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Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Proyecto Fin de Master: Estudio computacional del mecanismo de unión-disociación de la flavodoxina de Helicobacter pylori y su ligando. Autor: Lic. Guillermo Gutiérrez Teixeira Director de Proyecto: Dr. Javier Sancho Sanz Curso 2012-2013 Indice: 1.Introducción ..........................................................................1 2.Métodos y materiales ............................................................3 Plataformas de cálculo....................................................3 Aplicaciones....................................................................3 Métodos .........................................................................4 Dinámica molecular.................................................4 Igualdad de Jarzynski...............................................7 Método de medias de bloques................................9 Experimentación...........................................................11 3.Resultados ...........................................................................17 Fase de preparación .....................................................17 Fase de producción.......................................................19 4.Discusión y conclusiones......................................................25 5.Bibliografía y referencias .....................................................29 1 1.Introducción: Helicobacter pylori es una bacteria que infecta el epitelio gástrico en el ser humano. Pese a que los primeros indicios de su existencia se encontraron hace más de un siglo no fue hasta las décadas finales del siglo XX cuando se consiguió cultivar y caracterizar [1]. A día de hoy se estima que más de la mitad de la población mundial está infectada, variando la prevalencia en función de la localización geográfica, la edad, grupo étnico y otros factores, pudiendo llegar a alcanzar cotas cercanas al 90% en algunos países [2]. Este microorganismo ha sido reconocido, no sin cierta controversia en su momento, como agente causal de diversos trastornos gástricos como gastritis, úlceras o cáncer de estómago [3]. En la mayoría de los casos la infección transcurre de forma asintomática, y de hecho se estudia la posibilidad de que la presencia de H. pylori en el estómago sea beneficiosa[4], sin embargo, en los casos en los que se producen trastornos resulta claramente favorable para el paciente la eliminación de la bacteria de su tracto digestivo. Para ello es imperativo el uso de antibióticos (los casos en los que se han observado la erradicación espontánea son muy escasos y están asociados a un mal estado de la mucosa en el estómago), pero con su uso surgen cepas de H. pylori resistentes al tratamiento [5-7] y pueden aparecer trastornos asociados a la perturbación de la flora bacteriana beneficiosa y necesaria en caso de que la especificidad del antibiótico no sea lo suficientemente alta. Es por esto por lo que se buscan activamente nuevas dianas terapéuticas que sean propias de H. pylori, entre las que se encuentra la proteína sobre la que se centra este estudio[8-10]. La flavodoxina de H. pylori es una proteína red-ox cuya función es acoplar la reacción de descarboxilación oxidativa del piruvato a la producción de NADPH mediante el transporte de electrones desde el complejo piruvato-ferredoxina oxidorreductasa al complejo flavodoxina-quinona reductasa[11]. El buen funcionamiento de esta proteína es imprescindible para la supervivencia del microorganismo[12]. En el centro activo se encuentra unida de forma no covalente una molécula de flavin-mononucleótido (FMN). Curiosamente el sitio de unión del ligando presenta una diferencia importante respecto de otras flavodoxinas semejantes, que es la sustitución de un residuo de triptófano por alanina, lo que hace que quede un 2 espacio descubierto cercano al cofactor. Esta particularidad hace que el cofactor sea diferencialmente accesible para desarrollar antibióticos específicos. En ese sentido ya se han desarrollado trabajos[13-14], y otros están en plena investigación. El propósito de este proyecto es profundizar en el conocimiento acerca de la interacción proteína-ligando orientado hacia el caso concreto de la flavodoxina de H. pylori completando aspectos que el trabajo previo de caracterización de la proteína en laboratorio no pudo llegar a resolver, entre ellos las interacciones que se dan entre el ligando y la proteína y aspectos del mecanismo de unión-disociación, para aportar información nueva que tal vez pueda ayudar de cara al desarrollo dirigido de antibióticos. 