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1 Trabajo Fin de Máster Evaluación de propiedades mecánicas de un andamio estructural de ácido poli-L-láctico (PLLA) en entorno dinámico. Autor Alejandro Duizabo Ingalaturre Director: Ignacio Ochoa Garrido Co-Director: Víctor Andrés Acosta Santamaría Ponente: José Manuel García Aznar Instituto de Investigación en Ingeniería de Aragón Escuela de Ingeniería y Arquitectura Universidad de Zaragoza Febrero de 2013 2 3 A mi familia. 4 5 Agradecimientos. Quiero expresar mi más profundo agradecimiento a los Doctores Ignacio Ochoa Garrido, Víctor Andrés Acosta Santamaría y José Manuel García Aznar, directores de este Trabajo fin de Máster, por su apoyo científico, por su experiencia transmitida, por sus consejos y aportaciones en la ejecución de este trabajo, y sobre todo por el interés, disponibilidad, ayuda y paciencia que han mostrado en todo momento. A los equipos de trabajo del Centro de Biomateriales e Ingeniería de Tejidos de la Universidad Politécnica de Valencia (CBIT), del Servicio de Cirugía General y del Aparato Digestivo del Hospital Royo Villanova de Zaragoza. A los que me apoyaron a lo largo del proyecto, Carlos Marzo M., Aitor Sanesteban G., José Ángel Pardo G., Ricardo Ríos J., José Ignacio Peña T. y Fernando Usón J. A los amigos y a los compañeros del área de Ingeniería Biomédica, Rosa, Daniel, Alejandro, Guillermo, Chema, José Luis, Alberto, Diana, Rebeca, Carol, Clara, Nieves, Sara y Jamal. A mis amigos, y a mi familia. A todos, muchas gracias. Alejandro Duizabo Ingalaturre Zaragoza, Febrero de 2013 6 7 Resumen. La degradación del cartílago articular, principal síndrome de la artrosis, es una causa muy común de dolor y discapacidad en la población activa y jubilada. Al día de hoy no existen recursos eficaces para evitar esta enfermedad ni métodos para detener su empeoramiento [1]. Por estos motivos, la Ciencia de Materiales junto a la Ingeniería de Tejidos proponen una estrategia basada en la regeneración del cartílago articular a través de sustitutos fabricados con biomateriales que proporcionan a las células un entorno mecánicamente estable y estimulante para favorecer la regeneración del tejido [2]. Varios estudios han demostrado la eficacia del ácido poli-L-láctico (PLLA) como biomaterial para la fabricación de estructuras tridimensionales (andamios) destinadas a la Ingeniería Tisular del cartílago [3, 4, 17], pero sus propiedades mecánicas y estructurales se han caracterizado principalmente en entornos estáticos. Para obtener productos que respondan de manera adecuada a las solicitaciones mecánicas de la articulación, particularmente de rodilla, es necesario estudiar en profundidad las propiedades mecánicas de este biomaterial en entornos que simulen el comportamiento fisiológico de actuación. En este proyecto, se propone estudiar la evolución de las propiedades mecánicas de un andamio estructural de PLLA en entornos dinámicos de flujo y de deformación a través de experimentaciones diseñadas y realizadas a propósito. Se evalúa la permeabilidad y los cambios estructurales del andamio de PLLA sometido a deformaciones compresivas tanto escalonadas como dinámicas, y se estudia el comportamiento de la permeabilidad de la estructura sometida a una degradación bajo flujo. Los resultados obtenidos demuestran que la arquitectura del andamio, inicialmente heterogénea, se homogeneíza al aplicarle una deformación de forma graduada, lo que se refleja en la conducta de su permeabilidad que disminuye hasta que las trabéculas se colapsen. En cambio, cuando se somete el andamio a deformaciones cíclicas de fatiga, su permeabilidad aumenta en acorde con la amplitud de deformación, y su arquitectura tiende a redistribuirse frente al colapso de las trabéculas delgadas y se vuelve más heterogénea. El análisis de la degradación dinámica bajo flujo no pudo interpretarse debido a la contaminación fúngica de las muestras durante la experimentación. 8 9 Índice general. I Memoria ............................................................................................ 15 1. Introducción ......................................................................................................... 17 1.1. Objetivos .................................................................................................... 19 1.2. Metodología .............................................................................................. 19 1.3. Subíndice - descripción del trabajo ............................................................ 20 2. Comportamiento de la permeabilidad del andamio de PLLA bajo gradientes de deformación .................................................................................. 21 2.1. Permeabilidad ............................................................................................. 21 2.2. Materiales y métodos .................................................................................. 22 2.2.1. Ensayo de permeabilidad .................................................................. 22 2.2.2. Análisis de la macro-estructura ........................................................ 27 2.3. Resultados y discusiones ............................................................................. 29 2.3.1. Permeabilidad ................................................................................... 29 2.3.2. Macro-estructura ............................................................................... 31 2.4. Conclusiones y trabajos futuros .................................................................. 32 3. Comportamiento de la permeabilidad del andamio de PLLA durante un proceso de degradación bajo flujo continuo ................................................ 33 3.1. Degradación del PLLA ............................................................................... 33 3.2. Materiales y métodos .................................................................................. 35 3.2.1. Preparación de las muestras .............................................................. 35 3.2.2. Protocolo experimental ..................................................................... 36 3.2.3. Ensayo de permeabilidad .................................................................. 36 3.3. Resultados y discusiones ............................................................................. 37 3.4. Conclusiones ............................................................................................... 39 16 17 Capítulo 1 Introducción. El uso de materiales en aplicaciones y tratamientos médicos como substitutos de componentes biológicos se remonta a épocas históricas muy antiguas. Ya en la civilización Egipcia se tienen referentes arqueológicos de momias con prótesis implantadas, o en las civilizaciones Romana y Griega indicios del uso de diversos metales para tratamientos particulares. A mediados del siglo XX, finalizada la Segunda Guerra Mundial, la necesidad de generar tratamientos masivos para diversos procesos biomédicos promueve una gran evolución en diversas áreas del conocimiento, y dentro del mismo, la profundización en la ciencia e ingeniería de los biomateriales. A lo largo del tiempo la definición de biomaterial ha adoptado diversos cambios, paralelos al desarrollo que se ha logrado generar en el área. Actualmente el término biomaterial designa a aquellos materiales farmacológicamente inertes, utilizados en la fabricación de dispositivos que interactúan con los sistemas biológicos, incorporados o implantados para reemplazar y/o restaurar tejidos vivos y sus funciones [5]. En el desarrollo y avances de los biomateriales se pueden catalogar tres grandes generaciones. La primera generación tenía como objetivo encontrar materiales inertes con propiedades similares a las del tejido a reemplazar, pero debido a la presencia de lesiones provocadas por los implantes, la segunda generación florece con la prioridad de inducir una reacción controlada por parte del tejido vivo, es decir, materiales bioactivos y biodegradables. Actualmente se desarrollan e investigan los de la tercera generación, centrados en la autorregeneración del tejido mediante estímulos a nivel celular y molecular [6]. Para ello se utilizan los materiales de la segunda generación, o híbridos orgánicos e inorgánicos. Muchos de los dispositivos biomédicos son fabricados con materiales poliméricos, debido a la gran cantidad de formulaciones y a la versatilidad de aplicaciones que este material otorga, desde el diseño de sistemas de liberación de fármacos, en dispositivos para la fijación de fracturas, estructuras tridimensionales que sirven como soporte de células vivas, y en el remplazo de tejidos ya sean duros o blandos [7]. Esas dos últimas utilidades se investigan y se desarrollan dentro de un campo de la biomedicina conocido como Ingeniería de Tejidos. Esta disciplina se compone principalmente por tres factores: matriz extracelular (ECM), células y estímulos. En sí, la ECM proporciona un soporte mecánico para las células y al mismo tiempo actúa como un conductor de señales mecánicas y bioquímicas, como por ejemplo los factores de crecimiento. 