Repositorio Institucional de Documentos

Agradecimientos En primer lugar quiero agradecer a mi directora de este Trabajo Fin de Máster, Gema Martínez, toda su paciencia, tiempo y dedicación, sin los que no hubiera sido posible realizar este proyecto. A mis compañeros de laboratorio del INA, gracias por toda la ayuda prestada, especialmente a Ana, y por todos los buenos momentos que me habéis hecho pasar. Agradecer también a Vanesa que me hiciera posible y muy agradable la realización de las prácticas bajo su tutela. Y por último dar las gracias a mi familia y mis amigos por su apoyo incondicional, sin el cual no habría llegado hasta aquí. Muchas gracias a todos. Fabricación de Nanoplataformas Multifuncionales para su Aplicación en nanomedicina: Agentes de Contraste en Imagen Molecular, Hipertermia Magnética y Liberación de Fármacos. Resumen En el presente trabajo se ha realizado la síntesis de diferentes suspensiones coloidales de nanopartículas basadas en magnetita y sílice densa y porosa, y su estudio como potencial aplicación en el campo de la biomedicina como agentes de contrate para imagen por resonancia magnética, hipertermia magnética y sistema de liberación de fármacos. La síntesis de las nanopartículas magnéticas se ha llevado a cabo mediante descomposición térmica de precursores orgánicos de hierro en disolventes orgánicos. Tras la síntesis es necesario refuncionalizar su superficie, para conseguir un coloide más estable y que pueda tener lugar la unión híbrida de estas nanopartículas sobre un soporte silíceo (denso o poroso) mediante un enlace peptídico. Las síntesis de las nanoplataformas multifuncionales de soporte poroso ha finalizado, mientras las nanopartículas híbridas de soporte denso se someten a un crecimiento, lo que proporcionará un recubrimiento (shell) de óxido de hierro sobre el soporte de sílice (core). Este paso es el intermedio para intentar sintetizar nanoplataformas multifuncionales huecas de óxido de hierro. Tras cada síntesis, se procede a la caracterización de las nanopartículas para conocer la morfología, el tamaño, el diámetro hidrodinámico, la carga superficial y la concentración de la muestra. Y por último se sucederán una serie de experimentos para probar su validez en las aplicaciones de hipertermia, de carga de moléculas orgánicas (cristal de violeta) y como agente de contraste para resonancia magnética (relaxometría). Índice de Contenidos 1 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1 2 OBJETIVOS ............................................................................................................................. 3 3 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ......................................................................................... 4 Síntesis de Nanopartículas Magnéticas: Fe3O4 .............................................................. 4 Síntesis de Nanopartículas Híbridas: MCM-41@Fe3O4 y SiO2@Fe3O4. ......................... 5 Síntesis de nanopartículas Core-Shell SiO2@FexOy ....................................................... 5 Experimento absorción-desorción de CV. ..................................................................... 5 Caracterización .............................................................................................................. 6 3.5.1 Microscopio Electrónico de Trasmisión (TEM) ...................................................... 6 3.5.2 Radio Hidrodinámico ............................................................................................. 7 3.5.3 Potencial Zeta (ξ). .................................................................................................. 7 3.5.4 Relaxometría ......................................................................................................... 8 3.5.5 Espectroscopia Ultravioleta-Visible ....................................................................... 8 4 DISCUSIÓN Y RESULTADOS .................................................................................................... 9 Esquema de Trabajo ...................................................................................................... 9 Nanopartículas superparamagnéticas ........................................................................ 10 4.2.1 Agentes de Contraste .......................................................................................... 12 4.2.2 Hipertermia Magnética ....................................................................................... 13 Nanopartículas Híbridas: MCM-41@Fe3O4 ................................................................. 13 4.3.1 Agentes de contraste .......................................................................................... 16 4.3.2 Absorción y desorción de CV ............................................................................... 16 Nanopartículas Huecas ................................................................................................ 