3 2.Métodos y materiales: Todos los métodos aplicados en el desarrollo del proyecto son computacionales, y por tanto todos los materiales son o bien plataformas de computación de alto rendimiento o bien herramientas informáticas. Plataformas de cálculo: Las plataformas utilizadas han sido TERMINUS, y MEMENTO, alojados en las instalaciones del Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Minotauro, del Centro de Supercomputación de Barcelona (BSC) y adicionalmente, prometeo, una estación de mi propiedad y competitiva con las anteriores. TERMINUS y MEMENTO son plataformas que basan su potencia de cálculo directamente en la CPU, (microprocesadores Intel® Xeon® y AMD OpteronTM respectivamente), mientras que Minotauro y prometeo, de diseño y tecnología más reciente y adecuado al ámbito del proyecto, realizan los cálculos a través de GPU (tarjetas gráficas Nvidia TeslaTM M2090 y GTX660, con tecnología KeplerTM, respectivamente), aumentando la velocidad y potencia de cálculo a la vez que se reduce el tamaño del supercomputador y por tanto su consumo. Todos los centros de cálculo utilizan distribuciones de Linux como sistema operativo. El total de tiempo de cálculo consumido para llevar a cabo todos los experimentos y pruebas, y el tratamiento de datos ronda el medio millón de horas Aplicaciones: Para llevar a cabo las simulaciones se ha utilizado la aplicación NAMD[15] en su versión 2.9, desarrollada por el grupo de Biofísica Teórica y Computacional en el Instituto Beckman de Ciencia Avanzada y Tecnología de la Universidad de Illinois. En las plataformas que así lo permiten se ha utilizado la versión CUDA de la aplicación para realizar los cálculos por medio de GPUs. En la preparación del sistema, visionado de las simulaciones y la extracción de datos a partir de éstas, se ha utilizado la aplicación VMD[16] en su versión 1.9.1, desarrollada también por el citado grupo, así como varios de sus plugins de análisis y modelado. 4 El análisis de componentes principales de las trayectorias se llevó a cabo a través de la suite de aplicaciones PCZtools en su versión 4.0, desarrollada por el grupo de Reconocimiento Molecular, dentro del grupo de Modelado Molecular y Bioinformática perteneciente al Instituto de Investigación Biomédica de Barcelona, al Parque Científico de Barcelona y a la Universidad de Barcelona. Para la mayor parte de los análisis, configuración de las simulaciones, lanzamiento de simulaciones a través de los diversos supercomputadores, comprobación y mantenimiento de los archivos se han utilizado scripts y plantillas, todos ellos de desarrollo propio (incluidos los más importantes en los anexos) salvo el usado para calcular la energía libre del proceso de disociación por estimación de medias de bloques, que fue creado por los autores que describieron la técnica (ver apartado de métodos). Las figuras han sido creadas a través de VMD (representaciones moleculares) o la herramienta de software libre gnuplot (para gráficas y funciones). Métodos: Dinámica molecular Los datos sobre los que se realizan los cálculos para obtener resultados provienen todos en última instancia de simulaciones de dinámica molecular. Esta técnica consiste en aplicar las leyes de un modelo físico a escala atómica sobre los datos de la posición de cada átomo o partícula de una estructura molecular de partida para predecir su comportamiento a lo largo del tiempo. Habitualmente el volumen de cálculos que se deben realizar es inabarcable de no usar ordenadores para resolverlos, y por tanto la técnica viene desarrollándose de forma efectiva desde poco después del origen de los computadores[17], ampliándose al ritmo del crecimiento de la potencia de cálculo su ámbito de aplicación desde la química a un nivel muy básico en sus orígenes hasta la simulación de polímeros, nanomateriales y sistemas de interés biológico[18], desde los más pequeños, abarcando pocas moléculas, hasta los más grandes, que incluyen decenas de millones de átomos, a día de hoy[19-20]. La simulación de un sistema complejo en el ámbito de la mecánica cuántica, que sería lo adecuado a esta escala, resulta impracticable debido al alto coste computacional, que aumenta muy rápidamente con el número de electrones en el 5 sistema, por lo que se deben