18 Una de las grandes líneas de investigación en Ingeniería de Tejidos se dedica a la regeneración del cartílago articular. Este tejido tiene funciones específicas tales como la de disminuir la fricción entre las superficies articulares en contacto y proteger el hueso subyacente de los requerimientos mecánicos. Su estructura uniforme, densa y con ausencia de vasos sanguíneos, linfáticos e inervación le otorga las propiedades mecánicas para cumplir con su cargo, pero en contrapartida posee una limitada capacidad de reparación debido a su falta de irrigación [8,9]. Por ello, una lesión del cartílago articular puede extenderse progresivamente y llegar a provocar cambios en la estructura y morfología del tejido hasta la pérdida de sus características mecánicas y la degeneración del mismo, que son los síndromes principales de la artrosis [10]. En este contexto, la Ciencia de Materiales y las técnicas de Ingeniería Tisular ofrecen alternativas para la regeneración del cartílago articular (Musgrave et al., 2002), evitando la sustitución de la articulación. Una de las estrategias se basa en el desarrollo de implantes de condrocitos, células fundamentales del cartílago, en el interior de matrices tridimensionales habitualmente constituidas por biomateriales de tercera generación, que actúan como andamiaje (o andamio, scaffold en inglés) [11, 12]. El papel del andamio es ofrecer a las células un soporte viable y favorable a su adhesión, proliferación y diferenciación, proporcionándoles un ambiente mecánico adecuado [13], y conservando los factores bioquímicos de su entorno a través de la difusión de nutrientes del medio biológico y de la evacuación de los productos de desecho metabólicos [14]. Por estas razones, el material empleado para tales estructuras debe ser biocompatible, tener una alta porosidad interconectada, además de presentar unas propiedades mecánicas semejantes a las del cartílago articular (como la rigidez o la permeabilidad), y una degradabilidad progresiva coordinada con la cinética de formación del tejido permitiendo mantener las propiedades mecánicas del mismo. El ácido poli-L-láctico (PLLA), polímero termoplástico de la familia de los poliésteres, demostró ser un biomaterial que reúne las características necesarias para su uso apropiado en la ingeniería tisular de cartílago [15]. Su biodegradación por hidrólisis dentro del cuerpo humano genera como producto el ácido láctico, un intermediario común en el metabolismo de los carbohidratos del organismo. Además, sus excelentes propiedades químicas, físicas y mecánicas, combinadas con una porosidad controlada a través de un proceso de síntesis adecuado, permiten diseñar y fabricar un andamio estructural óptimo como implante en la regeneración del cartílago articular. El estudio realizado por Acosta Santamaría V.A. [17] expone la caracterización de las propiedades mecánicas y estructurales de un andamio de PLLA, en condiciones estáticas de deformación y degradabilidad en inmersión. El autor determina algunos factores críticos para el diseño y el uso adecuado de un andamio destinado a la regeneración del cartílago articular. Sin embargo, las condiciones estáticas limitan la definición de tales factores, y la exposición de un listado más amplio y preciso requiere caracterizar el andamio estructural bajo condiciones dinámicas, homólogas al entorno fisiológico de su futuro uso in vitro e in vivo. 19 1.1. Objetivos. El presente trabajo, de carácter predominante hacía la experimentación, trata de ampliar y profundizar el estudio sobre la caracterización mecánica de andamios estructurales de PLLA. Para ello, el objetivo planteado es caracterizar las propiedades mecánicas de arquitecturas tridimensionales de PLLA bajo condiciones dinámicas de flujo y de deformación. Para cumplir con el objetivo principal, se definen los siguientes objetivos específicos:  Caracterizar la evolución de la arquitectura tridimensional de PLLA frente a gradientes de deformación, analizando el comportamiento de la macro-estructura trabecular, la porosidad y la permeabilidad en cada estado de deformación.  Estudiar experimentalmente la evolución temporal de la permeabilidad del andamio en un entorno de degradación sometido a flujo.  Evaluar el comportamiento de las propiedades mecánicas del andamio sometido a compresiones dinámicas de fatiga. 1.2. Metodología. El estudio desarrollado dentro del marco de este trabajo pretende evaluar las propiedades mecánicas de un andamio estructural de PLLA, destinado a la regeneración de cartílago articular, cuando el mismo se encuentra en entornos dinámicos de degradación inducidos por flujo, y por fatiga debida a compresiones cíclicas. Se plantea una metodología experimental para determinar la permeabilidad del andamio, sometido a gradientes de deformación del 10, 20 30 y 40% de su espesor inicial, a partir de la medición de la presión generada en su interior por el paso de una corriente fluidica. Paralelamente, se efectúan micro-tomografías para cada estado deformado con la intención de valorar la evolución de la macro-estructura del andamio y de su porosidad. Con un estudio en condiciones dinámicas de degradación, simulando un entorno de cultivo celular in vitro y con caudales de flujo controlados (1,5 y 3 mL/min), se evalúan en función del tiempo las características mecánicas del andamio (0, 3, 7, 14 y 21 días). Finalmente, se propone analizar el comportamiento del andamio inmerso y sometido a deformaciones cíclicas, a través de un ensayo de fatiga con control en deformación. Se pretende simular con estas condiciones un entorno dinámico de cultivo celular, en el cual las propiedades mecánicas del andamiaje desempeñan un papel clave en la diferenciación de los condrocitos. 20 Las fases experimentales se efectúan sobre andamios tridimensionales de PLLA (Figura 1.1) fabricados y generosamente suministrados por el Centro de Biomateriales e Ingeniería Tisular (CBIT) de la Universidad Politécnica de Valencia. El protocolo de síntesis y de manufactura de los andamios de PLLA se describe en el Anexo A. 1.3. Subíndice - descripción del trabajo. El presente documento consta de 4 capítulos principales, los cuales se detallan a continuación: El capítulo 2 presenta la descripción de la permeabilidad como factor de caracterización de un andamio, explicando la relevancia de esta característica en la regeneración del tejido articular. Se detalla el planteamiento y la realización del protocolo experimental que permite determinar los cambios en la permeabilidad del andamio de PLLA frente a un gradiente de deformación impuesta, además de la evolución de su macro-estructura mediante el análisis de micro-tomografías realizadas en cada etapa de su deformación. A partir de estos resultados, se realiza una reconstrucción tridimensional del andamio que permite evaluar el comportamiento de la porosidad de la estructura. En el capítulo 3 se justifica la importancia de la degradación del andamio de PLLA y su implicación en la Ingeniería Tisular. Se establece un protocolo experimental para estudiar la evolución de las propiedades mecánicas de la estructura tridimensional durante un proceso de degradación dinámica bajo un flujo continuo. El capítulo 4 describe la metodología experimental desarrollada para estudiar y analizar el comportamiento de las propiedades mecánicas del andamio en condiciones de deformación dinámica. El protocolo se basa en un ensayo de fatiga controlando la deformación de las muestras. De esta forma se analiza la influencia de diferentes amplitudes de deformación sobre la conducta del andamio. Finalmente, en el capítulo 5 se presentan las conclusiones generales del trabajo, las aportaciones más relevantes en el estado del arte, para finalizar con una breve descripción de las líneas de trabajo futuro. Figura 1.1: Andamios estructurales de ácido poli-L-láctico (PLLA). 