18 5 CONCLUSIONES ................................................................................................................... 21 6 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 22 7 ANEXO: Prácticas del Trabajo Fin de Máster ...................................................................... 23 Índice de figuras Figura 1. Escala nanométrica. ____________________________________________________________ 1 Figura 2. Algunos ejemplos de nanomateriales y sus aplicaciones en tecnología y biomedicina. _______ 1 Figura 3. Síntesis por sonicación química y tratamiento térmico post-reacción. ____________________ 2 Figura 4. Método layer-by-layer de Zhu, Y., et al. (2003) [5] ___________________________________ 3 Figura 5. Sustitución nucleófila realizada por Kim, J., et al. (2006) [8]. ____________________________ 3 Figura 6. Montaje para síntesis de NPs Fe3O4 _______________________________________________ 4 Figura 7. Montaje para síntesis de NPs Core-Shell ____________________________________________ 5 Figura 8.Esquema funcional del TEM ______________________________________________________ 6 Figura 9. Esquema de síntesis de NPs ______________________________________________________ 9 Figura 10. Síntesis de NPs Fe3O4. _________________________________________________________ 10 Figura 11. Funcionalización de NPs magnéticas. ____________________________________________ 10 Figura 12. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs Fe3O4. ________ 10 Figura 13. (a) Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) y (b) potencial zeta de NPs Fe3O4. _____ 11 Figura 14. Magnetización de NPs Fe3O4. (Miguel-Sancho, N., et al.(2011)) _______________________ 12 Figura 15. Relaxometría T2 de las NPs magnéticas. __________________________________________ 12 Figura 16. Hipertermia magnética de NPs magnéticas. _______________________________________ 13 Figura 17. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs MCM-41. _____ 13 Figura 18. (a) Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) y (b) potencial zeta de NPs MCM-41. ___ 14 Figura 19. Síntesis de nanopartículas híbridas MCM-41@Fe3O4 por reacción de condensación. _______ 14 Figura 20. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de NPs MCM-41@Fe3O4. _ 15 Figura 21. (a) Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) NPs MCM-41@Fe3O4 y potenciales zeta de NPs MCM-41@Fe3O4 y sus materiales iniciales. _____________________________________________ 15 Figura 22. Relaxometría T2 de las NPs MCM-41@Fe3O4. ______________________________________ 16 Figura 23. Estudio de absorción de CV a diferentes pHs. ______________________________________ 17 Figura 24. (a) Evolución temporal de adsorción y (b) cinética de segundo orden. __________________ 18 Figura 25. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs SiO2. _________ 19 Figura 26. Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) NPs SiO2 densa. _______________________ 19 Figura 27. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs SiO2@Fe3O4. __ 19 Figura 28. Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) NPs SiO2@Fe3O4. ______________________ 20 Figura 29. Síntesis de NP score-shell. _____________________________________________________ 20 Figura 30. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs SiO2@FexOy ___ 21 Índice de tablas Tabla 1. Tabla de concentraciones de las muestras medidas por relaxometría. _____________________ 8 Tabla 2. Concentraciones de Fe y de Fe3O4 en mg/ml de NPs Fe3O4. ____________________________ 11 Tabla 3.Concentraciones de Fe, de Fe3O4 y de semillado en mg/ml de NPs MCM-41@Fe3O4. _______ 16 Tabla 4. Concentraciones de Fe y de Fe3O4 en mg/ml de NPs SiO2@Fe3O4. ________________________ 20 Introducción 1 | P á g i n a 1 INTRODUCCIÓN Los términos nanociencia y nanotecnología proceden del prefijo griego “nano” o del latín “nanus”, que significan “enano”. La nanociencia y la nanotecnología son unas de las disciplinas de mayor relevancia del siglo XXI, son multidisciplinares e interdisciplinares, y engloban distintas áreas científicas como química, física, ciencia de los materiales, ingeniería, biología e incluso medicina. La nanociencia puede definirse como la ciencia que estudia los fenómenos que tienen lugar a escala nanométrica, y la nanotecnología como el diseño, la síntesis, la manipulación y la aplicación de sistemas o dispositivos a través del control de la materia a nanoescala. Figura 1. Escala nanométrica. La figura 1 representa una escala nanométrica que compara diferentes tamaños desde el ser humano hasta las nanopartículas. Se considera nanomaterial a aquel que al menos una de sus dimensiones oscila entre un nanómetro y varios cientos de nanómetros. El interés de estas dimensiones radica en que, para determinados materiales, algunas de las leyes físicas a escala nanométrica difieren de las del material masivo, proporcionándoles propiedades únicas como, fluorescencia, plasmón superficial, superparamagnetismo, alta relación superficie/volumen, etc. Debido a esto, el