & Bartley. IV.II.iii. Salmonella-Shigella agar Las bacterias del género Salmonella sp. se analizaron utilizando el medio de cultivo Salmonella-Shigella agar (Scharlau) (SS agar). La composición se muestra en la Tabla III. Dicho agar en su cantidad medida se disuelve en agua destilada, la cual ha sido previamente esterilizada en autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121oC. La solución se lleva a ebullición, y seguidamente se deja enfriar a 50oC en el baño termostático hasta su utilización. Las especies de Salmonella que son productoras de sulfuro de hidrógeno desarrollan colonias con centro oscuro. Tabla III . Composición SS agar Figura IV. Aspecto colonias Salmonella sp. en SS agar. Ingredientes Concentración (g/l) Triptosa 20,0 Extracto de levadura 5,0 Dextrosa 2,0 Hidrogenofosfato de potasio 4,0 Azida de sodio (NaN 3 ) 0,4 Agar 12,0 Ingredientes Concentración (g/l) Extracto de carne 5,0 Peptona 5,0 Lactosa 10,0 Sales biliares 5,6 Citrato de sodio 10,0 Tiosulfato de sodio 8,5 Citrato férrico 1,0 Verde brillante 0,00033 Rojo neutro 0,025 Agar 15,0 73 Figura X. Valores de pH en el agua del acuario a lo largo de la duración experimental del proyecto. Figura XI. Conductividad (µS/cm) en el agua del acuario a lo largo de la duración experimental del proyecto. 6,8 7 7,2 7,4 7,6 7,8 8 8,2 8,4 8,6 pH pH 0 500 1000 1500 2000 2500 Conductividad µS/cm Conductividad uS/cm 80 Figura XII. Dureza total (mg CaCO3/l) en el agua del acuario a lo largo de la duración experimental del proyecto. Figura XIII. Concentración de calcio (mg Ca/l) en el agua del acuario a lo largo de la duración experimental del proyecto. 0 200 400 600 800 1000 1200 27-nov 04-dic 11-dic 18-dic 25-dic 01-ene 08-ene 15-ene 22-ene 29-ene 05-feb 12-feb 19-feb 26-feb 05-mar 12-mar 19-mar 26-mar 02-abr 09-abr 16-abr Dureza total (mg CaCO3/l) Dureza total -mg CaCO3/l 0 50 100 150 200 250 300 350 27-nov 04-dic 11-dic 18-dic 25-dic 01-ene 08-ene 15-ene 22-ene 29-ene 05-feb 12-feb 19-feb 26-feb 05-mar 12-mar 19-mar 26-mar 02-abr 09-abr 16-abr [Ca] mg/l [Ca] mg/l 81 V.II. Imágenes de los resultados de acumulación bacteriana V.II.i. Escherichia coli La Figura XIV muestra la imagen de reducción de bacterias de E.coli en el agua de un experimento estudio de acumulación bacteriana por mejillones cebra. Las placas están cultivadas con una misma dilución en tiempos de experimentación distintos. Se puede ver claramente una disminución considerable en el número de UFC de la bacteria a estudiar a las 10 horas de experimento estudio. Figura XIV. Disminución de la cantidad de bacterias de E.coli en el agua de experimentación, entre las 0 horas y las 10 horas, provocado por la capacidad de acumulación bacteriana de los mejillones cebra. V.II.ii. Enterococcus sp. En la Figura XV se visualiza la reducción de enterococos en el agua de un experimento estudio de acumulación bacteriana por mejillones cebra, donde las placas de Petri están inoculadas con la misma dilución experimental y a tiempos distintos. 82 Figura XV. Disminución de la cantidad de bacterias de Enterococcus sp. en el agua de experimentación, entre las 0 horas y las 10 horas, provocado por la capacidad de acumulación bacteriana de los mejillones cebra. V.II.iii. Salmonella sp. En la Figura XVI se observa la reducción de Salmonella sp. en el agua de un experimento estudio de acumulación bacteriana por mejillones cebra, donde las placas de Petri están inoculadas con la misma dilución experimental y a tiempos distintos. Se observa una tremenda reducción de bacterias ocasionada por la acumulación de los mejillones cebra y por la muerte de dichas bacterias que son muy sensibles al ambiente acuático en el que se ha desarrollado el experimento. Figura XVI. Disminución de la cantidad de bacterias de Salmonella sp. en el agua de experimentación, entre las 0 horas, las 5 horas y las 24 horas, provocado por la capacidad de acumulación bacteriana de los mejillones cebra y la muerte natural de las bacterias en el medio de experimentación. 83 84