21 Capítulo 2 Comportamiento de la permeabilidad del andamio de PLLA bajo gradientes de deformación. Una de las propiedades clave para un andamio destinado a la Ingeniería Tisular y aplicado en la regeneración del cartílago articular es su permeabilidad. Dado que el cartílago articular está fisiológicamente sometido a demandas mecánicas, es importante conocer la influencia de la deformación de la estructura del andamio sobre este parámetro. Un conocimiento exhaustivo de estos fenómenos nos permitirá evaluar y asegurar el correcto intercambio de nutrientes y residuos metabólicos de las células alojadas dentro de la estructura, de tal modo que las mismas puedan proliferar bajo estímulos mecánicos y así mismo logren regenerar el tejido con las propiedades mecánicas adecuadas. A continuación se presentan y analizan los resultados obtenidos experimentalmente y realizados con el objetivo de estudiar la permeabilidad del andamio (PLLA), sometido a diferentes gradientes de deformación mediante un protocolo experimental diseñado y optimizado. Adicionalmente, se estudia la arquitectura del biomaterial mediante micro-tomografías con el objetivo de determinar la evolución del tamaño de poro y su porosidad, frente a una deformación impuesta. Estos resultados permitirán comprender el comportamiento de estos índices mecánicos del andamio frente a un gradiente de deformación aplicado, y establecer la coherencia de estas tendencias con los resultados obtenidos por otros autores [17]. 2.1. Permeabilidad. La permeabilidad es una variable estructural asociada al porcentaje de porosidad y que permite establecer la resistencia que tiene un material poroso al paso de un fluido (líquido o gaseoso) por su interior sin alterar su estructura interna. Para una aplicación adecuada en la Ingeniería Tisular, un andamio estructural debe presentar una porosidad interconectada [16, 18-20] que permita tanto la difusión del medio que provee los 22 nutrientes a las células, como la evacuación de los residuos metabólicos. Además, la interconexión entre poros facilita la migración de las células en el interior del andamio [19, 21-24]. Para determinar la relación entre la porosidad y la interconectividad de la estructura, el grupo GEMM implementó un ensayo de permeabilidad fundamentado bajo la ley de Darcy [21, 22, 25, 26] (ver Ec. 1). Esta formulación es una función de las propiedades del medio poroso y del fluido que lo atraviesa. De hecho, es intuitivo pensar que un fluido muy viscoso se desplazará a una tasa menor que el agua por el interior de un mismo tipo de material poroso. Por esta razón, la descarga es inversamente proporcional a la viscosidad dinámica del fluido 𝝁. En un andamio estructural la permeabilidad intrínseca 𝒌 es una función del tamaño de los poros. Así, conforme más pequeño es el tamaño de los poros más grande es el área superficial trabecular en contacto con el fluido. Este aumento en el área superficial ocasiona un incremento en la resistencia por fricción al flujo e induce que la 𝒌 disminuye. 𝑘=  𝐿 𝐴 𝑄 ∆𝑃 (1) donde 𝝁 es la viscosidad dinámica del fluido que atraviesa el andamio, 𝑳 el espesor de la muestra, 𝑨 su área transversal, 𝑸 el caudal volumétrico y ∆𝑷 la diferencia de presión generada a través de la muestra. Se puede calcular la 𝒌 de un andamio poroso, conocidas sus dimensiones y midiendo la presión diferencial generada al pasar un flujo determinado a través de él. 2.2. Materiales y métodos. 2.2.1. Ensayo de permeabilidad. Para llevar a cabo el ensayo experimental de permeabilidad bajo diferentes gradientes de deformación, se hizo uso de los siguientes insumos:  5 muestras cilíndricas de andamios estructurales porosos de PLLA, con diámetros de 6 a 6,5 mm y espesores de 5,2 a 5,5 mm.  2 cámaras para cultivo celular EBERS® P3D-6.  4 discos porosos diseñados especialmente para el ensayo (2 para cada cámara P3D-6). Se presenta el diseño en el Anexo B.  Una bomba peristáltica Watson Marlow® 323 sciQ.  Tubos Tygon® con diámetro interno de 3,2 mm.  2 conectores-válvulas de tres vías.  Un amortiguador de pulso.  Un frasco de 250 mL con agua destilada (cuya viscosidad es 𝝁 = 10-3 Pa·s).  Un manómetro diferencial (Testo®521).  Un pie de rey digital. 23 A partir del protocolo experimental elaborado por Acosta Santamaría V.A [17], se realizan ciertas consideraciones y modificaciones que optimizan la fase experimental. Así, en vez de utilizar el permeámetro patentado por el grupo GEMM [27], ha sido preferible usar una cámara de cultivo celular P3D-6 de la empresa EBERS® junto con dos discos porosos diseñados con el propósito de sujetar y comprimir el andamio simultáneamente (Figura 2.1). Las ventajas de la P3D-6 residen en su cierre ajustable, muy útil para infligir progresivamente a la muestra la deformación deseada. Además la transparencia del material de fabricación permite hacer el análisis de cada estado comprimido en un equipo de μ-CT con facilidad y sin tener que retirar la muestra de su respectiva cámara. Se diseñó un adaptador especial para colocar la cámara P3D-6 en el μ-CT (con roscas Luer-Lock macho) de modo que la muestra a analizar se encuentre siempre en la misma posición en todas la micro-tomografías realizadas. La adquisición de datos correspondientes a las ∆𝑷 generadas a través del andamio se hizo mediante el software-controlador del manómetro empleado (Testo®Comfort). Para evitar posibles perturbaciones en las mediciones, se fabricó un soporte en el cual se ancla la cámara para así mantenerla fija y en una misma posición a la hora de realizar las medidas manométricas. Figura 2.1: (1) Cámara EBERS® P3D-6, (2) discos porosos y (3) montaje con un andamio de PLLA. 2.2.1.1. Preparación de las muestras. Las cinco muestras que se emplearon para el ensayo fueron previamente seleccionadas dentro de un lote de andamios cilíndricos de PLLA suministrados por el Centro de Biomateriales e Ingeniería Tisular (CBIT) de la Universidad Politécnica de Valencia. Se eligen las muestras con las dimensiones más homogéneas posibles, y se recortan cuidadosamente las bases desiguales con un escalpelo para conseguir que las 24 bases de cada cilindro sean lo más planas posibles. El espesor medio de las muestras resultó ser de 5,34 ± 0,06 mm y el diámetro medio de 6,26 ± 0,09 mm. De estas cinco muestras, una se reserva para ser analizada en cada etapa del ensayo mediante μ-CT. El protocolo para esta muestra se detalla en la sección 2.2.2. Una vez preparadas, todas las muestras son sumergidas sucesivamente en etanol (CH3CH2OH) a 96°, 80° y 70° y finalmente en agua destilada. Cada inmersión se realiza durante 3 minutos dentro de una cámara de vacío a 0,5 bar para asegurarse la eliminación de posibles burbujas de aire atascadas dentro de los poros de la estructura. Se dejan las muestras inmersas de nuevo en H2O destilada durante 24h antes de seguir con el protocolo. 2.2.1.2. Protocolo experimental. 1º. Ubicación de la muestra. Cada muestra húmeda se coloca entre dos discos porosos y se inserta dentro de una cámara P3D-6, de tal manera que el disco inferior permita la sujeción del andamio mientras que el disco superior actúa como elemento compresor del andamio. La Figura 2.2 detalla la correcta colocación del andamio. A continuación la cámara se cierra cuidadosamente, evitando comprimir y preacondicionar la muestra. Se recomienda dejar el menor espacio posible entre el disco y el andamio. 