uso de los nanomateriales está creciendo de forma exponencial y sus aplicaciones cada vez abarcan un rango más amplio. Desde aplicaciones de la vida cotidiana como en cosméticos, crema de protección solar, envases para alimentación, sector textil y en electrodomésticos, hasta aplicaciones más específicas como nanobiosensores, absorbentes para purificación de aguas contaminadas, agentes de contraste para imagen médica, en ingeniería de tejidos, etc. Figura 2.Algunos ejemplos de nanomateriales y sus aplicaciones en tecnología y biomedicina. NANOSISTEMAS BIOMEDICINA TECNOLOGÍA Absorción de moléculas orgánicas Agente de contrate en IRM Protección contra rayos UV Recubrimiento bactericida en electrodomésticos Nanosensores Liberación controlada de fármacos Hipertermia óptica Biomarcadores Fe3O4 TiO2 Fe3O4 SiO2 MCM-41 Ag Au SiO2 MCM-41 Au, Ag, Cu, Co,… Introducción 2 | P á g i n a La figura 2 recoge algunos ejemplos de materiales nanoestructurados y sus aplicaciones. Entre los materiales más versátiles con aplicaciones tanto en el sector de la biomedicina como en el área tecnológica. Cabe destacar las nanopartículas magnéticas. La magnetita (Fe3O4) es un material muy utilizado como agente de contraste, en biosensores, como separador catalítico, en hipertermia, etc. Esto se debe a que su principal característica a escala nanométrica es el superparamagnetismo. Es un comportamiento magnético con algunas características del ferromagnetismo y otras del paramagnetismo. Esto conlleva que bajo el efecto de un campo magnético, las nanopartículas tienen un comportamiento magnético, pero cuando cesa la influencia del campo, también cesa su respuesta magnética. Otro material muy interesante es la sílice (SiO2), tanto densa como porosa, ya que es biocompatible y biodegradable. Su fabricación es sencilla, engloba un amplio rango de tamaños y su funcionalización abarca diferentes posibilidades. En el caso de la sílice porosa su relación superficie/volumen es muy grande, lo que hace que sea una candidata perfecta para cargar moléculas huésped. Mientras que las nanopartículas individuales generalmente desempeñan una única función, la combinación de ellas permite crear sistemas híbridos que combinan diferentes funciones en un mismo nanosistema, produciéndose un efecto de sinergia. Para una unión híbrida es necesario una elección inteligente de materiales individuales a combinar, y ha de hacerse teniendo en cuenta las aplicaciones a las que se va a destinar. Las propiedades únicas y los beneficios de la sílice y la magnetita los hacen nanomateriales ideales para combinarlos. El propósito de conseguir estas nanopartículas híbridas es que combinen aplicaciones biomédicas y tecnológicas. La presencia de las nanopartículas magnéticas daría a la estructura híbrida aplicación como agente de contrate en Imagen por Resonancia Magnética (IRM), mientras que la sílice porosa aportaría al nanosistema híbrido propiedades absorbente para cargar moléculas orgánicas, como fármacos o tintes, que posteriormente podrían ser liberados por hipertermia. No son muchos los métodos de síntesis descritos en bibliografía que definan el anclaje de nanopartículas magnéticas sobre soportes de sílice densa, y menos aún sobre sílice porosa. Los primeros procedimientos publicados fueron el método electroquímico [1] y la sonicación química [2, 3] de Fe(CO)5 sobre nanopartículas de sílice. El principal inconveniente es que las nanopartículas híbridas que se obtienen directamente de la síntesis no tienen repuesta magnética, por lo cual es necesario aplicar un tratamiento térmico post-reacción que produce la formación de agregados magnéticos distribuidos de forma heterogénea sobre la superficie de la sílice (figura 3). Métodos más recientes consisten en ensamblar a la superficie de la sílice nanopartículas magnéticas previamente sintetizadas a través de interacciones electrostáticas [4-6]. Como ejemplo cabe destacar el método layer-by-layer (autoensamblaje capa a capa) que intercala SiO2 Fe(CO)5 + Sonicación química SiO2 Fe2+ Fe3+ Tratamiento térmico SiO2 Figura 3. Síntesis por sonicación química y tratamiento térmico post-reacción. Introducción/Objetivos 3 | P á g i n a capas de polielectrolito cargado positivamente con capas de nanopartículas magnéticas cargadas negativamente (figura 4). Sin embargo, el inconveniente de este método es que su síntesis requiere muchas etapas experimentales y además la fuerza iónica entre capas puede ser debilitada con variaciones en el pH del medio, llegando a producirse el desmoronamiento de la estructura. Debido a los inconvenientes de los procedimientos anteriormente descritos, más recientemente se han desarrollado métodos en los que nanopartículas magnéticas han sido ancladas a la superficie de la sílice a través de interacciones covalentes [7-11], unión más robusta y estable frente a variaciones de pH que las interacciones iónicas. Kim, J., et al. (2006) desarrollaron un método de anclaje covalente utilizando una reacción de sustitución nucleófila (figura 5). El inconveniente de este método de síntesis es que la reacción se lleva a cabo con disolventes orgánicos tóxicos, como el tolueno. Además las nanopartículas híbridas resultantes tienen que ser recubiertas en una etapa posterior con PEG (polietilenglicol) para conseguir su biocompatibilidad. En este contexto el reto inmediato que se plantea es el diseño de un nuevo método de síntesis que permita la unión covalente de las nanopartículas magnéticas a un soporte de sílice evitando la utilización de disolventes tóxicos y permitiendo su obtención en una única etapa y en medio acuoso. 