realizar aproximaciones más eficientes y que conduzcan a resultados razonables y verosímiles en un tiempo asequible. La primera y principal de estas aproximaciones consiste en aplicar las leyes de la dinámica de Newton, la mecánica clásica, lo que implica una serie de asunciones y consecuencias: Los átomos son considerados corpuscularmente como esferas homogéneas y relativamente blandas dotadas de masa y carga, con posiciones bien definidas en el espacio y en el tiempo. También quedan excluidos del cálculo los fenómenos de polarización al igual que procesos que dependan directamente de fenómenos cuánticos como el efecto túnel, presente, por ejemplo, en la inversión del amoniaco y algunas aminas, o algunas reacciones de transferencia de hidruro. Los enlaces se aproximan mediante potenciales armónicos modelados como si de muelles se tratase, con una distancia de equilibrio y constante de rigidez introducidas en el cálculo como parámetros. Esto implica que los enlaces no se pueden formar ni romper, impidiendo llevar a cabo simulaciones de reacciones, desde las que se puedan dar en el centro activo hasta fenómenos más ubicuos como la autoionización del agua u otras reacciones de equilibrio ácido-base. La resolución del sistema de ecuaciones diferenciales que relaciona la fuerza sobre cada átomo y su posición a lo largo del tiempo no se puede llevar a cabo de forma analítica para sistemas de más de dos átomos (problema de N cuerpos), y por tanto se debe hacer una aproximación numérica en la que se calcula la fuerza sobre cada átomo y recursivamente las variaciones de aceleración, velocidad y posición para intervalos discretos de tiempo. El tamaño del incremento de tiempo debe ser tan aproximado a un diferencial como resulte posible. En la práctica suele tomar valores entre 0.5 y 2.0 femtosegundos. La fuerza para cada átomo se calcula como el gradiente de la energía potencial del sistema. Para poder hallarla se debe conocer la función de energía potencial, que se estima mediante un conjunto de funciones y parámetros al que se denomina campo de fuerzas. En este campo de fuerzas se clasifican las contribuciones energéticas entre las que se deben al enlace covalente (energía potencial del enlace, de rotación, de torsión y deformación de ángulos simples y diedros) y las que no (interacciones electrostáticas, interacciones débiles y otras). Pese a que las funciones en sí han sido muy estudiadas y se conocen bien, éstas requieren parámetros cuyos valores dependen del elemento y el entorno de enlaces en el que se 12 no figuran en la estructura inicial, a excepción de los del primer residuo, fueron calculadas y los átomos creados en la nueva estructura mediante la extensión de VMD guesscoord de acuerdo a los archivos de topología (el básico de CHARMM en su versión 2.9 para la cadena peptídica y el descrito por Schulten et al. para la molécula de FMN, también en formato para CHARMM 2.6 o superior[26]). Al crear la caja de agua se eligió una geometría ortoédrica con suficientes moléculas de agua como para que la distancia mínima de cualquier átomo del complejo proteína-ligando con el límite de la caja fuera de 7 Å. El modelo de agua utilizado es TIP3P[27-28] y las dimensiones finales de la caja fueron de 46.2 x 56.7 x 50.1 Å. La caja de agua fue generada a través de la extensión de VMD waterbox. Para neutralizar la carga neta del sistema fue necesario añadir 19 átomos de sodio. La determinación de los emplazamientos óptimos de partida y el posicionamiento de los iones se llevaron a cabo a través de la extensión autoionize. Los archivos de topología del sistema fueron creados a través del paquete psfgen y la extensión mergestruct incluidos en la compilación de VMD. Una vez terminada la formación del constructo inicial, el sistema consta de un total de 11776 átomos, incluyendo la proteína, la molécula de FMN, las 3045 moléculas de agua y los 19 iones de sodio. El campo de fuerzas utilizado en las simulaciones es un campo de fuerzas personalizado que incluye el campo de fuerzas básico de CHARMM en su versión 2.9 y la parametrización de la molécula de FMN descrita por Schulten et al.