2º. Distancia de referencia (estado inicial sin deformar). Con un pie de rey se mide cuidadosamente la distancia entre los puntos A y B como se enseña en la Figura 2.3. Para una cámara con dos discos porosos y sin andamio la distancia AB es de 14,30 ± 0,05 mm. Esta medición previa sirve de referencia para poder deformar la muestra con precisión en los siguientes pasos del protocolo. Conocido el espesor medio de las muestras (5,34 ± 0,06 mm), se determinan los gradientes de deformación a ser aplicados y así reducir sus espesores en un 10, 20, 30 y 40%. Para ello, en cada nivel de deformación se reducirá la distancia AB de la cámara. Por ejemplo, una reducción de aproximadamente 0,53 ± 0,01 mm será necesaria para lograr una deformación correspondiente de 10% del espesor medio de las muestras. 3º. Montaje del sistema. Como se mencionó anteriormente, se calcula la permeabilidad bajo el fundamento de la Ley de Darcy, midiendo la presión diferencial ∆𝑷. Para ello, se monta un circuito cerrado de agua destilada (con una 𝝁 = 10-3 Pa·s) y provisto por una bomba peristáltica con la que se gradúa el caudal (𝑸) requerido. Después de la bomba se conecta un amortiguador con el objetivo de absorber los impulsos generados por la 25 misma. Este amortiguador elimina las posibles sobrepresiones que se puedan presentar sobre las paredes del andamio garantizando un flujo constante y evitando el ruido en la lectura de datos. Sigue, a continuación, la cámara P3D-6 empalmada con válvulas de tres vías que permiten la conexión en paralelo de un manómetro diferencial con el que se consigue capturar las mediciones de presión antes y después del andamio. Finalmente, la línea aguas abajo vacía su contenido en un recipiente que se convierte nuevamente en la entrada del fluido al sistema. El sistema utilizado se muestra esquemáticamente en la Figura 2.4. Figura 2.2: (1) Disco poroso inferior, (2) andamio de PLLA, y (3) disco superior. Figura 2.3: Puntos de referencia para medir la deformación del andamio. Figura 2.4: Esquema y montaje del sistema de medición para ensayos de permeabilidad de andamios de PLLA. (1) Almacenamiento (2) bomba peristáltica, (3) amortiguador, (4) válvulas de tres vías, (5) manómetro diferencial y (6) cámara P3D-6. 32 2.4. Conclusiones y trabajos futuros. El protocolo experimental presentado en este capítulo permitió determinar tanto el comportamiento de la permeabilidad del andamio de PLLA, como el de su estructura trabecular, cuando está sometida a gradientes de deformación. La permeabilidad y la porosidad disminuyen conforme se comprime el andamio, hasta llegar a un supuesto colapso de los poros. La heterogeneidad de la estructura en su estado inicial, relacionada con la permeabilidad significativamente diferente de la de sus estados deformados, debe tomarse en cuenta a la hora de diseñar y fabricar el andamio de PLLA en vista de optimizar su comportamiento para su posterior uso tanto in vitro como in vivo. Un detalle relevante en este estudio ha sido determinar el comportamiento de los macroporos de la estructura polimérica, que bajo la deformación aplicada se colapsan en primer lugar y logran contribuir a la homogeneidad de la arquitectura, reflejada además con el comportamiento de la permeabilidad del andamio. Los datos obtenidos en los análisis por μ-CT siguen en tratamiento para la futura elaboración y publicación de un modelo computacional del comportamiento del andamio de PLLA bajo deformación, en colaboración con Malvé M., Mena A. y Acosta Santamaría V.A. Este modelo se basará en la simulación de las propiedades físicas del andamio partiendo de los resultados obtenidos en el presente estudio. 33 Capítulo 3 Comportamiento de la permeabilidad del andamio de PLLA durante un proceso de degradación bajo flujo continuo. Para cumplir con su correcta función, un andamio estructural de PLLA debe presentar unas propiedades mecánicas estables bajo condiciones dinámicas, además de una degradación progresiva después de la implantación, coordinada con la cinética de producción del tejido in-vivo, permitiendo mantener sus propiedades mecánicas adecuadamente. Varios autores han estudiado el comportamiento del andamio de PLLA durante un proceso de degradación estática [4, 29, 30,31]. Pero realmente, tanto in-vitro como in-vivo, la estructura polimérica estará expuesta a un entorno dinámico en el cual la degradación desempeña un papel primordial ya que está relacionada con el comportamiento mecánico de la estructura. En este capítulo se presenta el protocolo experimental diseñado y aplicado para estudiar la evolución de la permeabilidad y de las propiedades mecánicas del andamio de PLLA durante un proceso de degradación dinámica bajo un flujo continuo. Debido a una contaminación fúngica descontrolada en las muestras durante los diferentes ensayos, los resultados del experimento de permeabilidad no se pudieron analizar productivamente. En cambio se propone una optimización del protocolo experimental para su futura aplicación. 3.1. Degradación del PLLA. La biodegradabilidad para un andamio en Ingeniería de Tejidos es esencial puesto que su misión es servir de soporte mecánico hasta ser eliminado por las células que formarán el tejido regenerado, sin la necesidad de una intervención quirúrgica adicional. La degradación debe ser progresiva después de la implantación del andamio, en coordinación con la regeneración del tejido in-vivo y así permitir mantener las propiedades mecánicas del mismo (ver Figura 3.1). Mientras las células están 34 fabricando su propia estructura matricial, el andamio debe proporcionar un soporte estructural para la lesión, hasta el momento en que el tejido regenerado sea capaz de tolerar la carga mecánica impuesta. La degradación depende de la superficie del andamio, de su forma, densidad, lugar de implantación y masa molecular del polímero empleado. Un fallo en la velocidad de degradación puede incidir negativamente en la regeneración del tejido, y en el peor de los casos en un colapso del mismo. Figura 3.1: Gráfica ilustrando la interdependencia entre la pérdida de peso molecular y la disminución de la masa de un andamio estructural tridimensional frente al tiempo en la ingeniería de tejido de cartílago. (A) Fabricación del andamio reabsorbible; (B) Sembrado de condrocitos dentro del andamio en cultivos estáticos; (C) Crecimiento de tejido inmaduro en entorno dinámico; (D) Crecimiento de tejido maduro en entorno fisiológico; (E) Trasplante quirúrgico; (F) Asimilación del tejido trasplantado. Fuente: [30], traducido por A. Duizabo. El uso de polímeros biodegradables como andamios temporales para el crecimiento de células/tejidos in-vitro para la aplicación en la regeneración de tejidos in-vivo se ha convertido en un aspecto muy importante de la investigación y del desarrollo dentro de la Ingeniería de Tejidos. Los polímeros biodegradables deben fabricarse con diseños que aporten estructuras mecánicamente estables antes de que puedan utilizarse como andamios aplicados en Ingeniería de Tejidos. La estabilidad mecánica de la estructura del andamio es importante durante la regeneración ya que debe mantener su forma y tamaño tanto in-vitro como in-vivo. El PLLA es un termoplástico de la familia de los poliésteres biodegradables. Se diferencia de otros poliésteres por sus excelentes propiedades químicas, físicas y mecánicas. Al mismo tiempo, es el poliéster biodegradable que requiere mayores tiempos para su degradación. El tiempo en inmersión que corresponde a una pérdida de resistencia mecánica del 50%, es de aproximadamente 6 meses [32]. La degradación del PLLA se realiza por procesos hidrolíticos y genera como subproducto moléculas de ácido láctico. Este subproducto del polímero es incorporado dentro de los procesos fisiológicos a nivel celular, donde continúa su degradación y da inicio a la ruta metabólica de los carbohidratos del organismo fácilmente metabolizable. 