2 OBJETIVOS Los objetivos principales de este trabajo son el diseño de una nueva ruta de síntesis de nanopartículas híbridas, compuestas por un núcleo o soporte (core) de sílice, densa o porosa, y un recubrimiento de nanopartículas magnéticas con potenciales aplicaciones tanto en el área biomédica como en el área tecnológica. Así como el estudio y caracterización de estos materiales de cara a su aplicación como agente de contraste en IRM y como sistema de carga de moléculas orgánicas y liberación por hipertermia. Figura 5. Sustitución nucleófila realizada por Kim, J., et al. (2006) [8]. Figura 4. Método layer-by-layer de Zhu, Y., et al. (2003) [5] Procedimiento Experimental 4 | P á g i n a 3 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Síntesis de Nanopartículas Magnéticas: Fe3O4 Las nanopartículas (NPs) de magnetita solubles en agua se sintetizan siguiendo el procedimiento previamente descrito en bibliografía. Los reactivos necesarios para la síntesis son acetil acetonato de hierro (III) (Aldrich) y trietilenglicol (TREG) (Aldrich), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), etanol absoluto, acetato de etilo (Aldrich) e hidróxido sódico (NaOH) (Aldrich). En un matraz de tres bocas se introduce acetil acetonato de hierro (III) (0,6 g) y (TREG) (90 ml). Se procede a realizar el montaje de la figura 6, que consta de un agitador mecánico, un sistema de reflujo, un equipo para controlar la temperatura (termopar, manta y controlador de temperatura), y una corriente de argón para desgasificar. La mezcla se calienta hasta 180ºC a una velocidad de 15ºC/min, y se mantiene a dicha temperatura durante 30 minutos para conseguir la descomposición del precursor, que tiene lugar a temperaturas entre 180-190ºC. A continuación, se calienta a una velocidad de 5ºC/min hasta 280ºC, temperatura a la cual se mantiene durante 30 minutos. La solución resultante se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Posteriormente se añaden acetato de etilo (40 ml) y etanol absoluto (10 ml) y la mezcla resultante se deja bajo el efecto de un imán durante al menos una noche para producir la separación magnética de las nanopartículas. Tras la precipitación magnética se procede a los lavados para eliminar los reactivos sobrantes. Sin que la solución deje de estar bajo el efecto del campo magnético del imán, se procede a la separación de las nanopartículas de su sobrenadante, simplemente vertiendo éste a otro recipiente. A continuación se añadirá etanol absoluto (10 ml) y acetato de etilo (40 ml) a las nanopartículas y para redispersar la mezcla, ya que estarán aglomeradas por efecto del imán, se utilizará un baño de ultrasonidos. Se repetirá el proceso otras dos veces. Para funcionalizar las nanopartículas se prepara una disolución de agua destilada (20 ml) con ácido dimercaptosuccínico (DMSA) (0,3 g) que se añade directamente sobre las nanopartículas magnéticas precipitadas dando una suspensión muy turbia, sobre la que se añade gotas de una disolución de hidróxido sódico (0,3g en 10 ml de agua) hasta que desaparezca la turbidez. Tras este proceso se procederá a su diálisis para eliminar el exceso de DMSA y NaOH. Se introducirá la solución dentro de la membrana de diálisis, y ésta en un baño de agua destilada con agitación, el cual se cambiará regularmente para contribuir a la difusión. Figura 6. Montaje para síntesis de NPs Fe3O4 Procedimiento Experimental 5 | P á g i n a Síntesis de Nanopartículas Híbridas: MCM-41@Fe3O4 y SiO2@Fe3O4. El soporte de las nanoestructuras híbridas son nanopartículas de sílice densa (SiO2) y porosa (MCM-41), sintetizadas en el grupo siguiendo el método Stober [12] y el método reportado por Zeng et al. [13], respectivamente. Posteriormente a su síntesis ambas fueron tratadas con APTES (aminopropil trimetoxisilano) lo que permitió funcionalizar su superficie con grupos amino (NH2). Para que la reacción se lleve a cabo se mezclan una relación de masas de sílice/magnetita de 0,75/0,45 mg, respectivamente. Las nanopartículas se encuentran en disolución acuosa, y la cantidad de volumen a mezclar dependerá de la concentración de la disolución. La concentración de la sílice es constante (30 mg/ml) para todas las síntesis, y se pipetearán 0,025 ml. En las disoluciones de magnetita, varía la concentración dependiendo del lote sintetizado, y en cada caso será un volumen diferente, el preciso para que pipeteen 0,45 mg