[26]. Antes de poder llevar a cabo simulaciones de producción se debe minimizar la energía del sistema y calentar gradualmente hasta llegar a equilibrar el sistema a la temperatura de trabajo. Primero se llevó a cabo la minimización de 5000 pasos de cálculo con los átomos de la proteína y el FMN fijos, de forma que la caja de agua quedó compactada y alcanzó un estado estable en un mínimo local de energía. Acto seguido se realizó una breve dinámica, al igual que en el paso anterior sólo para el agua, de 1ns con un tiempo de integración de 1 fs, en la que las moléculas del solvente quedaron relajadas. Posteriormente la fijación rígida de los átomos de la proteína y el FMN se sustituyó por potenciales armónicos con valores pares decrecientes para la constante asociada, desde 20 hasta 0, llegando a una dinámica libre. Para cada valor de la constante se hizo 13 una simulación de 1 ps. Tras esto se llevó a cabo el calentamiento gradual del sistema, empezando desde 10 K y subiendo hasta los 310 K de trabajo en 30 pasos de 100 ps cada uno. Para finalizar el proceso de preparación se hizo una simulación sin fuerzas externas de 2 ns en las condiciones de trabajo. Salvo que se indique lo contrario, en todas las simulaciones de producción se han utilizado dinámicas de Langevin sobre la proteína y el FMN con un coeficiente de 0.5, las distancias de corte para las interacciones ha sido de 14 Å y la de atenuación de 12 Å, el tamaño de gradilla para los cálculos del PME de 48x54x48 puntos sobre los vectores base de la celda, la temperatura de 310 K mantenida por la dinámica de Langevin y la presión de 1 atmósfera mantenida por el método de Nosé-Hoover. A partir de la última estructura en la trayectoria previa se inició la primera simulación de producción, una dinámica de 100 ns con potenciales armónicos muy suaves sobre los carbonos carbonílicos de la tirosina 49 y de la lisina 115 para evitar la deriva de la proteína hacia los bordes de la caja de agua. Sobre la trayectoria obtenida se llevó a cabo un análisis de componentes principales para evaluar el comportamiento de la proteína. En el cálculo se incluyeron sólo los átomos de la cadena principal de la proteína. De acuerdo a los resultados se eligieron aleatoriamente ocho estructuras equivalentes como punto de partida para llevar a cabo el resto de experimentos. Para estudiar las posibles vías de salida del ligando se han utilizado experimentos de dinámica molecular forzada. Las experiencias se pueden dividir en dos grupos: Las que aplicaban la fuerza sobre el anillo de flavina del FMN y las que aplicaban la fuerza sobre el grupo fosfato, también del FMN. Dentro de cada grupo se eligió un conjunto de vectores (7 para la flavina y 11 para el fosfato) en cuya dirección que aplicar la fuerza. La elección de las direcciones fue arbitraria y sistemática, barriendo un espacio alrededor de la dirección aproximadamente más directa de salida del átomo. Las direcciones se calculan vectorialmente a partir de las posiciones relativas de varios átomos en la estructura, de forma que se puede automatizar la extracción del vector director minimizando las diferencias debidas a fluctuaciones conformacionales leves. 14 Ejemplos de vectores de salida. A la izquierda el vector Metil.2, a la derecha el vector Phos2. Los valores de la constante elástica y la velocidad se ajustaron por prueba y error iterativamente para cada uno de los vectores. Los átomos concretos sobre los que se aplicó la fuerza fueron el carbono del grupo metilo del carbono 8 de la flavina y el átomo de fósforo. A las simulaciones sobre el metilo se les identifica en esta memoria por la partícula Metil, y a las realizadas sobre el fosfato por Phos. También se impusieron restricciones de movimiento a varios átomos de la cadena principal de la proteína para evitar la rotación y traslación de la misma en respuesta a las fuerzas externas sobre el ligando. Los átomos fijados fueron el carbono carbonílico de la tirosina 49, el carbono alfa de la isoleucina 52, el carbono carbonílico de la lisina 115, el carbono alfa de la isoleucina 156 y el carbono carbonílico de la fenilalanina 167. 