35 Esta característica convierte el PLLA, desde el punto de vista toxicológico, en un producto ideal para su uso en Ingeniería de Tejidos. Sin embargo, hay que destacar también que la degradación de este polímero provoca la acidificación del medio en el que se encuentra, aspecto que no siempre es tolerable por el tejido. 3.2. Materiales y métodos. Para evaluar el comportamiento de las propiedades mecánicas del andamio de PLLA durante su degradación bajo un flujo continuo, se emplearon los siguientes insumos:  24 muestras cilíndricas de PLLA poroso, con diámetros de 5,6 a 6,2 mm y espesores de 2,8 a 3,2 mm.  6 cámaras para cultivo celular EBERS® P3D-6.  Una bomba peristáltica con 8 canales ECOLINE®.  Tubos Tygon® con diámetro interno 3,2 mm, y 6 tubos con pasadores con diámetro interior 0,88 mm.  Conectores-adaptadores de diámetro 3,2 mm a 0,88 mm.  12 conectores-válvulas de tres vías.  3 frascos de 250 mL con PBS (Phosphate Buferred Saline).  Penicilina estreptomicina (P/S*).  Anfotericina B (Fungizone®). La degradación de las muestras se experimentó a temperatura ambiente y bajo dos caudales distintos de PBS (1,5 y 3 mL/min). Se realizó el seguimiento del ensayo a 3, 7, 14 y 21 días. Se emplearon 3 muestras de PLLA para cada tiempo de seguimiento y caudal de flujo, aprovechando así continuamente 6 de los 8 canales disponibles por la bomba peristáltica empleada. El experimento duró 24 días para cada rango de caudal. 3.2.1. Preparación de las muestras. Las muestras empleadas para el experimento se seleccionaron de la misma manera que en el ensayo de permeabilidad presentado en el Capítulo 2 sección 2.2.1.1. El espesor medio de las muestras elegidas fue de (3,0 ± 0,2) mm y el diámetro medio de (5,9 ± 0,3) mm. Una vez preparadas, se sumergen sucesivamente en etanol (CH3CH2OH) de gradación decreciente a 96°, 80° y 70° y finalmente en PBS. Se realiza cada inmersión durante 3 minutos dentro de una cámara de vacío a 0,5 bar. Finalmente, las muestras se dejan inmersas de nuevo en PBS durante 24h antes de seguir con el protocolo. Al medio empleado (PBS) se le añade un tratamiento bactericida compuesto por una dosis de P/S* (Penicilina estreptomicina) correspondiente al 1% del volumen total de medio y de Fungizone® (Anfotericina B) correspondiente al 0,5% del volumen total. 36 3.2.2. Protocolo experimental. Los andamios de PLLA humidificados se colocan en las cámaras P3D-6, cerrándolas cuidadosamente de manera que no se pre-acondicionen las muestras. Las cámaras se conectan mediante conectores-válvulas de tres vías a un circuito fluídico (Figura 3.2) similar al del montaje del ensayo de permeabilidad (sección 2.2.1.2, Capítulo 2):  Cada frasco de almacenamiento provee medio a dos muestras, por lo cual llevan tapones perforados con 5 agujeros: 2 entradas, 2 salidas, y 1 toma de aire (con un filtro) para que la presión dentro del sistema sea homogénea (presión atmosférica).  El medio contenido en los frascos se trata con bactericida (1% de P/S* y 0,5% de Fungizone®) cada 2~3 días para evitar la aparición de bacterias y la formación de hongos dentro del andamio. Además se recomienda proteger de la luz el contenido de los frasco por razón de la fotosensibilidad del Fungizone®.  Las salidas de medio se anclan en los canales de la bomba, que impulsa el PBS con un caudal de 1,5 mL/min hasta las cámaras conectadas al circuito mediante las válvulas de tres vías. El medio vuelve al frasco de almacenamiento por el canal de entrada.  Se emplean simultáneamente 6 de los 8 canales disponibles de la bomba peristáltica, organizados de la siguiente manera: tres canales corresponden a las tres muestras de cada tiempo de degradación (3, 7, 14, 21 días). Se dedican los tres primeros canales al seguimiento de 7 días de degradación, y los otros tres al de 21 días. Una vez transcurrido los 7 días de degradación de las primeras muestras, los mismos canales son dedicados al seguimiento de 14 días de degradación de tal manera que se terminen al mismo tiempo los seguimientos de 14 y 21 días de degradación. Finalmente se realiza el seguimiento de 3 días de degradación. Una vez terminados todos los seguimientos para la degradación bajo caudal de 1,5mL/min, se retiran las muestras, y se repiten los pasos anteriores cambiando el caudal del flujo de degradación a 3 mL/min para las nuevas muestras. Se procede al lavado de las muestras degradadas, sumergiéndolas en agua destilada durante 3 minutos dentro de una cámara de vacío a 0,5 bar. 3.2.3. Ensayo de permeabilidad. Se mide la permeabilidad de los andamios de PLLA degradados siguiendo el protocolo experimental presentado en la sección 2.2.1.2 del capítulo anterior (pasos 3 y 4). 37 Figura 3.2: Montaje del circuito de degradación de los andamios de PLLA bajo flujo continuo. (a) Almacenamiento, (b) bomba peristáltica, (c) cámaras P3D-6 con válvulas de tres vías. 3.3. Resultados y discusiones. Como se ha mencionado al principio de este capítulo, el protocolo experimental no fue productivo debido a la contaminación por hongos que sufrieron las muestras. A pesar de mantener el tratamiento bactericida a lo largo del ensayo, la proliferación no se pudo contener y las repercusiones sobre los resultados fueron evidentes a partir del 3º día de degradación bajo los dos caudales de flujo. Los datos obtenidos del ensayo de la permeabilidad se muestran en la Figura 3.3 y la Tabla 2. Figura 3.3: Evolución de la permeabilidad del andamio de PLLA contaminado en función del tiempo de degradación bajo flujo de PBS a caudales de 1,5 mL/min (en azul) y 3 mL/min (en verde). 0 2E-10 4E-10 6E-10 8E-10 1E-09 0 3 7 14 21 k (m²) Tiempo de degradación (días) Q degrad. = 1,5 mL/min Q degrad. = 3 mL/min 38 Tiempo de degradación Degradación a Q = 1,5 mL/min Degradación a Q = 3 mL/min ∆𝑷 (Pa) 𝒌 (m²) ∆𝑷 (Pa) 𝒌 (m²) 0 días 523,1 ± 20,1 ( 3,78 ± 0,34 ) ·10-10 523,1 ± 20,1 ( 3,78 ± 0,34 ) ·10-10 3 días 530,3 ± 88,4 ( 5,05 ± 1,89 ) ·10-10 630,5 ± 58,0 ( 2,61 ± 0,57 ) ·10-10 7 días 550,8 ± 53,2 ( 3,75 ± 1,04 ) ·10-10 442,1 ± 20,4 ( 6,39 ± 1,28 ) ·10-10 14 días 638,6 ± 155 ( 3,44 ± 1,07 ) ·10-10 501,3 ± 99,5 ( 7,08 ± 2,55 ) ·10-10 21 días 560,9 ± 52,5 ( 3,39 ± 0,81 ) ·10-10 1235,6 ± 68,9 ( 8,62 ± 0,11 ) ·10-10 Tabla 2: Resultados de ∆𝑃 y de 𝑘 para los andamios de PLLA sometidos a gradientes de deformación. A la vista de tales resultados, es evidente que la presencia de hongos ha afectado el experimento porque la alta dispersión de los datos experimentales para ambos rangos de caudales de degradación, expresado por el error estándar, muestra la alteración del experimento debido a la contaminación. Además, la limitación en el número de andamios de PLLA (suministrados generosamente por el grupo CBTI de la Universidad Politécnica de Valencia) ha hecho imposible repetir los experimentos ni aumentar el tamaño muestral (3 andamios para cada tiempo de degradación) para obtener resultados estadísticamente relevantes. Todas las anteriores consideraciones indujeron a interpretar estos resultados como no aplicables para un análisis adecuado de la evolución de la permeabilidad de un andamio de PLLA en condiciones de degradabilidad dinámica bajo flujo. Para optimizar y mejorar el protocolo utilizado, y dado que tanto el PBS y el ácido poli-láctico son productos nutritivos y metabolizables para los organismos celulares, se proponen las siguientes modificaciones:  Preparar las muestras de PLLA y el medio de PBS bajo un ambiente estéril (campana de flujo laminar).  Higienizar y/o esterilizar los componentes del circuito fluídico de degradación.  Realizar el montaje fluídico de degradación dentro un biorreactor, una incubadora o una estufa aseptizada, a temperatura de 37ºC y en ausencia de luz.  Prever un mayor número de muestras, como mínimo 48 andamios de PLLA. El coste en tiempo del ensayo de degradación se doblará, pero asegurando en contraparte la caracterización de las propiedades mecánicas con un muestreo comparable estadísticamente.  Dedicar al mínimo un andamio como muestra de control, a la cual se realizará el seguimiento de su macro-estructura con micro-tomografías en cada tiempo de degradación. 