de nanopartículas. Para que se produzca el ensamblaje y tenga lugar la formación del enlace peptídico es necesario un control exhaustivo del pH, que debe tener un valor en la disolución resultante en torno a 5. Se introduce la mezcla en un agitador rotativo para tubos a 40 rpm durante al menos 24 horas. Síntesis de Nanopartículas Core-Shell SiO2@FexOy Tras el semillado de la sílice densa, se procede al segundo paso para conseguir estructura core-shell. Los reactivos necesarios son: Cloruro férrico hexahidratado (FeCl3x6H2O) (Aldrich), sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4x7H2O) (Aldrich) y etilenglicol (Aldrich). El montaje de la figura 7 es el necesario para el proceso experimental. Consta de un agitador mecánico, un controlador de la velocidad de inyección (0,1 ml/hora) y una placa calefactora con control de temperatura (85ºC). El matraz contiene agua destilada (5 ml), etilenglicol (1 ml) y nanopartículas híbridas de sílice densa (0,5 ml de concentración de sílice 0,6 mg/ml). Sobre la disolución contenida en dicho matraz, se añadirán por inyección 0,5 ml de una disolución acuosa que contiene FeCl3x6H2O (0,9 mg) y FeSO4x7H2O (1,8 mg) en 2 ml de agua. El proceso de adición se realiza durante 20 horas, después de las cuales las nanopartículas se aíslan por centrifugación y lavados con agua. Experimento absorción-desorción de CV. El reactivo escogido para estos ensayos es el cristal de violeta (CV) o violeta de metilo (Aldrich), un compuesto químico utilizado como tinte o marcador. El experimento ha constado de varias partes, las cuales se detallan a continuación: Figura 7. Montaje para síntesis de NPs Core-Shell Discusión y Resultados 12 | P á g i n a Las nanopartículas presentan comportamiento superparamagnético (figura 14), con una magnetización de saturación de 64 emu/g [12]. Figura 14. Magnetización de NPs Fe3O4. (Miguel-Sancho, N., et al.(2011)) 4.2.1 Agentes de Contraste Debido a las propiedades superparamagnéticas, las nanopartículas de Fe3O4 influyen acortando el tiempo de relajación de las moléculas de agua colindantes expuestas a un campo magnético. Este acortamiento se debe al decrecimiento en la señal y supone un contraste negativo en IRM, es decir que la zona destacada de la imagen será oscura, más oscura cuanta mayor sea la concentración de las nanopartículas. En la figura 15 se representa la inversa del tiempo T2 en la componente de ordenadas y la concentración de las diferentes muestras medidas en abscisas. El coeficiente r2 o la relajación específica es 125 mM-1s-1, obtenido de la pendiente de la recta. Cuanto mayor sea la relajación específica mejor agente de contraste será el material, ya que proporcionará mayor contraste en la imagen con menor concentración de nanopartículas. En el trabajo realizado por Lee H.J., et. al. [10] la relajación específica es r2=116 mM-1s-1, menor que en nuestro caso. Comparando con nanopartículas que se encuentran ya en el mercado, el Endorem®/Feridex® posee una r2=120 mM-1s-1 y el Sinerem®/Combidex®, r2=65 mM-1s-1 [14]. Figura 15. Relaxometría T2 de las NPs magnéticas. 0,0350,0300,0250,0200,0150,0100,0050,000 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 [Fe] (mM) 1/T2 (s-1) y = 125,2x + 0,0007 R² = 0,9784 Discusión y Resultados 13 | P á g i n a 4.2.2 Hipertermia Magnética Se realizó la medición sobre una solución acuosa de nanopartículas de magnetita de concentración 0,54 mg/ml de Fe, sometiéndola a un campo magnético constante (580 kHz, 300 Gauss). El resultado fue positivo, ya que se elevó su temperatura con el paso del tiempo (figura 16). Nanopartículas Híbridas: MCM-41@Fe3O4 La síntesis de las nanopartículas de sílice, que se utilizarán como soporte en la construcción de las nanoestructuras híbridas, fue previamente realizada en el grupo de acuerdo con el protocolo previamente descrito en bibliografía [13]. Tras su síntesis, las nanopartículas MCM-41 se funcionalizaron con APTES, lo que proporcionó grupos amino (NH2) en la superficie de las partículas. De las fotos de TEM (figura 17a) cabe destacar que su morfología es aproximadamente esférica y los poros tienen forma de poliedros de base hexagonal. Su diámetro medio indicado en la figura 17b es de 69,8 ± 3,03 nm. En este caso, el diámetro diámetros hidrodinámico medio (figura 18a) es de 175,95 nm. 350300250200150100500 30,0 29,5 29,0 28,5 28,0 27,5 27,0 Tiempo (s) Tª (ºC) Figura 16. Hipertermia magnética de NPs magnéticas. Figura 17. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs MCM-41. 