15 Posiciones de los átomos anclados durante las simulaciones SMD, marcadas con esferas rojas Estas posiciones se eligieron atendiendo a motivos estructurales y topológicos, por una parte están situados lo suficientemente lejos de la zona de estudio como para no interferir en los experimentos, y por otra parte se encuentran en zonas relativamente robustas y rígidas estructuralmente de modo que al mantenerlos fijos en el espacio se evitan deformaciones de torsión de la estructura a gran escala. Se llevaron a cabo 56 repeticiones por cada vector para un total de 1008 simulaciones. En ellas el tiempo de integración se aumentó a 1.2 fs para reducir el tiempo de cálculo necesario. Las duraciones de estas simulaciones se puede clasificar en cuatro grupos (de 1.5 ns, de 1.86 ns de 2.34 ns y de 3 ns), debido a ampliaciones de algunas dinámicas en función de su comportamiento inicial. Tras seleccionar las trayectorias válidas y descartar las demás se procedió al cálculo de la energía libre de salida del ligando para cada uno de los vectores por separado y en conjunto, y para el proceso de salida del fosfato y del anillo de flavina teniendo en cuenta el orden de los sucesos y la vía de salida. El cribado de trayectorias se basa fundamentalmente en que el sistema haya sido capaz de llegar a tener una separación de 4 Å entre la proteína y el FMN. En algunos casos el FMN al salir por un lado de la caja y entrar por el opuesto se acercaba demasiado a la proteína o directamente entraba en contacto con ella antes de haberse separado lo suficiente 16 como para poder considerar que no hubiese interacciones intensas entre el FMN y los residuos de la zona circundante al sitio de unión. El trabajo fue calculado numéricamente como la integral de la fuerza a lo largo del desplazamiento del átomo en cuestión por el método de trapecios desde tiempo 0 hasta el momento en el que la molécula de FMN se encontrase a más de 4 Å de distancia de la proteína, medida entre los dos átomos más cercanos de ambas moléculas. 17 3.Resultados: Fase de preparación Tras la minimización se resolvieron 48 colisiones entre átomos y la energía global del sistema se estabilizó en torno a un valor mucho menor que el inicial. Durante el primer equilibrado de la caja de agua el sistema se compactó y aproximó su presión a la de trabajo. La fase de relajación de la proteína y el FMN también redujo la energía total del sistema como cabía esperar. El incremento de la temperatura se llevó a cabo sin contratiempos y la dinámica corta para terminar de equilibrar el sistema completo alcanzó un punto deseable para el inicio de las simulaciones. Energía a lo largo del primer paso de minimización 18 Volumen a lo largo del equilibrado del agua Energía a lo largo de la relajación de la proteína 19 Temperatura a lo largo del calentamiento del sistema Fase de producción El análisis de la variabilidad estructural a través del RMSD muestra que la trayectoria es estable, sin cambios conformacionales drásticos, aunque se pueden observar regiones diferenciables a lo largo de la secuencia temporal. 20 RMSD a lo largo de los 100 ns de trayectoria La temperatura se mantiene fluctuando alrededor de los 310K y la presión y el volumen se mantienen también aproximadamente constantes. El análisis del RMSD por residuo hace intuir que pueden haberse visitado varios estados distintos a lo largo de la simulación. Al representar las proyecciones de las coordenadas de los átomos de cada instantánea de la trayectoria sobre los primeros vectores propios del análisis por componentes principales se confirma esta hipótesis observándose varios cúmulos que representan a estados distintos de la proteína. Las estructuras de partida para los experimentos siguientes se eligieron aleatoriamente del cúmulo más compacto, de forma que sus resultados fuesen comparables. 21 RMSD desglosado para cada residuo. En verde calculado sobre el esqueleto carbonado y en rojo para el aminoácido completo. Rodeados en azul varios de los grupos que presentan estados discernibles. Curvas de frecuencias para intervalos de RMSD de amplitud 0.2 para cada residuo a lo largo de toda la simulación. 28 cálculo o análisis de gran cantidad de datos de forma automatizada entre otras y ha sido una herramienta tan poderosa como necesaria para el tratamiento de los más de 400 Gb de información generada a lo largo de esta investigación. 29 5.Bibliografía y Referencias: [1] KIDD, Mark; MODLIN, Irvin M. A century of Helicobacter pylori. Digestion, 1998, vol. 59, no 1, p. 1-15. [2] POUNDER, R. E.; NG, D. The prevalence of Helicobacter pylori infection in different countries. Alimentary pharmacology and therapeutics, 1995, vol. 9, no 2, p. 33-40. [3] KUSTERS, Johannes G.; VAN VLIET, Arnoud HM; KUIPERS, Ernst J. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clinical microbiology reviews, 2006, vol. 19, no 3, p. 449490. [4] BLASER, Martin J. Who are we? Indigenous microbes and the ecology of human diseases. EMBO reports, 2006, vol. 7, no 10, p. 956. [5] MEGRAUD, F. 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