39 3.4. Conclusiones. Este protocolo experimental resultó ser inapropiado e insuficiente para las condiciones en las que se deseó degradar los andamios de PLLA. La falta de esterilidad de las muestras y de los componentes del circuito fluídico para el ensayo de degradación han podido ser un factor muy relevante en el origen y la proliferación de la contaminación fúngica en los andamios de PLLA. 40 41 Capítulo 4 Comportamiento del andamio de PLLA bajo deformaciones dinámicas. La Ingeniería de Tejidos se basa principalmente en tres etapas: el diseño y la fabricación de un andamio estructural capaz de soportar las condiciones mecánicas y fisiológicas del tejido a reparar, un cultivo in vitro de células especificas que permitan la regeneración del tejido dentro del andamio seleccionado, y la implantación in vivo del andamio en la zona lesionada. Para el diseño óptimo del andamio se deben tener en cuenta las condiciones mecánicas y fisiológicas a las que puede estar sometido tanto en los periodos in vitro como in vivo [33]. En este capítulo se presenta el protocolo experimental diseñado y realizado para estudiar el comportamiento de la permeabilidad del andamio de PLLA sometido a deformaciones cíclicas. Se evaluaron y analizaron los cambios experimentados por la tensión máxima soportada por la estructura frente a los niveles de deformación impuesta, la deformación acumulada a lo largo de los ciclos del ensayo, y la permeabilidad al inicio y al final del tratamiento. Varios autores emplearon protocolos similares para estudiar el efecto de cargas compresivas dinámicas sobre la biosíntesis de condrocitos [34], o la degradación in vitro de andamios estructurales de otras composiciones [35, 31]. Mientras unos eligen la estimulación dinámica con control en carga, otros optan por el control en deformación, con amplitudes del 2% hasta 10% del espesor inicial de las muetras, a frecuencias fisiológicas (entre 0,1 y 1 Hz) y durante ensayos continuos o interrumpidos [33]. Los resultados obtenidos permitirán completar el estado del arte sobre el comportamiento del andamio de PLLA en condiciones dinámicas, y evaluar la capacidad de la estructura polimérica estudiada a cumplir con sus futuros objetivos. 4.1. Materiales y métodos. El experimento descrito en este capítulo se realizó empleando los siguientes materiales e instrumentos: 48 En el caso de deformaciones del 5 y 10% respecto al espesor inicial de las muestras, la variabilidad de los resultados reportados para 𝝈máx disminuye conforme pasan los ciclos (ver Tabla 3), lo que puede interpretarse como una heterogeneización de la arquitectura trabecular, que acaba constituida únicamente por las trabéculas más gruesas que no se colapsaron. Figura 4.5: Gráfica de la tensión máxima para cada amplitud de deformación dinámica. Nº de ciclos Tensión máxima (MPa) Deformación al 2% Deformación al 5% Deformación al 10% 0 0,0176 ± 0,0085 0,0661 ± 0,0215 0,0447 ± 0,0144 20000 0,0187 ± 0,0085 0,0453 ± 0,0138 0,0288 ± 0,0115 40000 0,0189 ± 0,0085 0,0409 ± 0,0120 0,0250 ± 0,0086 60000 0,0167 ± 0,0077 0,0361 ± 0,0103 0,0221 ± 0,0072 80000 0,0183 ± 0,0082 0,0357 ± 0,0099 0,0202 ± 0,0063 100000 0,0190 ± 0,0084 0,0352 ± 0,0095 0,0206 ± 0,0063 120000 0,0177 ± 0,0079 0,0329 ± 0,0086 0,0201 ± 0,0059 140000 0,0191 ± 0,0084 0,0316 ± 0,0082 0,0175 ± 0,0054 160000 0,0192 ± 0,0084 0,0318 ± 0,0083 0,0194 ± 0,0061 180000 0,0177 ± 0,0078 0,0309 ± 0,0078 0,0194 ± 0,0059 200000 0,0185 ± 0,0081 0,0298 ± 0,0077 0,0177 ± 0,0054 Tabla 3: Resultados de la tensión máxima para cada amplitud de deformación dinámica y número de ciclos. 49 Figura 4.6: Gráfica de la deformación acumulada para cada amplitud de deformación dinámica. Nº de ciclos Deformación acumulada (%) Deformación al 2% Deformación al 5% Deformación al 10% 0 0,3 0,5 0,8 20000 0,5 1,7 4,2 40000 0,63 2,1 4,9 60000 0,65 2,4 5,2 80000 0,67 2,4 5,7 100000 0,67 2,4 5,75 120000 0,7 2,5 5,75 140000 0,67 2,6 5,7 160000 0,65 2,7 5,6 180000 0,7 2,7 5,75 200000 0,7 2,7 5,75 Tabla 4: Resultados de la deformación acumulada para cada amplitud de deformación dinámica y número de ciclos. La estabilidad del comportamiento del andamio de PLLA durante 200000 ciclos de deformación dinámica con una amplitud del 2% respecto al espesor inicial, permite afirmar que este rango de deformaciones altera mínimamente a la arquitectura del andamio y a su capacidad a aguantar las deformaciones periódicas. En cambio, la aplicación de amplitudes de deformación mayores tiende a colapsar la estructura tridimensional, exigiendo la redistribución de sus trabéculas para resistir de forma estable a las cargas impuestas. 50 4.2.2. Permeabilidad. Los resultados de las ∆𝑷 medidas y de las 𝒌 calculadas se reportan en la Tabla 5 y las Figuras 4.8 y 4.9. Mediante un análisis estadístico “One-Way ANOVA” aplicado a los datos de ∆𝑷 y 𝒌, se reveló una diferencia significativa entre los resultados para las muestras deformadas y los del control, que corresponden al estado previo al ensayo. Por lo cual se descartan los posibles vínculos entre estas dos condiciones. Tal y como se puede apreciar en la Figura 4.8, la permeabilidad 𝒌 va incrementando en acorde con la amplitud de la deformación dinámica que se impuso a la estructura tridimensional de PLLA. Esta tendencia apoya las hipótesis anteriormente formuladas. A mayor amplitud de deformación, las trabeculas delgadas no resisten a la carga impuesta y colapsan, lo cual implica la formación de espacios vacantes y, por consecuente, un aumento del número y tamaño de macro-poros dentro de la arquitectura tridimensional. La Figura 4.7 ilustra la repartición de las trabéculas de distintos tamaños dentro de un andamio de PLLA sin deformar. Se pueden distinguir claramente las trabéculas más delgadas de las más gruesas. Figura 4.7: Imagen por Microscopía Electrónica de Barrido (a) y micro-tomografía (b) de un andamio estructural de PLLA. Fuente: [17] Además, un detalle relevante se observó durante el protocolo del ensayo de permeabilidad: transcurrido 24h después de la experimentación, las muestras se recuperaron totalmente de su deformación acumulada en el caso de una deformación del 2% con respecto al espesor inicial. Para les deformaciones del 5 y 10%, la deformación acumulada se reduzco respectivamente hasta el 1 y el 3% del espesor inicial. Este fenómeno, junto con las observaciones anteriores, justifica el comportamiento estudiado para la permeabilidad. Finalmente, el alto error típico asociado a la 𝒌 para la amplitud de deformación del 10% puede interpretarse como una heterogeneidad elevada de la estructura tridimensional, consecuencia de la redistribución de sus trabéculas. 51 Figura 4.8: Permeabilidad del andamio de PLLA para cada amplitud de deformación dinámica aplicada durante 200 000 ciclos. Figura 4.9: Presión diferencial para cada amplitud de deformación dinámica aplicada al andamio de PLLA durante 200 000 ciclos. Amplitud de deformación ∆𝑷 (Pa) 𝒌 (m²) 0% (control) 434,41 ± 31,22 ( 4,51 ± 0,99 ) ·10-10 2% 801,63 ± 118,05 ( 1,68 ± 0,42 ) ·10-10 5% 610,32 ± 29,75 ( 2,44 ± 0,26 ) ·10-10 10% 587,58 ± 72,68 ( 2,98 ± 0,95 ) ·10-10 Tabla 5: Resultados de ∆𝑃 y de 𝑘 para los andamios de PLLA sometidos a deformaciones dinámicas durante 200 000 ciclos. 52 4.3. Conclusiones. El protocolo experimental diseñado y elaborado para estudiar el comportamiento del andamio de PLLA frente a deformaciones dinámicas permitió evaluar la influencia de la amplitud de la deformación impuesta a la estructura polimérica inmersa sobre su permeabilidad. Se establece que una amplitud de deformación del 2% respecto al espesor inicial del andamio es la más tolerada por su estructura, la cual conserva una conducta estable y no acumula deformación a lo largo del experimento. Mientras que frente a deformaciones de mayor amplitud, la estructura tridimensional de PLLA se ve alterada por el cúmulo de las cargas compresivas y su arquitectura se readapta mediante la deformación de las trabéculas, volviéndose más heterogénea. La permeabilidad del andamio en su condición final permanece dentro del rango de valores tolerables para su uso como injerto en regeneración de cartílago articular. La tendencia de la estructura tridimensional de PLLA a modificar su conformación es un comportamiento crítico y no despreciable para el cultivo celular dinámico in vitro y la implantación in vivo del andamio, teniendo en cuenta las condiciones fisiológicas de compresión a las que estará expuesto para tal uso. 53 Capítulo 5 Conclusiones y trabajos futuros. 