76747270686664 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Distribución de diámetros (nm) Frecuencia Mean 69,80 StDev 3,030 N110 a) b) Discusión y Resultados 14 | P á g i n a La carga superficial de la sílice queda representada en la figura 18b. En la gráfica se contempla que dependiendo del pH su potencial zeta será negativo o positivo. El punto isoeléctrico se observa a un pH 6,2, a pH más ácidos su carga es positiva y a pH más básico es negativo. Esto se debe a que el grupo terminal amino –NH2, a pH menor de 6,2 se encuentra protonado en forma de catión amonio –NH3+. Las nanopartículas de MCM-41 están dispersas en agua con una concentración de 30 mg/ml. La síntesis de las nanopartículas híbridas tiene lugar mediante la reacción de condensación descrita en la figura 19. Dos moléculas se combinan para dar un único producto acompañado de la liberación de una molécula de agua. La reacción tiene lugar a temperatura ambiente y en medio acuoso. Para que tenga lugar la formación del enlace peptídico y la liberación de la molécula de agua se debe trabajar en un rango de pH determinado. En la figura 19 se representan los potenciales zeta de ambas nanopartículas, y su carga superficial a los diferentes pH. La zona resaltada entre pH 4 y pH 5,5 es el rango óptimo de pH para que el enlace covalente entre el grupo carboxilo (-COOH-) de las magnéticas y el amino (-NH3+) de la sílice tenga lugar satisfactoriamente. Si el pH está fuera de rango, el número nanopartículas de magnetita que recubran la superficie de la sílice se reducirá notablemente. La estabilidad de las nanopartículas Figura 18. (a) Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) y (b) potencial zeta de NPs MCM-41. Figura 19. Síntesis de nanopartículas híbridas MCM-41@Fe3O4 por reacción de condensación. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 Potential  (mV) pH b) a) Discusión y Resultados 15 | P á g i n a híbridas queda vigente cuando se las somete a pH extremos y las nanopartículas de magnetita siguen ancladas a la superficie de la sílice. En la figura 20a la imagen de TEM nos indica que el anclaje de las nanopartículas magnéticas a lo largo de toda la superficie de la sílice se ha producido de manera uniforme. Al igual que se ha realizado en apartados anteriores, es necesario un análisis estadístico para obtener la distribución de diámetros de las nanopartículas. El diámetro medio calculado a partir de las micrografías de TEM es 84,5 ± 12 nm (figura 20b), superior al de las nanopartículas de MCM-41 sin semillar debido al volumen extra aportado los las nanopartículas de Fe3O4 ancladas. El diámetro hidrodinámico medio registrado por la técnica DLS es 117 nm (figura 21a). El potencial zeta de las nanopartículas híbridas es el representado en la figura 21b. Es negativo a cualquier pH, como cabía esperar, ya que al recubrir la sílice con la magnetita, el potencial zeta de esta última es el dominante por estar en la superficie de la nueva nanopartícula híbrida. Figura 21. (a) Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) NPs MCM-41@Fe3O4 y (b) potenciales zeta de NPs MCM41@Fe3O4 y sus materiales iniciales. 12011010090807060 25 20 15 10 5 0 Distribución de diámetros (nm) Frecuencia Mean 84,50 StDev 12,01 N121 a) b) NH3 + Figura 20. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs MCM-41@Fe3O4. a) b) 2 4 6 8 10 12 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 Fe3O4 MCM-41 MCM-41@Fe3O4 Potencial Zeta pH C O Fe3O4 ONa+ O C OHMCM-41 NH2 MCM-41 Fe3O4 NH3 + (mV) Discusión y Resultados 16 | P á g i n a Se realizaron diferentes síntesis de estas nanopartículas híbridas, y en la tabla 3 se exponen algunos de los resultados obtenidos. Se miden concentraciones de hierro mediante espectroscopia UV/Vis, y a partir de ahí se calcula la de magnetita. Y por diferencia de pesada se calcula una concentración aproximada de las nanopartículas híbridas. [Fe] (mg/ml) [Fe3O4] (mg/ml) [MCM-41@ Fe3O4] (mg/ml) NPs_1_MCM-41@ Fe3O4_3 0,2243 ± 0,0283 0,3100 ± 0,039 - NPs_2_MCM-41@ Fe3O4_3 0,2107 ± 0,0093 0,2913 ± 0,0128 - NPs_3_MCM-41@ Fe3O4_3 0,4133 ± 0,0050 0,5713 ± 0,0069 - NPs_4_MCM-41@ Fe3O4_2 - - 43,5 NPs_4_MCM-41@ Fe3O4_4 - - 11,1 Tabla 3.Concentraciones de Fe, de Fe3O4 y de semillado en mg/ml de NPs MCM-41@Fe3O4. 4.3.1 Agentes de contraste En la figura 22 se representa la inversa de la relajación trasversal frente a diferentes concentraciones. En este caso la relajación específica es 215 mM-1s-1, superior al de las nanopartículas magnéticas individuales (125 mM-1s-1), y más de tres órdenes superior al del agente de contraste comercial Sinerem®/Combidex®, r2=65 mM-1s-1 [14]. 4.3.2 Absorción y desorción de CV Las ventajas de utilizar estas nanopartículas híbridas para carga y liberación de moléculas orgánicas son las siguientes: el núcleo poroso de sílice es una plataforma perfecta para absorción, debido a su elevada superficie específica y la presencia de nanopartículas magnética permite la liberación molecular por calentamiento empleando un campo magnético (hipertermia magnética). Además como propiedad a destacar es que son nanoplataformas que pueden recuperarse magnéticamente con el objeto de su reutilización. El compuesto químico utilizado para demostrar el potencial de estos nanosistemas híbridos como plataforma de carga es el cristal de violeta. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 20 40 60 80 100 120 140 160 r2= 215 mM-1s-1 1/ T2 (s-1) Fe concentration (mM) Figura 22. Relaxometría T2 de las NPs MCM-41@Fe3O4. Discusión y Resultados 17 | P á g i n a Lo primero fue estudiar la influencia del pH en el proceso de adsorción, con el objetivo de determinar el valor de pH para el cual la adsorción es máxima. Para ello y para el resto del experimento, se utilizó la siguiente recta de calibrado para relacionar absorbancia con concentración de cristal de violeta: Absorbancia = 177,23x[CV] - 0,0395. En la figura 23 se representa la carga de CV (mol CV/g NP) frente al pH. El CV absorbido o carga de CV se calcula mediante la siguiente ecuación: 𝑞 = ([𝐶]𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − [𝐶]𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙). 𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑚_𝑛𝑎𝑛𝑜𝑝𝑎𝑟𝑡í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 La carga es la diferencia de concentraciones, de la solución acuosa inicial y de la solución con las nanopartículas trascurridas un tiempo, por el volumen total de disolución y dividido por los gramos de nanopartículas híbridas utilizados en el experimento. Se puede comprobar en la figura que la capacidad de absorción decrece significativamente a pH bajo (2-4), con una máxima absorción a pH 6,8. Esto puede ser atribuido a que la interacción electrostática entre las cargas superficiales de las nanopartículas y del cristal de violeta es máxima a este pH, ya que como se puede ver en la figura 13b, el potencial z más negativo de las nanopartículas magnéticas se alcanza alrededor en pH 6,8. A pH ácidos la adsorción de CV es menor porque hay una competencia por coordinarse la sílice entre las moléculas de tinte y los protones del medio. A pH básicos mayores a pH 8, las moléculas de cristal de violeta se descomponen. Una vez conocido el valor de pH óptimo para la carga se ha estudiado la cinética de adsorción. Los resultados de estos estudios revelan la velocidad a la que son cargadas las moléculas orgánicas, lo cual es muy útil para la selección de material adsorbente [16]. En la figura 24a se representa la evolución de la carga de CV con el tiempo (18 h) a temperatura ambiente y pH 6,8. Se observa que en la absorción es mucho más acusada tiempos cortos, como cabe esperar debido al proceso de difusión. Conforme va trascurriendo el tiempo el gradiente es menor y absorbe más lentamente, hasta que llega un momento en el que hay equilibrio en la muestra y la absorción prácticamente se estabiliza. Esto ocurre aproximadamente a las 4 horas. Figura 23. Estudio de absorción de CV a diferentes pHs. 1098765432 0,000026 0,000024 0,000022 0,000020 0,000018 0,000016 0,000014 0,000012 pH q (mol CV/g NP) Discusión y Resultados 18 | P á g i n a Del análisis de los datos cinéticos se representa t/qt frente al tiempo (figura 24b), resultando una línea recta con un alto coeficiente de correlación (R2>0,99), con lo que se puede afirmar que la cinética de adsorción de CV en las nanopartículas híbridas es de segundo orden [17]. Comportamientos similares de materiales mesoporosos han sido publicados anteriormente [15]. La capacidad de adsorción de equilibrio teórica obtenida de la pendiente de la recta es 1,59x10-5 mol/g, la cual concuerda con el valor experimental (1,5x10-5 mol/g). La velocidad constante de reacción es 976.5 g·mol-1·min-1. Estos parámetros son comparables con otros reportados en artículos bibliográficos de adsorción de tintes orgánicos en disoluciones acuosas utilizando materiales mesoporosos [15, 18]. Y la conclusión es que las nanopartículas híbridas muestran una buena capacidad de adsorción del cristal de violeta en medio acuoso. Por problemas técnicos del equipo sólo se ha podido realizar un ensayo de desorción por hipertermia. Un mililitro de disolución que contenía 1 mg de nanoparticulas cargadas fue sometido a un campo magnético externo durante 30 minutos (inicialmente la concentración de CV en disolución es despreciable), transcurrido este tiempo se midió la concentración de CV en disolución y se observó una liberación del 20 %, mientras que la cantidad liberada por difusión natural al cabo de 12 horas es despreciable. Nanopartículas Core-Shell SiO2@FexOy. Para la síntesis de estas nanopartículas son necesarios varias etapas. La primera sería la síntesis de nanopartículas híbridas SiO2@Fe3O4. La segunda, realizar el crecimiento y conseguir la nanoestructura core-shell. Y por último eliminar el soporte y obtener las nanopartículas huecas. La sílice densa ya estaba previamente sintetizada [12]. De su caracterización resaltar que las nanopartículas tienen forma esférica como se aprecia en la micrografía de TEM (figura 25a), su diámetro medio es 137±7,636 nm (figura 25b) y su radio hidrodinámico es 186,51 nm (figura 26). 