5.1. Conclusiones. A lo largo de este trabajo, se han desarrollado diferentes metodologías para evaluar experimentalmente el comportamiento del andamio estructural de PLLA en entorno dinámico. La realización de las mismas ha permitido determinar las siguientes conclusiones, que se delinean agrupadas por las siguientes temáticas: Comportamiento de la permeabilidad bajo gradientes de deformación:  Conforme se comprime el andamio, su permeabilidad y su porosidad disminuyen hasta llegar a un supuesto colapso.  Los macro-poros de la estructura tridimensional colapsan bajo las deformaciones aplicadas, lo que contribuye a la homogeneización de la arquitectura del andamio.  La heterogeneidad de la estructura en su estado inicial, y la diferencia significativa entre su permeabilidad y la de los estados deformados, debe tomarse en cuenta a la hora de diseñar el andamio de PLLA en vista de optimizar su comportamiento para su posterior uso tanto in vitro como in vivo. Comportamiento de la permeabilidad durante un proceso de degradación bajo flujo:  El protocolo experimental resultó ser inapropiado e insuficiente para las condiciones en las que se deseó degradar los andamios de PLLA.  La falta de esterilidad de la muestras y de los componentes del circuito fluídico para el ensayo de degradación han sido un factor relevante en el origen y la proliferación de la contaminación fúngica en los andamios de PLLA. 54 Comportamiento del andamio bajo deformaciones dinámicas:  Una amplitud de deformación del 2% respecto al espesor inicial del andamio afecta mínimamente sus propiedades estructurales.  A mayor amplitud de deformación, la estructura tridimensional se ve alterada por el cúmulo de cargas compresivas y su arquitectura se readapta mediante la deformación de las trabéculas, volviéndose más heterogénea.  La tendencia de la estructura tridimensional de PLLA a modificar su conformación es un comportamiento crítico y no despreciable para el cultivo celular dinámico in vitro y la implantación in vivo del andamio. 5.2. Trabajos futuros. A continuación se citan algunas líneas de trabajo futuro que se podrían abordar, para permitir ahondar más en la caracterización del andamio de PLLA y en la valoración de su funcionalidad para sus futuras aplicaciones:  Elaborar un modelo computacional del comportamiento del andamio de PLLA bajo deformación, basado en la simulación de las propiedades mecánicas y estructurales del andamio, partiendo de los resultados obtenidos experimentalmente en este trabajo.  Estudiar el comportamiento y la evolución de las propiedades mecánicas (modulo de Young, modulo agregado) y estructurales (porosidad, tamaño de poros) del andamio bajo deformaciones dinámicas.  Estudiar y perfeccionar una metodología para caracterizar las propiedades mecánicas de la estructura tridimensional de PLLA bajo degradación dinámica con flujo.  Elaborar una metodología para estudiar la estimulación de células, mediante el cultivo celular dinámico dentro del andamio. 55 Bibliografía. [1] Sociedad Española de Reumatología, La artrosis, Folletos de la SER. 2009. [2] U. Meyer y H.P. Wiesmann, Bone and cartilage engineering. 2006, Springer: Berlin. [3] K.A. Athanasiou, G.G. Niederauer y C.M. Agrawal, Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid polyglycolic acid copolymers. Biomaterials, 1996. 17(2):93-102 [4] G. Yihong, Z. Qingliang, G. Changyou y S. Jiacong, In vitro and in vivo degradability and cytocompatibility of (polyl-lactic) acid scaffold fabricated by a gelatin particle leaching method. Acta Biomaterialia, 2007. 3(4): 531-540. [5] A. Morato, I. Narváez y C. Toribio, Ciencias de la Salud - El futuro de los biomateriales tendencias tecnológicas a medio y largo plazo, Observatorio de Pros-pectiva Tecnológica Industrial y Federación Española de Empresas de Tecnología Sanitaria. 2004, Cyan Proyectos y Producciones Editoriales S.A.: Madrid. [6] B. Valdez, M. Schorr, E. Valdez. y M. Carrillo, Biomateriales para la rehabilitación del cuerpo humano. Ciencia y desarrollo en internet, 2005. [7] Gustavo A. Abraham & al., La ciencia y la ingeniería de los biomateriales, un desafío interdisciplinario. La Ciencia Hoy, 1998. 49(9). [8] J.R. Steadman, W.G. Rodkey, S.B. Singleton y K.K. Briggs, Microfracture technique forfull-thickness chondral defects: Technique and clinical results. Operative Techniques in Orthopaedics, 1977. 7(4): 300-304. [9] V.C. Mow, M.H. Holmes y W.M. Lai, Fluid transport and mechanical properties of articular cartilage: A review. Journal of Biomechanics, 1984. 17(5): 377-39. [10] M.B. Abhijit y B.R. James, Articular cartilage: structure, injuries and review of management. British Medical Bulleting, 2008: 77-95. [11] M. Marcacci, M. Berruto, D. Brocchetta, A. Delcogliano, D. Ghinelli, A. Gobbi, E. Kon, L. Pederzini, D. Rosa, G.L. Sacchetti, G. Stefani y S. Zanasi, Articular cartilage engineering with hyalograft(R) C: 3-Year clinical results. Clinical Orthopaedics & Related Research, 2005. 435: 96-105. [12] R. Dorotka, U. Bindreiter, K. Macfelda, U. Windberger y S. Nehrer, Marrow stimulation and chondrocyte transplantation using a collagen matrix for cartilage repair. Osteoarthritis and Cartilage, 2005. 13(8): 655-664. [13] M. Chiquet, A.S. Renedo, F. Huber y M. Flück, How do fibroblasts translate mechanical signals into changes in extracellular matrix production?. Matrix Biol, 2003. 22: 73–80. [14] G. Falke y A. Atala, Reconstruccción de tejidos y órganos utilizando ingeniería tisular. Arch.argent.pediatr 2000. 98(2): 103. [15] J.K. Suh y H.W. Matthew, Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review. 2000 24: 2589-2598. [16] L. Budyanto, Y.Q. Goh y C.P. Ooi, Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid–liquid phase separation and freeze extraction. J Mater Sci: Mater Med, 2009. 20: 105–111. [17] V.A. Acosta Santamaría, Caracterización mecánica y simulación de los principales factores involucrados en la Ingeniería Tisular del cartílago articular. 2011, Tesis doctoral. Universidad de Zaragoza. 56 [18] B. A. Harley, J.H. Leung, E.C. Silva y L.J. Gibson, Mechanical characterization of collagen-glycosaminoglycan scaffolds. Acta Biomaterialia, 2007. 3(4): 463-474. [19] Ming-Hua Ho, Pei-Yun Kuo, Hsyue-Jen Hsieh, Tzu-Yang Hsien, Lein-Tuan Hou, JuinYih Lai, Da-Ming Wang, Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods. Biomaterials, 2004. 25(1): 129-138. [20] T.M. Freyman, I.V. Yannas y L.J. Gibson, Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progr. Mater. Sci. , 2001. 46: 273–282. [21] A. Al-Munajjed, M. Hien, R. Kujat, J.P. Gleeson y J. Hammer, Influence of pore size on tensile strength, permeability and porosity of hyaluronan-collagen scaffolds. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 2008. 19(8): 2859-2864. [22] F.J. O'Brien, B.A. Harley, M.A. Waller, I. Yannas, L.J. Gibson y P. Prendergast, The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care, 2007. 15(1): 3-17. [23] R.D. Brígido, J.M. Estellés, J.A. Sanz, J.M. García-Aznar y M. S. Sánchez, Polymer scaffolds with interconnected spherical pores and controlled architecture for tissue engineering: Fabrication, mechanical properties, and finite element modeling. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2007. 81B(2): 448-455. [24] D.Lacroix, A. Chateau, M.P. Ginebra y J.A. Planell, Micro-finite element models of bone tissue-engineering scaffolds. Biomaterials, 2006. 27(30): 5326-5334. [25] M.V. Chor y L. Wei, A permeability measurement system for tissue engineering scaffolds Meas sci Tecnol 2007. 18: 208-216 [26] J.A. Sanz, C. Kasper, M. van Griensven, J.M. Garcia-Aznar, I. Ochoa y M. Doblare, Mechanical and flow characterization of Sponceram® carriers: Evaluation by homogenization theory and experimental validation. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2008. 87B(1): 42-48. [27] I. Ochoa, J.A. Sanz, J.M. Garcia-Aznar, M. Doblare, D.M. Yunos y A.R. Boccaccini, Permeability evaluation of 45S5 Bioglass-based scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics, 2009. 42(3): 257-60. [28] J.M. Mansour y V.C. Mow, The permeability of articular cartilage under compressive strain and at high pressures. Journal of Bone and Joint Surgery, 1976. 58(4): 509-516. [29] W. Li, J.A. Cooper, R.L. Mauck y R.S. Tuan, Fabrication and characterization of six electrospun poly([alpha]-hydroxy ester)-based fibrous scaffolds for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia, 2006. 2(4): 377-385. [30] D.W. Hutmacher, Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials, 2000. 21(24): 2529-2543. [31] Y.Y. Kang, Y. Yadong, H. Guangfu, L. Zhongbing, X. Xiaoming and G. Xiujuan Zhao, A study on the in vitro degradation properties of poly(L-lactic acid)/beta-tricalcuim phosphate (PLLA/beta-TCP) scaffold under dynamic loading. Medical engineering & physics, 2009. 31(5): 589-94. [32] G. Wei y P.X. Ma, Structure and properties of nano-hydroxyapatite/polymer composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials, 2004. 25(19): 4749-4757. [33] Lee C., Grad S., Wimmer M., Alini M., The influence of mechanical stimuli on cartilage tissue engineering. Topics in Tissue Engineering, vol.2. 2005. [34] J.D. Kisiday, M. Jin, M.A. DiMicco, B. Kurz, A.J. Grodzinsky, Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics, 2004. 37: 595-604. [35] Y. Yang, Y. Zhao, G. Tang, H. Li, X. Yuan, Y. Fan, In vitro degradation of porous poly(L-lactide-co-glycolide)/beta-tricalcuim phosphate (PLGA/beta-TCP) scaffold under dynamic and static conditions. Polymer Degradation and Stability, 2008. 93: 1838-1845. [36] K. G. Holt, S.F. Jeng, R. Ratcliffe, J. Hamill, Energy cost and stability during walking at the preferred stride frequency. Journal of Motor Behaviour, 1995. 27(2): 164-178. [37] BioDynamic Test Instrument Reference Manual, 2008-2011. BOSE Corporation. [38] Poly-lactic acid. Wikipedia, 2012. 57 Parte II Anexos 64 Figura C.1: Sistema Biodynamic 5210 multi-espécimen (izquierda), y sistema generador de pulso fluídico (derecha). Figura C.2: Sistema Biodynamic 5170 mono-espécimen con micrómetro de láser. 65 66 67 Anexo D Resumen de las prácticas del Trabajo Fin de Máster. “Para el cumplimiento de la parte práctica del presente Trabajo Fin de Máster, he elegido asistir, como observador, a las intervenciones quirúrgicas que se realizaron en el área de Quirófanos del Hospital Royo Villanova en Zaragoza, durante el periodo del 9 al 13 de Julio del 2012. Bajo la tutela del Doctor José Antonio Fatás Cabeza, Jefe de Servicio en Cirugía general y del aparato digestivo del Hospital Royo Villanova, estuve presente en cada intervención quirúrgica realizada durante mi estancia, junto con el equipo de cirujanos y enfermeras del área de Quirófanos. Pude observar con atención el procedimiento de las operaciones, fueran con métodos convencionales o de mínima invasión, desde el ingreso de los pacientes en los bloques quirúrgicos hasta su salida. Asistí a intervenciones laparoscópicas, principalmente de aparato digestivo, realizadas sobre casos de obesidad mórbida, cánceres de colon y estómago, apendicitis agudas, además de intervenciones traumatológicas de colocación de prótesis de rodilla, cadera, placas de fijación de fracturas óseas, ligamentoplastia, y operación de juanete. En presencia de los representantes de casas comerciales de prótesis, como Zimmer® y Stryker®, y de instrumentación quirúrgica y endoscópica, aproveche la oportunidad para compartir y profundizar mis conocimientos con ellos. Esta experiencia me permitió reflexionar y desarrollar mis ideas sobre la mejora de las técnicas quirúrgicas laparoscópicas y traumatológicas, y de su instrumentación. Aunque esta parte práctica no tuvo relación directa con el tema del TFM, me facilitó vincular correctamente los trabajos en la investigación en Ingeniería de los Tejidos con su posterior e hipotética aplicación in vivo en futuros pacientes.” 68 69 Anexo E Trabajos complementarios. A lo largo del desarrollo del presente Trabajo Fin de Máster, participe y colabore voluntariamente en los siguientes trabajos segundarios: Pruebas de cultivo celular dinámico con un biorreactor de flujo: EBERS®, empresa “spin-off” de la Universidad de Zaragoza, desarrolló la fabricación de un biorreactor de flujo (TEB1000) para realizar cultivos celulares dinámicos. Se hicieron pruebas de cultivo celular en andamios cerámicos (Sponceram®) para evaluar el correcto funcionamiento del dispositivo, y realizar por la misma ocasión un video tutorial del protocolo de montaje de los componentes del sistema. Se puede visualizar este tutorial en las siguientes páginas web: http://www.ebersmedical.com/ http://www.youtube.com/watch?v=KWQyhL86cDs&feature=player_embedded. Ensayos de fatiga de biomateriales: Se colaboró en la realización del Proyecto Fin de Carrera “Caracterización Mecánica de hidrogeles de Pluronic® para aplicaciones en Ingeniería de Tejidos” del alumno Alexis Allueva Arjol, diseñando y elaborando un protocolo experimental para estudiar la evolución de las propiedades mecánicas de hidrogeles de Pluronic® de dos concentraciones distintas, bajo un ambiente dinámico de deformación. Se realizaron los ensayos en condiciones de cultivo celular dinámico, usando el biorreactor BOSEElectroForce® BioDynamic 5210. Siguiendo el mismo protocolo definido para los hidrogeles de Pluronic®, se realizaron ensayos experimentales para caracterizar mecánicamente unos hidrogeles híbridos de PEA/PHEA (Poli-etil acrilato/Poli-hidroxietil acrilato) bajo deformaciones dinámicas. Los resultados fueron destinados a la elaboración del PFC de Carlos Pelegay Salas, “Caracterización de biomateriales compuestos para su uso en Ingeniería de Tejidos”. 70 Publicación de un artículo de revista científica: Se colaboró en la elaboración del artículo “Computational methodology to determine fluid related parameters of non-regular three-dimensional scaffolds”, publicado por Acosta Santamaría V.A, Malvè M., Duizabo A., Mena Tobar A., Gallego Ferrer G, García Aznar J.M., Doblare M., y Ochoa Garrido I., que ha sido aceptado en la revista Annals of Biomedical. Ensayos de permeabilidad de andamios de β-TCP: Para la elaboración de la tesis doctoral de Sonja Kress, titulada ”Osteogenic differenciation of Human Mesenchymal stem cells by the design of a microenvironment”, se realizaron una serie de ensayos de permeabilidad sobre andamios cerámicos Sponceram 30-90 (Zellwerk GmbH) y Osseolive (Curasan), destinados a la investigación en ingeniería tisular de hueso. Se empleó el permeámetro patentado por el grupo GEMM. Degradación de bloques de PLLA: En colaboración con el grupo CBIT de la Universidad Politécnica de Valencia, se implementó un protocolo experimental para estudiar y caracterizar la degradación de bloques de ácido poli-L-láctico (PLLA). Las muestras se mantuvieron inmersas en PBS y en SBF durante tiempos de seguimiento de 6, 12, 24 y 36 semanas y a temperatura de 37ºC. Se evaluaron la pérdida de masa, los cambios de volumen, y las propiedades mecánicas (módulo de Young Es, y módulo agregado Ha) mediante ensayos de compresión uniaxial (confinada y no confinada). Diseño de un “gradient maker”: Un gradient maker es un instrumento usado en bioquímica para producir un gradiente lineal de concentración al mezclar dos soluciones acuosas. Dado el alto precio comercial del dispositivo, y su necesidad en los laboratorios, se realizó un diseño CAD de un gradient maker para ser fabricado mediante técnicas de prototipado rápido con el fin de minimizar los costes (Figura E.1). A continuación, se presentan los planos del diseño y fabricación de los componentes del instrumento. Figura E.1: Diseño tridimensional de los componentes del gradient maker (izquierda), y piezas fabricadas por prototipado rápido, ensambladas (derecha). 71 72