10008006004002000 70000000 60000000 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0 t (min) t/q (min.mol-1 CV.gNP) y = 62665x + 4E+06 R² = 0,9988 10008006004002000 0,000016 0,000014 0,000012 0,000010 0,000008 0,000006 0,000004 0,000002 0,000000 Tiempo (min) q (mol CV/g NP) Figura 24. (a) Evolución temporal de adsorción y (b) cinética de segundo orden. a) b) Discusión y Resultados 19 | P á g i n a La síntesis y funcionalización de las nanopartículas SiO2@Fe3O4 es análoga al caso de las nanopartículas MCM-41@Fe3O4, descrito en el apartado 4.3 de este mismo proyecto. En la figura 27a se observa la micrografía de TEM de estas nanopartículas híbridas, perfectamente dispersas y uniformemente semilladas. El diámetro medio calculado a partir de estas imágenes es 157,9 ± 11,88 nm (figura 27b) y su radio hidrodinámico medio es de 439 nm (figura 28). Figura 26. Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) NPs SiO2 densa. Figura 27. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs SiO2@Fe3O4. 192180168156144132 70 60 50 40 30 20 10 0 Distribución de diámetros (nm) Frecuencia Mean 157,9 StDev 11,88 N441 a) b) Figura 25. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs SiO2. 160152144136128120 25 20 15 10 5 0 Distribución de diámetros (nm) Frecuencia Mean 137,9 StDev 7,636 N98 a) b) Discusión y Resultados 20 | P á g i n a La última prueba realizada fue la medición de la concentración de hierro en la muestra por espectroscopia UV/Vis, necesaria para el siguiente procedimiento (tabla 4). [Fe] (mg/ml) [Fe3O4] (mg/ml) NPs_SiO2@Fe3O4_3 0,2243 ± 0,0283 0,3100 ± 0,039 Tabla 4. Concentraciones de Fe y de Fe3O4 en mg/ml de NPs SiO2@Fe3O4. No se realizaron más ensayos de caracterización, ya que es una etapa intermedia para conseguir las nanopartículas huecas, y con estos datos fue más que suficiente para corroborar que las nanopartículas se encuentran en perfecto estado y para emprender la segunda etapa de síntesis. La síntesis de las nanopartículas core-shell tiene lugar mediante la reacción descrita en la figura 29. Los reactivos Fe2SO4 y FeCl3 se descomponen y aportan iones de Fe2+ y Fe3+, respectivamente, que se depositan sobre la superficie de las nanopartículas semilladas. Estos iones junto a las nanopartículas magnéticas producen un crecimiento de una capa alrededor de la sílice. Debido a que el crecimiento se produce a temperaturas no muy elevadas (85ºC), la capa formada será poco cristalina, y por lo tanto poco magnética. En la micrografía de TEM de la figura 30a se observa el crecimiento amorfo del shell. Todas las nanopartículas han sufrido crecimiento y la muestra está dispersa. Haciendo el análisis estadístico pertinente, el diámetro medio de la muestra es de 160 ± 10,08 nm (figura 30b). Figura 28. Distribución de diámetros hidrodinámicos (nm) NPs SiO2@Fe3O4. Figura 29. Síntesis de NP score-shell. + Fe2SO4 + FeCl3 Discusión y Resultados/Conclusiones 21 | P á g i n a El trabajo realizado en el laboratorio ha llegado hasta este punto, dejando como posibilidades de futuro: completar la caracterización con radio hidrodinámico y potencial zeta y conseguir un comportamiento magnético optimo realizando procesos de recristalización en disolventes de alto punto de ebullición, además de ser el punto de partida para la síntesis de la nanoparticulas huecas, que se obtendrían por disolución del núcleo interno de sílice. 5 CONCLUSIONES Las nanopartículas magnéticas se sintetizan a partir de un procedimiento sencillo y en disolución acuosa. Gracias a los resultados positivos tanto del ensayo de relaxometría, y a sus propiedades superparamagnéticas se puede afirmar su validez como futuro agente de contrate. Se ha desarrollado un método fácil y versátil para la síntesis en medio acuoso de nanopartículas híbridas MCM-41@Fe3O4 a través de la formación de un enlace peptídico entre los dos componentes. La nanopartículas que se obtienen directamente ya están estabilizadas en agua, lo cual es de vital importancia para su posterior aplicación en biomedicina. Se ha probado también su validez como agente de contraste, mejorando su relajación específica respecto a las nanopartículas magnéticas iniciales. La adsorción de cristal de violeta ha demostrado la capacidad de las nanopartículas híbridas como sistemas de carga de moléculas, lo que abre un amplio abanico de posibilidades para su utilización, por ejemplo, en la carga y liberación controlada de fármacos o sistemas de purificación de agua como adsorbente. Además podrían cargarse con nanopartículas metálicas de tamaño inferior al poro para su utilización en catálisis como catalizadores recuperables magnéticamente. En la primera etapa hacia las nanopartículas huecas, se ha sintetizado estructuras coreshellSiO2@Fe3O4. La futura línea de trabajo que se deja abierta sería conseguir nanopartículas huecas con buena respuesta magnética que pudieran cargarse con moléculas orgánicas para su liberación por hipertermia. Así como la utilización de estas nanopartículas huecas como nanovectores para producir a escala atómica reacciones que necesiten de una activación, que en este caso se conseguiría debido a la propiedad de hipertermia magnética. 190180170160150140 25 20 15 10 5 0 Distribución de diámetros (nm) Frecuencia Mean 160,0 StDev 10,08 N119 a) b) Figura 30. (a) Imagen TEM y (b) distribución de tamaños de diámetro (nm) de las NPs SiO2@FexOy.